JPWO2012115270A1 - Method for selecting iPS cell clones and method for selecting genes used in the selection method - Google Patents
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Abstract
本発明は、分化させても腫瘍化が起きにくいiPS細胞クローンの選択方法、及びその選択方法に用いる遺伝子の選択方法を提供することを目的とし、一実施態様として、未分化状態のiPS細胞クローンにおいて、第1〜第10遺伝子群のいずれかの遺伝子群において、少なくとも一つの遺伝子について、発現レベルを調べることによって、分化させても腫瘍化が起きにくいiPS細胞クローンを選択する。また、正常に分化できないか、あるいは分化しても腫瘍化を起こしやすい複数の第1のiPS細胞クローンと、腫瘍化を起こしにくい複数の第2のiPS細胞クローンにおいて、未分化状態の各iPS細胞クローンで、1以上の遺伝子を含む候補遺伝子群に属する遺伝子の発現レベルを調べることによって、分化させても腫瘍化が起きにくいiPS細胞クローンの選択方法に用いる遺伝子を選択する。An object of the present invention is to provide a method for selecting an iPS cell clone that is unlikely to undergo tumorigenesis even if differentiated, and a method for selecting a gene used in the selection method. In the above, by examining the expression level of at least one gene in any one of the first to tenth gene groups, iPS cell clones that are unlikely to undergo tumorigenesis even when differentiated are selected. In addition, in each of a plurality of first iPS cell clones that are not normally differentiated or that are susceptible to tumorigenesis even when differentiated and a plurality of second iPS cell clones that are less likely to be tumorigenic, each iPS cell in an undifferentiated state By examining the expression level of a gene belonging to a candidate gene group including one or more genes in a clone, a gene to be used in a method for selecting an iPS cell clone that hardly causes tumorigenesis even when differentiated is selected.
Description
本発明は、iPS細胞クローンの選択方法、及びその選択方法に用いる遺伝子の選択方法に関する。 The present invention relates to a method for selecting an iPS cell clone and a method for selecting a gene used in the selection method.
iPS細胞(induced pluripotent stem cells; 人工多能性幹細胞)は、多能性を有し、分化細胞から調製できるため、再生医療において移植に用いるための細胞として期待されている。しかしながら、iPS細胞を分化させて移植しても、in vivoでは、移植されたiPS細胞由来の細胞が腫瘍化する問題が指摘されている(Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5.)。 Since iPS cells (induced pluripotent stem cells) are pluripotent and can be prepared from differentiated cells, they are expected to be used for transplantation in regenerative medicine. However, even if iPS cells are differentiated and transplanted, there has been a problem that cells derived from transplanted iPS cells become tumors in vivo (Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27). : p.743-5.).
本発明は、分化させても腫瘍化が起きにくいiPS細胞クローンの選択方法、及びその選択方法に用いる遺伝子の選択方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for selecting an iPS cell clone that is unlikely to undergo tumorigenesis even when differentiated, and a method for selecting a gene used in the selection method.
本発明は、以下のような各項からなる。
(1)iPS細胞クローンの選択方法であって,未分化状態のiPS細胞において、以下の第1〜第12遺伝子群のいずれかの遺伝子群において、少なくとも一つの遺伝子について、発現レベルを調べる工程、を含む方法。
(2)第1項に記載の選択方法であって,前記発現レベルを、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現レベル、及び、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現レベルと比較する工程、をさらに含む方法。
(3)第1項に記載の選択方法であって,前記iPS細胞クローンにおいて、第1〜第12遺伝子群のいずれかの遺伝子群に属する全ての遺伝子の発現レベルを調べる工程と,調べた遺伝子群において、発現レベルに異常のある遺伝子の個数を調べる工程と、調べた遺伝子の個数を、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける発現レベルに異常のある遺伝子の個数、及び、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおける発現レベルに異常のある遺伝子の個数と比較する工程、をさらに含む方法。
(4)第3項に記載の選択方法であって、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞の発現レベルと比較することによって、前記発現レベルが異常かどうか判断することを特徴とする、方法。
(5)第1項に記載の選択方法であって,前記iPS細胞クローンにおいて、第1〜第12遺伝子群のいずれかの遺伝子群に属する全ての遺伝子の発現レベルを調べる工程と,調べた遺伝子群について、前記iPS細胞クローンにおける発現レベルと、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける発現レベルとを指標にして、iPS細胞クローンのclustering分析を行う工程と、当該iPS細胞クローンが、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンと正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンのいずれに分類されるかを調べる工程と、を含む方法。
(6)第5項に記載の選択方法であって、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞の発現レベルとの相対値を指標にして、前記iPS細胞クローンのclustering分析を行うことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
(7)iPS細胞クローンを選択するために発現レベルを調べる遺伝子の選択方法であって、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすい複数の第1のiPS細胞クローンと、腫瘍化を起こしにくい複数の第2のiPS細胞クローンにおいて、未分化状態のiPS細胞で、1以上の遺伝子を含む候補遺伝子群に属する遺伝子の発現レベルを調べる工程、を含む方法。
(8)前記候補遺伝子群に属する遺伝子が、多能性幹細胞で分化細胞より発現の高い遺伝子、及びDNA修復に関与する遺伝子であることを特徴とする、第7項に記載の方法。
(9)前記候補遺伝子群に属する遺伝子が、第1遺伝子群及び第2遺伝子群のいずれかに属する遺伝子であることを特徴とする、第7項に記載の方法。
(10)第7項に記載の選択方法であって、複数の第1のiPS細胞クローンにおいて得られた第1の発現レベルと、複数の第2のiPS細胞クローンにおいて得られた第2の発現レベルとを比較する工程と、第1の発現レベルと第2の発現レベルとが異なるかどうか調べる工程と、を含む方法。
(11)第7項に記載の選択方法であって、複数の第1のiPS細胞クローンにおいて得られた発現レベルにおいて、発現レベルに異常のある遺伝子の第1の個数と、複数の第2のiPS細胞クローンにおいて得られた発現レベルのうち、発現レベルに異常のある遺伝子の第2の個数とを比較する工程と、第1の個数と第2の個数とが異なるかどうか調べる工程と、を含む方法。
(12)第11項に記載の選択方法であって、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞の発現レベルと比較することによって、前記発現レベルが異常かどうか判断することを特徴とする、方法。
(13)第7項に記載の選択方法であって、前記iPS細胞クローンについて、前記発現レベルを指標にしてclustering分析を行う工程と、複数の第1のiPS細胞クローンと複数の第2のiPS細胞クローンが、それぞれ別のclusterに分類されるかどうか調べる工程と、を含む方法。
(14)第13項に記載の選択方法であって、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞の発現レベルとの相対値を指標にして、前記iPS細胞クローンについてclustering分析を行うことを特徴とする、方法。The present invention comprises the following items.
(1) A method for selecting an iPS cell clone, the step of examining an expression level of at least one gene in any of the following first to twelfth gene groups in an undifferentiated iPS cell: Including methods.
(2) The selection method according to item 1, wherein the expression level is not normally differentiated, or the expression level of the gene in an iPS cell clone that is prone to oncogenesis even if differentiated, and oncogenesis Comparing the expression level of the gene in iPS cell clones that are unlikely to occur.
(3) The selection method according to item 1, wherein in the iPS cell clone, a step of examining expression levels of all genes belonging to any one of the first to twelfth gene groups, and the examined genes In the group, a step of examining the number of genes having abnormal expression levels, and a gene having abnormal expression levels in iPS cell clones that are not normally differentiated or that are susceptible to oncogenesis even if differentiated. And a step of comparing the number of genes with the number of genes having abnormal expression levels in iPS cell clones that are unlikely to undergo tumorigenesis.
(4) The selection method according to (3), wherein the expression level is determined to be abnormal by comparing with an expression level of a pluripotent stem cell that is unlikely to cause tumorigenesis.
(5) The selection method according to item 1, wherein in the iPS cell clone, a step of examining expression levels of all genes belonging to any one of the first to twelfth gene groups, and the examined genes A clustering analysis of the iPS cell clones using the expression level in the iPS cell clone and the expression level in the iPS cell clone that is not normally differentiated or is easily differentiated even when differentiated as an index, Investigating whether the iPS cell clone is normally differentiated from an iPS cell clone that is unlikely to undergo tumorigenesis, or is classified into an iPS cell clone that is likely to undergo tumorigenesis even if differentiated.
(6) The selection method according to (5), wherein clustering analysis of the iPS cell clone is performed using as an index a relative value with an expression level of a pluripotent stem cell that is unlikely to cause tumorigenesis. The method according to claim 7.
(7) A method for selecting genes whose expression levels are examined in order to select iPS cell clones, and a plurality of first iPS cell clones that do not differentiate normally or are susceptible to oncogenesis even after differentiation, and oncogenesis A step of examining expression levels of genes belonging to a group of candidate genes including one or more genes in undifferentiated iPS cells in a plurality of second iPS cell clones that are unlikely to cause morphogenesis.
(8) The method according to item 7, wherein the genes belonging to the candidate gene group are pluripotent stem cells that are higher in expression than differentiated cells and genes involved in DNA repair.
(9) The method according to item 7, wherein the gene belonging to the candidate gene group is a gene belonging to either the first gene group or the second gene group.
(10) The selection method according to item 7, wherein the first expression level obtained in the plurality of first iPS cell clones and the second expression obtained in the plurality of second iPS cell clones Comparing the level and examining whether the first expression level and the second expression level are different.
(11) The selection method according to item 7, wherein, in the expression level obtained in the plurality of first iPS cell clones, a first number of genes having an abnormal expression level, and a plurality of second Of the expression levels obtained in the iPS cell clone, a step of comparing the second number of genes having abnormal expression levels and a step of examining whether the first number and the second number are different from each other. Including methods.
(12) The selection method according to item 11, wherein the expression level is judged to be abnormal by comparing with an expression level of a pluripotent stem cell which is less likely to cause tumorigenesis.
(13) The selection method according to item 7, wherein the iPS cell clone is subjected to a clustering analysis using the expression level as an index, a plurality of first iPS cell clones and a plurality of second iPS. Examining whether each cell clone is classified into a different cluster.
(14) The selection method according to (13), wherein clustering analysis is performed on the iPS cell clone using the relative value to the expression level of pluripotent stem cells that are unlikely to be tumorigenic as an index. ,Method.
==関連文献とのクロスリファレンス==
本出願は、2011年2月25日付で出願した日本国特許出願2011−40979、及び2011年3月22日付で出願した米国仮出願US61/466298に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。== Cross reference with related literature ==
This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2011-40979 filed on Feb. 25, 2011, and US Provisional Application US 61/466298 filed on Mar. 22, 2011. The application is hereby incorporated by reference.
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; Juan S. Bonifacino (Bethesda, Maryland); Mary Dasso (Bethesda, Maryland); J. B. Harford, J. L-Schwartz, K. M. Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。Hereinafter, embodiments of the present invention completed based on the above knowledge will be described in detail with reference to examples.
Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd .; Juan S. Bonifacino (Bethesda, Maryland); Mary Dasso (Bethesda, Maryland); JB Harford, J. L-Schwartz, KM Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd. The described method, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
(1)iPS細胞の作製方法
iPS細胞は、分化した細胞に初期化因子を導入し、脱分化させることによって製造できる。(Takahashi K & Yamanaka S. Cell 2006 vol.126: p.663-676; Takahashi K, et al., Cell 2007 vol.131: p.861-872)。(1) Method for producing iPS cells iPS cells can be produced by introducing reprogramming factors into differentiated cells and dedifferentiating them. (Takahashi K & Yamanaka S. Cell 2006 vol.126: p.663-676; Takahashi K, et al., Cell 2007 vol.131: p.861-872).
