JPWO2012133119A1 - Method for producing ferritin - Google Patents
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Abstract
本発明は、互いに異なるアミノ酸配列を有する第１のサブユニット及び／又は第２のサブユニットから構成されるフェリチンの製造方法であって、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子、プロモーター、シャイン・ダルガノ配列、複製起点、及び、ラクトースリプレッサー遺伝子を含み、シャイン・ダルガノ配列がプロモーターと第１の遺伝子との間に配置されている第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子、プロモーター、シャイン・ダルガノ配列、及び、複製起点を含み、シャイン・ダルガノ配列がプロモーターと第２の遺伝子との間に配置されている第２のプラスミドとともに、大腸菌に導入する工程と、大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程と、を備える、フェリチンの製造方法を提供する。The present invention relates to a method for producing ferritin composed of a first subunit and / or a second subunit having different amino acid sequences, the first gene encoding the first subunit, a promoter, A first plasmid comprising a Shine-Dalgarno sequence, an origin of replication, and a lactose repressor gene, wherein the Shine-Dalgarno sequence is located between the promoter and the first gene, alone or in a second A second gene encoding a subunit, a promoter, a Shine-Dalgarno sequence, and a second plasmid comprising an origin of replication, wherein the Shine-Dalgarno sequence is located between the promoter and the second gene, And a step of culturing Escherichia coli to produce ferritin. To provide a production method.
Description
本発明は、フェリチンの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing ferritin.
フェリチンは、２０〜２５ｋＤａのサブユニットから構成される直径８．５〜１２ｎｍのかご状タンパク質である。フェリチンの内部は空洞であり、そこに鉄等の金属元素を貯蔵することができる。このような性質を持つフェリチンは、電子機器、医療及び環境等の分野において、ナノサイズの材料としての利用が期待されている（特許文献１）。 Ferritin is a cage protein with a diameter of 8.5 to 12 nm composed of subunits of 20 to 25 kDa. The interior of ferritin is a cavity in which metal elements such as iron can be stored. Ferritin having such properties is expected to be used as a nano-sized material in the fields of electronic equipment, medicine, and the environment (Patent Document 1).
ウマのフェリチン等の動物由来のフェリチンは、２２ｋＤａのＨサブユニットと２０ｋＤａのＬサブユニットとからなるヘテロ２４量体である。動物由来のフェリチンは、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が変化すると、金属元素を貯蔵できる量が変化することが知られている。しかし、容易に入手可能な天然のフェリチンは、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が２：８であるウマの脾臓由来のフェリチン及びそのアポフェリチンだけである。近年、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なる動物由来のフェリチンの製造方法が提案されている（非特許文献１〜３）。 Animal-derived ferritin such as horse ferritin is a hetero24-mer composed of a 22 kDa H subunit and a 20 kDa L subunit. It is known that the amount of metal element that can be stored in animal-derived ferritin changes when the composition ratio of the H subunit and the L subunit changes. However, the only natural ferritin that is readily available is ferritin and equine apoferritin derived from the spleen of horses with a composition ratio of H subunit to L subunit of 2: 8. In recent years, methods for producing animal-derived ferritin with different constituent ratios of the H subunit and the L subunit have been proposed (Non-Patent Documents 1 to 3).
非特許文献１に記載の方法では、無細胞タンパク質合成系（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるヒト由来のフェリチンを合成している。しかしながら、この方法は、反応混合物が２０μｌと極めて少ない容量で行われており、工業的にフェリチンを製造する方法としては不向きである。 In the method described in Non-Patent Document 1, human-derived ferritin having a different composition ratio of H subunit and L subunit is synthesized by using a cell-free protein synthesis system (in vitro translation system). However, this method is carried out in a very small volume of 20 μl of reaction mixture, and is not suitable as a method for industrially producing ferritin.
非特許文献２に記載の方法では、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるヒト由来のフェリチンを、ｐＥＴベクターを用いて大腸菌に発現させている。非特許文献３に記載の方法では、ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるヒト由来のフェリチン及びマウス由来のフェリチンを、ｐＥＴベクター又はｐＡＣＹＣベクターを用いて大腸菌に発現させている。しかしながら、これらの方法では、タンパク質の発現誘導が制御しにくく、目的のタンパク質を大量に製造することが困難である。また、発現されるフェリチンのＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率のパターンも、多いとは言い難く、改善の余地が残っている。 In the method described in Non-Patent Document 2, human-derived ferritin having a different composition ratio of H subunit and L subunit is expressed in Escherichia coli using a pET vector. In the method described in Non-Patent Document 3, human-derived ferritin and mouse-derived ferritin having different constituent ratios of H subunit and L subunit are expressed in E. coli using a pET vector or a pACYC vector. However, in these methods, the induction of protein expression is difficult to control, and it is difficult to produce the target protein in large quantities. Moreover, it is difficult to say that the pattern of the composition ratio of the H subunit and L subunit of ferritin expressed is large, and there remains room for improvement.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造できる、フェリチンの製造方法の提供を目的とする。 This invention is made | formed in view of the said situation, and it aims at provision of the manufacturing method of ferritin which can manufacture efficiently various ferritin from which the component ratio of a subunit differs.
本発明は、互いに異なるアミノ酸配列を有する第１のサブユニット及び／又は第２のサブユニットから構成されるフェリチンの製造方法に関する。本発明に係る製造方法は、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子、第１の遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列（ＳＤ配列）、複製起点、及び、上記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、上記ＳＤ配列が上記プロモーターと第１の遺伝子との間に配置されている第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子、第２の遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列、及び、第１のプラスミドの複製起点とは異なる複製起点を含み、上記ＳＤ配列が上記プロモーターと上記第２の遺伝子との間に配置されている第２のプラスミドとともに、大腸菌に導入する工程と、上記大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程と、を備える。 The present invention relates to a method for producing ferritin composed of a first subunit and / or a second subunit having different amino acid sequences. The production method according to the present invention includes a first gene encoding a first subunit, a promoter that controls expression of the first gene, a Shine-Dalgarno sequence (SD sequence), an origin of replication, and a function of the promoter A first plasmid containing a lactose repressor gene that suppresses the above, and wherein the SD sequence is located between the promoter and the first gene, alone or a second plasmid encoding the second subunit Gene, a promoter that controls expression of the second gene, an SD sequence, and an origin of replication different from the origin of replication of the first plasmid, wherein the SD sequence is between the promoter and the second gene. A step of introducing into E. coli together with the second plasmid arranged, and a step of culturing the E. coli to produce ferritin.
本発明に係る製造方法によれば、第１のサブユニットをコードする遺伝子及び第２のサブユニットをコードする遺伝子をそれぞれ別々のプラスミドに組み入れ、これらを組み合わせて大腸菌に導入することにより、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造することができる。 According to the production method of the present invention, the gene encoding the first subunit and the gene encoding the second subunit are respectively incorporated into separate plasmids, and these are combined and introduced into E. coli, whereby the subunits are obtained. A variety of ferritins having different composition ratios can be efficiently produced.
