JPWO2016129322A1 - Liquid chromatography analysis method - Google Patents
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Abstract
本発明は、複数の分析用カラムおよび分析装置を用いず、疎水性化合物および親水性化合物を１本のカラムにて簡便に分析する液体クロマトグラフィー分析方法を提供することを課題とする。本発明は、水酸基を有するポリマー充填剤が充填された分析カラムを用いること、移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いること、および、前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることにより逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを切替え、親水性化合物および疎水性化合物を分析することを特徴とする液体クロマトグラフィー分析方法に関する。An object of the present invention is to provide a liquid chromatography analysis method for simply analyzing a hydrophobic compound and a hydrophilic compound with one column without using a plurality of analytical columns and analyzers. The present invention uses an analytical column packed with a polymer filler having a hydroxyl group, a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase, and a combination of the water-soluble organic solvent of the mobile phase and water. The present invention relates to a liquid chromatography analysis method characterized in that a hydrophilic compound and a hydrophobic compound are analyzed by switching a reverse phase chromatography mode and a hydrophilic interaction chromatography mode by changing a composition ratio.
Description
本発明は、親水性化合物および疎水性化合物を分析するための液体クロマトグラフィー分析方法に関する。 The present invention relates to a liquid chromatography analysis method for analyzing a hydrophilic compound and a hydrophobic compound.
医薬品、食品および化粧品などの有効成分もしくは不純物の同定または定量を行う方法として液体クロマトグラフィー法が用いられている。例えば分子量が２０００以下の有機化合物を分析する場合、該有機化合物の多くは、アセトニトリルおよびアルコール類等の水溶性有機溶媒に可溶である。そのため、従来、オクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）などの疎水性充填剤が充填された分析用カラムを用いて、前記有機化合物を逆相クロマトグラフィー法にて分析する方法が広く用いられている。 Liquid chromatography is used as a method for identifying or quantifying active ingredients or impurities such as pharmaceuticals, foods and cosmetics. For example, when analyzing an organic compound having a molecular weight of 2000 or less, most of the organic compound is soluble in water-soluble organic solvents such as acetonitrile and alcohols. Therefore, conventionally, a method of analyzing the organic compound by a reverse phase chromatography method using an analytical column packed with a hydrophobic filler such as octadecyl silica gel (ODS) has been widely used.
しかし、前記有機化合物には、上記の水溶性有機溶媒に可溶な化合物の他に、水酸基、アミノ基およびカルボキシル基等の極性官能基を有する親水性化合物も多く存在している。これらの親水性化合物は、逆相クロマトグラフィー法では、ほとんどカラム内にて保持および分離されずに溶出してしまう。 However, in addition to the above-mentioned compounds that are soluble in the water-soluble organic solvent, there are many hydrophilic compounds having polar functional groups such as hydroxyl groups, amino groups, and carboxyl groups. These hydrophilic compounds are eluted almost without being retained and separated in the column in the reverse phase chromatography method.
一方、親水性化合物の分析方法として、親水性相互作用クロマトグラフィー法が使用されている。この方法では、未修飾のシリカゲル、または、水酸基、アミノ基、アミド基、スルホ基、カルボキシル基、スルホベタイン基もしくはホスホリルコリン基などの置換基を導入した親水性充填剤を充填した分析用カラム（例えば、特許文献１）を用いる。これにより、逆相クロマトグラフィー法と同様の移動相を用いて溶出順を逆転させることができるため、親水性化合物を良好に保持して分離することができる。 On the other hand, hydrophilic interaction chromatography is used as a method for analyzing hydrophilic compounds. In this method, an analytical column packed with an unmodified silica gel or a hydrophilic filler into which a substituent such as a hydroxyl group, amino group, amide group, sulfo group, carboxyl group, sulfobetaine group or phosphorylcholine group is introduced (for example, Patent Document 1) is used. Thereby, since the elution order can be reversed using a mobile phase similar to the reverse phase chromatography method, the hydrophilic compound can be well retained and separated.
しかし、この方法では、芳香族化合物およびアルキル基を有する化合物などの疎水性の高い化合物がカラム内にて保持および分離されずに溶出してしまう。このため、親水性化合物および疎水性化合物を分析するためには、複数のカラムおよび装置を用いる必要があり、それぞれの分析条件の検討などが必要であった。 However, in this method, highly hydrophobic compounds such as aromatic compounds and compounds having an alkyl group are eluted without being held and separated in the column. For this reason, in order to analyze a hydrophilic compound and a hydrophobic compound, it is necessary to use a plurality of columns and apparatuses, and it is necessary to examine each analysis condition.