初期化方法は特に限定されないが、核初期化因子を導入することにより、多分化能及び自己増殖能を有するように誘導することが好ましい。例えば国際公開WO2005/080598やWO2007/069666に記載された初期化方法を用いることができる。 The initialization method is not particularly limited, but it is preferably induced to have pluripotency and self-proliferation ability by introducing a nuclear reprogramming factor. For example, an initialization method described in International Publications WO2005 / 080598 and WO2007 / 069666 can be used.
核初期化因子は、特に限定されないが、Oct遺伝子群、Klf遺伝子群、Sox遺伝子群のそれぞれの遺伝子群から選択された遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含むことが好ましく、iPS細胞樹立の効率という点では、遺伝子群の遺伝子産物をさらに含んだ組み合わせを含むことがより好ましい。Oct遺伝子群に属する遺伝子としては、Oct3/4、Oct1A、Oct6などがあり、Klf遺伝子群に属する遺伝子としては、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5などがあり、Sox遺伝子群に属する遺伝子としては、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18などがある。Myc遺伝子群に属する遺伝子としては、c-Myc、N-Myc、L-Mycなどがある。 The nuclear reprogramming factor is not particularly limited, but preferably includes a combination of gene products of genes selected from each gene group of the Oct gene group, the Klf gene group, and the Sox gene group, and the efficiency of iPS cell establishment Then, it is more preferable to include a combination further including a gene product of a gene group. The genes belonging to the Oct gene group include Oct3 / 4, Oct1A, Oct6, the genes belonging to the Klf gene group include Klf1, Klf2, Klf4, Klf5, etc., and the genes belonging to the Sox gene group include Sox1 , Sox2, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18. Examples of genes belonging to the Myc gene group include c-Myc, N-Myc, and L-Myc.
核初期化因子としては、上記組み合わせ以外にも、Oct遺伝子群の遺伝子、Sox遺伝子群の遺伝子に加え、Nanog遺伝子、lin-28遺伝子、及び/又はglis1遺伝子を含む組み合わせが挙げられる。また、これらの遺伝子のいずれかの組み合わせに加え、p53を欠損させてもよく、例えば、shp53によってp53遺伝子をノックダウンしてもよい。なお、細胞に導入する場合、上記組み合わせの遺伝子に加え、他にも遺伝子産物を導入してもよく、例えば、不死化誘導因子などが挙げられる。 As a nuclear reprogramming factor, in addition to the above combination, a combination including a Nanog gene, a lin-28 gene, and / or a glis1 gene in addition to the genes of the Oct gene group and the Sox gene group can be mentioned. Further, in addition to any combination of these genes, p53 may be deleted. For example, the p53 gene may be knocked down by shp53. In addition, when introducing into a cell, in addition to the gene of the said combination, you may introduce | transduce other gene products, for example, an immortalization inducer etc. are mentioned.
これらの遺伝子は、いずれも、脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では、特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、polymorphismを含め、変異を有する遺伝子であっても、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する遺伝子もまた、含まれるものとする。 These genes are genes that are highly conserved in vertebrates, and in this specification, unless the name of an animal is indicated, the gene including a homolog is assumed. Moreover, even if it is a gene which has a variation | mutation including polymorphism, the gene which has a function equivalent to a wild-type gene product shall also be included.
さらに、これら遺伝子の組み合わせに加え、サイトカインや化合物を補助因子として培地に添加しても良い。この場合のサイトカインとして、例えばSCFやbFGFなどが挙げられ、これらは、c-Mycに代替でき、化合物として、例えばバルプロ酸などが挙げられ、これは、c-Myc遺伝子やKlf4遺伝子に代替できる。 Furthermore, in addition to the combination of these genes, cytokines and compounds may be added to the medium as cofactors. Examples of cytokines in this case include SCF and bFGF, which can be substituted for c-Myc, and examples of compounds include valproic acid, which can be substituted for c-Myc gene and Klf4 gene.
(2)iPS細胞クローンの選択方法
本発明にかかるiPS細胞クローンの選択方法は、未分化状態のiPS細胞において、表1〜12に示す第1〜第12の遺伝子群など、所定の遺伝子群において、少なくとも一つの遺伝子について、発現レベルを調べる工程を含む。
遺伝子の発現レベルの調べ方は、特に限定されず、例えば、未分化状態のiPS細胞から常法によって全mRNAを抽出し、そのmRNAを用いて、調べたい遺伝子をプローブにしてノザンブロッティングを行ったり、逆転写の後PCRを行ったりすることで、その遺伝子の発現レベルを知ることができる。複数の遺伝子について同時に発現を調べる場合は、DNAアレイを用いることが好ましい。すなわち、調べたい遺伝子に対するプローブが固定されたDNAアレイに対し、標識した全mRNAをハイブリダイズさせ、得られたシグナルの強度を解析することによって、その遺伝子の発現レベルを知ることができる。
これまで、未分化状態のiPS細胞の遺伝子発現レベルを調べることによって、そのiPS細胞が分化した時にどのような性状を示すかを予測する方法は知られていなかった。しかし、本発明の一実施形態においては,未分化状態のiPS細胞において特定の遺伝子の発現レベルを調べ、その発現レベルを指標にすることによって、そのiPS細胞が腫瘍化を起こしにくいかどうか、を予測することが可能である。以下,その予測方法について,具体的な方法を説明するが、本発明の方法は、下記のものに限定されない。なお、本明細書で「iPS細胞クローンが腫瘍化を起こしにくい」とだけ言う時、in vitroで分化した時あるいはin vivoに移植して分化した場合に、そのクローンが腫瘍化しにくいということを意味するのであって、分化しない場合は含まないものとする。(2) Method for selecting iPS cell clones The method for selecting iPS cell clones according to the present invention is based on a predetermined gene group such as the first to twelfth gene groups shown in Tables 1 to 12 in undifferentiated iPS cells. And a step of examining the expression level of at least one gene.
The method for examining the expression level of the gene is not particularly limited, and for example, total mRNA is extracted from undifferentiated iPS cells by a conventional method, and using that mRNA, Northern blotting is performed using the gene to be examined as a probe. By performing PCR after reverse transcription, the expression level of the gene can be known. When examining the expression of a plurality of genes simultaneously, it is preferable to use a DNA array. That is, the expression level of a gene can be known by hybridizing all labeled mRNA to a DNA array in which a probe for the gene to be examined is immobilized and analyzing the intensity of the obtained signal.
Until now, there has been no known method for predicting what kind of property the iPS cell shows when it is differentiated by examining the gene expression level of the undifferentiated iPS cell. However, in one embodiment of the present invention, whether the iPS cell is unlikely to undergo tumorigenesis by examining the expression level of a specific gene in an undifferentiated iPS cell and using the expression level as an index. It is possible to predict. Hereinafter, although the specific method is demonstrated about the prediction method, the method of this invention is not limited to the following. In this specification, when only saying that “iPS cell clones are less likely to cause oncogenesis”, it means that the clones are less likely to become tumors when differentiated in vitro or transplanted and differentiated in vivo. If it does not differentiate, it will not be included.
[1]特定の遺伝子の発現を比較する方法
所定の遺伝子群のうちの少なくとも一つの遺伝子について、予め、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現レベルと、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現レベルとを、それぞれ1以上のiPS細胞クローンを用いて決定し、そして、これらの発現(以下、対象発現と称する)のレベルを、性状を調べたいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現のレベルと比較する。[1] Method for comparing the expression of a specific gene For at least one gene in a predetermined gene group, expression of the gene in an iPS cell clone that does not differentiate normally in advance or is susceptible to oncogenesis even after differentiation And the expression level of the gene in iPS cell clones that are less prone to oncogenesis are determined using one or more iPS cell clones, respectively, and the levels of these expressions (hereinafter referred to as subject expression) are: Comparison is made with the expression level of the gene in the iPS cell clone to be examined.
ここで、あるクローンが腫瘍を起こしやすいかどうかを判断する方法は特に限定されないが、例えば、iPS細胞からニューロスフェアを分化させ(Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086-98; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5)、NOD/SCIDマウスの線条体や精巣に移植し、1〜6ヶ月後にニューロスフェアの分化状態を調べ,腫瘍が形成されたかどうかを調べたり、形成された場合,その大きさや個数を調べたり、移植細胞の異常増殖等を調べたりすればよい(Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086-98; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5)。腫瘍を起こしやすいかどうかの基準は、iPS細胞の使用目的によって、当業者が適切に決定すればよく、例えば、治療目的の移植に用いる場合は、厳しい基準とすればよく、形成された腫瘍を研究する場合は、緩い基準にすれば良い。この時、全ての種類の腫瘍について考慮に入れてもよいが、グリオーマなど特定の腫瘍についてのみ考慮に入れてもよい。 Here, a method for determining whether a certain clone is likely to cause a tumor is not particularly limited. For example, neurospheres are differentiated from iPS cells (Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086- 98; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5), transplanted into the striatum and testis of NOD / SCID mice, and examined the differentiation state of neurospheres 1-6 months later , If the tumor is formed, if it is formed, the size and number of the tumor, or the abnormal growth of the transplanted cells may be examined (Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086-98; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5). The criteria for determining whether or not a tumor is likely to develop may be appropriately determined by those skilled in the art depending on the intended use of the iPS cells. For example, when used for transplantation for therapeutic purposes, the criteria may be strict. When studying, loose standards should be used. At this time, all types of tumors may be taken into account, but only specific tumors such as gliomas may be taken into account.
対照発現レベルの数値化の方法は特に限定されず、複数のクローンにおける発現レベルのリスト、複数のクローンにおける発現レベルの平均または平均±標準偏差(または誤差)、複数のクローンにおける発現レベルの上限から下限までの範囲、複数のクローンにおける発現レベルから推測または統計的に計算された値または範囲など、性状を調べたいクローンにおいて調べた発現レベルがどちらの発現レベルに適合するかが判定できる限り、いずれの数値化であってもよい。そして、その数値化のやり方によって、適切な比較方法を選択することができる。例えば,調べた発現レベルと対照発現レベルの間に有意差はあるか,あるいは、調べた発現レベルは対照発現レベルの範囲の中に入っているか等を検定する。そして、調べた発現レベルが、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンの対照発現レベルに適合すると判定された場合,そのクローンは正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンである、あるいは腫瘍化を起こしにくいクローンではないと判断し、腫瘍化を起こしにくいクローンにおける対照発現レベルに適合すると判定された場合,そのクローンは腫瘍化を起こしにくいiPS細胞であると判断する。 The method of quantifying the control expression level is not particularly limited. From the list of expression levels in a plurality of clones, the average or mean ± standard deviation (or error) of the expression levels in a plurality of clones, the upper limit of the expression level in a plurality of clones As long as it is possible to determine which expression level the expression level examined in the clone you want to examine, such as a range to the lower limit, a value or range estimated or statistically calculated from the expression levels in multiple clones, It may be a numerical value. An appropriate comparison method can be selected according to the digitization method. For example, it is tested whether there is a significant difference between the examined expression level and the control expression level, or whether the examined expression level falls within the range of the control expression level. If it is determined that the examined expression level does not differentiate normally or matches the control expression level of a clone that is prone to oncogenesis even if differentiated, the clone does not differentiate normally or is differentiated and tumor If the clone is determined to be suitable for the control expression level in a clone that is unlikely to cause oncogenesis, or is determined not to be tumorigenic, and the clone is determined to be compatible with the control expression level in the clone that is unlikely to cause oncogenesis, the clone is an iPS cell that is unlikely to cause oncogenesis. Judge that there is.