第１のプラスミド及び第２のプラスミドのＳＤ配列をそれぞれ独立に選択することにより、当該フェリチンにおける上記第１のサブユニットと上記第２のサブユニットとの比率が調節されてもよい。ＳＤ配列を変化させることで、第１のサブユニット及び第２のサブユニットの発現量を調整することができる。その結果、産生されるフェリチンのサブユニットの構成比率のパターンをより多様に制御することができる。ＳＤ配列は、ＡＧＧＡ及びＡＧＧＡＧＧから選択されてもよい。 The ratio between the first subunit and the second subunit in the ferritin may be adjusted by independently selecting the SD sequences of the first plasmid and the second plasmid. By changing the SD sequence, the expression levels of the first subunit and the second subunit can be adjusted. As a result, the pattern of the composition ratio of the ferritin subunits to be produced can be controlled more diversely. The SD sequence may be selected from AGGA and AGGAGGG.
上記プロモーターは、ｔａｃプロモーターであってもよい。上記ラクトースリプレッサー遺伝子は、ｌａｃＩｑ遺伝子であってもよい。上記大腸菌は、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌であってもよい。これら各構成を採用することにより、フェリチン製造の効率を更に向上することができる。The promoter may be a tac promoter. The lactose repressor gene may be a lacI q gene. The Escherichia coli may be Escherichia coli having no deficiency in the lactose operon. By adopting each of these configurations, the efficiency of ferritin production can be further improved.
上記フェリチンがＨサブユニット及びＬサブユニットから構成されるウマ由来のフェリチンであり、第１のサブユニットがＨサブユニットで、第２のサブユニットがＬサブユニットであるか、又は、第１のサブユニットがＬサブユニットで、第２のサブユニットがＨサブユニットであってもよい。 The ferritin is a horse-derived ferritin composed of an H subunit and an L subunit, the first subunit is an H subunit, the second subunit is an L subunit, or the first subunit The subunit may be an L subunit and the second subunit may be an H subunit.
本発明によれば、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造できる、フェリチンの製造方法が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of ferritin which can manufacture efficiently various ferritin from which the component ratio of a subunit differs is provided.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態に係るフェリチンの製造方法は、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子を含む第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子を含む第２のプラスミドとともに大腸菌に導入する工程と、大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程とを主として備える。この方法により、互いに異なるアミノ酸配列を有する第１のサブユニット及び／又は第２のサブユニットから構成されるかご状タンパク質であるフェリチンが製造される。 The ferritin production method according to the present embodiment includes the first plasmid containing the first gene encoding the first subunit alone or the second plasmid encoding the second subunit. The method mainly includes a step of introducing it into E. coli together with the second plasmid and a step of culturing E. coli to produce ferritin. By this method, ferritin, which is a cage protein composed of a first subunit and / or a second subunit having different amino acid sequences, is produced.
本実施形態に係る方法により製造され得るフェリチンは、微生物由来のフェリチン、動物由来のフェリチン若しくは植物由来のフェリチン、又はこれらの変異体を含む。本明細書において、「フェリチン」は、フェリチン様タンパク質であるＤｐｓ（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ）も含む。微生物由来のフェリチンとしては、ヘリコバクター菌由来のフェリチン、フェリチン様タンパク質であるリステリア菌由来のＤｐｓ及びスルホロバス菌由来のＤｐｓ等が挙げられる。動物由来のフェリチンとしては、ヒト由来のフェリチン、マウス由来のフェリチン、及びウマ由来のフェリチン等が挙げられる。植物由来のフェリチンとしては、大豆フェリチン等が挙げられる。フェリチンの変異体は、フェリチン本来の構造及び機能を有する変異体であれば特に制限されない。フェリチンの変異体は、通常の遺伝子工学的手法、例えば部位特異的変異導入法によってフェリチンをコードする遺伝子に人為的に変異を導入する方法により作製することができる。本実施形態に係る方法は、動物由来のフェリチン、特にウマ由来のフェリチンを製造するために好適である。 Ferritin that can be produced by the method according to the present embodiment includes ferritin derived from microorganisms, ferritin derived from animals or ferritin derived from plants, or variants thereof. In the present specification, “ferritin” also includes Dps (DNA binding protein from cells) which is a ferritin-like protein. Examples of the ferritin derived from microorganisms include ferritin derived from Helicobacter, Dps derived from Listeria, which is a ferritin-like protein, and Dps derived from sulfolobas. Examples of animal-derived ferritin include human-derived ferritin, mouse-derived ferritin, and horse-derived ferritin. Examples of plant-derived ferritin include soybean ferritin. The mutant of ferritin is not particularly limited as long as it is a mutant having the original structure and function of ferritin. A ferritin mutant can be prepared by a method of artificially introducing a mutation into a gene encoding ferritin by a conventional genetic engineering technique, for example, a site-directed mutagenesis method. The method according to this embodiment is suitable for producing animal-derived ferritin, particularly horse-derived ferritin.
フェリチンのサブユニットとは、フェリチンを構成する単一のタンパク質分子を意味する。例えば、ウマ等の動物由来のフェリチンを構成するＨサブユニット及びＬサブユニットが挙げられる。フェリチンの変異体のサブユニットとしては、フェリチン本来の構造及び機能を有する変異体を構成するサブユニットであれば特に制限されない。フェリチンがＨサブユニット及びＬサブユニットから構成されるとき、第１のサブユニットがＨサブユニットで、第２のサブユニットがＬサブユニットであってもよいし、第１のサブユニットがＬサブユニットで、第２のサブユニットがＨサブユニットであってもよい。 The subunit of ferritin means a single protein molecule constituting ferritin. For example, H subunit and L subunit constituting ferritin derived from animals such as horses can be mentioned. The subunit of the ferritin mutant is not particularly limited as long as it is a subunit constituting a mutant having the original structure and function of ferritin. When ferritin is composed of an H subunit and an L subunit, the first subunit may be an H subunit, the second subunit may be an L subunit, or the first subunit may be an L subunit. In the unit, the second subunit may be an H subunit.
本実施形態に係る第１のプラスミドは、第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列及び第１の遺伝子をこの順に含み、さらに複製起点、及び、前記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を任意の配置に含む。本実施形態に係る第２のプラスミドは、第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子の発現を制御するプロモーター、ＳＤ配列及び第２の遺伝子をこの順に含み、さらに任意の位置に複製起点を含む。 The first plasmid according to the present embodiment includes a promoter that controls the expression of the first gene encoding the first subunit, an SD sequence, and the first gene in this order, and further includes a replication origin, and the promoter A lactose repressor gene that suppresses the function of The second plasmid according to the present embodiment includes a promoter that controls the expression of the second gene encoding the second subunit, an SD sequence, and the second gene in this order, and further has an origin of replication at an arbitrary position. Including.
