JPWO2012111810A1 - Chitinolytic enzyme gene and chitinolytic enzyme encoded by the gene - Google Patents
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Abstract
キチン分解酵素活性タンパク質発現遺伝子および該遺伝子によりコードされるキチン分解酵素活性タンパク質、並びに該キチン分解酵素活性タンパク質を用いるキチンの分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法を提供する。配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡと９０％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列からなり、キチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とするＤＮＡ、配列番号２に示されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含み、キチン分解酵素活性を有することを特徴とするタンパク質および、該タンパク質を用いるキチンの分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に関する。A chitinase-activating protein expression gene, a chitinase-activating protein encoded by the gene, a method for decomposing chitin using the chitinase-activating protein, and a method for producing N-acetylglucosamine are provided. A protein comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a base sequence represented by base numbers 1-1464 or a base sequence having 90% or more base sequence homology with the DNA, and having a chitinolytic enzyme activity DNA encoding the amino acid, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or any one of the amino acid sequences in which one to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence And a protein characterized by having a chitinolytic enzyme activity, a method for decomposing chitin using the protein, and a method for producing N-acetylglucosamine.
Description
本発明は新規なキチン分解酵素遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素に関するものである。より詳細には、エンド型キチナーゼのようにキチンをランダムに加水分解する活性を有し、しかも、これまで知られているエンド型キチナーゼでは２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースで停止していた分解反応を、単量体のＮ−アセチルグルコサミンまで分解することができる活性を有するキチン分解酵素遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素に関するものである。 The present invention relates to a novel chitinolytic enzyme gene and a chitinolytic enzyme encoded by the gene. More specifically, it has the activity of hydrolyzing chitin randomly like endo-type chitinase, and in addition, the known endo-type chitinase has been stopped by dimer diacetyl-N-chitobiose. The present invention relates to a chitinolytic enzyme gene having an activity capable of degrading the reaction to monomeric N-acetylglucosamine and a chitinolytic enzyme encoded by the gene.
また本発明は、該キチン分解酵素を用いるキチンの分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に関するものである。 The present invention also relates to a method for decomposing chitin using the chitinolytic enzyme and a method for producing N-acetylglucosamine.
キチンはカニ、エビなどの甲殻類の殻などに含まれる多糖であり、自然界においてセルロースに次ぐ豊富なバイオマスである。
このキチンは多糖の状態で、医薬品、農薬、食品、化粧品などの素材として、様々な産業で利用されている。さらに、キチンを加水分解して得られるＮ−アセチルグルコサミンおよびそのオリゴ糖も、免疫賦活作用、エリシター作用など種々の生理活性を示し、同様に、医薬品、食品、化粧品などの有効成分として利用されている。Chitin is a polysaccharide contained in crustacean shells such as crabs and shrimps, and is the most abundant biomass in the natural world after cellulose.
This chitin is in a polysaccharide state and is used in various industries as a material for pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods, cosmetics and the like. Furthermore, N-acetylglucosamine obtained by hydrolyzing chitin and its oligosaccharide also exhibit various physiological activities such as immunostimulatory action and elicitor action, and are also used as active ingredients for pharmaceuticals, foods, cosmetics and the like. Yes.
キチンの加水分解は、一般的に、強酸を用いた化学分解法が用いられているが、この方法は、多量の廃液を生じ環境に対する負荷が大きいことから、この問題を解決する方法として、キチン分解酵素を用いる方法が検討されている。
これまでにも、種々のキチン分解酵素産生微生物が見出されており、それらの微生物あるいはその培養液や単離された酵素などを用いたキチン分解方法が提案されている。（特許文献１〜５）For the hydrolysis of chitin, a chemical decomposition method using a strong acid is generally used. However, since this method generates a large amount of waste liquid and has a large environmental load, chitin is a method for solving this problem. A method using a degrading enzyme has been studied.
Various chitin degrading enzyme-producing microorganisms have been found so far, and a chitin decomposing method using these microorganisms, a culture solution thereof, an isolated enzyme, or the like has been proposed. (Patent Documents 1 to 5)
しかしながら、これまでに知られているキチン分解酵素は、概して反応性が低く、また、高分子のキチンを単糖のＮ−アセチルグルコサミンに分解するには、少なくとも２種類の酵素を用いて、２段階で分解する必要があった。
このため、分解能が強く、かつ、高分子のキチンから１段階でＮ−アセチルグルコサミンに分解できるような、分解特性に優れた酵素の開発が望まれていた。However, chitinolytic enzymes known so far are generally low in reactivity, and in order to decompose high molecular chitin into monosaccharide N-acetylglucosamine, at least two kinds of enzymes are used. It was necessary to decompose in stages.
For this reason, it has been desired to develop an enzyme having high degradability and excellent degradation characteristics that can be decomposed from high molecular chitin into N-acetylglucosamine in one step.
キチン分解酵素については、エンド型のキチナーゼとエキソ型のＮ-アセチルグルコサミニダーゼの２種類があることが知られている。前者はキチンをランダムに分解し、最終生産物はＮ−アセチルグルコサミンの２糖（ジアセチル−Ｎ−キトビオース）である。後者は、非還元末端より順次Ｎ−アセチルグルコサミンを切り出す反応を触媒するが、基質は低分子のオリゴ糖に限られ高分子キチンに対しては作用しない。
したがって、キチンからＮ−アセチルグルコサミンを製造するためには、少なくともこの２種類の酵素を用いる必要があり、しかも複雑な酵素反応系となるため反応の制御が難しいという問題点があった。It is known that there are two types of chitinolytic enzymes: endo-type chitinase and exo-type N-acetylglucosaminidase. The former decomposes chitin randomly, and the final product is N-acetylglucosamine disaccharide (diacetyl-N-chitobiose). The latter catalyzes the reaction of sequentially cutting out N-acetylglucosamine from the non-reducing end, but the substrate is limited to low-molecular oligosaccharides and does not act on high-molecular chitin.
Therefore, in order to produce N-acetylglucosamine from chitin, it is necessary to use at least these two types of enzymes, and there is a problem that the reaction is difficult to control because of a complicated enzyme reaction system.
本発明者らは、先に、長野県上田市の上田城の堀水より、強力なキチン分解能を有する新属新種のキチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株（ＮＢＲＣ１０４９７０、ＮＣＩＭＢ１４５０９、ＤＳＭ２３２７７）を分離同定し、報告した。（非特許文献１〜３） The present inventors previously described a new genus chitin-degrading bacterium Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain (NBRC104970, NCIMB14509, DSM23277) having a strong chitin resolution, from Horimizu, Ueda Castle, Ueda City, Nagano Prefecture, Japan. Were isolated and reported. (Non-patent documents 1 to 3)
本発明者らは、本菌株が有するキチン分解酵素遺伝子の解析を鋭意行った。その結果、これまでに報告されているキチン分解酵素遺伝子とは塩基配列の相同性が低い遺伝子を見出すことができた。
さらに、該遺伝子によりコードされるタンパク質は、従来報告されているキチン分解酵素と異なる特性を有する新規な酵素であることを確認した。
すなわち、本発明のキチン分解酵素は、従来のエンド型キチナーゼと同様に、高分子キチンに作用してランダムに分解する活性を示す一方、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、Ｎ−アセチルグルコサミンの２糖（ジアセチル−Ｎ−キトビオース）をも分解できるという優れた特性を有している。The present inventors diligently analyzed the chitinolytic enzyme gene of this strain. As a result, it was possible to find a gene having a low base sequence homology with the chitinolytic enzyme genes reported so far.
