JPWO2010044371A1 - Insulin secretagogue - Google Patents

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Abstract

アセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンなどの甘味受容体アゴニストをインスリン分泌促進剤の有効成分として用いる。また、甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択することによりインスリン分泌促進剤候補物質をスクリーニングする。さらに、甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する。A sweet receptor agonist such as acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin is used as an active ingredient of an insulin secretagogue. In addition, a test compound is added to a cell that expresses a sweet receptor, the sweet receptor signal is measured, and a substance that enhances the sweet receptor signal is selected to screen for a candidate substance for insulin secretagogue. Furthermore, in the cells expressing the sweet receptor gene and the cells in which the expression of the sweet receptor gene is suppressed, the amount of insulin secretion is measured by adding a test compound, and the insulin secretion promoting effect of the compound via the sweet receptor To evaluate.

Description

本発明は新規メカニズムに基づくインスリン分泌促進剤、並びにインスリン分泌促進剤のスクリーニング方法及び評価方法に関する。   The present invention relates to an insulin secretagogue based on a novel mechanism, and a screening method and an evaluation method for an insulin secretagogue.

インスリンは膵臓ランゲルハンス島β細胞（膵β細胞）から分泌されるホルモンで、その主な生理作用は血糖値を下げることにある。食事等により血糖値が上がると、インスリンが膵臓から分泌され、上記の作用により血糖値を正常に保つ。   Insulin is a hormone secreted from the pancreatic islets of Langerhans (pancreatic β cells), whose main physiological action is to lower blood sugar levels. When the blood sugar level rises due to meals or the like, insulin is secreted from the pancreas, and the blood sugar level is kept normal by the above action.

糖尿病は、インスリンの欠乏、または作用の不足によって、ブドウ糖の代謝に異常が起こり、慢性的に高血糖状態を呈する疾患である。そして、この高血糖状態により、神経障害、白内障、腎障害、網膜症、関節硬化症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性壊疽等の種々の合併症を発症することがある。糖尿病には、I型糖尿病(インスリン依存型)とII型糖尿病(インスリン非依存型)がある。I型糖尿病は、膵β細胞が、免疫障害等の原因でインスリンを分泌できなくなり、高血糖として発症するものである。一方、II型糖尿病は、インスリンの分泌量が低下するか（インスリン分泌不全）、インスリンの血糖を下げる作用が弱くなって（インスリン抵抗性）発症するもので、遺伝素因のほかに、エネルギーの過剰摂取や栄養の偏った食生活、運動不足、ストレスが大きく関わっており、日本人の糖尿病の90％を占めている。   Diabetes mellitus is a disease in which glucose metabolism is abnormal due to a lack of insulin or a lack of action, resulting in a chronically hyperglycemic state. This hyperglycemic state may cause various complications such as neuropathy, cataract, renal disorder, retinopathy, arteriosclerosis, atherosclerosis, and diabetic gangrene. Diabetes includes type I diabetes (insulin-dependent) and type II diabetes (insulin-independent). Type I diabetes develops as hyperglycemia because pancreatic β cells cannot secrete insulin due to immune disorders or the like. On the other hand, type II diabetes develops because insulin secretion is decreased (insulin secretion failure) or insulin's blood glucose lowering action is weakened (insulin resistance). Eating habits with uneven intake and nutrition, lack of exercise, and stress are greatly involved, accounting for 90% of Japanese diabetes.

