JPWO2014188775A1 - アンドロゲンレセプター活性依存性乳癌細胞株の作製方法、当該細胞株を用いたスクリーニング方法、ならびに乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の判定方法、キット及びマーカー - Google Patents

アンドロゲンレセプター活性依存性乳癌細胞株の作製方法、当該細胞株を用いたスクリーニング方法、ならびに乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の判定方法、キット及びマーカー Download PDF

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Abstract

本発明が解決すべき課題は、従来のホルモン療法耐性機序とは全く異なる新規の耐性機序を有する細胞株を提供すること、当該細胞株を用いたスクリーニング方法を提供すること、及び乳癌患者がかかる耐性機序を獲得してしまったか否かを判定する方法を提供することである。本発明は、Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞を、エストロゲンを枯渇させた培地で、かつアンドロゲンの存在下で培養する工程を含む、アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞の作製方法、当該乳癌細胞を用いたスクリーニング方法、ならびにＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを指標とする、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定する方法及びキットを提供する。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年５月２３日に出願された、日本国特許出願第２０１３−１０８７７４号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、ホルモン療法耐性乳癌細胞株の作製方法、当該細胞株を用いた乳癌治療剤のスクリーニング方法及び乳癌患者におけるホルモン療法耐性獲得の判定方法、キット及びマーカーに関する。
エストロゲンは、乳癌の発生及び増殖に深く関係する女性ホルモンであり、乳癌細胞の多くはエストロゲン依存性に増殖するホルモン依存性腫瘍である。乳癌細胞がエストロゲンを受容すると、エストロゲンレセプター（ＥＲ）を介して細胞増殖に関わるシグナル伝達系が活性化され、細胞増殖が促進されて癌が進展する。
乳癌患者の７０％以上の乳癌はエストロゲンレセプター（ＥＲ)陽性であり、ホルモン療法の治療対象である。
乳癌治療薬としてのホルモン剤は、大きく、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ラロキシフェン等のエストロゲンレセプターの阻害作用を示す薬剤（抗エストロゲン剤）；及びアナストロゾール、レトロゾール、エグゼメスタン等のエストロゲン合成酵素であるアロマターゼを阻害する薬剤（アロマターゼ阻害剤（ＡＩ））の２種類に分類される。
しかし、これらの薬剤はいずれも、やがて耐性を獲得されてしまうという問題がある。ホルモン療法を受けた乳癌患者のうち１／３は、癌がホルモン治療に耐性を獲得し、再発する。再発後は、化学療法が行われるが、予後が不良であり、治療が困難である。したがって、ホルモン療法耐性の獲得が、臨床上、重大な問題となっており、耐性機序の解明と新たな治療方法が望まれている。
かかる状況の下、本発明者は、既に、下記５種類のホルモン療法耐性乳癌細胞株の樹立している：
エストロゲン非依存性、かつ、エストロゲンレセプター（ＥＲ)活性依存性である細胞株（タイプ１）、
エストロゲン非依存性、かつ、ＥＲ活性非依存性である細胞株（タイプ２）、
エストロゲン非依存性、ＥＲ活性非依存性、かつ、成長因子（ＧＦ）依存性であり、ＨＥＲ２及び上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を発現する細胞株（タイプ３）、
アンドロゲン代謝産物依存性である細胞株（タイプ４）、及び／又は
アロマターゼ阻害剤（ＡＩ）非感受性、かつ、ＥＲ活性依存性である細胞株（タイプ５）
（特許文献１）。
特開２０１３−１７４１４
本発明は、従来のホルモン療法耐性機序とは全く異なる新規の耐性機序を有する細胞株を提供すること、当該細胞株を用いたホルモン療法耐性乳癌細胞に対する治療剤のスクリーニング方法を提供すること、及び乳癌患者がかかる耐性機序を獲得してしまったか否かを判定する方法を提供することを課題とする。
上記の状況の下、本発明者らは、種々の培養条件でホルモン療法耐性乳癌細胞株の樹立を試みたところ、親細胞としてＴ４７Ｄ−ＴＥ８細胞を用い、これをアンドロゲンを添加したエストロゲン枯渇培地で培養すると、意外にも当該細胞株がアンドロゲンレセプター（ＡＲ）活性依存性を獲得することを見出した。また、当該ＡＲ依存性獲得株の遺伝子発現を解析したところ、ＡＲ依存性を獲得した上記細胞株においてＰＳＡ（ＫＬＫ３）、ＤＤＣ及びＡＲの発現量が有意に増加していることを見出した。本発明はこれらの新規の知見に基づくものである。
従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを指標とする、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定する方法。
項２．乳癌患者が女性患者である、請求項１に記載の方法。
項３．ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの発現量を測定する手段を含む、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定するためのキット。
項４．乳癌患者が女性患者である、請求項３に記載のキット。
項５．ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを含む、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定するためのマーカー。
項６．乳癌患者が女性患者である、項５に記載のマーカー。