Furthermore, it was confirmed that the protein encoded by the gene is a novel enzyme having characteristics different from those of previously reported chitinolytic enzymes.
That is, the chitin-degrading enzyme of the present invention, like conventional endo-type chitinases, exhibits the activity of acting on high-molecular chitin and degrading it randomly, whereas N-acetylglucosamine that could not be decomposed by conventional endo-type chitinases The disaccharide (diacetyl-N-chitobiose) can also be decomposed.
本発明の目的は、新規なキチン分解酵素をコードする遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素を提供することである。
より詳細には、従来のキチン分解酵素では分解できなかった、１段階で高分子のキチンから単糖体のＮ−アセチルグルコサミンまで分解することができる、優れた分解特性を有する、新規なキチン分解酵素をコードする遺伝子、その遺伝子によりコードされるキチン分解酵素、並びに、該キチン分解酵素を用いたキチン分解方法およびＮ−アセチルグルコサミンの製造方法を提供することである。An object of the present invention is to provide a gene encoding a novel chitinolytic enzyme and a chitinolytic enzyme encoded by the gene.
More specifically, a novel chitin degradation having excellent degradation characteristics capable of degrading from high molecular chitin to monosaccharide N-acetylglucosamine in one step, which could not be degraded by conventional chitinolytic enzymes. It is to provide a gene encoding an enzyme, a chitinolytic enzyme encoded by the gene, a chitin decomposing method using the chitinolytic enzyme, and a method for producing N-acetylglucosamine.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中、先に長野県上田市の上田城の堀水より分離同定した、新種のキチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株の遺伝子解析を行い、新規なキチン分解酵素遺伝子を単離し、そのＤＮＡの塩基配列を同定することに成功した。さらに、該遺伝子により発現されるキチン分解酵素が、極めて優れたキチン分解能を示すことを確認し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention have conducted extensive research to solve the above-mentioned problems, and previously isolated and identified from Uorijo Castle's Ueda castle water, Nagano Prefecture, Chitiniphilus shinanonensis SAY3 strain. We conducted a genetic analysis, isolated a new chitinase gene, and succeeded in identifying the base sequence of the DNA. Furthermore, as a result of confirming that the chitinolytic enzyme expressed by the gene exhibits extremely excellent chitin resolution, and further researching it, the present invention has been completed.
より詳細には、本発明は、
[１] 配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列またはその配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡ配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ、および
[２] 配列番号３に示された塩基配列において、塩基番号１〜１５２７に示される塩基配列またはその配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示されるＤＮＡ配列を含む、キチン分解酵素をコードするＤＮＡ、および
[３] キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株由来のＤＮＡであることを特徴とする、[１]または[２]に記載のＤＮＡ、
に関する。More particularly, the present invention provides:
[1] The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes the base sequence shown in base numbers 1-1464 or the DNA sequence shown in the sequence in which one or more bases of the sequence are deleted, substituted or added DNA encoding a chitinolytic enzyme, and
[2] The base sequence shown in SEQ ID NO: 3 includes the base sequence shown in base numbers 1 to 1527 or the DNA sequence shown in the sequence in which one or more bases of the sequence are deleted, substituted or added DNA encoding a chitinolytic enzyme, and
[3] The DNA according to [1] or [2], which is DNA derived from Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain,
About.
また、本発明は、
[４] 配列番号２または４に示されたアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、キチン分解酵素、
[５] [１]または[２]に記載の ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とする、[４]に記載のキチン分解酵素、および、
[６] [１] または[２]に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはキチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株から産生されるものであることを特徴とする、[５]に記載のキチン分解酵素、
に関する。The present invention also provides:
[4] Chitin characterized in that it contains any one of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 or an amino acid sequence in which one to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence Degrading enzymes,
[5] The amino acid sequence encoded by the DNA according to [1] or [2] or the amino acid sequence including any one of amino acid sequences in which one to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added A chitinolytic enzyme according to [4], and
[6] The chitin according to [5], wherein the chitin is produced from a transformed microorganism into which the DNA according to [1] or [2] is introduced, or from Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain Degrading enzymes,
About.
また、本発明は、
[７] [４]〜[６]のいずれか一項に記載のキチン分解酵素を活性成分として含有することを特徴とする、キチン分解剤、
[８] [６]に記載のキチン分解酵素を産生する微生物またはその培養液を含むものであることを特徴とする、[７]に記載のキチンの分解剤、および、
[９] キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株または、[１]に記載のＤＮＡを導入した形質転換微生物またはその培養液を含むものであることを特徴とする、[８]に記載のキチンの分解剤、
に関する。The present invention also provides:
[7] A chitin degrading agent comprising the chitinolytic enzyme according to any one of [4] to [6] as an active ingredient,
[8] The chitin degrading agent according to [7], comprising a microorganism that produces the chitin degrading enzyme according to [6] or a culture solution thereof, and
[9] The chitin degrading agent according to [8], comprising the Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain, the transformed microorganism into which the DNA according to [1] is introduced, or a culture solution thereof ,
About.
また、本発明は、
[１０] [７]〜[９]のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とする、キチンの分解方法、および、
[１１] [７]〜[９]のいずれか一項に記載のキチン分解剤を用いることを特徴とする、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法、
に関する。The present invention also provides:
[10] A method for decomposing chitin, comprising using the chitin degrading agent according to any one of [7] to [9], and
[11] A method for producing N-acetylglucosamine, comprising using the chitin degrading agent according to any one of [7] to [9],
About.
さらに、本発明は、
[１２] [１]に記載のＤＮＡを含む形質転換用プラスミド、および、
[１３] プラスミドpCold I-cshchiGであることを特徴とする、[１２]記載のプラスミド、
に関する。Furthermore, the present invention provides
[12] A plasmid for transformation comprising the DNA according to [1], and
[13] The plasmid according to [12], which is a plasmid pCold I-cshchiG,
About.
本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、高分子キチンをエンド型に分解する作用を有しており、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる。よって、本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質は、高分子のキチンから、複雑な工程や操作を要する事なく、１段階で単糖体のＮ−アセチルグルコサミンまで分解することができ、効率的なＮ−アセチルグルコサミンの製造方法に極めて有用である。
また、Ｎ−アセチルグルコサミンは、加水分解することにより、容易にグルコサミンを製造することができることから、本発明のキチン分解酵素は、グルコサミンの効率的な製造方法としても極めて有用である。The protein encoded by the gene of the present invention has an action of degrading high molecular chitin into endo form, and also dimer diacetyl-N-chitobiose which could not be degraded by conventional endo chitinase. To produce N-acetylglucosamine as the final product. Therefore, the protein encoded by the gene of the present invention can be decomposed from the high molecular chitin to the monosaccharide N-acetylglucosamine in one step without requiring complicated steps and operations, and is efficient. It is extremely useful for the production method of N-acetylglucosamine.