糖尿病の症状を改善するには、インスリンを直接注射する治療法のほかに、スルホニル尿素剤のように膵臓β細胞に直接働き、インスリンの分泌を促進する薬剤を服用する方法がある。
スルホニル尿素剤は、膵β細胞を刺激し、内因性インスリン分泌を促進するが、インスリン分泌のタイミング及び分泌量は、血糖値とは関係なく、薬物の投与タイミング及び投与量によって決まる。このため、副作用として薬剤の作用持続に起因する低血糖を呈する場合がある。また、食欲不振等の消化器症状が現れる。更に、重症ケトーシス又は肝若しくは腎機能障害のある患者には禁忌である。一方、インスリン製剤は、確実に血糖値を低下させるが、注射により投与しなければならない上に、低血糖になるおそれもある。そこで、より優れた血糖降下剤が切望されていた。In order to improve the symptoms of diabetes, in addition to the treatment method in which insulin is directly injected, there is a method of taking a drug that directly acts on pancreatic β cells and promotes insulin secretion, such as a sulfonylurea agent.
The sulfonylurea agent stimulates pancreatic β-cells and promotes endogenous insulin secretion, but the timing and amount of insulin secretion are determined by the timing and dose of the drug regardless of the blood glucose level. For this reason, hypoglycemia resulting from the sustained action of the drug may be exhibited as a side effect. In addition, gastrointestinal symptoms such as anorexia appear. Furthermore, it is contraindicated in patients with severe ketosis or liver or kidney dysfunction. On the other hand, insulin preparations certainly lower blood sugar levels, but they must be administered by injection and may result in hypoglycemia. Thus, a better hypoglycemic agent has been eagerly desired.

甘味受容体はＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３という２種類のサブユニットからなるGタンパク共役受容体（GPCR）スーパーファミリーに属する受容体であり、甘味刺激を認識する受容体である（非特許文献１および２）。しかしながら、甘味受容体は主に舌上皮に存在する味細胞に発現しており、その他の組織での発現や役割は不明である。   Sweet receptors are receptors belonging to the G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily consisting of two types of subunits, T1R2 and T1R3, and are receptors that recognize sweet stimuli (Non-Patent Documents 1 and 2). However, sweet receptors are expressed mainly in taste cells present in the tongue epithelium, and their expression and role in other tissues are unknown.

Ｃｅｌｌ，２００１．１０６（３）：ｐ．３８１−９０、Cell, 2001.106 (3): p. 381-90, Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２．９９（７）：ｐ．４６９２−６Proc Natl Acad Sci USA, 2002.99 (7): p. 4692-6

本発明は新規標的に作用してインスリン分泌を促進する薬剤を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide a drug that acts on a novel target to promote insulin secretion.

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、膵β細胞に甘味受容体が発現しており、甘味受容体のアゴニストにインスリン分泌促進作用があることを見出して本発明を完成させた。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor found that a sweet receptor is expressed in pancreatic β cells, and that an agonist of the sweet receptor has an insulin secretion promoting action, the present inventor Completed.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）甘味受容体アゴニストを有効成分とするインスリン分泌促進剤。
（２）甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、（１）のインスリン分泌促進剤。
（３）甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択する、インスリン分泌促進剤候補物質のスクリーニング方法。
（４）甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌促進能の評価方法。
（５）甘味受容体アゴニストのインスリン分泌促進剤の製造における使用。
（６）甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、（５）に記載の使用。
（７）甘味受容体アゴニストを投与する工程を含む、インスリン分泌促進方法。
（８）甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、（７）に記載の方法。That is, the present invention is as follows.
(1) An insulin secretion promoter comprising a sweet receptor agonist as an active ingredient.
(2) The insulin secretion promoter according to (1), wherein the sweet receptor agonist is acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin.
(3) A method for screening an insulin secretagogue candidate substance, comprising adding a test compound to a cell expressing a sweet receptor, measuring a sweet receptor signal, and selecting a substance that enhances the sweet receptor signal.
(4) In a cell expressing a sweet receptor gene and a cell in which the expression of the sweet receptor gene is suppressed, the amount of insulin secretion is measured by adding a test compound, and the insulin secretion is promoted via the sweet receptor of the compound. A method for evaluating the ability of a compound to promote insulin secretion, wherein the effect is evaluated.
(5) Use of a sweet receptor agonist in the production of an insulin secretagogue.
(6) The use according to (5), wherein the sweet receptor agonist is acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin.
(7) A method for promoting insulin secretion, comprising a step of administering a sweet receptor agonist.
(8) The method according to (7), wherein the sweet receptor agonist is acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin.