本実施形態に係るプラスミドは、ｐＢＲ系プラスミド、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＣＤＦ系プラスミド、ｐＣＯＬＡ系プラスミド及びｐＲＳＦ系プラスミド等の大腸菌を宿主とするプラスミドを基に構築することができる。例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴｋｍＳ２（Ｍｉｓｈｉｍａ， Ｎ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．、第１３巻、８６４−８６８頁、１９９７年）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン社製）、ｐＣＤＦ−２（ノバジェン社製）、ｐＲＳＦ−２（ノバジェン社製）、ｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）及びｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製）が挙げられる。好ましくは、ｐＫＫ２２３−３又はｐＡＣＹＣ１７７を基にプラスミドが構築される。 The plasmid according to this embodiment can be constructed on the basis of a plasmid using Escherichia coli as a host, such as pBR plasmid, pUC plasmid, pACYC plasmid, pCDF plasmid, pCOLA plasmid, and pRSF plasmid. For example, pUC118, pUC119, pBR322, pETkmS2 (Mishima, N. et al., Biotechnol. Prog., 13, 864-868, 1997), pMAL (New England Biolabs), pET-28a (+) (Novagen) Product), pCDF-2 (manufactured by Novagen), pRSF-2 (manufactured by Novagen), pKK223-3 (manufactured by GE Healthcare Japan) and pACYC177 (manufactured by Nippon Gene). Preferably, a plasmid is constructed based on pKK223-3 or pACYC177.
フェリチンのサブユニットをコードする遺伝子は、フェリチンを産生する細胞から通常のクローニング法によって得てもよいし、ＧｅｎＢａｎｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）に登録されているフェリチンのサブユニットの構造遺伝子を基に、通常行われる方法により人工的に合成してもよい。 The gene encoding the subunit of ferritin may be obtained from cells producing ferritin by a conventional cloning method, or registered in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Based on the structural gene of the ferritin subunit, it may be artificially synthesized by a conventional method.
第１の遺伝子又は第２の遺伝子の発現を制御するプロモーターは、互いに同一でも異なっていてもよい。プロモーターは、好ましくは、サブユニットをコードする遺伝子の５’側上流に配置される。プロモーターは、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、並びに、ｔａｃプロモーター及びｔｒｃプロモーター等のｌａｃプロモーターとｔｒｐプロモーターとが融合したプロモーターから選ばれる。発現効率の観点から、ｔａｃプロモーターが好ましい。 The promoters that control the expression of the first gene or the second gene may be the same as or different from each other. The promoter is preferably located 5 'upstream of the gene encoding the subunit. The promoter is selected from, for example, a lac promoter, a trp promoter, and a promoter obtained by fusing a lac promoter and a trp promoter such as a tac promoter and a trc promoter. From the viewpoint of expression efficiency, the tac promoter is preferable.
第１のプラスミドに含まれるラクトースリプレッサー遺伝子は、第１のプラスミドのプロモーターの機能を抑制し、通常は第２のプラスミドのプロモーターの機能も抑制する。プロモーターを制御する効率の観点から、このラクトースリプレッサーは、好ましくはｌａｃＩｑ遺伝子である。ｌａｃＩｑ遺伝子は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質を過剰に発現できるように変異された、制御プロモーター部位に接続されたｌａｃＩ遺伝子である。The lactose repressor gene contained in the first plasmid suppresses the function of the promoter of the first plasmid and usually also suppresses the function of the promoter of the second plasmid. From the viewpoint of the efficiency of controlling the promoter, this lactose repressor is preferably the lacI q gene. The lacI q gene is a lacI gene connected to a regulatory promoter site that has been mutated to allow overexpression of the lacI repressor protein.
ＳＤ配列は、アデニン及びグアニンに富んだ、４塩基〜６塩基の配列であれば特に制限はない。ＳＤ配列の種類によってサブユニットの発現量が異なることから、第１のプラスミド及び第２のプラスミドのＳＤ配列をそれぞれ独立に選択することにより、フェリチンにおける第１のサブユニットと第２のサブユニットとの比率をより多様に調節することができる。ＳＤ配列は、好ましくは、ＡＧＧＡ及びＡＧＧＡＧＧから選択される。ＡＧＧＡＧＧのＳＤ配列によれば、ＡＧＧＡのＳＤ配列と比べて、サブユニットの発現量が増大する傾向がある。 The SD sequence is not particularly limited as long as it is a 4 to 6 base sequence rich in adenine and guanine. Since the expression level of the subunit differs depending on the type of the SD sequence, the first subunit and the second subunit in ferritin are selected by independently selecting the SD sequences of the first plasmid and the second plasmid. The ratio of can be adjusted more diversely. The SD sequence is preferably selected from AGGA and AGGAGGG. According to the SD sequence of AGGAGGG, the expression level of subunits tends to increase as compared with the SD sequence of AGGA.
ＳＤ配列は、プロモーターとサブユニットをコードする遺伝子との間に配置される。ＳＤ配列は、開始コドンの直前に配置してもよいし、ＳＤ配列と開始コドンとの間にアデニン及びチミンに富んだスペーサー配列を配置してもよい。ＳＤ配列とスペーサー配列とを含む配列としては、例えばＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ（配列番号１０、以下「ＷＳＤ配列」と呼ぶ場合がある）が挙げられる。このようなＷＳＤ配列を開始コドンの直前に配置することで、ＡＧＧＡの配列を開始コドンの直前に配置したときと比べて、サブユニットの発現量を増大させることができる。 The SD sequence is placed between the promoter and the gene encoding the subunit. The SD sequence may be placed immediately before the start codon, or a spacer sequence rich in adenine and thymine may be placed between the SD sequence and the start codon. Examples of the sequence including the SD sequence and the spacer sequence include AGGAGGTATTAT (SEQ ID NO: 10, hereinafter sometimes referred to as “WSD sequence”). By arranging such a WSD sequence immediately before the start codon, the amount of subunit expression can be increased compared to when the AGGA sequence is located immediately before the start codon.
複製起点は、大腸菌内において、プラスミドのＤＮＡの複製を開始する起点として機能するものであれば、特に制限されない。ただし、第１のプラスミドの複製起点及び第２のプラスミドの複製起点は、互いに異なる起源のものから選択される。例えば、第１のプラスミド及び第２のプラスミドの複製起点は、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ及びｐ１５Ａｏｒｉから互いに異なるように選択される。複製起点は、プラスミドのコピー数に影響を与える。そのため、プラスミドの複製起点を変更することにより、サブユニットの発現量を調整して、サブユニットの構成比率を制御することができる。例えば、ｐＢＲ３２２ｏｒｉを含有するプラスミドのコピー数は一般的には２５であり、ｐ１５Ａｏｒｉを含有するプラスミドのコピー数は一般的には１０〜１２であることから、結果として同一タンパク質を発現させる場合、ｐＢＲ３２２ｏｒｉを含有するプラスミドの方がｐ１５Ａｏｒｉを含有するプラスミドに比べて、タンパク質を大腸菌内で多く発現する傾向がある。 The origin of replication is not particularly limited as long as it functions as an origin for starting replication of plasmid DNA in E. coli. However, the origin of replication of the first plasmid and the origin of replication of the second plasmid are selected from those of different origins. For example, the origin of replication of the first plasmid and the second plasmid is selected to be different from each other from pBR322ori and p15Aori. The origin of replication affects the copy number of the plasmid. Therefore, by changing the origin of replication of the plasmid, the expression level of the subunit can be adjusted, and the constituent ratio of the subunit can be controlled. For example, the copy number of a plasmid containing pBR322ori is generally 25 and the copy number of a plasmid containing p15Aori is generally 10-12, so that when the same protein is expressed as a result, pBR322ori There is a tendency that the plasmid containing E is expressed more in E. coli than the plasmid containing p15Aori.