In addition, since N-acetylglucosamine can be easily produced by hydrolysis, the chitinolytic enzyme of the present invention is extremely useful as an efficient method for producing glucosamine.
本発明は、新規なキチン分解細菌由来の、新規なキチン分解酵素遺伝子およびその遺伝子によりコードされるキチン分解酵素に関する。
なお、本発明においては、該キチン分解酵素を単にキチナーゼと称することもある。The present invention relates to a novel chitinolytic enzyme gene derived from a novel chitinolytic bacterium and a chitinolytic enzyme encoded by the gene.
In the present invention, the chitinolytic enzyme may be simply referred to as chitinase.
本発明者らは、先に、長野県上田市の上田城の堀水より分離同定した、新種のキチン分解細菌キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株が産生するキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の解析に鋭意努力し、該キチン分解酵素遺伝子を単離し、そのＤＮＡの塩基配列を同定することができた。 The present inventors previously encoded a protein having chitinolytic enzyme activity produced by a new species of chitin-degrading bacterium, Chitiniphilus shinanonensis SAY3 strain, which was isolated and identified from Uori Castle Uorimizu, Ueda City, Nagano Prefecture, Japan. We have made extensive efforts to analyze the genes to be isolated, isolated the chitinolytic enzyme gene, and identified the base sequence of the DNA.
すなわち、まず、フォスミドベクターpCC1FOSを用いて、該キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株の遺伝子ライブラリーを構築した。
次いで、キチナーゼに対する蛍光基質を添加した選択培地を用いて、ライブラリーの５，０００クローンの中から、１０クローンを選択した。
さらに、この選択クローンからフォスミドDNAを調製し、ゲノム・シーケンサーFLXシステム（Genome Sequnecer FLX system）を用いて核酸配列を解析した。That is, first, a gene library of the Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain was constructed using the fosmid vector pCC1FOS.
Next, 10 clones were selected from 5,000 clones of the library using a selective medium to which a fluorescent substrate for chitinase was added.
Furthermore, fosmid DNA was prepared from this selected clone, and the nucleic acid sequence was analyzed using the genome sequencer FLX system (Genome Sequnecer FLX system).
その解析において、既知のキチナーゼ酵素の遺伝子と相同性を示す１５種の遺伝子を見出した。そのうち、ファミリー１８のエンド型キチナーゼに相同性を示すものが１２種、ファミリー１９のエンド型キチナーゼが１種、ファミリー２０のエキソ型キチナーゼが１種、キチン結合ドメインを含むものの酵素活性ドメインが欠失したものが１種であることを確認した。 In the analysis, 15 kinds of genes having homology with known chitinase enzyme genes were found. Of these, 12 have homology to family 18 endo-chitinases, 1 have family 19 endo-chitinases, 1 have exo-type chitinases from family 20, and have a chitin-binding domain but lack the enzyme active domain It was confirmed that there was only one kind.
そして、１３種のエンド型キチナーゼの中で既知のキチナーゼ遺伝子との相同性が最も低いものが、配列番号1に示された塩基配列からなるＤＮＡであった。このＤＮＡを発現ベクターに挿入して大腸菌に形質転換し、この形質転換大腸菌が産生する組換えタンパク質を精製し、キチン分解活性を示すことを確認した。さらに、該キチン分解酵素活性タンパク質に必須なアミノ酸配列部分をコードする遺伝子が、配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列からなるＤＮＡであることを見出した。 Among the 13 types of endo-chitinases, the DNA having the lowest homology with the known chitinase gene was DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. This DNA was inserted into an expression vector and transformed into Escherichia coli, and the recombinant protein produced by the transformed Escherichia coli was purified and confirmed to exhibit chitinolytic activity. Furthermore, it has been found that the gene encoding the amino acid sequence part essential for the chitinolytic enzyme active protein is a DNA consisting of the base sequence shown by base numbers 1-1464 in the base sequence shown by SEQ ID NO: 1. .
本遺伝子は、これまでに報告されているエンド型キチナーゼ遺伝子と比較しても塩基配列の相同性が低く、その構造において新規なものである。
また、該遺伝子によりコードされるタンパク質は、高分子キチンをエンド型に分解する作用を有しており、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる、極めて優れた酵素活性を示す。This gene has a low base sequence homology compared to the endo-type chitinase genes reported so far, and is novel in its structure.
In addition, the protein encoded by the gene has an action of degrading high molecular chitin into endo form, and dimer diacetyl-N-chitobiose which could not be degraded by conventional endo chitinase is also present. It exhibits very good enzymatic activity that degrades to yield N-acetylglucosamine as the final product.
このような反応性を示す酵素はこれまで全く報告されておらず、本酵素を用いることにより、キチンから１段階でＮ−アセチルグルコサミンを製造することができることから、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造において、極めて有用である。 No enzyme having such reactivity has been reported so far, and by using this enzyme, N-acetylglucosamine can be produced from chitin in one step. Therefore, in the production of N-acetylglucosamine, Very useful.
本発明の酵素は、キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株の培養液から単離精製することもできるが、配列番号１に示された塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列を含むＤＮＡを、適当な微生物に導入した形質転換微生物（以下、本発明のキチン分解酵素産生微生物という）に産生させることにより、効率的に得ることができる。また、配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号３に示される塩基配列を含むＤＮＡとすることができる。 The enzyme of the present invention can be isolated and purified from the culture solution of Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain. In the base sequence, DNA containing the base sequence represented by base numbers 1-1464 is efficiently produced by causing a transformed microorganism introduced into an appropriate microorganism (hereinafter referred to as a chitinolytic enzyme-producing microorganism of the present invention). Can be obtained. Further, the DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be a DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
本発明のキチン分解酵素遺伝子は、配列番号１または３に示される塩基配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）、および該配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示され、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸を包含する。かかる塩基配列は、例えば、配列番号１または３に示される塩基配列を、１〜３０個、１〜５０個、１〜１００個または１〜２００個の塩基で欠失、置換もしくは付加した塩基配列である。
また、配列番号１または３に示される塩基配列からなる核酸であってもよい。The chitinolytic enzyme gene of the present invention is a nucleic acid (typically DNA) comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and a sequence in which one or more bases of the sequence are deleted, substituted or added. Nucleic acids comprising a sequence encoding a protein shown and having chitinolytic enzyme activity. Such a base sequence is, for example, a base sequence obtained by deleting, substituting or adding the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 with 1 to 30, 1 to 50, 1 to 100, or 1 to 200 bases. It is.
Moreover, the nucleic acid which consists of a base sequence shown by sequence number 1 or 3 may be sufficient.