マウス膵β細胞由来MIN6 細胞における甘味受容体遺伝子の発現（写真）。Expression of sweet receptor gene in mouse pancreatic β cell-derived MIN6 cells (photo). マウス膵島における甘味受容体遺伝子の発現（写真）。Expression of sweet receptor gene in mouse islets (photo). MIN6 細胞における人工甘味料AcesulfameKの作用（n=4、*: P<0.05）。Action of artificial sweetener AcesulfameK on MIN6 cells (n = 4, *: P <0.05). AcesulfameK による細胞内カルシウムと cAMP の増加。AcesulfameK increases intracellular calcium and cAMP. MIN6 細胞における各種人工甘味料の作用（n=4、*: P<0.05）。Effect of various artificial sweeteners on MIN6 cells (n = 4, *: P <0.05). MIN6 細胞におけるＴ１Ｒ２ノックダウンの効果（n=4、*: P<0.05）。Effect of T1R2 knockdown in MIN6 cells (n = 4, *: P <0.05). in vivo における人工甘味料（Saccharin）の血糖降下作用（n=4、*: P<0.05）。Hypoglycemic effect of artificial sweetener (Saccharin) in vivo (n = 4, *: P <0.05).

本発明のインスリン分泌促進剤は、甘味受容体アゴニストを有効成分とする。
ここで、甘味受容体とはＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３の２種類のサブユニットのヘテロダイマーからなるGタンパク質共役型受容体（GPCR）で、リガンドの刺激に対して細胞内にシグナル伝達を行う受容体を意味する。
甘味受容体としては、例えば、ヒトＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３からなる甘味受容体やマウスＴ１Ｒ２とＴ１Ｒ３からなる甘味受容体が例示される。
ヒトＴ１Ｒ２としては配列番号４のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_152232）を有するタンパク質が挙げられ、ヒトＴ１Ｒ３としては配列番号８のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_152228）を有するタンパク質が挙げられる。
また、マウスＴ１Ｒ２としては配列番号２のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_031873）を有するタンパク質が挙げられ、マウスＴ１Ｒ３としては配列番号６のアミノ酸配列（GenBank Accession No: NM_031872）を有するタンパク質が挙げられる。
なお、これらのタンパク質のアミノ酸配列は種や個体の違いによってアミノ酸が１〜数個、置換、欠失、挿入等されることがあるので、そのようなアミノ酸配列であっても互いにヘテロダイマーを形成して甘味受容体としての機能を果たすことのできるものであれば、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３として使用できる。なお、「１〜数個」とは好ましくは「１〜２０個」、より好ましくは「１〜１０個」を意味する。The insulin secretion promoter of the present invention contains a sweet receptor agonist as an active ingredient.
Here, the sweet receptor is a G protein-coupled receptor (GPCR) consisting of heterodimers of two types of subunits, T1R2 and T1R3, and means a receptor that performs intracellular signal transduction in response to ligand stimulation. To do.
Examples of the sweetness receptor include a sweetness receptor composed of human T1R2 and T1R3 and a sweetness receptor composed of mouse T1R2 and T1R3.
Human T1R2 includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (GenBank Accession No: NM_152232), and human T1R3 includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (GenBank Accession No: NM_152228).
Examples of mouse T1R2 include a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (GenBank Accession No: NM_031873). Examples of mouse T1R3 include a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (GenBank Accession No: NM_031872).
The amino acid sequences of these proteins may be substituted, deleted, inserted, etc., depending on the species or individual, so that even such amino acid sequences form heterodimers with each other. As long as it can function as a sweet taste receptor, it can be used as T1R2 and T1R3. In addition, “1 to several” preferably means “1 to 20”, and more preferably “1 to 10”.

甘味受容体アゴニストとは、甘味受容体に作用して甘味受容体のシグナルを増強させる物質をいう。甘味受容体のシグナルとしては、細胞内Ca2+濃度と細胞内サイクリックAMP（cAMP）濃度が挙げられる。
例えば、甘味受容体アゴニストとして、人工甘味料アセスルファームK（Acesulfame K ：アセスルファムカリウムとも呼ばれる）、 スクラロース（Sucralose：トリクロロガラクトスクロースとも呼ばれる）、サッカリン（Saccharin）、グリチルリチン (Glycyrrhizin)などが挙げられる。
また、ＷＯ２００５／０１５１５８に記載の化合物も甘味受容体アゴニストとして使用できる。A sweet receptor agonist refers to a substance that acts on a sweet receptor to enhance the signal of the sweet receptor. Examples of sweet receptor signals include intracellular Ca 2+ concentration and intracellular cyclic AMP (cAMP) concentration.
Examples of the sweet receptor agonist include artificial sweetener acesulfame K (also called acesulfame potassium), sucralose (also called trichlorogalactosucrose), saccharin, and glycyrrhizin.
The compounds described in WO2005 / 015158 can also be used as sweet receptor agonists.

