JPWO2010095721A1

JPWO2010095721A1 - Fusion monooxygenase and method for producing oxide using the same

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Publication number: JPWO2010095721A1
Application number: JP2011500664A
Authority: JP
Inventors: 今岡　進; 進今岡
Original assignee: Kwansei Gakuin Educational Foundation
Current assignee: Kwansei Gakuin Educational Foundation
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2012-08-30
Also published as: WO2010095721A1

Abstract

本発明は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を提供することを課題とする。また、本発明は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を利用することにより、高温環境下で、又は有機溶媒系において酸化物を生産する方法を提供することも別の課題とする。本発明はかかる課題の解決手段として、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼを提供する。さらに当該融合モノオキシゲナーゼを利用する酸化物の生産方法を提供する。An object of the present invention is to provide a P450 monooxygenase system having heat resistance and organic solvent resistance. Another object of the present invention is to provide a method for producing an oxide in a high temperature environment or in an organic solvent system by utilizing a P450 monooxygenase system having heat resistance and organic solvent resistance. . The present invention provides a fusion monooxygenase obtained by linking P450 derived from a hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus, ferredoxin reductase, and ferredoxin in this order from the N-terminal side directly or through a linker as a means for solving such a problem. To do. Furthermore, an oxide production method using the fusion monooxygenase is provided.

Description

本発明は、融合モノオキシゲナーゼに関する。また本発明は、融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に酸素を添加することにより水酸化物など一酸素原子付加物を得る方法に関する。 The present invention relates to a fusion monooxygenase. The present invention also relates to a method for obtaining a monooxygen atom adduct such as hydroxide by adding oxygen to a substrate using a fusion monooxygenase.

チトクロームP450（cytochrome P450；本明細書において、「P450」ということもある。）は、還元して一酸化炭素（CO）を結合させた時に450nm付近に特異的な吸収帯（ソーレー帯）を示すプロトヘムIX含有タンパク質の総称である。動物、植物、細菌、酵母に至るまで広く生物界に存在する、ヘムを有するモノオキシゲナーゼである（非特許文献１）。 Cytochrome P450 (cytochrome P450; sometimes referred to as “P450” in this specification) exhibits a specific absorption band (Sorley band) around 450 nm when it is reduced to bind carbon monoxide (CO). A generic term for protoheme IX-containing proteins. It is a monooxygenase having heme widely present in the living world from animals, plants, bacteria, and yeast (Non-patent Document 1).

P450は、あらゆる生物に見られ、真核生物では細胞内のミトコンドリア内膜又はミクロソームに局在し、原核生物では細胞質に存在している。P450は、（１）生理活性物質であるコレステロール、ステロイドホルモン、胆汁酸、及び活性型ビタミンDの生合成、（２）ヘム、脂肪酸、及びエイコサノイドの代謝、並びに（３）医薬品や内分泌かく乱物質のような脂溶性の外来異物の解毒代謝等に関与している。 P450 is found in all living organisms. In eukaryotes, it is localized in the mitochondrial inner membrane or microsome, and in prokaryotes, it is present in the cytoplasm. P450 consists of (1) biosynthesis of bioactive substances cholesterol, steroid hormones, bile acids, and active vitamin D, (2) metabolism of heme, fatty acids, and eicosanoids, and (3) pharmaceuticals and endocrine disruptors. It is involved in the detoxification metabolism of such fat-soluble foreign substances.

各反応系においてP450はいずれもNAD（P）Hから供給される2個の電子と分子状酸素を利用して基質の水酸化、エポキシ化、O-脱メチル反応、N-メチル反応、スルホキシド反応、脱アルキル、及びジオール間の開裂反応等を触媒する、いわゆる一原子酸素添加反応（モノオキシゲナーゼ反応）を行う（非特許文献２及び３）。これらの反応にはP450に電子を供給する電子伝達系が必要である。P450及びこれらの電子伝達系はいわゆる複合酵素系を構成することでその機能を発揮する（特許文献１及び２）。この複合酵素系はP450モノオキシゲナーゼ系とも呼ばれる。 In each reaction system, P450 uses two electrons supplied from NAD (P) H and molecular oxygen to hydroxylate the substrate, epoxidize, O-demethylation, N-methylation, sulfoxide reaction. , Dealkylation, and a so-called monoatomic oxygenation reaction (monooxygenase reaction) that catalyzes a cleavage reaction between diols (Non-patent Documents 2 and 3). These reactions require an electron transfer system that supplies electrons to P450. P450 and these electron transfer systems exhibit their functions by constituting a so-called complex enzyme system (Patent Documents 1 and 2). This complex enzyme system is also called the P450 monooxygenase system.

P450モノオキシゲナーゼ系により行われるモノオキシゲナーゼ反応は、生理活性物質であるプロスタグランジン類若しくはステロイド類等の有用物質を生産し、又はダイオキシン若しくはPCB等の環境汚染物質を分解すること等に利用することができる。 The monooxygenase reaction performed by the P450 monooxygenase system should be used to produce useful substances such as prostaglandins or steroids that are physiologically active substances, or to decompose environmental pollutants such as dioxins or PCBs. Can do.

特表2008-521448Special table 2008-521448 WO2003/087381WO2003 / 087381

Biochemical and Biophysical Research Communications 339 (2006) pp. 331-336Biochemical and Biophysical Research Communications 339 (2006) pp. 331-336 Ortiz de M. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. (1995), pp. 3-48Ortiz de M. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. (1995), pp. 3-48 Gunsalus IC., Pederson TC.,and Sligar SG. Annu. Rev. Biochem. 44, 377 (1975)Gunsalus IC., Pederson TC., And Sligar SG. Annu. Rev. Biochem. 44, 377 (1975)

従来のP450モノオキシゲナーゼ系は熱耐性を有さず、それらを用いて反応を行う場合には反応温度が制限されてしまうという問題がある。また、従来のP450モノオキシゲナーゼ系は有機溶媒中で不安定なため水溶媒系においてのみ利用されるに止まっており、難水溶性の有機化合物の合成及び代謝の効率が低いという問題がある。 Conventional P450 monooxygenase systems do not have heat resistance, and there is a problem that the reaction temperature is limited when the reaction is carried out using them. Further, since the conventional P450 monooxygenase system is unstable in an organic solvent, it is only used in an aqueous solvent system, and there is a problem that the efficiency of synthesis and metabolism of a poorly water-soluble organic compound is low.

したがって、本発明の目的は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a P450 monooxygenase system having heat resistance and organic solvent resistance.

また、本発明の別の目的は、熱耐性及び有機溶媒耐性を有するP450モノオキシゲナーゼ系を利用することにより、高温環境下で、又は有機溶媒系において酸化物を生産する方法を提供することにある。 Another object of the present invention is to provide a method for producing an oxide in a high temperature environment or in an organic solvent system by utilizing a P450 monooxygenase system having heat resistance and organic solvent resistance. .

本発明者は、上記課題を解決するために、まず、本発明者が新たに同定した高度好熱性細菌由来のP450モノオキシゲナーゼ系を利用することを考えた。このP450モノオキシゲナーゼ系はP450、フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシンから構成される。このP450モノオキシゲナーゼ系においては、NADPHから供給された電子がフェレドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、そしてP450の順に伝達される。 In order to solve the above problems, the present inventor first considered using a P450 monooxygenase system derived from a highly thermophilic bacterium newly identified by the present inventor. This P450 monooxygenase system is composed of P450, ferredoxin reductase and ferredoxin. In this P450 monooxygenase system, electrons supplied from NADPH are transferred in the order of ferredoxin reductase, ferredoxin, and P450.

本発明者は、このP450モノオキシゲナーゼ系を構成する酵素群を互いに連結した融合タンパク質を利用することによって上記課題を解決できるのではないかとの着想のもと鋭意検討を行った。その結果、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で連結してできた融合タンパク質（融合モノオキシゲナーゼ）が熱耐性及び有機溶媒耐性を有しているだけでなく、これらの酵素を単に組み合わせて用いた場合に比べても、また他の連結順で連結したものに比べても際立って優れたモノオキシゲナーゼ活性を有していることを見出した。このように、電子が伝達される順番と無関係に連結した融合モノオキシゲナーゼのほうが、電子が伝達される順番に連結したものよりもより優れたモノオキシゲナーゼ活性を有していようなどとは、従来技術からは全く予測することができかった。本発明者は、この驚くべき結果をもとに本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の通りである。 The present inventor has intensively studied based on the idea that the above problem can be solved by using a fusion protein in which enzyme groups constituting the P450 monooxygenase system are linked to each other. As a result, P450, ferredoxin reductase, and the fusion protein (fusion monooxygenase) formed by linking ferredoxin in this order from the N-terminal side have not only heat resistance and organic solvent resistance, but also The present inventors have found that the monooxygenase activity is remarkably superior even when compared with the case where they are simply used in combination or when they are connected in other order of connection. In this way, the fusion monooxygenase linked regardless of the order in which electrons are transferred has better monooxygenase activity than that linked in the order in which electrons are transferred. Could not be predicted at all. The present inventor has completed the present invention based on this surprising result. That is, the present invention is as follows.

１．融合モノオキシゲナーゼ
〈１−１〉 Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−２〉 Thermus 属の高度好熱性細菌がThermus thermophilus である〈１−１〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−３〉 P450が次の(A)又は(B)のポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
〈１−４〉 P450が配列番号１のアミノ酸配列において、65〜72番目のアミノ酸領域、150〜157番目のアミノ酸領域、176〜198番目のアミノ酸領域、207〜240番目のアミノ酸領域及び269〜276番目のアミノ酸領域からなる群より選択される少なくとも1種のアミノ酸領域に属する1個又は複数個のアミノ酸が、より嵩の低いアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、
当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−５〉 P450が〈１−４〉のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−６〉 P450が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換したポリペプチドである、〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−７〉 P450が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換したポリペプチドである、〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−８〉 P450が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換し、かつ269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換したポリペプチドである、〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−９〉フェレドキシンレダクターゼが次の(A)又は(B)のポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
〈１−１０〉フェレドキシンが次の(A)又は(B)のポリペプチドである〈１−１〉又は〈１−２〉に記載の融合モノオキシゲナーゼ：
(A) 配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(B) (A)のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すものである、ポリペプチド。
〈１−１１〉 P450のC末端側にフェレドキシンレダクターゼのN末端側が連結されている、〈１−１〉〜〈１―１０〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１２〉フェレドキシンレダクターゼのC末端側にフェレドキシンのN末端側が連結されている、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１３〉リンカーが２〜２０個のアミノ酸残基からなるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１４〉リンカーが２〜１０個のアミノ酸残基からなるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１５〉リンカーが３〜７個のアミノ酸残基からなるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１１〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１６〉リンカーが、親水性アミノ酸が構成アミノ酸の半数以上を占めるペプチドである、〈１−１〉〜〈１―１５〉の融合モノオキシゲナーゼ。
〈１−１７〉親水性アミノ酸が、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、チロシン、及びシステインからなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸である、〈１−１６〉の融合モノオキシゲナーゼ。1. Fusion monooxygenase <1-1> A fusion monooxygenase obtained by linking P450, ferredoxin reductase, and ferredoxin derived from a hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus in this order directly or via a linker.
<1-2> The fusion monooxygenase according to <1-1>, wherein the highly thermophilic bacterium of the genus Thermus is Thermus thermophilus.
<1-3> The fusion monooxygenase according to <1-1> or <1-2>, wherein P450 is the following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A), the polypeptide comprising the polypeptide, ferredoxin reductase And a fusion monooxygenase obtained by linking ferredoxin directly or via a linker in this order from the N-terminal side, exhibits a monooxygenase activity.
<1-4> In the amino acid sequence of P450, SEQ ID NO: 1, 65 to 72 amino acid region, 150 to 157 amino acid region, 176 to 198 amino acid region, 207 to 240 amino acid region, and 269 to 276 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids belonging to at least one amino acid region selected from the group consisting of the second amino acid regions are substituted with lower bulk amino acids,
The polypeptide is a polypeptide in which a fusion monooxygenase obtained by linking the polypeptide, ferredoxin reductase, and ferredoxin from the N-terminal side in this order directly or via a linker exhibits a monooxygenase activity <1-1> Or the fusion monooxygenase as described in <1-2>.
<1-5> Polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of the polypeptide in which P450 is <1-4>, <1-1> or <1-2, wherein the polypeptide, ferredoxin reductase, and fusion monooxygenase obtained by linking ferredoxin and ferredoxin in this order from the N-terminal side directly or via a linker are polypeptides exhibiting monooxygenase activity. The fusion monooxygenase described in>.
<1-6> A polypeptide in which P450 is a polypeptide obtained by substituting the 67th glutamic acid and the 68th tyrosine with glycine and isoleucine, respectively, in the amino acid sequence of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 1-2>. The fusion monooxygenase according to <1-2>.
<1-7> P1-1 is a polypeptide obtained by substituting phenylalanine and alanine for the 269th tryptophan and the 270th isoleucine in the amino acid sequence of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, <1-1>1-2>. The fusion monooxygenase according to <1-2>.
<1-8> In the amino acid sequence of the polypeptide in which P450 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 269th tryptophan and 270th isoleucine are substituted with phenylalanine and alanine, respectively, and 269th tryptophan and 270th isoleucine are substituted. The fusion monooxygenase according to <1-1> or <1-2>, which is a polypeptide substituted with phenylalanine and alanine, respectively.
<1-9> The fusion monooxygenase according to <1-1> or <1-2>, wherein the ferredoxin reductase is the following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(B) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A), the polypeptide comprising P450, the polypeptide, And a fusion monooxygenase obtained by linking ferredoxin directly or via a linker in this order from the N-terminal side, exhibits a monooxygenase activity.
<1-10> The fusion monooxygenase according to <1-1> or <1-2>, wherein the ferredoxin is a polypeptide of the following (A) or (B):
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(B) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A), the polypeptide comprising P450, ferredoxin reductase, and A polypeptide in which a fusion monooxygenase formed by linking the polypeptide from the N-terminal side in this order directly or via a linker exhibits monooxygenase activity.
<1-11> The fusion monooxygenase of <1-1> to <1-10>, wherein the N-terminal side of ferredoxin reductase is linked to the C-terminal side of P450.
<1-12> The fusion monooxygenase of <1-1> to <1-11>, wherein the N-terminal side of ferredoxin is linked to the C-terminal side of ferredoxin reductase.
<1-13> The fusion monooxygenase according to <1-1> to <1-11>, wherein the linker is a peptide composed of 2 to 20 amino acid residues.
<1-14> The fusion monooxygenase according to <1-1> to <1-11>, wherein the linker is a peptide composed of 2 to 10 amino acid residues.
<1-15> The fusion monooxygenase according to <1-1> to <1-11>, wherein the linker is a peptide composed of 3 to 7 amino acid residues.
<1-16> The fusion monooxygenase according to <1-1> to <1-15>, wherein the linker is a peptide in which a hydrophilic amino acid accounts for more than half of the constituent amino acids.
<1-17> The hydrophilic amino acid is at least one amino acid selected from the group consisting of asparagine, serine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, threonine, arginine, histidine, lysine, tyrosine, and cysteine. -16> fusion monooxygenase.