プラスミドは、ターミネーター、抗生物質の耐性遺伝子等の他の配列を更に含んでいてもよい。ターミネーターは、好ましくは、サブユニットをコードする遺伝子の３’側下流に配置される。ターミネーターは、宿主として利用する大腸菌において機能することが知られているものから選ばれる。好適なターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来のターミネーター、ファージ由来のターミネーター、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーター等が挙げられる。抗生物質の耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）、ストレプトマイシン耐性遺伝子（Ｓｍｒ）、及びカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）等が挙げられる。The plasmid may further contain other sequences such as a terminator and antibiotic resistance gene. The terminator is preferably placed 3 ′ downstream of the gene encoding the subunit. The terminator is selected from those known to function in E. coli used as a host. Suitable terminators include trpA-derived terminators, phage-derived terminators, rrnB ribosomal RNA-derived terminators, and the like. Antibiotic resistance genes include ampicillin resistance gene (Amp r ), tetracycline resistance gene (Tet r ), chloramphenicol resistance gene (Cm r ), streptomycin resistance gene (Sm r ), and kanamycin resistance gene (Km r). ) And the like.
プラスミドの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる。プラスミドの調製に用いられる宿主菌は、例えば、当該技術分野で通常用いられる宿主菌から適宜選択することができる。具体的には、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＨＢ１０１、及び大腸菌ＪＭ１０９等が挙げられる。これらの宿主菌のうち、精製の容易化、大量調製、及び安全性等の観点から、大腸菌ＪＭ１０９が好ましい。 Plasmid construction can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering. The host bacterium used for the preparation of the plasmid can be appropriately selected from, for example, host bacteria commonly used in the art. Specifically, E. coli DH5α, E. coli HB101, E. coli JM109 and the like can be mentioned. Of these host bacteria, Escherichia coli JM109 is preferable from the viewpoints of easy purification, large-scale preparation, safety, and the like.
第１のプラスミドを、単独で、又は、第２のプラスミドとともに大腸菌に導入することによって、第１のサブユニット（例えばＨサブユニット）と第２のサブユニット（例えばＬサブユニット）との構成比率が異なるフェリチンを産生する形質転換体としての大腸菌を得ることができる。本実施形態において、形質転換体とは、フェリチンのサブユニットをコードする遺伝子が導入され、当該遺伝子が発現した組換え微生物（大腸菌）のことを指す。 The composition ratio of the first subunit (for example, H subunit) and the second subunit (for example, L subunit) by introducing the first plasmid into E. coli alone or together with the second plasmid Can be obtained as a transformant producing different ferritin. In the present embodiment, the transformant refers to a recombinant microorganism (E. coli) into which a gene encoding a ferritin subunit has been introduced and the gene is expressed.
第１のプラスミド及び第２のプラスミドを、同時に大腸菌に導入してもよいし、第１のプラスミド及び第２のプラスミドを任意の順で逐次、大腸菌に導入してもよい。 The first plasmid and the second plasmid may be simultaneously introduced into E. coli, or the first plasmid and the second plasmid may be sequentially introduced into E. coli in any order.
第１のプラスミド及び第２のプラスミドとともに、第１のサブユニット又は第２のサブユニットをコードする遺伝子を含み、第１のプラスミド及び第２のプラスミドとは異なる１種又は２種以上の他のプラスミドを大腸菌に導入して形質転換体を得てもよい。このようにすることで、第１のサブユニットと第２のサブユニットとの構成比率がより多様なパターンで制御されたフェリチンを製造することができる。この場合、各プラスミドを同時に大腸菌に導入してもよいし、任意の順で逐次、大腸菌に導入してもよい。 Along with the first plasmid and the second plasmid, one or more other genes containing the gene encoding the first subunit or the second subunit and different from the first plasmid and the second plasmid A plasmid may be introduced into E. coli to obtain a transformant. By doing in this way, the ferritin by which the composition ratio of a 1st subunit and a 2nd subunit was controlled by the more various pattern can be manufactured. In this case, each plasmid may be introduced into E. coli at the same time, or sequentially introduced into E. coli in any order.
大腸菌の形質転換は、例えば、リン酸カルシウム法、及びエレクトロポレーション法等、当業者に周知の方法により行うことができる。 Transformation of E. coli can be performed by methods well known to those skilled in the art, such as the calcium phosphate method and the electroporation method.
大腸菌としては、ラクトースオペロンに欠損のない大腸菌が好ましい。大腸菌は、好ましくは、Ｗ３１１０株、ＲＢ７９１株、ＢＬ２１株、又はＳＣＳ１株であり、より好ましくはＷ３１１０株である。 As E. coli, E. coli having no deficiency in the lactose operon is preferable. The Escherichia coli is preferably the W3110 strain, the RB791 strain, the BL21 strain, or the SCS1 strain, and more preferably the W3110 strain.
プラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転換体としての大腸菌を培養することにより、大腸菌が増殖して、フェリチンが産生される。産生されるフェリチンは、遺伝子工学的に容易に精製することができる。したがって、本実施形態に係る方法は、容易に工業的な製造に適用することができる。 By culturing Escherichia coli as a transformant obtained by introducing the plasmid into Escherichia coli, Escherichia coli grows and ferritin is produced. The ferritin produced can be easily purified by genetic engineering. Therefore, the method according to the present embodiment can be easily applied to industrial production.
