JPWO2017034031A1 - 自己免疫疾患の診断方法、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー、及び自己免疫疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

自己免疫疾患の診断方法、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー、及び自己免疫疾患の予防又は治療剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、自己免疫疾患の診断方法であって、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（１）又は（２）を実施するステップと、を備える、診断方法に関する。（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。

Description

本発明は、自己免疫疾患の診断方法、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー、及び自己免疫疾患の予防又は治療剤に関する。
多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）は、自己免疫疾患のひとつで、髄鞘及び神経軸索を標的とする多発性炎症が惹起され、広汎な脱髄に起因する神経伝導障害を引き起こす疾患である。
近年、腸内細菌叢は、腸管免疫系の細胞性及び体液性免疫に影響を及ぼす重要な因子であることが明らかとなってきている（非特許文献１）。また、ヒト糞便由来のクロストリジウムクラスターＸＩＶａ及びクラスターＩＶに属する細菌、並びにバクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）がＦｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞を誘導し、結腸炎及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の炎症状態を抑制することが報告されている（非特許文献２〜４）。
Ｃｅｌｌ，２０１４年，１５７巻，ｐｐ．１２１−１４１ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１年，３３１巻，ｐｐ．３３７−３４１ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０年，１８５巻，ｐｐ．４１０１−４１０８ Ｎａｔｕｒｅ，２０１３年，５００巻，ｐｐ．２３２−２３６
本発明は、腸内細菌叢とＭＳ等の自己免疫疾患との相関関係を明らかにすると共に、当該相関関係に基づいた自己免疫疾患の診断方法を提供することを目的とする。本発明はまた、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー、及び自己免疫疾患の治療剤を提供することも目的とする。
本発明者らは、ＭＳ患者と健常対照とで腸内細菌叢の構成に統計上の有意差があることを見出した。また、ＭＳ患者と健常対照との間で、腸内細菌叢における相対存在量が統計上有意に異なる細菌種を見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
すなわち、本発明は、例えば、下記［１］〜［８］に係る発明に関する。
［１］自己免疫疾患の診断方法であって、
被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、
以下の（１）又は（２）を実施するステップと、を備える、診断方法。
（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
［２］自己免疫疾患の診断方法であって、
治療前及び治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、
以下の（３）又は（４）を実施するステップと、を備える、診断方法。
（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、前記被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する
（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、前記被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する
［３］細菌の相対存在量の測定が、糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読することを含む、［１］又は［２］に記載の診断方法。
［４］前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、［１］〜［３］のいずれかに記載の診断方法。
［５］前記多発性硬化症が、再発寛解型の多発性硬化症である、［４］に記載の診断方法。
［６］１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する腸内細菌からなる、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー。
［７］１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する腸内細菌の、自己免疫疾患の診断用バイオマーカーとしての使用。
［８］１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
本発明はまた、下記［２−１］〜［２−５］にも関する。
［２−１］被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、取得した塩基配列データから、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された基準値と比較して自己免疫疾患の病態を判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させるプログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な非一時的記録媒体。
［２−２］被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、取得した塩基配列データから、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された健常人における相対存在量と比較するステップ、比較結果に基づいて、被験者が、自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いかを判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させるプログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な非一時的記録媒体であって、上記判定するステップは、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者は、自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する、非一時的記録媒体。
［２−３］治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、取得した塩基配列データから、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された治療前の被験者における相対存在量と比較するステップ、比較結果に基づいて、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたかを判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させるプログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な非一時的記録媒体であって、上記判定するステップは、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する、非一時的記録媒体。
