JPWO2008035527A1 - Anti-C1q monoclonal antibody - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体およびその製造方法、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットに関する。The present invention relates to an anti-C1q monoclonal antibody capable of specifically recognizing C1q protein and a method for producing the same, a hybridoma producing the anti-C1q monoclonal antibody, and the presence or amount of C1q protein in a sample using the anti-C1q monoclonal antibody. The present invention relates to a method for determination, and a kit therefor.
Description
本発明は、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、かかる抗体を用いたＣ１ｑの存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットなどに関するものである。 The present invention relates to an anti-C1q monoclonal antibody, a method for determining the presence or amount of C1q using such an antibody, a kit for the same, and the like.
関節リウマチ（ＲＡ）患者は、将来重篤な関節破壊に陥る群と、そうでない群とに二分される。ＲＡ患者がいずれの群に属するかで必要な治療方法は異なるが、かかる予後を有効に診断する方法はない。 Rheumatoid arthritis (RA) patients are divided into two groups: those who will suffer severe joint destruction in the future and those who will not. Although the necessary treatment method differs depending on which group the RA patient belongs to, there is no method for effectively diagnosing such prognosis.
ＲＡ患者の血中Ｃ１ｑタンパク質の量によって、関節破壊に陥るか否かの予後診断が可能であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、臨床において、患者試料中のＣ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体は確立されておらず、その開発が望まれていた。
本発明の解決課題は、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる抗Ｃ１ｑ抗体を得ること、かかる抗体の製造方法、特異的かつ再現性のあるＣ１ｑタンパク質の定量方法、ならびにそのためのキットを開発することである。 The problem to be solved by the present invention is to obtain an anti-C1q antibody that can be used for quantification of C1q protein, to develop a method for producing such antibody, a specific and reproducible method for quantification of C1q protein, and a kit therefor It is.
本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、Ｃ１ｑタンパク質量に依存して抗原と抗体の結合体量が増大する抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in view of the above circumstances, the present inventors have succeeded in producing a hybridoma that produces an anti-C1q monoclonal antibody in which the amount of a conjugate of an antigen and an antibody increases depending on the amount of C1q protein. It came to complete.
すなわち、本発明は、
（１）Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、
（２）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識することができる、（１）記載の抗体、
（３）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６４９を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（４）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５０を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（５）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５１を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（６）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５２を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（７）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５３を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（８）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５４を有するハイブリドーマにより産生される、（１）または（２）記載の抗体、
（９）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、
（１０）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法、
（１１）（９）記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法、
（１２）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、
（１３）ＥＬＩＳＡ法によるものである、（１２）記載の方法、
（１４）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を２種以上用いるものである、（１２）または（１３）記載の方法、
（１５）（４）記載の抗体と（７）記載の抗体、（４）記載の抗体と（８）記載の抗体、（６）記載の抗体と（７）記載の抗体、または（６）記載の抗体と（８）記載の抗体を用いるものである、（１４）記載の方法、
（１６）関節リウマチの予後診断のための、（１２）から（１５）のいずれか記載の方法、
（１７）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキット、
（１８）ＥＬＩＳＡ法によるものである、（１７）記載のキット、
（１９）（１）〜（８）のいずれか記載の抗体を２種以上含むものである、（１７）または（１８）記載のキット、
（２０）（４）記載の抗体と（７）記載の抗体、（４）記載の抗体と（８）記載の抗体、（６）記載の抗体と（７）記載の抗体、または（６）記載の抗体と（８）記載の抗体を含むものである、（１９）記載のキット、
（２１）関節リウマチの予後診断のための、（１７）〜（２０）のいずれか記載のキット、
を提供するものである。That is, the present invention
(1) an anti-C1q monoclonal antibody capable of specifically recognizing C1q protein,
(2) the antibody according to (1), which can specifically recognize a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7,
(3) The antibody according to (1) or (2), which is produced by a hybridoma having an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center accession number FERM BP-10649,
(4) The antibody according to (1) or (2), which is produced by a hybridoma having an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center accession number FERM BP-10650,
(5) The antibody according to (1) or (2), which is produced by a hybridoma having an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center accession number FERM BP-10651,
(6) The antibody according to (1) or (2), produced by a hybridoma having the Patent Organism Depository Accession Number FERM BP-1065, AIST
(7) The antibody according to (1) or (2), which is produced by a hybridoma having an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Accession Number FERM BP-10653,
(8) The antibody according to (1) or (2), which is produced by a hybridoma having an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center accession number FERM BP-10654,
(9) National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center Accession Number FERM BP-10649, FERM BP-10650, FERM BP-10651, FERM BP-10652, FERM BP-10653, or FERM BP-10654, A hybridoma producing an anti-C1q monoclonal antibody,
(10) A method for producing an anti-C1q monoclonal antibody, comprising using a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7,
(11) A method for producing an anti-C1q monoclonal antibody, comprising culturing the hybridoma according to (9),
(12) A method for determining the presence or amount of C1q protein in a sample, which comprises using the antibody according to any one of (1) to (8),
(13) The method according to (12), which is based on an ELISA method,
(14) The method according to (12) or (13), wherein two or more antibodies according to any one of (1) to (8) are used.
