JPWO2013180124A1 - 生分解性高分子の分解制御方法 - Google Patents
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Abstract
Description
<2> さらに芽胞の発芽剤を含有する、<1>に記載の生分解性高分子組成物。
<3> 発芽剤が、イーストエキスである、<2>に記載の生分解性高分子組成物。
<4> <1>〜<3>のいずれかに記載の生分解性高分子組成物中の芽胞を、発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことを特徴とする、生分解性高分子の分解方法。
<5> <1>〜<3>のいずれかに記載の生分解性高分子組成物を調製し、
生分解性高分子組成物中の芽胞を、発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことを特徴とする、生分解性高分子の分解制御方法。
本発明によれば、環境条件(特に微生物の種類、分布等)に依存せずに、生分解性高分子の分解速度を制御(特に促進)することが可能である。
また、本発明によれば、使用中は十分な物性を発揮し、廃棄後は速やかに分解されるように、生分解性高分子の分解開始時期を制御することが可能である。
また、本発明の芽胞形成菌は、高温耐性及び生分解性高分子(特にPESu)の分解能に優れた、生分解性高分子分解促進剤として有用な芽胞を形成する。
PHB:ポリ(3−ヒドロキシブチレート)(poly(3-hydroxybutyrate))
PESu:ポリ(エチレンスクシネート)(poly(ethylene succinate))
PBAT:ポリブチレンアジペートテレフタレート(poly(butylene adipate terephthalate))
YE:イーストエキス(Yeast extract)
本発明は、生分解性高分子の生分解能を有する芽胞形成菌の芽胞および生分解性高分子を含有する、生分解性高分子組成物に関する。
例えば、脂肪族ポリエステル、脂肪族芳香族ポリエステル等の生分解性高分子の生分解能を有する芽胞形成菌として、バチラス(Bacillus)属細菌、パエニバチラス(Paenibacillus)属細菌、ブレビバチラス(Brevibacillus)属細菌等が報告されており(Biotechnol. Lett. 26, 2004,771-777, Appl. Environ. Microbiol. 69. 2003. 2498-2504, Polym. Degrad. Stabil. 84. 2004. 115-121, J. Biosci. Bioeng. 97. 2004. 131-133, FEMS Microbiol. Lett.264. 2006.152-159, Appl. Microbiol. Biotechnol. 79, 2008, 743-750, Biotecnol. Adv. 26, 2008, 246-265)、これらを本発明に用いることもできる。
このような方法で、栃木県下野市の水田土壌より分離された細菌の一例として、バチルス・エスピーJKCM2010株がある。
後記実施例に示すとおり、バチルス・エスピーJKCM2010株の16Sリボゾーム塩基配列は、バチルス・サブチリスに98%と高い相動性を示した。これにより、本発明菌をバチルス属細菌と同定し、バチルス・エスピーJKCM2010株と名づけた(図1)。
バチルス・エスピーJKCM2010株は、生分解性高分子の生分解能に優れ、その芽胞が耐熱性に優れる等の点から、生分解性高分子分解促進剤として、本発明の生分解性高分子組成物に好ましく用いることができる。
芽胞形成菌の芽胞は、土壌微生物の芽胞の混合物を単離せず、用いることもできる。
本発明に用いられる芽胞の発芽剤は、イーストエキス等の発芽剤から選択される1種類又は2種類以上の発芽剤であり得る。
本発明の生分解性高分子組成物における芽胞形成菌の芽胞の濃度は、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はないが、生分解性高分子組成物において、芽胞から発芽する菌として、10000〜1000000000CFU/g(コロニー形成単位)であり得る。
例えば、本発明の生分解性高分子組成物は、その分解速度(例えば、芽胞を発芽環境に曝してから10日間での質量減少率)が、芽胞を含有しない場合の分解速度に比べて、∞%以上、700%以上であり得る。
本発明は、生分解性高分子組成物中の芽胞を、発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことを特徴とする、生分解性高分子の分解方法に関する。