また、本発明のキチン分解酵素遺伝子は、配列番号１または３で示される塩基配列と、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）であってもよい。また、配列番号１または３で示される塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子も含まれる。 The chitinolytic enzyme gene of the present invention has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more. , 95% or more, 98% or more, or 99% or more, and a nucleic acid (typically DNA) containing a sequence encoding a protein having chitinolytic enzyme activity. Also included are nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions with the nucleic acid molecule having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3.
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。
あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。The term “stringent conditions” as used herein is a parameter well known in the art, and stringent conditions in the present invention are, for example, 3.5 × SSC (0.15 M at 65 ° C.). Hybridization buffer consisting of sodium chloride / 0.15M sodium citrate, pH 7), Ficoll 0.02%, polyvinylpyrrolidone 0.02%, bovine serum albumin 0.02%, NaH2PO425 mM (pH 7), SDS 0.05%, EDTA 2 mM Refers to hybridization. After hybridization, the membrane to which the DNA has been transferred is washed with 2 × SSC at room temperature and then with 0.1-0.5 × SSC / 0.1 × SDS at a temperature up to 68 ° C.
Alternatively, stringent hybridization may be performed using commercially available hybridization buffers under the hybridization and washing conditions described by the manufacturer.
このような遺伝子転換微生物としては、遺伝子工学分野で用いられる微生物で、病原性のない微生物であればどのようなものでもよいが、遺伝子工学分野で汎用されている病原性のない大腸菌が好ましい。 As such a gene-transformed microorganism, any microorganism can be used as long as it is a microorganism used in the field of genetic engineering and has no pathogenicity, but Escherichia coli having no pathogenicity that is widely used in the field of genetic engineering is preferable.
また、形質転換に用いるＤＮＡとしては、上記、配列番号１に示された塩基配列において、塩基番号１〜１４６４に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは、該ＤＮＡと９０％以上の塩基配列相同性を有する塩基配列からなり、キチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードするものであることを特徴とするＤＮＡを用いることができる。 In addition, as DNA used for transformation, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, the DNA consisting of the base sequence shown in base Nos. 1-1464, or 90% or more base sequence homology with the DNA It is possible to use DNA characterized in that it comprises a base sequence having an amino acid sequence and encodes a protein having chitinolytic enzyme activity.
形質転換には、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）を用いてもよく、好ましくは配列番号３に示される塩基配列を含む核酸である。また、配列番号１または３に示される塩基配列、または該配列の１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示される塩基配列を含む核酸を用いてもよい。 For transformation, a nucleic acid (typically DNA) containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be used, preferably a nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. Alternatively, a nucleic acid comprising the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 or 3 or the base sequence shown by a sequence in which one or more bases of the sequence are deleted, substituted or added may be used.
また、配列番号１または３で示される塩基配列と、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む核酸（典型的にはＤＮＡ）を用いてもよい。また、配列番号１または３で示される塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分子を用いてもよい。 The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, Alternatively, a nucleic acid (typically DNA) containing a sequence encoding a protein having a homology of 99% or more and having a chitinolytic enzyme activity may be used. Alternatively, a nucleic acid molecule that hybridizes with a nucleic acid molecule having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 under stringent conditions may be used.
本発明のキチン分解酵素は、エンド型キチナーゼ活性を有しており、高分子キチンをエンド型に分解する作用を示し、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解できる酵素活性を示し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる、極めて優れた活性特性を示すものである。 The chitin-degrading enzyme of the present invention has endo-type chitinase activity, exhibits the action of degrading high-molecular chitin into endo-type, and has not been able to be decomposed by conventional endo-type chitinases. N-chitobiose also exhibits an enzymatic activity capable of degrading, and exhibits extremely excellent activity characteristics to produce N-acetylglucosamine as a final product.
また、本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、配列番号２または４に示されたアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列のいずれかを含むことを特徴とするタンパク質である。かかるアミノ酸配列は、例えば、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を、１〜３個、１〜５個、１〜１０個または１〜２０個のアミノ酸で置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列である。
本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、本発明のキチン分解酵素産生微生物を、適当な培養液中で培養し、その培養液等から通常の方法により分離、精製することにより得ることができる。The chitinolytic enzyme active protein of the present invention is any one of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, or an amino acid sequence in which one to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence. It is a protein characterized by including these. For example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 is substituted, deleted, inserted or added with 1 to 3, 1 to 5, 1 to 10, or 1 to 20 amino acids. Amino acid sequence.
The chitinolytic enzyme-active protein of the present invention can be obtained by culturing the chitinolytic enzyme-producing microorganism of the present invention in an appropriate culture solution, and separating and purifying it from the culture solution and the like by a usual method.
本発明のキチン分解酵素は、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、および該アミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質を包含する。また、本発明のキチン分解酵素は、配列番号２または４で示されるアミノ配列と、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有し、かつキチン分解酵素活性を有するタンパク質を包含する。
また、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。The chitinolytic enzyme of the present invention has a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence, And a protein having chitinolytic enzyme activity. The chitinolytic enzyme of the present invention comprises an amino sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, It includes proteins having a homology of 95% or more, 98% or more, or 99% or more and having chitinolytic enzyme activity.
Moreover, the protein which consists of an amino acid sequence shown by sequence number 2 or 4 may be sufficient.
本発明のキチン分解酵素は、高分子キチンをエンド型に分解する作用を有しており、本酵素を用いることにより、キチンから１段階でＮ−アセチルグルコサミンを製造することができることから、Ｎ−アセチルグルコサミンの製造において、極めて有用なものである。 The chitin degrading enzyme of the present invention has an action of degrading high molecular chitin into endo-type, and by using this enzyme, N-acetylglucosamine can be produced from chitin in one step. It is extremely useful in the production of acetylglucosamine.
本発明のキチン分解酵素を用いて、キチンを適当な大きさのオリゴ糖に分解する場合、あるいは、Ｎ−アセチルグルコサミンを製造する場合、精製した酵素を用いてもよいが、酵素を含有する組成物として用いることもできる。
そのような組成物としては、例えば、上記本発明のキチン分解酵素産生微生物もしくはその培養液を含む組成物、または、上記本発明のキチン分解酵素産生微生物の培養液もしくはその粗精製液などを挙げることができる。When degrading chitin into an oligosaccharide of an appropriate size using the chitin degrading enzyme of the present invention, or when producing N-acetylglucosamine, a purified enzyme may be used, but the composition containing the enzyme It can also be used as a product.
Examples of such a composition include a composition containing the above-described chitinolytic enzyme-producing microorganism of the present invention or a culture solution thereof, or a culture solution of the above-described chitinolytic enzyme-producing microorganism of the present invention or a roughly purified solution thereof. be able to.
Ｎ−アセチルグルコサミンは、甘味料としても利用可能であり、また、軟骨補充効果を示すことも知られており、老齢者の関節の健康を目的としたサプリメントなどに使用されている。さらに、体内でヒアルロン酸に変換されることから、肌のうるおいを保つ成分としての効果にも注目されている。
本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、このように機能性健康食品あるいは医薬品組成物の有効成分として有用なＮ−アセチルグルコサミンを、これまでのように、複数の酵素を組み合わせることなく、一段階で、極めて簡便に、製造することができる。N-acetylglucosamine can be used as a sweetener and is also known to have a cartilage replenishing effect, and is used in supplements for the purpose of joint health of the elderly. Furthermore, since it is converted into hyaluronic acid in the body, it is also attracting attention as an effect of keeping the skin moist.