(15) The antibody according to (4) and the antibody according to (7), the antibody according to (4) and the antibody according to (8), the antibody according to (6) and the antibody according to (7), or the description according to (6) The method according to (14), wherein the antibody according to (8) and the antibody according to (8) are used.
(16) The method according to any one of (12) to (15), for prognosis of rheumatoid arthritis,
(17) A kit for determining the presence or amount of C1q protein in a sample, comprising the antibody according to any one of (1) to (8) as an essential component;
(18) The kit according to (17), which is based on an ELISA method,
(19) The kit according to (17) or (18), comprising two or more antibodies according to any one of (1) to (8),
(20) The antibody according to (4) and the antibody according to (7), the antibody according to (4) and the antibody according to (8), the antibody according to (6) and the antibody according to (7), or the description according to (6) A kit according to (19), comprising the antibody according to (8) and the antibody according to (8),
(21) The kit according to any one of (17) to (20), for prognosis of rheumatoid arthritis,
Is to provide.
本発明により、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識する抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体およびその製造方法、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いた試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法、ならびにそのためのキットなどが提供される。 According to the present invention, an anti-C1q monoclonal antibody that specifically recognizes C1q protein and a method for producing the same, a hybridoma that produces the anti-C1q monoclonal antibody, and a sample using the anti-C1q monoclonal antibody can be used for quantification of C1q protein. Provided are methods for determining the presence or amount of C1q protein, as well as kits therefor.
本発明は、１の態様において、Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識することができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体（以下、「抗Ｃ１ｑ抗体」ともいう）に関するものである。本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、Ｃ１ｑタンパク質と特異的に結合できるだけでなく、かかるタンパク質量に依存して、形成される抗原と抗体の結合体量が増大する点、すなわち、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる点で非常に優れている。本発明の抗体は、例えば、マウスのような哺乳動物をＣ１ｑタンパク質で免疫し、免疫動物のリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイブリドーマを作製し、これを培養することにより、得ることができる。他の既知の方法、例えば、遺伝子組換え法、化学合成法などを用いてかかる抗体を製造してもよい。 In one aspect, the present invention relates to an anti-C1q monoclonal antibody (hereinafter also referred to as “anti-C1q antibody”) capable of specifically recognizing C1q protein. The anti-C1q monoclonal antibody of the present invention not only specifically binds to the C1q protein but also increases the amount of the antigen-antibody conjugate formed depending on the amount of the protein, that is, for quantifying the C1q protein. It is very excellent in that it can be used. The antibody of the present invention can be obtained, for example, by immunizing a mammal such as a mouse with C1q protein, fusing a lymphocyte of the immunized animal and a myeloma cell line to produce a hybridoma, and culturing the hybridoma. it can. Such antibodies may be produced using other known methods such as gene recombination methods and chemical synthesis methods.