甘味受容体アゴニストは上記のものに限定されず、新たにスクリーニングを行うことによって得られる化合物であってもよい。化合物は合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検化合物を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。
甘味受容体アゴニストは、例えば、MIN6（マウスインスリノーマ細胞）などの膵β細胞由来細胞にＴ１Ｒ２遺伝子とＴ１Ｒ３遺伝子を発現させて、その細胞に被検化合物を添加し、細胞内のCa2+濃度とcAMP濃度を増加させる化合物を選択することによりスクリーニングすることができる。
ここで、Ｔ１Ｒ２遺伝子としては、配列番号１（マウス）または３（ヒト）の塩基配列を含むDNA、Ｔ１Ｒ３遺伝子としては、配列番号５（マウス）または７（ヒト）の塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、これらの塩基配列とストリンジェントな条件（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）でハイブリダイズし、甘味受容体の機能的サブユニットをコードするDNAであってもよい。
化合物の選択の基準としては、例えば、上記のアセスルファームKをポジティブコントロールとし、それと同じかそれ以上の細胞内Ca2+濃度とcAMP濃度を増加させる能力を有する化合物を甘味受容体アゴニストとして選択することができる。The sweet receptor agonist is not limited to those described above, and may be a compound obtained by performing a new screening. The compound may be a synthetic compound or a compound contained in a natural product. Moreover, a peptide may be sufficient. Although individual test compounds may be used for screening, a compound library containing these substances may be used.
For example, a sweet receptor agonist expresses T1R2 gene and T1R3 gene in a pancreatic β cell-derived cell such as MIN6 (mouse insulinoma cell), adds a test compound to the cell, and determines the intracellular Ca 2+ concentration. Screening can be done by selecting compounds that increase cAMP concentration.
Here, the T1R2 gene includes DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (mouse) or 3 (human), and the T1R3 gene includes DNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 (mouse) or 7 (human). It is done. Further, it may be DNA that hybridizes with these base sequences under stringent conditions (for example, 65 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS) and encodes a functional subunit of a sweet receptor. Good.
As a criterion for selection of compounds, for example, acesulfame K described above is used as a positive control, and compounds having the same or higher ability to increase intracellular Ca 2+ concentration and cAMP concentration are selected as sweet receptor agonists. can do.

甘味受容体アゴニストは、膵β細胞に発現する甘味受容体に作用してインスリンの分泌を促進する。
したがって、インスリン分泌促進剤として使用することができる。インスリン分泌促進剤は、糖尿病、特に２型糖尿病治療薬の治療に使用することができるが、メタボリックシンドロームや肥満などの治療にも使用することができる。Sweet receptor agonists act on sweet receptors expressed in pancreatic β cells to promote insulin secretion.
Therefore, it can be used as an insulin secretion promoter. Insulin secretion promoters can be used for the treatment of diabetes, particularly type 2 diabetes therapeutics, but can also be used for the treatment of metabolic syndrome and obesity.

本発明のインスリン分泌促進剤は、投与対象、投与ルート、対象疾患、体重、症状などによっても異なるが、例えば、成人のインスリン分泌促進剤が必要な糖尿病患者に経口投与する場合、有効成分である化合物を、通常1回量として約０．０１〜８００ｍｇ、好ましくは０．1〜５００ｍｇ、さらに好ましくは０．５〜３００ｍｇであり、この量を１日１〜３回投与するのが好ましい。   The insulin secretagogue of the present invention varies depending on the administration subject, administration route, target disease, weight, symptoms, etc., but is an active ingredient when administered orally to diabetic patients who need an insulin secretagogue, for example. The compound is usually about 0.01 to 800 mg, preferably 0.1 to 500 mg, more preferably 0.5 to 300 mg as a single dose, and this amount is preferably administered 1 to 3 times a day.

