JPWO2012121266A1

JPWO2012121266A1 - Method for assessing the degree of progression of diabetic disease

Info

Publication number: JPWO2012121266A1
Application number: JP2013503564A
Authority: JP
Inventors: 誠一橋田; 麻子梅原
Original assignee: 誠一橋田
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2014-07-17
Also published as: WO2012121266A1

Abstract

本発明は、糖尿病に起因する疾患の初期症状の診断と介入後のコントロール状態を的確に評価できる尿検査方法を提供することを課題とする。特に、糖尿病性腎症の初期症状の診断が的確にできる尿検査評価方法を提供することを課題とする。本発明者は、上記の課題を解決するために、免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を使用して、尿中に排出される以下の糖尿病関連抗原（バイオマーカー）の評価を行ない、複数のバイオマーカーの組合わせにより、糖尿病の進行状況と共に、腎臓の機能障害の進行状況も早期に把握できることを見出し、本発明を完成するに至った。An object of the present invention is to provide a urine test method capable of accurately evaluating the initial symptoms of a disease caused by diabetes and the control state after intervention. In particular, an object of the present invention is to provide a urinalysis evaluation method that can accurately diagnose early symptoms of diabetic nephropathy. In order to solve the above problems, the present inventor evaluated the following diabetes-related antigens (biomarkers) excreted in urine using an immune complex transferase immunoassay method (ICT-EIA method). The present inventors have found that by combining a plurality of biomarkers, it is possible to grasp the progress of diabetes as well as the progress of renal dysfunction at an early stage, thereby completing the present invention.

Description

本発明は、糖尿病に起因する疾患の初期症状の診断と介入後のコントロール状態を的確に評価するための尿検査方法に関するものである。特に、糖尿病性の腎臓障害の初期症状の診断とコントロール状態を評価するための尿検査方法に関するものである。 The present invention relates to a method for urinalysis for accurately diagnosing early symptoms of a disease caused by diabetes and evaluating a control state after intervention. In particular, the present invention relates to a urinalysis method for diagnosing the initial symptoms of diabetic kidney injury and evaluating the control state.

国内における糖尿病患者は、２００７年の国民健康・栄養調査に基き、糖尿病予備群も含め約２，２１０万人と推定されている（非特許文献１）。実際、４０歳以上の男・女の３人に１人が糖尿病あるいは予備群と考えられ、この１０年間で８００万人以上増加している。その背景には、わが国の生活習慣の欧米化による肥満・内臓脂肪蓄積を基盤としたメタボリックシンドロームの増加が考えられている。従って、糖尿病あるいは予備群の数は今後も増加の一途をたどると予想されている。
今後の糖尿病対策としては、これら糖尿病予備群の発症を防ぎ、更には糖尿病予備群を増加させないことが急務である。そのためには、糖尿病予備群を抽出し、現状を認識させ生活を変容させることが必須となっている。しかし、これら糖尿病予備群の抽出や認識・変容は、糖尿病予備群が検診に参加することにより初めて可能となる。一般に糖尿病患者は身体的症状が出るまで診療を受けない傾向にある。そこで、本発明者は、非観血的検査法による糖尿病予備群の積極的な参加を促す糖尿病予防の新戦略を提唱している。即ち、家庭で自ら採取し提供できる尿や乾燥ろ紙血を試料として、糖尿病リスクのプロファイリングを行い、現状を認識させ、さらに、その後の生活指導による糖尿病リスク軽減の評価を行うという手法である。本発明者らは、このために独自の超高感度測定法も開発しており、既に糖尿病リスクマーカーであるアディポネクチンに関して、尿や乾燥ろ紙血での検出方法を発表している（非特許文献２）。
しかし、糖尿病予備群の糖尿病への推移状況を的確に診断し、更には積極的な介入により、健康に引き戻すためのコントロール状態を適切に把握するためには、上記非観血的検査法を尿検査に限定して、検査に対する利便性を高め、採血という心理的な抵抗感を排除することが必要である。
一般的に、糖尿病性疾患の診断に用いられる尿検査項目としては、尿糖検査が挙げられる。しかし、尿中に尿糖が排出されてくるのは、通常、血糖値が約１７０ｍｇ／ｄｌ以上の場合の人であり、この値を示す人は、糖尿病予備群ではなく完全な糖尿病患者に該当する。高齢者の場合には、腎機能の低下で血糖値が１７０ｍｇ／ｄｌより更に高くなっても尿糖が出ない場合もあることが指摘されている。
また、尿タンパクやＣペプチド（ＣＰＲ）についても尿検査が行なわれているが、数値に変動が現れるのは、糖尿病がかなり進行してからの場合が多く、糖尿病予備群に関して、糖尿病への推移状況を初期の段階で的確に評価することは困難な状況であった。
そこで、尿中に排出される特定のタンパク質に着目し、糖尿病性疾患の進行度を検査することが行なわれている。例えば、早期に糖尿病性腎症を検出し進展度を判定するために尿中のプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１を測定する方法（特許文献１）、あるいはサボシンＢとトランスサイレチンを測定する方法（特許文献２）が知られている。
しかしながら、これらのマーカーが糖尿病性疾患（糖尿病性腎症）の進行度の評価になり得るかについては、充分な検証はまだなされていない状況である。Based on the 2007 National Health and Nutrition Survey, the number of diabetic patients in Japan is estimated to be approximately 22.1 million including the diabetes preparatory group (Non-patent Document 1). In fact, one in three men and women over the age of 40 is considered diabetic or a reserve group, and over the last 10 years it has increased by over 8 million. The background of this is thought to be an increase in metabolic syndrome based on obesity and visceral fat accumulation due to westernization of Japanese lifestyle. Therefore, it is expected that the number of diabetes or reserve groups will continue to increase.
As measures for diabetes in the future, there is an urgent need to prevent the onset of these diabetic preparatory groups and not to increase the diabetic preparatory group. To that end, it is essential to extract a pre-diabetes group, recognize the current situation and change life. However, extraction, recognition, and transformation of these diabetic preparatory groups are possible only when diabetic preparatory groups participate in screening. In general, diabetics tend not to receive medical care until physical symptoms appear. Therefore, the present inventor has proposed a new strategy for preventing diabetes that encourages active participation of the pre-diabetes group by noninvasive testing. That is, it is a technique of profiling diabetes risk by using urine or dried filter paper blood that can be collected and provided at home as a sample, recognizing the current situation, and then evaluating diabetes risk reduction by life guidance. For this purpose, the present inventors have also developed a unique ultrasensitive measurement method, and have already announced a detection method using urine and dry filter paper blood for adiponectin, which is a diabetes risk marker (Non-patent Document 2). ).
However, in order to accurately diagnose the status of transition to diabetes in the pre-diabetes group and to properly grasp the control status for returning to health through active intervention, the above non-invasive testing method is used. It is necessary to limit the examination to the convenience for the examination and eliminate the psychological resistance of blood collection.
Generally, a urine glucose test is an example of a urine test item used for diagnosis of a diabetic disease. However, urinary glucose is normally excreted in the urine when the blood glucose level is about 170 mg / dl or higher, and the person showing this value is not a diabetic preparatory group but a fully diabetic patient. To do. In the case of elderly people, it has been pointed out that urine sugar may not be produced even if the blood glucose level becomes higher than 170 mg / dl due to a decrease in renal function.
In addition, urine tests have been conducted for urine protein and C peptide (CPR), but the changes appear in the numerical values often after diabetes has progressed considerably. It was difficult to accurately assess the situation at an early stage.
Then, paying attention to the specific protein excreted in urine, examining the progress of diabetic disease has been performed. For example, a method of measuring urinary plasminogen activator inhibitor-1 in order to detect diabetic nephropathy at an early stage and determine the degree of progression (Patent Document 1), or a method of measuring saposin B and transthyretin (Patent Document 2) is known.
However, whether these markers can be used to evaluate the degree of progression of diabetic disease (diabetic nephropathy) has not yet been fully verified.

特開２００６−６１３４５号公報JP 2006-61345 A 特表２００８−１７５８１４号公報Special table 2008-175814 gazette

厚生労働省健康局総務課生活習慣病対策室：平成１９年国民健康・栄養調査の概要Ministry of Health, Labor and Welfare Health Bureau General Affairs Division Lifestyle Disease Control Office: Overview of the 2007 National Health and Nutrition Survey 橋田誠一ら、「高感度アディポネクチン測定法の開発とその運動・栄養指導への応用」徳島文理大学研究紀要第７８号７〜２０頁（２００９年）Seiichi Hashida et al., “Development of high-sensitivity adiponectin measurement method and its application to exercise and nutrition guidance” Bulletin of Tokushima Bunri University, No. 78, pp. 7-20 (2009)

本発明の目的は、糖尿病に起因する疾患の初期症状の診断と介入後のコントロール状態を的確に評価できる尿検査方法を提供することにある。特に、糖尿病性腎症の初期症状の診断が的確にできる尿検査方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a urinalysis method capable of accurately evaluating the diagnosis of early symptoms of a disease caused by diabetes and the control state after intervention. In particular, it is to provide a urine test method capable of accurately diagnosing the initial symptoms of diabetic nephropathy.