[2]発現に異常のある遺伝子の個数を比較する方法
あるいは、予め、1以上の正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンと1以上の腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおいて、所定の遺伝子群の全ての遺伝子の発現レベルを決定し、発現レベルに異常のある遺伝子の個数を算出し、それぞれのiPS細胞クローンにおいて発現レベルに異常のある遺伝子の個数を決定(以下、対照個数と称する)する。そして、性状を調べたいiPS細胞クローンにおいて発現レベルに異常のある遺伝子の個数を対照個数と比較する。[2] Method for comparing the number of genes with abnormal expression Alternatively, one or more iPS cell clones that are not normally differentiated or that are prone to oncogenesis even if differentiated and one or more iPS that are less likely to be oncogenic In the cell clone, the expression level of all genes in a predetermined gene group is determined, the number of genes having abnormal expression levels is calculated, and the number of genes having abnormal expression levels in each iPS cell clone is determined ( Hereinafter referred to as the number of controls). Then, the number of genes having abnormal expression levels in the iPS cell clones whose properties are to be examined is compared with the number of controls.
ここで、一つの遺伝子について、複数種類のプローブを用いて調べた結果を用いてclustering解析を行ってもよいが、複数種類のプローブを用いる遺伝子の割合は少ない方が好ましく、全体の20%未満であることが好ましく、10%未満であることがより好ましく、0%であることが最も好ましい。一つの遺伝子について、複数種類のプローブを用いる場合であっても、プローブの種類も少ない方が好ましく、三種類以下のプローブを用いるのが好ましく、二種類以下のプローブを用いるのがより好ましいが、最も好ましいのは一種類のプローブを用いる場合である。また、検出できる遺伝子が特定されていないプローブを用いても良いが、その数は少ない方が好ましく、全体の20%未満であることが好ましく、10%未満であることがより好ましく、0%であることが最も好ましい。なお、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいか、については、[1]と同様にして判断できる。 Here, for one gene, clustering analysis may be performed using the results of investigation using a plurality of types of probes. However, the proportion of genes using a plurality of types of probes is preferably small, and less than 20% of the total. Preferably, it is less than 10%, most preferably 0%. Even if a plurality of types of probes are used for one gene, it is preferable that the number of types of probes is small, preferably three or less types of probes are used, and more preferably two types or less probes are used. Most preferred is when one type of probe is used. In addition, a probe in which a gene that can be detected is not specified may be used, but the number is preferably smaller, preferably less than 20%, more preferably less than 10%, more preferably 0%. Most preferably it is. In addition, it can be determined in the same manner as in [1] whether normal differentiation occurs or whether differentiation is likely to cause tumorigenesis.
発現レベルに異常があるかどうかを判断する方法は特に限定されないが、正常な多能性幹細胞クローンと比較して決めることが好ましい。ここで、正常な多能性幹細胞クローンとしては、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞クローンであればよく、多能性幹細胞は、ES細胞でもiPS細胞でもよい。そして、遺伝子群の各遺伝子について、正常な多能性幹細胞クローンにおける発現レベルと比較して、所定の割合以下、及び所定の割合以上の発現レベルを異常とする。例えば、異常とする割合は、10%以下、20%以下、50%以下、66.7%以下、80%以下、あるいは、120%以上、125%以上、133.3%以上、150%以上、180%以上を例示できる。 The method for determining whether or not there is an abnormality in the expression level is not particularly limited, but it is preferable to determine by comparing with a normal pluripotent stem cell clone. Here, the normal pluripotent stem cell clone may be a pluripotent stem cell clone that is unlikely to cause oncogenesis, and the pluripotent stem cell may be an ES cell or an iPS cell. And about each gene of a gene group, compared with the expression level in a normal pluripotent stem cell clone, below a predetermined ratio and the expression level above a predetermined ratio are made abnormal. For example, the rate of abnormality is 10% or less, 20% or less, 50% or less, 66.7% or less, 80% or less, or 120% or more, 125% or more, 133.3% or more, 150% or more, For example, 180% or more.
ここでも、対照個数の提示の仕方は特に限定されず、複数のクローンにおける個数のリスト、複数のクローンにおける個数の平均または平均±標準偏差(または誤差)、複数のクローンにおける個数の上限から下限までの範囲、複数のクローンにおける個数から推測または統計的に計算された値または範囲など、性状を調べたいクローンにおいて調べた個数がどちらに適合するかが判定できる限り、いずれの表示であってもよい。そして、その表示の仕方によって、適切な比較方法を選択することができる。例えば,調べた個数と対照個数の間に有意差はあるか,あるいは、調べた個数は対照個数の範囲の中に入っているか等を検定する。そして、調べた個数が、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンの対照個数に適合すると判定された場合、そのクローンは正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンである、あるいは腫瘍化を起こしにくいクローンではないと判断され、腫瘍化を起こしにくいクローンにおける対照個数に適合すると判定された場合,そのクローンは腫瘍化を起こしにくいクローンであると判断される。 Here too, the method of presenting the control number is not particularly limited, from a list of the numbers in multiple clones, the average or average ± standard deviation (or error) of the numbers in multiple clones, from the upper limit to the lower limit of the numbers in multiple clones Any display may be used as long as it can be determined whether the number of clones to be examined is suitable, such as a range or a value or range estimated or statistically calculated from the number of clones. . An appropriate comparison method can be selected depending on the display method. For example, it is tested whether there is a significant difference between the number examined and the number of controls, or whether the number examined is within the range of the number of controls. And if it is determined that the number examined does not differentiate normally or matches the control number of clones that are prone to tumorigenesis even if differentiated, the clone will not differentiate normally or will become tumoriable even if differentiated. If it is determined that the clone is not susceptible to oncogenesis, or is not likely to cause oncogenesis, and if it is determined to match the number of controls in a clone that is less likely to cause oncogenesis, the clone is determined to be less likely to cause oncogenesis. The
[3]clustering分析によって分類する方法
あるいは、予め、1以上の正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンと1以上の腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおいて、所定の遺伝子群の全ての発現レベルを決定する。ここで、そして、性状を調べたいiPS細胞クローンにおいても、同じ遺伝子群の全ての発現レベルを決定し、各iPS細胞クローンのclustering解析を行なう。[3] Method of classifying by clustering analysis Alternatively, in one or more iPS cell clones that are not normally differentiated or that are susceptible to oncogenesis even after differentiation, Determine the expression level of all genes. Here, also for iPS cell clones whose properties are to be examined, all expression levels of the same gene group are determined, and clustering analysis of each iPS cell clone is performed.
ここで、一つの遺伝子について、複数種類のプローブを用いて調べた結果を用いてclustering解析を行ってもよいが、複数種類のプローブを用いる遺伝子の割合は少ない方が好ましく、全体の20%未満であることが好ましく、10%未満であることがより好ましく、0%であることが最も好ましい。一つの遺伝子について、複数種類のプローブを用いる場合であっても、プローブの種類も少ない方が好ましく、三種類以下のプローブを用いるのが好ましく、二種類以下のプローブを用いるのがより好ましいが、最も好ましいのは一種類のプローブを用いる場合である。また、検出できる遺伝子が特定されていないプローブを用いても良いが、その数は少ない方が好ましく、全体の20%未満であることが好ましく、10%未満であることがより好ましく、0%であることが最も好ましい。なお、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいか、及び所定の遺伝子群の中の遺伝子について、発現に異常があるかどうか、については、[1]と同様にして判断できる。 Here, for one gene, clustering analysis may be performed using the results of investigation using a plurality of types of probes. However, the proportion of genes using a plurality of types of probes is preferably small, and less than 20% of the total. Preferably, it is less than 10%, most preferably 0%. Even if a plurality of types of probes are used for one gene, it is preferable that the number of types of probes is small, preferably three or less types of probes are used, and more preferably two types or less probes are used. Most preferred is when one type of probe is used. In addition, a probe in which a gene that can be detected is not specified may be used, but the number is preferably smaller, preferably less than 20%, more preferably less than 10%, more preferably 0%. Most preferably it is. In addition, it can be judged in the same manner as in [1] whether it does not differentiate normally, is susceptible to oncogenesis even if differentiated, and whether there is an abnormality in the expression of genes in a predetermined gene group. .
ここで、clustering分析を行なう際、調べた発現レベルが異常かどうかを指標にしてもよい。発現レベルに異常があるかどうかを判断する方法は、[2]の記載と同様である。なお、clusteringtは、Cluster 3.0(東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターDNA情報解析分野によるフリーウェア;M. J. L. de Hoon, S. Imoto, J. Nolan, and S. Miyano: Open Source Clustering Software. Bioinformatics, 20 (9): 1453--1454 (2004).;http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/)や Gene spring GX(Agilent社)などのソフトを用いて行うことができる。 Here, when performing clustering analysis, it may be used as an index whether the examined expression level is abnormal. The method for determining whether the expression level is abnormal is the same as described in [2]. In addition, clusteringt is Cluster 3.0 (Freeware by the Department of DNA Information Analysis, Human Genome Center, University of Tokyo; MJL de Hoon, S. Imoto, J. Nolan, and S. Miyano: Open Source Clustering Software. Bioinformatics, 20 (9): 1453--1454 (2004) .; http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/) and Gene spring GX (Agilent).
clustering分析の結果、性状を調べたいiPS細胞が、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンに分類された場合、そのクローンは正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンである、または腫瘍化を起こしにくいクローンではないと判断され、腫瘍化を起こしにくいクローンに分類された場合、そのクローンは腫瘍化を起こしにくいiPS細胞であると判断される。 As a result of clustering analysis, when iPS cells whose properties are to be examined are classified as clones that do not differentiate normally or are susceptible to tumorigenesis even after differentiation, the clones do not differentiate normally or become tumorous even if differentiated. When it is determined that the clone is not a clone that is likely to cause tumorigenesis or is not likely to cause tumorigenesis, and is classified as a clone that is unlikely to cause tumorigenesis, the clone is determined to be an iPS cell that is unlikely to cause tumorigenesis.
(3)遺伝子の選択方法
(1)で述べたように、未分化状態のiPS細胞クローンにおいて、第1〜第12遺伝子群など、所定の遺伝子群のうちの少なくとも一つの遺伝子について、発現レベルを調べることによって、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンを選択できる。(3) Gene selection method As described in (1) above, in an undifferentiated iPS cell clone, the expression level of at least one gene in a predetermined gene group such as the first to twelfth gene groups is determined. By investigating, it is possible to select iPS cell clones that are unlikely to be tumorigenic.
あるクローンが腫瘍化を起こしにくいかどうかを判断するために、どの遺伝子あるいはどの遺伝子群について発現レベルを調べるかについては、iPS細胞の起源によっても異なる可能性があるが、当業者が試行錯誤することなく、容易に決定することができる。以下、その決定方法について述べる。 In order to determine whether a certain clone is unlikely to undergo tumorigenesis, the expression level of which gene or which gene group is examined may vary depending on the origin of iPS cells. Can be easily determined. The determination method will be described below.