大腸菌の培養は、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養時間の他、インデューサー（誘導因子）の使用量及び使用時間等の条件について、フェリチンが効率的に発現するように適宜調整される。 The culture of E. coli is appropriately adjusted so that ferritin can be expressed efficiently with respect to conditions such as medium composition, medium pH, culture temperature, and culture time, as well as the amount and time of use of inducer (inducing factor). The
大腸菌の培養に使用される培地は、当業者に知られる固体培地及び液体培地のどちらでもよい。好ましくは、液体培地が用いられる。培地の炭素源及び窒素源として、培養される大腸菌が利用できる任意の炭素源及び窒素源を用いることができる。炭素源は、好ましくは、デンプン、スクロース及びグルコース等の糖、グリセロール等のアルコール、並びに、有機酸（例えば、酢酸及びクエン酸）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）から選ばれる。窒素源は、好ましくは、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、及び肉エキス等の天然窒素源、並びに、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及び尿素等の無機窒素化合物から選ばれる。炭素源の濃度は好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜５ｗ／ｖ％である。窒素源の濃度は好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜５ｗ／ｖ％である。好適な培地の具体例としては、ＬＢ培地、ＴＢ培地、及び２×ＹＴ培地が挙げられる。培養温度は、培養される微生物が十分に生育できる温度であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養時間は、フェリチンが十分に産生されるように適宜調整され、好ましくは１６〜４８時間程度である。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌又は振盪を用いて行うことができる。誘導因子としては、例えばラクトースが好ましい。 The medium used for culturing E. coli may be either a solid medium or a liquid medium known to those skilled in the art. Preferably, a liquid medium is used. Any carbon source and nitrogen source that can be used by the cultured Escherichia coli can be used as the carbon source and nitrogen source of the medium. The carbon source is preferably selected from sugars such as starch, sucrose and glucose, alcohols such as glycerol, and organic acids (eg acetic acid and citric acid) or salts thereof (eg sodium salts). The nitrogen source is preferably selected from natural nitrogen sources such as yeast extract, casein, corn steep liquor, peptone and meat extract, and inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride and urea. The concentration of the carbon source is preferably 1 to 20 w / v%, more preferably 1 to 5 w / v%. The concentration of the nitrogen source is preferably 1 to 20 w / v%, more preferably 1 to 5 w / v%. Specific examples of suitable media include LB media, TB media, and 2 × YT media. The culture temperature is a temperature at which the cultured microorganism can sufficiently grow, and is preferably 20 to 37 ° C. The culture time is appropriately adjusted so that ferritin is sufficiently produced, and is preferably about 16 to 48 hours. Culturing can preferably be carried out under aerobic conditions, for example using aeration or shaking. As the inducer, for example, lactose is preferable.
大腸菌がアンピシリン及びカナマイシン等の抗生物質の耐性遺伝子を有している場合、対応する抗生物質を加えた培地を使用してもよい。 When Escherichia coli has antibiotic resistance genes such as ampicillin and kanamycin, a medium supplemented with the corresponding antibiotic may be used.
形質転換体（大腸菌）の培養物からフェリチンを精製する方法は、当業者により通常行われている方法から採用することができる。細胞内にフェリチンが蓄積する場合には、例えば、培養終了後、遠心分離によって形質転換体（大腸菌）を集める。得られた細胞を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得る。これを出発材料とし、加熱処理（例えば、７５℃、３０分）による精製法、塩析法、並びに、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等のタンパク質精製法によってフェリチンを精製することができる。 A method for purifying ferritin from a culture of a transformant (E. coli) can be employed from methods commonly used by those skilled in the art. When ferritin accumulates in cells, for example, after completion of the culture, transformants (E. coli) are collected by centrifugation. The obtained cells are disrupted by sonication or the like, and then a cell-free extract is obtained by centrifugation or the like. Using this as a starting material, purification method by heat treatment (for example, 75 ° C., 30 minutes), salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, etc. Ferritin can be purified by protein purification methods such as various chromatographic methods.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第２版（ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ）ら、１９８９年）に従って行った。なお、実施例において、％は、特に明記しない限り、ｗ／ｖ％を表す。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples. Unless otherwise stated, the various operations were performed according to the Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd edition (Sambrook, J. et al., 1989). In Examples,% represents w / v% unless otherwise specified.
（実施例１：２種類のウマ由来のフェリチンのサブユニットをコードする遺伝子を１つの大腸菌内で別々に発現させるための基本となるプラスミドベクターの構築）
（ｐＫＬ２２３ベクターの構築）
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製、商品名）を鋳型にして、プライマーＢｓａ−ｌａｃＩ−ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１）及びＢａｍ−ｌａｃＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２）をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ｌａｃＩｑ遺伝子とその制御プロモーターとを含む領域を増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６２℃、３０秒；ステップ４：６８℃、１分；ステップ５：４℃、∞；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返した。得られた約１４００ｂｐの増幅断片をＢｓａＡＩ及びＢａｍＨＩで二重消化した。消化した増幅断片をプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、商品名）のｔａｃプロモーターの上流に位置するＢｓａＡＩ−ＢａｍＨＩギャップに挿入して、図１に示すプラスミドｐＫＬ２２３を得た。プライマーの配列を以下に示す。
Ｂｓａ−ｌａｃＩ−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＡＴＣＧＣＴＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号１）
Ｂａｍ−ｌａｃＩ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣ−３’（配列番号２）(Example 1: Construction of basic plasmid vector for separately expressing genes encoding two types of horse-derived ferritin subunits in one E. coli)
(Construction of pKL223 vector)
Using the plasmid pTrcHis (trade name, manufactured by Invitrogen) as a template, PCR was performed using primers Bsa-lacI-forward (SEQ ID NO: 1) and Bam-lacI-reverse (SEQ ID NO: 2) as primers, and the lacI q gene and The region containing the regulatory promoter was amplified. PCR was performed under the following reaction conditions using KOD-plus- (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Step 1: 94 ° C., 2 minutes; Step 2: 94 ° C., 15 seconds; Step 3: 62 ° C., 30 seconds; Step 4: 68 ° C., 1 minute; Step 5: 4 ° C., ∞; Repeated 30 cycles. The obtained amplified fragment of about 1400 bp was double digested with BsaAI and BamHI. The digested amplified fragment was inserted into the BsaAI-BamHI gap located upstream of the tac promoter of the plasmid pKK223-3 (trade name, manufactured by GE Healthcare Japan) to obtain the plasmid pKL223 shown in FIG. The primer sequences are shown below.