Ｃ１ｑタンパク質のエピトープのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１〜７および配列番号８〜１６に示す。従って、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、好ましくは、（ａ）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号１〜７のアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、および（ｃ）配列番号１〜７のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、例えば、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３％の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドを特異的に認識することができるものである。アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ジェネティクス製）を用いて測定することができる。上記ペプチドまたはそれを含むタンパク質などでマウスなどの動物を免疫し、かかる免疫マウスのリンパ球と骨髄腫細胞株を融合させてハイブリドーマを作製し、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を得てもよい。
The amino acid sequence and nucleotide sequence of the C1q protein epitope are shown in SEQ ID NO: 1-7 and SEQ ID NO: 8-16, respectively. Accordingly, the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention preferably has (a) a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 and (b) one or more, preferably 1 Or a peptide having an amino acid sequence in which several,
本発明の抗体の１の具体例は、マウス骨髄腫細胞株とマウスリンパ球との融合細胞であるハイブリドーマＫＳ−０１３１ ＃８、ＫＳ−０１３１ ＃３３、ＫＳ−０１３１ ＃３５、ＫＳ−０１３１ ＃４０、ＫＳ−０１３１ ＃５４、またはＫＳ−０１３１ ＃７６により産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体である。当該ハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託され、平成１８年８月２日付で受領され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５３、およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５４を付与された。かかるハイブリドーマを、公知の培養条件、例えば、組成：ＲＰＭＩ １６４０（Kohjin 16005005） ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA G7513） ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA S8636） ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017） １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA P4333） ２．５ｍＬ、ＦＢＳ ７５ｍＬの培地中、３７±０．１℃、５±０．１５％ ＣＯ２にて培養し、産生された抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を公知の手段・方法にて回収・精製することにより、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を製造することができる。本明細書において、ハイブリドーマＫＳ−０１３１ ＃８、ＫＳ−０１３１ ＃３３、ＫＳ−０１３１ ＃３５、ＫＳ−０１３１ ＃４０、ＫＳ−０１３１ ＃５４、およびＫＳ−０１３１ ＃７６により産生される抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体をそれぞれ、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃８、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃３３、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃３５、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃４０、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃５４、および抗Ｃ１ｑ抗体 ＃７６と表す。One specific example of the antibody of the present invention is a hybridoma KS-0131 # 8, KS-0131 # 33, KS-0131 # 35, KS-0131 # 40 which is a fusion cell of a mouse myeloma cell line and mouse lymphocytes. , KS-0131 # 54, or KS-0131 # 76. The hybridomas were deposited at the Patent Organism Depositary Center (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) and received on August 2, 2006, each with the deposit number FERM BP. -10649, FERM BP-10650, FERM BP-10651, FERM BP-1065, FERM BP-10653, and FERM BP-10654. Such hybridomas are cultured under known culture conditions, for example, composition: RPMI 1640 (Kohjin 16005005) 425 mL, L-Glutamine (SIGMA G7513) 5 mL, sodium pyruvate (SIGMA S8636) 5 mL, HAT supplement (GIBCO 21060-017) 10 mL, penicillin Streptomycin (SIGMA P4333) In a medium of 2.5 mL and FBS of 75 mL, cultured at 37 ± 0.1 ° C. and 5 ± 0.15% CO 2 , and the produced anti-C1q monoclonal antibody was subjected to known means / methods The anti-C1q monoclonal antibody can be produced by collecting and purifying the product. As used herein, anti-C1q monoclonal antibodies produced by hybridomas KS-0131 # 8, KS-0131 # 33, KS-0131 # 35, KS-0131 # 40, KS-0131 # 54, and KS-0131 # 76 Are designated as
本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、そのフラグメント、およびそのキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体または変異抗体もまた、元の抗体と同様のＣ１ｑタンパク質に対する特異性を有するものである。これらは、当業者に既知の手段・方法により製造され得る。 The anti-C1q monoclonal antibodies of the present invention include fragments thereof, modified antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies, and mutated antibodies. These fragments, modified antibodies or mutant antibodies also have the same specificity for the C1q protein as the original antibody. These can be produced by means and methods known to those skilled in the art.
本発明は、別の態様において、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６４９、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５３、またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５４を有する、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するものである。本発明のハイブリドーマは、Ｃ１ｑタンパク質で免疫されたマウス由来のリンパ球とマウス骨髄腫細胞株を融合させて得られた細胞である。 In another aspect, the present invention relates to Patent Organism Depositary, Accession No. FERM BP-10649, FERM BP-10650, FERM BP-10651, FERM BP-10652, FERM BP-10653, or FERM. The present invention relates to a hybridoma that produces an anti-C1q monoclonal antibody having BP-10654. The hybridoma of the present invention is a cell obtained by fusing a mouse lymphocyte immunized with C1q protein and a mouse myeloma cell line.