項７．ホルモン療法に耐性を示す乳癌に対する治療剤をスクリーニングする方法であって、ホルモン療法耐性乳癌細胞に被験物質を接触させる工程と、この細胞を培養し、細胞の増殖及び／又はアンドロゲンレセプター活性を測定する工程と、前記被検物質と接触させていない前記ホルモン療法耐性乳癌細胞を同じ条件下で培養及び測定した結果と比較して前記被検物質が細胞の増殖及び／又はＡＲ活性の低下をもたらしたか否かを判定する工程とを含み、
前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、エストロゲン非依存性、エストロゲンレセプター活性非依存性、かつアンドロゲンレセプター活性依存性である細胞株である、方法。
項８．Ｔ４７Ｄ細胞を、エストロゲンを枯渇させた培地で、かつアンドロゲンの存在下で培養する工程を含む、アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞の作製方法。
項９．Ｔ４７Ｄ細胞を、エストロゲンを枯渇させた培地で、かつアンドロゲンの存在下で培養する工程を含む方法により得られる、アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞株。
本発明によれば、従来のホルモン療法耐性機序とは全く異なる新規の耐性機序を有する細胞株を提供すること、及び当該細胞株を用いたホルモン療法耐性乳癌細胞に対する治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。また、本発明によれば、ホルモン療法により乳癌患者がアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得たか否かを判定することができる。
実施例におけるエストロゲン存在下でのT47D-TE8、A3T及びB4Tの細胞増殖試験の結果を示す。 実施例におけるT47D-TE8、A3T及びB4TのER活性測定結果を示す。 実施例でのウエスタンブロッティングの結果（ＥＲ）を示す。 実施例におけるリアルタイムRT-PCRによるER発現量の測定結果を示す。 実施例におけるアンドロゲン存在下でのT47D-TE8、A3T及びB4Tの細胞増殖試験の結果を示す。 実施例におけるT47D-TE8、A3T及びB4TのAR活性測定結果を示す。 実施例におけるT47D-TE8、A3T及びB4TのER活性測定結果を示す。 実施例でのウエスタンブロッティングの結果（AR及びPSA）を示す。 実施例におけるリアルタイムRT-PCRによるAR及びKLK3発現量の測定結果を示す。 実施例におけるリアルタイムRT-PCRによるDDC発現量の測定結果を示す。 実施例におけるDHT存在下でのT47D-TE8、A3T及びB4Tの細胞増殖試験の結果を示す。 ＫＬＫ３遺伝子の塩基配列を示す。 ＤＤＣ遺伝子の塩基配列を示す。 ＡＲ遺伝子の塩基配列を示す。
アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞の作製方法
本発明は、Ｔ４７Ｄ細胞を、エストロゲンを枯渇させた培地で、かつアンドロゲンの存在下で培養する工程を含む、アンドロゲンレセプター依存性（アンドロゲンレセプター活性依存性）の乳癌細胞の作製方法を提供する。
本発明において親細胞として用いるＴ４７Ｄ株は、ヒト乳癌細胞株であり、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３３で寄託されている。本発明において、「Ｔ４７Ｄ細胞」には、本発明の効果を棄損しない限りにおいて、Ｔ４７Ｄ株を形質転換したものも含まれる。例えば、本発明において、Ｔ４７Ｄ細胞には、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ）の下流にレポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を含むベクターを用い、公知の方法（Yamaguchi Y. et al., Cancer Res, 2005, 65: 4653-4662）で上記Ｔ４７Ｄ株を形質転換したＴ４７Ｄ−ＴＥ８細胞等も含まれる。
本発明における培養工程で用いるエストロゲンを枯渇させた培地としては、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清として事前にエストロゲンを除去したものを培地に添加したものを示す。本発明において、エストロゲンを枯渇させた培地で培養するとは、上記のようにエストロゲンを除去した培地に細胞を添加して培養することを意味する。上記のような培地を用いていれば、細胞中に元々微量のエストロゲンが含まれていたり、または培養中に細胞により微量のエストロゲンが生成されても、本発明におけるエストロゲンを枯渇させた培地での培養に該当する。本発明においては、Ｔ４７Ｄ細胞はアンドロゲンの存在下で培養することを特徴とする。アンドロゲンとしては、特に限定されないが、テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン等を挙げることができ、テストステロンが好ましい。アンドロゲンの濃度としては特に限定されないが、例えば、5〜500ｎＭ、好ましくは10〜300ｎＭ、より好ましくは50〜150ｎＭの範囲で適宜設定できる。
培地の種類は、エストロゲンが枯渇しており、かつアンドロゲンが存在している限り特に限定されず、乳癌細胞の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、RPMI1640培地等が挙げられる。また、上記培地には、抗生物質等の所定の添加物を加えてもよい。培養温度は特に限定されず、36.5〜38.0℃、より好ましくは37.0〜37.5℃の範囲で適宜設定できる。気相として空気もしくは適当な濃度の酸素を含み培地の濃度を所定の範囲に保つために適当な濃度のＣＯ2を含む不活性ガスを用いることができる。培養時間は特に限定されないが、例えば、720〜3000時間、より好ましくは2000〜2500時間の範囲で適宜設定できる。
本発明の方法により、アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞株を得ることができる。また、本発明の方法により、アンドロゲンレセプター活性依存性だけでなくエストロゲン非依存性、エストロゲンレセプター活性非依存性も有する乳癌細胞株を作製することができる。本明細書において、アンドロゲンレセプターは、アンドロゲン受容体又はＡＲと表記することもある。