本発明のインスリン分泌促進剤は、経口、口腔内、吸入、経鼻、経粘膜、直腸および注射等の投与経路で投与されるが、有効成分である化合物に適当な製剤添加物を使用し製剤化することができる。当該製剤添加物としては、上記投与経路に適した剤型の医薬品を製造する上で通常使用される添加剤が挙げられ、例えば、第１４改正日本薬局方（以下、「局方」ともいう）および「医薬品添加物事典」（薬事日報社、1994年1月14日発行）に収載されている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、湿潤剤、溶剤、基剤、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、保存剤、安定剤などから錠剤、顆粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、トローチ剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、エアゾール剤および坐剤などに適したものが選択される。   The insulin secretagogue of the present invention is administered by the route of administration such as oral, buccal, inhalation, nasal, transmucosal, rectal and injection, and is formulated using appropriate formulation additives for the active ingredient compound. Can be Examples of the formulation additive include additives usually used for producing a pharmaceutical product having a dosage form suitable for the above administration route. For example, the 14th revised Japanese Pharmacopoeia (hereinafter also referred to as “Pharmacopeia”) And excipients, binders, disintegrants, lubricants, coating agents, wetting agents, solvents, bases listed in the “Pharmaceutical Additives Encyclopedia” (published on January 14, 1994) Suspending agents, emulsifiers, solubilizers, preservatives, stabilizers, etc., tablets, granules, powders, hard capsules, soft capsules, troches, dry syrups, syrups, solutions, suspensions, injections Those suitable for aerosols and suppositories are selected.

当該製剤添加物の具体的な物質としては、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、ゼラチン、寒天、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、水素添加植物油、マクロゴール、グリセリン、注射用水、アルギン酸、ポリソルベート、レシチンなどが挙げられる。
本発明のインスリン分泌促進剤は、例えば、局方に記載の錠剤、顆粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、トローチ剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、エアゾール剤および坐剤の製造法に従って製造することができる。Specific substances of the formulation additive include starch, corn starch, crystalline cellulose, lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol, gelatin, agar, gum arabic, hydroxypropylcellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, methylcellulose, carboxy Examples include methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, magnesium stearate, talc, calcium carbonate, sodium bicarbonate, hydrogenated vegetable oil, macrogol, glycerin, water for injection, alginic acid, polysorbate, lecithin and the like.
The insulin secretagogue of the present invention includes, for example, tablets, granules, powders, hard capsules, soft capsules, troches, dry syrups, syrups, solutions, suspensions, injections, aerosols described in the pharmacopoeia It can be manufactured according to the manufacturing method of suppositories and suppositories.

本発明はまた、甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌能の評価方法を提供する。用いる甘味受容体遺伝子を発現する細胞としては、ＭＩＮ６細胞などの膵β細胞が好ましい。そして、甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞としては甘味受容体遺伝子を発現する細胞と同じ種類の細胞であって、siRNA（small interfering RNA）などを用いて甘味受容体遺伝子の発現を抑制した細胞が好ましく用いられる。
甘味受容体遺伝子が抑制された細胞ではインスリン分泌を促進せず、甘味受容体遺伝子を発現する細胞ではインスリン分泌を促進することが確認できれば、当該化合物は甘味受容体に作用してインスリン分泌を促進する化合物と判断することができる。The present invention also relates to the measurement of the amount of insulin secreted by adding a test compound in cells expressing the sweet receptor gene and cells in which the expression of the sweet receptor gene is suppressed, and the insulin via the sweet receptor of the compound is measured. Provided is a method for evaluating an insulin secretory ability of a compound for evaluating a secretagogue effect. As the cells expressing the sweet receptor gene to be used, pancreatic β cells such as MIN6 cells are preferable. The sweet receptor gene expression is suppressed in the same type of cells that express the sweet receptor gene, and the expression of the sweet receptor gene is suppressed using siRNA (small interfering RNA). Cells are preferably used.
If it is confirmed that cells that suppress the sweet receptor gene do not promote insulin secretion and cells that express the sweet receptor gene promote insulin secretion, the compound acts on the sweet receptor to promote insulin secretion. It can be judged that it is a compound.

