JPWO2014077279A1 - Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)Xkr8発現細胞と、Xkr8の機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および
(2)該細胞の細胞膜におけるリン脂質の分布を変化させる候補物質を選択する工程。
(1)細胞株、組換タンパク質、抗体、および材料
マウスインターロイキン(IL-3)依存性Ba/F3細胞50は、RPMI(10%ウシ胎児血清(FCS, Gibco)、45 単位/ml マウスIL-3、および50μM β-メルカプトエタノール含有)で維持した。ヒトPLB-98551、Jurkat (ATCC TIB152)、Namalwa (ATCC CRL-1432)、およびRaji (ATCC CCL-86) 細胞は、RPMI1640 (10% FCSおよび50μMβ-メルカプトエタノール含有)にて増殖させた。Plat-Eパッケージング細胞52は、DMEM (10% FCS含有)にて増殖させた。組換マウスIL-353およびヒトFasL54は、既報のとおり調製した。ウサギ抗活性型カスパーゼ3 mAbは、Cell Signalingから入手した。マウス抗ヒトICAD mAbはMedical & Biological Laboratories (MBL)から入手し、Alexa 488- およびAlexa 568- 標識ヤギ抗ウサギIgGはInvitrogenから入手した。スタウロスポリンは協和発酵キリンより提供を受けた。
Ba/F3-PS19細胞由来のポリ(A) RNAを用いて、ランダムヘキサマーをプライマーとして使用して二本鎖cDNAを合成し、BstXIアダプターを既報のとおり連結した55。長さ1.0-2.5 kbのDNA断片を1%アガロースゲルでの電気泳動によりサイズ分画し、Bst XIで消化したpMXsベクター56にライゲートした。E. coli DH10B細胞 (ElectroMax DH10B; Invitrogen) をエレクトロポレーションにより形質転換して、約1.3 x 106 クローンを得た。cDNAライブラリー由来のプラスミドDNAを用いて、Plat-E細胞においてレトロウイルスを産生し、遠心分離により濃縮し、既報のとおりBa/F3細胞に感染させた55。A23187で処理した細胞を、氷上で、Cy5-Annexin V (Biovision)により15分間、および5μg/ml ヨウ化プロピジウム (PI)により2分間、染色し、FACSAria (BD Biosciences)でソートした。レトロウイルスベクターに組み込まれたcDNAは、Ba/F3細胞形質転換体由来のDNAを用いて、既報のとおりPCRにより同定した55。
mXkr8 (GenBank NM_201368) およびhXkr8 (GenBank NM_018053) の全長コーディング配列を、それぞれBa/F3細胞およびNamalwa細胞からRT-PCRにより調製した。使用したプライマーは以下のとおりである(各プライマーにおいて、Bam HIまたはEco RI 認識配列を下線で示す。):
mXkr8: 5’-ATATGGATCCATCATGCCTCTGTCCGTGCACCA-3’ (配列番号7)および 5’-ATATGAATTCGAGGACTCCATTCAGCTGCA-3’ (配列番号8)
hXkr8: 5’-ATATGGATCCGCCATGCCCTGGTCGTCCCGCGG-3’ (配列番号9)および5’-ATATGAATTCTCCCTTCACTGGCGAAGCAG-3’ (配列番号10)
GFP配列をpMXs puroのEco RI部位とXho I部位の間に挿入することにより、pMXs puro c-GFPを構築した。次いで、Xkr8 cDNAをpMXs puro c-FLAG55またはpMXs puro c-GFPのBam HI/Eco RI部位に挿入し、C末端にFLAGタグまたはGFPタグを有するタンパク質を発現させた。mXkr8のD351A/D354A (2DA)変異体およびhXkr8のD352A/D355A (2DA) 変異体を作成するため、マウスおよびヒトXkr8 cDNAを、変異ヌクレオチドを有する以下の30ヌクレオチドのプライマーを用いた組換PCR57により変異させた:
mXkr8 2DA: 5’-GGGACCCTGCCCTCGTGGCTGGGACCCTAG-3’, (配列番号11)および 5’-CTAGGGTCCCAGCCACGAGGGCAGGGTCCC-3’ (配列番号12)