まず、クローンを選択するための遺伝子として使用できるかどうかを調べる候補遺伝子を選択する。この選択方法は、特に限定されず、ランダムに選んでも良いが、多能性幹細胞で分化細胞より発現の高い遺伝子やDNA修復に関与する遺伝子から選ぶのが好ましく、さらに第1遺伝子群及び第2遺伝子群から選ぶのがより好ましい。それによって、極めて高確率で目的のクローンを選択するための遺伝子を選択することが可能になる。それらの遺伝子群からの候補遺伝子の選び方も特に限定されないが、実施例のように、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞クローンと、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすい多能性幹細胞クローンとの間で、発現レベルが顕著に異なるような遺伝子を選択することが好ましい。こうして選択した、1以上、好ましくは2以上の遺伝子を含む遺伝子の群を第X遺伝子群とする。 First, a candidate gene for selecting whether or not it can be used as a gene for selecting a clone is selected. This selection method is not particularly limited, and may be selected at random, but is preferably selected from genes that are higher in pluripotent stem cells than differentiated cells and genes involved in DNA repair. More preferably, it is selected from the gene group. This makes it possible to select a gene for selecting a target clone with extremely high probability. The method for selecting candidate genes from these gene groups is not particularly limited, but as in the examples, pluripotent stem cell clones that are unlikely to undergo tumorigenesis and those that do not differentiate normally or are susceptible to tumorigenesis even when differentiated. It is preferable to select genes whose expression levels are significantly different from those of competent stem cell clones. A group of genes including one or more, preferably two or more genes selected in this way is defined as the Xth gene group.
なお、多能性幹細胞で分化細胞より発現の高い遺伝子は、RT−PCRやマイクロアレイ等を用いて、当業者には容易に調べることが可能である。また、DNA修復に関与する遺伝子とは、DNA修復過程のいずれか1つの過程に関わっている遺伝子であればよく、論文、特許公報、データベース等でそのように報告されている遺伝子であってもよい。これらの報告は、例えば、PUBMED、各国(例えば、日本、欧州、米国)特許庁やWIPOのHP、GO(Gene Ontology)などのデータベースからアクセス可能なデータベースに載っている論文や特許公報から検索することができる。すなわち、DNA修復に関与する遺伝子とは、PUBMEDや各国(例えば、日本、欧州、米国)特許庁やWIPOのデータベースやGOのデータベースに含まれている論文、特許公報、遺伝子情報の中に、機能の少なくとも一つがDNA修復に関与していることが報告されている遺伝子であることが最も好ましい。 A gene having higher expression than a differentiated cell in a pluripotent stem cell can be easily examined by those skilled in the art using RT-PCR, microarray, or the like. The gene involved in DNA repair may be any gene involved in any one of the DNA repair processes, and may be a gene reported as such in a paper, patent publication, database, or the like. Good. These reports are retrieved from articles and patent publications that are accessible from databases such as PUBMED, each country (eg, Japan, Europe, USA) Patent Office, WIPO HP, GO (Gene Ontology), etc. be able to. In other words, genes involved in DNA repair are functions in PUBMED, papers, patent gazettes, and gene information included in the patent offices of various countries (for example, Japan, Europe, and the US), WIPO databases, and GO databases. Most preferably, at least one of the genes is a gene reported to be involved in DNA repair.
次に、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすい1以上の、好ましくは複数の第1のiPS細胞クローンと、腫瘍化を起こしにくい1以上の、好ましくは複数の第2のiPS細胞において、未分化状態の各iPS細胞で、第X遺伝子群に属する遺伝子の発現レベルを調べる。そして、この発現レベルを指標にして、第1のiPS細胞クローンと第2のiPS細胞クローンを比較する。比較の方法は特に限定されないが、以下に、いくつかの具体例を述べる。 Next, one or more, preferably a plurality of first iPS cell clones that do not differentiate normally or are susceptible to oncogenesis upon differentiation, and one or more, preferably a plurality of second, idiosyncratic cells that are less likely to cause oncogenesis. In iPS cells, the expression level of the gene belonging to the X gene group is examined in each undifferentiated iPS cell. Then, using the expression level as an index, the first iPS cell clone and the second iPS cell clone are compared. The comparison method is not particularly limited, but some specific examples will be described below.
[1]発現レベル自体を比較する方法
例えば、第1のクローンの発現レベルと、第2のクローンの発現レベルが異なるかどうか調べる。[1] Method of comparing expression levels themselves For example, it is examined whether the expression level of the first clone is different from the expression level of the second clone.
ここで、発現レベルが異なるという判断は、腫瘍化を起こしにくいかどうか不明のクローンにおいて、同様に第X遺伝子群の遺伝子の発現レベルを調べ、そのクローンが、第1のクローンと第2のクローンのどちらに適合するかが判断できれば、どのような基準で判断してもよい。例えば、第1及び第2のクローンにおける発現レベルを、それぞれ最低レベルと最高レベルの範囲で表し、それらの範囲が重ならない場合に異なると判断しても良く、それぞれ平均値で表し、それらの値に有意差がある場合に異なると判断してもよいが、これらに限定されない。 Here, the judgment that the expression level is different is made by examining the expression level of the gene of the X gene group in clones in which it is unknown whether tumorigenesis is unlikely to occur, and the clones are the first clone and the second clone. As long as it can be determined which one of the two is applicable, any criterion may be used. For example, the expression levels in the first and second clones may be expressed as a range of the lowest level and the highest level, respectively, and may be determined to be different when the ranges do not overlap. However, the present invention is not limited to these.
このように、第1のクローンと第2のクローンにおける発現レベルを比較し、それらが異なるようであれば、この第X遺伝子群は、腫瘍化を起こしにくいクローンを選択するための遺伝子群として用いることができる。 Thus, if the expression levels in the first clone and the second clone are compared and if they differ, this X gene group is used as a gene group for selecting clones that are unlikely to cause oncogenesis. be able to.
[2]多能性幹細胞と発現レベルが異なる遺伝子数を比較する方法
あるいは、第X遺伝子群の中で、第1及び第2のiPS細胞クローンにおいて、正常な多能性幹細胞クローンと発現レベルが異なる遺伝子の個数を測定し、それらの個数が異なれば、この第X遺伝子群は、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンを選択するための遺伝子群として用いることができる。なお、正常な多能性幹細胞クローンとは、in vitroまたはin vivoに移植した時に、腫瘍化を起こしにくいことが判明している多能性幹細胞クローンのことであって、腫瘍化を起こしにくいのであれば、ES細胞であってもよく、iPS細胞であってもよい。[2] Method for comparing the number of genes whose expression level is different from that of pluripotent stem cells Or, among the first and second iPS cell clones in the X gene group, the expression level is different from that of normal pluripotent stem cell clones If the number of different genes is measured and these numbers are different, this X-th gene group can be used as a gene group for selecting iPS cell clones that are less likely to cause tumorigenesis. A normal pluripotent stem cell clone is a pluripotent stem cell clone that has been found to be less likely to cause tumorigenesis when transplanted in vitro or in vivo. If present, it may be an ES cell or an iPS cell.
ここで、個数が異なるという判断は、腫瘍化を起こしやすいかどうか不明のiPS細胞クローンにおいて、同様に第X遺伝子群の遺伝子の発現レベルを調べ、正常な多能性幹細胞クローンと発現レベルが異なる遺伝子の個数が、第1のiPS細胞クローンと第2のiPS細胞クローンのどちらに適合するかが判断できれば、どのような基準で判断してもよい。ここで、正常な多能性幹細胞クローンと発現レベルが異なると判断するための基準は、[1]に記載の方法と同様の方法で行うことができる。そして、第1のiPS細胞クローンと第2のiPS細胞クローンとの間で、例えば、個数の分布範囲が重ならなかったり、個数の平均値が有意に異なったりするようであれば、この第X遺伝子群は、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンを選択するための遺伝子群として用いることができる。 Here, the judgment that the number is different is that the expression level of the gene of the X gene group is similarly examined in the iPS cell clones that are unclear whether or not they are likely to be tumorigenic, and the expression levels are different from those of normal pluripotent stem cell clones. As long as it can be determined whether the number of genes is compatible with the first iPS cell clone or the second iPS cell clone, any criteria may be used. Here, the standard for determining that the expression level is different from that of a normal pluripotent stem cell clone can be performed by the same method as described in [1]. Then, for example, if the distribution ranges of the numbers do not overlap or the average values of the numbers are significantly different between the first iPS cell clone and the second iPS cell clone, this Xth The gene group can be used as a gene group for selecting iPS cell clones that are unlikely to cause tumorigenesis.
[3]clustering分析の結果を比較する方法
この方法は、第X遺伝子群に属する遺伝子について、第1及び第2のiPS細胞クローンにおいて、正常な多能性細胞クローンと発現レベルを比較し、その比較結果を用いて、iPS細胞をclustering解析し、第1及び第2のiPS細胞クローンが、それぞれ別のclusterとして分類されれば、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンを選択するための遺伝子群として用いることができる。clusteringの方法は、(1)[3]で述べたのと同じ方法を用いることができる。[3] Method of comparing the results of clustering analysis This method compares the expression levels of the genes belonging to the X gene group with the normal pluripotent cell clones in the first and second iPS cell clones, Using the comparison results, clustering analysis of iPS cells is performed, and if the first and second iPS cell clones are classified as different clusters, they are used as genes for selecting iPS cell clones that are unlikely to cause tumorigenesis. Can be used. As the clustering method, the same method as described in (1) [3] can be used.
(1)用いた多能性幹細胞クローンの性状の評価
実施例においては、ヒトES細胞クローンとして、KhES1〜KhES3の3クローン(Suemori et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006 vol.345: p.926-32.)、ヒトiPS細胞クローンとして、201B6、201B7、253G1、253G4の各クローン(Takahashi et al..Cell. 2007 131:861-72; Nakagawa et al. Nat Biotechnol. 2008 vol.26: p.101-6.)を用いた。培養は、通常に使用される方法を用いた(Suemori et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006 vol.345: p.926-32.)。(1) Evaluation of properties of used pluripotent stem cell clones In the examples, as human ES cell clones, three clones of KhES1 to KhES3 (Suemori et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006 vol.345: p.926- 32.) As clones of human iPS cells, each clone of 201B6, 201B7, 253G1, 253G4 (Takahashi et al .. Cell. 2007 131: 861-72; Nakagawa et al. Nat Biotechnol. 2008 vol.26: p.101) -6.) Was used. The culture was carried out using a commonly used method (Suemori et al. Biochem Biophys Res Commun. 2006 vol.345: p.926-32.).
まず、これらのiPS細胞クローンを、公知の方法(国際公開WO2010/090007号公報)を用いて、in vitroでニューロスフェアに分化させたところ、201B6のみ、ニューロスフェアが形成されなかったが、201B7、253G1、253G4からは、正常にニューロスフェアが形成された。
ニューロスフェアが形成された3系統について、2回継代した後、3次ニューロスフェアを、公知の方法(国際公開WO2010/090007号公報)を用いて神経系細胞に分化誘導したところ、大部分が神経細胞に分化し、グリア細胞はほとんど分化しなかった。なお、対照として、KhES1細胞をin vitroで分化させたものを用いた。
マイクロアレイにより、遺伝子発現profileを検討すると、ヒトiPS細胞から誘導した神経幹細胞も、ヒトES細胞から誘導した神経幹細胞とほぼ同様のProfileを示した(後述の(6)比較例参照)。なお、ヒトiPS細胞分化後の3次ニューロスフェアでは、TRA−1−60、TRA−1−81、NCAMなどの未分化マーカーはほとんど検出されず、これらのヒトiPS細胞クローンには、分化抵抗性の細胞や未分化細胞の残存はほとんど無いことが確認された。
また、ニューロスフェアが形成された3クローンについては、電気生理学的に解析をしたが、ヒトES細胞と同様に活動電位が記録され、これらの3クローンは機能的なニューロンに分化できることが示された。First, when these iPS cell clones were differentiated into neurospheres in vitro using a known method (International Publication WO2010 / 090007), only 201B6 did not form neurospheres. Neurospheres were normally formed from 253G1 and 253G4.