本発明は、別の態様において、配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。本発明のこの態様の製造方法において、（ａ）配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチド、（ｂ）配列番号１〜７のアミノ酸配列において、１個以上、好ましくは、１または数個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチド、または（ｃ）配列番号１〜７のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上、例えば、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９３％の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを用いてもよい。 In another aspect, the present invention relates to a method for producing an anti-C1q monoclonal antibody, wherein a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7 is used. In the production method of this aspect of the present invention, (a) a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 7, (b) one or more, preferably 1 or several, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 7, For example, a peptide having an amino acid sequence in which 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 14 amino acids have been deleted, substituted or added, or (c) A peptide having an amino acid sequence having at least 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 7, for example, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 93% may be used.
本発明のこの態様の製造方法は、上記ペプチドでマウスなどの動物を免疫する工程、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を精製する工程などを含んでいてもよい。ペプチドでの免疫、および抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の精製は、当業者に既知の方法により行われ得る。 The production method of this aspect of the present invention may include a step of immunizing an animal such as a mouse with the above peptide, a step of purifying an anti-C1q monoclonal antibody, and the like. Immunization with peptides and purification of anti-C1q monoclonal antibodies can be performed by methods known to those skilled in the art.
本発明は、さらに別の態様において、本発明のハイブリドーマを培養することを特徴とする、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の製造方法に関するものでる。ハイブリドーマの培養は、インビトロ培養、およびインビボ培養の両方を含む。インビトロ培養は、公知の培養条件にて、例えば、組成：ＲＰＭＩ １６４０（Kohjin 16005005） ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA G7513） ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA S8636） ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017） １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA P4333） ２．５ｍＬ、ＦＢＳ ７５ｍＬの培地中、３７±０．１℃、５±０．１５％ ＣＯ２にて行うことができる。インビボ培養は、例えば、マウスのごとき動物の腹腔に本発明のハイブリドーマを移植することで、達成される。本発明の製造方法は、得られた抗体を精製する工程をさらに含んでいてもよい。精製方法を当業者は適宜選択して用いることができる。In still another aspect, the present invention relates to a method for producing an anti-C1q monoclonal antibody, wherein the hybridoma of the present invention is cultured. Hybridoma culture includes both in vitro and in vivo culture. In vitro culture is performed under known culture conditions, for example, composition: RPMI 1640 (Kohjin 16005005) 425 mL, L-Glutamine (SIGMA G7513) 5 mL, sodium pyruvate (SIGMA S8636) 5 mL, HAT supplement (GIBCO 21060-017) 10 mL Penicillin / streptomycin (SIGMA P4333) in a medium of 2.5 mL and FBS 75 mL at 37 ± 0.1 ° C. and 5 ± 0.15% CO 2 . In vivo culture is achieved, for example, by transplanting the hybridoma of the present invention into the abdominal cavity of an animal such as a mouse. The production method of the present invention may further include a step of purifying the obtained antibody. Those skilled in the art can select and use the purification method as appropriate.