hXkr8 2DA: 5’-AAGCCCGACCCTGCCCAGGTAGCCGGGGCC-3’ (配列番号13)および5’-GGCCCCGGCTACCTGGGCAGGGTCGGGCTT-3’ (配列番号14)
hXkr8のC末端欠失変異体を構築するため、以下の変異型リバースプライマー: 5’-CGAGATCTGAATTCTCAGTCTACCTGGTCAGGGTCGG-3’ (配列番号15)(Eco RI認識配列を下線で示す)を用いてPCRを行い、pMXs puroベクターに挿入した。
mXkr8のための、ピューロマイシン抵抗性遺伝子を有するpRS shRNAベクターにおけるshRNA発現プラスミド4種類は、OriGeneより購入した。4つの配列のうち、shRNAに最適な標的配列は5’-GAATCTGTGCCATCGCCTTGTTCTCAGCT-3’ (配列番号16)であった。pRSにおけるスクランブルshRNAもまた、OriGeneより購入した。Ba/F3にshRNAを含むレトロウイルスを感染させ、WR19Lにはエレクトロポレーションにより導入した。1.0μg/mlピューロマイシンを含む培地中で培養することにより安定な形質転換体を限界希釈によりクローニングした。Xkr8 mRNAはリアルタイムRT-PCRにより定量した。
Xkr8をコンディショナルに標的化したマウスは、Unitechに特別注文して作成した。 説明すると、FRT配列で挟まれたホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK) プロモーター誘導性ネオマイシン耐性(neo) 遺伝子を有するneo-loxP カセットをXkr8遺伝子のイントロン3に挿入した。エクソン3を含む1.0-kbのDNAフラグメントを対応する配列とP1 (loxP)配列において交差する遺伝子座を有するフラグメントと置き換えた。チミジンキナーゼ (tk) プロモーターに誘導されるジフテリア毒素A断片 (DT-A)をベクターの5’末端に挿入した。マウスBruce-4h胚性幹 (ES) 細胞58にターゲティングベクターを導入し、G418耐性クローンをPCRにより相同組換についてスクリーニングした。陽性クローンを胚盤胞に注射し、Xkr8+/NeoFRTマウスを作成した。Xkr8+/NeoFRT マウスを、サイトメガロウイルスエンハンサー−トリβ-アクチンハイブリットプロモーター(CAG)誘導性のフリッパーゼ変異体 (FLPe) 遺伝子(CAG-FLPe)59を有するトランスジェニックマウスと交配し、得られたマウスをC57BL/6に戻し交配して、Xkr8+/floxマウスを得た。いずれのマウスも京都大学における特定の飼育室(SPF, 特定された微生物や寄生虫が存在しない飼育室)で飼育し、動物実験は全て京都大学に認可されたプロトコールにしたがって実施した。
不死化胎児胸腺細胞株 (IFET) は、胎児胸腺細胞を既報のとおりH-rasV12およびc-mycにより不死化することで樹立した60, 61。説明すると、Xkr8+/floxマウス同士を交配し、胎児胸腺細胞を胎生 (E) 14.5日で得た。H-rasV12 およびc-mycの遺伝子を有するレトロウイルスを pCX4ベクター62を用いてPlat-E細胞で産生し、RetroNectinコートプレート (Takara Bio) に、室温で2,000 x gにて2-3時間遠心分離することにより結合させた。400 x gにて5分間遠心分離することにより、レトロウイルスをコートしたプレートに胸腺細胞を接着させ、DMEM(10% FCS、1 x 非必須アミノ酸、10 mM Hepes-NaOHバッファー (pH 7.4)、50μM β-メルカプトエタノール、5 ng/ml マウスIL-763 (PeproTech)、およびGlutaMax(商標) (Gibco)含有)にて培養した。得られたIFET細胞にAdeno-Cre (Adenovirus Cre/loxP, Takara Bio)を感染させ、限界希釈によりクローニングした。Xkr8-/-アリルを有するクローンを、以下のプライマーを用いたPCRにより選択した (野生型特異的センスプライマー: 5’-CTCATTGCTGATGTGGGTGACAATA-3’ (配列番号17); 変異型特異的センスプライマー: 5’-AGGCTTTTCTCTACTTTTGATGGAG-3’ (配列番号18); および共通のアンチセンスプライマー: 5’-CATTATCTTCCTCACTGGCTGAATC-3’ (配列番号19))。