［２−４］被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者が自己免疫疾患へ罹患している、又は罹患する危険性が高いことを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える、自己免疫疾患の診断システム。
［２−５］治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたかを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える、自己免疫疾患の診断システム。
本発明によれば、腸内細菌叢に基づいた自己免疫疾患の診断方法の提供が可能となる。また、本発明によれば、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー、及び自己免疫疾患の治療剤の提供が可能となる。
ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢の解析結果を示す図である。（ａ）は、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群のＯＴＵ及びクラスタ数の平均値を示す。（ｂ）は、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群のＯＴＵ及びクラスタ数のＣｈａｏ１推定値を示す。（ｃ）は、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群のＳｈａｎｎｏｎ値を示す。 ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢の非加重ＵｎｉＦｒａｃ解析の結果を示す図である。（ａ）は、主座標分析（ＰＣｏＡ）の結果を示す。（ｂ）は、ＵｎｉＦｒａｃ距離解析の結果を示す。 ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢の加重ＵｎｉＦｒａｃ解析の結果を示す図である。（ａ）は、主座標分析（ＰＣｏＡ）の結果を示す。（ｂ）は、ＵｎｉＦｒａｃ距離解析の結果を示す。 ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢における細菌種組成を門レベルで解析した結果を示す図である。 ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢における細菌種組成を属レベルで解析した結果を示す図である。 １６Ｓリードのマッピング解析のワークフローを示す図である。 ＭＳ２０群とＨＣ４０群との間での、細菌の相対存在量の差（Ｌｏｇ１０（ＭＳ２０群の平均リード数／ＨＣ４０群の平均リード数））を示す図である。 １６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度を解析した結果を示す図である。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度を解析した結果を示す図である。 クロストリジウム類の細菌種の系統樹解析の結果を示す図である。 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度を解析した結果を示す図である。 ＭＳ２０群と長期ＨＣ１８群との間での、細菌の相対存在量の差（Ｌｏｇ１０（ＭＳ２０群の平均リード数／長期ＨＣ１８群の平均リード数））を示す図である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー、及び自己免疫疾患の診断プログラム及び診断システム、並びに自己免疫疾患の治療剤は、自己免疫疾患のひとつである多発性硬化症に罹患した患者において、健常対照に比較して腸内細菌叢の構成が有意に変化するという新規な知見に基づく。
自己免疫疾患とは、自己の免疫系が自己の正常な細胞及び組織に対して反応することにより引き起こされる疾患である。自己免疫疾患としては、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、クローン病、尋常性白斑、ベーチェット病、膠原病、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、シェーグレン症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性肝疾患、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症等の疾患を挙げることができる。
多発性硬化症には、急性増悪と寛解を繰り返す再発寛解型ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）と、進行型ＭＳがある。進行型ＭＳには、一次進行型ＭＳ（ＰＰ−ＭＳ）と、ＲＲ−ＭＳ病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型ＭＳ（ＳＰ−ＭＳ）、及び再発を繰り返しながら進行する進行再発型ＭＳ（ＰＲ−ＭＳ）が知られている。
本発明が対象とする自己免疫疾患としては、多発性硬化症が好ましく、再発寛解型多発性硬化症がより好ましい。
〔自己免疫疾患の診断方法〕
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法は、被験者の腸内細菌叢の構成に基づく判定を行うものであるため、例えば、自己免疫疾患への罹患の有無又は罹患の危険性を判定すること（第１の実施形態）、及び自己免疫疾患の治療効果を判定すること（第２の実施形態）に用いることができる。
第１の実施形態に係る診断方法は、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（１）又は（２）を実施するステップと、を備える。
（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。
（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。
第２の実施形態に係る診断方法は、治療前及び治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、以下の（３）又は（４）を実施するステップと、を備える。
（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、前記被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する。
（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、前記被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する。
細菌の相対存在量とは、細菌叢全体に対し当該（特定の）細菌が占める割合を意味する。細菌の相対存在量は、例えば、細菌叢を構成する全細菌数と、細菌叢に含まれる特定の細菌の数から求めることができる。より具体的には、例えば、細菌叢に含まれる細菌に共通する塩基配列と各細菌種に特徴的な塩基配列とを有する遺伝子（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を網羅的に解読し、解読した遺伝子の総数、及び特定の細菌種に帰属される遺伝子の総数を、それぞれ細菌叢を構成する全細菌数、及び特定の細菌の数として、特定の細菌の相対存在量を求めることができる。
後述の実施例で詳述するとおり、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が増加する細菌として、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列である細菌が同定された。同様に、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が減少する細菌として、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列が、配列番号５〜２３のいずれかで特定される塩基配列である細菌が同定された。