一方、ＭＣＦ７−Ｅ１０細胞を親細胞とし、エストロゲン枯渇、かつアンドロゲン存在下で培養することにより、アンドロゲン代謝産物依存性細胞株を得ることができる（特許文献１、タイプ４）。具体的には、ＭＣＦ７−Ｅ１０細胞由来のタイプ４細胞株は、アンドロゲンであるテストステロンの代謝物であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）依存性であり、ＤＨＴ代謝酵素である３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ１（３β−ＨＳＤタイプ１：ＨＳＤ３Ｂ１）の発現の増大が見られる。ＨＳＤ３Ｂ１によりＤＨＴは３β−ジオールに変換される。３β−ジオールはエストロゲン様の作用をするものであるため、タイプ４細胞株においては、アンドロゲンからＤＨＴを介して得られる３β−ジオールによってＥＲ活性が誘導される機構でエストロゲン枯渇耐性を獲得しているものと考えられる（特許文献１）。しかし、当該タイプ４細胞株では、アンドロゲンレセプター発現の低下が見られ、アンドロゲンレセプター活性依存性を有しない。
本発明の方法により得られる乳癌細胞株は、アンドロゲンレセプター活性依存性を有し、かつエストロゲン非依存性及びエストロゲンレセプター活性非依存性であるため、タイプ４細胞株とは全く異なる機構によりエストロゲン枯渇耐性を獲得していることが明らかである。また、本発明の方法により得られる乳癌細胞株は女性ホルモンであるエストロゲン非依存性及びエストロゲンレセプター活性非依存性であり、かつ男性ホルモンの受容体活性であるアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していることから、本発明の方法においては、乳癌細胞株が男性化しているということができる。乳癌細胞がこのような男性化をするということは、これまでに報告がない。
乳癌細胞株
本発明は、上記方法により得られるアンドロゲンレセプター依存性（アンドロゲンレセプター活性依存性）を有する乳癌細胞株を提供する。本発明の乳癌細胞株の特徴及びその製造方法は、前述の通りである。
スクリーニング方法
本発明は、またホルモン療法に耐性を示す乳癌に対する治療剤をスクリーニングする方法であって、ホルモン療法耐性乳癌細胞に被験物質を接触させる工程と、この細胞を培養し、細胞の増殖及び／又はアンドロゲンレセプター活性を測定する工程と、前記被検物質と接触させていない前記ホルモン療法耐性乳癌細胞を同じ条件下で培養及び測定した結果と比較して前記被検物質が細胞の増殖及び／又はＡＲ活性の低下をもたらしたか否かを判定する工程とを含み、
前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、エストロゲン非依存性、エストロゲンレセプター活性非依存性、かつアンドロゲンレセプター依存性（アンドロゲンレセプター活性依存性）である細胞株である、方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法に用いるエストロゲン非依存性、エストロゲンレセプター活性非依存性、かつアンドロゲンレセプター活性依存性である細胞株としては、前記の方法により作製したアンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞を用いることができる。
細胞と被検物質との接触は、培地に被検物質を添加することにより容易に行うことができる。被検物質との接触は、短時間のパルスで行ってもよく、培養期間中を通じて培地に存在させてもよい。したがって、接触と培養とは同時に行うことができる。培地としては、必要に応じて以下に説明する普通培地、エストロゲン枯渇培地、又はこれらに所定の添加物を添加した培地等を使用することができる。細胞の増殖は、常法により細胞数をカウントすること等により、行うことができる。アンドロゲンレセプター活性の測定は、自体公知の方法に従い行うことができる。
本発明の方法において、細胞の増殖及びアンドロゲンレセプター活性の一方のみを測定し評価しても、これらの両方を測定し評価してもよい。本発明の方法において、被検物質に接触させていないホルモン療法耐性乳癌細胞と比較して被検物質に接触させたホルモン療法耐性乳癌細胞において細胞の増殖が低下（抑制）され、かつＡＲ活性が低下した場合、当該被検物質は、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得した乳癌細胞に対して有効な治療薬となり得ると判断できる。被検物質に接触させたホルモン療法耐性乳癌細胞において細胞の増殖は低下したが、かつＡＲ活性が低下しない場合、アンドロゲン−アンドロゲンレセプターの系を阻害する機構ではないもののアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得した乳癌細胞に対して有効な治療薬となり得る余地があると判断できる。また、被検物質に接触させたホルモン療法耐性乳癌細胞において細胞の増殖は低下しないが、かつＡＲ活性が低下した場合、当該被検物質単独ではアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得した乳癌細胞に対して有効ではない可能性があるが、他の治療薬と組合わせることで有効な治療を構築できる余地があると判断できる。
本発明の細胞は、上述のようにしてインビトロでの薬剤スクリーニングに用いることができるのに加えて、これらの細胞を動物に移植してそれぞれの機序のモデル動物を作製し、より個体に近い実験系で薬剤の効果を評価するために使用することができる。
また、新規な薬剤を見出すことだけでなく、既存薬剤の投与順序や併用の組合せ等に関しても、最適な方法を見出すために、上記と同様のインビトロ又はインビボ実験を行うことができる。
アンドロゲンレセプター活性依存性獲得の判定方法