After three passages of the three strains in which neurospheres were formed, the third neurosphere was induced to differentiate into neural cells using a known method (International Publication WO2010 / 090007). Differentiated into nerve cells, glial cells hardly differentiated. As a control, KhES1 cells differentiated in vitro were used.
When the gene expression profile was examined by microarray, the neural stem cells derived from human iPS cells showed almost the same profile as the neural stem cells derived from human ES cells (see (6) Comparative Example described later). In the third neurosphere after differentiation of human iPS cells, undifferentiated markers such as TRA-1-60, TRA-1-81, NCAM and the like are hardly detected, and these human iPS cell clones have differentiation resistance. It was confirmed that almost no cells or undifferentiated cells remained.
In addition, three clones with neurospheres were analyzed electrophysiologically, but action potentials were recorded in the same manner as human ES cells, indicating that these three clones can differentiate into functional neurons. .
(2)用いた多能性幹細胞の造腫瘍性の評価
ここでは、これらのヒトiPS細胞クローンを、3次ニューロスフェアに分化誘導し、細胞を分離して、NOS/SCIDマウスの脳に移植し、in vivoにおける分化能と造腫瘍性を解析した。(2) Evaluation of tumorigenicity of the pluripotent stem cells used Here, these human iPS cell clones were induced to differentiate into tertiary neurospheres, and the cells were isolated and transplanted into the brain of NOS / SCID mice. The in vivo differentiation ability and tumorigenicity were analyzed.
まず、公知の方法(Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086-98; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5)で、各iPS細胞からヒトEB(Embryoid body; 胚様体)を作製し、その後、1次ニューロスフェアに分化誘導した。なお、iPS細胞クローンの一つ201B6は、正常に分化しなかった。ここで、Venusを発現するレンチウイルス(Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086-98)を導入し、Venusを発現する神経幹細胞を製造した。さらに、2回継代して3次ニューロスフェアを作製し、単一の細胞に分離して、1−5x105個の細胞をNOD/SCIDマウスの線条体に注入した(Ogawa et al., J Neurosci Res. 2009 vol.87: p.307-17; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5)。細胞注入6ヶ月後、マウスから脳を摘出し、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、それぞれのマーカーに対する抗体を用いて、免疫組織化学的に、移植した細胞の分化状態を調べたところ、in vivoでは、3つの神経系細胞に分化していた。また、分化した神経細胞の種類も、TH陽性カテコラミン作動性ニューロン、ChAT陽性コリン作動性ニューロン、GAD67 陽性GABA作動性ニューロンが検出され、いずれのクローンも正常な分化能を有していた。First, each iPS by a known method (Okada et al., Stem Cells. 2008 vol. 26: p. 3086-98; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol. 27: p. 743-5). Human EB (Embryoid body) was prepared from the cells and then induced to differentiate into primary neurospheres. One iPS cell clone 201B6 did not differentiate normally. Here, a lentivirus expressing Venus (Okada et al., Stem Cells. 2008 vol.26: p.3086-98) was introduced to produce neural stem cells expressing Venus. In addition, the third neurosphere was generated by passage 2 times, separated into single cells, and 1-5 × 10 5 cells were injected into the striatum of NOD / SCID mice (Ogawa et al.,). J Neurosci Res. 2009 vol.87: p.307-17; Miura K. et al., Nat Biotechnol. 2009 vol.27: p.743-5). Six months after cell injection, the brain was removed from the mouse, and the differentiation state of the transplanted cell was examined immunohistochemically using antibodies against each of the markers of nerve cells, astrocytes, oligodendrocytes. In vivo, it was differentiated into three nervous system cells. As for the types of differentiated neurons, TH positive catecholaminergic neurons, ChAT positive cholinergic neurons, and GAD67 positive GABAergic neurons were detected, and all clones had normal differentiation ability.
同時に、マウス脳切片をHE染色したところ、253G1、253G4を移植したマウス脳では、低級グリオーマの像が観察され、核異型を有する細胞(図では鏃で示されている)も観察された(図13)。これに対し、201B7を移植したマウス脳では、対照のKhES1と同様、正常な脳組織が観察された(図13)。
特に、脳の組織切片上でvenusの発現している面積を調べたところ、253G1及び253G4では腫瘍化の兆候が見られ、特に253G4の移植組織では、移植細胞由来の巨大な腫瘤が観察された(図14)。なお、201B7では、対照のKhES1と同様、移植細胞に以上は見られなかった。At the same time, when mouse brain sections were stained with HE, images of lower glioma were observed in mice brain transplanted with 253G1 and 253G4, and cells having nuclear atypia (indicated by wrinkles in the figure) were also observed (Fig. 13). In contrast, in the mouse brain transplanted with 201B7, normal brain tissue was observed as in the control KhES1 (FIG. 13).
In particular, when the area where venus was expressed on the brain tissue section was examined, signs of tumor formation were observed in 253G1 and 253G4, and a huge tumor derived from transplanted cells was observed particularly in the transplanted tissue of 253G4. (FIG. 14). In 201B7, the above was not observed in the transplanted cells, similar to the control KhES1.
次に、未分化細胞の残存について、より高感度に解析するために、3次ニューロスフェアを単一の細胞に分離して、1−5x105個の細胞をNOD/SCIDマウスの精巣に注入し、3ヵ月後に精巣を摘出し、外見(A)、長軸方向の長さ(B)、iPS細胞作製時に導入した初期化遺伝子の発現(C)を観察した(図15)。201B7では、全ての点で、対照のKhES1と同様であったが、253G1では、細胞の増殖はほぼ正常だったが、対照のKhES1とは異なり、初期化遺伝子(POU5F1のみ)の発現が認められた。253G4では、細胞の増殖が著しく、初期化遺伝子(特にPOU5F1)の発現も著しく亢進していた。また、組織化学的な解析では、脳の組織切片と同様に、201B7を移植したマウス脳では、対照のKhES1と同様、正常組織であったが、253G1及び253G4を移植したマウス脳では低級グリオーマの像が観察され、特に253G4は悪性度が高かった。Next, in order to analyze the remaining undifferentiated cells with higher sensitivity, the tertiary neurospheres are separated into single cells, and 1-5 × 10 5 cells are injected into the testes of NOD / SCID mice. Three months later, the testis was removed, and the appearance (A), the length in the long axis direction (B), and the expression of the reprogramming gene introduced at the time of iPS cell production (C) were observed (FIG. 15). In 201B7, in all respects, it was similar to the control KhES1, but in 253G1, the cell proliferation was almost normal, but unlike the control KhES1, expression of the reprogramming gene (POU5F1 only) was observed. It was. In 253G4, cell proliferation was remarkable and expression of reprogramming genes (particularly POU5F1) was also significantly increased. Moreover, in the histochemical analysis, as in the brain tissue section, the mouse brain transplanted with 201B7 was a normal tissue like the control KhES1, but the mouse brain transplanted with 253G1 and 253G4 had lower glioma. Images were observed, especially 253G4, which was highly malignant.
以上から、201B7は、組織に移植した時、in vivoで腫瘍化を起こしにくいクローンであり、253G1及び253G4は、in vivoで腫瘍化を起こしやすいクローンであると考えられ、以下の実験では、特定の遺伝子群の発現パターンで、201B7がES細胞と同じパターンを取り、253G1及び253G4は、それらと異なるパターンを取ることを示す。 From the above, 201B7 is a clone that is less likely to cause tumor formation in vivo when transplanted into tissue, and 253G1 and 253G4 are considered to be clones that are likely to cause tumor formation in vivo. It shows that 201B7 takes the same pattern as ES cells and 253G1 and 253G4 take a different pattern from the expression pattern of the gene group.
(3)第1〜第10遺伝子群を用いたiPS細胞クローンの分類
ここでは、多能性幹細胞で分化細胞より発現の高い遺伝子群、DNA修復に関与する遺伝子群、及びそれらに共通する遺伝子群から、様々な遺伝子群を抽出し、それらについて、ES細胞及びiPS細胞における未分化状態での発現パターンを調べ、その発現パターンによって、腫瘍化を起こしにくいクローンと、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンが区別できることを示す。(3) Classification of iPS cell clones using the first to tenth gene groups Here, a gene group that is higher in the pluripotent stem cells than a differentiated cell, a gene group involved in DNA repair, and a gene group common to them From these, various gene groups are extracted and their expression patterns in ES cells and iPS cells are examined in an undifferentiated state. Depending on the expression pattern, clones that are unlikely to cause tumorigenesis are not differentiated or differentiated normally. Shows that clones that are prone to oncogenesis can be distinguished.
[1]遺伝子群の抽出
まず、マイクロアレイHuman U-133 Plus 2.0 Array (Affymetrix社)を用いて、多能性幹細胞で分化細胞より発現の高い遺伝子として、22種類のヒト組織(骨髄、小脳、大脳皮質、胎児脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管支、子宮)の発現レベルと、KhES1〜KhES3のES細胞クローンの発現レベルを比較し、
1.FDR(False Discovery Rate)のq値が0.05未満であること
2.ES3クローン全てがpフラグであること
3.ES3クローン全てで、ヒト組織の発現レベルの平均より5倍以上高いこと。
の3つの条件を満たすプローブ1340個(表1)(特定された遺伝子種929個;対応遺伝子が特定されていないプローブ102個を含む)を選択し、特定された遺伝子種929個を第1遺伝子群とした。ここで、特定された遺伝子とは、遺伝子名が判明し、単一に数えられた遺伝子のことを言う。[1] Extraction of gene group First, 22 types of human tissues (bone marrow, cerebellum, cerebrum) were expressed as genes that are expressed in pluripotent stem cells higher than differentiated cells using microarray Human U-133 Plus 2.0 Array (Affymetrix). Cortex, fetal brain, heart, kidney, liver, lung, pancreas, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thymus, thyroid, bronchi, uterus) and KhES1-KhES3 ES Compare expression levels of cell clones,
1. 1. q value of FDR (False Discovery Rate) is less than 0.05 2. All ES3 clones are p-flags All ES3 clones should be at least 5 times higher than the average human tissue expression level.
1340 probes (Table 1) satisfying the above three conditions (Table 1) (including 929 identified gene species; including 102 probes for which no corresponding gene is identified) are selected, and 929 identified gene species are selected as the first gene. Grouped. Here, the specified gene means a gene whose gene name is known and is counted as a single gene.
第1遺伝子群から、KhES1〜KhES3のES細胞クローンの発現レベルの平均と201B7の発現レベルが2倍以上であるプローブを除いた1304個のプローブ(表2)(特定された遺伝子種906個;対応遺伝子が特定されていないプローブ96個を含む)からなる遺伝子群を選択し、特定された遺伝子種906個を第2遺伝子群とした。 From the first gene group, 1304 probes (Table 2) excluding probes in which the average expression level of ES cell clones of KhES1 to KhES3 and the expression level of 201B7 are more than twice (Table 906 identified gene types; A gene group consisting of 96 probes whose corresponding genes are not specified) was selected, and 906 specified gene types were designated as the second gene group.