したがって、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を指標とすることにより、自己免疫疾患への罹患の有無又は罹患の危険性を判定すること、及び自己免疫疾患の治療効果を判定することが可能になる。判定精度をより高める観点から、上記同一性は、９９．５％以上であることが好ましく、９９．７％以上であることがより好ましく、９９．９％以上であることが更に好ましく、１００％であることが更により好ましい。
なお、ここでいう「同一性」とは、２つの塩基配列のアラインメント（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用したアラインメント）を行ったとき、一致する塩基の割合を意味する。
真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子には、多くの生物種で塩基配列の保存度が高い領域（保存領域）の他に、特定の細菌種及びその近縁種に固有の塩基配列の領域（可変領域）が存在する。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子には、Ｖ１〜Ｖ９と呼ばれる９つの可変領域が知られている。可変領域の塩基配列を同定することにより、細菌種を特定することができる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列とは、Ｖ１可変領域及びＶ２可変領域の塩基配列である。
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法に使用する被験者由来の試料は、被験者の腸内細菌叢の構成を解析できる試料であればよく、被験者の糞便試料を用いることができる。糞便試料は、被験者の肛門から排泄された糞便であってもよく、被験者の腸（特に、大腸）から採取された排泄前の糞便であってもよい。
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法は、（１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定することができる。同様に、（２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定することができる。
自己免疫疾患への罹患の有無又は罹患の危険性の判定にあたっては、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の少なくとも１種について、判定を行ってもよい。判定精度をより高める観点から、上記細菌の２種以上について判定を行ってもよく、上記細菌の全てについて判定を行ってもよい。
健常人における上記細菌の相対存在量は、予め測定しておいてもよい。健常人における上記細菌の相対存在量は、複数の健常人の平均値であってもよい。また、健常人における上記細菌の相対存在量の複数のデータと被験者の当該相対存在量のデータとから、統計解析（例えば、Ｗｅｌｃｈのｔ検定）により有意差の有無を解析することもできる。
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法は、（３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定することができる。同様に、（４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定することができる。
自己免疫疾患の病態の改善の判定にあたっては、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の少なくとも１種について、判定を行ってもよい。判定精度をより高める観点から、上記細菌の２種以上について判定を行ってもよく、上記細菌の全てについて判定を行ってもよい。
治療前の被験者における上記細菌の相対存在量は、予め測定しておいてもよく、また治療後の被験者における上記細菌の相対存在量と略同時に測定してもよい。ここでいう「治療前」及び「治療後」とは、例えば、継続的な治療（例えば、定期的な投薬）を行っている期間の途中で施された治療（例えば、３回目の投薬）の前後を含む概念である。
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法は、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップを含み、当該細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌である、自己免疫疾患への罹患の有無又は罹患の危険性を判定するためのデータ収集方法と捉えることもできる。
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断方法はまた、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップを含み、当該細菌は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌である、自己免疫疾患の治療効果を判定するためのデータ収集方法と捉えることもできる。
〔自己免疫疾患の診断プログラム及び診断システム〕
上述した本発明に係る診断方法は、コンピュータを自己免疫疾患の診断システムとして機能させるプログラムとして提供することもできる。
本実施形態に係るプログラムは、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、取得した塩基配列データから、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された基準値と比較して自己免疫疾患の病態を判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させる。
第１の実施形態において、基準値は、健常人における対応する塩基配列の相対存在量であり、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者は、自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。
すなわち、第１の実施形態に係るプログラムは、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、取得した塩基配列データから、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された健常人における相対存在量と比較するステップ、比較結果に基づいて、被験者が、自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いかを判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させる。判定するステップでは、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者は、自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する。
第１の実施形態に係る診断システムは、被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者が自己免疫疾患へ罹患している、又は罹患する危険性が高いことを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える。
入力手段は、網羅的に解読した塩基配列データをコンピュータに入力するためのものであって、例えば、マウス、キーボード、データ伝送回線、モデム等の各種インターフェースが挙げられる。