２．融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA等
〈２−１〉１．のいずれかに記載の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA。
〈２−２〉〈２−１〉のDNAを導入した微生物。
〈２−３〉〈２−２〉の微生物、又はその微生物から得られる培養物から融合モノオキシゲナーゼを採取する工程を含む、融合モノオキシゲナーゼの生産方法。2. DNA encoding fusion monooxygenase <2-1> DNA which codes the fusion monooxygenase in any one of.
<2-2> A microorganism into which the DNA of <2-1> has been introduced.
<2-3> A method for producing a fusion monooxygenase, comprising a step of collecting the fusion monooxygenase from the microorganism of <2-2> or a culture obtained from the microorganism.

３．酸化物の生産方法
〈３−１〉１．のいずれかに記載の融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に対して酸素を添加することによりその酸化物を得る工程を含む、酸化物の生産方法。
〈３−２〉基質がβ−カロテンである〈３−１〉の生産方法。
〈３−３〉基質がテストステロンである〈３−１〉の生産方法。
〈３−４〉基質がアミノピリンである〈３−１〉の生産方法。
〈３−５〉基質がアラキドン酸である〈３−１〉の生産方法。
〈３−６〉基質がポリ塩化ビフェニル（PCB）である〈３−１〉の生産方法。3. Production method of oxide <3-1> A method for producing an oxide, comprising a step of obtaining the oxide by adding oxygen to a substrate using the fusion monooxygenase according to any one of the above.
<3-2> The production method of <3-1>, wherein the substrate is β-carotene.
<3-3> The production method of <3-1>, wherein the substrate is testosterone.
<3-4> The production method of <3-1>, wherein the substrate is aminopyrine.
<3-5> The production method of <3-1>, wherein the substrate is arachidonic acid.
<3-6> The production method of <3-1>, wherein the substrate is polychlorinated biphenyl (PCB).

本発明の融合モノオキシゲナーゼは、高度好熱性細菌由来のP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンを連結した融合モノオキシゲナーゼであり、高いモノオキシゲナーゼ活性を有するだけでなく同時に熱耐性及び有機溶媒耐性を備えている。 The fusion monooxygenase of the present invention is a fusion monooxygenase linking P450, ferredoxin reductase, and ferredoxin derived from a highly thermophilic bacterium, and has not only high monooxygenase activity but also heat resistance and organic solvent resistance. .

また、本発明の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA等は、上記のような融合モノオキシゲナーゼを提供することができる。 Moreover, the DNA encoding the fusion monooxygenase of the present invention can provide the fusion monooxygenase as described above.

さらに、本発明の酸化物の生産方法は、上記のような融合モノオキシゲナーゼを利用することにより、効率性に優れた酸化物の生産方法を提供することができる。 Furthermore, the oxide production method of the present invention can provide an oxide production method with excellent efficiency by utilizing the above-described fusion monooxygenase.

高度好熱性細菌由来のCYP175A1とラット由来のCYP1A1について、様々な濃度のDMSO存在下における有機溶媒耐性を調べた結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having investigated the organic-solvent tolerance in various concentrations of DMSO presence about CYP175A1 derived from a hyperthermophilic bacterium and CYP1A1 derived from a rat. 実施例１で作製された融合モノオキシゲナーゼ175RFをSDS-PAGEに供した結果を示す図面に変わる写真である。2 is a photograph instead of a drawing showing the result of subjecting the fusion monooxygenase 175RF produced in Example 1 to SDS-PAGE. 比較例１で作製された融合モノオキシゲナーゼ175FRをSDS-PAGEに供した結果を示す図面に変わる写真である。FIG. 5 is a photograph instead of a drawing showing the result of subjecting the fused monooxygenase 175FR produced in Comparative Example 1 to SDS-PAGE. 融合モノオキシゲナーゼ175RF、175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化反応を行わせ、その速度論的解析を行った結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having performed the hydroxylation reaction of (beta) -carotene, respectively using fusion monooxygenase 175RF, 175FR, and a reconstitution system, and performing the kinetic analysis. 融合モノオキシゲナーゼ175RF、175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化反応を行わせ、その酵素濃度とモノオキシゲナーゼ活性との関係を解析した結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having analyzed the relationship between the enzyme concentration and monooxygenase activity by performing the hydroxylation reaction of (beta) -carotene, respectively using fusion monooxygenase 175RF, 175FR, and a reconstitution system. 融合モノオキシゲナーゼ175RF、及び175FRを用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化反応を行わせ、そのモノオキシゲナーゼ活性のpH依存性を解析した結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having made hydroxylation reaction of (beta) -carotene each using the fusion monooxygenase 175RF and 175FR, and analyzing the pH dependence of the monooxygenase activity. 融合モノオキシゲナーゼ175RFの熱耐性を解析した結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of having analyzed the heat tolerance of fusion monooxygenase 175RF. 融合モノオキシゲナーゼ175RF、及び変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉をそれぞれ用いてテストステロンの水酸化反応を行わせ、その水酸化物の水酸化部位を解析した結果を示すクロマトグラムである。It is a chromatogram which shows the result of having hydroxylated the testosterone using each of the fusion monooxygenase 175RF and the mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I>, and analyzing the hydroxylation site of the hydroxide.

１．融合モノオキシゲナーゼ
本発明の融合モノオキシゲナーゼは、以下の通りである：
Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼ。1. Fusion monooxygenase The fusion monooxygenase of the present invention is as follows:
A fusion monooxygenase obtained by linking P450, ferredoxin reductase, and ferredoxin derived from a hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus in this order directly or via a linker from the N-terminal side.

本明細書において「高度好熱性細菌」とは、約75℃以上で生育可能な好熱性細菌をいう。生育至適温度が60℃以上である細菌が含まれる。 As used herein, “highly thermophilic bacterium” refers to a thermophilic bacterium that can grow at about 75 ° C. or higher. Includes bacteria with optimal growth temperature of 60 ° C or higher.

Thermus 属の高度好熱性細菌としては、例えばThermus thermophilus、Thermus aquaticus、Thermus flavus、Rhodothermus marinus、Thermus aquaticus及びThermus marinusのいずれかの種に属する高度好熱性細菌等が挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of the hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus include, but are not limited to, thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Rhodothermus marinus, Thermus aquaticus and Thermus marinus.

Thermus 属の高度好熱性細菌としては、産生される酵素の熱耐性という点では、とりわけThermus thermophilusが好ましい。Thermus thermophilusの菌株としては、例えば、HB8やHB27等が挙げられるが、これらに限定されない。 As the thermophilic bacterium of the genus Thermus, Thermus thermophilus is particularly preferable in view of the heat resistance of the produced enzyme. Examples of strains of Thermus thermophilus include, but are not limited to, HB8 and HB27.

Thermus thermophilus以外のThermus属の種の細菌であっても、高度好熱性細菌であれば本発明に用いることができる。とりわけ、ゲノムDNA配列が既に少なくとも部分的に解析されており、通常の方法に従って塩基配列の相同性を検索することによってP450を取得することができる状態となっている細菌であれば好ましい。そのような細菌としては、例えば、全ゲノム配列が明らかとなっているThermus aquaticus Y51MC23等が挙げられる。 Even bacteria of the genus Thermus other than Thermus thermophilus can be used in the present invention as long as they are highly thermophilic bacteria. In particular, it is preferable to use a bacterium in which the genomic DNA sequence has already been analyzed at least partially and P450 can be obtained by searching for the homology of the base sequence according to a usual method. Examples of such bacteria include Thermus aquaticus Y51MC23 whose entire genome sequence is known.

P450は、還元して一酸化炭素（CO）を結合させた時に450nm付近に特異的な吸収帯（ソーレー帯）を示すプロトヘムIX含有タンパク質である。機能的にはモノオキシゲナーゼ活性を有するものをいう。 P450 is a protoheme IX-containing protein that exhibits a specific absorption band (Soley band) around 450 nm when reduced to bind carbon monoxide (CO). Functionally, it has monooxygenase activity.

本明細書において「モノオキシゲナーゼ」とは、酸素分子のうち１原子の酸素を還元して１分子の水を作るとともに、残りの酸素原子を様々な基質に添加することにより水酸化物などの一酸素原子付加物、すなわち酸素化化合物（以下、単に「酸化物」ということがある。）を得る反応を触媒する酵素のことをいう。また、この触媒活性のことを「モノオキシゲナーゼ活性」という。また、本明細書において「融合モノオキシゲナーゼ」とは、P450モノオキシゲナーゼ系に属する酵素群が互いに連結したものであって、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するものをいう。
モノオキシゲナーゼ活性は、例えば本願明細書の実施例２のような方法によって測定することができる。P450の種類によっても異なるが、例えば、β−カロテン（β-carotene）、テストステロン（testosterone）、アミノピリン、アラキドン酸、及び多環芳香族等が基質となりうる。多環芳香族としては、例えばポリ塩化ビフェニル（PCB）、ダイオキシン、及びベンゾピレン等が基質となりうる。
P450として例えばThermus thermophilus由来のCYP175A1を用いる場合は、β−カロテンが基質となりうる（Blasco F, Kauffmann I & Schmid RD (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64, 671-674、Momoi K, Hofmann U, Schmid RD & Urlacher VB (2006) Biochem Biophys Res Commun 339, 331-336）。具体的には、β−カロテンの3-及び3’-位を水酸化する。In the present specification, “monooxygenase” means that one atom of oxygen molecules is reduced to form one molecule of water, and the remaining oxygen atoms are added to various substrates to form one hydroxide or the like. An enzyme that catalyzes a reaction for obtaining an oxygen atom adduct, that is, an oxygenated compound (hereinafter sometimes simply referred to as “oxide”). This catalytic activity is referred to as “monooxygenase activity”. In the present specification, “fusion monooxygenase” refers to a substance in which enzyme groups belonging to the P450 monooxygenase system are linked to each other and have monooxygenase activity.
The monooxygenase activity can be measured, for example, by a method as in Example 2 of the present specification. Although it varies depending on the type of P450, for example, β-carotene, testosterone, aminopyrine, arachidonic acid, polycyclic aromatic, and the like can be substrates. As the polycyclic aromatic, for example, polychlorinated biphenyl (PCB), dioxin, benzopyrene and the like can be used as a substrate.
For example, when CYP175A1 derived from Thermus thermophilus is used as P450, β-carotene can be a substrate (Blasco F, Kauffmann I & Schmid RD (2004) Appl Microbiol Biotechnol 64, 671-674, Momoi K, Hofmann U, Schmid RD & Urlacher VB (2006) Biochem Biophys Res Commun 339, 331-336). Specifically, the 3- and 3′-positions of β-carotene are hydroxylated.

