JPWO2010090030A1 - Blank sample - Google Patents
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Abstract
測定系に含まれる過酸化物によるブランク値の上昇を抑制し、パーオキシダーゼを含有する試薬により被検物質を正確に定量することのできるブランク試料及びこれを用いた被検物質の定量方法の提供。パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられるブランク試料であって、カタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを含有することを特徴とするブランク試料。Providing a blank sample capable of accurately quantifying a test substance with a reagent containing peroxidase while suppressing an increase in the blank value due to peroxide contained in the measurement system, and a method for quantifying the test substance using the blank sample . A blank sample used for quantification of a test substance using a peroxidase-containing reagent, wherein the blank sample contains catalase and / or peroxidase.
Description
本発明は、パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられるブランク試料及びこれを用いた定量方法に関する。 The present invention relates to a blank sample used for quantification of a test substance using a peroxidase-containing reagent and a quantification method using the same.
測定対象物をそれと特異的に反応する酸化酵素と作用させて過酸化物を生成し、該過酸化物をパーオキダーゼ（以下、ＰＯＤと略記する場合がある）の存在下において発色基質と反応させて発色へと導く比色定量法において、測定系に含まれる過酸化物によりブランク値が上昇してくるという問題がある。特に、界面活性剤やプロテアーゼを含有する試薬を用いる測定系では、該物質により過酸化物が持ち込まれるためブランク値が上昇し易い。 A measurement object is allowed to react with an oxidase specifically reacting therewith to produce a peroxide, and the peroxide is reacted with a chromogenic substrate in the presence of peroxidase (hereinafter sometimes abbreviated as POD). In the colorimetric determination method leading to color development, there is a problem that the blank value increases due to peroxide contained in the measurement system. In particular, in a measurement system using a reagent containing a surfactant or a protease, the peroxide is brought in by the substance, so that the blank value tends to increase.
過酸化物の影響を回避する方法としては、生理食塩水等を盲検として測定し過酸化物に由来するシグナルを差し引く方法や、試薬中の過酸化物を選択的に除去する方法がある。
しかし、生理食塩水等を盲検として測定する方法では、第一試薬に過酸化物が含有していると、第二試薬でパーオキシダーゼの存在下において発色へと導く二試薬系の場合、生理食塩水等の測定シグナルが正確なブランク値を反映せず、正確な検量線を作成できない場合があった。この場合、正確な定量を行うことができない。As a method for avoiding the influence of peroxide, there are a method in which physiological saline or the like is measured blindly and a signal derived from peroxide is subtracted, or a method in which peroxide in a reagent is selectively removed.
However, in the method of measuring physiological saline or the like as a blind test, if a peroxide is contained in the first reagent, the second reagent leads to color development in the presence of peroxidase. In some cases, measurement signals such as saline do not reflect an accurate blank value, and an accurate calibration curve cannot be created. In this case, accurate quantification cannot be performed.
また、試薬中の過酸化物を選択的に除去する方法として、プロテアーゼ含有試薬にカタラーゼを共存させて過酸化物を消去し、次いでアジ化ナトリウム等の添加によりカタラーゼを失活させた後に測定対象物を定量する方法が知られているが（特許文献１）、プロテアーゼ含有試薬には安定剤としてアジ化ナトリウムを配合する場合が多く、その場合には、ここにカタラーゼを安定に共存させることはできない。 In addition, as a method of selectively removing peroxide in the reagent, the target is measured after the peroxide is eliminated by coexisting with the protease-containing reagent and then the catalase is deactivated by adding sodium azide or the like. Although a method for quantifying substances is known (Patent Document 1), protease-containing reagents often contain sodium azide as a stabilizer, and in that case, catalase can coexist stably here. Can not.
従って、本発明の課題は、測定系に含まれる過酸化物によるブランク値の上昇を抑制し、パーオキシダーゼを含有する試薬により被検物質を正確に定量することのできるブランク試料及びこれを用いた被検物質の定量方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to use a blank sample that can suppress an increase in the blank value due to peroxide contained in the measurement system and can accurately quantify a test substance using a reagent containing peroxidase. It is to provide a method for quantifying a test substance.
本発明者は、生理食塩水等を盲検として測定する方法において正確なブランク値が得られない原因について種々検討したところ、パーオキシダーゼ（パーオキシダーゼ様活性）及び／又はカタラーゼを含有する測定試料及び校正試料においては、該試料に含まれるパーオキシダーゼ及び／又はカタラーゼにより測定試薬に含まれる過酸化物が消去されるのに対して、生理食塩水等をブランク試料とした場合、測定試薬に含まれる過酸化物が消去されずシグナルとして測り込まれるために、正確なブランク値が得られないことを見出した。
そして、さらに検討したところ、ブランク試料として生理食塩水等の代わりに、パーオキシダーゼ及び／又はカタラーゼを含有する試料を用いれば過酸化物によるシグナルを低減でき、正確なブランク値が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。The present inventor has conducted various studies on the cause of failure to obtain an accurate blank value in the method of measuring physiological saline or the like as a blind test. As a result, a measurement sample containing peroxidase (peroxidase-like activity) and / or catalase and In the calibration sample, the peroxide contained in the measurement reagent is erased by the peroxidase and / or catalase contained in the sample, whereas when physiological saline is used as a blank sample, it is contained in the measurement reagent. It has been found that an accurate blank value cannot be obtained because the peroxide is not erased and is measured as a signal.
As a result of further investigation, it was found that if a sample containing peroxidase and / or catalase is used as a blank sample instead of physiological saline, the signal due to peroxide can be reduced and an accurate blank value can be obtained. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は、パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられるブランク試料であって、カタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを含有することを特徴とするブランク試料を提供するものである。
また、本発明は、上記ブランク試料を用いることを特徴とするパーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量方法を提供するものである。That is, this invention provides the blank sample used for fixed_quantity | assay of the to-be-tested substance using a peroxidase containing reagent, Comprising: Catalase and / or peroxidase are provided, The blank sample characterized by the above-mentioned is provided.
The present invention also provides a method for quantifying a test substance using a peroxidase-containing reagent, wherein the blank sample is used.