一方、DNA修復に関与する遺伝子群として、GO(Gene Ontology)のデータベースにおいて、DNA repairで登録されているhumanの遺伝子を抽出したところ、DNArepairに関するとされている遺伝子が313個得られた。また、文献中(Wood et al., Science 2001 vol.291 p.1284; Wood et al., 2005 Mutation research vol.577 p.275; Negrini Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 vol.113: p.220-8.)にDNArepairに関するとされている遺伝子163個を得て、重複なく332個抽出して第3遺伝子群を作製し、それらに対応するプローブ676個を選択した(表3)。そして、第2遺伝子群と第3遺伝子群で重複している83個のプローブ(表4)(特定された遺伝子種60個を含む)を選択し、特定された遺伝子種60個を第4遺伝子群とした。 On the other hand, as a group of genes involved in DNA repair, human genes registered in DNA repair were extracted from a database of GO (Gene Ontology), and 313 genes related to DNA repair were obtained. Also in the literature (Wood et al., Science 2001 vol.291 p.1284; Wood et al., 2005 Mutation research vol.577 p.275; Negrini Nat Rev Mol Cell Biol. 2010 vol.113: p.220- In 163, 163 genes related to DNArepair were obtained, 332 were extracted without duplication, a third gene group was prepared, and 676 probes corresponding to them were selected (Table 3). Then, 83 probes (Table 4) (including 60 identified gene species) overlapping in the second gene group and the third gene group are selected, and the 60 identified gene species are selected as the fourth gene. Grouped.
さらに、第1遺伝子群の遺伝子から、201B6、253G1、253G4すべての発現レベルが、ES3クローンの発現レベルの平均より1.5倍以上であり、201B7の発現レベルとESの平均との差が1.5倍以内である80個のプローブ(表5)(特定された遺伝子種70個;対応遺伝子が特定されていないプローブ3個を含む)を選択し、特定された遺伝子種70個を第5遺伝子群とし;第1遺伝子群の遺伝子から、201B6、253G1、253G4すべての発現レベルがES3クローンの発現レベルの平均より1.5倍以上であり、さらに、ES3クローンと201B7のすべてで、ES3クローンの発現レベルの平均との差が1.5倍以内である72個のプローブ(表6)(特定された遺伝子種63個;対応遺伝子が特定されていないプローブ2個を含む)を選択し、特定された遺伝子種63個を第6遺伝子群とし;第3遺伝子群の遺伝子から、201B6、253G1、253G4のすべての発現レベルが、ES3クローンの発現レベルの平均より1.5倍以上である59個のプローブ(表7)(特定された遺伝子種54個を含む)を選択し、特定された遺伝子種54個を第7遺伝子群とし;第7遺伝子群の遺伝子から、ES3クローンと201B7のすべてで、ES3クローンの発現レベルの平均との差が1.5倍以内である18個のプローブ(表8)(特定された遺伝子種17個を含む)を選択し、特定された遺伝子種17個を第8遺伝子群とし;第4遺伝子群の遺伝子から、201B6、253G1、253G4のいずれかの発現レベルが、ES3クローンの発現レベルの平均より1.5倍以上であり、201B7の発現レベルとESの平均との差が1.5倍以内である13個のプローブ(表9)(特定された遺伝子種13個を含む)を選択し、対応する遺伝子を第9遺伝子群とし;第4遺伝子群の遺伝子から、201B6、253G1、253G4のすべての発現レベルが、ES3クローンの発現レベルの平均より1.5倍以上であり、201B7の発現レベルとESの平均との差が1.5倍以内である5個のプローブ(表10)(特定された遺伝子種5個を含む)を選択し、対応する遺伝子を第10遺伝子群とした。 Furthermore, from the genes of the first gene group, the expression levels of all 201B6, 253G1, and 253G4 are 1.5 times or more higher than the average expression level of the ES3 clone, and the difference between the expression level of 201B7 and the average ES is 1 80 probes that are within 5 times (Table 5) (70 identified gene species; including 3 probes for which the corresponding gene is not identified) are selected, and 70 identified gene species are selected as the fifth From the genes of the first gene group, the expression level of all of 201B6, 253G1, and 253G4 is 1.5 times or more of the average expression level of ES3 clone, and further, all of ES3 clone and 201B7 72 probes (Table 6) with a difference from the average of the expression level of 1.5 or less (Table 6) (63 identified gene species; (Including 2 probes not selected) and 63 identified gene species as the sixth gene group; from the genes of the third gene group, all the expression levels of 201B6, 253G1, 253G4 are 59 probes (Table 7) (including 54 identified gene species) that are 1.5 times or more than the average of the expression level are selected, and 54 identified gene species are defined as a seventh gene group; From the genes of 7 genes group, 18 probes (Table 8) whose difference between the ES3 clone and 201B7 is 1.5 times less than the average expression level of ES3 clone (Table 8) 17) and the 17 identified gene types are designated as the 8th gene group; the expression level of any of 201B6, 253G1, and 253G4 from the genes of the 4th gene group is 13 probes (Table 9) (identified gene species 13) that are at least 1.5 times the average expression level of the gene and the difference between the expression level of 201B7 and the average of ES is within 1.5 times And the corresponding gene is the 9th gene group; from the gene of the 4th gene group, all the expression levels of 201B6, 253G1, 253G4 are 1.5 times the average of the expression level of the ES3 clone 5 probes (Table 10) (including 5 identified gene species) in which the difference between the expression level of 201B7 and the mean of ES is 1.5 times or less are selected, and the corresponding genes are selected. It was set as the 10th gene group.
<マイクロアレイを用いた解析方法>
マイクロアレイとして、Affymetrix社 U133plus2.0を用いた。
正常ヒト組織(骨髄、小脳、大脳皮質、胎児脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管支、子宮)のRNAは、Clontech, Ambion, Cell Applications, Stratagene社から購入した。他の細胞などに関しては、Trizol(InVitrogen社)にて全RNAを回収し、RNAeasy mini kit(Quiagen社)を用いてカラム精製を行った。また、キアゲン社のRNAase-free DNaseにより処理し、混入するDNAを分解した。RNAの品質は、Bioanalyzer 2100 (Agilent社)を用いて確認した。<Analysis method using microarray>
Affymetrix U133plus2.0 was used as a microarray.
Normal human tissues (bone marrow, cerebellum, cerebral cortex, fetal brain, heart, kidney, liver, lung, pancreas, prostate, salivary gland, skeletal muscle, small intestine, spinal cord, spleen, stomach, testis, thymus, thyroid, bronchi, uterus) RNA was purchased from Clontech, Ambion, Cell Applications, Stratagene. For other cells, total RNA was collected with Trizol (InVitrogen), and column purification was performed using RNAeasy mini kit (Quiagen). Further, the DNA was treated with Qiagen RNAase-free DNase to decompose contaminating DNA. The quality of RNA was confirmed using Bioanalyzer 2100 (Agilent).
[2]発現に異常のある遺伝子の個数を比較する方法
ここでは、第1遺伝子群の遺伝子を含むプローブにおいて、各iPS細胞の発現レベルが、ES3クローンの発現レベルの平均に比べて、0.667倍以下あるいは1.5倍以上という異常な発現レベルを示すプローブの個数を調べ、その結果を図1にグラフ化した。[2] Method of comparing the number of genes having abnormal expression In this case, in the probe containing the genes of the first gene group, the expression level of each iPS cell was 0. 0 compared to the average expression level of the ES3 clone. The number of probes showing an abnormal expression level of 667 times or less or 1.5 times or more was examined, and the results are graphed in FIG.
腫瘍化を起こしにくいiPS細胞(201B7)と、正常に分化しないか(201B6)、分化しても腫瘍化を起こしやすい(253G1、253G4)iPS細胞とでは、発現に異常のあるプローブの個数に有意な差があった。 Significant in the number of probes that are abnormally expressed in iPS cells (201B7) that are unlikely to be tumorigenic and iPS cells that do not differentiate normally (201B6) or that are susceptible to tumorigenesis even after differentiation (253G1, 253G4) There was a big difference.
従って、第1遺伝子群の遺伝子の発現を調べ、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞に対して発現に異常のある遺伝子の個数を調べることにより、腫瘍化を起こしにくいかどうかを判断できる。 Therefore, by examining the expression of the genes of the first gene group and examining the number of genes that are abnormally expressed in pluripotent stem cells that are unlikely to be tumorigenic, it can be determined whether or not tumorigenicity is likely to occur.
[3]clustering分析によって分類する方法
ここでは、第2〜第10遺伝子群の遺伝子を含むプローブについて、ES3クローンの発現レベルの平均に対する、各iPS細胞の発現レベルの割合を計算し、Log2(ratio)で表した(表2〜表10)。これらのデータに対し、Cluster 3.0を用いて、clustering解析を行い、得られた結果をJava Treeview(東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターDNA情報解析分野によるフリーウェア;M. J. L. de Hoon, S. Imoto, J. Nolan, and S. Miyano: Open Source Clustering Software. Bioinformatics, 20 (9): 1453--1454 (2004).;http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/)を用いて、treeを作製した(図2〜図10)。[3] Method of classifying by clustering analysis Here, the ratio of the expression level of each iPS cell to the average expression level of the ES3 clone is calculated for the probe containing the genes of the second to tenth gene groups, and Log2 (ratio ) (Table 2 to Table 10). Clustering analysis is performed on these data using Cluster 3.0, and the obtained results are displayed as a Java Treeview (Freeware by DNA Information Analysis Field, Human Genome Analysis Center, University of Tokyo; MJL de Hoon, S. Imoto, J. Nolan, and S. Miyano: Open Source Clustering Software. Bioinformatics, 20 (9): 1453--1454 (2004) .; http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/) Thus, a tree was produced (FIGS. 2 to 10).
図2〜図10のtreeに示されているように、調べたiPS細胞のうち、201B7だけがヒトES細胞と同じグループに分類されており、201B6、253G1、253G4は、それとは別に一つのグループに分類されている。 As shown in the trees of FIGS. 2 to 10, among the examined iPS cells, only 201B7 is classified into the same group as human ES cells, and 201B6, 253G1, and 253G4 are one group separately. It is classified.
このように、多能性幹細胞で分化細胞より発現の高い遺伝子、及びDNA修復に関与する遺伝子から選択された遺伝子からなる遺伝子群について、腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞における発現レベルと比較することにより、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞と、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞に分類ができる。従って、この方法を使えば、腫瘍化を起こしにくいかどうかわからないiPS細胞についても、どちらのグループに属するかを明らかにでき、そのiPS細胞が腫瘍化を起こしにくいかどうかを判断できる。 In this way, the gene group consisting of genes that are higher in the pluripotent stem cells than the differentiated cells and genes selected from genes involved in DNA repair are compared with the expression levels in the pluripotent stem cells that are unlikely to cause tumorigenesis. Thus, it is possible to classify into iPS cells that do not differentiate normally or are easily differentiated even if differentiated, and iPS cells that are unlikely to become tumorous. Therefore, by using this method, it is possible to clarify which group an iPS cell that is not likely to cause tumorigenesis belongs, and to determine whether the iPS cell is less likely to cause tumorigenesis.