演算手段（例えば、ＣＰＵ）は、入力した塩基配列データから配列番号３〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の少なくとも１つについて、当該塩基配列の出現頻度から相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を、記憶装置（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）から読み出した基準値（健常人における上記相対存在量）と比較し、（ｉ）上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ上記被験者における上記相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、（ｉｉ）上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ上記被験者における上記相対存在量が健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、被験者は、自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定するステップを実行するものである。演算手段はまた、（ｉ）又は（ｉｉ）に該当しない場合、被験者は自己免疫疾患に罹患していない、又は罹患する危険性が高くないと判定するステップを実行してもよい。
判定結果は、例えば、ディスプレイ、プリンタ等の出力手段に出力される。判定結果はまた、他の情報処理端末へのデータ転送回線等を介して出力されてもよい。
第２の実施形態において、被験者は、自己免疫疾患の治療後の被験者であり、かつ基準値は、当該治療前の被験者における対応する塩基配列の相対存在量であり、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する。
すなわち、第２の実施形態に係るプログラムは、治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得するステップ、取得した塩基配列データから、配列番号３〜２３のいずれかで特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の頻度を計算し、当該塩基配列の相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を予め入力された治療前の被験者における相対存在量と比較するステップ、比較結果に基づいて、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたかを判定するステップ、及び得られた判定結果を出力するステップをコンピュータに実行させる。判定するステップでは、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して少ない場合、当該被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する。
第２の実施形態に係る診断システムは、治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読した塩基配列データを取得する入力手段と、取得した塩基配列データに基づいて、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたかを判定する演算手段と、上記演算手段で得られた判定結果を出力する出力手段を備える。
第２の実施形態において、演算手段（例えば、ＣＰＵ）は、入力した塩基配列データから、配列番号３〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の少なくとも１つについて、当該塩基配列の出現頻度から相対存在量を算出するステップ、算出した相対存在量を、記憶装置（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）から読み出した基準値（治療前の被験者における上記相対存在量）と比較し、（ｉｉｉ）上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ上記相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して多い場合、又は、（ｉｖ）上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列であり、かつ上記相対存在量が治療前の被験者における当該相対存在量に比較して少ない場合、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定するステップを実行するものである。演算手段はまた、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）に該当しない場合、被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されていないと判定するステップを実行してもよい。
なお、第２の実施形態では、被験者は、自己免疫疾患の治療前の被験者であり、かつ基準値は、当該治療後の被験者における対応する塩基配列の相対存在量であり、上記相対存在量が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療後の被験者における当該相対存在量に比較して少ない場合、又は、上記相対存在量が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列の相対存在量であり、かつ算出した相対存在量が治療後の被験者における当該相対存在量に比較して多い場合、当該被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定するものであってもよい。
本実施形態に係るプログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。すなわち、本実施形態に係るコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、上述したプログラムが記録されている。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。コンピュータ読み取り可能な記録媒体としては、例えば、コンピュータのＲＯＭ若しくはハードディスク、ネットワークに接続されたサーバ・コンピュータ等に設けられた外部記憶装置、又はフレキシブルディスク、メモリーカード、光磁気ディスク等の可搬記録媒体が挙げられる。
〔自己免疫疾患の診断用バイオマーカー及びその使用〕
本実施形態に係る自己免疫疾患の診断用バイオマーカーは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する腸内細菌からなる。
上述のとおり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列である腸内細菌は、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が増加する。また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列が、配列番号５〜２３のいずれかで特定される塩基配列である腸内細菌は、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が減少する。したがって、当該相対存在量の多寡に基づき、上記腸内細菌をバイオマーカーとして使用することができる。本実施形態のバイオマーカーによれば、例えば、自己免疫疾患への罹患の有無又は罹患の危険性を判定すること、及び自己免疫疾患の治療効果を判定することなど、自己免疫疾患を診断することができる。
〔自己免疫疾患の予防又は治療剤〕
本実施形態に係る自己免疫疾患の予防又は治療剤は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。
上述のとおり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列が、配列番号５〜２３のいずれかで特定される塩基配列である腸内細菌は、健常対照と比較してＭＳ患者で有意に相対存在量が減少する。本実施形態に係る予防又は治療剤は、当該腸内細菌又はこれら由来の生理活性物質を含有することから、ＭＳ等の自己免疫疾患の予防又は治療（病態の改善、緩和、寛解）に適する。
有効成分である腸内細菌は、例えば、ヒトの腸内細菌叢を構成する腸内細菌を単離培養し、単離された腸内細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１領域−Ｖ２領域の塩基配列を解析し、所望の塩基配列を有する腸内細菌を特定することにより得ることができる。また、既知菌種と９９％以上の類似度を有する腸内細菌は、当該菌種と同一種であるため、当該菌種をＡＴＣＣ等の細胞バンクから購入してもよい。腸内細菌由来の生理活性物質は、当該腸内細菌を培養し、培地中に分泌された生理活性物質を精製又は単離することで得ることができる。また、当該腸内細菌を接種及び定着させたマウス等の動物の腸管内容物から精製又は単離することで得ることもできる（Ｉｎ ｖｉｖｏ方法）。