本発明者は、非特許文献２の免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を使用して、尿中に排出される以下の糖尿病関連抗原（バイオマーカー）の検出、評価を試みた。

上記表１に示されるように、尿中に存在するタンパク質は、血液中のタンパク質が腎臓で濾過されて、尿中に排出されるものである。健常人の尿中に排出されるタンパク質は、腎臓の糸球体の網目のサイズに依って大きな影響を受け、血中に存在するタンパク質の分子量が１万以下のものは、尿中に排出され易くなっている。また、分子量が約６万までのタンパク質は尿中にある程度排出される。しかし、６万以上のタンパク質は、あまり排出されないと考えられ、血中と尿の存在比は、タンパク質の分子量が大きくなるほど、血中から尿中に排出され難くなっていると考えられている。例えば、血中から尿へ排出される、糖尿病関連の主なバイオマーカーを表２（糖尿病関連生理活性物質の検出限界と血中及び尿中濃度の一覧表）に示す。表２に示されるように、タンパク質の分子量が大きくなるほど、尿中には排出され難くなっている。

そこで、上記表１に記載の糖尿病性疾患のバイオマーカーを用いて、非肥満非糖尿病者（ＮＯＮＤＭ）、肥満非糖尿病者（ＯＮＤＭ）、糖尿病者（ＤＭ）の３群から尿を採取し、ＩＣＴ−ＥＩＡ法で尿中のバイオマーカーを測定・評価した。その結果、図１と図３に示すように、糖尿病患者と非糖尿病患者（糖尿病予備群）を明確に区別できるバイオマーカーとして、レジスチン、アディポネクチンを見出すことができた。更に、腎臓悪化の指標として汎用される尿中のアルブミン濃度と尿中のアディポネクチン濃度の相関関係を見たところ、図２に示すように、良好な直線関係を与えることが見出された。即ち、糖尿病が進行し、糖尿病性腎症になってくれば、心臓の糸球体の網目が壊れ、アディポネクチンのような分子量の大きいタンパク質が尿中に漏れて来ることになる。従って、尿中のアディポネクチン濃度を測定することにより、腎機能の悪化の程度（糖尿病性腎症の進行状況）を評価できることを見出した。
更に、本発明者らは、上記ＩＣＴ−ＥＩＡ法で測定した尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度を対比し、その比（尿中濃度／血中濃度）を取ることにより、腎機能の悪化の程度をより明確に評価できるパラメーターになることを見出した。即ち、図７に示されるように、腎機能の悪化の指標の尿中アルブミン濃度では捕捉が充分出来ない、初期の腎機能障害者も明瞭に識別できることを見出した。また、尿中に排出されるバイオマーカー（アディポネクチン、レジスチン、インスリン）を組み合すことにより、図１０に示されるように非侵襲的に糖尿病患者と糖尿病予備軍の患者（肥満非糖尿病対象者）を識別できる指標（パラメーター）として使用できることを見出した。本発明者は、以上の知見に基き、本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定することを特徴とする、糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（２）上記バイオマーカーがインスリン、レジスチン、アディポネクチン、レプチンおよびＣＲＰの中から複数選択されることを特徴とする、上記（１）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（３）上記バイオマーカーとして、アディポネクチンと共に、レプチンまたはレジスチンが選択されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（４）糖尿病性疾患が糖尿病性腎症であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（５）尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することを特徴とする、上記（４）の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（６）上記バイオマーカーとして、アディポネクチンと共に、インスリン及び／又はレジスチンが選択されることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（７）上記バイオマーカーを組み合わせた指標として、アディポネクチンとレジスチンの積、アディポネクチンとインスリンの積、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３つの積のいずれか一つを用いて評価することを特徴とする、上記（６）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（８）肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）を識別するために評価することを特徴とする、上記（７）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（９）上記バイオマーカーとして、レプチンと共に、インスリンまたはレジスチンの中から１つを選択して用いる、上記（１）又は（２）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１０）糖尿病性疾患がインスリン抵抗性または高血糖であることを特徴とする、上記（９）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１１）尿中のアディポネクチン濃度を測定することによる、糖尿病性腎症の進行度（腎機能の悪化の程度）を評価することを特徴とする、上記（１）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１２）上記尿中のアディポネクチンの濃度と血清中のアディポネクチン濃度の比（尿中濃度／血中濃度）を指標とする、上記（１１）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１３）上記アディポネクチン濃度比（尿中濃度／血中濃度）が、１０×１０^−５以上の場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することを特徴とする、上記（１２）の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１４）上記（１）〜（１３）のいずれかの進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１５）糖尿病性疾患が糖尿病性腎症であることを特徴とする、上記（１４）に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１６）尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上の場合に、介入療法を開始することを特徴とする、上記（１４）または（１５）に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１７）糖尿病性疾患がインスリン抵抗性または高血糖であることを特徴とする、上記（１４）に記載の糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（１８）環境要因と日内変動を受け易く、変動し易い糖尿病性関連バイオマーカーの積分値として、一定時間蓄尿された尿中の当該バイオマーカーを評価することを特徴とする、糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（１９）糖尿病性関連バイオマーカーがインスリンである、上記（１８）に記載の糖尿病性疾患の進行度評価方法。
（２０）上記（１８）または（１９）のいずれかの進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法。
（２１）糖尿病性疾患に関する介入療法を受けた被験者に関して、介入療法前後の尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定することにより、介入療法の適否と継続をスクリーニングする方法。
（２２）介入療法が、食事療法、運動療法または薬物療法である、上記（２１）のスクリーニング方法。
（２３）糖尿病性疾患が糖尿病性腎症である、上記（２１）または（２２）に記載のスクリーニング方法。
（２４）バイオマーカーがインスリンまたはアディポネクチンである、上記（２１）〜（２３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２５）バイオマーカーがインスリンであり、介入療法が薬物療法である、上記（２１）〜（２４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。The present inventor attempted detection and evaluation of the following diabetes-related antigens (biomarkers) excreted in urine using the immune complex metastasis measurement method (ICT-EIA method) of Non-Patent Document 2.

As shown in Table 1 above, the proteins present in urine are those that are excreted in the urine after the proteins in the blood are filtered by the kidneys. Proteins excreted in the urine of healthy people are greatly affected by the size of the glomerular mesh of the kidney. Proteins with a molecular weight of 10,000 or less in the blood are easily excreted in the urine. It has become. Proteins with molecular weights up to about 60,000 are excreted to some extent in urine. However, 60,000 or more proteins are considered not to be excreted so much, and the abundance ratio between blood and urine is thought to be less likely to be excreted from blood into urine as the molecular weight of the protein increases. For example, major biomarkers related to diabetes that are excreted from blood into urine are shown in Table 2 (list of detection limits and concentrations in blood and urine of diabetes-related physiologically active substances). As shown in Table 2, the greater the molecular weight of the protein, the less it is excreted in urine.

Therefore, urine was collected from three groups of non-obese non-diabetic (NONDM), obese non-diabetic (ONDM), and diabetic (DM) using the biomarkers of diabetic disease described in Table 1 above, and ICT -The biomarker in urine was measured and evaluated by EIA method. As a result, as shown in FIGS. 1 and 3, resistin and adiponectin could be found as biomarkers that can clearly distinguish diabetic patients from non-diabetic patients (preliminary diabetes group). Furthermore, the correlation between the urinary albumin concentration and the urinary adiponectin concentration, which are widely used as an indicator of kidney deterioration, was found to give a good linear relationship as shown in FIG. That is, if diabetes progresses and diabetic nephropathy occurs, the glomerular mesh of the heart is broken, and a protein with a large molecular weight such as adiponectin leaks into the urine. Therefore, it was found that the degree of deterioration of renal function (the progress of diabetic nephropathy) can be evaluated by measuring the concentration of adiponectin in urine.
Furthermore, the present inventors compared the concentration of adiponectin in urine measured by the ICT-EIA method with the concentration of adiponectin in serum, and by taking the ratio (urine concentration / blood concentration), renal function It was found that the parameter can be more clearly evaluated for the degree of deterioration. That is, as shown in FIG. 7, it was found that early-stage renal dysfunction can be clearly identified even if the urinary albumin concentration, which is an indicator of deterioration of renal function, cannot be sufficiently captured. In addition, by combining biomarkers excreted in urine (adiponectin, resistin, insulin), non-diabetic patients and pre-diabetes patients (obese non-diabetic subjects) as shown in FIG. It was found that it can be used as an index (parameter) that can be identified. The present inventor completed the present invention based on the above findings.
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) A method for evaluating the degree of progression of diabetic disease, wherein one or more biomarkers related to diabetes in urine are measured by an immune complex transfer measurement method (ICT-EIA method).
(2) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (1) above, wherein a plurality of the biomarkers are selected from insulin, resistin, adiponectin, leptin and CRP.
(3) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (1) or (2) above, wherein leptin or resistin is selected together with adiponectin as the biomarker.
(4) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to any one of (1) to (3) above, wherein the diabetic disease is diabetic nephropathy.
(5) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (4) above, wherein when the urinary adiponectin concentration is 1 to 10 ng / mg Cre, it is evaluated as an initial symptom of diabetic nephropathy.
(6) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (1) or (2) above, wherein insulin and / or resistin is selected as the biomarker together with adiponectin.
(7) As an index combining the biomarkers, the evaluation is performed using any one of the three products of adiponectin and resistin, adiponectin and insulin, adiponectin and resistin, and insulin. The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (6).
(8) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to the above (7), characterized in that evaluation is performed to distinguish obese non-diabetic (OND) and diabetic patients (DM).
(9) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (1) or (2) above, wherein one of insulin and resistin is selected and used as leptin as the biomarker.
(10) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (9) above, wherein the diabetic disease is insulin resistance or hyperglycemia.
(11) The progression of diabetic disease according to (1) above, wherein the progression of diabetic nephropathy (degree of deterioration of renal function) is evaluated by measuring the concentration of adiponectin in urine Degree evaluation method.
(12) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (11) above, wherein the ratio of urine adiponectin concentration to serum adiponectin concentration (urine concentration / blood concentration) is used as an index.
(13) When the adiponectin concentration ratio (urine concentration / blood concentration) is 10 × 10 ⁻⁵ or more, it is evaluated as an initial symptom of diabetic nephropathy, (12) For assessing the degree of progression of diabetic disease
(14) Prevention of diabetic disease, characterized in that intervention therapy is performed on a diabetic patient and / or a diabetic preparatory group using the method for evaluating the degree of progression according to any one of (1) to (13) above. Or treatment method.
(15) The method for preventing or treating a diabetic disease according to (14) above, wherein the diabetic disease is diabetic nephropathy.
(16) The method for preventing or treating a diabetic disease according to the above (14) or (15), wherein interventional therapy is started when the concentration of adiponectin in urine is 1 ng / mg Cre or more.
(17) The method for preventing or treating a diabetic disease according to the above (14), wherein the diabetic disease is insulin resistance or hyperglycemia.
(18) Diabetes disease progression characterized by evaluating the biomarker in urine accumulated for a certain period of time as an integrated value of diabetic-related biomarkers that are susceptible to environmental factors and diurnal fluctuations and are susceptible to fluctuations. Degree evaluation method.
(19) The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to (18) above, wherein the diabetic-related biomarker is insulin.
(20) Prevention of diabetic disease, characterized in that intervention therapy is performed on a diabetic patient and / or a diabetic preparatory group using the method for evaluating the degree of progression according to any of (18) or (19) above. Or treatment method.
(21) By measuring one or more biomarkers related to diabetes in the urine before and after the intervention therapy by the immune complex metastasis measurement method (ICT-EIA method) for the subject who received the intervention therapy for the diabetic disease, How to screen for the propriety and continuation of interventional therapy.
(22) The screening method according to (21) above, wherein the intervention therapy is diet therapy, exercise therapy, or drug therapy.
(23) The screening method according to (21) or (22) above, wherein the diabetic disease is diabetic nephropathy.
(24) The screening method according to any one of (21) to (23), wherein the biomarker is insulin or adiponectin.
(25) The screening method according to any one of (21) to (24) above, wherein the biomarker is insulin and the intervention therapy is drug therapy.