疎水性化合物および親水性化合物を連続分析するための方法として、逆相クロマトグラフィー用カラムと親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとを同時に用いる方法が提案されている（例えば、非特許文献１）。この方法では、まず、疎水性化合物および親水性化合物の混合物から疎水性化合物のみを逆相クロマトグラフィー用カラムを用いて分離して溶出させ、親水性化合物を親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムにトラップさせる。次に、親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム中の親水性化合物を分離して溶出させることができる。 As a method for continuously analyzing a hydrophobic compound and a hydrophilic compound, a method of simultaneously using a column for reverse phase chromatography and a column for hydrophilic interaction chromatography has been proposed (for example, Non-Patent Document 1). In this method, first, only a hydrophobic compound is separated and eluted from a mixture of a hydrophobic compound and a hydrophilic compound using a column for reverse phase chromatography, and the hydrophilic compound is trapped on a column for hydrophilic interaction chromatography. Let Next, the hydrophilic compound in the hydrophilic interaction chromatography column can be separated and eluted.
しかし、この方法は、２本のカラムが必要になること、配管系が複雑となること、高価な専用装置が必要となることなどから必ずしも簡便に分析できる方法とは言えない。そのため、より簡便に疎水性化合物および親水性化合物を分析できる方法が望まれている。 However, this method is not necessarily a method that allows simple analysis because two columns are required, the piping system is complicated, and an expensive dedicated device is required. Therefore, a method capable of analyzing a hydrophobic compound and a hydrophilic compound more easily is desired.
本発明は、複数の分析用カラムおよび分析装置を用いず、疎水性化合物および親水性化合物を１本のカラムにて簡便に分析する液体クロマトグラフィー分析方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a liquid chromatography analysis method for simply analyzing a hydrophobic compound and a hydrophilic compound with one column without using a plurality of analytical columns and analyzers.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、水酸基を有するポリマー充填剤が充填された分析カラムを用いて、水溶性有機溶媒および水からなる移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることにより、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを切替え、１本のカラムにて親水性化合物および疎水性化合物を簡便に分析する方法を見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have used a water-soluble organic solvent and a mobile phase water-soluble organic solvent composed of water using an analytical column packed with a polymer filler having a hydroxyl group. By switching the composition ratio between water and water, the method switches between reverse-phase chromatography mode and hydrophilic interaction chromatography mode, and finds a simple method for analyzing hydrophilic and hydrophobic compounds in one column. The present invention has been completed.
すなわち本発明は次の事項に関する。 That is, the present invention relates to the following matters.
［１］水酸基を有するポリマー充填剤が充填された分析カラムを用いること、
移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いること、および、
前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることにより逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを切替え、親水性化合物および疎水性化合物を分析すること
を特徴とする液体クロマトグラフィー分析方法。[1] using an analytical column packed with a polymer filler having a hydroxyl group;
Using a mixed solvent of water-soluble organic solvent and water as the mobile phase; and
By switching the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode by changing the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water of the mobile phase, the hydrophilic compound and the hydrophobic compound are analyzed. Liquid chromatography analysis method.
［２］前記ポリマー充填剤が、水酸基および水酸基に変換可能なエステル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基を有するモノマー（Ａ）を含む原料モノマーを重合させて得られるポリマーである、［１］に記載の液体クロマトグラフィー分析方法。 [2] The polymer filler is a polymer obtained by polymerizing a raw material monomer containing a monomer (A) having at least one substituent selected from the group consisting of a hydroxyl group and an ester group convertible to a hydroxyl group. The liquid chromatography analysis method according to [1].
［３]前記モノマー（Ａ）が、ヒドロキシ（メタ）アクリレートまたはカルボン酸ビニルエステルである、［２］に記載の液体クロマトグラフィー分析方法。 [3] The liquid chromatography analysis method according to [2], wherein the monomer (A) is hydroxy (meth) acrylate or carboxylic acid vinyl ester.
［４］前記ポリマー充填剤が、ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる、［１］〜［３］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析方法。 [4] The liquid chromatography analysis method according to any one of [1] to [3], wherein the polymer filler is made of a polyhydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin.
［５］前記ポリマー充填剤１ｇあたりの水酸基の含有量が０．１〜１０ｍｍｏｌである、［１］〜［４］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析方法。 [5] The liquid chromatography analysis method according to any one of [1] to [4], wherein the hydroxyl group content per 1 g of the polymer filler is 0.1 to 10 mmol.