pMX-puroベクターをPlat-E細胞に導入することにより、マウスおよびヒトXkr8cDNAを有するレトロウイルスを作製し、遠心分離により濃縮し、Ba/F3細胞およびXkr8-/- IFET細胞に感染させた。安定な形質転換体を、ピューロマイシン含有培地(Ba/F3細胞について1.0μg/ml、IFET細胞について2.0μg/ml)にて選択し、組換タンパク質の発現を抗Flag (Clone M2, Sigma)または抗GFP (Clone JL8, Clontech)によるウェスタンブロッティングにより確認した。レトロウイルスによる形質転換によってマウスFas cDNA64をIFET細胞に導入し、その発現を抗マウスFas mAb (Jo2)65によるフローサイトメトリーにより確認した。ヒトPLB-985およびマウスWR19L細胞を両種性レトロウイルスエンベロープまたはVSVγエンベロープによるレトロウイルス感染により形質転換した。説明すると、pMXsレトロウイルスベクター、pGP (Takara Bio) (gag-pol融合タンパク質用)、およびpE-ampho (Takara Bio)またはpCMV-VSV-G-RSV-Rev (理化学研究所三好博士より供与)を一緒に293T細胞に導入することにより、レトロウイルスを産生した。培養上清中のウイルス粒子を遠心分離により濃縮し、細胞株を形質転換した。Xkr8-GFPを293T細胞で発現させるため、Fugene 6 (Promega)を用いたリポフェクションにより、293T細胞にpMXs puroXkr8-GFPを導入した。安定な形質転換体は、1.0μg/ml ピューロマイシンを含む培地で選択した。
細胞にFasLまたはスタウロスポリンを処理し、あるいはUV照射し、アポトーシスを誘導した。説明すると、5 x 105細胞(培養培地500μl中)を、37℃で、10-400単位/ml hFasLと1.2-2.0時間、あるいは10μM スタウロスポリンと1.5-4.0時間、インキュベートした。UV照射では、StrataLinker UVオーブン (Stratagene)において、1 x 106細胞(PBS2 ml中)に500-2000 J/m2 (254 nm)にてUV照射し、10% FCS含有RPMI1640(4 ml)中で37℃にて1.5-2.0時間インキュベートした。Ca2+イオノフォア誘発PtdSer露出をモニターするため、細胞 (5 x 105細胞)をAnnexin V染色バッファー (10 mM Hepes-NaOHバッファー [pH7.4]、140 mM NaClおよび2.5 mM CaCl2含有) 500μl中で20℃にて3分間インキュベートし、3.0-10μM A23187で処理し、FACSAriaで20℃にて解析した。
細胞表面に露出するPtdSerおよびPtdEtnを検出するため、細胞を氷上で2500-5000倍希釈のCy5-Annexin V (Biovision)または800倍希釈のビオチン-Ro09-019866で15分間染色し、続いて1.0μg/ml APC-ストレプトアビジン (Annexin V染色バッファー中)により5μg/mlヨウ化プロピジウム(PI)の存在下染色し、FACSAriaまたはFACSCalibur (BD Biosciences)により解析した。PtdChoおよびSMの取り込みを評価するため、1 x 106細胞 (1 mM CaCl2含有HBSS (HBSS-Ca) 0.5 ml 中)を氷上で7分間インキュベートした。等量の200 nM 1-オレイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(NBD-PC)(Avanti Polar Lipids)またはN-[6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル]-スフィンゴシン-1-ホスホコリン(NBD-SM) (Avanti Polar Lipids) (HBSS-Ca中)を添加し、20℃でインキュベートした。一部(150μl)を150μl HBSS (5μg/ml 脂肪酸不含BSA (Sigma-Aldrich)および500 nM Sytoxblue (Molecular Probes)含有)と混合し、FACSAriaにより解析した。