マウス膵β細胞由来MIN6 細胞における甘味受容体遺伝子の発現
MIN6 細胞よりトータルRNAを抽出し、甘味受容体（T1R2+T1R3）、ガストデューシンαサブユニット（Gαgust）遺伝子の発現をRT-PCRで検討した。プライマー配列は以下のとおり。
T1R2：配列番号９，１０
T1R3：配列番号１１，１２
Gαgust：配列番号１３，１４
結果を図１に示した。その結果、甘味受容体が膵β細胞において発現していることがわかった。なお、膵β細胞での発現が報告されているガストデューシンαサブユニットの発現も確認できた。Expression of sweet receptor genes in mouse pancreatic beta cell-derived MIN6 cells
Total RNA was extracted from MIN6 cells, and the expression of sweet receptor (T1R2 + T1R3) and gustducin α subunit (Gαgust) gene was examined by RT-PCR. Primer sequences are as follows.
T1R2: SEQ ID NOs: 9, 10
T1R3: SEQ ID NOS: 11, 12
Gαgust: SEQ ID NOs: 13 and 14
The results are shown in FIG. As a result, it was found that the sweet receptor was expressed in pancreatic β cells. In addition, the expression of gustducin α subunit, which was reported to be expressed in pancreatic β cells, was also confirmed.

マウス膵島における甘味受容体の発現
マウス（C57/B）から膵島を単離してmRNA を抽出し、T1R2、T1R3、ガストデューシンαサブユニット（Gαgust）についてmRNA 発現を RT-PCR法により測定した。用いたプライマーは上記と同じである。
結果を図２に示す。その結果、甘味受容体が膵島において発現していることがわかった。なお、ガストデューシンαサブユニットの発現も確認できた。Expression of sweet receptor in mouse islets Islet was isolated from mouse (C57 / B) and mRNA was extracted, and mRNA expression of T1R2, T1R3 and gustducin α subunit (Gαgust) was measured by RT-PCR. The primers used are the same as above.
The results are shown in FIG. As a result, it was found that the sweet receptor is expressed in the islets. The expression of gustducin α subunit was also confirmed.

MIN6 細胞における人工甘味料AcesulfameKの作用方法
MIN6 細胞を 3 x 105/well の密度で２４穴プレートに培養した。グルコースを含まないKrebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB)に１時間プレインキュベーションした後、グルコースまたはAcesulfameKを加え、１時間インキュベーションを行った。この時、KRB のグルコース濃度は0、2.8 あるいは20 mM とした。Action method of artificial sweetener AcesulfameK in MIN6 cells
MIN6 cells were cultured in 24-well plates at a density of 3 × 10 5 / well. After preincubation for 1 hour in Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB) containing no glucose, glucose or AcesulfameK was added and incubated for 1 hour. At this time, the glucose concentration of KRB was 0, 2.8 or 20 mM.

結果を図３に示す。それによると、代表的なインスリン刺激物質である 20mM グルコースはインスリン分泌を基礎分泌(2.8mM グルコース) の約８倍に増加させたが、50mM AcesulfameK もほぼ同等の分泌刺激効果を示した。AcesulfameK の作用はグルコースの非存在下でも観察された。さらに、AcesulfameK の作用は 20mM グルコースと相加作用を示した。   The results are shown in FIG. According to it, 20 mM glucose, which is a typical insulin stimulating substance, increased insulin secretion to about 8 times that of basal secretion (2.8 mM glucose), but 50 mM AcesulfameK also showed almost the same secretory stimulating effect. The effect of AcesulfameK was also observed in the absence of glucose. Furthermore, AcesulfameK had an additive effect with 20 mM glucose.