本発明の尿中の糖尿病関連バイオマーカーの評価方法により、採取された単一の尿から、同時に多種のバイオマーカーの検査が可能となり、これらのバイオマーカーの検査結果から、糖尿病の進行状況と共に、腎臓の機能障害の進行状況も早期に把握することが可能となった。これらの尿検体は採血と異なり苦痛を伴わず簡便に採取可能であるため、対象者の積極的な検診への参加が期待できる。そのため、本発明の尿中のバイオマーカーの評価方法を用いた診断方法は、糖尿病性疾患の診断として、特に問題の多い糖尿病性腎症の早期発見や、糖尿病予備群の糖尿病リスクの判定や生活指導後の糖尿病リスクの軽減を評価する上で有用である。 By the method for evaluating diabetes-related biomarkers in urine of the present invention, it becomes possible to test various biomarkers simultaneously from a single collected urine. From the test results of these biomarkers, along with the progress of diabetes, The progress of kidney dysfunction can be grasped early. Since these urine samples can be easily collected without pain unlike blood collection, it is expected that the subject will participate in the active examination. Therefore, the diagnostic method using the urinary biomarker evaluation method of the present invention is used for the early detection of diabetic nephropathy, which is particularly problematic, as a diagnosis of diabetic disease, the determination of diabetes risk and life It is useful in evaluating the reduction of diabetes risk after guidance.

図１は健常者と肥満非糖尿病者、糖尿病患者のそれぞれの尿中のアディポネクチンの濃度（ｎｇ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。糖尿病患者の尿中のアディポネクチン濃度が、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に高い数値を示した。
図２は尿中のアディポネクチンの濃度（ｎｇ／ｍｇＣｒｅ．）が、腎臓の機能障害の指標であるアルブミン尿の濃度（μｇ／ｍｇＣｒｅ．）と正の相関関係を有することを明らかにした図である。このことから、アディポネクチンの尿中濃度を検査することにより、腎臓の機能障害の様子と病態の進行状況を評価することができるようになった。
図３は健常者と肥満非糖尿病者、糖尿病患者のそれぞれの尿中のレジスチンの濃度（ｎｇ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。糖尿病患者の尿中のレジスチン濃度が、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に高い数値を示した。
図４は健常者と肥満非糖尿病者、糖尿病患者のそれぞれの尿中のレプチンの濃度（ｐｇ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。肥満非糖尿病者の尿中のレプチン濃度が、健常者と糖尿病患者のそれより有意に高い数値を示した。尿中のレプチン濃度を評価することで、肥満への移行状況が早期に検知され、糖尿病（インスリン抵抗性等）の発症を回避するために介入療法を開始することができる。
図５は健常者（ＮＤＭＮＯ）と肥満非糖尿病者（ＮＤＭＯ）、糖尿病患者（ＤＭ）のそれぞれの尿中のインスリンの濃度（μＵ／ｍｇＣｒｅ．）を測定し、対比した図である。糖尿病患者の尿中のインスリン濃度が、健常者のインスリン濃度より、有意に高い数値を示した。また、肥満非糖尿病者の尿中のインスリンの濃度も、糖尿病患者のインスリン濃度より低い数値ではあるが、健常者のインスリン濃度より高い数値を示した。このことは、肥満非糖尿病者において、既にインスリン抵抗性が起こり始めていることを示している。
図６は経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行なった被験者の試験開始後６０分経過した後の乾燥濾紙血中のインスリン濃度（Ｕ／ｍｌ）と、ＯＧＴＴ後２時間蓄尿の尿中インスリン量が正の相関関係にあることを示した図である。被験者の血中インスリン濃度が上昇（糖尿病が進行）しているほど、尿中に排出されるインスリン量は増大することが示されている。
図７は腎機能の悪化の指標である尿中アルブミン濃度と共に、糸球体濾過値（ｅＧＦＲ）、血清中のアディポネクチン濃度、尿中のアディポネクチン濃度、及びアディポネクチンの濃度比（尿中濃度／血清中濃度）を記載した４人の被験者の検査データを掲載した図である。アディポネクチンの濃度比（尿／血中の濃度比）を指標とすることにより、アルブミン尿が検出される腎機能障害者（被験者Ｂ）と共に、微量アルブミン尿が検出されない腎機能障害者（被験者Ｃ）についても識別が明確にできるようになる。
図８は図７に記載の４名の被験者の血清中アディポネクチン濃度（μｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。縦軸は血清中アディポネクチン濃度であり、被験者Ａを基準にして相対比で表示した。横軸は、カラム分画の番号を表わす。
図９は図７に記載の４名の被験者の尿中アディポネクチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。腎機能障害者（被験ＣとＤ）においては、尿中に排出されるアディポネクチンは、血清中では少ない濃度の低分子（３量体）が尿中に多く排出されていることが分った。被験者の内、健常者（被験者ＡとＢ）の尿中には単分子が相対的に多く排出されており、腎機能障害者（被験ＣとＤ）では、単分子よりも低分子が多く尿中に排出されていた。
図１０は尿中のアディポネクチン濃度、レジスチン濃度、インスリン濃度を用いて、糖尿病予備軍である肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）あるいは健常者（非肥満非糖尿病者ＮＯＮＤ）を識別できるパラメーターを作成し、パラメーター間の有効性を評価した図である。腎障害指標のアディポネクチンと糖尿病指標のインスリンやレジスチンを組み合わせると、糖尿病性腎症の指標となり得ることを示している。FIG. 1 is a graph comparing the concentrations (ng / mgCre.) Of adiponectin in the urine of healthy subjects, obese non-diabetics, and diabetic patients. The adiponectin concentration in the urine of diabetic patients was significantly higher than that of healthy and obese non-diabetics.
FIG. 2 is a graph showing that the concentration of urine adiponectin (ng / mgCre.) Has a positive correlation with the concentration of albuminuria (μg / mgCre.), Which is an indicator of renal dysfunction. . From this, it became possible to evaluate the state of renal dysfunction and the progress of the disease state by examining the urinary concentration of adiponectin.
FIG. 3 is a graph comparing the concentrations (ng / mg Cre.) Of resistin in the urine of healthy subjects, obese non-diabetics, and diabetic patients. The resistin concentration in urine of diabetic patients was significantly higher than that of healthy and obese non-diabetics.
FIG. 4 is a diagram comparing and comparing leptin concentrations (pg / mgCre.) In urine of healthy subjects, obese non-diabetics, and diabetic patients. The leptin concentration in the urine of obese non-diabetics was significantly higher than that of healthy and diabetics. By evaluating the urinary leptin concentration, the transition to obesity can be detected at an early stage, and intervention therapy can be started to avoid the onset of diabetes (such as insulin resistance).
FIG. 5 is a graph comparing the concentrations (μU / mg Cre.) Of insulin in the urine of healthy individuals (NDMNO), obese non-diabetics (NDMO), and diabetic patients (DM). The insulin concentration in the urine of the diabetic patient was significantly higher than that of the healthy subject. In addition, the concentration of insulin in the urine of obese non-diabetics was lower than that of diabetics but higher than that of healthy subjects. This indicates that insulin resistance has already begun to occur in obese non-diabetic individuals.
FIG. 6 shows that the insulin concentration (U / ml) in the blood of the dried filter paper after 60 minutes from the start of the test of the subject who performed the oral glucose tolerance test (OGTT) and the urine insulin amount of urine collected for 2 hours after OGTT are correct. FIG. It has been shown that the amount of insulin excreted in the urine increases as the blood insulin concentration in the subject increases (diabetes progresses).
FIG. 7 shows glomerular filtration rate (eGFR), serum adiponectin concentration, urine adiponectin concentration, and adiponectin concentration ratio (urinary concentration / serum concentration) together with urinary albumin concentration which is an index of deterioration of renal function It is the figure which published the test data of the four test subjects which described). By using the adiponectin concentration ratio (urine / blood concentration ratio) as an index, the renal dysfunction person (subject B) in which albuminuria is detected and the renal dysfunction person (subject C) in which microalbuminuria is not detected Can be clearly identified.
FIG. 8 is a view showing the serum adiponectin concentration (μg / ml) of the four subjects described in FIG. 7 for each column fraction. The vertical axis represents the serum adiponectin concentration, and is expressed as a relative ratio based on subject A. The horizontal axis represents the column fraction number.
FIG. 9 is a view showing the urinary adiponectin concentration (ng / ml) of the four subjects described in FIG. 7 for each column fraction. It was found that adiponectin excreted in the urine in the patients with impaired renal function (tests C and D) was excreted in the urine in a small amount of small molecules (trimers) at a low concentration. Among the subjects, a relatively large amount of single molecules are excreted in the urine of healthy subjects (subjects A and B), and those with impaired renal function (tests C and D) have more low molecules than single molecules in the urine. Was being discharged inside.
FIG. 10 can distinguish obese non-diabetic (OND) and diabetic patients (DM) or healthy persons (non-obese non-diabetic NOND) who are diabetic reserves using urine adiponectin concentration, resistin concentration, and insulin concentration It is the figure which created the parameter and evaluated the effectiveness between parameters. It shows that the combination of adiponectin, which is an index of renal impairment, and insulin and resistin, which are index of diabetes, can be an index of diabetic nephropathy.