ヒトPLB-985細胞を5-アザ-2’-デオキシシチジン (DAC, Sigma-Aldrich)で処理するため、1.0 x 106細胞(10% FCS含有RPMI10 ml中)を0.5 mM DACと7日間インキュベートした。DACは不安定な化合物であるため、DAC含有培地は24時間毎に交換した。DAC処理後、細胞を3つに分けた。1つはPtdSer露出の解析のためのFACS用、1つはXkr8遺伝子発現のためのリアルタイムRT-PCR 用、1つはメチル化特異的PCR解析用である67。バイサルファイトゲノムシークエンスのため、キット(MethyEasy Xceed, Human Genetic Signatures)を用いてDNAを亜硫酸水素塩で修飾した。説明すると、3μgのDNAを37℃で15分間0.3 M NaOH中でインキュベートすることにより変性させ、インキュベーション時間を90分に変更した点を除き供給元のプロトコールにしたがい亜硫酸水素ナトリウムで処理した。修飾したDNAを95℃で20分間変性させ、処理したDNAに特異的なプライマー(TTAGGGATTAGAATGTGTTT (配列番号20)および CCTATACAAATAACCCAACT (配列番号21))を用いてPCRにより増幅した。EpiTaq HSポリメラーゼ (Takara Bio) を用いてPCRを7-40サイクル実施し、配列決定のため生成物をpGEM-Teasyベクターにクローニングした。
ヒトおよびマウス細胞株並びに様々なマウス組織に由来する全RNAを、Superscript III 逆転写酵素 (Invitrogen) またはHigh Capacity RNA-to-cDNA(商標) キット (Applied Biosystems)を用いて逆転写した。生成物の一部を、LightCycler(商標)480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics)を含む反応混合物中で増幅した。リアルタイムRT-PCR用のプライマーは以下のとおりである:
mXkr8: 5’-GCGACGCCACAGCTCACACT-3’ (配列番号22)および 5’-CCCCAGCAGCAGCAGGTTCC-3’ (配列番号23)
mGapdh: 5’-AGCAGGCATCTGAGGGCCCA-3’ (配列番号24)および 5’-GAGAGCAATGCCAGCCCCGG-3’ (配列番号25)
hXkr8: 5’-AGGCCGGGCCATCATCCACT-3’ (配列番号26)および 5’-TGCGCCTGTTCTGAGGCAGC-3’ (配列番号27)
ヒトβ-アクチン: 5’-GCATCCTCACCCTGAAGTAC-3’ (配列番号28)および5’-CTTAATGTCACGCACGATTTC-3’ (配列番号29)
特異的mRNAは、LightCycler Systemが参照としてのそれぞれの直線化プラスミドDNAについてPCRによる集積の対数期の立ち上がりを検出した時点で、定量した。
hXkr8-GFPまたはhXkr8 2DA-GFPを発現するPLB-985細胞形質転換体から、既報のとおり膜画分を調製した53。次いで、膜を溶解バッファー (20 mM Tris-HCl [pH 7.2]、140 mM NaCl、1% Triton X-100、10% グリセロール、および1 mM (p-アミノフェニル) メタンスルホニルフルオリド (APMSF))に懸濁することにより可溶化した。不溶性物質を遠心分離により除去した後、膜タンパク質 (20μg) を、37℃で1時間、3単位の各組換ヒトカスパーゼ (Biovision)と、50 mM Hepes-NaOH (pH 7.4)、50 mM NaCl、5% (v/v) グリセロール、5 mM DTT、10 mM EDTA、0.1 mM APMSF、および0.1% CHAPS(100μl)中でインキュベートし、ウェスタンブロッティングにより解析した。
RIPAバッファー (50 mM Hepes-NaOH バッファー [pH 8.0]、1% NP-40、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、および10%プロテアーゼ阻害剤カクテル)中で細胞を溶解した。溶解物を5 x SDSサンプルバッファー (200 mM Tris-HCl [pH 6.8]、10% SDS、25% グリセロール、5% β-メルカプトエタノール、および0.05% ブロモフェノールブルー)と混合し、Xkr8-GFPの検出のため室温で1時間インキュベートし、あるいは他のタンパク質の検出のため5分間煮沸した。タンパク質を10-20%勾配SDS-PAGE (Bio Craft)上の電気泳動により分離し、PVDF メンブレン (Millipore)に転写した。メンブレンに3000倍希釈マウス抗GFP mAb、3000倍希釈マウス抗ヒトICAD mAb、または3000倍希釈ウサギ抗活性型カスパーゼ3 mAbを結合させ、続いて1,000倍希釈HRP結合ヤギ抗マウスまたはウサギ免疫グロブリン (Dako)とともにインキュベートした。ペルオキシダーゼ活性は、Western Lightning(商標)-ECL システム (PerkinElmer)により検出した。