[4]発現レベル自体を比較する方法
例えば、本実施例では、表10に記載のsuppressor of Ty 16 homolog (S. cerevisiae)の発現レベルは、ES3クローンと、正常に分化しないか(201B6)、分化しても腫瘍化を起こしやすい(253G1、253G4)とでは、有意に差がある。そして、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞(201B7)の発現レベルは、ES3クローンと差がなく、腫瘍化を起こしやすいiPS細胞とは顕著な差がある。[4] Method of comparing expression level itself For example, in this example, the expression level of suppressor of Ty 16 homolog (S. cerevisiae) described in Table 10 does not differentiate normally from ES3 clone (201B6), There is a significant difference from (253G1, 253G4), which tends to cause oncogenesis even after differentiation. The expression level of iPS cells (201B7) that are less likely to cause tumorigenesis is not different from that of the ES3 clone, and is significantly different from iPS cells that are likely to be tumorigenic.
このように、発現レベル自体を比較することによっても、iPS細胞が腫瘍化を起こしにくいかどうかを判断できる。 Thus, it can be determined whether iPS cells are unlikely to undergo tumorigenesis by comparing the expression levels themselves.
(4)第11〜第12遺伝子群を用いたiPS細胞クローンの分類
ここでは、第1遺伝子群及び第3遺伝子群に属する各遺伝子を含むプローブに対し、表2及び表3に示された発現レベルを表す数値に基づき、ES3クローンと201B7のグループ及び201B6、253G1、253G4のグループの間でSAMの検定を行い、各遺伝子群でp<0.1またはp<0.05で有意差のあったプローブを、それぞれ27個(表11)(特定された遺伝子26個を含む)と19個(表12)(特定された遺伝子17個を含む)抽出し、特定された遺伝子種26個と17個を第11遺伝子群及び第12遺伝子群とした。(3)[3]と同様に、clustering解析をしたところ、図11及び図12のtreeに示されているように、調べたiPS細胞のうち、201B7だけがヒトES細胞と同じグループに分類されており、201B6、253G1、253G4は、それとは別に一つのグループに分類されていた。(4) Classification of iPS cell clones using the 11th to 12th gene groups Here, the expression shown in Table 2 and Table 3 for the probe containing each gene belonging to the 1st gene group and the 3rd gene group Based on the numerical value representing the level, the SAM test was performed between the ES3 clone and the 201B7 group and the 201B6, 253G1, 253G4 group, and probes having a significant difference at each gene group at p <0.1 or p <0.05. 27 (Table 11) (including 26 identified genes) and 19 (Table 12) (including 17 identified genes) were extracted, respectively, and 26 and 17 identified gene species were extracted from the 11th. The gene group and the 12th gene group were used. (3) Similar to [3], when clustering analysis was performed, as shown in the trees of FIG. 11 and FIG. 12, only 201B7 was classified into the same group as human ES cells among the examined iPS cells. 201B6, 253G1, and 253G4 were classified into one group separately.
このように、統計学的有意性を有する発現レベルの差を用いることによっても、iPS細胞を、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞と、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞に分類ができる。 Thus, iPS cells that do not differentiate normally or are easily differentiated by iPS cells and iPS cells that are less likely to be tumoriZed by differentiation of expression levels having statistical significance are also obtained. Can be classified into cells.
(5)ゲノムDNAにおける変異
本発明は、未分化状態のiPS細胞における、DNA修復に関与する遺伝子の発現の異常が、分化後のiPS細胞の造腫瘍性に影響があるという発見に基づくものである。以下、そのメカニズムとして、未分化状態におけるDNA修復に関与する遺伝子の異状によって、DNAに多数の傷が生じ、それが原因となって、iPS細胞が正常に分化できないか、あるいはiPS細胞が分化したときに腫瘍化するということを示す。(5) Mutation in genomic DNA The present invention is based on the discovery that abnormal expression of genes involved in DNA repair in undifferentiated iPS cells affects the tumorigenicity of differentiated iPS cells. is there. Hereinafter, as a mechanism thereof, abnormalities in genes involved in DNA repair in an undifferentiated state cause numerous wounds in DNA, which may cause iPS cells to not differentiate normally or iPS cells to differentiate. Sometimes indicates that it becomes tumorous.
まず、未分化状態のiPS細胞(201B6、253G1、253G4、201B7)と、各細胞を分化させた3次ニューロスフェア、iPS細胞作製のもととなる線維芽細胞(HDF)、コントロールとして、ヒト胎児由来神経幹細胞(hNSC)および患者グリオーマ細胞由来細胞(GDC)から、ゲノムDNAを単離し、アレイCGH解析を行なった。 First, undifferentiated iPS cells (201B6, 253G1, 253G4, 201B7), tertiary neurospheres obtained by differentiating each cell, fibroblasts (HDF) from which iPS cells are produced, and human fetus as a control Genomic DNA was isolated from derived neural stem cells (hNSC) and patient glioma cell-derived cells (GDC) and subjected to array CGH analysis.
ゲノムDNAは、各クローンから、そして対照として正常ヒト男性ゲノム(Promega社)から、フェノールクロロホルム法、あるいは、DNeasy Blood & Tissue KitやQIAamp DNA mini Kit (Qiagen社)を用いて抽出し、PicoGreenを用いて定量した。各サンプルとして、500ngから1000ngの二本鎖DNAを用い、制限酵素(AluIとRsaI)による消化を行い、DNAを断片化した。その後、Genomic DNA Enzymatic Labeling キット(Agilent社)を用いて、DNA断片をCy3またはCy5でラベルし、片方をコントロール、もう片方をサンプルとした。精製後、Sureprint G3 human CGHマイクロアレイ4x180K(Agilent社)を用い、添付プロトコールに従い、ハイブリダイゼーション、Agilent スキャナーを用いたスキャニング、Feature extractionソフトウェアによるシグナルの数値化を行った。得られたデータは、Agilent Genomic Workbenchを用いて、Aberrationの検出を行った。検出されたAberrationのうち、対照のHDF(ヒト皮膚線維芽細胞)で見られるAberrationは、単なるCNV(copy number variation)の可能性が高いため、解析から除外して、各クローン間のaberrated geneとしての遺伝子数を比較した。 Genomic DNA is extracted from each clone and from normal human male genome (Promega) as a control using the phenol chloroform method, DNeasy Blood & Tissue Kit or QIAamp DNA mini Kit (Qiagen), and using PicoGreen And quantified. As each sample, 500 ng to 1000 ng of double-stranded DNA was digested with restriction enzymes (AluI and RsaI) to fragment the DNA. Thereafter, using a Genomic DNA Enzymatic Labeling kit (Agilent), the DNA fragment was labeled with Cy3 or Cy5, one was used as a control, and the other was used as a sample. After purification, using Sureprint G3 human CGH microarray 4x180K (Agilent), following the attached protocol, hybridization, scanning using an Agilent scanner, and signal quantification using Feature extraction software were performed. The obtained data was detected for Aberration using Agilent Genomic Workbench. Among the detected Aberrations, the Aberration found in the control HDF (human skin fibroblasts) is highly likely to be a mere CNV (copy number variation), so it is excluded from the analysis and used as an aberrated gene between each clone. The number of genes was compared.
図16に示されるように、ES細胞や腫瘍化を起こしにくいiPS細胞(201B7)では、分化しても、ゲノム異常は全体として変化がなく、一方、正常に分化しないか(201B6)、分化しても腫瘍化を起こしやすい(253G1、253G4)では、分化と共に、ゲノム異常が増加しており、その異状のレベルは、患者グリオーマに由来する培養細胞(GDC21、GDC36、GDC40)ほどではないものの、ES細胞や201B7と比べて、はるかに高かった。 As shown in FIG. 16, in ES cells and iPS cells (201B7) that are unlikely to undergo tumorigenesis, even if differentiated, the genome abnormality does not change as a whole, while it does not differentiate normally (201B6). However, in the case of being prone to oncogenesis (253G1, 253G4), genomic abnormalities increase with differentiation, and the level of abnormality is not as high as that of cultured cells derived from patient glioma (GDC21, GDC36, GDC40). It was much higher than ES cells and 201B7.
このように、未分化状態のiPS細胞において、DNA修復に関与する遺伝子の発現に異常があると、分化過程で生じるDNA変異が修復できず、そのために正常に分化できないか、あるいは分化させても細胞が腫瘍化するものと考えられる。 Thus, in an undifferentiated iPS cell, if there is an abnormality in the expression of a gene involved in DNA repair, a DNA mutation that occurs during the differentiation process cannot be repaired, and therefore it cannot be differentiated normally, or even if it is differentiated. It is thought that the cells become tumorous.
(6)比較例
本比較例では、いずれかのクローン中で発現が検出されたプローブ全てを対象とし、Rというclustering解析用ソフトウェアを用い(http://www.r-project.org/)、Ward's hierarchial clustering methodとEluclidian distanceによって、clustering解析を、行なった。その結果を図17に示すが、本発明のように適切な遺伝子群を選択しなければ、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞と、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞は、clusterによって区別することができなかった。(6) Comparative Example In this comparative example, all probes in which expression was detected in any clone were targeted, and the clustering analysis software called R was used (http://www.r-project.org/), Clustering analysis was performed by Ward's hierarchial clustering method and Eluclidian distance. The results are shown in FIG. 17, and iPS cells that are unlikely to undergo tumorigenesis unless they select an appropriate gene group as in the present invention, and iPS cells that do not differentiate normally or are susceptible to tumorigenesis even if differentiated. Could not be distinguished by cluster.
(7)エピソーマルベクターを用いて作製したヒトiPS細胞の解析
エピソーマルベクターを用いて作製したヒトiPS細胞株409B2及び414C2(Okita et al., Nat Methods 2011)について、比較する対照の細胞株として、KhES1、KhES2、KhES3、201B7、409B2、414C2、201B6、253G4、253G1の各クローンを用い、第4遺伝子群及び第12遺伝子群について、マイクロアレイを用いて(3)と同様の方法で、発現の解析及びclustering分析を行った。その結果、図18及び図19のtreeに示されるように、どちらの場合も、409B2及び414C2は、ES細胞及び201B7と同じ枝に分類された。
また、第12遺伝子群の19プローブについて、3つのES細胞における発現の平均値から、シグナル強度に1.5倍以上の差があるプローブの個数を測定したところ、図20に示すように、その個数が、409B2、414C2、201B7では6個以内、201B6、253G4、253G1では、10個以上となり、2つのグループで有意に(t検定でp=0.017)差が見られた。
次に、409B2及び414C2について、(2)と同様の方法で、造腫瘍性の評価を行なったところ、図21に示すように、409B2及び414C2は、ES細胞及び201B7と同様に、精巣移植後の腫大は観察されなかった。また、409B2及び414C2を移植した精巣のパラフィン切片を作製し、HE染色を行なって、移植細胞由来のテラトーマの組織像を観察したところ、図22及び図23に示すように、253G4、253G1より腫瘍化傾向が低く、十分に分化した神経細胞及びグリア細胞が観察された。
このように、本発明の遺伝子群は、iPS細胞を、正常に分化しないか、分化しても腫瘍化を起こしやすいクローンと、腫瘍化を起こしにくいクローンに分類するのに有用である。(7) Analysis of human iPS cells prepared using episomal vectors Human iPS cell lines 409B2 and 414C2 (Okita et al., Nat Methods 2011) prepared using episomal vectors were used as control cell lines for comparison. , KhES1, KhES2, KhES3, 201B7, 409B2, 414C2, 201B6, 253G4, 253G1 clones, and the fourth gene group and the twelfth gene group using the microarray in the same manner as in (3). Analysis and clustering analysis were performed. As a result, as shown in the trees of FIGS. 18 and 19, in both cases, 409B2 and 414C2 were classified into the same branches as ES cells and 201B7.