本発明は、さらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定する方法に関するものである。本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は、Ｃ１ｑタンパク質の量に依存して、抗原と抗体の結合体量が増大するという特性を有するので、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在ばかりでなく、量を決定することができる。本発明の決定方法において用いられる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は２種以上であってもよい。２種以上の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いることで、決定感度および特異性が増大し、精度が向上する。好ましくは、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃３３と抗Ｃ１ｑ抗体 ＃５４、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃３３と抗Ｃ１ｑ抗体 ＃７６、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃４０と抗Ｃ１ｑ抗体 ＃５４、抗Ｃ１ｑ抗体 ＃４０と抗Ｃ１ｑ抗体７６とが本発明の決定方法において用いられる。本発明の決定方法において用いられる抗体は、標識されたものであってもよい。様々な標識が公知であり、当業者は適宜選択して用いることができる。例えば、horseradish peroxidase（HRP）、ALP、Glucose oxidase、β-galactosidaseなどの酵素、FITC、Rhodamine、Cy3、Cy5、Texas Red、Alexa Fluor類、BODIPY類、IRDye類、MFP類、Quantum Dot類、AMCA、Allophycocyanin、BMP、Cy2、Cy3.5、Cy5.5、DTAF、DyLight 547、DyLight 647、FluoroNanogold、Phycoerythrin、Phycocyanin、R-PE、Saporin、TRITCなどの蛍光標識、Biotin、Digoxigenin（DIG）、Acridium Ester、Flashlightなどの化学物質、60mm Microbeadなどのビーズ、MagCellect Ferrofluid［登録商標］などの磁気ビーズ、125Iなどの放射標識、金粒子、Agaroseなどの標識が用いられる。かかる標識を付すことで、本発明の決定方法を効率よく行うことができる。In a further aspect, the present invention relates to a method for determining the presence or amount of C1q protein in a sample, characterized in that it uses an anti-C1q monoclonal antibody of the invention. Since the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention has the property that the amount of the conjugate of the antigen and the antibody increases depending on the amount of C1q protein, not only the presence of C1q protein in the sample but also the amount is determined. Can do. Two or more anti-C1q monoclonal antibodies may be used in the determination method of the present invention. By using two or more kinds of anti-C1q monoclonal antibodies, determination sensitivity and specificity increase, and accuracy improves. Preferably,
試料は、Ｃ１ｑタンパク質が含まれる可能性があればいずれのものであってもよく、例えば、血清、関節液、軟骨や骨及び各組織などが挙げられる。本発明の決定方法を用いることで、かかる試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができる。 The sample may be any sample as long as it may contain C1q protein, and examples thereof include serum, joint fluid, cartilage, bone, and each tissue. By using the determination method of the present invention, the presence or amount of C1q protein in such a sample can be determined quickly and easily.
本発明の決定方法は、例えば、上記試料を本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体とインキュベーションし、該抗Ｃ１ｑ抗体と試料中のＣ１ｑタンパク質との結合体を形成させ、次に該結合体を測定することにより、行われてもよい。例えば、サンドイッチELISA法などのELISA法、イムノブロット法、Radioimmunoassay（RIA）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いて本発明の決定方法を実施することができる。ＥＬＩＳＡ法は、特殊な設備等を必要とせず、実際の医療現場においてＣ１ｑタンパク質の存在または量の決定を迅速かつ容易に行うことが可能であるので、好ましく用いられる。 The determination method of the present invention includes, for example, incubating the sample with the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention to form a conjugate of the anti-C1q antibody and the C1q protein in the sample, and then measuring the conjugate. May be performed. For example, ELISA methods such as sandwich ELISA, immunoblot method, radioimmunoassay (RIA) method, immunoprecipitation method, method using protein array, method using flow cytometer, chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), bioluminescent enzyme The determination method of the present invention is carried out using an immunoassay (BLEIA), a measurement method using a developing device (test piece for immunoassay) that can be infused by capillary action, an immunochromatography method, an immunostaining method, an agglutination method, etc. be able to. The ELISA method is preferably used because it does not require special equipment or the like and can determine the presence or amount of C1q protein quickly and easily in an actual medical field.
本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて、Ｃ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、本発明の決定方法をＲＡの予後診断に用いることもできる。 Since the presence or amount of C1q protein can be quickly and easily determined using the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention, the determination method of the present invention can also be used for the prognosis of RA.
本発明は、なおさらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いて試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定することを特徴とする、患者におけるＲＡの予後の診断方法に関するものである。Ｃ１ｑタンパク質の存在または量は上述の方法にて決定されてもよい。 In a still further aspect, the present invention relates to a method for diagnosing the prognosis of RA in a patient, characterized in that the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention is used to determine the presence or amount of C1q protein in a sample. The presence or amount of C1q protein may be determined by the methods described above.
本発明は、もう１つの態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を投与することを特徴とする、患者におけるＲＡの治療方法に関するものである。 In another aspect, the present invention relates to a method for treating RA in a patient, characterized by administering an anti-C1q monoclonal antibody of the present invention.