本発明によれば、ブランク値を正確に求めて正確な検量線を作成することが可能となり、パーオキシダーゼ含有試薬、とりわけ第一試薬に過酸化物が含まれ、第二試薬でパーオキシダーゼの存在下において発色へと導く二試薬系の試薬により被検物質を正しく定量することができる。本発明のブランク試料は、検量線のキャリブレーション時に濃度０のブランク値が必要とされる際に特に有用である。 According to the present invention, it is possible to accurately calculate a blank value and create an accurate calibration curve, and a peroxide is contained in a peroxidase-containing reagent, particularly the first reagent, and the presence of peroxidase in the second reagent. The test substance can be accurately quantified with a two-reagent reagent that leads to color development below. The blank sample of the present invention is particularly useful when a blank value of zero concentration is required during calibration of a calibration curve.
本発明のブランク試料に用いられるカタラーゼとしては、臨床検査に使用できるものであれば特に制限はなく、例えば、牛肝臓、人赤血球等の動物由来のカタラーゼ；アスペルギルス、ミクロコッカス、ロドシュードモナス等の細菌由来のカタラーゼ；遺伝子組換えにより作製したカタラーゼ等が挙げられる。 The catalase used for the blank sample of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for clinical examinations. For example, catalase derived from animals such as cattle liver and human erythrocytes; bacteria such as Aspergillus, Micrococcus and Rhodopseudomonas Catalase derived from; catalase produced by gene recombination and the like.
ブランク試料中の上記カタラーゼの含有量は１０〜１０，０００，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１００〜１，０００，０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは１，０００〜１００，０００Ｕ／ｍＬである。 The content of the catalase in the blank sample is 10 to 10,000,000 U / mL, preferably 100 to 1,000,000 U / mL, more preferably 1,000 to 100,000 U / mL.
本発明のブランク試料に用いられるパーオキシダーゼとしては、臨床検査に使用できるものであれば特に制限はなく、例えば、西洋ワサビ、白血球、酵母等に由来するパーオキシダーゼ、遺伝子組換えにより作製したパーオキシダーゼ等が挙げられる。 The peroxidase used in the blank sample of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for clinical examination. For example, peroxidase derived from horseradish, leukocytes, yeast, etc., peroxidase prepared by gene recombination Etc.
ブランク試料中のパーオキシダーゼの含有量は０．０１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１，０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは１〜１００Ｕ／ｍＬである。 The content of peroxidase in the blank sample is 0.01 to 10,000 U / mL, preferably 0.1 to 1,000 U / mL, and more preferably 1 to 100 U / mL.
ブランク試料は、カタラーゼ及び／又はパーオキシダーゼを精製水、生理食塩水、又は緩衝液で溶解したものを用いるのが好ましい。
上記緩衝液としては、ｐＨ４．０〜１０．０、好ましくはｐＨ５．０〜９．０の範囲で緩衝能を有する緩衝剤を含有するものが挙げられ、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸及びその塩類等、グッドの緩衝液等の両性緩衝液が挙げられる。
また、ブランク試料には、必要に応じて、例えば、界面活性剤、安定化剤、防腐剤等を添加することも可能である。The blank sample is preferably prepared by dissolving catalase and / or peroxidase with purified water, physiological saline, or buffer solution.
Examples of the buffer include those containing a buffer having a buffering ability in the range of pH 4.0 to 10.0, preferably pH 5.0 to 9.0, such as citric acid, succinic acid, tartaric acid, Organic acids such as malic acid and salts thereof; amino acids such as glycine, taurine and arginine; amphoteric buffers such as Good's buffer such as inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, boric acid and acetic acid and their salts Liquid.
Moreover, it is also possible to add a surfactant, a stabilizer, a preservative, etc. to a blank sample as needed.
本発明のブランク試料は、パーオキシダーゼ含有試薬を用いた被検物質の定量に用いられる。ここで、パーオキシダーゼ含有試薬は、臨床検査に使用される試薬で、パーオキシダーゼを含有した酸化発色系の試薬であれば特に制限されず、例えば、測定対象物に、これに特異的に反応する酸化酵素を作用させて過酸化物を生成させ、該過酸化物をＰＯＤの存在下において発色基質と反応させて発色へと導く比色定量法に使用される試薬がある。
また、パーオキシダーゼ含有試薬は、一試薬系、二試薬系のいずれでもよいが、二試薬系であるのが好ましく、特に、第一試薬に発色基質を含有し、第二試薬にパーオキシダーゼを含有する二試薬系であるのが反応性や安定性の点から好ましい。The blank sample of the present invention is used for quantification of a test substance using a peroxidase-containing reagent. Here, the peroxidase-containing reagent is a reagent used in clinical examinations, and is not particularly limited as long as it is an oxidative coloring reagent containing peroxidase. For example, it specifically reacts with a measurement object. There are reagents used in colorimetric determination methods in which an oxidase is allowed to act to produce peroxide, and the peroxide is reacted with a chromogenic substrate in the presence of POD to lead to color development.
In addition, the peroxidase-containing reagent may be either one reagent system or two reagent system, but it is preferably a two reagent system. In particular, the first reagent contains a chromogenic substrate and the second reagent contains peroxidase. A two-reagent system is preferable from the viewpoint of reactivity and stability.
パーオキシダーゼ含有試薬中のパーオキシダーゼは、上記ブランク試料に用いられるパーオキシダーゼと同じものが用いられ、その試薬中の含有量は０．０１〜１０，０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１，０００Ｕ／ｍＬ、更に好ましくは０．５〜１００Ｕ／ｍＬである。 The peroxidase in the peroxidase-containing reagent is the same as the peroxidase used in the blank sample, and the content in the reagent is 0.01 to 10,000 U / mL, preferably 0.1 to 1, 000 U / mL, more preferably 0.5 to 100 U / mL.
上記パーオキシダーゼ含有試薬は、パーオキシダーゼ、発色基質の他に、例えば、プロテアーゼ、界面活性剤等を含有するのが好ましい。パーオキシダーゼ含有試薬が上記二試薬系である場合、プロテアーゼや界面活性剤は第一試薬に処方されるのが好ましい。
上記発色基質としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであれば如何なるものでもよい。例えば、４−アミノアンチピリンと、フェノール系、ナフトール系又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組み合わせ等の他、フェノチアジン系化合物などの一分子酸化発色化合物が挙げられる。The peroxidase-containing reagent preferably contains, for example, a protease, a surfactant and the like in addition to the peroxidase and the chromogenic substrate. When the peroxidase-containing reagent is the above-mentioned two-reagent system, the protease and the surfactant are preferably formulated in the first reagent.