−本発明の第一の態様−
本発明の第一の態様は、一つ以上のバイオマーカーを免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で評価することを特徴とする、糖尿病性疾患の評価診断方法に関する発明である。
本発明の「バイオマーカー」とは、尿中に排出され測定評価できる糖尿病のバイオマーカーのことであって、例えばインスリン、レジスチン、アディポネクチンおよびＣＲＰ（炎症性蛋白）を挙げることができる。好ましいバイオマーカーとしては、アディポネクチンまたはレジスチンを挙げることができる。
本発明の「糖尿病性疾患」とは、微小血管障害によって生じる糖尿病性神経障害・糖尿病性網膜症・糖尿病性腎症のことを言う。糖尿病性神経障害の内、自律神経障害としては、例えば胃腸障害（便秘／下痢）、発汗障害、起立性低血圧、インポテンツ等を挙げることが出来る。感覚神経障害としては、例えば末梢のしびれ、神経痛等を挙げることができる。糖尿病性網膜症とは、硝子体出血、牽引性網膜剥離、虹彩血管新生などにより失明に至る病気であり、その他に、白内障、緑内障をはじめとする眼科疾患の原因となっている。糖尿病性腎症とは、蛋白尿が進行し、徐々に体がむくむネフローゼ症候群という病態になり腎不全となって行く病気である。現在、日本において透析導入の原因の第一位となっている。なお、本発明の評価診断方法は、尿中のバイオマーカーを測定、評価する方法であるため、特に糖尿病性腎症の評価、診断に向く方法であると考えられる。
本発明の「免疫複合体転移酵素免疫測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）」とは、非競合法（サンドイッチ）エンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ）の高感度化した改良方法に関するものである（非特許文献２参照）。ＩＣＴ−ＥＩＡ法では、使用する抗体の非特異吸着（バックグランド）を下げることができたので、多くの高分子生理活性物質のａｍｏｌレベル以下（ｚｍｏｌ）の測定が可能となっている（ＨａｓｈｉｄａＳ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗＶｏｌｕｍｅ１，（１９９５）ｐｐ４０３−４５１，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ参照）。
本発明の「糖尿病性疾患の進行度評価方法」とは、尿中の糖尿病関連の複数のバイオマーカーの濃度または存在量の変動を測定することにより、被験者の糖尿病性疾患の進行状況を的確に評価する方法である。この評価方法により、被験者の糖尿病性疾患の進行を抑制し改善するための治療剤の投与や生活指導等の介入療法が的確に行なえるようになる。
例えば、バイオマーカーとして、アディポネクチンを指標にした場合、尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの場合には、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価することができる。そこで、尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上となった場合には、介入療法を開始すると糖尿病性腎症への進行を抑制回避できることになる。更には改善することができるようになる。
また、図７に示すように、尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度の濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とすることにより、微量アルブミン尿が検出されない腎機能障害者についても識別が明確にできるようになった。上記濃度比が、１０×１０^−５以上の場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして評価できることになる。より明確には、上記濃度比が２０×１０^−５以上の場合に糖尿病性腎症の初期症状として判断できることになる。
更に、上記尿中のバイオマーカーとして、インスリン、レジスチン、アディポネクチン、レプチンおよびＣＲＰの中から複数選択し、それらを組み合せて指標として使用することができる。例えば、図１０に示されるように、アディポネクチンとレジスチンの積、アディポネクチンとインスリンの積、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３つの積のいずれか一つを用いて、被験者の糖尿病性疾患の進行状況を的確に評価することができる。即ち、糖尿病予備軍である、肥満非糖尿病者（ＯＮＤ）と糖尿病患者（ＤＭ）あるいは健常者（非肥満非糖尿病者ＮＯＮＤ）を識別できる指標（パラメーター）とすることができる。即ち、腎障害指標となる尿中のアディポネクチン濃度と糖尿病指標の尿中のインスリンやレジスチンの濃度を組み合わせて指標とすると、糖尿病性疾患（糖尿病性腎症を含む）の進行度を表わす、より適切な指標になり得ることが示めされている。
同様に、尿中のレプチン濃度を中心にして、インスリンまたはレジスチンの尿中濃度を組み合わせることにより、糖尿病性疾患（糖尿病性腎症を含む）の進行度を表わす指標として、より適切なものになることが分かる。
−本発明の第二の態様−
本発明の第二の態様は、上記の糖尿病性疾患の進行度評価方法を用いて、糖尿病患者及び／又は糖尿病予備群に対して、介入療法を行うことを特徴とする、糖尿病性疾患の予防または治療方法に関する発明である。
本発明の「介入療法」とは、プロトコールに基づく生活習慣（食事・身体活動中心）の改善または公知の高脂血症治療剤、糖尿病疾患治療剤の服用を言う。即ち、食事療法や運動療法を生活習慣の中に取り入れ、必要カロリーと消費カロリーのコントロールを行なうものであり、精神的なストレスを軽減するよう指導して、糖尿病の発症にかかわる要因を削除軽減することを行なう。更には、初期症状の糖尿病患者に対しては、バイオマーカーの数値を下げるための薬物療法を行なうことを介入療法として含むものである。上記の糖尿病性疾患の進行度評価方法を用いて、早期の介入療法を開始することにより、重症度への移行を抑制、回避し、症状を改善し、健康な状態に戻すことができる。
−本発明の第三の態様−
本発明の第三の態様は、上記の介入療法の結果を判定し、被験者に対する介入療法の適否、継続の可否を判断する方法に関する発明である。
本発明の「スクリーニングする方法」とは、介入療法前後の尿中の糖尿病関連の一つ以上のバイオマーカーの数値（免疫複合体転移測定方法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）で測定された値）を比較対比し、介入療法が被験者に対して適否であるか否かを評価し、その介入療法の継続の是非をスクリーニングする方法のことを言う。例えば、バイオマーカーとしてアディポネクチンを指標とし、尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅ以上となった場合に介入療法を行ない、介入療法後に尿中のアディポネクチン濃度を測定し、アディポネクチン濃度が以前より低くなっていない場合には、その介入療法は、該当する被験者には適していなかったことになる。その場合には、介入療法の内容を変化させ、被験者の現状に適合したものにすることができる。
糖尿病性疾患が糖尿病性腎症の場合、２００８年の統計では、人工透析の要因の第一位に挙げられている。従って、糖尿病性腎症の進行を抑制、回避できれば、糖尿病患者にとって大きな朗報になる。そのため、本スクリーニング方法を用いて、被験者にとって一番適切な介入療法を、尿中のバイオマーカーの測定、評価から、早期に簡易に決定して行けることになる。
なお、本発明の第二の態様と第三の態様で使用される用語で、第一の態様と共通する用語は同じ意味を表わすものである。そのため、特に言及することをしていない。-First embodiment of the present invention-
A first aspect of the present invention is an invention relating to a method for evaluating and diagnosing diabetic disease, characterized in that one or more biomarkers are evaluated by an immune complex metastasis measuring method (ICT-EIA method).
The “biomarker” of the present invention is a biomarker of diabetes that is excreted in urine and can be measured and evaluated. Examples thereof include insulin, resistin, adiponectin and CRP (inflammatory protein). Preferred biomarkers include adiponectin or resistin.
The “diabetic disease” of the present invention refers to diabetic neuropathy / diabetic retinopathy / diabetic nephropathy caused by microvascular disorders. Among diabetic neuropathies, examples of autonomic neuropathy include gastrointestinal disorders (constipation / diarrhea), sweating disorders, orthostatic hypotension, impotence and the like. Examples of sensory neuropathy include peripheral numbness and neuralgia. Diabetic retinopathy is a disease that leads to blindness due to vitreous hemorrhage, traction retinal detachment, iris angiogenesis, and other causes of ophthalmic diseases such as cataracts and glaucoma. Diabetic nephropathy is a disease in which proteinuria progresses and nephrotic syndrome is gradually developed, resulting in renal failure. It is currently the leading cause of dialysis in Japan. In addition, since the evaluation diagnostic method of the present invention is a method for measuring and evaluating biomarkers in urine, it is considered to be a method particularly suitable for evaluation and diagnosis of diabetic nephropathy.
The “immunocomplex transferase immunoassay method (ICT-EIA method)” of the present invention relates to an improved method for improving the sensitivity of the non-competitive method (sandwich) enzyme immunoassay method (EIA) (Non-patent Document 2). reference). In the ICT-EIA method, the nonspecific adsorption (background) of the antibody to be used can be lowered, so that it is possible to measure amol level or less (zmol) of many macromolecular bioactive substances (Hashida S , Et al., Biotechnology Annual Review Volume 1, (1995) pp 403-451, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam).
The “diabetic disease progression evaluation method” of the present invention accurately measures the progress of a diabetic disease in a subject by measuring changes in the concentration or abundance of a plurality of diabetes-related biomarkers in urine. It is a method to evaluate. This evaluation method makes it possible to accurately perform interventional therapy such as administration of therapeutic agents and lifestyle guidance for suppressing and improving the progression of diabetic disease in the subject.
For example, when adiponectin is used as an index as a biomarker, when the concentration of adiponectin in urine is 1 to 10 ng / mg Cre, it can be evaluated as an initial symptom of diabetic nephropathy. Therefore, when the adiponectin concentration in urine becomes 1 ng / mg Cre or more, the progression to diabetic nephropathy can be suppressed and avoided by starting interventional therapy. Further improvements can be made.
In addition, as shown in FIG. 7, by using the ratio of urine adiponectin concentration to serum adiponectin concentration (urine concentration / blood concentration) as an index, a person with renal impairment who cannot detect microalbuminuria Even the distinction can be made clear. When the concentration ratio is 10 × 10 ⁻⁵ or more, it can be evaluated as an initial symptom of diabetic nephropathy. More specifically, when the concentration ratio is 20 × 10 ⁻⁵ or more, it can be determined as an initial symptom of diabetic nephropathy.
Furthermore, a plurality of urine biomarkers can be selected from insulin, resistin, adiponectin, leptin and CRP, and these can be combined and used as an index. For example, as shown in FIG. 10, the progress of diabetic disease in a subject can be accurately determined using any one of the three products of adiponectin and resistin, adiponectin and insulin, adiponectin and resistin, and insulin. Can be evaluated. That is, it can be used as an index (parameter) that can distinguish an obese non-diabetic person (OND) and a diabetic patient (DM) or a healthy person (non-obese non-diabetic person NOND) who are diabetic reserve forces. In other words, if the index is a combination of the urinary adiponectin concentration, which is a renal disorder index, and the urinary insulin or resistin concentration, which is a diabetic index, it represents the progression of diabetic diseases (including diabetic nephropathy). It can be a good indicator.
Similarly, combining the urinary concentration of insulin or resistin with a focus on urinary leptin concentration makes it more suitable as an indicator of the degree of progression of diabetic diseases (including diabetic nephropathy) I understand that.
-Second aspect of the present invention-
A second aspect of the present invention is the prevention of diabetic disease, characterized in that intervention therapy is performed on a diabetic patient and / or a diabetic preparatory group using the above-described method for evaluating the degree of progression of diabetic disease. Or it is invention regarding a treatment method.
The “intervention therapy” of the present invention means improvement of lifestyle habits (mainly on diet and physical activity) based on a protocol, or taking a known therapeutic agent for hyperlipidemia and therapeutic agent for diabetes. In other words, dietary and exercise regimens are incorporated into lifestyle habits to control the necessary and consumed calories, and guidance is given to reduce mental stress, eliminating and reducing factors related to the onset of diabetes. Do things. Furthermore, for patients with early-onset diabetes, drug therapy for lowering the value of the biomarker is included as interventional therapy. By using the above-described method for evaluating the degree of progression of diabetic disease, early intervention therapy can be started to suppress or avoid the transition to severity, improve symptoms, and return to a healthy state.
-Third aspect of the present invention-
The third aspect of the present invention is an invention relating to a method for determining the result of the above intervention therapy and determining whether the intervention therapy is appropriate for the subject and whether it can be continued.
The “screening method” of the present invention is a comparison of numerical values of one or more biomarkers related to diabetes in the urine before and after intervention therapy (values measured by an immune complex metastasis measurement method (ICT-EIA method)). In contrast, it refers to a method of evaluating whether or not an intervention therapy is appropriate for a subject, and screening whether the intervention therapy is continued or not. For example, adiponectin is used as an index as a biomarker, intervention is performed when the urinary adiponectin concentration is 1 ng / mg Cre or more, and the urine adiponectin concentration is measured after the intervention, and the adiponectin concentration is lower than before. If not, the intervention was not appropriate for the subject. In that case, the content of the intervention therapy can be changed to be adapted to the current situation of the subject.
When the diabetic disease is diabetic nephropathy, it is listed as the first factor of artificial dialysis in 2008 statistics. Therefore, if the progression of diabetic nephropathy can be suppressed and avoided, it will be a great news for diabetic patients. Therefore, by using this screening method, the most appropriate intervention therapy for the subject can be easily determined at an early stage from measurement and evaluation of biomarkers in urine.
The terms used in the second aspect and the third aspect of the present invention and common to the first aspect have the same meaning. Therefore, no particular mention is made.