本発明は、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを指標とする、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター依存性（アンドロゲンレセプター活性依存性）獲得の有無を判定する方法を提供する。本発明においては、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子産物を指標とすることを特徴とする。ここで、遺伝子産物とは、上記遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ及び当該ｍＲＮＡの翻訳産物であるタンパク質を含む。尚、本発明において、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲまたはこれらの遺伝子産物は、内在性の（ゲノム上の）遺伝子由来のものを意味する。
本発明の判定方法は、被験者から採取した検体中のＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの発現量を測定する工程、及び上記工程において測定した被験者検体の発現量とコントロールにおける発現量とを比較する工程を含む。
ＰＳＡ（前立腺特異抗原(prostate specific antigen)）は、前立腺腫瘍マーカーとして知られている糖蛋白である。ＫＬＫ３（kallikrein 3）は、このＰＳＡをコードする遺伝子である。ＫＬＫ３遺伝子の塩基配列としては、例えば、GenBankアクセッション番号NM_001648.2で示されるもの（配列番号１）が挙げられる。ＤＤＣ（L-Dopa decarboxylase）は、ＡＲコファクターであり、前立腺癌における予後不良因子である。ＤＤＣ遺伝子の塩基配列は自体公知であり、例えば、GenBankアクセッション番号M76180.1で示されるもの（配列番号２）が挙げられる。ＡＲ遺伝子は自体公知であり、例えば、GenBankアクセッション番号M34233.1で示されるもの（配列番号３）が挙げられる。
被験者としては、特に限定されるものではないが、ヒトを含む哺乳類が例示される。非ヒト哺乳類としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。本発明の判定方法の好ましい被験対象は、ヒトである。被験者は、女性（雌）でも男性（雄）でもよいが、特に女性被験者の検査に有用である。
ＫＬＫ３、ＤＤＣ及び／又はＡＲの測定方法としては、自体公知の方法を適宜採用することができ、特に限定されないが、例えば、乳癌患者から癌組織を摘出し、免疫染色による抗原の検出、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの検出等により行うことができる。
上記の方法により得られた被験者のＫＬＫ３、ＤＤＣ及び／又はＡＲの発現量の測定値が、コントロール（アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していない乳癌患者）の数値よりも統計的に有意に大きい場合にアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定することができる。例えば、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲのうち１つのみを測定した場合、被験者の数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法が挙げられる。また、例えば、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲの全てを測定する方法が挙げられる。その場合、３つ全ての数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法、少なくとも２つの数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法、及び少なくとも１つの数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法が挙げられる。また、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲのうち２つを測定する方法が挙げられる。その場合、測定した２つ両方の数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法、及び少なくとも１つの数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法が挙げられる。例えば、ＫＬＫ３及びＤＤＣの両方を測定した結果、ＫＬＫ３及びＤＤＣの両方の数値がコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法、及びＫＬＫ３及びＤＤＣの両方を測定した結果、ＫＬＫ３及びＤＤＣの一方のみがコントロールよりも有意に大きい場合、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定する方法が挙げられる。
上記方法により、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得していると判定された被験者には、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得した乳癌に適する治療を施すことができる。例えば、ビカルタミド、フルタミド、エンザルタミド等の治療方法が挙げられる。
従って、本発明は、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを指標とする、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定する工程、及び
上記判定工程においてアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得したと判定された乳癌患者に、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得した乳癌に適する治療を施す工程
を含む、乳癌患者の治療方法も提供する。
アンドロゲンレセプター活性依存性獲得の判定用キット
本発明は、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの発現量を測定する手段を含む、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター依存性（アンドロゲンレセプター活性依存性）獲得の有無を判定するためのキットを提供する。
ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの発現量を測定するための手段としては、特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ、免疫染色法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、マイクロアレイ法等に用いる手段を挙げることができる。ＫＬＫ３、ＤＤＣ及び／又はＡＲの発現量を測定するための手段としては、例えば、ＰＣＲ用のプライマー又はプローブとしてのＫＬＫ３、ＤＤＣ及び／又はＡＲのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ等；免疫染色法に用いるＰＳＡ、ＤＤＣ及び／又はＡＲに特異的に結合する抗体等；マイクロアレイ法に用いるプローブを固定したマイクロアレイ等が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲによりＫＬＫ３を検出するためのプライマーとしては、例えば、F:5'-TGTCCGTGACGTGGATT-3'（配列番号４） R:5'-ACGAGAGGCCACAAGCA-3' （配列番号５）等を挙げることができる。ＲＴ−ＰＣＲによりＤＤＣを検出するためのプライマーとしては、例えば、F:5'-GAAGTCGGTCCTATCTGCAAC-3' （配列番号６）、R:5'-ACTCCACTCCATTCAGAAGGT-3' （配列番号７）等を挙げることができる。ＲＴ−ＰＣＲによりＡＲを検出するためのプライマーとしては、例えば、F:5'-ATGTGGAAGCTGCAAGGTCT-3' （配列番号８） R:5'-CGAAGACGACAAGATGGACA-3' （配列番号９）等を挙げることができる。また、本発明のキットには、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分としては、例えば検体を採取するための道具、ポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられるが、これに限定されない。上記判定方法を行うための手順を書き記した書面等を含むこともできる。
アンドロゲンレセプター活性依存性獲得の判定用マーカー
本発明は、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを含む、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター依存性（アンドロゲンレセプター活性依存性）獲得の有無を判定するためのマーカーを提供する。本発明において、「マーカー」とは、被験者又は被験者から採取した検体が特定の性質を有するか否か、特定の状態にあるか否か等を評価するための指標となるものを意味する。本発明において、判定用マーカーに含まれる「ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲ」は、マーカーとして用いられ得るものである限りにおいて、これらの遺伝子自体に限られず、遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ、翻訳産物であるタンパク質等も含まれる。従って、本発明において、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを含むマーカーとしては、ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子に由来するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質等が挙げられる。尚、本発明において、特に言及しない限り、２本鎖DNA、１本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。また、本発明において、「ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子に由来するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質」は、ｍＲＮＡ全体、ｃＤＮＡ全体、タンパク質全体に限られず、これらの遺伝子に由来するものであることが特定できる限りにおいて、これらのｍＲＮＡの一部（断片）又は全部、ｃＤＮＡの一部（断片）又は全部、及びタンパク質の各々の一部（断片）又は全部がいずれも含まれる。
Ｉ．材料及び測定方法
Ｉ−１．樹立に使用した親細胞
T47D-TE8細胞は、ヒト乳癌細胞株T47D(ATCC番号：HTB-133)から、ｐｄ２ＥＧＦＰ−１ベクター（Clontech）において半減期の短いＧＦＰのｃＤＮＡの上流にエストロゲン応答配列（ＥＲＥ）を配したレポータープラスミドを公知の方法にしたがって導入することにより樹立した（Yamaguchi Y.et al. Cancer Res,2005,65:4653-4662）。T47D-TE8細胞は、普通培地で培養した。
Ｉ−２．細胞培養法
細胞の通常の培養には、１０％ＦＣＳ（Tissue Culture Biologicals）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（SIGMA）（「普通培地」と呼ぶことがある）を用いた。耐性株のエストロゲン枯渇培養には、１０％デキストラン被覆チャコール処理ＦＣＳ（ＤＣＣ−ＦＣＳ；Tissue Culture Biologicals）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）を添加したフェノールレッド無含有ＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO）（「枯渇培地」又は「エストロゲン枯渇培地」と呼ぶことがある）を用いた。細胞は、すべて５％ＣＯ2、３７℃に調整したＣＯ２インキュベーターで培養した。
特に記載がない場合、実験結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。
Ｉ−３．試薬等
エストラジオール、テストステロン、ＤＨＴは、Sigma-Aldrich Corpから購入した。フルベストラントはアストラゼネカから入手した。レトロゾールはノバルティスファーマ（Tokyo, Japan）から入手した。バイカルタミド（アンドロゲンレセプター阻害剤）はLKT Laboratories (St. Paul, MN,USA)から入手した。