The chromogenic substrate may be any substrate that reacts with hydrogen peroxide in the presence of POD and develops color. For example, in addition to combinations of 4-aminoantipyrine and phenolic, naphtholic or aniline compounds, combinations of 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and aniline compounds, and other molecules such as phenothiazine compounds An oxidation coloring compound is mentioned.
４−アミノアンチピリンと組み合わせることができるフェノール系化合物としては、例えば、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール等が挙げられ、ナフトール系化合物としては、例えば、１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナフトール−２−カルボン酸，１−ナフトール−８−スルホン酸，１−ナフトール−３−スルホン酸、１−ナフトール−４−スルホン酸等が挙げられ、アニリン系化合物としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＢｍＴ）、Ｎ，Ｎ−ジスルホブチル−ｍ−トルイジン（ＤＳＢｍＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）等が挙げられる。 Examples of phenolic compounds that can be combined with 4-aminoantipyrine include phenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, 2,4,6-trichlorophenol, and the like. Examples of naphthol compounds include 1-naphthol, 1-naphthol-2-sulfonic acid, 1-naphthol-2-carboxylic acid, 1-naphthol-8-sulfonic acid, 1-naphthol-3-sulfonic acid, 1 -Naphthol-4-sulfonic acid and the like. Examples of aniline compounds include N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, N, N-dimethyl-m-toluidine, N, N-diethyl- m-toluidine, N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidine (ESBmT), N, N Disulfobutyl-m-toluidine (DSBmT), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-acetyl Ethylenediamine, 3-methyl-N-ethyl-N- (hydroxyethyl) aniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline (ALOS), N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) ) Aniline (ALPS), N, N-dimethyl-m-anisidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine (ADOS) and the like.
その他、Ｎ−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン・ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン・ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミン等の一分子酸化発色化合物が用いられる。 In addition, N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) -diphenylamine sodium salt (DA-64), 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) ) -Phenothiazine sodium salt (DA-67), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-dimethylamino-10H-phenothiazine (MCDP), N, N, N ′, N ′, N ″, N ″ -hexa Single molecule oxidation coloring compounds such as -3-sulfopropyl-4,4 ', 4 "-triaminotriphenylmethane (TPM-PS), diaminobenzidine, hydroxyphenylpropionic acid, tetramethylbenzidine, orthophenylenediamine, etc. Used.
上記プロテアーゼとしては、微生物由来、動物由来、植物由来等何れでもよく、特に限定はされない。具体的には、プロテイナーゼＫ、トリプシン、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、アミノペプチダーゼ等研究用途の市販品として容易に入手できるもの、ニュートラルプロテイナーゼ、トヨチームＮＥＰ（以上、東洋紡社製）、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、モルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（以上、新日本化学工業社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＣ、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＳ１０、プロチンＮＹ１０、プロチンＮＬ１０、プロチンＮＣ２５（以上、大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）、プロナーゼＥ（ロシュ社製）、ウマミザイム、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（以上、アマノエンザイム社製）等工業用として市販されているものが挙げられる。 The protease may be any of microorganism-derived, animal-derived and plant-derived, and is not particularly limited. Specifically, proteinase K, trypsin, bromelain, carboxypeptidase, papain, pepsin, aminopeptidase, etc. which can be easily obtained as commercial products, neutral proteinase, Toyoteam NEP (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), acidic protease, Alkaline protease, Morsin, AO protease, peptidase (above, manufactured by Kikkoman), Sumiteam CP, Sumiteam TP, Sumiteam LP50D (above, manufactured by Shin Nippon Chemical Industry), Samoa PC10F, Protin PC, Protin PC10F, Protin PS10, Protin NY10 , Protin NL10, Protin NC25 (Yamato Kasei Co., Ltd.), Actinase AS (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.), Pronase E (Roche), Ummamizyme, Protease S "G, Protease A" Amano "G, protease P" Amano "3G (or, manufactured by Amano Enzyme Inc.), and those commercially available as such an industrial.
上記界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでもよい。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等が挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えば、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、例えば、ポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。脂肪酸アルカノールアミドとしては、例えば、ラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられる。ショ糖脂肪酸エステルとしては、例えば、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。As the surfactant, any of a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant and an amphoteric surfactant may be used.
Examples of the nonionic surfactant include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, polyoxyethylene Examples thereof include ethylene alkylamine, glycerin fatty acid ester, fatty acid alkanolamide, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate and the like. Among these nonionic surfactants, examples of the polyoxyethylene alkyl ether include polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, and the like. Examples of the polyoxyethylene alkyl phenyl ether include polyoxyethylene octyl phenyl ether and polyoxyethylene nonyl phenyl ether. Examples of the polyoxyethylene fatty acid ester include polyoxyethylene glycol monolaurate, polyoxyethylene glycol monostearate, polyoxyethylene glycol distearate, polyoxyethylene glycol monooleate and the like. Examples of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester include polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate And polyoxyethylene sorbitan trioleate. Examples of sorbitan fatty acid esters include sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, sorbitan monostearate, sorbitan distearate, sorbitan tristearate, sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, sorbitan sesquioleate, and the like. . Examples of the polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester include polyoxyethylene sorbitol tetraoleate. Examples of the polyoxyethylene alkylamine include polyoxyethylene laurylamine and polyoxyethylene stearylamine. Examples of the glycerin fatty acid ester include stearic acid monoglyceride and oleic acid monoglyceride. Examples of fatty acid alkanolamides include lauric acid diethanolamide. Examples of the sucrose fatty acid ester include sucrose palmitate ester and sucrose stearate ester.
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。このうち、脂肪族アミン塩としては、例えば、モノラウリルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられ、具体的にはラウリルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。
脂肪族４級アンモニウム塩としては、例えば、ラウリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等の塩等が挙げられ、具体的にはラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。Examples of the cationic surfactant include aliphatic amine salts and aliphatic quaternary ammonium salts. Among these, examples of the aliphatic amine salt include higher aliphatic amines such as monolaurylamine, monostearylamine, distearylamine, and tristearylamine, and inorganic acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, or acetic acid, lactic acid, and citric acid. Examples thereof include salts with lower carboxylic acids and the like, and specific examples thereof include laurylamine acetate and stearylamine acetate.