［６］前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を体積比で５：９５〜９５：５の範囲内で変える、［１］〜［５］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析方法。 [6] The liquid chromatography according to any one of [1] to [5], wherein the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water in the mobile phase is changed within a range of 5:95 to 95: 5 by volume ratio. Analysis method.
［７］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［６］のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー分析方法。 [7] The water-soluble organic solvent according to any one of [1] to [6], wherein the water-soluble organic solvent is at least one selected from the group consisting of acetonitrile, methyl alcohol, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, acetone, methyl ethyl ketone, and tetrahydrofuran. Liquid chromatography analysis method.
本発明の液体クロマトグラフィー分析方法は、水溶性有機溶媒および水からなる移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることで、複数の分析用カラムおよび分析装置を使用することなく、各種親水性化合物および疎水性化合物を連続的にもしくは不連続的に分離して溶出させることができるため、医薬品、化粧品、食品、環境、農業、医療および工業材料等の幅広い分野に有用であり、特に、医薬品、食品および化粧品などの有効成分もしくは不純物の同定または定量を行う方法として有用である。 In the liquid chromatography analysis method of the present invention, the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water in the mobile phase composed of the water-soluble organic solvent and water is changed, without using a plurality of analytical columns and analyzers. Since various hydrophilic compounds and hydrophobic compounds can be eluted continuously or discontinuously, they are useful in a wide range of fields such as pharmaceuticals, cosmetics, food, environment, agriculture, medicine and industrial materials, It is particularly useful as a method for identifying or quantifying active ingredients or impurities such as pharmaceuticals, foods and cosmetics.
以下、本発明をさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
本発明の液体クロマトグラフィー分析方法は、水酸基を有するポリマー充填剤が充填された分析用カラムを用いること、移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いること、および、前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることにより逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを切替え、親水性化合物および疎水性化合物を分析することを特徴とする。以下、本明細書では、「水酸基を有するポリマー充填剤」のことを単に「ポリマー充填剤」ともいう。 The liquid chromatography analysis method of the present invention uses an analytical column packed with a polymer filler having a hydroxyl group, uses a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase, and dissolves the mobile phase in water. By switching the composition ratio between the hydrophilic organic solvent and water, the reversed phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode are switched to analyze the hydrophilic compound and the hydrophobic compound. Hereinafter, in this specification, the “polymer filler having a hydroxyl group” is also simply referred to as “polymer filler”.
本発明の液体クロマトグラフィー分析方法は、移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることで、複数の分析用カラムおよび分析装置を用いることなく、親水性化合物および疎水性化合物を分離して溶出させ、分析することが可能な方法である。 The liquid chromatography analysis method of the present invention separates a hydrophilic compound and a hydrophobic compound without using a plurality of analytical columns and analyzers by changing the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water of the mobile phase. It is a method that can be eluted and analyzed.
前記親水性化合物および疎水性化合物は、化合物の骨格および官能基などの構造に制約はないが、分子量が２０００以下の有機化合物であることが好ましく、水、または、アセトニトリルおよびアルコール類などの水溶性有機溶媒に可溶であることが好ましく、紫外吸光度検出器および示差屈折率検出器等の液体クロマトグラフィー用検出器にて検出可能な化合物であることが好ましい。 The hydrophilic compound and the hydrophobic compound are not limited in structure such as the skeleton and functional group of the compound, but are preferably organic compounds having a molecular weight of 2000 or less, and are water-soluble or water-soluble such as acetonitrile and alcohols. The compound is preferably soluble in an organic solvent, and is preferably a compound that can be detected by a liquid chromatography detector such as an ultraviolet absorbance detector or a differential refractive index detector.