Ｉ−４．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
それぞれの条件下で培養した細胞から商品名「Isogen」（Nippon Gene）を用いて総ＲＮＡを抽出し、商品名「RNA PCR kit」（Takara Shuzo）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、商品名「StepOne real-time PCR system」（Applied Biosystems）を用いて標準プロトコールにしたがって行った。目的の遺伝子の発現を、内部標準としてのＧＡＰＤＨ又はＲＰＬ１３Ａに対する相対値として算出した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝２）で示した。
Ｉ−５．ウェスタンブロッティング
１００mmディッシュで増殖させた細胞を氷冷生理食塩水で洗浄し、ホスファターゼ阻害剤カクテル(「Phos STOP」、Roche)及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含む１mLのリシスバッファー（「Complete Lysis-M」、Roche Diagnotics GmbH）で溶解させた。５分後、ライセートをパルスソニケーションに供し、１４，０００rpmで１０分間遠心分離した後、１０％ポリアクリルアミドゲル（Wako）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質をＰＶＤＦ膜（GE Healthcare Bioscience）に転写した。この膜を、一次抗体（５％ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有溶液中）と反応させた。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を適用した。化学発光基質（「Immunsutar AP substrate」、 BIO-RAD）と反応させた後、目的のタンパクのバンドを、Ｘ線フィルムを感光させることにより可視化した。
Ｉ−６．ルシフェラーゼアッセイ
ＥＲＥ活性を、商品名「Dual-Luciferase Reporter System」（Promega）を用いて、基本的にBiochem Biophys Res Commun 2001, 285:340-347に記載された方法に従って測定した。枯渇培地で３日間培養後、３×１０5個の細胞を６cmディッシュに播き、同じ培地中で４８時間培養した。０．５μgのエストロゲンレポータープラスミド（Ｔｋ−ＥＲＥ−Ｌｕｃi）及び０．０５μgのコントロールベクター（ｐＲＬ―ＴＫ, Promega）を３００μLの無血清培地中で５μLの商品名「TransIt」LT-1試薬(Takara Bio)と混合し、製造業者の指示書に従ってトランスフェクションを行った。薬剤の存在下又は非存在下で40時間細胞を培養した後、商品名「Dual-Luciferase Reporter System」（Promega）を製造業者の指示書に従って用いてルシフェラーゼ活性を測定し、コントロールに対する相対値を算出した。
ＩＩ．タイプ６細胞株の樹立及び酵素活性の測定
ＩＩ−１．タイプ６細胞株の樹立
エストロゲン枯渇・アンドロゲン添加の条件下での長期培養によりT47D-TE8細胞から取得した細胞はアロマターゼ阻害薬で治療された乳癌のモデルを表す。具体的には、Phenol red free RPMI培地に10%DCC-FCS(チャコール処理ウシ胎児血清),1%Penicillin/Streptomycinを添加しテストステロン100nMとなるよう調製した培地でT47D-TE8細胞を約３カ月培養した。培養中、蛍光を発する細胞の割合は徐々に少なくなっていった。コロニーのうち蛍光を発するものをクローニングし、テストステロン添加にて蛍光が強くなる２つの細胞株A3T・B4Tを、タイプ６細胞とした。A3T,B4Tは培養を続けるうちに、徐々に蛍光を失っていった。
ＩＩ−２．エストロゲンに対する反応（図１、２）
親株であるT47D-TE8（枯渇培地で３日間培養し、ステロイドを枯渇させたもの）及び上記ＩＩ−１で樹立したA3T及びB4Tを、２万細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに播き、種々の濃度のエストロゲンの存在下及び非存在下で培養した。４日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ処理によって回収した。細胞をパーティクルカウンター（「CDA-500 Sysmex automated cell counter」(Sysmex Corporation)でカウントした。結果を図１に示す。親株T47D-TE8はエストラジオール100pM添加時にコントロール（エタノールを添加した４日目の細胞数）に比べ細胞数は約2倍に増加したが、A3T・B4Tは細胞数の変化はみられなかった。
次に、ER(エストロゲン受容体)活性を測定するため、EREルシフェラーゼレポーター、内部コントロールとしてpRLルシフェラーゼレポーターを一時導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った。具体的には、前述のＩ−６に記載の方法に従い、薬剤としてエストラジオール（100pM（Ｅ２））、エストラジオール100pM及び抗エストロゲン薬 フルベストラント1μＭ（Ｅ２＋Ｆｕｌ）又はコントロールとしてエタノールを用いてルシフェラーゼアッセイを行った。結果を図２に示す。T47D-TE8はコントロールに比べて、エストラジオール100pM添加により約8倍にER活性は上昇したが、A3T・B4Tはほとんど活性の変化はなかった。これらの結果から、A3T・B4TはT47D-TE8が有しているERを介した細胞増殖機構が機能していないと考えられた。
ＩＩ−３．エストロゲン受容体とその応答遺伝子の発現（図３、４）
親株であるT47D-TE8（枯渇培地で３日間培養し、ステロイドを枯渇させたもの）及び上記ＩＩ−１で樹立したA3T・B4Tについてウエスタンブロッティングを行ったところ、A3T・B4TのERの発現蛋白はほぼ消失していた（図３）。尚、ウエスタンブロッティングはテストステロン（10nM）を添加し、2日間培養したもの及びテストステロンを添加していないものの両方について行った。