Further, for the 19 probes in the 12th gene group, the number of probes having a difference of 1.5 times or more in signal intensity was measured from the average value of expression in three ES cells. As shown in FIG. The number was within 6 for 409B2, 414C2, and 201B7, and 10 or more for 201B6, 253G4, and 253G1, and there was a significant difference between the two groups (p = 0.017 by t test).
Next, 409B2 and 414C2 were evaluated for tumorigenicity by the same method as in (2). As shown in FIG. 21, 409B2 and 414C2 were tested after testis transplantation, similar to ES cells and 201B7. No swelling was observed. In addition, paraffin sections of testis transplanted with 409B2 and 414C2 were prepared, and stained with HE, and histological images of teratomas derived from transplanted cells were observed. As shown in FIGS. 22 and 23, tumors were observed from 253G4 and 253G1. A well-differentiated nerve cell and glial cell were observed.
As described above, the gene group of the present invention is useful for classifying iPS cells into clones that do not differentiate normally, or that tend to undergo tumorigenesis even when differentiated, and clones that do not tend to undergo tumorigenesis.
[表1A]第1遺伝子群(表1B)を含むプローブ1340個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 1A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 1340 probes including the first gene group (Table 1B)
[表1B]第1遺伝子群
[Table 1B] First gene group
[表2A]第2遺伝子群(表2B)を含むプローブ1304個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 2A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 1304 probes including the second gene group (Table 2B)
[表2B]第2遺伝子群
[Table 2B] Second gene group
[表3A]第3遺伝子群(表3B)を含むプローブ676個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 3A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 676 probes including the third gene group (Table 3B)
[表3B]第3遺伝子群
[Table 3B] Third gene group
[表4A]第4遺伝子群(表4B)を含むプローブ83個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 4A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clones (KhES1-S3) in 83 probes including the fourth gene group (Table 4B)
[表4B]第4遺伝子群
[Table 4B] Fourth gene group
[表5A]第5遺伝子群を含むプローブ80個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 5A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clones (KhES1-S3) in 80 probes containing the fifth gene group
[表5B]第5遺伝子群
[Table 5B] Fifth gene group
[表6A]第6遺伝子群(表6B)を含むプローブ72個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 6A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clones (KhES1-S3) in 72 probes including the sixth gene group (Table 6B)
[表6B]第6遺伝子群
[Table 6B] Sixth gene group
[表7A]第7遺伝子群(表7B)を含むプローブ59個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 7A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 59 probes including the seventh gene group (Table 7B)
[表7B]第7遺伝子群
[Table 7B] Seventh gene group
[表8A]第8遺伝子群(表8B)を含むプローブ18個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 8A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 18 probes including the eighth gene group (Table 8B)
[表8B]第8遺伝子群
[Table 8B] Eighth gene group
[表9A]第9遺伝子群(表9B)を含むプローブ13個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 9A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 13 probes including the ninth gene group (Table 9B)
[表9B]第9遺伝子群
[Table 9B] Ninth gene group
[表10A]第10遺伝子群(表10B)を含むプローブ5個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 10A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clones (KhES1-S3) in 5 probes including the 10th gene group (Table 10B)
[表10B]第10遺伝子群
[Table 10B] Tenth gene group
[表11A]第11遺伝子群(表11B)を含むプローブ27個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 11A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 27 probes including the eleventh gene group (Table 11B)
[表11B]第11遺伝子群
[Table 11B] Eleventh gene group
[表12A]第12遺伝子群(表12B)を含むプローブ19個において、ヒトES細胞クローン(KhES1-S3)の発現レベルの平均に対する、各ES細胞クローン及び各iPS細胞クローンの発現レベルの割合
[Table 12A] Ratio of the expression level of each ES cell clone and each iPS cell clone to the average expression level of human ES cell clone (KhES1-S3) in 19 probes including the 12th gene group (Table 12B)
[表12B]第12遺伝子群
[Table 12B] 12th gene group
本発明によって、分化させても腫瘍化が起きにくいiPS細胞クローンの選択方法、及びその選択方法に用いる遺伝子の選択方法が提供できるようになった。 According to the present invention, it is possible to provide a method for selecting an iPS cell clone that is unlikely to undergo tumorigenesis even when differentiated, and a method for selecting a gene used in the selection method.
Claims (14)
未分化状態のiPS細胞クローンにおいて、第1〜第12遺伝子群のいずれかの遺伝子群において、少なくとも一つの遺伝子について、発現レベルを調べる工程、
を含む方法。A method for selecting iPS cell clones, comprising:
In an undifferentiated iPS cell clone, in the gene group of any of the first to twelfth gene groups, a step of examining the expression level of at least one gene;
Including methods.
前記発現レベルを、正常に分化できないか、あるいは分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現レベル、及び、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおける当該遺伝子の発現レベルと比較する工程、
をさらに含む方法。The selection method according to claim 1, comprising:
The expression level is compared with the expression level of the gene in iPS cell clones that are not normally differentiated or are susceptible to tumorigenesis even when differentiated, and the expression level of the gene in iPS cell clones that are less likely to be tumorigenic Process,
A method further comprising:
前記iPS細胞クローンにおいて、第1〜第12遺伝子群のいずれかの遺伝子群に属する全ての遺伝子の発現レベルを調べる工程と,
調べた遺伝子群において、発現レベルに異常のある遺伝子の個数を調べる工程と、
調べた遺伝子の個数を、正常に分化できないか、あるいは分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける発現レベルに異常のある遺伝子の個数、及び、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンにおける発現レベルに異常のある遺伝子の個数と比較する工程、
をさらに含む方法。The selection method according to claim 1, comprising:
In the iPS cell clone, examining the expression levels of all genes belonging to any one of the first to twelfth gene groups;
In the examined gene group, a step of examining the number of genes having abnormal expression levels;
The number of genes examined is the number of genes that are abnormal in expression level in iPS cell clones that are not normally differentiated or that are susceptible to oncogenesis even if differentiated, and the expression level in iPS cell clones that are less likely to be tumorigenic Comparing with the number of abnormal genes in
A method further comprising:
腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞クローンの発現レベルと比較することによって、前記発現レベルが異常かどうか判断することを特徴とする、方法。The selection method according to claim 3, wherein
A method comprising determining whether or not the expression level is abnormal by comparing with an expression level of a pluripotent stem cell clone that is unlikely to cause oncogenesis.
前記iPS細胞クローンにおいて、第1〜第12遺伝子群のいずれかの遺伝子群に属する全ての遺伝子の発現レベルを調べる工程と,
調べた遺伝子群について、前記iPS細胞クローンにおける発現レベルと、正常に分化できないか、あるいは分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける発現レベルと、腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンにおける発現レベルとを指標にして、iPS細胞クローンのclustering分析を行う工程と、
当該iPS細胞クローンが、正常に分化できないか、あるいは分化しても腫瘍化を起こしやすいiPS細胞クローンと、腫瘍化を起こしにくいiPS細胞クローンのいずれに分類されるかを調べる工程と、
を含む方法。The selection method according to claim 1, comprising:
In the iPS cell clone, examining the expression levels of all genes belonging to any one of the first to twelfth gene groups;
About the examined gene group, the expression level in the iPS cell clone, the expression level in the iPS cell clone that is not normally differentiated or is easily differentiated even if differentiated, and the expression level in the iPS cell clone that is likely to be tumoriZed And a clustering analysis of iPS cell clones using
Investigating whether the iPS cell clone is classified into an iPS cell clone that is not normally differentiated or is susceptible to oncogenesis even if differentiated, and an iPS cell clone that is less likely to be tumorigenic;
Including methods.
腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞クローンの発現レベルとの相対値を指標にして、前記iPS細胞クローンのclustering解析を行うことを特徴とする、請求項7に記載の方法。The selection method according to claim 5, comprising:
The method according to claim 7, wherein clustering analysis of the iPS cell clone is performed using a relative value with an expression level of a pluripotent stem cell clone that is unlikely to be tumorigenic as an index.
正常に分化できないか、あるいは分化しても腫瘍化を起こしやすい複数の第1のiPS細胞クローンと、腫瘍化を起こしにくい複数の第2のiPS細胞クローンにおいて、未分化状態の各iPS細胞クローンで、1以上の遺伝子を含む候補遺伝子群に属する遺伝子の発現レベルを調べる工程、
を含む方法。A method for selecting a gene to examine an expression level in order to select an iPS cell clone,
In each of a plurality of first iPS cell clones that are not normally differentiated or that are likely to be tumoriated even if differentiated and a plurality of second iPS cell clones that are less likely to be tumorigenic, each iPS cell clone in an undifferentiated state Examining the expression level of a gene belonging to a candidate gene group comprising one or more genes,
Including methods.
複数の第1のiPS細胞クローンにおいて得られた第1の発現レベルと、複数の第2のiPS細胞クローンにおいて得られた第2の発現レベルとを比較する工程と、
第1の発現レベルと第2の発現レベルとが異なるかどうか調べる工程と、
を含む方法。The selection method according to claim 7, comprising:
Comparing a first expression level obtained in a plurality of first iPS cell clones with a second expression level obtained in a plurality of second iPS cell clones;
Examining whether the first expression level and the second expression level are different;
Including methods.
複数の第1のiPS細胞クローンにおいて得られた発現レベルにおいて、発現レベルに異常のある遺伝子の第1の個数と、複数の第2のiPS細胞クローンにおいて得られた発現レベルのうち、発現レベルに異常のある遺伝子の第2の個数とを比較する工程と、
第1の個数と第2の個数とが異なるかどうか調べる工程と、
を含む方法。The selection method according to claim 7, comprising:
Among the expression levels obtained in the plurality of first iPS cell clones, the expression level of the first number of genes having abnormal expression levels and the expression levels obtained in the plurality of second iPS cell clones Comparing the second number of abnormal genes;
Examining whether the first number and the second number are different;
Including methods.
腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞クローンの発現レベルと比較することによって、前記発現レベルが異常かどうか判断することを特徴とする、方法。The selection method according to claim 11, comprising:
A method comprising determining whether or not the expression level is abnormal by comparing with an expression level of a pluripotent stem cell clone that is unlikely to cause oncogenesis.
前記iPS細胞クローンについて、前記発現レベルを指標にしてclustering分析を行う工程と、
複数の第1のiPS細胞クローンと複数の第2のiPS細胞クローンが、それぞれ別のclusterに分類されるかどうか調べる工程と、
を含む方法。The selection method according to claim 7, comprising:
For the iPS cell clone, performing a clustering analysis using the expression level as an index,
Examining whether a plurality of first iPS cell clones and a plurality of second iPS cell clones are classified into different clusters;
Including methods.
腫瘍化を起こしにくい多能性幹細胞クローンの発現レベルとの相対値を指標にして、前記iPS細胞クローンについてclustering分析を行うことを特徴とする、方法。The selection method according to claim 13, comprising:
A method comprising performing clustering analysis on the iPS cell clone using the relative value of the expression level of a pluripotent stem cell clone that is unlikely to be tumorigenic as an index.
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