本発明の方法によれば、生分解性高分子中に、予め生分解性高分子を生分解する能力を有する芽胞形成菌の芽胞を含有させることで、生分解性高分子組成物を廃棄する環境条件(特に微生物の種類、分布等)に依存せずに、生分解性高分子の分解速度を制御(特に促進)することが可能である。
また、生分解性高分子組成物の切断等により、生分解性高分子組成物表面への芽胞の露出を促すこともできる。
本発明は、生分解性高分子組成物を調製し、生分解性高分子組成物中の芽胞を、発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことを特徴とする、生分解性高分子の分解制御方法に関する。
本発明によれば、生分解性高分子組成物を使用中は分解が開始されず、廃棄後発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことで、初めて生分解性高分子の分解が開始される。したがって、分解開始時期を厳密に制御することが可能である。
例えば、本発明の生分解性高分子組成物は、発芽させない状態で使用中の分解率(例えば10日間での質量減少率)が5%以下、0%であり得る。
(実験方法)
1. 環境からの有効芽胞を取り出す方法
1-1. 土壌からの芽胞の形成と精製
(1)群馬県桐生市の土壌を採取した。
(2)土壌をドラフト内で風乾した(一晩)。
(3)土壌約1gを加熱処理(120℃、30分間)した。
(4)滅菌純水(MilliQ水)10mLで土壌懸濁液を作製し、その希釈系列も作製した。
(5)上記の菌液をLB寒天培地に50μL塗布し、菌が生えてくるまで30℃で培養した。
(8)前培養液10mLを芽胞形成培地100mLの入った坂口フラスコに加え、30℃で振とう培養した(2日間)(本培養)。
(9)位相差顕微鏡で芽胞の形成を確認した。
(10)遠沈管に芽胞形成培地を全量移し、遠心分離した(8000rpm、4℃、20分間)。
(11)液体培地を捨て、冷滅菌MilliQ水(5mL)で懸濁し、1mLずつエッペンドルフチューブに分注した。
(12)エッペンドルフチューブを遠心分離(12000rpm、4℃、10分)した。
(13)沈殿物の表面を優しくピペッティングし洗浄した。
(14)沈殿物に、新しい冷滅菌milliQ水を加えて再懸濁し、遠心分離(12000rpm、4℃、10分)した。この操作を数回繰り返した。
(15)位相差顕微鏡で芽胞がほぼ100%であることを確認した。
(16)遠心分離後の上清を捨て、芽胞を凍結乾燥した(一晩)。
(17)芽胞を‐20℃の冷凍庫で保存した。
本実験で用いた生分解性プラスチックは表3の通り。
(2)2枚のフィルムで芽胞を溶融接着し、メタノールとMilliQ水で洗浄し一晩凍結乾燥させた。
(3)芽胞内在フィルムの重量を測定した。
(4)使用する器具・ステンレス製の網をオートクレーブ(121℃、15分)し滅菌した。
(5)15mLの液体ミネラル培地(表9)を準備した。
(6)フィルムをメタノールと滅菌MilliQ水で洗浄した。
(7)ステンレス製の網の上で、ハサミを用いてフィルムを芽胞が露出するように切断した。
(8)フィルムを網ではさみ、メタノールとMilliQ水で洗浄し、液体ミネラル培地に入れた。
(9)サンプルを30℃で振とう培養した(5, 10, 15, 20日間)。
(10)培養後、回収したフィルムをメタノールとMilliQ水で洗浄した。
(11)洗浄したフィルムを一晩凍結乾燥した。
(12)培養前の芽胞内在フィルムの重量から培養後の芽胞内在フィルムの重量を引くことで、重量減少量を計算した。
(13)PHB、PESu、そしてPBATに関して、YE無しの液体ミネラル培地でコントロール実験を行った。
2-1. 土壌芽胞内在PHBフィルムの分解実験
PHBの構造を以下に示す。
土壌芽胞をフィルムに内在させ(芽胞内在フィルム)、YEを添加すると、はじめてPHBに対して、分解剤として有効であった。すなわち、フィルムは優れた分解性を示した。YEを用いず、土壌芽胞のみ(芽胞内在フィルムのコントロール)では分解剤として機能しなかった。すなわち、フィルムは分解されなかった。
PESuの構造を以下に示す。
土壌芽胞をフィルムに内在させ(芽胞内在フィルム)、YEを添加すると、はじめてPESuに対して、分解剤として有効であった。すなわち、フィルムは優れた分解性を示した。YEを用いず、土壌芽胞のみ(芽胞内在フィルムのコントロール)では分解剤として機能しなかった。すなわち、フィルムは分解されなかった。
土壌芽胞をフィルムに内在させ(芽胞内在フィルム)、YEを添加すると、はじめてPBATに対して、分解剤として有効であった。すなわち、フィルムは優れた分解性を示した。YEを用いず、土壌芽胞のみ(芽胞内在フィルムのコントロール)では分解剤として機能しなかった。すなわち、フィルムは分解されなかった。
(実験方法)
1-1 試薬
(1)ポリエステル