本実施形態に係る予防又は治療剤は、有効成分のみで構成してもよく、また薬学的に許容される担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤等）又は添加剤（等張化剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、可溶化剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤、増量剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、吸着剤、崩壊抑制剤、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、無痛化剤等）を更に含有していてもよい。
本実施形態に係る予防又は治療剤の剤形は、投与方法、処方条件に応じて適宜選択してよい。剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、トローチ剤、液剤等を挙げることができる。また、有効成分を大腸に効率良く送達するという観点から、製剤には腸溶性コーティングを施してもよい。腸溶性コーティングとしては、公知のものを特に制限なく使用することができる。
本実施形態に係る予防又は治療剤の投与方法としては、経口投与、非経口投与のいずれであってもよい。非経口投与の場合は、腸管内に直接投与してもよい。
本実施形態に係る予防又は治療剤の投与量は、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、有効成分量換算で、通常０．００１ｍｇ〜５０００ｍｇ／日／人であり、好ましくは０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ／日／人である。複数回に分割して投与してもよい。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．試験方法
［１．対象］
２０名のＭＳ患者（平均年齢：３６．０±７．２歳、男性６名、女性１４名）と、５０名の健康対照（ＨＣ）（平均年齢：２７．２±９．２歳、男性２３名、女性２７名）を対象とした。ＭｃＤｏｎａｌｄの診断基準にしたがって診断した結果、全てのＭＳ患者が再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）であった。また、全てのＭＳ患者は、一次進行型ＭＳ、二次進行型ＭＳ、他の疾患を併発していなかった。ＭＳ患者及び健康対照を含む全ての対象はいずれも、糞便試料を回収する間、抗生物質を投与されることはなかった。なお、本試験は、精神・神経医療研究センター、順天堂大学附属病院、麻布大学附属病院及び東京大学附属病院の各ヒト研究倫理委員会に認可されたプロトコルで実施された。全ての対象から事前にインフォームドコンセントを得た。
［２．糞便試料の回収及び処理］
対象から回収した糞便は、直ちに使い捨ての酸素吸収剤及び二酸化炭素発生剤を含有するプラスチックバッグ（プラスチックバッグ内は、酸素感受性嫌気性細菌が生存可能な環境である。）に入れて、４℃の温度を維持しながら、実験室へ運搬した。実験室において、２０％グリセロールを含有するリン酸緩衝生理食塩水に糞便を懸濁させ、直ちに液体窒素で凍結させ、使用するまで−８０℃で保管した。
非特許文献（ＤＮＡ Ｒｅｓ．，２０１３年，２０巻，ｐｐ．２４１−２５３）に記載された酵素的分解法により、糞便試料から細菌ＤＮＡを単離及び精製した。
５０名の健康対照のうち、４０名の健康対照（ＨＣ４０群、平均年齢：２８．５±９．８歳）の糞便試料を、２０名のＭＳ患者（ＭＳ２０群）の糞便試料との比較試験に供した。比較試験では、ＨＣ４０群とＭＳ２０群との間で、細菌叢の構成の違いの評価と、存在比が異なる細菌種の同定を行った。
１８名の健康対照（長期ＨＣ１８群、年齢：２１．９±３．１歳）を長期観察ＨＣ１８群とした。１８名の健康対照のうち、８名はＨＣ４０群と重複する対象である。１８名の対象から、２週間毎に９回その糞便試料を回収した。具体的には、１４名の対象から９個の糞便試料を得て、４名の対象から８個の糞便試料を得た。長期ＨＣ１８群から得た糞便試料を用いて、ＨＣ４０群とＭＳ２０群とで相対存在量が統計上有意に異なる細菌種をさらに評価し、時間の経過に伴う存在比の違いに一貫性があるかを評価した。
ＭＳ患者の詳細なデータは、表１に記載のとおりである。健康対照の詳細なデータは、表２に記載のとおりである。
［３．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の決定］
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域を、フォワードプライマー２７Ｆｍｏｄ（バーコード配列を含む、配列番号１：５’−ａｇｒｇｔｔｔｇａｔｙｍｔｇｇｃｔｃａｇ−３’）及びリバースプライマー３３８Ｒ（配列番号２：５’−ｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃｃｇｔａｇｇａｇｔ−３’）を用いて、ＰＣＲで増幅した。２５０μＭ ｄＮＴＰｓ及び１Ｕ Ｅｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）の存在下、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、フォワードプライマー（０．２μＭ）、リバースプライマー（０．２μＭ）及び鋳型ＤＮＡ（＜２０ｎｇ）を含有する１×Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲバッファー（５０μＬ）を用いて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、９７００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジージャパン社製）を用いて、初期変性（９６℃、２分間）を行った後、変性（９６℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、４５秒間）及び伸長（７２℃、１分間）を２５サイクル繰り返し、最終伸長（７２℃、１分間）で実施した。
ＰＣＲ増幅産物を、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．社製）を用いて精製し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ライフテクノロジージャパン社製）を用いて定量した。ＰＣＲ増幅産物量が同量となるように、各ＰＣＲ増幅産物を混合し、４５４ ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ又は４５４ ＧＳ ＪＵＮＩＯＲ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、取扱説明書に記載のプロトコルに従い、塩基配列を決定した。
［４．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長配列データベースの構築］
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全長配列データベースを、ＲＤＰ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）、ＣＯＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｏｓｕ．ｅｄｕ．／）及びＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のデータベースに登録されている全長１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＦＬ−１６Ｓ）の塩基配列から構築した。