本発明の液体クロマトグラフィー分析方法は、例えば、１回目の試料注入にて逆相クロマトグラフィーモードにおいて疎水性化合物を分離して溶出させた後、親水性相互作用クロマトグラフィーモードに切替えて、１回目の試料注入を行ったカラムと同じ分析カラムを用いて２回目の試料注入にて親水性化合物を分離して溶出させる方法である。ここで、逆相クロマトグラフィーモードとは、通常、移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いた際に、前記混合溶媒の水の比率を高くして、親水性の高い成分から順に溶出させるモードをいう。対して、親水性相互作用クロマトグラフィーモードとは、通常、前記混合溶媒の水溶性有機溶媒の比率を高くして、極性の低い成分から順に溶出させるモードをいう。なお、本発明では、逆相クロマトグラフィーモードを発現させた後に親水性相互作用クロマトグラフィーモードへ切替えてもよく、反対に、親水性相互作用クロマトグラフィーモードを発現させた後に逆相クロマトグラフィーモードへ切替えてもよい。逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとの切替えは移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることで容易に行うことができる。また、分析中に単一移動相を用いるイソクラティック法および水溶性有機溶媒比率に勾配を設けるグラジエント法のいずれにおいても分析が可能である。逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードの切替えは、イソクラティック法では、例えば、逆相クロマトグラフィーモードで用いる移動相を送液している送液ポンプを停止し、送液する移動相を親水性相互作用クロマトグラフィーモードで用いる移動相に交換して、再度送液ポンプを作動させることで完了し、グラジエント法では、例えば、分析時間を設定しその時間内で逆相クロマトグラフィーモードで用いる移動相の組成比率から親水性相互作用クロマトグラフィーモードで用いる移動相の組成比率へと一定の勾配によって変えることで完了する。１回の分析中に移動相の切替えを完了させることができる点ではグラジエント法が好ましく、移動相の調整の簡易性という観点ではイソクラティック法が好ましい。 In the liquid chromatography analysis method of the present invention, for example, after the hydrophobic compound is separated and eluted in the reverse phase chromatography mode in the first sample injection, the hydrophilic interaction chromatography mode is switched to the first time. This is a method in which the hydrophilic compound is separated and eluted in the second sample injection using the same analytical column as that in which the sample was injected. Here, the reverse phase chromatography mode usually means that when a mixed solvent of water-soluble organic solvent and water is used as a mobile phase, the ratio of water in the mixed solvent is increased, and the components having higher hydrophilicity are sequentially ordered. The mode to elute. On the other hand, the hydrophilic interaction chromatography mode usually refers to a mode in which the ratio of the water-soluble organic solvent in the mixed solvent is increased and the components having a low polarity are eluted in order. In the present invention, the reverse-phase chromatography mode may be developed and then switched to the hydrophilic interaction chromatography mode. Conversely, the hydrophilic interaction chromatography mode may be developed and then the reverse-phase chromatography mode may be switched. It may be switched. Switching between the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode can be easily performed by changing the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water of the mobile phase. The analysis can be carried out by either an isocratic method using a single mobile phase during the analysis or a gradient method in which a gradient is provided in the water-soluble organic solvent ratio. Switching between reverse-phase chromatography mode and hydrophilic interaction chromatography mode is performed by isocratic method, for example, by stopping the liquid-feed pump that feeds the mobile phase used in reverse-phase chromatography mode and feeding the liquid. It is completed by exchanging the mobile phase with the mobile phase used in the hydrophilic interaction chromatography mode and operating the liquid feed pump again. In the gradient method, for example, the analysis time is set and the reverse phase chromatography is performed within that time. It is completed by changing the composition ratio of the mobile phase used in the mode to the composition ratio of the mobile phase used in the hydrophilic interaction chromatography mode with a certain gradient. The gradient method is preferable in that the switching of the mobile phase can be completed during one analysis, and the isocratic method is preferable in terms of ease of adjustment of the mobile phase.
上記のように分析モードの切り替えによって、逆相クロマトグラフィーモードおよび親水性相互作用クロマトグラフィーモードの両方の分析を連続的に行うことができる。ここで分析を連続的に行うとは、同一の分析カラムを使用して同一の試料を異なる分析モードで連続して分析することを意味し、１回の分析の間に分析モードが切り替わる場合と１回毎に分析モードを切り替える場合の両方が含まれる。 By switching the analysis mode as described above, both the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode can be continuously analyzed. Here, continuous analysis means that the same sample is continuously analyzed in different analysis modes using the same analysis column, and the analysis mode is switched during one analysis. Both cases of switching the analysis mode every time are included.
本発明で使用する水酸基を有するポリマー充填剤は、水酸基および水酸基に変換可能なエステル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基を有するモノマー（Ａ）を含む原料モノマーを重合させて得られるポリマーであることが好ましい。 The polymer filler having a hydroxyl group used in the present invention is obtained by polymerizing a raw material monomer containing a monomer (A) having at least one substituent selected from the group consisting of a hydroxyl group and an ester group convertible into a hydroxyl group. A polymer is preferred.
本願においてエステル基とは、エステル結合を含む官能基であり、Ｒ−ＣＯＯ−もしくは−ＣＯＯＲ'で表すことができる。但し、ＲとＲ'は、炭化水素基である。 In this application, an ester group is a functional group containing an ester bond, and can be represented by R—COO— or —COOR ′. However, R and R ′ are hydrocarbon groups.