poly(ethylene succinate) (PESu)は日本触媒(株)から提供された。PESuをクロロホルムに溶解し、メタノールで再沈殿させた。沈殿物を、濾紙 (FILTER PAPER No.2、ADVANTEC社製) により回収した。少量の溶媒を含む濾物を、そのまま乳鉢でパウダーになるまですり潰した。パウダー状にした高分子を減圧乾燥させた後、使用した。
0.2%PESu乳化培地を以下の手順で調製した。PESu-クロロホルム溶液、1%プライサーフ、およびMilliQ水の混合液を超音波処理 (TOMY UD-200) により乳化した。乳化液中のクロロホルムは、その後1日放置することにより完全に除去された。表7に示す基本培地に上記乳化溶液を加え、さらに2%の寒天を加えた。これを、オートクレーブ滅菌(121℃、15分間)し、滅菌シャーレ(サンセイ医療機材(株))に流し込んだ。
PESuをクロロホルムに溶解し、2.5%(wt/v)クロロホルム溶液とした。ガラスシャーレを用いて、ソルベントキャスト法でフィルムを作製した。さらに、ソルベントキャストフィルムを2枚のテフロン(登録商標)シートではさみ、熱プレス(120℃、10秒間)後、室温で急冷することで、溶融フィルムを作製した。
市販の特級試薬をそのまま使用した。
単離源として、栃木県下野市の水田土壌を用いた。土壌懸濁液を上記PESu乳化培地に塗布し、30℃で静置培養した。乳化培地上にクリアゾーンを形成したコロニーを新しい乳化培地に画線し、30℃で静置培養した。これを3回繰り返し、菌の純化を行った。
単離したPESu分解菌の16S rDNAをコロニーPCR法により増幅した。使用したプライマーは16Sf / 16Sr、あるいは、27f/ 1525rの組合せであり、これらを各々20pmol用いた。テンプレートは、コロニーを7.6μlの滅菌milliQ水に懸濁し、95℃で10分間保温した後、急冷することにより変性させたものを用いた。サーマルサイクルは、94℃5分、(94℃20秒 -55℃30秒 - 72℃2分)×25回、72℃10分の条件で行った。酵素はEx Taq Polymerase (TaKaRa社製)を用いた。このPCR産物をLigation Kit Ver2 (TaKaRa社製)を用いてpGEM-T EasyVector (Promega社製)に連結した。塩化カルシウム法を用いて、組み換えプラスミドをEscherichia coli DH5αに導入した。これをアンピシリン(100μg/mL) 50μL、Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG、1mM)30μL、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-galactopyranoside (X-Gal、0.1mM) 30μLを塗布しておいたLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養した。プレート上に形成されたコロニーの中から、白いコロニーをレプリカし、プラスミドDNAを抽出し、インサートを確認した。インサートの確認されたコロニーに関して、プラスミド抽出・精製を行った。
芽胞形成用培地(表2)20mLの入った50mLファルコンに単離株を植菌し、30℃で一晩振とう培養した(前培養)。芽胞形成用培地100mLの入った坂口フラスコに、前培養液を10mL植菌して30℃で2日間振とう培養した(本培養)。位相差顕微鏡(BX-PHD、OLYMPUS)を用いて芽胞の確認をした。培養液を遠沈管に移し遠心分離(8000rpm、20min、4℃)し、上清を捨て、冷却した滅菌MilliQ水に再懸濁した。再懸濁液をエッペンドルフチューブに分注した。これを遠心分離(12000rpm、4℃、10min)し、沈殿物の表面を優しくピペッティングすることにより洗浄した。残った沈殿物を、新たな冷滅菌MilliQ水に再懸濁し、遠心分離(12000rpm、4℃、10min)した。この操作を数回繰り返し、芽胞を洗浄した。再懸濁液を再度、位相差顕微鏡を用いて観察し、芽胞がほぼ100%であることを確認した。再懸濁液を遠心分離(12000rpm、4℃、10min)し、上清を捨て、一晩凍結乾燥した。粉末状の芽胞を-20℃の冷凍庫で保存した。
乾燥状態の芽胞1mgを滅菌サンプル瓶に入れた。Drying sterilizer SG62(yamato社)を用いて、加熱処理(100℃、20分間)した。芽胞の入ったサンプル瓶を取り出し、滅菌MilliQ水10mLを加えた。この芽胞懸濁液の希釈系列を作製し、Yeast Extract(YE)の量を変えたミネラル培地(表9)に塗布した。また、この培地には炭素源としてコハク酸を加えた。30℃で一晩培養後、形成されたコロニーを数え、1mg当たりの生菌数(cfu/mg)を計算した。YE濃度0.5g/Lのミネラル培地(表9)での芽胞の発芽数を100%とし、各々の培地での芽胞の発芽数から、発芽率を計算した。