まず、上記データベースに登録されている塩基配列（総配列数：２２１，５３７個）から、配列長が１，４００塩基対未満の塩基配列、４つ以上の不明瞭な塩基を含む塩基配列、及び真核生物由来と推測される塩基配列を排除し（品質チェック）、高品質ＦＬ−１６Ｓ配列（総配列数：１５４，８５０個）を得た。
得られた高品質ＦＬ−１６Ｓ配列をＵＳＥＡＲＣＨ５（閾値：９９．８％の同一性）を使用してクラスタリングし、非重複のＦＬ−１６Ｓ配列に相当する８７，５５８クラスタを得た。これをＦＬ−１６Ｓの全長配列データベースとし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の解析に使用した。
［５．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の解析］
（１）帰属分類群の推定
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の読み取りデータ（リード）の確立された解析パイプライン（ＤＮＡ Ｒｅｓ．，２０１３年，２０巻，ｐｐ．２４１−２５３；ＤＮＡ Ｒｅｓ．，２０１４年，２１巻，ｐｐ．１５−２５参照）を使用して、各試料の細菌叢を解析した。
簡潔にいうと、まず、各試料について、上述の品質チェックをパスした全てのリードから３，０００個の１６Ｓリード（平均クオリティ値＞２５）をランダムに選択した。選択された１６Ｓリードからプライマー配列を除去したものを以後の解析に用いた。各試料について、３，０００個の１６Ｓリードをクラスタリング（閾値：９６％の同一性）して、操作上の分類単位（ＯＴＵ：Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ）の数を得た。ＯＴＵの数を使用して、細菌種の多様性及び豊富さを評価した。
次に、ＦＬ−１６Ｓの全長配列データベースを使用して、１６Ｓリードをマッピングした。具体的には、ＦＬ−１６Ｓの全長配列データベース（非重複のＦＬ−１６Ｓ配列に相当する８７，５５８個の全長塩基配列を含む）に対して、１６ＳリードのＢＬＡＳＴ解析（≧９６％同一性、≧９０％カバー率）を行った結果に基づいて、１６ＳリードをＦＬ−１６Ｓにマッピングした。１６ＳリードがマッピングされたＦＬ−１６Ｓ配列を、ＵＳＥＡＲＣＨ５（閾値：９７％の同一性）を使用して更にクラスタリングすることによって、種レベルのＯＴＵに対応する９７％ＦＬ−１６Ｓクラスタ（以後、「ｒｃｌｕｓｔ」とも称し、クラスタ名に「ｒｃｌｕｓｔ」を付す。）を生成した。１６Ｓリードの帰属分類群は、それがマッピングされた９７％ＦＬ−１６Ｓクラスタに基づいて、種レベルで推定した。
マッピングされなかった１６Ｓリードは、ＵＳＥＡＲＣＨ５（閾値：９６％の同一性）を使用した標準的なクラスタリングによって、ＯＴＵ（以後、「ｕｎｍａｐ＿ＯＴＵ」とも称し、クラスタ名に「ｕｎｍａｐ＿ＯＴＵ」を付す。）を生成した。マッピングされなかった１６Ｓリードの帰属分類群は、ＦＬ−１６Ｓの全長配列データベースに対する相同性検索結果に基づき、より高次の分類レベル（すなわち、属、門等）で推定した。
「ｒｃｌｕｓｔ」及び「ｕｎｍａｐ＿ＯＴＵ」に帰属された１６Ｓリードの数から、種、属及び門レベルでの菌叢を解析した。解析に使用した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１−Ｖ２領域の塩基配列は、アクセッション番号ＤＲＡ０００６７２，ＤＲＡ０００６７３，ＤＲＡ０００６７５，ＤＲＡ０００６７６，ＤＲＡ０００６７８−ＤＲＡ０００６８４，ＤＲＡ００２８６６−ＤＲＡ００２８７４（ＭＳ患者），ＤＲＡ００２８７５−ＤＲＡ００２９０６（健常対照）にて、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースに登録した。
（２）細菌叢の類似度の解析（Ｕｎｉｆｒａｃ解析）
ＵｎｉＦｒａｃ解析により腸内細菌叢の全体構成の違いを解析した。Ｃｈａｏ１推定量に基づく各試料のＯＴＵの豊富さは、Ｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１５．２）に実装されたＶｅｇａｎ ｐａｃｋａｇｅ（ｖ．２．０−５）を使用して計算した。
（３）統計解析
全ての統計解析には、Ｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１５．２）を使用した。細菌種の豊富さ、均等度及び多様性は、Ｒ Ｖｅｇａｎ ｐａｃｋａｇｅを使用して評価した。統計検定は、ウェルチのｔ検定により行った。また、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法により多重検定のｐ値を補正した。系統樹は、近隣結合法により作製した。系統樹中の各節の長さは、ブートストラップ法（１０００反復）で評価した確率を示す（図１０左上に示した「−」の長さが確率０．０１に相当する）。
２．結果
［１．１６Ｓリードの帰属］
４５４ ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍを使用して、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群の糞便試料から、それぞれ１４１，５４９リード（１試料あたり７，０８０±８２５リード）及び３０３，５８５リード（１試料あたり７，５９０±６１６リード）の高品質１６Ｓリードを得た（表３及び表４参照）。

ＦＬ−１６Ｓの全長配列データベース（非重複のＦＬ−１６Ｓ配列に相当する８７，５５８個の全長塩基配列を含む）に対して、各試料についてランダムに選択した３，０００リード（計１８０，０００リード）を使用してＢＬＡＳＴ解析（≧９６％同一性、≧９０％カバー率）を行った結果、１６３，６９１リード（ＨＣ４０群由来：１０９，８９１リード、ＭＳ２０群由来：５３，８００リード）が、非重複の９，８１６クラスタにマッピングされた。一方、残りの１６，３０９リード（ＨＣ４０群由来：１０，１０９リード、ＭＳ２０群由来：６，２００リード）は、いずれのクラスタにもマッピングされなかった。この結果、全ての１６Ｓリードの約９１％は、既知の種又は株に帰属できることがわかった。また、マッピングされなかった割合は、ＨＣ４０群で８．４％、ＭＳ２０群で１０．３％であった。このことから、ＨＣ４０群よりもＭＳ２０群において、種レベルで未知の細菌の割合が若干多いことが示唆された。
１６ＳリードがマッピングされたＦＬ−１６Ｓ配列を、ＵＳＥＡＲＣＨ５（閾値：９７％の同一性）を使用して更にクラスタリングした結果、種レベルでの類似性を示す７６０クラスタが生成された。これらのクラスタのうち、平均相対存在量が０．１％未満であるクラスタ（６５９クラスタ）は、以後の解析から除外した。すなわち、１０１クラスタを更なる解析に供した。
マッピングされなかった１６Ｓリードに対して、ＵＳＥＡＲＣＨ５（閾値：９６％の同一性）を使用した標準的なクラスタリングを行った結果、１，３２１個のＯＴＵが生成された。これらのＯＴＵのうち、平均相対存在量が０．１％未満であるＯＴＵ（１，２９２個）は、以後の解析から除外した。すなわち、２９個のＯＴＵを更なる解析に供した。
更なる解析に供した１０１クラスタ、及び２９個のＯＴＵには、１６３，７２６リード（ＨＣ４０群由来：１０９，９１３リード、ＭＳ２０群由来：５３，８１３リード）が含まれていた。この数は、当初解析に使用した１８０，０００リード（３，０００リード／対象）の約９１％に相当する。
［２．ＭＳ患者と健康対照の腸内細菌叢の比較］
図１（ａ）は、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群のＯＴＵ及びクラスタ数の平均値を示す図である。縦軸はＯＴＵ及びクラスタの数を示す。図１（ｂ）は、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群のＯＴＵ及びクラスタ数のＣｈａｏ１推定値を示す図である。縦軸はＯＴＵ及びクラスタの数を示す。図１（ｃ）は、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群のＳｈａｎｎｏｎ値を示す図である。縦軸はＳｈａｎｎｏｎ値を示す。
ＭＳ２０群のＯＴＵ及びクラスタ数の平均値、及びＣｈａｏ１推定値は、それぞれ１２６．９及び１７２．８であった。同様に、ＨＣ４０群のＯＴＵ及びクラスタ数の平均値、及びＣｈａｏ１推定値は、それぞれ１２９．４及び１８４．８であった。いずれの数値もＭＳ２０群の方がＨＣ４０群よりも若干低かったが、統計上の有意差はなかった（図１（ａ）及び図１（ｂ））。また、種の豊富さと均等度を反映した多様度指数であるＳｈａｎｎｏｎ値は、ＭＳ２０群（３．２９±０．４６）とＨＣ４０群（３．３９±０．２９）との間で有意な差はなかった（図１（ｃ））。