また、水酸基に変換可能なエステル基とは、エステル交換反応やケン化によって当該エステル基が水酸基に変換され得ることを意味する。 The ester group that can be converted into a hydroxyl group means that the ester group can be converted into a hydroxyl group by transesterification or saponification.
前記モノマー（Ａ）としては、例えば、ヒドロキシ（メタ）アクリレートおよびカルボン酸ビニルエステルが挙げられる。 Examples of the monomer (A) include hydroxy (meth) acrylate and carboxylic acid vinyl ester.
ここで（メタ）アクリレートとは、メタクリレート及びアクリレートから選ばれる少なくとも１つを意味する。 Here, (meth) acrylate means at least one selected from methacrylate and acrylate.
前記ヒドロキシ（メタ）アクリレートとしては、例えば、１個以上のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個以上の水酸基とから構成されるヒドロキシ（メタ）アクリレートが挙げられ、具体的には、グリセリンジメタクリレート、グリセリンモノメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシブチルメタクリレートおよび２−ヒドロキシ-３-アクリロイルオキシプロピルメタクリレートが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。これらの中でも、得られるポリマー充填剤の粒径を小さくでき、液体クロマトグラフィー用充填剤としての強度、高性能化を図れるなどの点で、グリセリンジメタクリレートの単独重合体が特に好ましい。 Examples of the hydroxy (meth) acrylate include hydroxy (meth) acrylate composed of one or more ethylenic carbon-carbon double bonds and one or more hydroxyl groups. Methacrylate, glycerin monomethacrylate, 2-hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxybutyl methacrylate and 2-hydroxy-3-acryloyloxypropyl methacrylate. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, a glycerin dimethacrylate homopolymer is particularly preferable in that the particle size of the obtained polymer filler can be reduced, and the strength and performance of the liquid chromatography filler can be improved.
前記カルボン酸ビニルエステルとしては、例えば酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニルおよびピバリン酸ビニルが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。これらの中でも、酢酸ビニルおよびプロピオン酸ビニルが、比較的親水性が高く重合およびケン化が容易であるので好ましい。そして、これらのモノマーを重合して得られる重合体は、ケン化等によってエステル基を水酸基に変換させることができる。 Examples of the carboxylic acid vinyl ester include vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl butyrate, vinyl valerate, and vinyl pivalate. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, vinyl acetate and vinyl propionate are preferable because they are relatively hydrophilic and easy to polymerize and saponify. And the polymer obtained by superposing | polymerizing these monomers can convert an ester group into a hydroxyl group by saponification etc.
前記ポリマー充填剤としては、ヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂を用いることが望ましい。 As the polymer filler, it is desirable to use a hydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin.
前記ヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂としては、例えば、前記ヒドロキシ（メタ）アクリレートを含む原料モノマーの重合体が挙げられる。 Examples of the hydroxy (meth) acrylate resin include polymers of raw material monomers containing the hydroxy (meth) acrylate.
前記ポリビニルアルコール系樹脂としては、例えば、前記カルボン酸ビニルエステルと架橋性単量体から構成される架橋共重合体のエステル基をケン化またはエステル交換反応によってアルコール性水酸基に変換した樹脂が挙げられる。前記架橋性単量体としては、例えば、トリアリルイソシアヌレートが挙げられる。 Examples of the polyvinyl alcohol resin include a resin obtained by converting an ester group of a crosslinked copolymer composed of the carboxylic acid vinyl ester and a crosslinkable monomer into an alcoholic hydroxyl group by saponification or transesterification. . Examples of the crosslinkable monomer include triallyl isocyanurate.
前記ポリマー充填剤には、任意の割合で水酸基以外のアミノ基、スルホ基およびカルボキシル基等のイオン性官能基を導入することもできる。 An ionic functional group such as an amino group other than a hydroxyl group, a sulfo group, and a carboxyl group can be introduced into the polymer filler at an arbitrary ratio.