Examples of the aliphatic quaternary ammonium salt include higher aliphatic ammonium such as lauryltrimethylammonium, stearyltrimethylammonium, cetyltrimethylammonium, didecyldimethylammonium and benzylmethyltetradecylammonium, and salts such as chlorine and bromine. Specific examples include lauryltrimethylammonium chloride, stearyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium chloride, didecyldimethylammonium chloride, and benzyldimethyltetradecylammonium chloride.
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等が挙げられる。このうち、カルボン酸塩としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的にはオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。スルホン酸塩としては、例えば、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフチレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等の塩等が挙げられ、具体的にはラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。硫酸エステル塩としては、例えば、ラウリル硫酸エステル等の高級アルコール硫酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸等エステル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸等エステルと、ナトリウム、アンモニウム等との塩等が挙げられ、具体的にはラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等の高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩エステル塩等が挙げられる。リン酸エステル塩としては、例えば、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的にはモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。 Examples of the anionic surfactant include carboxylate, sulfonate, sulfate ester salt, phosphate ester salt and the like. Among these, examples of the carboxylate include salts with higher fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, and oleic acid, and alkali metals such as sodium and potassium. Examples include potassium oleate, sodium lauroyl sarcosine, sodium N-myristoyl-N-methyl-β-alanine, sodium polyoxyethylene lauryl ether acetate, and the like. Examples of the sulfonate include alkylbenzene sulfonic acids such as lauryl benzene sulfonic acid, naphthalene sulfonic acids such as dipropylnaphthylene sulfonic acid and dibutyl naphthalene sulfonic acid, sulfosuccinic acids such as dioctyl sulfosuccinic acid, and salts such as sodium. Specifically, sodium laurylbenzenesulfonate, sodium dipropylnaphthalenesulfonate, sodium dibutylnaphthalenesulfonate, sodium dioctylsulfosuccinate and the like can be mentioned. Examples of the sulfate ester salt include higher alcohol sulfates such as lauryl sulfate, polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as polyoxyethylene lauryl ether sulfate, and salts with sodium, ammonium, and the like. Specific examples include higher alcohol sulfates such as sodium lauryl sulfate and ammonium lauryl sulfate, and polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium polyoxyethylene lauryl ether sulfate. Examples of phosphoric acid ester salts include salts with monostearyl phosphoric acid ester, monolauryl phosphoric acid ester, polyoxyethylene lauryl ether phosphoric acid and the like, and alkali metals such as sodium and potassium. Includes sodium monostearyl phosphate, sodium monolauryl phosphate, potassium polyoxyethylene lauryl ether phosphate, and the like.
両性界面活性剤としては、例えば、カルボキシベタイン類、スルホベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類等が挙げられる。このうちカルボキシベタイン類としては、例えば、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。スルホベタイン類としては、例えば、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。グリシン類としては、例えば、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。２−アルキルイミダゾリンの誘導体類としては、例えば、２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミイダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。アミンオキサイド類としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。 Examples of amphoteric surfactants include carboxybetaines, sulfobetaines, glycines, alanines, 2-alkylimidazoline derivatives, amine oxides, and the like. Among these, examples of the carboxybetaines include lauric acid amidopropyl betaine, lauryldimethylaminoacetic acid betaine, and N-lauroyl-N'-carboxymethyl-N'-hydroxyethylethylenediamine sodium. Examples of sulfobetaines include lauric acid amidopropyl hydroxysulfobetaine. Examples of glycines include sodium lauryl diaminoethyl glycine. Examples of 2-alkylimidazoline derivatives include 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethyl imidazolinium betaine such as 2-lauroyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethyl imidazolinium betaine. Is mentioned. Examples of amine oxides include lauryl dimethylamine oxide.
また、パーオキシダーゼ含有試薬には、種々の目的のため必要に応じて、防腐剤、安定化剤等を添加することも可能である。 Moreover, it is also possible to add a preservative, a stabilizer, etc. to a peroxidase containing reagent as needed for various purposes.
本発明における被検物質としては、パーオキシダーゼ含有試薬により定量できるものであれば特に制限されないが、全血中の成分又は血球由来の成分が好ましい。全血中の成分又は血球由来の成分としては、例えば、糖化タンパク質、グルコース等が挙げられ、特にヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）、グルコースが好ましい。 The test substance in the present invention is not particularly limited as long as it can be quantified by a peroxidase-containing reagent, but a component in whole blood or a component derived from blood cells is preferable. Examples of the component in whole blood or the component derived from blood cells include glycated protein, glucose and the like, and hemoglobin A1c (hereinafter referred to as HbA1c) and glucose are particularly preferable.
本発明のブランク試料を用いて被検物質を定量する方法としては、例えば、被検物質をそれと特異的に反応する酸化酵素と作用させて過酸化物を生成させ、該過酸化物をパーオキダーゼの存在下において発色基質と反応させて発色へと導いて比色定量し、被検物質を定量する方法が挙げられる。具体的には、パーオキシダーゼ含有試薬を上記二試薬系の試薬として用いる場合、先ず、ブランク試料、既知濃度の被検物質及び濃度未知の被検物質を含む試料をそれぞれ第一試薬と反応させ、次いで第二試薬とそれぞれ反応させた後、各試料を用いた場合の吸光度変化量をそれぞれ測定し、ブランク試料及び既知濃度の被検物質を用いた場合の測定値より検量線を作成する。濃度未知の被検物質を含む試料の測定値を、作成した検量線に照らし合わせ、該試料中の被検物質の濃度を算出する。 As a method for quantifying a test substance using the blank sample of the present invention, for example, a test substance is allowed to react with an oxidase that specifically reacts with the test substance to generate a peroxide, and the peroxide is converted into a peroxidase. A method of quantifying a test substance by reacting with a chromogenic substrate in the presence to lead to color development and performing colorimetric quantification can be mentioned. Specifically, when using a peroxidase-containing reagent as a reagent of the above-mentioned two-reagent system, first, a blank sample, a sample containing a test substance with a known concentration and a test substance with an unknown concentration are each reacted with the first reagent, Next, after reacting with each of the second reagents, the amount of change in absorbance when each sample is used is measured, and a calibration curve is created from the measured values when using a blank sample and a test substance with a known concentration. The measured value of the sample containing the test substance having an unknown concentration is compared with the prepared calibration curve, and the concentration of the test substance in the sample is calculated.