また、リアルタイムRT-PCRにてmRNAの発現量を、RPL13Aを内部コントロールとして測定した（図４）。T47D-TE8に比べ、A3T及びB4TではERとその応答遺伝子であるPgRの発現が著明に低下していた。以上から、A3T及びB4TではERの機能のみならずERの発現もほぼ喪失していることが示された。
ＩＩ−４．アンドロゲン（テストステロン）に対する反応（図５〜７）
テストステロンを添加し4日間培養し細胞増殖試験を行った。具体的には、エストロゲンの代わりにテストステロンを用いる以外、前記ＩＩ−２と同様にして、細胞増殖試験を行った（図５上）。T47D-TE8はコントロールに比べて細胞数の変化はみられなかったが、A3T・B4Tではテストステロン10nMにて約1.4倍の増加を示した。
また、Ａ３Ｔ及びＢ４Ｔのそれぞれについて、アンドロゲンレセプターブロッカーであるバイカルタミド（Ｂｉｃ）、エストロゲンレセプターブロッカーであるフルベストラン（Ｆｕｌ）１００ｎＭ、又はアロマターゼ阻害剤（ＡＩ）であるレトロゾール（Ｌｅｔ）１００ｎＭを添加し、4日間培養したものについても同様に細胞増殖試験を行った（図５、中央、下）。増殖促進反応は、フルベストラントやレトロゾールを添加しても抑制されず、ビカルタミドにて抑制されたことから、この反応はエストロゲン受容体ではなくアンドロゲン受容体を介していることが示唆された。
次に、アンドロゲン受容体(AR)活性を測定するため、PSAプロモーター上流領域を含むAREルシフェラーゼレポーター、内部コントロールとしてpRLルシフェラーゼレポーターを一時導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った。AREルシフェラーゼレポーターの調製は、エストロゲンレポータープラスミド（Ｔｋ−ＥＲＥ−Ｌｕｃi）の代わりにアンドロゲンレポータープラスミド（PSAプロモーター領域を含む、PSA転写開始点より上流5800塩基―TK-luci（EREの代わりにAREを導入したもの））を用いる以外、前記Ｉ−６．に記載の方法に従って行った。当該試験には、T47D-TE8、Ａ３Ｔ及びＢ４Ｔ細胞株に、テストステロン10nM添加（ＴＳ）、テストステロン10nM及びバイカルタミド10μM添加（ＴＳ＋Ｂｉｃ）またはコントロールとしてエタノールを添加し、２日間培養したものを使用した。
結果を図６に示す。T47D-TE8ではテストステロン10nM添加（ＴＳ）によりAR活性の変化はなかったが、A3T・B4Tではコントロールに比べ2〜3倍の活性上昇が認められた。
AREとEREの配列が類似していることにより、ARがEREに作用するという報告があるため（Peters et al. Cancer Res.2009,69:6131-6140）、EREルシフェラーゼレポーター、内部コントロールとしてpRLルシフェラーゼレポーターを一時導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った（図７）。A3T・B4Tではテストステロン添加によるEREルシフェラーゼ値の上昇はなく、テストステロンによる細胞増殖促進反応はEREを介していないことが証明された。以上から、A3T・B4Tはアンドロゲン(テストステロン)により細胞増殖が促進し、その反応はARを介していることが示された。
ＩＩ−５．ARとその応答遺伝子の発現 (図８〜図９)
親株であるT47D-TE8及び上記ＩＩ−１で樹立したA3T・B4Tについて、前記Ｉ−２の培養法と同じ培地（TE8:RPMI+FCS+P/S A3T・B4T：フェノールレッドフリーRPMI+DCC-FCS+P/S）を用いてウエスタンブロッティングを行いT47D-TE8・A3T・B4Tの蛋白発現量を調べた。結果を図８に示す。ARとその応答遺伝子であるPSAの発現が、A3T・B4TではT47D-TE8に比べて著明に上昇していた。
また、ウエスタンブロッティングと同様に前記Ｉ−２の培地中のT47D-TE8・A3T・B4TについてリアルタイムRT-PCRによりAR及びPSAのmRNA発現量を調べたところ（図９）、A3T及びB4Tでは発現上昇がみられた。とりわけPSAの発現量上昇は顕著であった。A3T及びB4TではARの発現量の増加がARを介した増殖経路の活性化に寄与していると考えられた。
マイクロアレイによる遺伝子解析（図１０、１１）
アンドロゲン添加時の、T47D-TE8に対するA3Tの遺伝子発現量の比を検出することで、A3Tのアンドロゲン依存性増殖経路に関与する遺伝子を同定することができると考え、サンプルとして、T47D-TE8及びA3TにDHTをそれぞれ１nM添加し24時間後に採取したRNAを用いてマイクロアレイを行った。各遺伝子について、T47D-TE8での発現量に対するA3Tでの発現量の比（A3T-DHT/TE8-DHT）を下記表１に示す。
Figure 2014188775
アジレント社オリゴマイクロアレイ、データ解析ソフトGeneSpringGXを用いて、サンプル間の遺伝子の発現比を解析した。T47D-TE8に比べA3Tで2倍以上の発現上昇がみられた遺伝子の中から、パスウェイ解析ソフトIPAにて「Androgen」と「Cancer」両者に関連する遺伝子をピックアップした。PSAに次いで高い比の遺伝子が、DDC(L-Dopa decarboxylase)であった。DDCはARのcoactivatorであり、前立腺癌細胞では過剰発現により細胞増殖促進効果が報告されている(Wafa et al. Int.J.Cancer 2012,130:2835-2844)。
実際にリアルタイムRT-PCRを行いmRNAの発現量を測定したところ、A3T及びB4TではT47D-TE8に比べ著明な発現上昇を認めた（図１０）。尚、図１０は、T47D-TE8を１とした発現量の相対値を示す。A3TではDDCの発現増加が、AR活性上昇の大きな要因であると予測された。
さらに検証するため、アンドロゲン及びDDC阻害剤、NSD-1015を添加し細胞増殖試験を行った。（図１１）