P450としては、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来する野生型のP450を用いてもよいし、改変を加えた改変型のP450を用いてもよい。限定されないが、改変としては例えば、野生型のP450のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドを挙げることができる。このようなポリペプチドを用いることで、本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。 As P450, a wild-type P450 derived from a hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus may be used, or a modified P450 with a modification may be used. Examples of modifications include, but are not limited to, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of wild-type P450, the polypeptide, ferredoxin reductase, And a polypeptide in which a fusion monooxygenase formed by linking ferredoxin directly or via a linker in this order from the N-terminal side exhibits a monooxygenase activity. By using such a polypeptide, a fusion monooxygenase having the effects of the present invention can be constructed.

また、野生型のP450に適当なアミノ酸変異を導入すること等によってその基質特異性を変化させ、野生型では基質となりえなかった物質を新たに基質とするような変異型のP450を生産することもできる。そのような変異型のP450も野生型のP450と同様に本発明においてP450として用いることができる。 In addition, by introducing appropriate amino acid mutations into wild-type P450, etc., to change its substrate specificity, and to produce mutant P450 that uses a substance that could not be a substrate in wild-type as a new substrate You can also. Such mutant P450 can also be used as P450 in the present invention, like wild-type P450.

そのような変異としては、例えばP450の基質認識部位中の適当な１個又は複数個のアミノ酸に対してアミノ酸変異を導入することが挙げられる。基質認識部位は、例えば本発明においてP450としてCYP175A1を用いる場合、B’ helix (65〜72番目のアミノ酸領域)、F helix (150〜170番目のアミノ酸領域)、G helix (176〜198番目のアミノ酸領域)、I helix (207〜240番目のアミノ酸領域)、及びβ-strand 1〜4 (269〜276番目のアミノ酸領域）である。 Examples of such mutation include introduction of an amino acid mutation into one or more appropriate amino acids in the substrate recognition site of P450. For example, when CYP175A1 is used as P450 in the present invention, the substrate recognition site is B 'helix (65th to 72nd amino acid region), F helix (150th to 170th amino acid region), G helix (176th to 198th amino acid). Region), I helix (207th to 240th amino acid region), and β-strand 1 to 4 (269th to 276th amino acid region).

基質特異性を変化させる方法としては例えば、基質認識部位のポケット様構造をより拡張することにより基質認識特異性を変化させることが挙げられる。具体的には、基質認識部位中の適当なアミノ酸に対して、より嵩の低いアミノ酸に置換すること等が挙げられる。比較的嵩の高いアミノ酸分子をより嵩の低いアミノ酸に置換することが好ましい。置換部位としては、B’ helix及びβ-strandに含まれるアミノ酸が好ましく、それらの領域中のグルタミン酸、チロシン、トリプトファン及びイソロイシンがさらに好ましい。置換部位としては、P450としてCYP175A1を用いる場合、例えば、67番目のグルタミン酸、68番目のチロシン、269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシン等が挙げられる。置換により新たに導入するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、フェニルアラニン及びイソロイシン等が挙げられる。 Examples of the method for changing the substrate specificity include changing the substrate recognition specificity by further expanding the pocket-like structure of the substrate recognition site. Specifically, for example, substitution of a suitable amino acid in the substrate recognition site with a less bulky amino acid may be mentioned. It is preferable to replace a relatively bulky amino acid molecule with a less bulky amino acid. As the substitution site, amino acids contained in B 'helix and β-strand are preferable, and glutamic acid, tyrosine, tryptophan and isoleucine in these regions are more preferable. As the substitution site, when CYP175A1 is used as P450, for example, the 67th glutamic acid, the 68th tyrosine, the 269th tryptophan, the 270th isoleucine and the like can be mentioned. Examples of amino acids newly introduced by substitution include glycine, alanine, phenylalanine, and isoleucine.

例えば、CYP175A1において(i) 67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換した変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）、(ii) 269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（W269P、I270A）、及び(iii) 67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに、かつ269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）では、野生型では基質とならない、テストステロン、アミノピリン等を代謝できるようになる。具体的には、これらの変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）、変異型CYP175A1（W269P、I270A）及び変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）はテストステロンの２β位での水酸化やアミノピリンのジメチルアミノ基のメチル基脱離を触媒することができる。 For example, in CYP175A1, (i) mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I) in which 67th glutamic acid and 68th tyrosine are replaced with glycine and isoleucine, respectively, (ii) 269th tryptophan and 270th isoleucine in phenylalanine and alanine, respectively. CYP175A1 (W269P, I270A), and (iii) 67th glutamic acid and 68th tyrosine were replaced with glycine and isoleucine, and 269th tryptophan and 270th isoleucine were replaced with phenylalanine and alanine, respectively. Mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I, W269P, I270A) can metabolize testosterone, aminopyrine, etc., which are not substrates in the wild type. Specifically, these mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I), mutant CYP175A1 (W269P, I270A) and mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I, W269P, I270A) are hydroxylated at the 2β position of testosterone and dimethyl aminopyrine. It can catalyze the elimination of the methyl group of the amino group.

また、変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）及び変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）は野生型では基質とならないテストステロンを代謝できるようになる。具体的には、この変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）及び変異型CYP175A1（Q67G、Y68I、W269P、I270A）はテストステロンの6β位、16α位、及び2β位を水酸化することができる。 Mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I) and mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I, W269P, I270A) can metabolize testosterone which is not a substrate in the wild type. Specifically, this mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I) and mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I, W269P, I270A) can hydroxylate the 6β-position, 16α-position, and 2β-position of testosterone.

様々な物質を代謝することができ、比較的基質認識特異性が元来低いと思われる特定のP450の基質認識部位の構造に近付けることによっても、基質認識特異性を変化させることができる。例えば、常温細菌由来のP450であるP450BM3は様々な物質を代謝できることで知られる。例えば本発明においてP450としてCYP175A1を用いる場合、P450BM3とCYP175A1の基質認識部位を互いに対比すると、大きく相違しているアミノ酸として67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンが挙げられる。これらアミノ酸をそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換した変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）では、野生型では基質とならないテストステロン及びアミノピリンを代謝できるようになる。具体的には、この変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）はテストステロンの6β位、16α位、及び2β位を水酸化することができる。また、この変異型CYP175A1（Q67G、Y68I）はアミノピリンのメチル基を脱離することができる。 A variety of substances can be metabolized, and the substrate recognition specificity can also be changed by approaching the structure of a specific P450 substrate recognition site, which has a relatively low substrate recognition specificity. For example, P450BM3, a P450 derived from cold bacteria, is known to be capable of metabolizing various substances. For example, when CYP175A1 is used as P450 in the present invention, when the substrate recognition sites of P450BM3 and CYP175A1 are compared with each other, amino acids that are greatly different include 67th glutamic acid and 68th tyrosine. Mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I) in which these amino acids are substituted with glycine and isoleucine, respectively, can metabolize testosterone and aminopyrine, which are not substrates in the wild type. Specifically, this mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I) can hydroxylate the 6β-position, 16α-position, and 2β-position of testosterone. In addition, this mutant CYP175A1 (Q67G, Y68I) can remove the methyl group of aminopyrine.

また、ラット由来のP450であるCYP1A1に関する報告ではあるが、240番目のフェニルアラニンをアラニンに置換することによって野生型では基質とならない2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（2,3,7,8-TetraCDD）を代謝できるようになったという報告もある（Shinkyo et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 584-590）。 In addition, although there is a report on rat-derived P450 CYP1A1, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,2, which is not a substrate in the wild type by replacing the 240th phenylalanine with alanine) 7,8-TetraCDD) has been reported (Shinkyo et al. (2006) Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 584-590).

Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450としては、Thermus thermophilus HB27由来のP450であるCYP175A1を好ましく用いることができる。このCYP175A1のアミノ酸配列を配列番号１に、それをコードする核酸配列を配列番号２に示す。 As P450 derived from the hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus, CYP175A1, which is P450 derived from Thermus thermophilus HB27, can be preferably used. The amino acid sequence of this CYP175A1 is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleic acid sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 2.

Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450としては、CYP175A1のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、当該ポリペプチド、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドも用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、CYP175A1を用いた場合と同様に、本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。 P450 derived from Thermus genus hyperthermophilic bacteria is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of CYP175A1, and the polypeptide, ferredoxin A polypeptide in which a fusion monooxygenase obtained by linking reductase and ferredoxin from the N-terminal side in this order directly or via a linker exhibits monooxygenase activity can also be used. By using such a polypeptide, a fusion monooxygenase exhibiting the effects of the present invention can be constructed as in the case of using CYP175A1.

フェレドキシンレダクターゼ（FdR）は、酸化型フェレドキシンを還元することにより還元型フェレドキシンを生成することができる酵素である。この生成反応にはNADPHなどが必要である。 Ferredoxin reductase (FdR) is an enzyme that can produce reduced ferredoxin by reducing oxidized ferredoxin. This production reaction requires NADPH and the like.

フェレドキシンレダクターゼとしては、特に限定されないが、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するもの等を用いることができる。また、野生型フェレドキシンレダクターゼの他、野生型フェレドキシンレダクターゼにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示す改変型フェレドキシンレダクターゼも用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、野生型フェレドキシンレダクターゼを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。 Although it does not specifically limit as ferredoxin reductase, What originates in the hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus etc. can be used. In addition to wild-type ferredoxin reductase, a polypeptide in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in wild-type ferredoxin reductase, and P450, the polypeptide and ferredoxin are added in this order from the N-terminal side. It is also possible to use a modified ferredoxin reductase in which a fused monooxygenase linked directly or via a linker exhibits monooxygenase activity. By using such a polypeptide, a fusion monooxygenase having the effects of the present invention can be constructed in the same manner as when wild-type ferredoxin reductase is used.

フェレドキシンレダクターゼの由来は、特に限定されないが、P450の由来と同一であれば好ましい。 The origin of ferredoxin reductase is not particularly limited, but is preferably the same as that of P450.

フェレドキシン（Fdx）は、補欠分子族として非ヘム鉄と無機硫黄からなる酸化還元中心を持ち、電子伝達体として機能する鉄−硫黄タンパク質の総称である。 Ferredoxin (Fdx) is a general term for iron-sulfur proteins that have a redox center consisting of non-heme iron and inorganic sulfur as a prosthetic group and function as an electron carrier.

フェレドキシンとしては、特に限定されないが、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するもの等を用いることができる。また、野生型フェレドキシンの他、野生型フェレドキシンにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドであって、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示す改変型フェレドキシンも用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、野生型フェレドキシンを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。 Ferredoxin is not particularly limited, and ferredoxin derived from a highly thermophilic bacterium of the genus Thermus can be used. In addition to wild-type ferredoxin, it is a polypeptide in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in wild-type ferredoxin, and P450, ferredoxin reductase, and the polypeptide in this order from the N-terminal side. A modified ferredoxin in which a fused monooxygenase linked directly or via a linker exhibits monooxygenase activity can also be used. By using such a polypeptide, a fusion monooxygenase having the effects of the present invention can be constructed in the same manner as when wild-type ferredoxin is used.

フェレドキシンの由来は、特に限定されないが、P450の由来と同一であれば好ましい。 The origin of ferredoxin is not particularly limited, but is preferably the same as that of P450.

本発明者は、Thermus 属の代表的種であるThermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼ及び同由来のフェレドキシンが、同由来のCYP175A1に電子を供給する電子伝達系として機能することをはじめて明らかにしている。本発明においては、このThermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼ及び同由来のフェレドキシンを、CYP175A1との組み合わせにおいて好ましく用いることができる。このThermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列を配列番号３に、それをコードする核酸配列を配列番号４に示す。同由来のフェレドキシンのアミノ酸配列を配列番号５に、それをコードする核酸配列を配列番号６に示す。 The present inventor has clarified for the first time that ferredoxin reductase derived from Thermus thermophilus, which is a representative species of the genus Thermus, and ferredoxin derived therefrom function as an electron transfer system for supplying electrons to CYP175A1 of the same origin. In the present invention, the ferredoxin reductase derived from Thermus thermophilus and the same ferredoxin can be preferably used in combination with CYP175A1. The amino acid sequence of ferredoxin reductase derived from Thermus thermophilus is shown in SEQ ID NO: 3, and the nucleic acid sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 4. The amino acid sequence of ferredoxin derived from the same is shown in SEQ ID NO: 5, and the nucleic acid sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 6.

フェレドキシンレダクターゼとしては、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列（配列番号３）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、P450、当該ポリペプチド、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドもCYP175A1若しくはその改変体との組み合わせにおいて好ましく用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンレダクターゼを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。 Ferredoxin reductase is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of ferredoxin reductase derived from Thermus thermophilus (SEQ ID NO: 3), comprising P450, A polypeptide in which a fusion monooxygenase obtained by linking a peptide and ferredoxin directly in this order from the N-terminal side or via a linker exhibits a monooxygenase activity can also be preferably used in combination with CYP175A1 or a variant thereof. By using such a polypeptide, a fusion monooxygenase that exhibits the effects of the present invention can be constructed in the same manner as when ferredoxin reductase derived from Thermus thermophilus is used.