The chitinolytic enzyme-active protein of the present invention can be obtained by combining N-acetylglucosamine, which is useful as an active ingredient of functional health foods or pharmaceutical compositions, in one step without combining a plurality of enzymes as in the past. It can be manufactured very simply.
以下に、本発明の実施の態様について実施例および試験例を挙げて説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to examples and test examples, but the present invention is not limited to the following examples.
キチナーゼ遺伝子（ｃｓｈｃｈｉＧ）の単離
（１）キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株ゲノムライブラリーの構築
キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株菌体よりＤＮＡ分離キット（Nexttec（登録商標） Genomic DNA Isolation kit for Bacteria (Nexttec) ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
ゲノムDNA溶液に対して、超音波破砕機 (Sonics ＆ Materials社、Vibra cell（登録商標）) を用いてＤＮＡの平均サイズを４０ｋｂｐ程度まで断片化した。
この断片化したＤＮＡより、フォスミド（fosmid）ベクターpCC1FOS を用いてフォスミド・ライブラリー作成キット（CopyControl（登録商標）Fosmid Library Production Kit (EPICENTRE BIOTECHNOLOGY) ）を用いてゲノムライブラリーを作成した。Isolation of chitinase gene (cshchiG) (1) Construction of Chitiniphilus shinanonensis SAY3 strain genomic library DNA isolation kit (Nexttec (registered trademark) Genomic DNA Isolation kit) from chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain for Bacteria (Nexttec)).
The genomic DNA solution was fragmented to an average DNA size of about 40 kbp using an ultrasonic disrupter (Sonics & Materials, Vibra cell (registered trademark)).
From this fragmented DNA, a fosmid library production kit (CopyControl (registered trademark) Fosmid Library Production Kit (EPICENTRE BIOTECHNOLOGY)) was used to prepare a genomic library using the fosmid vector pCC1FOS.
（２）キチン分解酵素活性を示すクローンの選抜
SAY3株のゲノムライブラリーを構成する大腸菌ＥＰＩ３００株クローンをキチン分解酵素活性検出用合成基質４−メチルウンベリフェリル（4-metylumbelliferyl (4MU)）- GlcNAc (1 mM) または４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３（１ｍＭ）を含有したＭ９合成培地（３６μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）に塗布し、摂氏３７度で一晩培養した。
キチン分解酵素活性を示すクローンは４ＭＵを遊離することからこれを指標として、ＵＶ照射下でコロニー周辺に青色の蛍光を発するキチン分解酵素活性を示すクローンを選抜した。(2) Selection of clones exhibiting chitinase activity
The E. coli EPI300 clone constituting the SAY3 strain genomic library was synthesized from 4-methylumbelliferyl (4-metylumbelliferyl (4MU))-GlcNAc (1 mM) or 4MU- (GlcNAc) 3 ( 1M) and M9 synthetic medium (containing 36 μg / ml chloramphenicol) and cultured overnight at 37 degrees Celsius.
Since clones exhibiting chitinase activity release 4 MU, clones exhibiting chitinase activity that emits blue fluorescence around colonies under UV irradiation were selected using this as an index.
（３）選抜クローンの塩基配列解読
シーケンス用テンプレートのフォスミドＤＮＡ（fosmid DNA）の調製は、キアゲン・ラージコンストラクトキット（QIAGEN Large-Construct Kit (QIAGEN) ）を用いて行った。
キチナーゼ活性を示した１０個のクローンから調製した組換えフォスミドＤＮＡ（fosmid DNA）をそれぞれ4 ×10−６ gずつ混合し、タカラバイオ株式会社による受託サービス(BAC / Fosmidなどの多クローン配列解析) に供した。
用いたシーケンサーは、ゲノム・シーケンス ＦＬＸ（Genome Sequence FLX (ロシュダイアグノスティクス) ）である。(3) Decoding the base sequence of selected clones The preparation of fosmid DNA, a template for sequencing, was performed using the Qiagen Large Construct Kit (QIAGEN). Large-Construct Kit (QIAGEN)).
Recombinant fosmid DNA (fosmid DNA) prepared from 10 clones that showed chitinase activity was mixed 4 x 10 -6 g each, and commissioned by Takara Bio Inc. (multiclonal sequence analysis such as BAC / Fosmid) It was used for.
The sequencer used was Genome Sequence FLX (Genome Sequence FLX (Roche Diagnostics)).
（４）塩基配列の解析
ＤＮＡデータバンクオフジャパン（DNA Data Bank of Japan (DDBJ) ）のＢＬＡＳＴ (http：//www.ddbj.nig.ac.jp/sear ch/blast-j.html) 、ナショナルセンター フォー バイオテクノォジー インフォメーション（National Center for Biotechnology Information (NCBI)のＯＲＦファインダー（ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)）、およびジェネティックス（GENETYX (株式会社ジェネティックス) ）を用いて、上記（３）で解読した塩基配列の中からキチン分解酵素関連遺伝子を探索した。
キチン分解酵素と考えられるＯＲＦに関しては、シグナル配列推定プログラムシグナルＰ（SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)）を用いて、シグナル配列の有無を判定した。また、ピーファム（pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/) ）およびケイジー（cazy (http://www.ca zy.org/)）を用いて、糖質加水分解酵素のファミリー（family）を推定した。
その結果、ファミリー１８のエンド型キチナーゼが１２種、ファミリー１９のエンド型キチナーゼが１種、ファミリー２０のエキソ型キチナーゼが１種と、キチン結合ドメインを含むものの酵素活性ドメインが欠失したポリペプチドが１種であると推定された。(4) Analysis of nucleotide sequence BLAST of DNA Data Bank of Japan (DDBJ) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html), National Center for Biotechnology Information (ORF finder (ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)) of National Center for Biotechnology Information (NCBI)) and Genetics (GENETYX ( Genetics Co., Ltd.) was used to search for chitinase-related genes from the base sequence decoded in (3) above.
Regarding the ORF considered to be a chitinolytic enzyme, the presence or absence of a signal sequence was determined using a signal sequence estimation program signal P (SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)). In addition, the family of carbohydrate hydrolases (pham (http://pfam.sanger.ac.uk/)) and cazy (cazy (http://www.ca zy.org/)) are used. family).
As a result, 12 family 18 endo-chitinases, 1 family 19 endo-chitinase, 1 family 20 exo-chitinase, a polypeptide containing a chitin-binding domain but lacking an enzyme active domain It was estimated to be one species.
（５）キチナーゼ遺伝子（ｃｓｈｃｈｉＧ）の選定
１３種のエンド型キチナーゼ遺伝子について、既知のエンド型キチナーゼとの相同性を比較した結果、最も相同性の低い遺伝子をｃｓｈｃｈｉＧと名付けた。(5) Selection of chitinase gene (cshchiG) As a result of comparing the homology of 13 types of endo-type chitinase genes with known endo-type chitinases, the gene having the lowest homology was named cshchiG.