被検物質がＨｂＡ１ｃの場合、その定量方法として、酵素法による測定が好適に用いられる。酵素法としては、例えば、特開平２−１９５８９９号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平５−１９２１９３号公報、特開平６−４６８４６号公報、特開平７−２８９２５３号公報、特開平８−１５４６７２号公報、特開平８−３３６３８６号公報に記載の方法が挙げられ、具体的には、糖化ヘモグロビンよりプロテアーゼを用いて糖化アミノ酸／ペプチドを切り出し、次に該糖化アミノ酸／ペプチドと反応する酸化酵素を作用させて過酸化水素を生成させ、さらにパーオキシダーゼの存在下で発色基質を発色に導くことにより糖化ヘモグロビンを比色定量する。 When the test substance is HbA1c, measurement by an enzyme method is suitably used as the quantification method. Examples of the enzyme method include JP-A-2-195899, JP-A-2-195900, JP-A-5-192193, JP-A-6-46846, JP-A-7-289253, and JP-A-8. 154672 and JP-A-8-336386. Specifically, a glycated amino acid / peptide is excised from glycated hemoglobin using a protease and then reacted with the glycated amino acid / peptide. Glycated hemoglobin is colorimetrically determined by causing the enzyme to act to produce hydrogen peroxide and then leading the chromogenic substrate to color development in the presence of peroxidase.
また、ＨｂＡ１ｃを上記二試薬系の試薬により定量する場合、第一試薬にヘモグロビンを安定化するヘモグロビン安定化剤が含有されているのが好ましい。ヘモグロビン安定化剤の第一試薬中の含有量は、０．０００１〜０．１質量％（以下、単に％）、好ましくは０．００１〜０．１質量％である。
上記ヘモグロビン安定化剤としては、ヘモグロビンを安定化するものであれば特に制限はなく、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン化カリウム、好ましくは、アジ化ナトリウム、アジ化カリウムが挙げられる。In addition, when HbA1c is quantified with the above-described two-reagent reagent, the first reagent preferably contains a hemoglobin stabilizing agent that stabilizes hemoglobin. The content of the hemoglobin stabilizer in the first reagent is 0.0001 to 0.1% by mass (hereinafter simply referred to as%), preferably 0.001 to 0.1% by mass.
The hemoglobin stabilizer is not particularly limited as long as it stabilizes hemoglobin, and examples thereof include sodium azide, potassium azide, sodium cyanide, potassium cyanide, preferably sodium azide and potassium azide. It is done.
以下に実施例をもって本願発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ グルコース定量における添加回収試験
１．試料の作製
＜ブランク試料＞
・比較品；生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
・本発明品；１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液（１０，０００Ｕのパーオキシダーゼ（東洋紡社製）を、精製水１Ｌで溶解した）
＜校正用試料＞
・グルコース濃度既知ヒト全血（グルコース濃度９４ｍｇ／ｄＬ）
＜グルコース添加ヒト全血試料＞
０、２００、４００、６００、８００、１０００ｍｇ／ｄＬの濃度のグルコース水溶液１００μＬとヒト全血（グルコース濃度が９４ｍｇ／ｄＬである全血）９００μＬを混合した。Example 1 Addition Recovery Test for Glucose Determination Sample preparation <Blank sample>
・ Comparative product: Saline (0.9% NaCl)
-Product of the present invention: 10 U / mL POD aqueous solution (10,000 U peroxidase (Toyobo Co., Ltd.) was dissolved in 1 L of purified water)
<Sample for calibration>
-Human whole blood with known glucose concentration (glucose concentration 94 mg / dL)
<Glucose-added human whole blood sample>
100 μL of glucose aqueous solution having a concentration of 0, 200, 400, 600, 800, 1000 mg / dL and 900 μL of human whole blood (whole blood having a glucose concentration of 94 mg / dL) were mixed.
２．ブランク試料、校正用試料及びグルコース添加ヒト全血試料の測定
生化学自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ９１３０（日本電子）を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜基質試薬（第一試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、同仁化学研究所社製）緩衝液、ｐＨ６．０
１ｍＭ ＥＳＢｍＴ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ−ｍ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ、積水メディカル社製）
１Ｕ／ｍＬ Ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ（天野エンザイム社製）
０．１％プルロニックＦ８８（ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ＡＤＥＫＡ社製）
＜発色試薬（第二試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０
２ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
２Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡社製）
２００Ｕ／ｍＬ グルコースオキシダーゼ（東洋紡社製）2. Measurement of blank sample, calibration sample, and glucose-added human whole blood sample Each sample was measured by the following operation using a biochemical automatic analyzer JCA-BM9130 (JEOL).
<Substrate reagent (first reagent)>
100 mM MES (2-Morpholinoethane acid, monohydrate, manufactured by Dojindo Laboratories) buffer solution, pH 6.0 containing the following components:
1 mM ESBmT (N-ethyl-N-sulfobutyl-m-toluidine, manufactured by Sekisui Medical)
1U / mL Mutarotase (Amano Enzyme)
0.1% Pluronic F88 (polyoxyethylene (200) polyoxypropylene (40) glycol, manufactured by ADEKA)
<Coloring reagent (second reagent)>
100 mM MES buffer pH 6.0 containing the following ingredients
2 mM 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
2U / mL peroxidase (Toyobo)
200 U / mL glucose oxidase (Toyobo)
各試料５μＬを精製水１００μＬで希釈した希釈試料１５μＬ及び第一試薬６０μＬをセルに分注し３７℃で５分間加温後、主波長５９８ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ１）。続いて第二試薬２０μＬを添加し、３７℃で５分間加温後、主波長５９８ｎｍ、副波長８０５ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ２）。
各試料のＡｂｓ１（ＯＤ）及びＡｂｓ２（ＯＤ）から、下記式Ａを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ａ：吸光度変化量（ΔＡｂｓ）＝Ａｂｓ２−Ａｂｓ１×７５÷９５
各試料の感度を表１に示す。15 μL of a diluted sample obtained by diluting 5 μL of each sample with 100 μL of purified water and 60 μL of the first reagent were dispensed into a cell, heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then measured for absorbance at a main wavelength of 598 nm and a subwavelength of 805 nm (Abs1). Subsequently, 20 μL of the second reagent was added, and after heating at 37 ° C. for 5 minutes, absorbance at a main wavelength of 598 nm and a sub wavelength of 805 nm was measured (Abs2).