また、フェレドキシンとしては、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンのアミノ酸配列（配列番号５）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及び当該ポリペプチドをN末端側からこの順で直接又はリンカーを介して連結してなる融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を示すポリペプチドもCYP175A1若しくはその改変体との組み合わせにおいて好ましく用いることができる。このようなポリペプチドを用いることで、Thermus thermophilus由来のフェレドキシンを用いた場合と同様に本発明の効果を奏する融合モノオキシゲナーゼを構成することができる。 Ferredoxin is a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of Thermus thermophilus, and P450, ferredoxin reductase In addition, a polypeptide in which a fusion monooxygenase obtained by linking the polypeptide directly from the N-terminal side in this order or via a linker exhibits monooxygenase activity can also be preferably used in combination with CYP175A1 or a variant thereof. By using such a polypeptide, a fusion monooxygenase that exhibits the effects of the present invention can be constructed in the same manner as when ferredoxin derived from Thermus thermophilus is used.

P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをN末端側からこの順で連結してなる融合モノオキシゲナーゼは、好ましくはP450のC末端側にフェレドキシンレダクターゼのN末端側が、そして、フェレドキシンレダクターゼのC末端側にフェレドキシンのN末端側が、それぞれ連結したものである。しかしながら、モノオキシゲナーゼ活性を有する限り、P450のC末端側にフェレドキシンレダクターゼのC末端側が連結している融合モノオキシゲナーゼであってもよい。また、これと同様に、フェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの連結においても、連結により構成される融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、フェレドキシンレダクターゼのいずれのペプチド末端側にフェレドキシンのいずれのペプチド末端側が連結されていてもよい。 The fusion monooxygenase comprising P450, ferredoxin reductase, and ferredoxin linked in this order from the N-terminal side is preferably the N-terminal side of ferredoxin reductase on the C-terminal side of P450 and the ferredoxin on the C-terminal side of ferredoxin reductase. The N-terminal side is linked. However, as long as it has monooxygenase activity, it may be a fusion monooxygenase in which the C-terminal side of ferredoxin reductase is linked to the C-terminal side of P450. Similarly, in the connection of ferredoxin reductase and ferredoxin, any peptide terminal side of ferredoxin is connected to any peptide terminal side of ferredoxin reductase as long as the fusion monooxygenase constituted by the connection has monooxygenase activity. It may be.

P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンを直接連結してなる融合モノオキシゲナーゼとは、これらのポリペプチドが互いに他のアミノ酸、ペプチドその他の構造を介することなく直接に連結している融合モノオキシゲナーゼのことをいう。 P450, ferredoxin reductase, and a fusion monooxygenase obtained by directly linking ferredoxin refers to a fusion monooxygenase in which these polypeptides are directly linked to each other without intervening other amino acids, peptides or other structures. .

リンカーは、融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、いかなる構造であってもよい。融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を発揮する上では、連結される各ポリペプチドが比較的自由に動くことができることが好ましい。したがって、リンカーとしては各ポリペプチドが比較的自由に動くことができるような構造が好ましい。例えば、ペプチド、アミノ酸、炭素鎖、その他の化学構造であってもよい。 The linker may be any structure as long as the fusion monooxygenase has monooxygenase activity. In order for the fusion monooxygenase to exhibit monooxygenase activity, it is preferable that each linked polypeptide can move relatively freely. Accordingly, the linker preferably has a structure in which each polypeptide can move relatively freely. For example, it may be a peptide, amino acid, carbon chain, or other chemical structure.

融合モノオキシゲナーゼの生産のし易さという観点では、リンカーはペプチドであることが好ましい。リンカーをペプチドとし、融合モノオキシゲナーゼを全体としてポリペプチドとして構成すれば、それをコードする遺伝子を微生物に導入し大量発現させることにより当該ポリペプチドを容易に生産することができる。リンカーとしてペプチドを用いる場合、当該ペプチドのアミノ酸残基数は融合モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を有する限り、いくらであってもよい。各ポリペプチドの動きやすさという観点では、アミノ酸残基数は２〜２０個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、３〜７個がさらにより好ましい。また、各ポリペプチドの動きやすさという観点では、リンカーとなるペプチドが、親水性アミノ酸が構成アミノ酸の半数以上を占めるものであることが好ましい。親水性アミノ酸とは、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リシン、チロシン、及びシステインをいう。 In terms of ease of production of the fusion monooxygenase, the linker is preferably a peptide. When the linker is a peptide and the fusion monooxygenase is constituted as a polypeptide as a whole, the polypeptide can be easily produced by introducing a gene encoding it into a microorganism and expressing it in large quantities. When a peptide is used as the linker, the number of amino acid residues of the peptide is not particularly limited as long as the fusion monooxygenase has monooxygenase activity. In terms of ease of movement of each polypeptide, the number of amino acid residues is preferably 2-20, more preferably 2-10, and even more preferably 3-7. From the viewpoint of ease of movement of each polypeptide, it is preferable that the peptide serving as a linker is a hydrophilic amino acid that occupies more than half of the constituent amino acids. Hydrophilic amino acids refer to asparagine, serine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, threonine, arginine, histidine, lysine, tyrosine, and cysteine.

２．融合モノオキシゲナーゼをコードするDNA等
本発明の融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAは、上で説明した融合モノオキシゲナーゼのうち、全体としてポリペプチドとして構成されている融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAである。2. DNA encoding a fusion monooxygenase, etc. The DNA encoding the fusion monooxygenase of the present invention is a DNA encoding a fusion monooxygenase which is constituted as a polypeptide as a whole among the fusion monooxygenases described above. It is.

本発明の、融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAを導入した微生物は、そのDNAで形質転換された微生物である。形質転換は、例えば、DNAを一過的に又は安定的に発現させる発現ベクターを用いて行うことができる。発現ベクターの作製、導入対象となる微生物の選択、及び導入方法は、公知の手法に従い行うことができる（例えば、Sambrook, J., Russel, D. W., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001等を参照。）。例えば発現ベクターとしては、ファージ、ファージミドベクター、又はプラスミドベクターを用いることができる。また、導入対象となる微生物としては、発現ベクターが機能するものであればよく特に限定されないが、例えば、細菌、放線菌、又は酵母等を用いることができる。細菌としては、扱いやすさ等の観点から、大腸菌、又は枯草菌が好ましい。 The microorganism into which the DNA encoding the fusion monooxygenase of the present invention is introduced is a microorganism transformed with the DNA. Transformation can be performed using, for example, an expression vector that allows DNA to be expressed transiently or stably. Production of expression vectors, selection of microorganisms to be introduced, and introduction methods can be performed according to known methods (for example, Sambrook, J., Russel, DW, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, (See 2001 etc.). For example, as an expression vector, a phage, a phagemid vector, or a plasmid vector can be used. In addition, the microorganism to be introduced is not particularly limited as long as the expression vector functions. For example, bacteria, actinomycetes, yeasts, and the like can be used. As the bacterium, Escherichia coli or Bacillus subtilis is preferable from the viewpoint of ease of handling.

本発明の、融合モノオキシゲナーゼの生産方法は、上記の通り融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAを導入した微生物、又はその微生物から得られる培養物から融合モノオキシゲナーゼを採取する工程を含む、融合モノオキシゲナーゼの生産方法である。 The method for producing a fusion monooxygenase of the present invention comprises a step of collecting a fusion monooxygenase from a microorganism into which DNA encoding the fusion monooxygenase has been introduced as described above, or a culture obtained from the microorganism. It is a production method.

採取する工程は、前記DNAを導入した微生物を粉砕した後、通常の方法に従って行うことができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、若しくはアフィニティークロマトグラフィー等の、タンパク質精製の分野において汎用されている方法に従って精製することができる。 The step of collecting can be performed according to a normal method after pulverizing the microorganism into which the DNA has been introduced. For example, it can be purified according to a method widely used in the field of protein purification, such as ion exchange chromatography, partition chromatography, gel permeation chromatography, or affinity chromatography.

本発明の融合モノオキシゲナーゼは、精製工程における活性低下を回避するため精製せずに使用することもできる。酵素活性の高さを重視する反応においては、未精製で使用するのが好ましい。 The fusion monooxygenase of the present invention can be used without purification in order to avoid a decrease in activity in the purification process. In a reaction in which high enzyme activity is emphasized, it is preferable to use it without purification.

３．酸化物の生産方法
本発明の、酸化物の生産方法は、本発明の融合モノオキシゲナーゼを用いて基質に酸素を添加することによりその酸化物を得る工程を含む方法である。3. Oxide Production Method The oxide production method of the present invention is a method comprising a step of obtaining an oxide by adding oxygen to a substrate using the fusion monooxygenase of the present invention.

P450の種類によっても異なるが、例えば、β−カロテン（β-carotene）、テストステロン（testosterone）、アミノピリン、アラキドン酸、及び多環芳香族等が基質となりうる。多環芳香族としては、例えばポリ塩化ビフェニル（PCB）、ダイオキシン、及びベンゾピレン等が基質となりうる。 Although it varies depending on the type of P450, for example, β-carotene, testosterone, aminopyrine, arachidonic acid, polycyclic aromatic, and the like can be substrates. As the polycyclic aromatic, for example, polychlorinated biphenyl (PCB), dioxin, benzopyrene and the like can be used as a substrate.

反応条件は、P450の種類によって適宜決定することができる。pHに関しては好ましくはpH2〜11であり、より好ましくはpH4〜9であり、さらにより好ましくはpH5〜8である。温度に関しては好ましくは20〜100℃であり、より好ましくは20〜80℃であり、さらにより好ましくは20〜70℃である。また、電子供与体として例えばNADPHまたはNADHが必要である。長時間反応させる場合などに、P450をより安定化させる観点から、グリセロール存在下で反応させることもできる。この場合、グリセロールの濃度は好ましくは1〜40容量％であり、より好ましくは5〜30容量％であり、さらにより好ましくは10〜20容量％である。グリセロールの不存在下でも、反応を行うことができる。
有機溶媒の存在下で反応を行う場合は、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、及びDMSO等を使用できる。有機溶媒濃度は、好ましくは1〜50容量％であり、より好ましくは3〜30容量％であり、さらにより好ましくは5〜20容量％である。The reaction conditions can be appropriately determined depending on the type of P450. Regarding pH, it is preferably pH 2 to 11, more preferably pH 4 to 9, and still more preferably pH 5 to 8. The temperature is preferably 20 to 100 ° C, more preferably 20 to 80 ° C, and still more preferably 20 to 70 ° C. Further, for example, NADPH or NADH is required as an electron donor. In the case of reacting for a long time, the reaction can be performed in the presence of glycerol from the viewpoint of further stabilizing P450. In this case, the concentration of glycerol is preferably 1 to 40% by volume, more preferably 5 to 30% by volume, and even more preferably 10 to 20% by volume. The reaction can be carried out even in the absence of glycerol.
When the reaction is performed in the presence of an organic solvent, for example, methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, DMSO, and the like can be used. The organic solvent concentration is preferably 1 to 50% by volume, more preferably 3 to 30% by volume, and even more preferably 5 to 20% by volume.

以下に試験例及び実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to test examples and examples, but the present invention is not limited to the following examples.

試験例１：Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450の有機溶媒耐性
［目的］Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450の有機溶媒耐性を評価した。 Test Example 1: Resistance of organic solvent to P450 derived from highly thermophilic bacterium of the genus Thermus [Purpose] Resistance to organic solvent of P450 derived from highly thermophilic bacterium of the genus Thermus was evaluated.

［方法］Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450として、Thermus thermophilus由来のCYP175A1を使用した。CYP175A1のアミノ酸配列を配列番号１に、CYP175A1をコードするDNAの塩基配列を配列番号２に示す。
また、対照としてラット由来P450であるCYP1A1を使用した。
まず、10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 中にCYP175A1タンパク質またはCYP1A1タンパク質を加えた後、0%から90%になるようにDMSO（和光純薬工業株式会社）をそれぞれ加え (total volume: 100 μl)、25℃で30分間インキュベートした。
次に、インキュベートしたサンプルを50μlずつ2本の試験管に分注し、それぞれ950μlの10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) を加えてCO差スペクトルを測定した。
最後に、各DMSO濃度における450 nmの吸光度を測定することで有機溶媒耐性を評価した。DMSO濃度が0%の時の450 nmの吸光度を100%として、DMSO濃度を段階的に上げていき、各濃度における残存活性を算出した。[Method] CYP175A1 derived from Thermus thermophilus was used as P450 derived from the thermophilic bacterium of the genus Thermus. The amino acid sequence of CYP175A1 is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of DNA encoding CYP175A1 is shown in SEQ ID NO: 2.
In addition, CYP1A1, rat-derived P450, was used as a control.
First, after adding CYP175A1 protein or CYP1A1 protein in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 10% glycerol, DMSO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to adjust the concentration from 0% to 90%. (total volume: 100 μl) and incubated at 25 ° C. for 30 minutes.
Next, 50 μl of the incubated sample was dispensed into two test tubes, 950 μl of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 10% glycerol was added, and the CO difference spectrum was measured.
Finally, the organic solvent resistance was evaluated by measuring the absorbance at 450 nm at each DMSO concentration. The absorbance at 450 nm when the DMSO concentration was 0% was taken as 100%, the DMSO concentration was increased stepwise, and the residual activity at each concentration was calculated.