Bsa-lacI-forward: 5′-TATCGCTACCGTGACTGGGTCATGGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
Bam-lacI-reverse: 5'-CGGGATCCCTCGCGCTACTACTACATTAATTGCGTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 2)
（ｐＡＣＴ１７７ベクターの構築）
プラスミドｐＫＫ２２３−３を鋳型にして、Ｂａｍ−Ｐｔａｃ−ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３）及びＰｓｔ−Ｐｔａｃ−ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４）をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、ｔａｃプロモーターを含む領域を増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製、商品名）を用いて次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９４℃、１５秒；ステップ３：６０℃、３０秒；ステップ４：６８℃、１分；ステップ５：４℃、∞；ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返した。得られた約２８０ｂｐの増幅断片をＰｓｔＩで消化した。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（ニッポンジーン社製、商品名）を、まずＢａｍＨＩで消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡社製、商品名）を用いて平滑末端化した。次いでＰｓｔＩ消化を行い、約３０００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。上記約２８０ｂｐの増幅断片と上記約３０００ｂｐの断片とをライゲーションして図１に示すプラスミドｐＡＣＴ１７７を得た。プライマーの配列を以下に示す。
Ｂａｍ−Ｐｔａｃ−ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣ−３’（配列番号３）
Ｐｓｔ−Ｐｔａｃ−ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴ−３’（配列番号４）(Construction of pACT177 vector)
PCR was performed using plasmid pKK223-3 as a template and Bam-Ptac-forward (SEQ ID NO: 3) and Pst-Ptac-reverse (SEQ ID NO: 4) as primers to amplify the region containing the tac promoter. PCR was performed under the following reaction conditions using KOD-plus- (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Step 1: 94 ° C., 2 minutes; Step 2: 94 ° C., 15 seconds; Step 3: 60 ° C., 30 seconds; Step 4: 68 ° C., 1 minute; Step 5: 4 ° C., ∞; Repeated 30 cycles. The obtained amplified fragment of about 280 bp was digested with PstI. Plasmid pACYC177 (Nippon Gene, trade name) was first digested with BamHI, and blunt-ended using Blunting high (Toyobo, trade name). Next, PstI digestion was performed, and a fragment of about 3000 bp was recovered by agarose gel electrophoresis. The about 280 bp amplified fragment and the about 3000 bp fragment were ligated to obtain the plasmid pACT177 shown in FIG. The primer sequences are shown below.
Bam-Ptac-forward: 5′-GATCCGGAGCTTATCGACTGCACGGTGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 3)
Pst-Ptac-reverse: 5′-ACAGCTGCAGGTCGACGGGATCCCGGGAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
（実施例２：Ｈサブユニット発現用プラスミドの構築）
ＧｅｎＢａｎｋのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）に登録されているウマ由来フェリチンのＨサブユニットの構造遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ１１２７４２）を定法により人工合成して配列番号５の配列を有する遺伝子を得た。これを鋳型にして、以下に記す方法によりＰＣＲ増幅を行い、４種類の発現用ベクターを構築した。以下に示すプライマーをＰＣＲに用いた。
ＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１（配列番号６）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＴ−３’
ＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２（配列番号７）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＡＧＧＴ−３’
ＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩ（配列番号８）：
５’−ＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’
ＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＮｓｉＩ（配列番号９）：
５’−ＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧ−３’(Example 2: Construction of H subunit expression plasmid)
The structural gene (Accession No. AY112742) of the equine ferritin H subunit registered in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) is artificially synthesized by a conventional method and sequenced. A gene having the sequence number 5 was obtained. Using this as a template, PCR amplification was performed by the method described below to construct four types of expression vectors. The following primers were used for PCR.
HFT-forward-EcoRI1 (SEQ ID NO: 6):
5′-GTTGAATTCATGACGACCCGCGTTCCCCTCGCAGGT-3 ′
HFT-forward-EcoRI2 (SEQ ID NO: 7):
5′-GTTGAATTCAGGGAGGTATTATATGACGACCGCGTTCCCCTCGCAGGGT-3 ′
HFT-reverse-HindIII (SEQ ID NO: 8):
5′-ACAGAAGCTTCTTAGCTCTCGTCACACTCTCCCAGGGTTGTG-3 ′
HFT-reverse-NsiI (SEQ ID NO: 9):
5′-GTTACAGATGCATCTTAGCTCTCGTCACACTCTCCCAGGGTTGTG-3 ′
（ｐＫＬＨの構築）
ｔａｃプロモーターのＳＤ配列のすぐ下流のＥｃｏＲＩの直後に開始コドンが繋がるように設計したＰＣＲ用プライマーＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩを用い、人工合成したＨサブユニットの遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製、商品名）を用いて使用説明書の反応液組成に従い、次の反応条件で行った。ステップ１：９４℃、２分；ステップ２：９８℃、１０秒；ステップ３：６８℃、３０秒；ステップ４：４℃、∞；ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ―ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＫＬＨを構築した。(Construction of pKLH)
Using PCR primers HFT-forward-EcoRI1 and HFT-reverse-HindIII designed so that the start codon is linked immediately after EcoRI immediately downstream of the SD sequence of the tac promoter, using the artificially synthesized H subunit gene as a template, The H subunit gene was amplified by the PCR method. PCR was performed under the following reaction conditions according to the reaction solution composition in the instruction manual using KOD-plus-Neo (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.). Step 1: 94 ° C., 2 minutes; Step 2: 98 ° C., 10 seconds; Step 3: 68 ° C., 30 seconds; Step 4: 4 ° C., ∞; Step 2 to Step 3 were repeated 30 cycles. The obtained DNA fragment was double-digested with EcoRI and HindIII. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-HindIII gap located downstream of the tac promoter of plasmid pKL223 to construct a recombinant plasmid pKLH whose SD sequence was AGGA.
（ｐＷＫＬＨの構築）
開始コドンのすぐ上流に大腸菌での翻訳効率を高める為のＷＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴ、配列番号１０）を付加したＰＣＲ用プライマーであるＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＨＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＨｉｎｄＩＩＩを設計した。これら２つのプライマーを用い、人工合成したＨサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＫＬＨを構築した。(Construction of pWKLH)
HFT-forward-EcoRI2 and HFT-reverse-HindIII were designed as primers for PCR to which a WSD sequence (AGGAGGTATTAT, SEQ ID NO: 10) for enhancing translation efficiency in E. coli was added immediately upstream of the start codon. Using these two primers, the H subunit gene was amplified by PCR using the artificially synthesized H subunit structural gene as a template. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The obtained DNA fragment was double-digested with EcoRI and HindIII. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-HindIII gap located downstream of the tac promoter of the plasmid pKL223 to construct a recombinant plasmid pWKLH whose SD sequence is AGGAGG.
（ｐＡＣＨの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＨＦＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＮｓｉＩを用い、人工合成したＨサブユニットの遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＡＣＨを構築した。(Construction of pACH)
Using HFT-forward-EcoRI1 and HFT-Reverse-NsiI, which are PCR primers, the H subunit gene was amplified by PCR using the artificially synthesized H subunit gene as a template. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The resulting DNA fragment was double digested with EcoRI and NsiI. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-PstI gap located downstream of the tac promoter of plasmid pACT177 to construct a recombinant plasmid pACH whose SD sequence was AGGA.
（ｐＷＣＨの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＨＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＨＦＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ−ＮｓｉＩを用い、人工合成したＨサブユニットの遺伝子を鋳型として、Ｈサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＣＨを構築した。(Construction of pWCH)
Using HFT-forward-EcoRI2 and HFT-Reverse-NsiI as PCR primers, the H subunit gene was amplified by the PCR method using the artificially synthesized H subunit gene as a template. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The resulting DNA fragment was double digested with EcoRI and NsiI. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-PstI gap located downstream of the tac promoter of plasmid pACT177 to construct a recombinant plasmid pWCH having an SD sequence of AGGAGGG.