前記ポリマー充填剤は、水酸基の含有量が前記ポリマー充填剤１ｇあたり０．１〜１０ｍｍｏｌであることが好ましく、０．５〜８ｍｍｏｌであることがより好ましく、１〜５ｍｍｏｌであることが特に好ましい。前記水酸基は、モノマー（Ａ）に含有されている水酸基でもよく、モノマー（Ａ）またはポリマーに含有されているエステル基を変換した水酸基でもよく、ポリマー中の水酸基などを介して新たに導入した複数の水酸基でもよい。水酸基の含有量が前記ポリマー充填剤１ｇあたり１０ｍｍｏｌを超えると、前記ポリマー充填剤の親水性が強すぎてしまい、逆相クロマトグラフィーモードによる化合物の分離および保持が不十分となることがある。一方、水酸基の含有量が前記ポリマー充填剤１ｇあたり１ｍｍｏｌ未満であると、前記ポリマー充填剤の親水性が弱くなり、親水性相互作用クロマトグラフィーモードが作用しなくなることがある。 The polymer filler preferably has a hydroxyl group content of 0.1 to 10 mmol, more preferably 0.5 to 8 mmol, and particularly preferably 1 to 5 mmol per 1 g of the polymer filler. The hydroxyl group may be a hydroxyl group contained in the monomer (A), a hydroxyl group obtained by converting an ester group contained in the monomer (A) or the polymer, or a plurality of newly introduced hydroxyl groups in the polymer. May be a hydroxyl group. When the hydroxyl group content exceeds 10 mmol per 1 g of the polymer filler, the hydrophilicity of the polymer filler is too strong, and the separation and retention of the compound in the reverse phase chromatography mode may be insufficient. On the other hand, when the content of the hydroxyl group is less than 1 mmol per 1 g of the polymer filler, the hydrophilicity of the polymer filler becomes weak and the hydrophilic interaction chromatography mode may not work.
前記ポリマー充填剤の形状は、充分な分離性能および高感度を有し、１〜３０ＭＰａの圧力に耐え得る強度を得るために、体積平均粒径が１〜３０μｍの球状が好ましく、３〜１０μｍの球形がさらに好ましい。本願における上記の体積平均粒径は、コールターカウンター法を用いて次のように測定される。すなわち、測定装置としてＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４（ベックマン・コールター社製）を用い、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを加え、超音波を３分間当てて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒径を測定する。体積平均粒径を好ましい範囲とするには、風力分級、ふるい分けによる分級、沈殿を利用した分級等で制御できる。 The shape of the polymer filler is preferably a sphere having a volume average particle diameter of 1 to 30 μm, preferably 3 to 10 μm in order to obtain sufficient strength to withstand separation pressure and high sensitivity and withstand pressure of 1 to 30 MPa. A spherical shape is more preferable. The volume average particle diameter in the present application is measured as follows using a Coulter counter method. That is, using Multisizer 4 (manufactured by Beckman Coulter, Inc.) as a measuring device, adding 25 mL of isotone (diluted solution) to 0.2 g of the polymer filler, applying ultrasonic waves for 3 minutes to disperse, and then measuring about 1000 measurements The volume average particle diameter is measured by the number. In order to make the volume average particle size within a preferable range, it can be controlled by air classification, classification by sieving, classification using precipitation, or the like.
本発明で用いる移動相として、水および水溶性有機溶媒の混合溶媒が用いられる。水溶性有機溶媒としては、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、および、テトラヒドロフラン等のエーテル類などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。 As the mobile phase used in the present invention, a mixed solvent of water and a water-soluble organic solvent is used. Examples of the water-soluble organic solvent include alcohols such as acetonitrile, methyl alcohol, ethyl alcohol, and isopropyl alcohol, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, and ethers such as tetrahydrofuran. These may be used alone or in combination of two or more.
前記ポリマー充填剤を使用して、移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を調節することで、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードを切替えることができる。移動相は分析対象に応じて適宜選択することができるが、通常、水溶性有機溶媒の組成比率（体積比）として５０〜７０％に境界があり、その境界よりも低くすると逆相クロマトグラフィーモードが、高くすると親水性相互作用クロマトグラフィーモードが発現する。前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率（体積比）は、通常、１：９９〜９９：１、好ましくは５：９５〜９５：５の範囲内で変えることができる。 By using the polymer filler, the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode can be switched by adjusting the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water of the mobile phase. The mobile phase can be appropriately selected according to the analysis target. Usually, the composition ratio (volume ratio) of the water-soluble organic solvent has a boundary at 50 to 70%, and if it is lower than the boundary, the reverse phase chromatography mode However, when it is high, a hydrophilic interaction chromatography mode is developed. The composition ratio (volume ratio) of the water-soluble organic solvent and water in the mobile phase can be changed usually in the range of 1:99 to 99: 1, preferably 5:95 to 95: 5.