(1)マウスXkr8のクローニング
本発明者らは以前に、PtdSerを多く露出する細胞をFACSによりソーティングし増殖させることを繰り返すことで、PtdSerを高レベルに発現するマウスBa/F3細胞のサブライン(Ba/F3-PS19)を樹立している15。Ca2+依存性リン脂質スクランブラーゼであるTMEM16Fは、2.5 kb以上のcDNAで構築したBa/F3-PS19のcDNAライブラリーから単離した。アポトーシス性のPtdSer露出に関与するスクランブラーゼを探索するため、長さ1.0〜2.5 kbのBa/F3-PS19 cDNAによりcDNAライブラリーを調製し、Ba/F3細胞に導入した。PtdSerを効率的に露出する細胞のFACSによる選別と増殖を5回繰り返し、選別した細胞を限界希釈した。この工程により、恒常的にPtdSer を露出する細胞株(LD-PS5-2-2)を樹立した(図1a)。LD-PS5-2-2細胞には、複数の膜貫通領域を有する401アミノ酸のタンパク質であるマウスXkr8をコードするcDNAのみが組み込まれていた。
以前の報告と一致して17,18、ヒトPLB-985白血病株およびRajiリンパ腫株は、スタウロスポリン、UV、またはFasLなどのアポトーシス性刺激によってPtdSerを発現せず、スタウロスポリンに応答してPtdSerを発現するヒトNamalwa細胞およびJurkat細胞とは非常に対照的であった(図2a)。リアルタイムRT-PCR解析によれば、PLB-985細胞およびRaji細胞におけるXkr8 mRNAレベルは、それぞれNamalwa細胞の8%および9%であった(図2b)。PLB-985細胞またはRaji細胞にhXkr8発現プラスミドを導入すると、これらの形質転換体は、効率的にスタウロスポリン、UV照射、またはFasLに応答してPtdSerを露出し、カスパーゼ活性化は増強しなかった(図2c)。これらの結果は、PLB-985細胞およびRaji細胞がPtdSerを露出できないのはXkr8遺伝子の発現の欠如によることを示唆する。
リン脂質スクランブラーゼは、細胞膜において非特異的にリン脂質を移動させることができる酵素として定義される20。Xkr8を介するスクランブラーゼ活性について調べるため、ヒトPLB-985およびhXkr8を発現するその形質転換体をスタウロスポリンで処理した。4時間後、ICAD (ICAD-LおよびICAD-S)はPLB-985およびそのhXkr8発現形質転換体において同様に十分に切断されていた(図4a)。PtdSer露出で観察されたように、親PLB-985細胞およびhXkr8形質転換体をPtdEtn結合ペプチドであるRO09-019821 (ROペプチド)を用いて解析すると、どちらの細胞も増殖中はPtdEtnを露出しなかった(図4b)。一方、スタウロスポリン処理hXkr8発現PLB-985細胞は、ROペプチドにより染色されPtdEtnの発現が示されたが、親細胞では染色されなかった。PtdChoおよびSMについてのスクランブル活性は、1-オレオイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (NBD-PC)、またはN-[6-[(7-nitro-2-1,3- ベンゾオキサジアゾール-4-イル)アミノ] ヘキサノイル]-スフィンゴシン-1-ホスホコリン (NBD-SM)の取り込みにより調べた。図4cおよび4dに示されるように、NBD-PCおよびNBD-SMは増殖中のPLB-985細胞またはhXkr8形質転換体では取り込まれなかった。一方、NBD-PCおよびNBD-SMは、スタウロスポリンを処理したhXkr8形質転換体では取り込まれたが、親細胞では取り込まれなかった。これらの結果は、Xkr8がアポトーシス細胞死の間に活性化され、非特異的スクランブラーゼとして機能することを示す。このXkr8の非特異的スクランブリング活性は、Ca2+依存性リン脂質スクランブラーゼであるTMEM16Fと類似していた15。しかしながら、アポトーシス誘導性のPtdSer露出とは異なり、PLB-985細胞およびhXkr8形質転換体におけるCa2+誘導性のPtdSer露出は同じ速度で生じ(図8)、このことはXkr8がCa2+依存性のPtdSer露出には影響しないことを示唆する。