図２及び図３は、ＵｎｉＦｒａｃ距離解析（図２（ｂ）及び図３（ｂ））及びＵｎｉＦｒａｃ主座標分析（ＰＣｏＡ）（図２（ａ）及び図３（ａ））の結果を示す図である。図２及び図３は、それぞれ非加重及び加重ＵｎｉＦｒａｃ解析の結果に対応する。図２（ａ）及び図３（ａ）中の白丸（○）と黒丸（●）は、それぞれＨＣ４０群及びＭＳ２０群の個々の対象のデータに対応する。また、図２（ａ）では、類似度行列分析（ＡＮＯＳＩＭ）の結果が、Ｒ＝０．２３９，ｐ≦０．００００９であった。図３（ａ）では、ＡＮＯＳＩＭの結果が、Ｒ＝０．２０８，ｐ≦０．００２であった。図２（ｂ）及び図３（ｂ）中の「＊」は、ｐ≦０．０５であることを示す。
図２及び図３に示すように、非加重及び加重ＵｎｉＦｒａｃ解析いずれの場合もＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢の構成には有意差（ｐ＜０．０５）があった。また、ＭＳ２０群は、ＨＣ４０群と比較して、腸内細菌叢の対象（個体）間における変動が大きかった。これらの結果から、ＭＳ２０群は、ＨＣ４０群と比較して、中程度の腸内菌共生バランス失調を生じていることが示唆された。
［３．ＭＳ患者と健康対照で相対存在量に差のある細菌種の同定］
次に、ＭＳ２０群とＨＣ４０群との間で腸内細菌叢における相対存在量に差のある細菌種を同定するために、種々の分類レベルで細菌種組成を分析した。
図４は、ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢における細菌種組成を門レベルで解析した結果を示す図である。縦軸は、相対存在量（％）を示す。図５は、ＭＳ２０群とＨＣ４０群の腸内細菌叢における細菌種組成を属レベルで解析した結果を示す図である。縦軸は、相対存在量（％）を示し、白い棒がＨＣ４０群、塗りつぶした棒がＭＳ２０群である。図中の「＊」は、ｐ≦０．０５であることを示す。
門レベルでの解析の結果、ＭＳ２０群及びＨＣ４０群の腸内細菌叢はいずれも、主要な４つの門（アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデテス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）及びプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ））に属する細菌から構成されていた。
ＭＳ２０群では、ＨＣ４０群と比較して、アクチノバクテリア門に属する細菌の相対存在量が多く、フィルミクテス門及びバクテロイデテス門に属する細菌の相対存在量が少ない傾向があったが、統計上の有意差はなかった（図４）。
属レベルでの解析の結果、ＭＳ２０群では、ＨＣ４０群と比較して、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ファカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテーラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びアナエロスティペス属（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）に属する細菌の相対存在量が少なく、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の相対存在量が多い傾向があった（図５）。特に、バクテロイデス属、プレボテーラ属及びアナエロスティペス属に属する細菌の相対存在量には統計上の有意差があった（図５）。
種レベルでの解析の結果、ＭＳ２０群とＨＣ４０群との間で、細菌の相対存在量に統計上の有意差（ｐ＜０．０５）がある２１種を同定した（表５）。図６に、１６Ｓリードのマッピング解析のワークフローを示す。
図７は、ＭＳ２０群とＨＣ４０群との間での、細菌の相対存在量の差（Ｌｏｇ１０（ＭＳ２０群の平均リード数／ＨＣ４０群の平均リード数））を示す図である。図７の縦軸は、細菌の相対存在量の差を示しており、細菌の相対存在量の差は、表５中の「Ｌｏｇ１０（ＭＳ／ＨＣ）」の値に相当する。図７中、括弧内に示した細菌種は、２１種それぞれの代表的な１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列に対して最も高い類似度を示す細菌種である。
同定された２１種のうち、１５種は既知のＦＬ−１６Ｓ塩基配列と９６％以上の同一性を示す「ｒｃｌｕｓｔ」に分類された。残りの６種は既知のＦＬ−１６Ｓ塩基配列と９６％未満の同一性しか示さない（マッピングされなかった）「ｕｎｍａｐ＿ＯＴＵ」に分類された（表５及び図７）。
ｒｃｌｕｓｔ００２３１及びｒｃｌｕｓｔ００４６７は、いずれも属が未同定の酪酸産生菌と９９％を超える同一性を有していた。加えて、ｒｃｌｕｓｔ００２３１は、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）ＡＴＣＣ ２７７５８（アクセッション番号：ＮＺ＿ＡＢＶＲ００００００００）と９７．４％の同一性を有しており、ｒｃｌｕｓｔ００４６７は、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）（アクセッション番号：Ｓ００１０１４０９１）と９５．２％の同一性を有していたことから、いずれもコプロコッカス属に帰属した（表５）。
ｒｃｌｕｓｔ００４８９は、ラクトバチルス・ロゴサエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｇｏｓａｅ）（アクセッション番号：Ｓ００１８７３７８４）と９６．０％の同一性を有していた。しかし、ラクトバチルス・ロゴサエは、他の既知のラクトバチルス属の細菌種との１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度解析の結果、これらのラクトバチルス属の細菌種とは系統学的に異なる可能性が示された（図８）。図８は、１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度を解析した結果を示す図である。図８中の数値は上に示した細菌種と左に示した細菌種との１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の同一性（％）を示す。図８に示されるとおり、ラクトバチルス・ロゴサエは、他のラクトバチルス属の細菌種と８１％以下の同一性しか示さなかった。他方、ｒｃｌｕｓｔ００４８９は、ラクノスピラ・ペクチノスチザ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ ｐｅｃｔｉｎｏｓｃｈｉｚａ：図１０に示すように、クロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する細菌種である。）と高い同一性（９４．５％）を有していた。また、後述のクロストリジウム類の細菌種の系統樹解析の結果からも、ｒｃｌｕｓｔ００４８９は、未同定のクロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する細菌種に帰属できる。
ｒｃｌｕｓｔ００７１５は、ロゼブリア属種１１２０（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｓｐ．１１２０）（アクセッション番号：Ｓ００３６１０１８３）と９９．４％の同一性を有していた。しかし、ロゼブリア属種１１２０は、ロゼブリア・ファエシス（Ｒ．ｆａｅｃｉｓ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒ．ｈｏｍｉｎｉｓ）等の他の既知のロゼブリア属の細菌種との１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度解析の結果、これらのロゼブリア属の細菌種とは系統学的に異なる可能性が示された（図９）。図９は、１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度を解析した結果を示す図である。図９中の数値は上に示した細菌種と左に示した細菌種との１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の同一性（％）を示す。図９に示されるとおり、ロゼブリア属種１１２０は、他のロゼブリア属の細菌種と９０％以下の同一性しか示さなかった。他方、ｒｃｌｕｓｔ００７１５は、クロストリジウム科に属する細菌ＳＨ０３２（アクセッション番号：Ｓ０００９９４７８２）と２番目に高い同一性（８５．４％）を有していた。また、後述のクロストリジウム類の細菌種の系統樹解析の結果からも、ｒｃｌｕｓｔ００７１５は、未同定のクロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する細菌種に帰属できる。