本発明は、さらなる態様において、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を必須構成成分として含む、試料中のＣ１ｑタンパク質の存在または量を決定するためのキットに関するものである。本発明のキットに含まれる抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は２種以上であってもよい。２種以上の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を含むことで、本発明のキットを用いて行われるＣ１ｑタンパク質の存在または量の決定の感度、特異性、精度を向上させることができる。本発明のキットは、本発明の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体の他に、例えば、試料採取手段、標識、反応容器、決定用試薬等を含んでいてもよい。一般的に、キットには取扱説明書を添付する。本発明のキットにおいて、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体は標識されたものであってもよい。 In a further aspect, the present invention relates to a kit for determining the presence or amount of C1q protein in a sample comprising the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention as an essential component. Two or more anti-C1q monoclonal antibodies may be included in the kit of the present invention. By including two or more types of anti-C1q monoclonal antibodies, the sensitivity, specificity, and accuracy of determination of the presence or amount of C1q protein performed using the kit of the present invention can be improved. In addition to the anti-C1q monoclonal antibody of the present invention, the kit of the present invention may contain, for example, a sample collection means, a label, a reaction container, a determination reagent and the like. Generally, an instruction manual is attached to the kit. In the kit of the present invention, the anti-C1q monoclonal antibody may be labeled.
本発明のキットにおいて、例えば、サンドイッチELISA法などのELISA法、イムノブロット法、Radioimmunoassay（RIA）法、免疫沈降法、プロテインアレイを用いる方法、フローサイトメーターを用いる方法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）、毛細管現象によって輸液可能な展開器材（免疫測定用試験片）を用いる測定法、イミュノクロマト法、免疫染色法、凝集法などを用いてもよい。本発明のキットを用いて、Ｃ１ｑタンパク質の存在または量を迅速かつ容易に決定することができるので、臨床現場においてＲＡ患者の予後診断が可能になる。また、本発明のキットを用いてＲＡの病理学的研究等を行うこともできる。 In the kit of the present invention, for example, an ELISA method such as a sandwich ELISA method, an immunoblot method, a radioimmunoassay (RIA) method, an immunoprecipitation method, a method using a protein array, a method using a flow cytometer, a chemiluminescent enzyme immunoassay method ( CLEIA), bioluminescent enzyme immunoassay (BLEIA), measurement using a developing device (immunoassay test piece) that can be infused by capillary action, immunochromatography, immunostaining, agglutination, etc. . Since the kit of the present invention can be used to quickly and easily determine the presence or amount of C1q protein, RA patients can be prognosticated in clinical settings. Moreover, the pathological study of RA etc. can also be performed using the kit of this invention.
以下に実施例を示して本発明を詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。 The present invention will be described in detail and specifically with reference to examples, but the examples are not intended to limit the present invention.
抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス４匹にＣ１ｑ精製タンパク質（純度９９％以上、Calbiochem 204876）０．１ｍｇをアジュバント（タイターマックス、SIGMA）と共に２週間おきに２〜３回、フットパットおよび背中皮下に投与し、免疫した。マウスの脾臓からリンパ球を回収し、抗原３０μｇを含む培地にて３日間培養した。培養後、リンパ球とマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｕ１細胞を、ＰＥＧ１５００を用いて常法に従い融合させた。融合後、細胞を組成：ＲＰＭＩ １６４０（Kohjin 16005005） ４２５ｍＬ、L-Glutamine（SIGMA G7513） ５ｍＬ、ピルビン酸ナトリウム（SIGMA S8636） ５ｍＬ、ＨＡＴサプリメント（GIBCO 21060-017） １０ｍＬ、ペニシリン・ストレプトマイシン（SIGMA P4333） ２．５ｍＬ、ＦＢＳ ７５ｍＬの培地に懸濁し、あらかじめマウス胸腺細胞を播種した９６ウェルプレートに分注した。８日後、上清中の抗体の有無をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ法の手順は以下の通りである。１μｇ／ｍｌ Ｃ１ｑのＰＢＳ中溶液を調製し、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（３９１２ ファルコン）に添加し、室温にて２時間インキュベーションすることで結合させた。次に、１％ スキムミルク／ＰＢＳを用いてブロッキングを行い、抗原プレートとした。抗原プレートに培養上清を添加して反応させ、洗浄後、ＡＬＰ標識ヤギ抗ＩｇＧ（ザイメット）を結合させた。ＡＬＰ基質を添加して、酵素反応させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定し、抗体陽性ウェルを選択した。対照として、同様に免疫したウサギの血清から分離したポリクローナル抗体を用いた。結果を図１に示す。抗原を結合させていないＥＬＩＳＡ用マイクロプレートを用い、非特異的反応を除去し、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＫＳ−０１３１ ＃８、ＫＳ−０１３１ ＃２５、ＫＳ−０１３１ ＃３３、ＫＳ−０１３１ ＃３５、ＫＳ−０１３１ ＃４０、ＫＳ−０１３１ ＃５４、ＫＳ−０１３１ ＃７６、ＫＳ−０１３１ ＃１００、ＫＳ−０１３１ ＃１０２、ＫＳ−０１３１ ＃１０７、ＫＳ−０１３１ ＃１１２、およびＫＳ−０１３１ ＃１１９などを得た。Preparation of anti-C1q monoclonal antibody-producing hybridoma Four female BALB / C mice were given 0.1 mg of C1q purified protein (purity 99% or higher, Calbiochem 204876) with adjuvant (Titermax, SIGMA) 2-3 times every 2 weeks. It was administered to the foot pad and subcutaneously in the back and immunized. Lymphocytes were collected from mouse spleen and cultured in a medium containing 30 μg of antigen for 3 days. After culture, lymphocytes and mouse myeloma cell line P3U1 cells were fused using PEG1500 according to a conventional method. After fusion, the cells were composed of: RPMI 1640 (Kohjin 16005005) 425 mL, L-Glutamine (SIGMA G7513) 5 mL, sodium pyruvate (SIGMA S8636) 5 mL, HAT supplement (GIBCO 21060-017) 10 mL, penicillin streptomycin (SIGMA P4333) It was suspended in a medium of 2.5 mL and 75 mL of FBS, and dispensed into a 96-well plate previously seeded with mouse thymocytes. After 8 days, the presence or absence of antibody in the supernatant was screened by ELISA. The procedure of the ELISA method is as follows. A solution of 1 μg / ml C1q in PBS was prepared, added to an ELISA microplate (3912 Falcon), and allowed to bind by incubation at room temperature for 2 hours. Next, blocking was performed using 1% skim milk / PBS to prepare an antigen plate. The culture supernatant was added to the antigen plate for reaction, and after washing, ALP-labeled goat anti-IgG (Zymet) was bound. An ALP substrate was added for enzyme reaction, absorbance at 492 nm was measured, and antibody-positive wells were selected. As a control, a polyclonal antibody isolated from the serum of a similarly immunized rabbit was used. The results are shown in FIG. Using an ELISA microplate to which no antigen was bound, non-specific reaction was removed, and anti-C1q monoclonal antibody-producing hybridomas KS-0131 # 8, KS-0131 # 25, KS-0131 # 33, KS-0131 # 35 , KS-0131 # 40, KS-0131 # 54, KS-0131 # 76, KS-0131 # 100, KS-0131 # 102, KS-0131 # 107, KS-0131 # 112, KS-0131 # 119, etc. Got.
Ｃ１ｑエピトープの同定