AcesulfameK による細胞内カルシウムと cAMP の増加
AcesulfameK をMIN6細胞に添加し、細胞内カルシウムと cAMPの濃度変化を調べた。
なお、細胞内サイクリックAMP(cAMP)濃度の変化は、EpacのcAMP結合ドメインを用いたFLET法（J.Biol.Chem. vol. 280:p31294-31302. 2005）によりモニターした。また細胞内カルシウム濃度は、カルシウム感受性蛍光色素 Fura2 を用いて cAMPと同時測定を行った。AcesulfameK increases intracellular calcium and cAMP
AcesulfameK was added to MIN6 cells, and changes in intracellular calcium and cAMP concentrations were examined.
Changes in intracellular cyclic AMP (cAMP) concentration were monitored by the FLET method (J. Biol. Chem. Vol. 280: p31294-31302. 2005) using the cAMP binding domain of Epac. The intracellular calcium concentration was measured simultaneously with cAMP using the calcium sensitive fluorescent dye Fura2.

結果を図４に示す。それによると、AcesulfameK (50mM) を投与すると直ちに細胞内カルシウム濃度が増加した。わずかに遅れて細胞内 cAMP 濃度も増加し、ともにAcesulfameKが存在する間増加し続けた。以上の結果より、AcesulfameKのインスリン分泌促進効果は甘味受容体を介し正統的な細胞内メッセンジャー系を介して発現されることが考えられた。   The results are shown in FIG. According to it, intracellular calcium concentration immediately increased after administration of AcesulfameK (50 mM). Slightly later, intracellular cAMP concentrations also increased and both continued to increase while AcesulfameK was present. From the above results, it was considered that the insulin secretion-promoting effect of AcesulfameK is expressed via a sweet receptor and an orthodontic intracellular messenger system.

MIN6 細胞における人工甘味料の作用
その他の人工甘味料（Sucralose、Saccharinおよびグリチルリチン）についてもインスリン分泌促進効果を調べた。
MIN6 細胞を 3 x 105/well の密度で２４穴プレートに培養した。 2.8 mMグルコースを含むKrebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB)に１時間プレインキュベーションした後、20 mMグルコース、50mM Acesulfame K (Ace-K)、50 mM Sucralose(Sucra)、50 mM Saccharin (Sacch)、または50 mMグリチルリチン (Gly)を加え、１時間インキュベーションを行いインスリンを測定した。この時、KRB のグルコース濃度2.8 mM とした。Effects of artificial sweeteners on MIN6 cells Other artificial sweeteners (Sucralose, Saccharin and glycyrrhizin) were also examined for their insulin secretion promoting effects.
MIN6 cells were cultured in 24-well plates at a density of 3 × 10 5 / well. After preincubation for 1 hour in Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB) containing 2.8 mM glucose, 20 mM glucose, 50 mM Acesulfame K (Ace-K), 50 mM Sucralose (Sucra), 50 mM Saccharin (Sacch), or 50 mM glycyrrhizin (Gly) was added and incubated for 1 hour to measure insulin. At this time, the glucose concentration of KRB was set to 2.8 mM.

結果を図５に示す。それによると、Acesulfame K (Ace-K)、 Sucralose(Sucra)、Saccharin (Sacch)、グリチルリチン (Gly)など構造の異なる人工甘味料はグルコースにほぼ匹敵するインスリン分泌刺激能を示した。   The results are shown in FIG. According to it, artificial sweeteners with different structures such as Acesulfame K (Ace-K), Sucralose (Sucra), Saccharin (Sacch), and glycyrrhizin (Gly) showed insulin secretion stimulating ability almost comparable to glucose.

MIN6 細胞におけるsiRNA（small interfering RNA）を用いたＴ１Ｒ２ノックダウンの効果
MIN6 細胞にsiＴ１Ｒ２（配列番号１５）またはsiControl（配列番号１６）を導入し、甘味受容体をノックダウンした。その後、20 mM グルコースあるいは50 mM Sucralose(Sucra)を加え、１時間インキュベーションを行いインスリンを測定した。
結果を図６に示す。その結果、Sucraloseのインスリン分泌促進作用はＴ１Ｒ２のノックダウンにより抑制された。このことから、上記人工甘味料は甘味受容体を介した特異的作用によりインスリン分泌を促進していることが考えられた。Effect of T1R2 knockdown using siRNA (small interfering RNA) in MIN6 cells
SiT1R2 (SEQ ID NO: 15) or siControl (SEQ ID NO: 16) was introduced into MIN6 cells to knock down the sweet receptor. Then, 20 mM glucose or 50 mM Sucralose (Sucra) was added and incubated for 1 hour to measure insulin.
The results are shown in FIG. As a result, the insulin secretion promoting action of Sucralose was suppressed by knockdown of T1R2. From this, it was considered that the artificial sweetener promotes insulin secretion by a specific action via a sweet taste receptor.