また、「ｕｎｍａｐ＿ＯＴＵ」に分類された６種の細菌種は全て、種レベル及び属レベルで既知の細菌種に帰属することはできなかったが、後述のクロストリジウム類の細菌種の系統樹解析の結果から、いずれもクロストリジウムクラスターＸＩＶａに属する細菌種に帰属できる。
同定された２１種のうち、２種（ｒｃｌｕｓｔ００４１０及びｒｃｌｕｓｔ０００５４）は、ＨＣ４０群と比較して、ＭＳ２０群で相対存在量が多く、残りの１９種は、ＨＣ４０群と比較して、ＭＳ２０群で相対存在量が少なかった（表５及び図７）。
同定された２１種のうち、４種はバクテロイデテス門に帰属され、１種はアクチノバクテリア門に帰属され、１種はプロテオバクテリア門に帰属され、１５種はフィルミクテス門に帰属された。
また、フィルミクテス門に帰属された１５種のうち、１４種はクロストリジウム類のクレード（単系統群）に帰属された。そこで、より詳細な帰属分類群を決定するため、これら１４種と、既知のクロストリジウム類の細菌種とで、１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列に基づく系統樹解析を行った。既知のクロストリジウム類の細菌種には、結腸でＴｒｅｇを誘導することが示されている１７菌種を含めた（非特許文献４参照。以下、「Ｓｔ細菌種」ともいう。）。
図１０は、クロストリジウム類の細菌種の系統樹解析の結果を示す図である。図１０中、既知の細菌種のうちＳｔ細菌種は、名前の頭に「Ｓｔ」を付した。本実施例で同定した１４種は、ＯＴＵ名又はクラスタ名で示している。図８に示すとおり、本実施例で同定した１４種のうち、１２種はクロストリジウムクラスターＸＩＶａに属し、２種はクロストリジウムクラスターＩＶに属していた。
また、興味深いことに、本実施例で同定した１４種には、１７種のＳｔ細菌種と系統樹上で近い位置にあるものは存在しなかった（図１０）。このことは、これらのサブセットにおける１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度（同一性）解析の結果からも裏付けられた（図１１）。図１１は、１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の類似度を解析した結果を示す図である。図１１中の数値は上に示した細菌種と左に示した細菌種との１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の同一性（％）を示す。例えば、Ｓｔ０１の直下にある７３という数字は、Ｓｔ０１とｒｃｌｕｓｔ００１０７との１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の同一性が７３％であることを示す。図１１に示すとおり、本実施例で同定した１４種と１７種のＳｔ細菌種は、１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列の同一性がいずれも９５％以下であった。なお、本実施例で同定した１４種は、いずれもＭＳ２０群で相対存在量が少なかった細菌種である。
同定された２１種の１６Ｓ ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ２領域の塩基配列を表６〜表８に示す。


［４．腸内細菌叢の長期観察］
同定された２１種の細菌種の相対存在量の有意差を評価するために、ＨＣ１８群について、２週間毎に９回回収した糞便試料を用いて、長期に亘る各細菌種の相対存在量の変化を分析した（以下、長期ＨＣ１８群という。）。図１２は、ＭＳ２０群と長期ＨＣ１８群との間での、細菌の相対存在量の差（Ｌｏｇ１０（ＭＳ２０群の平均リード数／長期ＨＣ１８群の平均リード数））を示す図である。図１２の縦軸は、細菌の相対存在量の差を示す。
図１２中、白丸（○）は、相対存在量の差が０以上であることを示し、長期ＨＣ１８群と比較して、ＭＳ２０群で相対存在量が多いことを意味する。他方、黒丸（●）は、相対存在量の差が０未満であることを示し、長期ＨＣ１８群と比較して、ＭＳ２０群で相対存在量が少ないことを意味する。図１２から明らかなように、同定された２１種の細菌種の相対存在量の差は、ＭＳ２０群とＨＣ４０群とを比較した場合と同じ傾向を示した。

Claims (8)

  1. 自己免疫疾患の診断方法であって、
    被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、
    以下の（１）又は（２）を実施するステップと、を備える、診断方法。
    （１）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して多い場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
    （２）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量が、健常人における当該相対存在量に比較して少ない場合、前記被験者は自己免疫疾患に罹患している、又は罹患する危険性が高いと判定する
  2. 自己免疫疾患の診断方法であって、
    治療前及び治療後に被験者から採取された糞便試料に含まれる細菌の相対存在量を測定するステップと、
    以下の（３）又は（４）を実施するステップと、を備える、診断方法。
    （３）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３又は４で特定される塩基配列と９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して少ない場合、前記被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する
    （４）１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する細菌の相対存在量を治療前後で比較して、治療後の当該相対存在量が治療前に比較して多い場合、前記被験者の自己免疫疾患の病態は治療により改善されたと判定する
  3. 細菌の相対存在量の測定が、糞便試料に含まれる細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を網羅的に解読することを含む、請求項１又は２に記載の診断方法。
  4. 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断方法。
  5. 前記多発性硬化症が、再発寛解型の多発性硬化症である、請求項４に記載の診断方法。
  6. １６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する腸内細菌からなる、自己免疫疾患の診断用バイオマーカー。
  7. １６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号３〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する腸内細菌の、自己免疫疾患の診断用バイオマーカーとしての使用。
  8. １６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列番号５〜２３で特定される塩基配列のいずれかと９９％以上の相同性を有する細菌、及び前記細菌に由来する生理活性物質からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
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