次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）尿中のアディポネクチンの測定と健常者と糖尿病患者、肥満穂糖尿病者の３群間の比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、非特許文献２に記載の免疫複合体転移酵素免疫測定法（ＩＣＴ−ＥＩＡ法）を準用した。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・アディポネクチンはＢｉｏＶｅｎｄｏｒＬａｂＭｅｄＩｎｃ社（Ｐａｌａｃｋｅｃｈｏ，ＣｚｅｃｈＲｅｐｕｂｌｉｃ）より購入した。
［抗体］
モノクローナル抗ヒト・アディポネクチン抗体（ＢＡＦ１０６５及びＭＡＢ１０６５１）はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（ＭＮ，ＵＳＡ）より購入した。
［尿サンプル］
被験者の早朝第一尿（１０ｍＬ）に１／５０容量の５％ＢＳＡおよび５％ＮａＮ_３を加え、透析まで４℃で保存した。２４時間以内に採取した尿を透析した。
透析は、透析用セルロースチューブ（透析膜ＵＣ８−３２−２５、三光純薬、東京）を用い、緩衝液（０．１ＭＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０）に対して１．５ｍｌの上記尿サンプルの透析を行なった。透析後、透析尿の重量を秤量し、希釈倍率による補正を行なった。透析尿は直ちにマイクロチューブ（Ｓａｆｅ−ＬｏｃｋＴｕｂｅｓ１．５ｍｌ）に分注し、−２０℃で凍結保存を行なった。尚、尿中クレアチニン濃度は市販キット（クレアチニン−テストワコー、和光純薬、大阪）により測定した。
（２）尿中のアディポネクチンの測定
上記透析尿サンプル１００μｌを用いて、尿中のアディポネクチン濃度を測定した。健常者の尿中アディポネクチン濃度は、０．４±０．４（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．０１〜３．１４ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中アディポネクチン濃度は、０．５±０．４（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．１〜２．４ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中アディポネクチン濃度は、２．９±９．８（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．１〜４８．８ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、糖尿病患者の尿中アディポネクチン濃度は、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に（ｐ＜０．００１、＜０．０５）高値を示した。
（実施例２）尿中のアディポネクチン濃度とアルブミン濃度との対比
糖尿病患者では、試験紙法による尿蛋白が陰性の病期であっても、すでに組織学的変化が始まっている。この初期の病変（早期腎症）を診断する指標の一つとして尿中微量アルブミンが測定され、微量アルブミン尿を呈する症例の多くは後に持続性蛋白尿を呈し、糖尿病性腎症に移行することが明らかにされている。従って、尿中アルブミンを測定し、早期糖尿病性腎症の有無を確認して、対策を講じることが重要である。また、糸球体障害の指標であるので糸球体に組織変化をもたす腎疾患の原発性腎疾患でも有用であるとされている。
そこで、実施例１の透析尿サンプルを用いて、ＨｕｍａｎＡｌｂｕｍｉｎＥＬＩＳＡｋｉｔ（ＡｓｓａｙＰｒｏ，ＳｔＣｈａｒｂｅｓ，ＭＯ）を使用して、尿中アルブミン（クレアチニン基準）の測定を行なった。その測定結果と、実施例２のアディポネクチンの測定結果を合わせて、図２に示す。
図２に示されるように、尿中アディポネクチンと尿中アルブミンは良好な相関関係を有することが分かった。即ち、尿中のアディポネクチン濃度を測定することにより、尿サンプル提供者の糖尿病への進行度が判明すると共に、腎臓の障害レベルが判別できることが明らかになった。即ち、尿中のアディポネクチン濃度が１ｎｇ／ｍｇＣｒｅより少ない場合であると、尿中アルブミン濃度が３０μｇ／ｍｇＣｒｅ以下の正常値を示すことになる。このことは、腎臓に障害が起きておらず、アディポネクチン（分子量４４万）の漏出がほとんど見られない状況であることを表わしている。また、尿中のアディポネクチン濃度が１〜１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅの範囲にある場合には、尿中アルブミン濃度が３０〜３００μｇ／ｍｇＣｒｅの範囲の値を示すことになる。この尿中アルブミン濃度の範囲になると、腎臓に初期の機能障害が起きていることを表わしている。その結果、アディポネクチン（分子量４４万）の漏出が次第に起きて来る状況になったことを表わしている。更に尿中のアディポネクチン濃度が１０ｎｇ／ｍｇＣｒｅより大きくなる場合には、尿中アルブミン濃度が３００μｇ／ｍｇＣｒｅより大きくなり、腎臓に機能障害が顕著に起きていることを表わしている。
以上のように、アディポネクチンの尿中濃度を検査することにより、腎臓の機能障害の様子と病態の進行状況を評価することができることが見出された。更に、同じ尿サンプルを用いて、実施例４のレジスチンを同時評価することによって、糖尿病の有無、病態への進行状況等が同時に明らかとなってくる。具体的には尿検査のみによって、簡便に糖尿病性腎症の早期発見、早期対応が可能となっている。
本発明の高い利便性から、尿を用いた健康診断の参加率を向上させることができ、糖尿病予備群の捕捉が容易になっている。また、その後の介入療法の効果の判定も容易であることから、糖尿病予備群の病態改善が観察し易くなっている。
（実施例３）尿中のレジスチンの測定と健常者と糖尿病患者、肥満穂糖尿病者の３群間の比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、同じ尿サンプルを使用した。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・レジスチンはＢｉｏＶｅｎｄｏｒＬａｂＭｅｄＩｎｃ社（Ｐａｌａｃｋｅｃｈｏ，ＣｚｅｃｈＲｅｐｕｂｌｉｃ）のＨｕｍａｎＲｅｓｉｓｔｉｎＥＬＩＳＡｋｉｔに標準として添付されているものを購入、使用した。
［抗体］モノクローナル抗ヒト・レジスチン抗体（１８４３０５５及び１８４３２０）はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（ＭＮ，ＵＳＡ）より購入した。
（２）尿中のレジスチンの測定
実施例１の透析尿サンプルを用いて、尿中のレジスチン濃度を測定した。健常者の尿中レジスチン濃度は、１８．６±２０．９（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．５〜１３９．４ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中レジスチン濃度は、１５．４±１７．２（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；４．１〜７３．０ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中レジスチン濃度は、３０．０±３６．２（ＳＤ）ｎｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；２．２〜１５９．３ｎｇ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図３に示す。図３から明らかなように、糖尿病患者の尿中レジスチン濃度は、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に（ｐ＜０．０５）高値を示した。
（実施例４）尿中のレプチンの測定と健常者と糖尿病患者、肥満穂糖尿病者の３群間の比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、同じ尿サンプルを使用した。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・レプチンはＰｅｐｒｏｔｅｃｈＥＣ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を購入した。
［抗体］
モノクローナル抗ヒト・レプチン抗体（３Ｄ１０及び１６Ｃ９）は日本臨床医学研究所（京都）より購入した。
（２）尿中のレプチンの測定
実施例１の透析尿サンプルを用いて、尿中のレプチン濃度を測定した。健常者の尿中レプチン濃度は、５．２±８．２（ＳＤ）ｐｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．１〜７７．７ｐｇ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中レプチン濃度は、３４．５±１４６．３（ＳＤ）ｐｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；１．４〜８７４．０ｐｇ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中レプチン濃度は、６．０±７．５（ＳＤ）ｐｇ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．６〜１１６５ｐｇ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図４に示す。図４から明らかなように、肥満非糖尿病者の尿中レプチン濃度は、健常者と糖尿病者のそれより有意（ｐ＜０．０１、０．００１）に高値を示す傾向にあった。
レプチンは脂肪組織によって作り出され、エネルギーの取り込みと消費の制御に重要な役割を果たす１６ｋＤａのペプチドホルモンであり、食欲と代謝の調節を行うとされている。従って、肥満非糖尿病者の血中のレプチン濃度は高く、それを反映して、尿中のレプチン濃度も高くなっている。この尿中のレプチン濃度を測定することにより、肥満への移行状況が早期に検知され、インスリン抵抗性等の発症を回避するために介入療法を開始することができる。
（実施例５）尿中のインスリン濃度と血中のインスリン濃度との比較
（１）試薬と方法
［方法］
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、血液サンプルと尿サンプルについては、非特許文献２の方法に従って採取した。
本実施例の目的は、糖尿病の検査であるブドウ糖付加試験（ＯＧＴＴ）における、血中インスリン濃度と尿中インスリン濃度の相関性を検証することである。そのため、ＯＧＴＴ後６０分後に血液を濾紙法（乾燥濾紙血）により採取すると共に、ＯＧＴＴ後２時間の蓄尿を採取し、サンプルとした。
［血液サンプル］
乾燥濾紙血サンプルは、ＯＧＴＴ後６０分後に穿刺具を用いて血液を濾紙（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒｋＳｃｈｕｅｌｌ、ドイツ）に塗布し、風乾させた後、４℃で保存した。
乾燥濾紙血をパンチャー（セントラル科学）で打ち出したディスク（直径１／８インチ）１個に、５００μｌの緩衝液（０．１ＭＮａＣＬ、０．１％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣＬ_２、０．１％ＮａＮ_３を含む０．０１％Ｍリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０）を加え、４℃で２４時間抽出した。なお、１ディスク当たり約２．４〜２．７μｌの血液が含まれている。
［抗原］
標準リコンビナント・ヒト・インスリンはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＳｔＣｈａｒｂｅｓ，ＭＯ）を購入した。
［抗体］
モノクローナル抗ヒト・インスリン抗体（１６Ｅ９及び６Ｆ７）は日本臨床医学研究所（京都）より購入した。
（２）血中インスリンと尿中インスリンの測定
実施例１の尿サンプルを用いて、尿中のインスリン濃度を測定した。健常者の尿中インスリン濃度は、４．３±２．８（ＳＤ）μＵ／ｍｇクレアチニン（範囲；０．６〜１３．３μＵ／ｍｇクレアチニン）であった。また、肥満非糖尿病者の尿中インスリン濃度は、９．０±５．５（ＳＤ）μＵ／ｍｇクレアチニン（範囲；１．８〜２５．８μＵ／ｍｇクレアチニン）であり、糖尿病患者の尿中インスリン濃度は、１３．８±１７．６（ＳＤ）μＵ／ｍｇクレアチニン（範囲；１０．３〜９０．０μＵ／ｍｇクレアチニン）であった。その結果を図５に示す。図５から明らかなように、糖尿病患者の尿中インスリン濃度は、健常者と肥満非糖尿病者のそれより有意に（ｐ＜０．００１）高値を示した。
即ち、糖尿病患者の尿中のインスリン濃度が、健常者のインスリン濃度より、有意に高い数値を示し、また、肥満非糖尿病者の尿中のインスリンの濃度が、糖尿病患者のインリン濃度より低い数値ではあるものの、健常者のインスリン濃度より高い数値を示している。この結果から、肥満非糖尿病者において、既にインスリン抵抗性が起こり始めていることを示している。そして、糖尿病患者になれば更にインスリン抵抗性が高まっていくことが、尿中のインスリン濃度の数値ときれいに相関していることが示された。
また、上記被験者に経口ブドウ糖負荷試験（Ｏｒａｌｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔ：ＯＧＴＴ）を行なったところ、ブドウ糖水溶液を服用後６０分経過後の乾燥濾紙血中のインスリン濃度（Ｕ／ｍｌ）と、ＯＧＴＴ後２時間蓄尿の尿中インスリン量は、図６に示すように良好な相関性を示すことが明らかとなった。
血中インスリン濃度は、食事や行動による影響を受け、数値が変動し易いバイオマーカーである。そのため、採血の時間や採血スケジュールが厳しく制約されることになる。そのため、病院でないと検査できない種類の診断方法である。しかし、尿中インスリン濃度は、２時間蓄尿であるため数値変動も少なく、家庭でも容易に採取でき、それを試験機関に送付して評価することが可能である。従って、蓄尿の尿中インスリン濃度（尿中の総インスリン量）の測定を健康診断のバイオマーカーとすることにより、家庭でも容易にブドウ糖付加試験が実施でき、糖尿病予備群の発見が容易になり、早期介入療法が開始できることになった。
（実施例６）尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度の濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とする糖尿病性疾患の進行度の評価試験
（１）試薬と方法
測定方法は、実施例１と同じＩＣＴ−ＥＩＡ法を使用し、男女各２名の血液サンプルと尿サンプルについては、非特許文献２の方法に従って採取した。
上記血液サンプルと尿サンプルをカラムクロマトグラフィー処理を行い、フラクション・コレクターで各１ｍｌを採取、分画した。その分画に含まれる、アディポネクチンの量を測定し、得られたアディポネクチンの量を積分した。
カラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（２．６ｘ６０ｃｍ）を使用し、流出液は、１０ｍＭＮａＰＢ、ｐＨ７．０、０．１ＭＮａＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３の組成の緩衝液を用いた。溶出条件は、１ｍＬ／ｍｉｎ、１ｍＬ分画で行った。
（２）測定結果
カラム分画のアディポネクチン濃度の測定結果を図８と図９に示す。図８は、４名の被験者の血清中アディポネクチン濃度（μｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。縦軸は血清中アディポネクチン濃度であり、被験者Ａを基準にして相対比で表示した。横軸は、カラム分画の番号を表わす。図９は、４名の被験者の尿中アディポネクチン濃度（ｎｇ／ｍｌ）をカラム分画毎に表示した図である。図８と図９の対比から、腎機能障害者（被験ＣとＤ）の場合には、尿中に排出されるアディポネクチンは、血清中では少ない濃度の低分子（３量体）が多く排出されていることが示された。被験者の内、健常者（被験者ＡとＢ）の尿中には単分子が相対的に多く排出されており、腎機能障害者（被験ＣとＤ）では、単分子よりも低分子が多く尿中に排出されていた。
これらの結果をまとめると、図７に示される表が得られる。図７に示すように、尿中のアディポネクチン濃度と血清中のアディポネクチン濃度の濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とすることにより、微量アルブミン尿が検出されない初期症状の腎機能障害者についても識別が明確にできるようになった。即ち、上記濃度比が、１０×１０^−５以上の場合に、糖尿病性腎症の初期症状であるとして判断できることになる。より明確には、上記濃度比が２０×１０^−５以上の場合に糖尿病性腎症の初期症状として判断できることになる。
以上のことから、尿中のバイオマーカーの濃度を選択し、同一の血清中のバイオマーカーの濃度を測定して、その濃度比（尿中濃度／血中濃度）を指標とすることにより、糖尿病性疾患の進行度の評価が充分行なえることが示された。
（実施例７）尿中のバイオマーカーとしてアディポネクチン、インスリン、レジスチンを使用し、複数組み合わせて指標とする糖尿病性疾患の進行度の評価試験
実施例１に準じて得られた尿中アディポネクチン濃度、実施例３に準じて得られた尿中レジスチン濃度、実施例５に準じて得られた尿中インスリン濃度は、糖尿病が進行し、腎機能が障害を受けるに従い、それぞれの排出量が増大する。そこで、これらの濃度を指標として、それぞれの数値の積を取ることにより、腎機能障害の程度を拡大して評価できないかを検討した。
まず、アディポネクチンとレジスチンの積を取って指標としたところ、図１０に示されるように、健常人（非肥満非糖尿病対象者）と糖尿病予備軍である肥満非糖尿病対象者の間では、有意な差は見られなかったが、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者の間では、明確な数値上の相違が見出せた。このように、アディポネクチンとレジスチンの積を指標とすれば、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者を明確に識別できることが明らかとなった。
更に、アディポネクチンとインスリンの積を取って指標としたところ、同様に、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者を明確に識別できることが明らかとなった。そこで、アディポネクチンとレジスチン、インスリンの３種の積を取って指標としたところ、数値的に大きな差を示して、肥満非糖尿病対象者と糖尿病患者を明確に識別できることが明らかとなった。
以上のように、尿中のバイオマーカーの積を使用して、糖尿病性疾患の進行度の評価が充分行なえることが示された。EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is further demonstrated, this invention is not limited to these.