疎水性化合物の分離および溶出には逆相クロマトグラフィーモードが用いられ、逆相クロマトグラフィーモードでの水溶性有機溶媒と水との組成比率（体積比）は、通常、１：９９〜７０：３０であり、１：９９〜５０：５０とすることが好ましく、５：９５〜５０：５０とすることがさらに好ましく、１０：９０〜５０：５０とすることが特に好ましい。また、親水性化合物の分離および溶出には親水性相互作用クロマトグラフィーモードが用いられ、親水性相互作用クロマトグラフィーモードでの水溶性有機溶媒と水との組成比率（体積比）は、通常、５０：５０〜９９：１であり、６０：４０〜９９：１とすることが好ましく、７０：３０〜９５：５とすることがさらに好ましく、７５：２５〜９５：５とすることが特に好ましい。 The reverse phase chromatography mode is used for separation and elution of the hydrophobic compound, and the composition ratio (volume ratio) of the water-soluble organic solvent to water in the reverse phase chromatography mode is usually 1:99 to 70:30. It is preferably 1:99 to 50:50, more preferably 5:95 to 50:50, and particularly preferably 10:90 to 50:50. The hydrophilic interaction chromatography mode is used for separation and elution of the hydrophilic compound, and the composition ratio (volume ratio) of the water-soluble organic solvent and water in the hydrophilic interaction chromatography mode is usually 50. : 50 to 99: 1, preferably 60:40 to 99: 1, more preferably 70:30 to 95: 5, and particularly preferably 75:25 to 95: 5.
また、移動相には、親水性レベルおよび試料の保持時間を調整する目的で、任意の割合でギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどを添加することもできる。 In addition, ammonium formate, ammonium acetate, or the like can be added to the mobile phase at an arbitrary ratio for the purpose of adjusting the hydrophilic level and the retention time of the sample.
本発明で用いるカラムは、前記ポリマー充填剤が充填されたものであり、ハウジングの材質およびサイズに特に制限はないが、材質は、一般的に、液体クロマトグラフィー用ハウジングとして用いられているステンレスまたはポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂製が好ましく、サイズはより高分離および高感度に分析を行うために内径１．０〜４．６ｍｍ、長さ１００〜２５０ｍｍとすることが好ましい。 The column used in the present invention is filled with the polymer filler, and the material and size of the housing are not particularly limited, but the material is generally stainless steel or a housing used for liquid chromatography. A polyether ether ketone (PEEK) resin is preferable, and the size is preferably set to an inner diameter of 1.0 to 4.6 mm and a length of 100 to 250 mm in order to perform analysis with higher separation and higher sensitivity.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited at all by these Examples.
［実施例１］
ポリマー充填剤として、グリセリンジメタクリレートを単独重合して得られたヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂（粒子径５μｍ）を用いた。ピリジン３３ｍｌ中、前記樹脂２．５ｇと無水酢酸１７ｍｌとを９０℃の加熱下で１６時間撹拌して反応させ、その反応量から前記樹脂中の水酸基量を測定した。その結果、樹脂中の水酸基量は樹脂１ｇあたり２．０ｍｍｏｌであった。[Example 1]
As a polymer filler, hydroxy (meth) acrylate resin (
液体クロマトグラフとしてＮｅｘｅｒａ（島津製作所（株）製）を用い、カラムとして前記樹脂を内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスハウジングに充填したカラムを用い、検出器には紫外検出器（ＵＶ、波長：２５４ｎｍ）を用いた。分析条件は、カラム温度を４０℃、移動相の流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。 Nexera (manufactured by Shimadzu Corporation) is used as a liquid chromatograph, a column packed with a stainless steel housing with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 150 mm is used as a column, and an ultraviolet detector (UV, wavelength) is used as a detector. : 254 nm). The analysis conditions were a column temperature of 40 ° C. and a mobile phase flow rate of 1.0 ml / min.
まず初めに、移動相としてアセトニトリル：水＝４０：６０（体積比）を用いて、シチジン、ウリジン、ウラシル、トルエンおよびナフタレンの混合試料について逆相クロマトグラフィーモードで分析を行った。得られたクロマトグラムを図１に示す。シチジン、ウリジンおよびウラシル、トルエン、ナフタレンの順番で試料が溶出し、疎水性の高い、トルエンおよびナフタレンが良好に保持されて分離された。尚、シチジン、ウリジンおよびウラシルは保持時間において明確な有意差はなく、共にほとんど保持されなかった。 First, a mixed sample of cytidine, uridine, uracil, toluene and naphthalene was analyzed in a reverse phase chromatography mode using acetonitrile: water = 40: 60 (volume ratio) as a mobile phase. The obtained chromatogram is shown in FIG. The sample was eluted in the order of cytidine, uridine and uracil, toluene and naphthalene, and the highly hydrophobic toluene and naphthalene were well retained and separated. In addition, cytidine, uridine and uracil did not have a clear significant difference in retention time, and were hardly retained.