［考察］結果を図１に示す。ラット由来P450のCYP1A1は20%のDMSO存在下で活性が50%にまで低下した。これに対して、Thermus 属の高度好熱性細菌に由来するP450であるCYP175A1はDMSO濃度を70%まで上昇させたときに初めて50%まで低下した。これらの結果より、CYP175A1がCYP1A1よりも極めて高い有機溶媒耐性を持ち、高濃度の有機溶媒中でも活性を保つことができることが明らかとなった。 [Discussion] The results are shown in FIG. Rat-derived P450 CYP1A1 decreased to 50% in the presence of 20% DMSO. In contrast, CYP175A1, a P450 derived from a hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus, decreased to 50% for the first time when the DMSO concentration was increased to 70%. From these results, it was revealed that CYP175A1 has extremely higher organic solvent resistance than CYP1A1 and can maintain activity even in a high concentration of organic solvent.

実施例１：融合モノオキシゲナーゼの作製
本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。 Example 1: Production of fusion monooxygenase The fusion monooxygenase of the present invention was produced as follows.

（１）融合モノオキシゲナーゼをコードするDNAの設計
Thermus thermophilus由来のCYP175A1に、同由来のフェレドキシンレダクターゼ（FdR）、及び同由来のフェレドキシン（Fdx）をN末端側からこの順で連結させて融合タンパク質（本明細書において、「融合モノオキシゲナーゼ175RF」、又は単に「175RF」ということもある。）を作製した。各タンパク質の移動が自由に行えるようにするため、比較的小さな側鎖を持ち、さらに、親水的な性質を持つアミノ酸5つから構成されたリンカー配列で各タンパク質同士を連結した。FdRとFdxとの間はリンカー配列としてThr-Ser-Gly-Asp-Alaを用い、CYP175A1とFdx又はFdRとの間はリンカー配列としてAla-Asp-Gly-Thr-Serを用いた。(1) Design of DNA encoding fusion monooxygenase
CYP175A1 derived from Thermus thermophilus is linked to ferredoxin reductase (FdR) of the same origin and ferredoxin (Fdx) of the same origin in this order from the N-terminal side to form a fusion protein (in this specification, “fusion monooxygenase 175RF”, Or simply “175RF”). In order to allow movement of each protein freely, each protein was linked with a linker sequence composed of five amino acids having relatively small side chains and hydrophilic properties. Thr-Ser-Gly-Asp-Ala was used as a linker sequence between FdR and Fdx, and Ala-Asp-Gly-Thr-Ser was used as a linker sequence between CYP175A1 and Fdx or FdR.

（２）大腸菌発現ベクターの構築
表１に示したプライマーを用いて融合モノオキシゲナーゼ175RFを作製した。FdRからstop codonを除去し、さらに、そのC末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-FdRを鋳型として、primer 8 (forward primer) 及びprimer 9 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をNdeI及びBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した(pET-FdR-TS)。次に、FdRのC末端側にFdxを融合させた酵素(RF)を作製するため、pET-Fdxを鋳型として、primer 10 (forward primer) 及びprimer 11 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をSpeI及びBamHIで切断後、pET-FdR-TSに挿入した (pET-FdR-Fdx)。作製したFdR-FdxのN末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-FdR-Fdxを鋳型として、 primer 12 (forward primer) 及びprimer 11 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した(pET-GTS-FdR-Fdx)。リンカー配列を挿入しFdR-FdxのN末端側にCYP175A1を融合させた酵素(融合モノオキシゲナーゼ175RF)を作製するため、pET-CYP175A1を鋳型としてprimer 6 (forward primer) 及びprimer 7 (reverse primer) を用いてPCRを行った。、PCR産物をNdeI及びKpnIで切断し、pET-GTS- FdR-Fdxに挿入した (pET-175RF)。全てのPCRはKOD Plus DNA polymeraseを用いて、94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件で行った。(2) Construction of E. coli expression vector Fusion monooxygenase 175RF was prepared using the primers shown in Table 1. In order to remove stop codon from FdR and insert a linker sequence on the C-terminal side thereof, PCR was performed using primer 8 (forward primer) and primer 9 (reverse primer) using pET-FdR as a template. The PCR product was cleaved with NdeI and BamHI and then inserted into the pET-21a vector (pET-FdR-TS). Next, PCR was performed using primer 10 (forward primer) and primer 11 (reverse primer) using pET-Fdx as a template to produce an enzyme (RF) that fused Fdx to the C-terminal side of FdR. . The PCR product was cleaved with SpeI and BamHI and then inserted into pET-FdR-TS (pET-FdR-Fdx). In order to insert a linker sequence on the N-terminal side of the prepared FdR-Fdx, PCR was performed using pET-FdR-Fdx as a template and primer 12 (forward primer) and primer 11 (reverse primer). The PCR product was cleaved with BamHI and then inserted into the pET-21a vector (pET-GTS-FdR-Fdx). In order to prepare an enzyme (fusion monooxygenase 175RF) in which a linker sequence is inserted and CYP175A1 is fused to the N-terminal side of FdR-Fdx, primer 6 (forward primer) and primer 7 (reverse primer) are used using pET-CYP175A1 as a template. PCR was performed. The PCR product was cleaved with NdeI and KpnI and inserted into pET-GTS-FdR-Fdx (pET-175RF). All PCRs were performed using KOD Plus DNA polymerase under conditions of 94 ° C., 5 minutes → (94 ° C., 30 seconds, 55 ° C., 30 seconds, 68 ° C., 2 minutes) × 30 cycles.

（３）融合モノオキシゲナーゼの精製
（２）で作製した大腸菌用発現ベクター（pET-175RF）を用いて、E. coli BL21 (DE3) Codon Plusを形質転換した。この形質転換体を50 μg/ml ampicillin（和光純薬工業株式会社）及び34 μg/ml chloramphenicol（和光純薬工業株式会社）を含むLB培地にて一晩振盪培養した。この培養液50 mlを50 μg/ml ampicillin及び34 μg/ml chloramphenicolを含んだ2×YT培地1Lに植菌し、OD600が0.8〜1.0になるまで37℃で振盪培養後、終濃度1.0 mMとなるようにIPTG（和光純薬工業株式会社）を添加した。さらに25℃で24時間振盪培養を行った後、5000×g、4℃にて15分間遠心を行い集菌し、得られた菌体は-80℃で保存した。(3) Purification of fusion monooxygenase E. coli BL21 (DE3) Codon Plus was transformed using the expression vector for Escherichia coli (pET-175RF) prepared in (2). This transformant was cultured with shaking overnight in an LB medium containing 50 μg / ml ampicillin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 34 μg / ml chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 50 ml of this culture solution was inoculated into 1 L of 2 × YT medium containing 50 μg / ml ampicillin and 34 μg / ml chloramphenicol, and after shaking culture at 37 ° C. until OD600 was 0.8 to 1.0, the final concentration was 1.0 mM. IPTG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added so as to be. After further shaking culture at 25 ° C. for 24 hours, the cells were collected by centrifugation at 5000 × g and 4 ° C. for 15 minutes, and the obtained cells were stored at −80 ° C.

得られた菌体を1 mM PMSF（和光純薬工業株式会社）を含んだbuffer A (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4, 10%グリセロール) に懸濁後、1 mg/mlになるようにリゾチームを加え4℃で30分間処理を行った。細胞懸濁液を超音波破砕した後、50,000×g、4℃にて30分間遠心分離を行い、細胞断片を沈殿させた。上清を硫酸アンモニウムを用いて分画(20-35%) した。ペレットを10%グリセロール、1 mM PMSF及び0.1% Emulgen 911（花王）を含んだ50 mM Tris-HCl (pH 8.5)に懸濁後、この懸濁液を1.0 Mの硫酸アンモニウムを含んだ buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10%グリセロール) で2倍希釈した。 The resulting bacterial cells are suspended in buffer A (50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4, 10% glycerol) containing 1 mM PMSF (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and then lysozyme to 1 mg / ml. And treated at 4 ° C. for 30 minutes. The cell suspension was sonicated and then centrifuged at 50,000 × g and 4 ° C. for 30 minutes to precipitate cell fragments. The supernatant was fractionated (20-35%) using ammonium sulfate. After suspending the pellet in 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) containing 10% glycerol, 1 mM PMSF and 0.1% Emulgen 911 (Kao), this suspension was added to buffer B (50 M containing 1.0 M ammonium sulfate. Dilute 2-fold with mM Tris-HCl, pH 8.0, 10% glycerol).

この希釈溶液を0.5 Mの硫酸アンモニウムを含んだbuffer Bで平衡化したbutyl Sepharose 4 Fast Flow column (Amersham Biosciences) に供した。カラムを0.5 M及び0.2 Mの硫酸アンモニウムを含んだbuffer Bで洗浄後、2.0%コール酸を含んだbuffer Bで融合酵素を溶出させた。Amicon Ultra（Millipore）を用いて10 mlまで濃縮後、濃縮液にEmulgen 911を最終濃度0.1%になるように加えた。この溶液をbuffer C (50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.3, 10%グリセロール) に対して透析した。 This diluted solution was applied to a butyl Sepharose 4 Fast Flow column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer B containing 0.5 M ammonium sulfate. The column was washed with buffer B containing 0.5 M and 0.2 M ammonium sulfate, and then the fusion enzyme was eluted with buffer B containing 2.0% cholic acid. After concentration to 10 ml using Amicon Ultra (Millipore), Emulgen 911 was added to the concentrate to a final concentration of 0.1%. This solution was dialyzed against buffer C (50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.3, 10% glycerol).

透析したサンプルを0.1% Emulgen 911を含んだbuffer Cで平衡化したMono S HR5/5 column（Amersham Biosciences）に供した。流速1 ml/minでKCl濃度を100 mMから600 mMまで直線勾配にて上昇させ、目的タンパク質を溶出させた。 The dialyzed sample was applied to a Mono S HR5 / 5 column (Amersham Biosciences) equilibrated with buffer C containing 0.1% Emulgen 911. The target protein was eluted by increasing the KCl concentration from 100 mM to 600 mM with a linear gradient at a flow rate of 1 ml / min.

この溶出タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
SDS化したサンプルは10% ポリアクリルアミドゲルにアプライし、SDS-PAGE泳動Buffer(25mM Tris, 192mM Glysine, 0.1% SDS)にて250V、20mA（定電流）で100分間電気泳動を行った。
このSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の電気泳動写真を図２に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２はE. coli粗抽出液、レーン３は硫酸アンモニウム分画（20〜35%）後の沈殿、レーン４はbutyl-sepharose溶出画分、そしてレーン５は Mono S溶出画分である。This eluted protein was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
The SDS-modified sample was applied to a 10% polyacrylamide gel, and subjected to electrophoresis for 100 minutes at 250 V, 20 mA (constant current) with SDS-PAGE electrophoresis buffer (25 mM Tris, 192 mM Glysine, 0.1% SDS).
An electrophoresis photograph of this SDS polyacrylamide gel electrophoresis is shown in FIG. Lane 1 is molecular weight marker, lane 2 is crude E. coli extract, lane 3 is precipitation after ammonium sulfate fractionation (20-35%), lane 4 is butyl-sepharose elution fraction, and lane 5 is Mono S elution fraction Minutes.