From the Abs1 (OD) and Abs2 (OD) of each sample, the absorbance change amount (measured value) of each sample was calculated using the following formula A.
Formula A: Absorbance change (ΔAbs) = Abs2−Abs1 × 75 ÷ 95
The sensitivity of each sample is shown in Table 1.
表１から明らかなように、ブランク試料として生理食塩水を測定したときは過酸化物を測り込むため、過酸化物のシグナルが生じるのに対し、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液を測定したときは試料が含有するパーオキシダーゼ活性により過酸化物は消去されるため、ブランク値が低減されていた。 As is apparent from Table 1, when measuring saline as a blank sample, peroxide is measured, so a peroxide signal is generated, whereas when measuring a 10 U / mL POD aqueous solution, the sample is Since the peroxide was erased by the peroxidase activity contained, the blank value was reduced.
３．検量線の作成
ブランク試料（生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液）と校正用試料の２点より一次検量線を作成した。図１に示す。3. Preparation of calibration curve A primary calibration curve was prepared from two points of a blank sample (physiological saline, 10 U / mL POD aqueous solution) and a calibration sample. As shown in FIG.
４．グルコース添加ヒト全血試料の定量
上記３で作成した検量線を用いて、グルコース添加ヒト全血試料のグルコース濃度を算出した結果を表２に示す。4). Quantification of glucose-added human whole blood sample Table 2 shows the results of calculating the glucose concentration of the glucose-added human whole blood sample using the calibration curve prepared in 3 above.
表２から分かるように、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液をブランク試料として使用したときはグルコースの添加回収率は概ね１００％の回収率であったのに対して、生理食塩水をブランク試料として使用したときにはグルコースの回収率は大きな誤差が生じた。このように検量線作成において、過酸化物を含む試薬で測定を行うとき、パーオキシダーゼを含有するブランク試料を盲検として測定することにより正確な測定ができることが判明した。 As can be seen from Table 2, when a 10 U / mL POD aqueous solution was used as a blank sample, the glucose recovery rate was approximately 100%, whereas when physiological saline was used as a blank sample. There was a large error in glucose recovery. Thus, it was found that when a calibration curve was prepared with a reagent containing peroxide, an accurate measurement could be performed by measuring a blank sample containing peroxidase as a blind test.
実施例２ ＨｂＡ１ｃの定量
１．試料の作製
＜ブランク試料＞
・比較品；生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
・本発明品；１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液（１０，０００Ｕのパーオキシダーゼ（東洋紡社製）を、精製水１Ｌで溶解した）
＜校正用試料＞
・ヘモグロビンＡ１ｃ校正用試料Ｌ（ＨｂＡ１ｃ（％）５．２７％、凍結乾燥品）、（積水メディカル製、ＨｂＡ１ｃコントロールＬ）
・ヘモグロビンＡ１ｃ校正用試料Ｍ（ＨｂＡ１ｃ（％）７．６４％、凍結乾燥品）、（積水メディカル製、ＨｂＡ１ｃコントロールＭ）
・ヘモグロビンＡ１ｃ校正用試料Ｈ（ＨｂＡ１ｃ（％）１０．８１％、凍結乾燥品）、（積水メディカル製、ＨｂＡ１ｃコントロールＨ）
いずれも下記検体希釈液３００μＬで溶解して測定に供した。
なお、校正用試料であるＨｂＡ１ｃコントロールのＨｂ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）及びＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）は、ＨｂＡ１ｃコントロールをノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ用ＨｂＡ１ｃ前処理液（積水メディカル製）３００μＬで溶解したものを、ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ試薬（積水メディカル製）で測定して値を付した。
＜ＨｂＡ１ｃ実検体試料＞
予め、４℃、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した試料（ＮａＦ添加血漿８例）の血球層１５μＬを下記検体希釈液５００μＬで希釈して、溶血させた溶血試料を測定に供した。Example 2 Quantification of HbA1c Sample preparation <Blank sample>
・ Comparative product: Saline (0.9% NaCl)
-Product of the present invention: 10 U / mL POD aqueous solution (10,000 U peroxidase (Toyobo Co., Ltd.) was dissolved in 1 L of purified water)
<Sample for calibration>
・ Hemoglobin A1c calibration sample L (HbA1c (%) 5.27%, lyophilized product), (Sekisui Medical, HbA1c Control L)
・ Hemoglobin A1c calibration sample M (HbA1c (%) 7.64%, freeze-dried product), (Sekisui Medical, HbA1c Control M)
・ Hemoglobin A1c calibration sample H (HbA1c (%) 10.81%, freeze-dried product), (Sekisui Medical, HbA1c Control H)
All were dissolved in 300 μL of the following specimen diluent and used for measurement.
The Hb concentration (μmol / L) and HbA1c concentration (μmol / L) of the HbA1c control, which is a calibration sample, are those obtained by dissolving HbA1c control with 300 μL of HbA1c pretreatment solution for Nordia N HbA1c (manufactured by Sekisui Medical). The value was measured with a Nordia N HbA1c reagent (manufactured by Sekisui Medical).
<HbA1c actual sample sample>
A 15 μL blood cell layer of a sample (eight cases of NaF-added plasma) that was previously centrifuged at 4 ° C. and 2,000 rpm for 5 minutes was diluted with 500 μL of the following specimen diluent, and the hemolyzed sample was subjected to measurement.
２．ブランク試料、Ａ１ｃ検量線作成用試料及びＡ１ｃ検体試料の測定
日立７１７０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜検体希釈液＞
１０ｍＭ 亜硝酸ナトリウム
＜プロテアーゼ含有基質試薬（第一試薬）＞
以下の成分を含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１．５％ アンヒトール２０ＢＳ（花王社製）
２．０ｍｇ／ｍＬ プロチンＰＣ１０Ｆ（大和化成工業社製）
１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（東京化成工業社製）
０．０１％ アジ化ナトリウム（キシダ化学社製）
５０μＭ ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム、和光純薬工業社製）
＜発色試薬（第二試薬）＞
以下の成分を含む５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１０Ｕ／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（キッコーマン社製）
１Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡社製）2. Measurement of Blank Sample, A1c Calibration Curve Preparation Sample, and A1c Specimen Sample Using a Hitachi 7170 automatic analyzer, each sample was measured by the following operation.