キチナーゼ（ｃｓｈｃｈｉＧ）遺伝子構造の解析
実施例１、（４）と同様にして、塩基配列を解析した結果、ｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子のタンパク質コード領域は１，４６４塩基から構成され、４８７個のアミノ酸残基からなる分子量５１．４ｋＤａのポリペプチドをコードするものである事を確認した。
推定アミノ酸配列を解析したところ、Ｎ末端側からキチン結合ドメインが２回繰り返して出現し、さらにｆａｍｉｌｙ１８キチナーゼの活性ドメイン類似の配列が現れた。活性ドメインの配列類似性は、データベース上の最も類似性の高い、ストレプトミセス(Streptomyces sp.)のＡＣＴＥキチナーゼに対しても３８％と低いものであった。Analysis of chitinase (cshchiG) gene structure As a result of analyzing the base sequence in the same manner as in Examples 1 and (4), the protein coding region of the cshchiG gene is composed of 1,464 bases and consists of 487 amino acid residues. It was confirmed that it encodes a polypeptide having a molecular weight of 51.4 kDa.
When the deduced amino acid sequence was analyzed, a chitin binding domain appeared twice from the N-terminal side, and a sequence similar to the active domain of family 18 chitinase appeared. The sequence similarity of the active domain was as low as 38% for the most similar Streptomyces sp. ACTE chitinase in the database.
大腸菌を宿主としたｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子の発現
常法に従い、キチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、タンパク質相当部分をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲプライマーに用いるために設計したオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである。センスプライマー（配列番号５）には制限酵素Ｂａｍ ＨＩの認識配列、アンチセンスプライマー(配列番号６）にはＨｉｎｄ ＩＩＩ認識配列を５’末端側に付加した（下線部分）。
各プライマーの相同配列位置は、センスプライマーが配列番号１に示された塩基配列において塩基番号１〜１８に示される塩基配列であり、アンチセンスプライマーが塩基番号１４４７〜１４６４に示される塩基配列である。
センスプライマー 5’- GCGGATCCATGGCCGCGCATGCCGCG -3’
アンチセンスプライマー 5’- GCAAGCTTTCAGAACTCGCCGAAGAT -3’
常法にしたがって、得られたPCR増幅ＤＮＡ断片をＢａｍ ＨＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩで二重消化し、同じ酵素で二重消化した大腸菌用発現ベクターpCold I（タカラバイオ）と連結して，発現用プラスミドpCold I-cshchiGを作成した（図１）。
ｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子断片が、読み取り枠を合わせて正しく設計通りに発現ベクターに挿入されていることを塩基配列シークエンスにより確認した。Expression of cshchiG gene using Escherichia coli as a host According to a conventional method, a gene fragment encoding a protein-corresponding portion was PCR-amplified using the genomic DNA of Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain as a template.
The oligonucleotide sequences designed for use as PCR primers are as follows: A recognition sequence of restriction enzyme Bam HI was added to the sense primer (SEQ ID NO: 5), and a Hind III recognition sequence was added to the 5 ′ end side of the antisense primer (SEQ ID NO: 6) (underlined portion).
The homologous sequence position of each primer is the base sequence represented by base numbers 1 to 18 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the antisense primer is the base sequence represented by base numbers 1447 to 1464. .
Sense primer 5 ' -GC GGATCC ATGGCCGCGCATGCCGCG -3 '
Antisense primer 5 ' -GC AAGCTT TCAGAACTCGCCGAAGAT -3 '
According to a conventional method, the obtained PCR-amplified DNA fragment was double-digested with Bam HI and Hind III and ligated with the expression vector pCold I (Takara Bio) double-digested with the same enzymes, and the expression plasmid pCold I-cshchiG was created (Fig. 1).
It was confirmed by nucleotide sequence sequencing that the cshchiG gene fragment was inserted into the expression vector as designed in the correct reading frame.
組換えＣｓｈｃｈｉＧタンパク質の発現と精製
上記実施例３で構築した発現用プラスミドpCold I-cshchiGを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を５ｍｌのＬＢ培地（５０×１０−６ｇ／ｍｌ ampicillin含有）を用いて、一晩摂氏３７度で前培養した。
その前培養液１ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地（５０×１０−６ｇ／ｍｌ ampicillin含有）に移植して摂氏３７度、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。
濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．４〜０．５に達した時点でその培養液を摂氏１５度、３０分間静置した。
その後、終濃度０．５ｍＭとなるようにイソプロピル−１−チオ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside(IPTG))を添加し、摂氏１５度、２００ｒｐｍで２４時間、コールドショック発現を行った。
遠心（８０００ｒｐｍ、１５分間、摂氏４度）により、回収した菌体を１ｍｌの２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（Tris-HCl buffer）（ｐＨ８．０）に懸濁し、氷上で超音波破砕を計４分間（３０秒間破砕、３０秒間冷却を８サイクル）行った（Astrason Model 2020、 MISONIX）。
破砕液を遠心（８０００ｒｐｍ、３０分間、摂氏４度）した後、上清を可溶性タンパク質画分として得た。
可溶性画分に含まれる組換えタンパク質をN末端側に融合された６ｘＨｉｓタグを利用して、アフィニティーカラム（His GlaviTrap（登録商標）affinity columns (GE Healthcare )） により精製した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie Brilliant Blue (CBB)）により染色し、組換えタンパク質が精製されていることを確認した（図２）。
ゲル中のバンドの泳動距離から推定した分子量は約５４ｋＤａであり、予想された組換えタンパク質の分子量５４．３ｋＤａによく一致した。このタンパク質をＣｓｈｃｈｉＧと名付けた。Expression and Purification of Recombinant CshchiG Protein Using 5 ml of LB medium (containing 50 × 10 −6 g / ml ampicillin) for E. coli BL21 (DE3) strain carrying the expression plasmid pCold I-cshchiG constructed in Example 3 above And pre-cultured overnight at 37 degrees Celsius.
1 ml of the preculture was transplanted into 50 ml of LB medium (containing 50 × 10 −6 g / ml ampicillin) and cultured with shaking at 37 ° C. and 200 rpm.
When the turbidity (OD600) reached 0.4 to 0.5, the culture was allowed to stand at 15 degrees Celsius for 30 minutes.
Thereafter, isopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.5 mM, and 15 degrees Celsius, 200 rpm. For 24 hours.
The collected cells are suspended in 1 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) by centrifugation (8000 rpm, 15 minutes, 4 degrees Celsius), and sonication is performed on ice for a total of 4 minutes ( (8 cycles of crushing for 30 seconds and cooling for 30 seconds) (Astrason Model 2020, MISONIX).
After crushing the crushing solution (8000 rpm, 30 minutes, 4 degrees Celsius), the supernatant was obtained as a soluble protein fraction.
The recombinant protein contained in the soluble fraction was purified with an affinity column (His GlaviTrap (registered trademark) affinity columns (GE Healthcare)) using a 6xHis tag fused to the N-terminal side.