比較例１：融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉の作製
融合モノオキシゲナーゼ175RFの対照（本明細書において、「融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉」ということがある。）として、P450、フェレドキシン（Fdx）、及びフェレドキシンレダクターゼ（FdR）をN末端側からこの順で連結してなる融合モノオキシゲナーゼ（本明細書において、「融合モノオキシゲナーゼ175FR」、又は単に「175FR」ということもある。）を作製した。
表１に示したプライマーを用いて融合モノオキシゲナーゼ175FRを作製した。Fdxからstop codonを除去し、さらに、そのC末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-Fdxを鋳型として、primer 1 (forward primer) 及びprimer 2 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をNdeI及びBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した。次に、FdxのC末端側にFdRを融合させた酵素(FR)を作製するため、pET-FdRを鋳型として、primer 3 (forward primer) 及びprimer 4 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をSpeI及びBamHIで切断後、pET-Fdx-TSに挿入した (pET-Fdx-FdR)。作製したFdx-FdRのN末端側にリンカー配列を挿入するため、pET-Fdx-FdRを鋳型として、primer 5 (forward primer) 及びprimer 4 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をBamHIで切断後、pET-21aベクターに挿入した(pET-GTS-Fdx-FdR)。リンカー配列を挿入したFdx-FdRのN末端側にCYP175A1を融合させた酵素(融合モノオキシゲナーゼ175FR)を作製するため、pET-CYP175A1を鋳型としてprimer 6 (forward primer) 及びprimer 7 (reverse primer) を用いてPCRを行った。PCR産物をNdeI及びKpnIで切断後、pET-GTS- Fdx-FdRに挿入した (pET-175FR)。全てのPCRはKOD Plus DNA polymeraseを用いて、94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件で行った。
このようにして作製した発現ベクターを用いて、実施例１と同様な方法で、大腸菌を形質転換し、菌の培養を行い、得られた菌体からタンパク質を精製工程に付し、目的融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉タンパク質を溶出させた。 Comparative Example 1: Production of fusion monooxygenase <control> P450, ferredoxin (Fdx) as a control of fusion monooxygenase 175RF (sometimes referred to herein as "fusion monooxygenase <control>") , And ferredoxin reductase (FdR) were ligated in this order from the N-terminal side (in this specification, “fusion monooxygenase 175FR” or simply “175FR”).
Fusion monooxygenase 175FR was prepared using the primers shown in Table 1. In order to remove the stop codon from Fdx and insert a linker sequence on the C-terminal side thereof, PCR was performed using primer 1 (forward primer) and primer 2 (reverse primer) using pET-Fdx as a template. The PCR product was cleaved with NdeI and BamHI and then inserted into the pET-21a vector. Next, PCR was performed using primer 3 (forward primer) and primer 4 (reverse primer) using pET-FdR as a template to produce an enzyme (FR) fused with FdR on the C-terminal side of Fdx. . The PCR product was cleaved with SpeI and BamHI and then inserted into pET-Fdx-TS (pET-Fdx-FdR). In order to insert a linker sequence into the N-terminal side of the prepared Fdx-FdR, PCR was performed using pET-Fdx-FdR as a template and primer 5 (forward primer) and primer 4 (reverse primer). The PCR product was cleaved with BamHI and then inserted into the pET-21a vector (pET-GTS-Fdx-FdR). In order to prepare an enzyme (fusion monooxygenase 175FR) by fusing CYP175A1 to the N-terminal side of Fdx-FdR with a linker sequence inserted, primer 6 (forward primer) and primer 7 (reverse primer) were used using pET-CYP175A1 as a template. PCR was performed. The PCR product was cleaved with NdeI and KpnI and then inserted into pET-GTS-Fdx-FdR (pET-175FR). All PCRs were performed using KOD Plus DNA polymerase under conditions of 94 ° C., 5 minutes → (94 ° C., 30 seconds, 55 ° C., 30 seconds, 68 ° C., 2 minutes) × 30 cycles.
Using the expression vector thus prepared, Escherichia coli was transformed in the same manner as in Example 1, the bacteria were cultured, the protein was subjected to a purification step from the obtained cells, and the target fusion product Oxygenase <control> protein was eluted.

さらにこの溶出タンパク質を実施例１と同様な条件で、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
このSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の電気泳動写真を図３に示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２はE. coli粗抽出液、レーン３は硫酸アンモニウム分画（20〜35%）後の沈殿、レーン４はbutyl-sepharose溶出画分、そしてレーン５は Mono S溶出画分である。Furthermore, this eluted protein was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis under the same conditions as in Example 1.
An electrophoresis photograph of this SDS polyacrylamide gel electrophoresis is shown in FIG. Lane 1 is molecular weight marker, lane 2 is crude E. coli extract, lane 3 is precipitation after ammonium sulfate fractionation (20-35%), lane 4 is butyl-sepharose elution fraction, and lane 5 is Mono S elution fraction Minutes.

実施例２：融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産
実施例１で作製した融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いて基質を水酸化することにより、その水酸化物を得た。
なお、本実施例では基質としてβ−カロテンを用いた。 Example 2: Production of hydroxide using fusion monooxygenase The hydroxide was obtained by hydroxylating the substrate using the fusion monooxygenase 175RF produced in Example 1.
In this example, β-carotene was used as a substrate.

（１）融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産
β−カロテン（1〜80 μM）、融合モノオキシゲナーゼ175RF（15〜120nM）、NADPH（1 mM）、及び10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH5〜8) 中で水酸化反応を行った。反応は65℃で2分間行った。(1) Production of hydroxide using fusion monooxygenase 50 mM potassium containing β-carotene (1-80 μM), fusion monooxygenase 175RF (15-120 nM), NADPH (1 mM), and 10% glycerol The hydroxylation reaction was carried out in phosphate buffer (pH 5-8). The reaction was carried out at 65 ° C. for 2 minutes.

（２）水酸化物の抽出及び分析
（１）の水酸化反応を行ったサンプルに対して25倍量の氷冷したアセトニトリルを加え、5分間氷上で静置した。続いて、12,000 rpmで10分間遠心後、上清を直接HPLCに注入し、分析を行った。HPLCによる分析はODS-100S (150 x 4.6 mm, 東ソー)を装着したProminence (島津)を用いて行った。その条件として、流速1.0 ml/minでacetonitrile/methanol/isopropanol (85/10/5)を移動相として用い、検出は454 nmにて行った。(2) Hydroxide extraction and analysis 25 times the amount of ice-cooled acetonitrile was added to the sample subjected to the hydroxylation reaction of (1) and allowed to stand on ice for 5 minutes. Subsequently, after centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was directly injected into HPLC for analysis. Analysis by HPLC was performed using Prominence (Shimadzu) equipped with ODS-100S (150 x 4.6 mm, Tosoh). As the conditions, acetonitrile / methanol / isopropanol (85/10/5) was used as a mobile phase at a flow rate of 1.0 ml / min, and detection was performed at 454 nm.

試験例２〜４に示す通り、実施例２の方法に従って融合モノオキシゲナーゼを用い水酸化物を生産することができた。 As shown in Test Examples 2 to 4, hydroxides could be produced using the fusion monooxygenase according to the method of Example 2.

比較例２―１：融合モノオキシゲナーゼ〈対照〉を用いた水酸化物の生産
比較例１で作製した融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いて基質を水酸化することにより、その水酸化物を得た。
生産方法は実施例２に準じて行った。 Comparative Example 2-1: Production of hydroxide using fusion monooxygenase <control> The hydroxide was produced by hydroxylating the substrate using the fusion monooxygenase 175FR prepared in Comparative Example 1. Obtained.
The production method was performed according to Example 2.

比較例２−２：再構成系を用いた水酸化物の生産
融合モノオキシゲナーゼを用いずに、P450、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンをそれぞれ個別に用いて水酸化物を生産した（本明細書において、この系のことを「再構成系」ということもある。）。
β−カロテン（1〜80 μM）、CYP175A1(15〜120 nM)、フェレドキシンレダクターゼ(15〜120 nM)、フェレドキシン(15〜120nM)、NADPH (1 mM)、及び10% グリセロールを含んだ50mM potassium acetate buffer (pH 5.0)中で反応を行った。反応は65℃で2分間行った。 Comparative Example 2-2: Production of hydroxide using a reconstitution system Hydroxide was produced using P450, ferredoxin reductase, and ferredoxin individually without using the fusion monooxygenase (this book) In the specification, this system is sometimes referred to as “reconstruction system”.)
50 mM potassium acetate containing β-carotene (1-80 μM), CYP175A1 (15-120 nM), ferredoxin reductase (15-120 nM), ferredoxin (15-120 nM), NADPH (1 mM), and 10% glycerol The reaction was performed in buffer (pH 5.0). The reaction was carried out at 65 ° C. for 2 minutes.

試験例２：β―カロテン水酸化反応の速度論的解析
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFによるβ―カロテン水酸化反応に関して、速度論的解析を行った。 Test Example 2: Kinetic analysis of β-carotene hydroxylation reaction [Purpose] A kinetic analysis was performed on β-carotene hydroxylation reaction by fusion monooxygenase 175RF.

［方法］実施例２の方法に従い、融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いてβ−カロテンの水酸化物を生産した。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175RFの添加濃度は30nMとし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
対照として、融合モノオキシゲナーゼ175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化物を生産した。
融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いた反応は比較例２−１に従って行った。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175FRの添加濃度は60nMとし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
二種類の再構成系を用意して反応を行った。再構成系を用いた反応は比較例２−２に従って行った。ただし、CYP175A1、フェレドキシンレダクターゼ、及びフェレドキシンの添加濃度はいずれも30nMとした。[Method] According to the method of Example 2, β-carotene hydroxide was produced using fusion monooxygenase 175RF. However, the addition concentration of fusion monooxygenase 175RF was 30 nM, and 50 mM potassium phosphate buffer having a pH of 7.4 was used.
As controls, β-carotene hydroxide was produced using the fusion monooxygenase 175FR and the reconstitution system, respectively.
The reaction using the fusion monooxygenase 175FR was performed according to Comparative Example 2-1. However, the addition concentration of fusion monooxygenase 175FR was 60 nM, and 50 mM potassium phosphate buffer having a pH of 7.4 was used.
Two types of reconstitution systems were prepared and reacted. The reaction using the reconstitution system was performed according to Comparative Example 2-2. However, the addition concentrations of CYP175A1, ferredoxin reductase, and ferredoxin were all 30 nM.

［考察］結果を図４及び表２に示す。また、融合モノオキシゲナーゼ（融合モノオキシゲナーゼ175FR 及び融合モノオキシゲナーゼ175RF）並びに再構成系の間で基質であるβ―カロテンに対する親和性 (Km値)にはほとんど変化がなかった。 [Discussion] The results are shown in FIG. In addition, there was almost no change in the affinity (Km value) for β-carotene as a substrate between the fusion monooxygenase (fusion monooxygenase 175FR and fusion monooxygenase 175RF) and the reconstitution system.

一方、Vmax を比較したところ、融合モノオキシゲナーゼ175FRでは再構成系の場合よりも値が減少していたが、融合モノオキシゲナーゼ175RFでは再構成系の場合に比べてはるかに高い値を示した。このことから、融合モノオキシゲナーゼ175FRでは各タンパク質間の相互作用がうまく行かず、電子の伝達が正常に行われなかったため、活性が低かったと考えられる。一方、融合モノオキシゲナーゼ175RFでは各タンパク質間で適した相互作用が行われており、電子の伝達が効率良く行われたため、高い活性を示したと考えられる。 On the other hand, when Vmax was compared, the value was decreased in the fusion monooxygenase 175FR than in the reconstitution system, but the fusion monooxygenase 175RF was much higher than that in the reconstitution system. From this, it is considered that the fusion monooxygenase 175FR did not interact well between the proteins, and the electron transfer was not performed normally, so the activity was low. On the other hand, in the fusion monooxygenase 175RF, a suitable interaction is performed between each protein, and electron transfer is performed efficiently, so it is considered that the fusion monooxygenase 175RF showed high activity.

試験例３：融合モノオキシゲナーゼ濃度とモノオキシゲナーゼ活性との関係
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFによるβ―カロテン水酸化反応に関して、融合モノオキシゲナーゼ濃度と活性との関係を解析した。 Test Example 3: Relationship between Fusion Monooxygenase Concentration and Monooxygenase Activity [Purpose] Regarding β-carotene hydroxylation reaction by fusion monooxygenase 175RF, the relationship between fusion monooxygenase concentration and activity was analyzed.

［方法］実施例２の方法に従い、融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いてβ−カロテンの水酸化物を生産した。ただし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
対照として、融合モノオキシゲナーゼ175FR、及び再構成系を用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化物を生産した。
融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いた反応は比較例２−１に従って行った。ただし、50 mM potassium phosphate buffer はpH7.4のものを用いた。
再構成系を用いた反応は比較例２−２に従って行った。[Method] According to the method of Example 2, β-carotene hydroxide was produced using fusion monooxygenase 175RF. However, 50 mM potassium phosphate buffer having a pH of 7.4 was used.
As controls, β-carotene hydroxide was produced using the fusion monooxygenase 175FR and the reconstitution system, respectively.
The reaction using the fusion monooxygenase 175FR was performed according to Comparative Example 2-1. However, 50 mM potassium phosphate buffer having a pH of 7.4 was used.
The reaction using the reconstitution system was performed according to Comparative Example 2-2.