生分解性プラスチックに芽胞をブレンドする際、芽胞を溶融接着法によりブレンドするため、芽胞の耐熱性試験を行った。
2枚のPESuフィルムで芽胞0.5mgをはさみこんだ。これを2枚のテフロン(登録商標)シートではさみ、120℃で10秒間、熱プレスした。その後、芽胞内在PESuフィルムをメタノールとMilliQ水で洗浄し、一晩凍結乾燥させた。
使用する器具を全てオートクレーブ(121℃、15分間)で滅菌した。芽胞内在PESuフィルムをハサミで半分に切り、わざと芽胞を露出させた。フィルムをメタノールと滅菌MilliQ水で洗浄し、ステンレス製の網ではさみこんだ。再度メタノールと滅菌MilliQ水で洗浄しミネラル培地15mLの入ったファルコンに加えた。これを30℃で5、10、15、および20日間振とう培養した。培養後、回収されたフィルムはメタノールとMilliQ水で洗浄され、一晩凍結乾燥された。分解前のフィルムの重量から分解後のフィルムの重量を減算することによって、フィルムの重量減少を算出した。コントロール実験も同様に行った。
2-1 PESu分解菌
PESu分解菌として1株単離した。この1株をJKCM2010株と命名した。
JKCM2010株の位相差顕微鏡写真を図6に、クリアゾーン形成写真を図7に示す。
JKCM2010株の16S rDNA配列に基づき作製した系統樹を図1に示す。
JKCM2010株は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)に98%と高い相同性を示した。
JKCM2010株の芽胞形成を確認するため位相差顕微鏡観察を行った。その結果、光屈折性を有する芽胞が確認された(図8)。
初めに、YE濃度が0、0.1、0.2、0.3、0.4、および0.5[g/L]のミネラル培地において芽胞の発芽率を求めた(表10)。次に、YE濃度が0、0.02、0.04、0.06、0.08、および0.1[g/L]のミネラル培地において芽胞の発芽率を求めた(表11)。その結果、芽胞の発芽にはYEが必要であること、および芽胞の発芽はYE濃度に依存することが示唆された。
JKCM2010株の芽胞の耐熱性を乾熱条件下で調べた。各加熱温度での加熱時間に対する芽胞の生菌数の対数プロットを図9に示す。また、図9のグラフからD値を求めた(表12)。100℃でのD値は240分、120℃でのD値は70分であることがわかった。この結果、JKCM2010株の芽胞は、PESuの融点104℃付近において高い耐熱性を示すことが明らかになった。以上のことから、JKCM2010株の芽胞をPESuにブレンドできることが示された。
作製した芽胞内在PESuフィルムを図10に示す。
白い粒(原図では茶色)が芽胞である。
図11に芽胞内在PESuフィルムの分解実験の結果を示す。YE存在下芽胞内在PESuフィルムでは重量減少が起きていることから、分解が起こっていることがわかった。Control 1では重量減少が起こっていないことから、YE存在下芽胞非内在PESuフィルムでは分解が起こらないことがわかった。control 1との比較から、内在する芽胞の発芽により生じた分解菌によって生分解が起きたことが示唆された。同様に、control 2では重量減少が起こっていないことから、YE非存在下芽胞内在PESuフィルムでは分解は起こらないことがわかった。control 2との比較から、内在させた芽胞の発芽にはYEが必要であることがわかった。以上の結果のまとめを表13に示す。
(1)発芽剤を添加した自然環境中に、芽胞内在生分解性プラスチックを廃棄する。
(2)プラスチック表面に傷がつき、芽胞が露出する。
(3)露出した芽胞が発芽し分解菌が生じる。
(4)発芽した分解菌によって生分解が開始される。
Claims (5)
- 生分解性高分子の生分解能を有する芽胞形成菌の芽胞および生分解性高分子を含有する、生分解性高分子組成物。
- さらに芽胞の発芽剤を含有する、請求項1に記載の生分解性高分子組成物。
- 発芽剤が、イーストエキスである、請求項2に記載の生分解性高分子組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の生分解性高分子組成物中の芽胞を、発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことを特徴とする、生分解性高分子の分解方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の生分解性高分子組成物を調製し、
生分解性高分子組成物中の芽胞を、発芽剤存在下、芽胞の発芽環境に曝すことを特徴とする、生分解性高分子の分解制御方法。
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