(Example 1) Measurement of adiponectin in urine and comparison between three groups of healthy subjects, diabetic patients, and obese ear diabetics (1) Reagents and methods [Method]
As the measurement method, the immune complex transferase immunoassay (ICT-EIA method) described in Non-Patent Document 2 was applied mutatis mutandis.
[antigen]
Standard recombinant human adiponectin was purchased from BioVendor Lab Med Inc (Parackecho, Czech Republic).
[antibody]
Monoclonal anti-human adiponectin antibodies (BAF1065 and MAB10651) are available from R & D Systems Inc. (MN, USA).
[Urine sample]
1/50 volumes of 5% BSA and 5% NaN ₃ were added to the subject's early morning first urine (10 mL) and stored at 4 ° C. until dialysis. The urine collected within 24 hours was dialyzed.
For dialysis, a cellulose tube for dialysis (dialysis membrane UC8-32-25, Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokyo) was used, and 1. against a buffer solution (0.01 M sodium phosphate buffer pH 7.0 containing 0.1 M NaCl). Dialysis of 5 ml of the urine sample was performed. After dialysis, the weight of dialysis urine was weighed and corrected by the dilution factor. The dialyzed urine was immediately dispensed into microtubes (Safe-Lock Tubes 1.5 ml) and stored frozen at -20 ° C. The urinary creatinine concentration was measured with a commercially available kit (creatinine-Test Wako, Wako Pure Chemicals, Osaka).
(2) Measurement of adiponectin in urine Using 100 μl of the dialysis urine sample, the concentration of adiponectin in urine was measured. The concentration of adiponectin in the urine of healthy subjects was 0.4 ± 0.4 (SD) ng / mg creatinine (range; 0.01 to 3.14 ng / mg creatinine). Moreover, the urinary adiponectin concentration of obese non-diabetics is 0.5 ± 0.4 (SD) ng / mg creatinine (range; 0.1-2.4 ng / mg creatinine), and the urinary adiponectin of diabetic patients The concentration was 2.9 ± 9.8 (SD) ng / mg creatinine (range; 0.1-48.8 ng / mg creatinine). The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 1, the urinary adiponectin concentration of diabetic patients was significantly higher (p <0.001, <0.05) than that of healthy and obese non-diabetics.
(Example 2) Comparison between urinary adiponectin concentration and albumin concentration In diabetic patients, histological changes have already begun even in the stage of urine protein negative by the test paper method. Urinary microalbumin is measured as one of the indicators for diagnosing this early lesion (early nephropathy), and many cases of microalbuminuria later develop persistent proteinuria and shift to diabetic nephropathy Has been revealed. Therefore, it is important to measure urinary albumin, confirm the presence or absence of early diabetic nephropathy, and take measures. Further, since it is an index of glomerular injury, it is also useful for primary kidney disease, which is a renal disease that causes tissue changes in the glomerulus.
Thus, urinary albumin (creatinine reference) was measured using the Human Albumin ELISA kit (Assay Pro, St Charbes, MO) using the dialyzed urine sample of Example 1. The measurement result and the measurement result of adiponectin of Example 2 are shown together in FIG.
As shown in FIG. 2, it was found that urinary adiponectin and urinary albumin have a good correlation. That is, by measuring the concentration of adiponectin in urine, it became clear that the degree of progression to diabetes of the urine sample provider and the level of kidney damage could be discriminated. That is, when the urine adiponectin concentration is less than 1 ng / mgCre, the urine albumin concentration shows a normal value of 30 μg / mgCre or less. This indicates that the kidney is not damaged, and that adiponectin (molecular weight: 440,000) is hardly leaked. Moreover, when the adiponectin concentration in urine is in the range of 1 to 10 ng / mgCre, the urinary albumin concentration indicates a value in the range of 30 to 300 μg / mgCre. This urinary albumin concentration range indicates that the kidney has an early dysfunction. As a result, it was shown that leakage of adiponectin (molecular weight: 440,000) began to occur gradually. Further, when the adiponectin concentration in urine is higher than 10 ng / mg Cre, the urinary albumin concentration is higher than 300 μg / mg Cre, indicating that the dysfunction is remarkable in the kidney.
As described above, it was found that by examining the urine concentration of adiponectin, it is possible to evaluate the state of renal dysfunction and the progress of the disease state. Furthermore, by simultaneously evaluating the resistin of Example 4 using the same urine sample, the presence / absence of diabetes, progress to a disease state, and the like are simultaneously revealed. Specifically, early detection and early treatment of diabetic nephropathy are possible simply by urinalysis.
Because of the high convenience of the present invention, the participation rate of health examination using urine can be improved, and the pre-diabetes group can be easily captured. In addition, since it is easy to determine the effect of subsequent intervention therapy, it is easy to observe the improvement in the condition of the diabetic preparatory group.
(Example 3) Measurement of urinary resistin and comparison among three groups of healthy subjects, diabetic patients, and obese ear diabetics (1) Reagents and methods [Method]
The same ICT-EIA method as in Example 1 was used as the measurement method, and the same urine sample was used.
[antigen]
The standard recombinant human resistin was purchased and used as a standard attached to the Human Resistin ELISA kit of BioVendor Lab Med Inc (Parackecho, Czech Republic).
[Antibodies] Monoclonal anti-human resistin antibodies (1843055 and 184320) are available from R & D Systems Inc. (MN, USA).
(2) Measurement of resistin in urine Using the dialyzed urine sample of Example 1, the concentration of resistin in urine was measured. The urinary resistin concentration of healthy subjects was 18.6 ± 20.9 (SD) ng / mg creatinine (range; 0.5 to 139.4 ng / mg creatinine). In addition, the urinary resistin concentration of obese non-diabetics is 15.4 ± 17.2 (SD) ng / mg creatinine (range; 4.1 to 73.0 ng / mg creatinine). The concentration was 30.0 ± 36.2 (SD) ng / mg creatinine (range; 2.2 to 159.3 ng / mg creatinine). The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 3, the urinary resistin concentration of diabetic patients was significantly higher (p <0.05) than that of healthy and obese non-diabetics.
(Example 4) Measurement of leptin in urine and comparison among three groups of healthy subjects, diabetic patients, and obese ear diabetics (1) Reagents and methods [Method]
The same ICT-EIA method as in Example 1 was used as the measurement method, and the same urine sample was used.
[antigen]
Standard recombinant human leptin was purchased from Peprotech EC (London, UK).
[antibody]
Monoclonal anti-human leptin antibodies (3D10 and 16C9) were purchased from Japan Clinical Medical Laboratory (Kyoto).
(2) Measurement of leptin in urine Using the dialyzed urine sample of Example 1, the concentration of leptin in urine was measured. The concentration of leptin in urine of healthy subjects was 5.2 ± 8.2 (SD) pg / mg creatinine (range; 0.1-77.7 pg / mg creatinine). In addition, the urinary leptin concentration of obese non-diabetics is 34.5 ± 146.3 (SD) pg / mg creatinine (range; 1.4-874.0 pg / mg creatinine). The concentration was 6.0 ± 7.5 (SD) pg / mg creatinine (range; 0.6-1165 pg / mg creatinine). The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 4, the urinary leptin concentration of obese non-diabetics tended to be significantly higher (p <0.01, 0.001) than that of healthy and diabetics.
Leptin is a 16 kDa peptide hormone produced by adipose tissue that plays an important role in controlling energy uptake and consumption, and is said to regulate appetite and metabolism. Therefore, the leptin concentration in the blood of obese non-diabetics is high, and the leptin concentration in urine is also high reflecting this. By measuring the urinary leptin concentration, the transition to obesity can be detected at an early stage, and intervention therapy can be started to avoid the onset of insulin resistance and the like.
(Example 5) Comparison of insulin concentration in urine and insulin concentration in blood (1) Reagent and method [method]