［考察］結果を図５に示す。分子間で電子の伝達が行われている場合、酵素濃度が増えるにつれて活性は対数的に増加するはずであるが、分子内で電子の伝達が行われている場合、酵素濃度が増えるにつれて活性は直線的に増加するはずである。再構成系では酵素濃度が増えるにつれて、活性が対数的に増加しており、分子間で電子の伝達が行われていることが確認できた。一方、融合酵素では酵素濃度が増えるにつれて、活性は直線的に増加しており、融合酵素ではその分子内で電子の伝達が行われていることが分かった。 [Discussion] The results are shown in FIG. When electrons are transferred between molecules, the activity should increase logarithmically as the enzyme concentration increases. However, when electrons are transferred within the molecule, the activity increases as the enzyme concentration increases. Should increase linearly. In the reconstitution system, the activity increased logarithmically as the enzyme concentration increased, confirming that electrons were transferred between molecules. On the other hand, the activity of the fusion enzyme increased linearly as the enzyme concentration increased, and it was found that the fusion enzyme conducts electrons within the molecule.

試験例４：融合モノオキシゲナーゼ活性のｐＨ依存性
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFによるβ―カロテン水酸化反応に関して、ｐＨ依存性を解析した。 Test Example 4: pH dependence of fusion monooxygenase activity [Purpose] The pH dependence of β-carotene hydroxylation reaction by fusion monooxygenase 175RF was analyzed.

［方法］実施例２の方法に従い、融合モノオキシゲナーゼ175RFを用いてβ−カロテンの水酸化物を生産した。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175RFの添加濃度は30nMとし、pH 5.0〜6.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium acetate buffer を用いて測定を行い、pH 6.0〜8.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium phosphate buffer を用いて測定を行った。
対照として、融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いてそれぞれβ−カロテンの水酸化物を生産した。
融合モノオキシゲナーゼ175FRを用いた反応は比較例２−１に従って行った。ただし、融合モノオキシゲナーゼ175FRの添加濃度は30nMとし、pH 5.0〜6.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium acetate buffer を用いて測定を行い、pH 6.0〜8.0の範囲では10% glycerolを含んだ50 mM potassium phosphate buffer を用いて測定を行った。[Method] According to the method of Example 2, β-carotene hydroxide was produced using fusion monooxygenase 175RF. However, the concentration of fusion monooxygenase 175RF should be 30 nM, measured in 50 mM potassium acetate buffer containing 10% glycerol in the range of pH 5.0 to 6.0, and 10% glycerol in the range of pH 6.0 to 8.0. Measurement was performed using 50 mM potassium phosphate buffer.
As a control, the fusion monooxygenase 175FR was used to produce β-carotene hydroxide, respectively.
The reaction using the fusion monooxygenase 175FR was performed according to Comparative Example 2-1. However, the concentration of fusion monooxygenase 175FR should be 30 nM, measured in 50 mM potassium acetate buffer containing 10% glycerol in the range of pH 5.0 to 6.0, and 10% glycerol in the range of pH 6.0 to 8.0. Measurement was performed using 50 mM potassium phosphate buffer.

［考察］結果を図６に示す。再構成系 (単独) の場合はpH5.0を最適pHとしていたが、融合モノオキシゲナーゼ (融合モノオキシゲナーゼ175RF及び融合モノオキシゲナーゼ175FR) では最適pHが7.0-7.4であることが分かった。 [Discussion] The results are shown in FIG. In the case of the reconstitution system (single), pH 5.0 was set as the optimum pH, but in the case of fusion monooxygenase (fusion monooxygenase 175RF and fusion monooxygenase 175FR), the optimum pH was found to be 7.0-7.4.

試験例５：融合モノオキシゲナーゼの熱安定性
［目的］融合モノオキシゲナーゼ175RFの熱安定性を評価した。 Test Example 5: Thermal stability of fusion monooxygenase [Purpose] The thermal stability of fusion monooxygenase 175RF was evaluated.

［方法］10%グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) 中で融合モノオキシゲナーゼ175RF (60 nM)を10分間各温度でインキュベート後、氷上で5分静置することで、熱処理を停止させた。そして、β-carotene (80 μM) 及びNADPH (1 mM) の存在下でβ-carotene水酸化活性を測定した。グラフは50℃における活性を100%とした時の相対値を示している。 [Method] Stop the heat treatment by incubating the fusion monooxygenase 175RF (60 nM) in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing 10% glycerol for 10 minutes at each temperature and then let stand on ice for 5 minutes. I let you. Then, β-carotene hydroxylation activity was measured in the presence of β-carotene (80 μM) and NADPH (1 mM). The graph shows relative values when the activity at 50 ° C. is taken as 100%.

［考察］結果を図７に示す。融合モノオキシゲナーゼ175RFは80℃においても50%の活性を維持しており、高い熱耐性を持つことが分かった。 [Discussion] The results are shown in FIG. Fusion monooxygenase 175RF maintained 50% activity even at 80 ° C. and was found to have high heat resistance.

実施例３：変異型融合モノオキシゲナーゼの作製（１）
変異型のP450を含む本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。
CYP175A1の67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに置換した変異型CYP175A1（本明細書において、「変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉」、又は単に「175RF〈Q67G、Y68I〉」ということもある。）をコードするDNAを次のようにして作製した。 Example 3: Production of mutant fusion monooxygenase (1)
A fusion monooxygenase of the present invention containing a mutant form of P450 was prepared as follows.
Mutant CYP175A1 in which 67th glutamic acid and 68th tyrosine of CYP175A1 are respectively substituted with glycine and isoleucine (in this specification, “mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I>” or simply “175RF <Q67G, Y68I”) > ”Was also prepared as follows.

CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして、プライマー（primer 13）5’-AAGGCCACCTTCGGGTTACGGGCCCTCCT-3’（配列番号１９；下線部は変異導入箇所を示す）を用いてmegaprimer法により変異体をコードするDNAを作製した。１回目のPCRではprimer 13 (forward primer) 及び表１に示したprimer 7 (reverse primer) 及びKOD Plus DNA polymeraseを用いて、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った後、PCR産物をゲル抽出した。２回目のPCRではゲル抽出後のPCR産物(reverse primer)、表１に示したprimer 6 (forward primer)、そして、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、50 ℃・1分、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った。そして、実施例１と同様の方法でpET-GTS-RFにPCR産物を挿入し、変異型CYP175A1と電子伝達系の融合酵素発現用ベクターを作製した。大腸菌における融合酵素の発現及び菌体からの目的融合酵素の精製を実施例１と同様の条件で行い、変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を得た。DNA encoding CYP175A1 as a template, DNA encoding the mutant by the megaprimer method using primer (primer 13) 5'-AAGGCCACCTTC GGGTTA CGGGCCCTCCT-3 '(SEQ ID NO: 19; underlined indicates the site of mutation introduction) Was made. In the first PCR, primer 13 (forward primer) and primer 7 (reverse primer) and KOD Plus DNA polymerase shown in Table 1 were used, and the DNA encoding CYP175A1 was used as a template at 94 ° C for 5 minutes → (94 ° C (30 seconds, 55 ° C./30 seconds, 68 ° C./2 minutes) × 30 cycles of PCR were performed, and then the PCR product was gel-extracted. In the second round of PCR, the PCR product after gel extraction (reverse primer), primer 6 (forward primer) shown in Table 1, and DNA encoding CYP175A1 as a template at 94 ° C for 5 minutes → (94 ° C · 30 PCR was performed under the conditions of seconds, 50 ° C. · 1 minute, 68 ° C. · 2 minutes) × 30 cycles. Then, the PCR product was inserted into pET-GTS-RF in the same manner as in Example 1 to produce a mutant CYP175A1 and electron transfer system fusion enzyme expression vector. Expression of the fusion enzyme in E. coli and purification of the target fusion enzyme from the bacterial cells were performed under the same conditions as in Example 1 to obtain a mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I>.

実施例４：変異型融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産（１）
実施例３で作製した変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を用いて、野生型P450（CYP175A1）では基質とはならないテストステロンを水酸化することにより、その水酸化物を得た。 Example 4: Production of hydroxide using mutant fusion monooxygenase (1)
Using the mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I> prepared in Example 3, the hydroxide was obtained by hydroxylating testosterone which does not serve as a substrate with wild-type P450 (CYP175A1).

テストステロン（500 μM）、変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉（1μM）、NADPH（1 mM）、及び10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH7.4) 中（総量400μl）で水酸化反応を行った。
60℃で15分間反応させた後、2mlの酢酸エチルを添加することで反応産物を抽出した。抽出物を遠心濃縮機を用いて乾固させ、残渣を50％のメタノールに溶解させ、HPLCを用いて分析した。カラム（ODS-100Z）を40℃に加温し、流速1.0ml/minで水：メタノール：アセトニトリル=62:36:2から30:64:6まで20分間で直線的に濃度変化させることで分析を行った。その結果を図８に示す。In 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing testosterone (500 μM), mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I> (1 μM), NADPH (1 mM), and 10% glycerol (total volume 400 μl) A hydroxylation reaction was performed.
After reacting at 60 ° C. for 15 minutes, 2 ml of ethyl acetate was added to extract the reaction product. The extract was dried using a centrifugal concentrator and the residue was dissolved in 50% methanol and analyzed using HPLC. The column (ODS-100Z) is heated to 40 ° C and analyzed by linearly changing the concentration in 20 minutes from 62: 36: 2 to 30: 64: 6 at a flow rate of 1.0 ml / min. Went. The result is shown in FIG.

その結果、この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を用いることで、P450が野生型のP450（CYP175A1）である融合モノオキシゲナーゼ175RFでは基質となり得ないテストステロンを水酸化してその水酸化物を生産できることが明らかになった。具体的には、テストステロンの6β位、16α位、及び2β位を水酸化することができることが明らかになった。 As a result, by using this mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I>, hydroxylated testosterone that cannot be a substrate in the fusion monooxygenase 175RF where P450 is wild-type P450 (CYP175A1) It became clear that can be produced. Specifically, it was revealed that 6β-position, 16α-position and 2β-position of testosterone can be hydroxylated.

実施例５：融合モノオキシゲナーゼを用いた有機溶媒中における水酸化物の生産
実施例３で得た変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉を用い、有機溶媒中において水酸化物を生産した。 Example 5: Production of hydroxide in organic solvent using fusion monooxygenase Using mutant-type fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I> obtained in Example 3, hydroxide in organic solvent Produced.

基質としてはテストステロンを用いた。NADPH (1 mM)、変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉(1 μM)、10%グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH7.4)中で行った。
また、メタノール濃度が1%の時は50 mMテストステロン、5%の時は10 mMテストステロン、10%の時は5 mMテストステロンをそれぞれ最終濃度が500 μMになるよう加えた。反応時間及び代謝産物の分析は実施例４と同様に行った。Testosterone was used as the substrate. This was carried out in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing NADPH (1 mM), mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I> (1 μM), 10% glycerol.
Further, 50 mM testosterone was added when the methanol concentration was 1%, 10 mM testosterone was added when the methanol concentration was 5%, and 5 mM testosterone was added when the methanol concentration was 10% so that the final concentration was 500 μM. Reaction time and metabolite analysis were performed in the same manner as in Example 4.

その結果を表３に示す。この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉は、有機溶媒の存在下においても水酸化物を生産できることが明らかになった。 The results are shown in Table 3. It was revealed that this mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I> can produce hydroxide even in the presence of an organic solvent.

実施例６：変異型融合モノオキシゲナーゼの作製（２）
変異型のP450を含む本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。
CYP175A1の269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（本明細書において、「変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈W269P、I270A〉」、又は単に「175RF〈W269P、I270A〉」ということもある。）をコードするDNAを次のようにして作製した。 Example 6: Production of mutant fusion monooxygenase (2)
A fusion monooxygenase of the present invention containing a mutant form of P450 was prepared as follows.
Mutant CYP175A1 obtained by substituting phenylalanine and alanine for 269th tryptophan and 270th isoleucine of CYP175A1 (in this specification, “mutant fusion monooxygenase 175RF <W269P, I270A>” or simply “175RF <W269P, I270A”) > ”Was also prepared as follows.

CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして、プライマー（primer 14）5’-TCTACCCCCCCGCCCCGGCCCTCACCCGGA-3’（配列番号２０；下線部は変異導入箇所を示す）を用いてmegaprimer法により変異体をコードするDNAを作製した。１回目のPCRではprimer 14 (forward primer) 及び表１に示したprimer 7 (reverse primer) 及びKOD Plus DNA polymeraseを用いて、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った後、PCR産物をゲル抽出した。２回目のPCRではゲル抽出後のPCR産物(reverse primer)、表１に示したprimer 6 (forward primer)、そして、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、50 ℃・1分、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った。そして、実施例１と同様の方法でpET-GTS-RFにPCR産物を挿入し、変異型CYP175A1と電子伝達系の融合酵素発現用ベクターを作製した。大腸菌において融合酵素を発現させた。菌体からの目的融合酵素の精製を実施例１と同様の条件で行い、目的変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈W269P、I270A〉を得た。なお、次の実施例８、９においてこの融合酵素は精製工程を経ることなく、直接基質との反応に付し、分光学的に測定した。DNA encoding the mutant by the megaprimer method using the DNA encoding CYP175A1 as a template and using the primer (primer 14) 5'-TCTACCCCCCCGCC CCGGCC CTCACCCGGA-3 '(SEQ ID NO: 20; the underlined portion indicates the site of mutation introduction) Was made. In the first PCR, primer 14 (forward primer) and primer 7 (reverse primer) and KOD Plus DNA polymerase shown in Table 1 were used, and the DNA encoding CYP175A1 was used as a template at 94 ° C for 5 minutes → (94 ° C (30 seconds, 55 ° C./30 seconds, 68 ° C./2 minutes) × 30 cycles of PCR were performed, and then the PCR product was gel-extracted. In the second round of PCR, the PCR product after gel extraction (reverse primer), primer 6 (forward primer) shown in Table 1, and DNA encoding CYP175A1 as a template at 94 ° C for 5 minutes → (94 ° C · 30 PCR was performed under the conditions of seconds, 50 ° C. · 1 minute, 68 ° C. · 2 minutes) × 30 cycles. Then, the PCR product was inserted into pET-GTS-RF in the same manner as in Example 1 to produce a mutant CYP175A1 and electron transfer system fusion enzyme expression vector. The fusion enzyme was expressed in E. coli. Purification of the target fusion enzyme from the cells was performed under the same conditions as in Example 1 to obtain the target mutant fusion monooxygenase 175RF <W269P, I270A>. In the following Examples 8 and 9, this fusion enzyme was directly subjected to a reaction with a substrate without undergoing a purification step, and spectroscopically measured.

実施例７：変異型融合モノオキシゲナーゼの作製（３）
変異型のP450を含む本発明の融合モノオキシゲナーゼを次の通り作製した。
CYP175A1の67番目のグルタミン酸及び68番目のチロシンをそれぞれグリシン及びイソロイシンに、並びに269番目のトリプトファン及び270番目のイソロイシンをそれぞれフェニルアラニン及びアラニンに置換した変異型CYP175A1（本明細書において、「変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉、又は単に「175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉」ということもある。）をコードするDNAを次のようにして作製した。 Example 7: Production of mutant fusion monooxygenase (3)
A fusion monooxygenase of the present invention containing a mutant form of P450 was prepared as follows.
Mutant CYP175A1 in which the 67th glutamic acid and 68th tyrosine of CYP175A1 are substituted with glycine and isoleucine, and the 269th tryptophan and 270th isoleucine are substituted with phenylalanine and alanine, respectively. A DNA encoding oxygenase 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A> or simply “175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A>” was prepared as follows.

変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈W269P、I270A〉をコードするDNAを鋳型にして、プライマー（primer 15）5’-AAGGCCACCTTCGGGTTACGGGCCCTCTC-3’（配列番号２１；下線部は変異導入箇所を示す）を用いてmegaprimer法により変異体をコードするDNAを作製した。１回目のPCRではprimer 15 (forward primer) 及び表１に示したprimer 7 (reverse primer) 及びKOD Plus DNA polymeraseを用いて、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、55 ℃・30秒、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った後、PCR産物をゲル抽出した。２回目のPCRではゲル抽出後のPCR産物(reverse primer)、表１に示したprimer 6 (forward primer)、そして、CYP175A1をコードするDNAを鋳型にして94 ℃、5分→(94 ℃・30秒、50 ℃・1分、68 ℃・2分)×30サイクルの条件でPCRを行った。そして、実施例１と同様の方法でpET-GTS-RFにPCR産物を挿入し、変異型CYP175A1と電子伝達系の融合酵素発現用ベクターを作製した。大腸菌において、目的変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を発現させた。これらは実施例１と同様の方法で精製を行った。なお、次の実施例８、９においてこの融合酵素は精製工程を経ることなく、直接基質との反応に付し、分光学的に測定した。Using a DNA encoding the mutant fusion monooxygenase 175RF <W269P, I270A> as a template, using a primer (primer 15) 5'-AAGGCCACCTTC GGGTTA CGGGCCCTCTC-3 '(SEQ ID NO: 21; underlined indicates the site of mutation introduction) DNA encoding the mutant was prepared by the megaprimer method. In the first PCR, primer 15 (forward primer) and primer 7 (reverse primer) and KOD Plus DNA polymerase shown in Table 1 were used, and the DNA encoding CYP175A1 was used as a template at 94 ° C for 5 minutes → (94 ° C (30 seconds, 55 ° C./30 seconds, 68 ° C./2 minutes) × 30 cycles of PCR were performed, and then the PCR product was gel-extracted. In the second round of PCR, the PCR product after gel extraction (reverse primer), primer 6 (forward primer) shown in Table 1, and DNA encoding CYP175A1 as a template at 94 ° C for 5 minutes → (94 ° C · 30 PCR was performed under the conditions of seconds, 50 ° C. · 1 minute, 68 ° C. · 2 minutes) × 30 cycles. Then, the PCR product was inserted into pET-GTS-RF in the same manner as in Example 1 to produce a mutant CYP175A1 and electron transfer system fusion enzyme expression vector. The target mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A> was expressed in E. coli. These were purified in the same manner as in Example 1. In the following Examples 8 and 9, this fusion enzyme was directly subjected to a reaction with a substrate without undergoing a purification step, and spectroscopically measured.

実施例８：変異型融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産（２）
実施例３及び７でそれぞれ作製した変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉及び175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉（上述のように未精製品）を用いて、野生型P450（CYP175A1）では基質とはならないテストステロンを水酸化することにより、その水酸化物を得た。 Example 8: Production of hydroxide using mutant fusion monooxygenase (2)
Using the mutant fusion monooxygenases 175RF <Q67G, Y68I> and 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A> (unrefined products as described above) prepared in Examples 3 and 7, respectively, wild type P450 (CYP175A1) Then, the hydroxide was obtained by hydroxylating the testosterone which is not a substrate.

テストステロン（500 μM）と175RF、175RF〈Q67G、Y68I〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉（1μM）、NADPH（1 mM）及び10% グリセロールを含んだ50 mM potassium phosphate buffer (pH7.4) 中（総量400μl）で水酸化反応を行った。
60℃で15分間反応させた後、2mlの酢酸エチルを添加することで反応産物を抽出した。抽出物を遠心濃縮機を用いて乾固させ、残渣を50％のメタノールに溶解させ、HPLCを用いて分析した。カラム（ODS-100Z）を40℃に加温し、流速1.0ml/minで水：メタノール：アセトニトリル=62:36:2から30:64:6まで20分間で直線的に濃度変化させることで分析を行った。その結果を表４に示す。50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) containing testosterone (500 μM) and 175RF, 175RF <Q67G, Y68I> or 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A> (1 μM), NADPH (1 mM) and 10% glycerol ) The hydroxylation reaction was carried out in the medium (total amount 400 μl).
After reacting at 60 ° C. for 15 minutes, 2 ml of ethyl acetate was added to extract the reaction product. The extract was dried using a centrifugal concentrator and the residue was dissolved in 50% methanol and analyzed using HPLC. The column (ODS-100Z) is heated to 40 ° C and analyzed by linearly changing the concentration in 20 minutes from 62: 36: 2 to 30: 64: 6 at a flow rate of 1.0 ml / min. Went. The results are shown in Table 4.

その結果、この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を用いることで、P450が野生型のP450（CYP175A1）である融合モノオキシゲナーゼ175RFでは基質となり得ないテストステロンを水酸化してその水酸化物を生産できることが明らかになった。本実施例では、具体的には、テストステロンの2β位が水酸化されることを確認した。 As a result, by using this mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I> or 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A>, P450 can be a substrate for the fusion monooxygenase 175RF, which is a wild type P450 (CYP175A1). It became clear that no testosterone can be hydroxylated to produce its hydroxide. In this example, specifically, it was confirmed that the 2β position of testosterone was hydroxylated.

また、これら融合モノオキシゲナーゼは、未精製のものを直接用いたことにより、失活乃至活性低下が回避でき、高い活性を示すことも分かった。 Moreover, it was also found that these fusion monooxygenases can avoid inactivation or decrease in activity by directly using unpurified ones and exhibit high activity.

実施例９：変異型融合モノオキシゲナーゼを用いた水酸化物の生産（３）
実施例３、６及び７でそれぞれ作製した変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉、175RF〈W269P、I270A〉及び175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を用いて、野生型P450（CYP175A1）では基質とはならないアミノピリンのジメチルアミノ基のメチル基を一つ脱離し、モノメチルアミノ体を得た。 Example 9: Production of hydroxide using mutant fusion monooxygenase (3)
Using the mutant fusion monooxygenases 175RF <Q67G, Y68I>, 175RF <W269P, I270A> and 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A> prepared in Examples 3, 6 and 7, respectively, wild type P450 (CYP175A1) Then, one methyl group of the dimethylamino group of aminopyrine that does not serve as a substrate was eliminated to obtain a monomethylamino compound.

アミノピリン5mMと175RF、175RF〈Q67G、Y68I〉、175RF〈W269P、I270A〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉（いずれも未精製品）0.25 μM及び0.1 M Tris Hcl バッファー(pH7.5)を混合し、さらにNADPH 0.2mMを添加した上（総量2000μl）で60℃、15分間インキュベートすることにより脱メチル化反応を行った。
その後、20 % トリクロロ酢酸（TCA）を1 ml添加することで反応を停止した。4,000 rpm、4℃で10分間遠心分離し、上清をチューブに移した。このチューブにNash試薬（酢酸アンモニウム9 gとアセチルアセトン120 μlに蒸留水を添加して総量30 mlとしたもの）を1 ml添加してボルテックスし、さらに60℃にて30分間インキュベートした。これを波長415 nmで分光学的に測定した。その結果を表５に示す。Aminopyrine 5mM and 175RF, 175RF <Q67G, Y68I>, 175RF <W269P, I270A> or 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A> (both unpurified products) 0.25 μM and 0.1 M Tris Hcl buffer (pH 7.5) After mixing, NADPH 0.2 mM was further added (total amount 2000 μl) and incubated at 60 ° C. for 15 minutes to carry out demethylation reaction.
Thereafter, the reaction was stopped by adding 1 ml of 20% trichloroacetic acid (TCA). Centrifugation was performed at 4,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was transferred to a tube. To this tube, 1 ml of Nash reagent (9 g of ammonium acetate and 120 μl of acetylacetone was added to make a total volume of 30 ml) was vortexed and further incubated at 60 ° C. for 30 minutes. This was measured spectroscopically at a wavelength of 415 nm. The results are shown in Table 5.

その結果、この変異型融合モノオキシゲナーゼ175RF〈Q67G、Y68I〉、175RF〈W269P、I270A〉又は175RF〈Q67G、Y68I、W269P、I270A〉を用いることで、P450が野生型のP450（CYP175A1）である融合モノオキシゲナーゼ175RFでは基質となり得ないアミノピリンのメチル基を脱離することが明らかになった。 As a result, by using this mutant fusion monooxygenase 175RF <Q67G, Y68I>, 175RF <W269P, I270A> or 175RF <Q67G, Y68I, W269P, I270A>, P450 is a wild type P450 (CYP175A1) Monooxygenase 175RF was found to eliminate the methyl group of aminopyrine, which cannot be a substrate.

Claims

A fusion monooxygenase obtained by linking P450, ferredoxin reductase, and ferredoxin derived from a hyperthermophilic bacterium of the genus Thermus in this order directly or via a linker from the N-terminal side.

The fusion monooxygenase according to claim 1, wherein the thermophilic bacterium of the genus Thermus is Thermus thermophilus.

The fusion monooxygenase according to claim 1, wherein P450 is the following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
(B) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A), the polypeptide comprising the polypeptide, ferredoxin reductase And a fusion monooxygenase obtained by linking ferredoxin directly or via a linker in this order from the N-terminal side, exhibits a monooxygenase activity.

The fusion monooxygenase according to claim 1, wherein the ferredoxin reductase is the following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(B) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A), the polypeptide comprising P450, the polypeptide, And a fusion monooxygenase obtained by linking ferredoxin directly or via a linker in this order from the N-terminal side, exhibits a monooxygenase activity.

The fusion monooxygenase according to claim 1, wherein the ferredoxin is the following polypeptide (A) or (B):
(A) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
(B) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide of (A), the polypeptide comprising P450, ferredoxin reductase, and A polypeptide in which a fusion monooxygenase formed by linking the polypeptide from the N-terminal side in this order directly or via a linker exhibits monooxygenase activity.

A DNA encoding the fusion monooxygenase according to claim 1.

A microorganism into which the DNA according to claim 6 is introduced.

A method for producing a fusion monooxygenase, comprising the step of collecting the fusion monooxygenase from the microorganism according to claim 7 or a culture obtained from the microorganism.

A method for producing an oxide, comprising the step of obtaining the oxide by adding oxygen to a substrate using the fusion monooxygenase according to claim 1.

The production method according to claim 9, wherein the substrate is β-carotene, testosterone, or aminopyrine.