The gel after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) to confirm that the recombinant protein was purified (FIG. 2).
The molecular weight estimated from the migration distance of the band in the gel was about 54 kDa, which was in good agreement with the expected molecular weight of the recombinant protein of 54.3 kDa. This protein was named CshchiG.
組換え酵素ＣｓｈｃｈｉＧのキチン分解酵素活性
精製した組換えＣｓｈｃｈｉＧ酵素のキチン分解酵素活性を、反応中に高分子基質キチンの分解により新たに生成した還元糖量をシェールズ（Schales）法により定量することにより評価した。
反応液（２ｍｌ）は、０．２５％コロイダルキチン、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）、適当量の酵素からなり、摂氏３７度で３０分間インキュベートして反応を進行させ、摂氏１００度、３分間の熱処理により酵素反応を停止させた。
そこにシェールズ（Schales）試薬（フェリシアン化カリウム０．５ｇを０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液１リットルに溶解させたもの）を２．７ｍｌ加え、摂氏１００度、１５分間処理してＦｅ３＋の還元反応を終了させた。
遠心（４，０００ｒｐｍ、２０分間）により基質沈殿を除去した上清部の吸光度（Ｏ．Ｄ．４２０）を測定し、還元糖量を測定した。
コントロールには、上記反応液から酵素を除去したものを用いた。活性（１Ｕ）は、１分間に１×１０−６ｍｏｌの Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に相当する還元糖量を生成する酵素量と定義した。
組換え酵素ＣｓｈｃｈｉＧは明らかにコロイダルキチン分解活性を示し、タンパク質量当たりの活性は０．２１Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。Chitinolytic enzyme activity of the recombinant enzyme CshchiG By measuring the amount of reducing sugar newly produced by the degradation of the polymeric substrate chitin during the reaction using the Schales method. evaluated.
The reaction solution (2 ml) is composed of 0.25% colloidal chitin, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.6) and an appropriate amount of enzyme, and incubated at 37 degrees Celsius for 30 minutes to proceed the reaction, 100 degrees Celsius, The enzyme reaction was stopped by heat treatment for 3 minutes.
2.7 ml of Schales reagent (0.5 g of potassium ferricyanide dissolved in 1 liter of 0.5 M sodium carbonate solution) was added thereto and treated at 100 degrees Celsius for 15 minutes to complete the reduction of Fe 3+ I let you.
The absorbance (OD 420) of the supernatant portion from which the substrate precipitate was removed by centrifugation (4,000 rpm, 20 minutes) was measured, and the amount of reducing sugar was measured.
For the control, a solution obtained by removing the enzyme from the reaction solution was used. The activity (1 U) was defined as the amount of enzyme that produces a reducing sugar amount corresponding to 1 × 10 −6 mol of N-acetylglucosamine (GlcNAc) per minute.
The recombinant enzyme CshchiG clearly showed colloidal chitinolytic activity, and the activity per protein amount was 0.21 U / mg-protein.
反応生成物の分析
基質には、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の２〜５量体またはコロイダルキチンを用いた。反応液 （５０×１０−６ｌ） は２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）、１０ｍＭ ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖（または０．０２５％コロイダルキチン）、適当量の酵素から成り、摂氏３７度で一晩反応させた後、摂氏１００度、５分間の熱処理で反応を停止させた。
その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心で回収した上清１０×１０−６ｌをシリカゲル薄層プレート (TLC plastic sheets 20 x 20 cm silica gel 60 F254: MERCK) にスポットした。
展開溶媒にはＮ−プロパノール：滅菌水：酢酸エチル：３０％アンモニア水＝６０：２８：３０：１２（ｖ／ｖ）を用いた。
ＧｌｃＮＡｃオリゴ糖の展開スポット検出には、アニリン−ジフェニルアミンアセトン溶液（１０ｇ／ｌアニリン：１０ｇ／ｌジフェニルアミン−アセトン溶液：８５％リン酸＝５：５：１（ｖ／ｖ））を用いた。
長時間反応の結果、ＧｌｃＮＡｃ２〜５量体からはＧｌｃＮＡｃのみのスポットが検出され、酵素ＣｓｈｃｈｉＧは最終生成物としてＧｌｃＮＡｃ単量体を与えることがわかった。
また、高分子のコロイダルキチンを基質とした場合にもＧｌｃＮＡｃを生じることがわかった（図３）。
続いて、ＧｌｃＮＡｃ５量体を基質に用いた上記反応液を作成し、経時的に反応を停止しＴＬＣで生成物を分析した（図４）。
その結果、反応初期には５量体が、先ず２量体と３量体に分解され、その後３量体は２量体と単量体に、生じた２量体はさらに単量体に分解され、最終的に全て単量体にまで分解された。
反応初期にＧｌｃＮＡｃ単量体が生じることなく、２量体と３量体を生じたことから、酵素ＣｓｈｃｈｉＧは明らかにエンド型の分解活性を示すことが確認された。Analysis of reaction product As a substrate, N-acetylglucosamine (GlcNAc) 2-5 mer or colloidal chitin was used. The reaction solution (50 × 10 −6 l) consists of 25 mM acetate buffer (pH 5.6), 10 mM GlcNAc oligosaccharide (or 0.025% colloidal chitin), and an appropriate amount of enzyme, and is reacted overnight at 37 degrees Celsius. After that, the reaction was stopped by heat treatment at 100 degrees Celsius for 5 minutes.
Thereafter, 10 × 10 −6 l of the supernatant collected by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes was spotted on a silica gel thin layer plate (TLC plastic sheets 20 × 20 cm silica gel 60 F 254 : MERCK).
N-propanol: sterile water: ethyl acetate: 30% aqueous ammonia = 60: 28: 30: 12 (v / v) was used as the developing solvent.
An aniline-diphenylamine acetone solution (10 g / l aniline: 10 g / l diphenylamine-acetone solution: 85% phosphoric acid = 5: 5: 1 (v / v)) was used for detecting the development spot of GlcNAc oligosaccharide.
As a result of the long-time reaction, it was found that a spot of only GlcNAc was detected from the GlcNAc 2-5mer, and the enzyme CshchiG gave a GlcNAc monomer as a final product.
Further, it was found that GlcNAc was also produced when a high molecular weight colloidal chitin was used as a substrate (FIG. 3).
Subsequently, the above reaction solution using GlcNAc pentamer as a substrate was prepared, the reaction was stopped over time, and the product was analyzed by TLC (FIG. 4).
As a result, the pentamer is first decomposed into a dimer and a trimer at the beginning of the reaction, then the trimer is decomposed into a dimer and a monomer, and the resulting dimer is further decomposed into a monomer. And finally all decomposed into monomers.
Since the dimer and trimer were formed without the occurrence of GlcNAc monomer at the initial stage of the reaction, it was confirmed that the enzyme CshchiG clearly shows endo-type degradation activity.