The same ICT-EIA method as in Example 1 was used as the measurement method, and blood samples and urine samples were collected according to the method of Non-Patent Document 2.
The purpose of this example is to verify the correlation between blood insulin concentration and urine insulin concentration in the glucose addition test (OGTT), which is a test for diabetes. Therefore, blood was collected 60 minutes after OGTT by the filter paper method (dry filter paper blood), and urine collected for 2 hours after OGTT was collected as a sample.
[Blood sample]
The dried filter paper blood sample was stored at 4 ° C. after 60 minutes after OGTT, blood was applied to the filter paper (Schleicher Schuell, Germany) using a puncture tool, air-dried.
500 μl of a buffer (0.1 M NaCl, 0.1% BSA, 1 mM MgCL ₂ , 0.1% NaN _{3) was} added to one disk (1/8 inch diameter) on which dry filter paper blood was punched with a puncher (Central Science). 0.01% M sodium phosphate buffer (pH 7.0) was added, and the mixture was extracted at 4 ° C. for 24 hours. Note that approximately 2.4 to 2.7 μl of blood is contained per disc.
[antigen]
Standard recombinant human insulin was purchased from Millipore (St Charbes, MO).
[antibody]
Monoclonal anti-human insulin antibodies (16E9 and 6F7) were purchased from Japan Clinical Medical Laboratory (Kyoto).
(2) Measurement of blood insulin and urine insulin Using the urine sample of Example 1, the urine insulin concentration was measured. The urinary insulin concentration of healthy subjects was 4.3 ± 2.8 (SD) μU / mg creatinine (range; 0.6 to 13.3 μU / mg creatinine). Moreover, the urinary insulin concentration of obese non-diabetics is 9.0 ± 5.5 (SD) μU / mg creatinine (range; 1.8 to 25.8 μU / mg creatinine). The concentration was 13.8 ± 17.6 (SD) μU / mg creatinine (range; 10.3-90.0 μU / mg creatinine). The result is shown in FIG. As is apparent from FIG. 5, the urinary insulin concentration of the diabetic patient was significantly higher (p <0.001) than that of the healthy person and the obese non-diabetic person.
That is, the insulin concentration in the urine of the diabetic patient is significantly higher than that of the healthy subject, and the insulin concentration in the urine of the obese non-diabetic subject is lower than that of the diabetic patient. Although it is, it shows a numerical value higher than that of healthy individuals. This result indicates that insulin resistance has already begun to occur in obese non-diabetic individuals. In addition, it was shown that the increase in insulin resistance in a diabetic patient is clearly correlated with the value of the urine insulin concentration.
In addition, when an oral glucose tolerance test (OGTT) was performed on the test subject, the insulin concentration (U / ml) in the dried filter paper blood after 60 minutes of taking the aqueous glucose solution and 2 hours after OGTT It became clear that the amount of urine insulin in accumulated urine shows a good correlation as shown in FIG.
Blood insulin concentration is a biomarker that is easily affected by diet and behavior and whose values are likely to fluctuate. Therefore, blood collection time and blood collection schedule are severely restricted. Therefore, it is a type of diagnostic method that can only be examined by a hospital. However, since the urine insulin concentration is stored for 2 hours, there is little fluctuation in the numerical value, and it can be easily collected at home, and it can be sent to a testing institution for evaluation. Therefore, by using the measurement of urine insulin concentration (total amount of insulin in urine) of urine collection as a biomarker for health check, glucose addition tests can be easily carried out at home, and the discovery of a pre-diabetes group is facilitated. Early intervention therapy can be started.
(Example 6) Evaluation test of the degree of progression of diabetic disease using the ratio of urine adiponectin concentration to serum adiponectin concentration (urine concentration / blood concentration) as an index (1) Reagent and method The same ICT-EIA method as in Example 1 was used, and blood samples and urine samples of two men and women were collected according to the method of Non-Patent Document 2.
The blood sample and urine sample were subjected to column chromatography, and 1 ml each was collected and fractionated with a fraction collector. The amount of adiponectin contained in the fraction was measured, and the amount of adiponectin obtained was integrated.
The column used was Superdex 200 (2.6 × 60 cm), and the effluent used was a buffer solution having a composition of 10 mM NaPB, pH 7.0, 0.1 M NaCl, 0.01% BSA, 0.1% NaN 3. The elution conditions were 1 mL / min and 1 mL fractionation.
(2) Measurement results FIG. 8 and FIG. 9 show the measurement results of the adiponectin concentration in the column fraction. FIG. 8 is a view showing the serum adiponectin concentration (μg / ml) of four subjects for each column fraction. The vertical axis represents the serum adiponectin concentration, and is expressed as a relative ratio based on subject A. The horizontal axis represents the column fraction number. FIG. 9 is a view showing the urine adiponectin concentration (ng / ml) of four subjects for each column fraction. From the comparison between FIG. 8 and FIG. 9, in the case of patients with renal dysfunction (tests C and D), adiponectin excreted in urine is excreted in small amounts of small molecules (trimers) at low concentrations in serum. It was shown that. Among the subjects, a relatively large amount of single molecules are excreted in the urine of healthy subjects (subjects A and B), and those with impaired renal function (tests C and D) have more low molecules than single molecules in the urine. Was being discharged inside.
When these results are summarized, the table shown in FIG. 7 is obtained. As shown in FIG. 7, by using the ratio of urine adiponectin concentration to serum adiponectin concentration (urine concentration / blood concentration) as an index, patients with early renal impairment who cannot detect microalbuminuria It became possible to identify clearly about. That is, when the concentration ratio is 10 × 10 ⁻⁵ or more, it can be determined that it is an initial symptom of diabetic nephropathy. More specifically, when the concentration ratio is 20 × 10 ⁻⁵ or more, it can be determined as an initial symptom of diabetic nephropathy.
From the above, by selecting the concentration of biomarker in urine, measuring the concentration of biomarker in the same serum, and using the concentration ratio (urinary concentration / blood concentration) as an index, diabetes It was shown that the progression of sexually transmitted diseases can be sufficiently evaluated.
(Example 7) Evaluation test of progress of diabetic disease using adiponectin, insulin, resistin as biomarkers in urine, and using multiple combinations as indicators, urinary adiponectin concentration obtained according to Example 1, implementation The urinary resistin concentration obtained according to Example 3 and the urinary insulin concentration obtained according to Example 5 are increased as the diabetes progresses and the renal function is impaired. Therefore, it was examined whether the degree of renal dysfunction could be expanded and evaluated by taking the product of the respective values using these concentrations as indices.
First, when the product of adiponectin and resistin was taken as an index, as shown in FIG. 10, it was significant between healthy persons (non-obese non-diabetic subjects) and obese non-diabetic subjects who are diabetic reserves. Although there was no difference, a clear numerical difference was found between obese non-diabetic subjects and diabetic patients. Thus, it became clear that obese non-diabetic subjects and diabetic patients can be clearly identified using the product of adiponectin and resistin as an index.
Furthermore, when the product of adiponectin and insulin was used as an index, it was also found that the obese non-diabetic subject and the diabetic patient could be clearly distinguished. Therefore, taking the product of three types of adiponectin, resistin, and insulin as an index, it became clear that the obese non-diabetic subject and the diabetic patient can be clearly distinguished by showing a large numerical difference.
As described above, it was shown that the progress of diabetic disease can be sufficiently evaluated using the product of biomarkers in urine.