T47D-TE8、A3T、B4TはDHT1nM添加によりコントロールに比べ細胞数は増加した。この増殖促進反応はNSD-1015 200μM添加にて、A3T・B4Tでは抑制されたが、T47D-TE8では抑制されなかった。以上の結果から、T47D-TE8が元来保持しているARを介した増殖経路が、A3T・B4Tでは活性が高められており、その活性化にDDCが大きく寄与していることが示唆された。これらの結果から推察されることは、乳癌のホルモン療法耐性の機序のひとつとして、乳癌が、前立腺癌のように、アンドロゲンとアンドロゲン受容体を介したシグナルに依存した増殖を示すようになることがあり得ると考えられる。その際、ＤＤＣが重要な役割を果たしていると思われる。このような耐性機序を獲得した進行・再発乳癌には、抗アンドロゲン剤治療が有効である可能性がある。
ＩＩＩ．AR依存性AI耐性メカニズムの実在性の検証
初発乳癌手術後に術後補助療法としてAIを投与中に再発し、再発病変の切除手術が行われ、初発・再発病変組織が使用可能であった症例21例を対象とした。内訳は東北大学病院7例、東北公済病院5例、宮城県がんセンター5例、岩手県立中央病院4例。なお以上の検体を用いた研究計画は各病院の倫理委員会にて承認を受けた。
10%ホルマリン固定パラフィン包埋標本より未染色標本を作製し、ヒストファインキット（ニチレイバイオサイエンス）を使用しstreptavidin-biotin 増幅法にて行った。
1次抗体には抗ERα抗体(ER1D5, Immunotech, Marseille, France)、 抗PR（プロゲステロンレセプター）抗体(MAB429, Chemicon, Temecula, CA, USA)、抗HER2抗体(A0485, DAKO, Carpinteria, CA, USA))、抗Ki-67抗体(MIB1, DAKO, Carpinteria, CA, USA)、抗AR抗体(AR441, DAKO)を使用した。ERα、PR、Ki-67、ARの抗原賦活化には、クエン酸緩衝液を用いてオートクレーブで120℃, 5分の熱処理を行った。希釈倍率は各々ERα；1/50、PR；1/30、HER2；1/200、Ki-67；1/50、AR；1/50、抗原・抗体複合体の発色には3.3'-diaminobenzidine(DAB)溶液を使用し、ヘマトキシリンで核染色を施した。ERα、PgR、AR、Ki67は1000個以上の癌細胞における陽性細胞数を計測し、その割合を算出するLI［labeling Index:陽性細胞の割合(%)］で評価し、ERα、PgRは1%以上、ARはLI 10%以上を陽性とした。HER2の免疫染色は細胞膜上のHER2蛋白の発現に対し、染色動態に従って4段階(スコア)に評価した。全ての免疫組織化学染色の結果は、癌の浸潤巣のみで判定した。結果を下記表２に示す。
Figure 2014188775
前述したように、耐性株においてARの発現が亢進していたことから、ARはAR依存性増殖を示す乳癌の指標となる可能性があると考えられる。耐性株が持つ性質と同様に、ERα陰転化・AR発現亢進の特徴を示すAI耐性乳癌の存在を探索するため、AI耐性乳癌症例21例におけるホルモン受容体の発現を免疫組織化学的に検討した。表２に示すように、再発時にERαが陽性から陰転化した症例は6例であった。初発時にARが陰性であった症例は9例であり、再発時に陽転化した症例は3例であった。初発時にARが陽性であった症例は12例であり、うち2例は再発時に陰転化した。以上の結果から、ARの転写活性が亢進している可能性のある症例もあることが示唆された。
配列番号４はプライマーである。
配列番号５はプライマーである。
配列番号６はプライマーである。
配列番号７はプライマーである。
配列番号８はプライマーである。
配列番号９はプライマーである。

Claims (10)

  1. ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを指標とする、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定する方法。
  2. 乳癌患者が女性患者である、請求項１に記載の方法。
  3. ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つの発現量を測定する手段を含む、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定するためのキット。
  4. 乳癌患者が女性患者である、請求項３に記載のキット。
  5. ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを含む、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定するためのマーカー。
  6. 乳癌患者が女性患者である、請求項５に記載のマーカー。
  7. ホルモン療法に耐性を示す乳癌に対する治療剤をスクリーニングする方法であって、ホルモン療法耐性乳癌細胞に被験物質を接触させる工程と、この細胞を培養し、細胞の増殖及び／又はアンドロゲンレセプター活性を測定する工程と、前記被検物質と接触させていない前記ホルモン療法耐性乳癌細胞を同じ条件下で培養及び測定した結果と比較して前記被検物質が細胞の増殖及び／又はＡＲ活性の低下をもたらしたか否かを判定する工程とを含み、
    前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、エストロゲン非依存性、エストロゲンレセプター活性非依存性、かつアンドロゲンレセプター活性依存性である細胞株である、方法。
  8. Ｔ４７Ｄ細胞を、エストロゲンを枯渇させた培地で、かつアンドロゲンの存在下で培養する工程を含む、アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞の作製方法。
  9. Ｔ４７Ｄ細胞を、エストロゲンを枯渇させた培地で、かつアンドロゲンの存在下で培養する工程を含む方法により得られる、アンドロゲンレセプター活性依存性の乳癌細胞株。
  10. ＫＬＫ３、ＤＤＣ及びＡＲからなる群より選択される少なくとも一つを指標とする、乳癌患者におけるアンドロゲンレセプター活性依存性獲得の有無を判定する工程、及び
    上記判定工程においてアンドロゲンレセプター活性依存性を獲得したと判定された乳癌患者に、アンドロゲンレセプター活性依存性を獲得した乳癌に適する治療を施す工程
    を含む、乳癌患者の治療方法。
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