酵素ＣｓｈｃｈｉＧの活性中心アミノ酸残基の決定
酵素ＣｓｈｃｈｉＧの活性中心アミノ酸残基を探索するため、点突然変異を導入した変異型組換え酵素を作成し、キチン分解活性を測定した。
ファミリー１８キチナーゼにおいて、活性中心を構成するＡｓｐ Ｘ Ａｓｐ Ｘ Ｇｌｕの配列が保存されていること、および、左端のＡｓｐと右端のＧｌｕが活性発現に必須なアミノ酸残基であることが報告されている。ＣｓｈｃｈｉＧタンパク質のアミノ酸配列を調べたところ、Ｎ末端から配列番号４の３１３番目よりＡｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕという類似のアミノ酸配列が保存されていた。そこで、点突然変異導入の手法により、Ａｓｐ３１３とＡｓｐ３１５をそれぞれＡｓｎに、Ｇｌｕ３１７をＧｌｎに置換した３種類の変異型酵素を作成した。既報によれば、キチナーゼ活性の発現には、ＡｓｐとＧｌｕが有する側鎖のカルボキシル基が重要な役割を果たしている。活性中心であるＡｓｐ、Ｇｌｕが、カルボキシル基にアミノ基が結合したＡｓｎ、Ｇｌｎに置換された場合、活性は消失するはずである。なお、配列番号４の３１３番目、３１５番目および３１７番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号２の２９２番目、２９４番目および２９６番目のアミノ酸に対応する。Determination of the active center amino acid residue of the enzyme CshchiG In order to search for the active center amino acid residue of the enzyme CshchiG, a mutant recombinant enzyme into which a point mutation was introduced was prepared and the chitinolytic activity was measured.
In family 18 chitinases, it has been reported that the sequence of Asp X Asp X Glu constituting the active center is conserved, and that the leftmost Asp and the rightmost Glu are essential amino acid residues for active expression. . When the amino acid sequence of the CshchiG protein was examined, a similar amino acid sequence of Asp Leu Asp Pro Glu was conserved from the 313th position of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus. Therefore, three types of mutant enzymes were prepared by replacing Asp313 and Asp315 with Asn and Glu317 with Gln, respectively, by the point mutation introduction technique. According to a previous report, the side chain carboxyl groups of Asp and Glu play an important role in the expression of chitinase activity. When Asp and Glu, which are active centers, are substituted with Asn and Gln in which an amino group is bonded to a carboxyl group, the activity should disappear. The 313th, 315th and 317th amino acids of SEQ ID NO: 4 correspond to the 292nd, 294th and 296th amino acids of SEQ ID NO: 2, respectively.
点突然変異の導入は、ＣｓｈｃｈｉＧ発現プラスミドpCold I-cshchiG ＤＮＡをテンプレートに用い、QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Tachnologies社)を用いて行った。作製後、ｃｓｈｃｈｉＧ遺伝子領域の塩基配列を解読し、設計した変異が正しく導入されていることを確認した。変異型ｃｓｈｃｈｉＧ酵素の発現と精製は、野生型ｃｓｈｃｈｉＧと同様に行った。
精製した野生型ｃｓｈｃｈｉＧと３種の変異型酵素Ｄ３１３Ｎ（Ａｓｐ３１３をＡｓｎに置換）、Ｄ３１５Ｎ（Ａｓｐ３１５をＡｓｎに置換）、Ｅ３１７Ｑ（Ｇｌｕ３１７をＧｌｎに置換）を用いて、各種キチン関連基質の分解活性を調査した。その結果、変異型酵素Ｅ３１７Ｑにおいてのみ、いずれの基質に対してもほとんど活性が消失した（表１）。Point mutations were introduced using the CshchiG expression plasmid pCold I-cshchiG DNA as a template and QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Tachnologies). After production, the base sequence of the cshchiG gene region was decoded to confirm that the designed mutation was correctly introduced. Expression and purification of the mutant cshchiG enzyme were performed in the same manner as wild-type cshchiG.
Using purified wild-type cshchiG and three mutant enzymes D313N (Replace Asp313 with Asn), D315N (Replace Asp315 with Asn), and E317Q (Replace Glu317 with Gln), the degradation activity of various chitin-related substrates investigated. As a result, almost only the mutant enzyme E317Q lost activity against any substrate (Table 1).
合成基質ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）−ＧｌｃＮＡｃ２量体および３量体に対する分解活性は、ｐ−ニトロフェノール遊離量で示した。
各基質に対する野生型酵素の活性を１００％とした場合の相対活性を括弧内に示した。
The degradation activity for the synthetic substrate p-nitrophenyl (pNP) -GlcNAc dimer and trimer was expressed as the amount of p-nitrophenol released.
The relative activity when the activity of the wild-type enzyme for each substrate is taken as 100% is shown in parentheses.
この結果は、酵素ｃｓｈｃｈｉＧ中のＧｌｕ３１７（３１７番目のグルタミン酸）残基が、キチナーゼ活性発現に必須な活性中心であることを証明するものである。 This result proves that the Glu317 (317th glutamic acid) residue in the enzyme cshchiG is an active center essential for the expression of chitinase activity.
なお、本実施例において使用したキチニフィラス・シナノネンシス（Chitiniphilus shinanonensis）SAY3株は、
ＮＢＲＣ１０４９７０として、NITE Biological Resource Center (NBRC)、〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に、平成20年8月15日付で（図５）、
ＮＣＩＭＢ１４５０９として、National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria、Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdomに、2008年8月11日付で（図６、http://www.ncimb.com/results.php?parent=culture）、および
ＤＳＭ２３２７７として、DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、2010年3月8日付で(図７、http://old.dsmz.de/microorganisms/html/strains/strain.dsm023277.html）、それぞれ寄託されている。Note that the Chitininiphilus shinanonensis SAY3 strain used in this example is
As NBRC 104970, NITE Biological Resource Center (NBRC), 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818 Japan, as of August 15, 2008 (Fig. 5),
As NCIMB 14509, National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdom dated August 11, 2008 (Figure 6, http://www.ncimb.com/ results.php? parent = culture) and DSM23277 as DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany on March 8, 2010 (Figure 7, http: // old.dsmz.de/microorganisms/html/strains/strain.dsm023277.html), each deposited.
本発明のキチン分解酵素活性タンパク質は、高分子キチンをエンド型に分解する、エンド型キチナーゼ活性を示し、しかも、従来のエンド型キチナーゼでは分解できなかった、２量体のジアセチル−Ｎ−キトビオースも分解できる酵素活性を有し、最終産物としてＮ−アセチルグルコサミンを生じさせる、極めて優れた活性特性を示すものであり、キチンの分解方法またはＮ−アセチルグルコサミンの製造方法において極めて有用である。 The chitin-degrading enzyme-active protein of the present invention exhibits endo-type chitinase activity that degrades high-molecular chitin into endo-type, and also dimer-diacetyl-N-chitobiose that could not be degraded by conventional endo-type chitinase. It has an enzymatic activity that can be decomposed, and exhibits extremely excellent activity characteristics that give N-acetylglucosamine as a final product, and is extremely useful in a method for decomposing chitin or a method for producing N-acetylglucosamine.
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