本発明の尿中糖尿病関連バイオマーカーの評価方法は、採取された単一の尿から、多種のバイオマーカーの検査が可能であり、得られたバイオマーカーの数値から、糖尿病の進行状況と共に、腎臓の機能障害の進行状況も早期に把握することが可能である。また、尿検体は採血と異なり苦痛を伴わず簡便に採取できるため、対象者の積極的な検診への参加が期待できる。そのため、本発明の評価方法を用いて、健康診断への応用と介入療法と組み合わせての医療システムの構築が可能となる。 The method for evaluating a urinary diabetes-related biomarker of the present invention can test various biomarkers from a single collected urine. From the values of the obtained biomarkers, along with the progress of diabetes, kidneys It is possible to grasp the progress of the functional disorder in the early stage. In addition, unlike urine samples, urine samples can be collected easily and without pain, so that the subject can be expected to participate actively in screening. Therefore, using the evaluation method of the present invention, it is possible to construct a medical system in combination with application to health checkup and intervention therapy.

Claims

One or more biomarkers related to diabetes in urine are measured by the immune complex transfer measuring method (ICT-EIA method), The progress evaluation method of a diabetic disease characterized by the above-mentioned.

The method for assessing the degree of progression of diabetic disease according to claim 1, wherein a plurality of the biomarkers are selected from insulin, resistin, adiponectin, leptin and CRP.

Leptin or resistin is selected together with adiponectin as the biomarker, The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to claim 1 or 2.

The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to any one of claims 1 to 3, wherein the diabetic disease is diabetic nephropathy.

5. The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to claim 4, wherein when the adiponectin concentration in the urine is 1 to 10 ng / mg Cre, it is evaluated as an initial symptom of diabetic nephropathy.

The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to claim 1 or 2, wherein insulin and / or resistin is selected together with adiponectin as the biomarker.

7. The evaluation according to claim 6, wherein the evaluation is performed using any one of three products of adiponectin and resistin, adiponectin and insulin, adiponectin and resistin, and insulin as an index combining the biomarkers. The method for evaluating the degree of progression of the diabetic disease as described.

The method for evaluating the degree of progression of diabetic disease according to claim 7, wherein the evaluation is performed to distinguish obese non-diabetic (OND) from diabetic patients (DM).

A method for the prophylaxis or treatment of diabetic disease, characterized in that an intervention therapy is performed on a diabetic patient and / or a diabetic preparatory group using the method for evaluating the degree of progression according to any one of claims 1 to 8.

The method for preventing or treating diabetic disease according to claim 9, wherein the diabetic disease is diabetic nephropathy.

The method for preventing or treating diabetic disease according to claim 9 or 10, wherein intervention therapy is started when the concentration of adiponectin in urine is 1 ng / mg Cre or more.