in vivo における人工甘味料の血糖降下作用
ラット（ウィスター系雄ラット８週令）腹腔内に 1.25 mg/g 体重の Saccharin を投与し、その後の血糖値の変化を計時的に測定した。Hypoglycemic effect of artificial sweetener in vivo Rat (8-week old male Wistar rats) was intraperitoneally administered with 1.25 mg / g body weight of Saccharin, and the subsequent change in blood glucose level was measured timely.

結果を図７に示す。それによると、Saccharin の腹腔内投与により血糖値は有意に低下し、その効果は少なくとも３０分以上持続した。   The results are shown in FIG. According to it, blood glucose level was significantly decreased by intraperitoneal administration of Saccharin, and the effect lasted for at least 30 minutes.

本発明のインスリン分泌促進剤は甘味受容体に作用してインスリンの分泌を促進するため、従来とは異なるメカニズムでインスリン分泌を促進することができる。本発明のインスリン分泌促進剤は高濃度グルコースに匹敵するインスリン分泌刺激能を持ち、さらに高濃度グルコースの作用と相加性を示すため、効率よくインスリン分泌を刺激することができる。
また、甘味受容体シグナルを増強する化合物をスクリーニングすることにより、新規なインスリン分泌促進剤を得ることもできる。Since the insulin secretion promoter of the present invention acts on a sweet receptor to promote insulin secretion, the insulin secretion can be promoted by a mechanism different from the conventional mechanism. The insulin secretagogue of the present invention has an insulin secretion stimulating ability comparable to that of high-concentration glucose, and further exhibits the action and additivity of high-concentration glucose, so that it can efficiently stimulate insulin secretion.
In addition, a novel insulin secretagogue can be obtained by screening a compound that enhances a sweet receptor signal.

Claims (8)

甘味受容体アゴニストを有効成分とするインスリン分泌促進剤。 An insulin secretion promoter comprising a sweet receptor agonist as an active ingredient. 甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項１に記載のインスリン分泌促進剤。 The insulin secretion promoter according to claim 1, wherein the sweet receptor agonist is acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin. 甘味受容体を発現する細胞に被検化合物を添加して甘味受容体シグナルを測定し、甘味受容体シグナルを増強する物質を選択する、インスリン分泌促進剤候補物質のスクリーニング方法。 A method for screening an insulin secretagogue candidate substance, comprising adding a test compound to a cell expressing a sweet receptor, measuring a sweet receptor signal, and selecting a substance that enhances the sweet receptor signal. 甘味受容体遺伝子を発現する細胞および甘味受容体遺伝子の発現が抑制された細胞において、被検化合物を添加してインスリン分泌量を測定し、化合物の甘味受容体を介したインスリン分泌促進効果を評価する、化合物のインスリン分泌促進能の評価方法。 In cells expressing the sweet receptor gene and in cells where the sweet receptor gene expression is suppressed, the amount of insulin secretion is measured by adding a test compound, and the effect of the compound on promoting insulin secretion via the sweet receptor is evaluated. A method for evaluating the ability of a compound to promote insulin secretion. 甘味受容体アゴニストのインスリン分泌促進剤の製造における使用。 Use of a sweet receptor agonist in the production of an insulin secretagogue. 甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項５に記載の使用。 Use according to claim 5, wherein the sweet receptor agonist is acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin. 甘味受容体アゴニストを投与する工程を含む、インスリン分泌促進方法。 A method for promoting insulin secretion, comprising a step of administering a sweet receptor agonist. 甘味受容体アゴニストがアセスルファームK、スクラロース、サッカリンまたはグリチルリチンである、請求項７に記載の方法。 8. The method of claim 7, wherein the sweet receptor agonist is acesulfame K, sucralose, saccharin or glycyrrhizin.
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