<Sample dilution solution>
10 mM sodium nitrite <Protease-containing substrate reagent (first reagent)>
50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 containing the following ingredients
1.5% Amphitol 20BS (manufactured by Kao Corporation)
2.0mg / mL Protin PC10F (manufactured by Daiwa Kasei Kogyo Co., Ltd.)
1 mM N-ethylmaleimide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
0.01% sodium azide (Kishida Chemical Co., Ltd.)
50 μM DA-67 (10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
<Coloring reagent (second reagent)>
50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 containing the following ingredients
10 U / mL fructosyl peptide oxidase (Kikkoman)
1U / mL peroxidase (Toyobo)
＜測定パラメータ＞
分析方式：３ポイントエンド
測定波長（Ｈｂ、副／主）：８００／５０５
（ＨｂＡ１ｃ、副／主）：８００／６６０
測光ポイント（Ｈｂ）：０−１４
（ＨｂＡ１ｃ）：１６−３４
反応時間：１０分
サンプル量：１２μＬ
第一試薬：１８０μＬ（Ｒ１） 第３試薬（Ｒ２）：６０μＬ<Measurement parameters>
Analysis method: 3-point end measurement wavelength (Hb, secondary / main): 800/505
(HbA1c, Deputy / Main): 800/660
Metering point (Hb): 0-14
(HbA1c): 16-34
Reaction time: 10 minutes Sample volume: 12 μL
First reagent: 180 μL (R1) Third reagent (R2): 60 μL
各試料１２μＬ及び第一試薬１８０μＬをセルに分注し３７℃で５分間加温後、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度の差（Ａｂｓ１）、及び主波長５０５ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度の差（Ａｂｓ３）を測定した。続いて第二試薬６０μＬを添加し、３７℃で５分間加温後、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍの吸光度の差を測定した（Ａｂｓ２）。
各試料のＡｂｓ１（ｍＯＤ）及びＡｂｓ２（ｍＯＤ）から下記式Ｂを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ｂ：吸光度変化量（ΔＡｂｓ）＝Ａｂｓ２−Ａｂｓ１×１９２÷２５２
各試料の感度を表３に示す。After dispensing 12 μL of each sample and 180 μL of the first reagent into the cell and heating at 37 ° C. for 5 minutes, the difference in absorbance between the main wavelength of 660 nm and the sub wavelength of 800 nm (Abs1), and the difference in absorbance between the main wavelength of 505 nm and the sub wavelength of 800 nm (Abs3) was measured. Subsequently, 60 μL of the second reagent was added, and after heating at 37 ° C. for 5 minutes, the difference in absorbance between the main wavelength of 660 nm and the sub wavelength of 800 nm was measured (Abs2).
The absorbance change amount (measured value) of each sample was calculated from Abs1 (mOD) and Abs2 (mOD) of each sample using the following formula B.
Formula B: Absorbance change amount (ΔAbs) = Abs2−Abs1 × 192 ÷ 252
The sensitivity of each sample is shown in Table 3.
表３から明らかなように、ブランク試料として生理食塩水を測定したときは過酸化物を測り込むため、過酸化物のシグナルが生じるのに対し、１０Ｕ／ｍＬＰＯＤ水溶液を測定したときはパーオキシダーゼ活性により過酸化物は消去されるため、ブランク値が低減されていた。 As is apparent from Table 3, peroxide was measured when physiological saline was measured as a blank sample, so that a peroxide signal was generated, whereas peroxidase activity was measured when a 10 U / mL POD aqueous solution was measured. Since the peroxide was erased, the blank value was reduced.
３．検量線の作成
ブランク試料（生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液）と校正用試料の４点のΔＡｂｓよりＨｂＡ１ｃの検量線を作成した。検量線のグラフを図２に示す。図２から明らかなように、生理食塩水をブランク試料として検量線を作成した場合、ブランク試料の感度が校正用試料の感度を上回ることにより、特にＨｂＡ１ｃ低濃度域において正確な測定値を算出できないのに対し、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液をブランク試料として検量線を作成した場合、ブランク試料、校正用試料の４点がほぼ直線上に位置し正確な定量が可能となった。
また、ブランク試料（生理食塩水、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液）とブランク試料と校正用試料（ＨｂＡ１ｃコントロールＬ）の２点のＡｂｓ３よりＨｂの検量線を作成した。3. Preparation of calibration curve A calibration curve of HbA1c was prepared from four points of ΔAbs of a blank sample (physiological saline, 10 U / mL POD aqueous solution) and a calibration sample. A graph of the calibration curve is shown in FIG. As is apparent from FIG. 2, when a calibration curve is prepared using physiological saline as a blank sample, the measurement value cannot be calculated accurately particularly in the low concentration region of HbA1c because the sensitivity of the blank sample exceeds the sensitivity of the calibration sample. On the other hand, when a calibration curve was prepared using a 10 U / mL POD aqueous solution as a blank sample, the four points of the blank sample and the calibration sample were located almost on a straight line, and accurate quantification became possible.
In addition, a calibration curve of Hb was prepared from two points of Abs3 of the blank sample (physiological saline, 10 U / mL POD aqueous solution), the blank sample, and the calibration sample (HbA1c control L).
４．実検体試料のＨｂＡ１ｃの定量
上記３で作成した検量線を用いて、実検体試料のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）及びＨｂ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を算出し、さらに下記式Ｃ（日本糖尿病学会グリコヘモグロビン標準化ＨｂＡ１ｃ値に換算するために自動分析装置の項目間演算式、日本臨床化学会 糖尿病関連指標専門委員会：ＡＤＡ、ＥＡＳＤ、ＩＦＣＣ、ＩＤＦによるヘモグロビンＡ１ｃ測定の国際標準化に関するコンセンサス・ステートメントに対する糖尿病関連指標専門委員会の見解、臨床化学 ３６、３１０（２００７））を用いてＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
式Ｃ ＨｂＡ１ｃ（％）＝ＨｂＡ１ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）÷Ｈｂ（μｍｏｌ／Ｌ）×９６．３＋１．６２
結果を表４に示す。なお、対照としてＨＰＬＣ法でＨｂＡ１ｃ（％）の定量を行った。4). Quantitative determination of HbA1c in actual sample Using the calibration curve prepared in 3 above, the HbA1c concentration (μmol / L) and Hb concentration (μmol / L) of the actual sample were calculated. Calculation formula between items of automatic analyzer for conversion to hemoglobin standardized HbA1c value, Japan Clinical Chemistry Society Diabetes-related index expert committee: Diabetes related to consensus statement on international standardization of hemoglobin A1c by ADA, EASD, IFCC, IDF HbA1c (%) was calculated using the view of the Indicator Committee, Clinical Chemistry 36, 310 (2007)).