Xkr8はXKファミリーのメンバーであり22、そのホモログは哺乳類、魚類、および両生類に存在する(図5a)。TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)およびTMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)を含むトポロジー予測プログラムを用いて、各種由来のXkr8のアミノ酸配列の解析により、6つから8つの膜貫通領域という予測の不一致が生じた。Xkr8タンパク質の全体構造が種間で保存されているとすれば、Xkr8は6つの膜貫通領域を有し、N末端およびC末端が細胞質内に存在すると考えられる(図5b)。オンラインサーチツール(CASVM, http://www.casbase.org/casvm/index.html)により、ヒト、マウス、ラット、フグ、メダカ、およびXenopusのXkr8のC末端細胞内領域に、よく保存された カスパーゼ3認識配列23が同定された(図5a)。
PtdSerはアポトーシスを起こしたほとんどの細胞で細胞表面に暴露される。それゆえ、mXkr8 mRNAは、精巣で非常に高く発現し、心臓および筋肉での発現が低い点を除き、様々なマウス組織で普遍的かつほぼ同程度に発現している(図6a)。リン脂質スクランブリングにおけるXkr8の役割を調べ、またそのリン脂質スクランブリング活性をTMEM16Fと比較するため、Xkr8欠損胎児胸腺細胞株 (IFET) を樹立した(図6b)。FasLに応答して、Xkr8flox/flox IFET細胞およびTMEM16F-/- IFET細胞は迅速にPtdSerを露出した(図6c)。これに対して、Xkr8-/- IFET細胞はこの処理に対してPtdSerを露出しなかったが、カスパーゼ3 は同様に活性化されていた。Xkr8-/- IFET細胞にmXkr8 cDNAを有するレトロウイルスを感染させると、この形質転換体はFasLに応答してPtdSerを露出した。一方、Ca2+ イオノフォアはXkr8flox/flo IFET細胞およびXkr8-/- IFET細胞においてPtdSerの露出を誘導したが、TMEM16F-/- IFET細胞では誘導しなかった(図6d)。これらの結果から、Xkr8はアポトーシス性のPtdSer露出に関与し、TMEM16FはCa2+誘導性のPtdSer露出に関与することがわかる。
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Claims (9)
- Xkr8の機能を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法:
(1)Xkr8発現細胞と、Xkr8の機能を調節する物質の候補物質とを接触させる工程、および
(2)該細胞の細胞膜におけるリン脂質の分布を変化させる候補物質を選択する工程。 - リン脂質が、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンから選択される、請求項1記載の方法。
- ホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項2記載の方法。
- ホスファチジルエタノールアミンの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルエタノールアミンの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項2記載の方法。
- ホスファチジルコリンの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、ホスファチジルコリンの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項2記載の方法。
- スフィンゴミエリンの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質がXkr8の機能を亢進する物質として選択され、スフィンゴミエリンの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質がXkr8の機能を抑制する物質として選択される、請求項2記載の方法。
- アポトーシスが関与する疾患の治療または予防のための薬剤のスクリーニング方法である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- アポトーシスが関与する疾患が自己免疫疾患である、請求項7記載の方法。
- アポトーシスが関与する疾患ががんである、請求項7記載の方法。
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