次に、移動相をアセトニトリル：水＝９０：１０（体積比）に切替えて、上記と同様にシチジン、ウリジン、ウラシル、トルエンおよびナフタレンの混合試料の分析を親水性相互作用クロマトグラフィーモードで行った。 Next, the mobile phase was changed to acetonitrile: water = 90: 10 (volume ratio), and analysis of the mixed sample of cytidine, uridine, uracil, toluene and naphthalene was performed in the hydrophilic interaction chromatography mode in the same manner as described above. .
得られたクロマトグラムを図２に示す。移動相としてアセトニトリル：水＝４０：６０（体積比）を用いたときと溶出順序は逆転し、ナフタレンおよびトルエン、ウラシル、ウリジン、シチジンの順に溶出した。親水性の高い、シチジン、ウリジンおよびウラシルが良好に保持されて分離された。尚、ナフタレンおよびトルエンは保持時間において明確な有意差はなく、共にほとんど保持されなかった。 The obtained chromatogram is shown in FIG. The elution order was reversed when acetonitrile: water = 40: 60 (volume ratio) was used as the mobile phase, and elution was performed in the order of naphthalene, toluene, uracil, uridine, and cytidine. The highly hydrophilic cytidine, uridine and uracil were well retained and separated. Naphthalene and toluene had no clear significant difference in retention time, and both were hardly retained.
［比較例１］
ポリマー充填剤として、ヒドロキシ（メタ）アクリレート樹脂の代わりに水酸基を有さないエチレングリコールジメタクリレートを単独重合して得られる（メタ）アクリレート樹脂（粒子径５μｍ）を用いた。[Comparative Example 1]
As the polymer filler, a (meth) acrylate resin (particle diameter: 5 μm) obtained by homopolymerizing ethylene glycol dimethacrylate having no hydroxyl group was used instead of the hydroxy (meth) acrylate resin.
実施例１に記載の液体クロマトグラフ、検出器および分析条件を用い、カラムとして前記樹脂を内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレスハウジングに充填したカラムを用い、移動相としてアセトニトリル：水＝４０：６０（体積比）を用いて、シチジン、ウリジン、ウラシル、トルエンおよびナフタレンの混合試料について分析した。次に、移動相をアセトニトリル：水＝９０：１０（体積比）に切替えて、上記と同様にシチジン、ウリジン、ウラシル、トルエンおよびナフタレンの混合試料について分析を行った。それぞれの移動相で得られたクロマトグラムを図３および図４に示す。移動相を切替えても溶出順序は変わらず、いずれの移動相を用いても、シチジン、ウリジンおよびウラシル、トルエン、ナフタレンの順番で溶出した。また、いずれの移動相を用いても、親水性の高い化合物であるシチジン、ウリジンおよびウラシルの保持および分離が不十分であった。 Using the liquid chromatograph, detector, and analysis conditions described in Example 1, a column in which the resin was packed in a stainless steel housing with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 150 mm was used as a column, and acetonitrile: water = 40: as a mobile phase. A mixed sample of cytidine, uridine, uracil, toluene and naphthalene was analyzed using 60 (volume ratio). Next, the mobile phase was switched to acetonitrile: water = 90: 10 (volume ratio), and analysis was performed on a mixed sample of cytidine, uridine, uracil, toluene and naphthalene in the same manner as described above. The chromatograms obtained with each mobile phase are shown in FIG. 3 and FIG. Even if the mobile phase was switched, the elution order did not change, and any mobile phase was used for elution in the order of cytidine, uridine and uracil, toluene, and naphthalene. In addition, no matter which mobile phase was used, cytidine, uridine and uracil, which are highly hydrophilic compounds, were not sufficiently retained and separated.
１ シチジンのピーク
２ ウリジンのピーク
３ ウラシルのピーク
４ トルエンのピーク
５ ナフタレンのピーク1 Peak of
Claims (7)
移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いること、および、
前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることにより逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを切替え、親水性化合物および疎水性化合物を分析すること
を特徴とする液体クロマトグラフィー分析方法。Using an analytical column packed with a polymer filler having a hydroxyl group,
Using a mixed solvent of water-soluble organic solvent and water as the mobile phase; and
By switching the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode by changing the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water of the mobile phase, the hydrophilic compound and the hydrophobic compound are analyzed. Liquid chromatography analysis method.
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