（実施例３：Ｌサブユニット発現用プラスミドの構築）
ウマ由来のフェリチンの天然型のＬサブユニットにおいては、論文（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９３年，１１７４巻，ｐ．２１８−２２０）に記載のアミノ酸配列からＮ末端の８アミノ酸残基がプロセッシングの過程で欠損していることが知られている。天然型のＬサブユニットを作るために、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースに登録されているウマ由来のフェリチンのＬサブユニットの構造遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１４５２３）からＮ末端の８アミノ酸残基をコードする２４塩基を削除し、メチオニン１残基をコードする３塩基を付加したＬサブユニットをコードする遺伝子を人工合成し、配列番号１１の配列を有する遺伝子を得た。これを鋳型にして以下に記す方法でＰＣＲ増幅を行い、４種類の発現用プラスミドを構築した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
ＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１（配列番号１２）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’
ＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２（配列番号１３）：
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴ−３’
ＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩ（配列番号１４）：
５’−ＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡＡＧ−３’(Example 3: Construction of plasmid for expressing L subunit)
In the natural L subunit of ferritin derived from horses, the N-terminal 8 amino acid residues from the amino acid sequence described in the paper (Biochimica et Biophysica Acta, 1993, 1174, p.218-220) are processed. It is known to be deficient. In order to make a natural L subunit, 24 bases encoding the N-terminal 8 amino acid residues from the structural gene (Accession No. D14523) of the ferritin L subunit derived from horse registered in the GenBank database. A gene encoding the L subunit, which was deleted and added with 3 bases encoding one methionine residue, was artificially synthesized to obtain a gene having the sequence of SEQ ID NO: 11. Using this as a template, PCR amplification was performed by the method described below to construct four types of expression plasmids. The primers used for PCR are shown below.
LSFT-forward-EcoRI1 (SEQ ID NO: 12):
5′-GTTGAATTCATGTATTCTACTGAAGTGGAGGCCGCCGGT-3 ′
LSFT-forward-EcoRI2 (SEQ ID NO: 13):
5′-GTTGAATTCAGGGAGGTATTATATGTATTCTACTGAAGTGGAGGCCGCCGGT-3 ′
LFT-reverse-PstI (SEQ ID NO: 14):
5′-ACAGCTGCAGCTTAGGTCGTGCTTGAGGGTGAGCCTTTCAAAG-3 ′
（ｐＫＬＳの構築）
ｔａｃプロモーターのＳＤ配列のすぐ下流のＥｃｏＲＩの直後に開始コドンが繋がるように設計したＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを用い、Ｌサブユニットをコードする人工合成した遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＫＬＳを構築した。(Construction of pKLS)
An artificially synthesized gene that encodes the L subunit using LSFT-forward-EcoRI1 and LFT-reverse-PstI, which are PCR primers designed so that the start codon is linked immediately after EcoRI immediately downstream of the SD sequence of the tac promoter Was used as a template to amplify the equine-derived L subunit gene by PCR. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The resulting DNA fragment was double digested with EcoRI and PstI. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-PstI gap located downstream of the tac promoter of plasmid pKL223 to construct a recombinant plasmid pKLS whose SD sequence was AGGA.
（ｐＷＫＬＳの構築）
開始コドンのすぐ上流に大腸菌での翻訳効率を高める為のＷＳＤ配列を付加したＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを設計した。設計した２つのプライマーを用い、人工合成したウマ由来のＬサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＫＬ２２３のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＫＬＳを構築した。(Construction of pWKLS)
LSFT-forward-EcoRI2 and LFT-reverse-PstI were designed as primers for PCR to which a WSD sequence for enhancing translation efficiency in E. coli was added immediately upstream of the start codon. Using the designed two primers, the horse-derived L subunit gene was amplified by PCR using the artificially synthesized horse-derived L subunit structural gene as a template. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The resulting DNA fragment was double digested with EcoRI and PstI. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-PstI gap located downstream of the tac promoter of plasmid pKL223 to construct a recombinant plasmid pWKLS having an SD sequence of AGGAGG.
（ｐＡＣＳの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ１及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを用い、人工合成したＬサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡである組換えプラスミドｐＡＣＳを構築した。(Construction of pACS)
Using the PCR primers LSFT-forward-EcoRI1 and LFT-reverse-PstI, the artificially synthesized L subunit structural gene was used as a template to amplify the horse-derived L subunit gene by the PCR method. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The obtained DNA fragment was double-digested with EcoRI and PstI. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-PstI gap located downstream of the tac promoter of plasmid pACT177 to construct a recombinant plasmid pACS with an SD sequence of AGGA.
（ｐＷＣＳの構築）
ＰＣＲ用プライマーであるＬＳＦＴ−ｆｏｒｗａｒｄ−ＥｃｏＲＩ２及びＬＦＴ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ＰｓｔＩを用い、人工合成したＬサブユニットの構造遺伝子を鋳型として、ウマ由来のＬサブユニット遺伝子をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲは、ｐＫＬＨの構築と同様の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで二重消化した。消化したＤＮＡ断片をプラスミドｐＡＣＴ１７７のｔａｃプロモーターの下流に位置するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩギャップに挿入して、ＳＤ配列がＡＧＧＡＧＧである組換えプラスミドｐＷＣＳを構築した。(Construction of pWCS)
Using the PCR primers LSFT-forward-EcoRI2 and LFT-reverse-PstI, the artificially synthesized L subunit structural gene was used as a template to amplify the horse-derived L subunit gene by the PCR method. PCR was performed under the same conditions as the construction of pKLH. The resulting DNA fragment was double digested with EcoRI and PstI. The digested DNA fragment was inserted into the EcoRI-PstI gap located downstream of the tac promoter of plasmid pACT177 to construct a recombinant plasmid pWCS having an SD sequence of AGGAGG.
（実施例４：ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるウマ由来のフェリチンの生産）
実施例２及び３で作製したプラスミドを表１に示した組み合わせで用い、それらを同時に大腸菌Ｗ３１１０株へ導入した。その後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天粉末１．５％、ｐＨ７．２）で生育する形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株を得た。(Example 4: Production of horse-derived ferritin having different constituent ratios of H subunit and L subunit)
The plasmids prepared in Examples 2 and 3 were used in the combinations shown in Table 1, and they were simultaneously introduced into Escherichia coli W3110. Thereafter, the cells were transformed to grow on LB agar medium (peptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%, agar powder 1.5%, pH 7.2) containing ampicillin 50 μg / ml and kanamycin 50 μg / ml. E. coli strain W3110 was obtained.