Formula C HbA1c (%) = HbA1c (μmol / L) ÷ Hb (μmol / L) × 96.3 + 1.62
The results are shown in Table 4. As a control, HbA1c (%) was quantified by HPLC.
＜ＨＰＬＣ法によるＨｂＡ１ｃ値の測定＞
東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３Ｇ８を用い、ＨｂＡ１ｃ（％）を測定した。<Measurement of HbA1c value by HPLC method>
HbA1c (%) was measured using a Tosoh automated glycohemoglobin analyzer HLC-723G8.
表４から分かるように、１０Ｕ／ｍＬ ＰＯＤ水溶液をブランク試料として使用したときに測定値は対照であるＨＬＣ−７２３ Ｇ８に対して、ＨｂＡ１ｃ（％）で＋０．１〜−０．３％の差異であった。それに対して生理食塩水をブランク試料として使用したときに、測定値は特にＨｂＡ１ｃ低濃度の試料においてＨｂＡ１ｃ（％）で最大２．６％の誤差が生じる結果であった。このように検量線作成において、過酸化物を含む試薬で測定を行うとき、パーオキシダーゼを含有するブランク試料を盲検として測定することにより正確な測定ができることが判明した。 As can be seen from Table 4, when a 10 U / mL POD aqueous solution was used as a blank sample, the measured value was a difference of +0.1 to −0.3% in HbA1c (%) with respect to HLC-723 G8 as a control. Met. On the other hand, when physiological saline was used as a blank sample, the measured value was a result that a maximum error of 2.6% occurred in HbA1c (%) particularly in a sample with a low concentration of HbA1c. Thus, it was found that when a calibration curve was prepared with a reagent containing peroxide, an accurate measurement could be performed by measuring a blank sample containing peroxidase as a blind test.
実施例３ ブランク試料の測定１．ブランク試料の作製
・比較品；生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
・本発明品；５０，０００Ｕ／ｍＬ カタラーゼ水溶液（和光純薬工業社製）
・本発明品；１０，０００Ｕ／ｍＬ カタラーゼ（和光純薬工業社製）＋１，０００Ｕ／ｍＬ ＰＯＤの混合溶液Example 3 Measurement of Blank Sample Blank sample preparation
・ Comparative product: Saline (0.9% NaCl)
-Product of the present invention: 50,000 U / mL catalase aqueous solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
-Product of the present invention; 10,000 U / mL catalase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) + 1,000 U / mL POD mixed solution
２．測定
日立７１７０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜界面活性剤含有基質試薬（第一試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、同仁化学研究所社製）緩衝液、ｐＨ６．０
１ｍＭ ＥＳＢｍＴ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ−ｍ−ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ、積水メディカル社製）
１Ｕ／ｍＬ Ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ（天野エンザイム社製）
１％プルロニックＦ８８（ポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール、ＡＤＥＫＡ社製）
＜発色試薬（第二試薬）＞
以下の成分を含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０
２ｍＭ ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
２Ｕ／ｍＬ パーオキシダーゼ（東洋紡社製）
２００Ｕ／ｍＬ グルコースオキシダーゼ（東洋紡社製） 2. Measurement Using a Hitachi 7170 automatic analyzer, each sample was measured by the following operation.
<Surfactant-containing substrate reagent (first reagent)>
100 mM MES (2-Morpholinoethane acid, monohydrate, manufactured by Dojindo Laboratories) buffer solution, pH 6.0 containing the following components:
1 mM ESBmT (N-ethyl-N-sulfobutyl-m-toluidine, manufactured by Sekisui Medical)
1U / mL Mutarotase (Amano Enzyme)
1% Pluronic F88 (polyoxyethylene (200) polyoxypropylene (40) glycol, manufactured by ADEKA)
<Coloring reagent (second reagent)>
100 mM MES buffer pH 6.0 containing the following ingredients
2 mM 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
2U / mL peroxidase (Toyobo)
200 U / mL glucose oxidase (Toyobo)
各試料３μＬ及び第一試薬１８０μＬをセルに分注し３７℃で５分間インキュベートした後、６００ｎｍの吸光度と８００ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ１）。続いて第二試薬６０μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、６００ｎｍの吸光度と８００ｎｍの吸光度を測定した（Ａｂｓ２）。
各試料のＡｂｓ１（ＯＤ）及びＡｂｓ２（ＯＤ）から、下記式Ｄを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ｄ：吸光度変化量（ΔＡｂｓ）＝Ａｂｓ２−Ａｂｓ１×１８３÷２４３）
各試料の感度を表５に示す。3 μL of each sample and 180 μL of the first reagent were dispensed into the cell and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then the absorbance at 600 nm and the absorbance at 800 nm were measured (Abs1). Subsequently, 60 μL of the second reagent was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then the absorbance at 600 nm and the absorbance at 800 nm were measured (Abs2).
From the Abs1 (OD) and Abs2 (OD) of each sample, the absorbance change amount (measured value) of each sample was calculated using the following formula D.
Formula D: Absorbance change (ΔAbs) = Abs2−Abs1 × 183 ÷ 243
The sensitivity of each sample is shown in Table 5.
表５から明らかなように、ブランク試料として生理食塩水を測定したときは過酸化物を測り込むため、過酸化物のシグナルが生じるのに対し、本発明品を測定したときは試料が含有するカタラーゼ、ＰＯＤ活性により過酸化物は消去されるため、ブランクが低減されていた。 As is apparent from Table 5, peroxide is measured when physiological saline is measured as a blank sample, so that a peroxide signal is generated, whereas when the present product is measured, the sample contains. Since the peroxide was eliminated by the catalase and POD activities, the blank was reduced.
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