形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株は、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌ（終濃度）を添加した５ｍｌのＬＢ培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、ｐＨ７．２）で、３７℃、２００ｒｐｍの条件で一夜振とう培養して、シード培養液を調製した。続いて、３Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を用いて、１．５Ｌのラクトース（１％又は２％）を含む２×ＹＴ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム２％、ｐＨ７．２）にシード培養液１．５ｍｌを添加し、３７℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌数４００ｒｐｍの条件で培養を開始した。経時的に培養液をサンプリングし、遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間、４℃）により集めた菌体内に含まれる組換えタンパク質であるウマ由来のアポフェリチン（組換えウマアポフェリチン）の生産をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により解析し（図２及び図３）、Ｈサブユニット（理論分子量２１ｋＤａ）とＬサブユニット（理論分子量１９ｋＤａ）の構成比率を求めた。 The transformed Escherichia coli W3110 strain was obtained by adding 5 ml of LB medium (peptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%, pH 7) supplemented with ampicillin 50 μg / ml (final concentration) and kanamycin 50 μg / ml (final concentration). In 2), the seed culture solution was prepared by shaking culture overnight at 37 ° C. and 200 rpm. Subsequently, using a 3 L mini jar fermenter (manufactured by Biott), 2 × YT medium (2% peptone, 1% yeast extract, 2% sodium chloride) containing 1.5 L lactose (1% or 2%) , PH 7.2) was added 1.5 ml of the seed culture solution, and the culture was started under the conditions of 37 ° C., aeration volume 1 vvm, and stirring speed 400 rpm. The production of apoferritin derived from horse (recombinant horse apoferritin), which is a recombinant protein contained in the bacterial cells collected by sampling the culture solution over time and centrifugation (13000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) Analysis was performed by SDS-PAGE (FIGS. 2 and 3), and the composition ratio of the H subunit (theoretical molecular weight 21 kDa) and the L subunit (theoretical molecular weight 19 kDa) was determined.
（実施例５：ＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率が異なるウマ由来のフェリチンの精製）
５０ｍＭ トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した大腸菌をその湿重量の５倍量の同緩衝液に再懸濁し、超音波破砕器にて菌体を破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を遠心分離（１３０００×ｇ、３０分間、４℃）し、上清を集め、組換えウマアポフェリチンを含む無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液を７５℃で４０分間、加熱処理した。次いで、遠心分離（１３０００×ｇ、３０分間、４℃）によって、熱によって変性した夾雑タンパク質の沈殿物を無細胞抽出液から除去した。(Example 5: Purification of horse-derived ferritin with different constituent ratios of H subunit and L subunit)
E. coli washed with 50 mM Tris-hydroxymethylaminomethane hydrochloride (Tris-HCl) buffer (pH 8.0) was resuspended in the same buffer of 5 times its wet weight, and the cells were removed using an ultrasonic crusher. It was crushed. The suspension containing the disrupted cells was centrifuged (13000 × g, 30 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was collected to obtain a cell-free extract containing recombinant horse apoferritin. This cell-free extract was heat-treated at 75 ° C. for 40 minutes. Subsequently, the precipitate of contaminating proteins denatured by heat was removed from the cell-free extract by centrifugation (13000 × g, 30 minutes, 4 ° C.).
続いて、無細胞抽出液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した陰イオン交換カラムＨｉｌｏａｄ ２６／１０ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ （ＧＥ ヘルスケア・ジャパン社製、商品名）に添加し、同緩衝液で陰イオン交換カラムを洗浄した。次いで塩化ナトリウムの０Ｍから０．４Ｍまでのリニアグラジェントにより、組換えウマアポフェリチンを陰イオン交換カラムから溶出させた。溶出した組換えウマアポフェリチンの溶液を、ゲルろ過カラムＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ、東ソー株式会社製、商品名）により分析したところ、組換えウマアポフェリチンが分子量約４３０ｋＤａの一本のピークとして現れたことから、ＨサブユニットとＬサブユニットとが複合体を形成していることが示唆された。表２に、精製した組換えウマアポフェリチンの純度、収量及びＨサブユニットとＬサブユニットとの構成比率をまとめた。 Subsequently, the cell-free extract was added to an anion exchange column Hiload 26/10 Q Sepharose HP (trade name, manufactured by GE Healthcare Japan) previously equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Then, the anion exchange column was washed with the same buffer. The recombinant equine apoferritin was then eluted from the anion exchange column with a linear gradient of sodium chloride from 0M to 0.4M. When the eluted recombinant horse apoferritin solution was analyzed with a gel filtration column TSK-GEL G4000SWXL (7.8 × 300 mm, manufactured by Tosoh Corporation, trade name), the recombinant horse apoferritin had a molecular weight of about 430 kDa. From this, it was suggested that the H subunit and the L subunit form a complex. Table 2 summarizes the purity and yield of the purified recombinant horse apoferritin and the composition ratio of H subunit and L subunit.
以上の実験結果から、本発明によれば、サブユニットの構成比率が異なる多様なフェリチンを効率良く製造できることが確認された。 From the above experimental results, it was confirmed that according to the present invention, various ferritins having different subunit composition ratios can be efficiently produced.
本発明の製造方法によって得られるフェリチンは、電子機器、医療及び環境等の分野において、ナノサイズの材料としての利用が期待される。 Ferritin obtained by the production method of the present invention is expected to be used as a nano-sized material in the fields of electronic equipment, medicine, environment, and the like.
Claims (7)
前記第１のサブユニットをコードする第１の遺伝子、前記第１の遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列、複製起点、及び、前記プロモーターの機能を抑制するラクトースリプレッサー遺伝子を含み、前記シャイン・ダルガノ配列が前記プロモーターと前記第１の遺伝子との間に配置されている第１のプラスミドを、単独で、又は、
前記第２のサブユニットをコードする第２の遺伝子、前記第２の遺伝子の発現を制御するプロモーター、シャイン・ダルガノ配列、及び、前記第１のプラスミドの複製起点とは異なる複製起点を含み、前記シャイン・ダルガノ配列が前記プロモーターと前記第２の遺伝子との間に配置されている第２のプラスミドとともに、大腸菌に導入する工程と、
前記大腸菌を培養し、フェリチンを産生させる工程と、
を備える、フェリチンの製造方法。A method for producing ferritin composed of a first subunit and / or a second subunit having different amino acid sequences,
A first gene encoding the first subunit, a promoter that controls expression of the first gene, a Shine-Dalgarno sequence, an origin of replication, and a lactose repressor gene that suppresses the function of the promoter, A first plasmid in which the Shine-Dalgarno sequence is located between the promoter and the first gene, alone or
A second gene encoding the second subunit, a promoter controlling the expression of the second gene, a Shine-Dalgarno sequence, and an origin of replication different from the origin of replication of the first plasmid, Introducing a Shine-Dalgarno sequence into E. coli along with a second plasmid located between the promoter and the second gene;
Culturing the E. coli to produce ferritin;
A method for producing ferritin.
前記第１のサブユニットがＨサブユニットで、前記第２のサブユニットがＬサブユニットであるか、又は、前記第１のサブユニットがＬサブユニットで、前記第２のサブユニットがＨサブユニットである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。The ferritin is a horse-derived ferritin composed of an H subunit and an L subunit;
The first subunit is an H subunit and the second subunit is an L subunit, or the first subunit is an L subunit and the second subunit is an H subunit. The manufacturing method according to any one of claims 1 to 6, wherein
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