ヒトＣ１ｑのサブユニットＡ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖のアミノ酸配列を配列番号１７〜１９に、ヌクレオチド配列を配列番号２０〜２２に示す。それぞれのアミノ酸配列をもとにして、各サブユニットのアミノ酸配列を１５アミノ酸（残基）ずつ３アミノ酸の間隔でずらした配列を合成ペプチド（順に、ペプチド番号１〜７８、９７〜１１７、１９３〜２７０番）としてガラスアレイ上に合成した。それぞれのペプチドの合成はアレイ上の特定の位置で行い、Ｃ１ｑのサブユニットの全アミノ酸配列を網羅する合成ペプチド含むペプチドアレイを作製した。尚、アレイの作製はＪＰＴ社に委託して行った。Identification of C1q epitope The amino acid sequences of subunits A chain, B chain and C chain of human C1q are shown in SEQ ID NOs: 17 to 19, and nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 20 to 22, respectively. Based on the respective amino acid sequences, sequences obtained by shifting the amino acid sequence of each subunit by 15 amino acids (residues) at intervals of 3 amino acids were synthesized peptides (in order of
得られた抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから産生された抗Ｃ１ｑ抗体 ＃８、＃３３、＃４０、＃５４、および＃７６をProtein Gカラムを用いて精製した。精製した抗体のＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０、０．１Ｍ ＮａＣｌ）での１，０００倍希釈液 ３３０μｌをペプチドアレイ上に塗布し、シールをした後、４℃で１２時間インキュベートした。その後メタノール１回、Ｍｉｌｉ−Ｑ水で５分間×５回洗浄した。遠心してアレイスライドを乾燥させ、蛍光スキャナー（Agilent DNAマイクロアレイスキャナ；アジレント社製）で、スキャンし、ソフトウェア（Feature Extractionソフトウェア；アジレント社製）を用いてアレイ上のそれぞれのペプチドスポットの蛍光強度を数値化した。強い蛍光強度を示すいくつかのスポットを検出した。このうち、バックグラウンドレベルより１３，０００以上高い蛍光強度を示すペプチドスポットを表１に示す（ペプチド番号１４９、１５０、２４４〜２４６番のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３〜７に示す）。
１４９番および１５０番のペプチドはＣ１ｑＢサブユニット（Ｂ鎖）由来の配列であり、２４４番〜２４６番のペプチドはＣ１ｑＣサブユニット（Ｃ鎖）由来の配列である。これらの配列から、Ｃ１ｑエピトープのアミノ酸配列はＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基あるいはその一部を含むと予測した。 The peptides 149 and 150 are sequences derived from the C1qB subunit (B chain), and the peptides 244 to 246 are sequences derived from the C1qC subunit (C chain). From these sequences, the amino acid sequence of the C1q epitope was predicted to contain 9 residues of CKVPGLYYF (SEQ ID NO: 2) or a part thereof.
「１４９番、１５０番、２４４〜２４６番のペプチドに共通するのは９個のアミノ酸からなる配列ＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）であることから、かかる配列自体、あるいはかかる配列内に抗Ｃ１ｑ抗体のエピトープが存在すると考えられる。このアミノ酸配列に由来するより短いペプチドを使用することによって、エピトープとして必要な配列をさらに特定することができる。そのような配列を有するペプチドとしては、例えば、８アミノ酸（ＣＫＶＰＧＬＹＹ（配列番号２３）、ＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２４））、７アミノ酸（ＣＫＶＰＧＬＹ（配列番号２５）、ＫＶＰＧＬＹＹ（配列番号２６）、ＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２７））、６アミノ酸（ＣＫＶＰＧＬ（配列番号２８）、ＫＶＰＧＬＹ（配列番号２９）、ＶＰＧＬＹＹ（配列番号３０）、ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１））、５アミノ酸（ＣＫＶＰＧ（配列番号３１）、ＫＶＰＧＬ（配列番号３２）、ＶＰＧＬＹ（配列番号３３）、ＰＧＬＹＹ（配列番号３４）、ＧＬＹＹＦ（配列番号３５））、４アミノ酸（ＣＫＶＰ（配列番号３６）、ＫＶＰＧ（配列番号３７）、ＶＰＧＬ（配列番号３８）、ＰＧＬＹ（配列番号３９）、ＧＬＹＹ（配列番号４０）、ＬＹＹＦ（配列番号４１））からなるペプチド、またはそれ以下のアミノ酸からなるペプチドが挙げられる。 “The peptide 149, 150, 244 to 246 has a common sequence CKVPGLYYF (SEQ ID NO: 2) consisting of 9 amino acids, so that this sequence itself or an epitope of an anti-C1q antibody in this sequence By using a shorter peptide derived from this amino acid sequence, a sequence required as an epitope can be further specified.For example, a peptide having such a sequence may be 8 amino acids (CKVPGLYY). (SEQ ID NO: 23), KVPGLYYF (SEQ ID NO: 24)), 7 amino acids (CKVPGLY (SEQ ID NO: 25), KVPGLYY (SEQ ID NO: 26), VPGLYYF (SEQ ID NO: 27)), 6 amino acids (CKVPGL (SEQ ID NO: 28), KVPGLY) (SEQ ID NO: 29), VPGLY (SEQ ID NO: 30), PGLYYF (SEQ ID NO: 1)), 5 amino acids (CKVPG (SEQ ID NO: 31), KVPGL (SEQ ID NO: 32), VPGLY (SEQ ID NO: 33), PGLYY (SEQ ID NO: 34), GLYYF (SEQ ID NO: 35) )) 4 amino acids (CKVP (SEQ ID NO: 36), KVPG (SEQ ID NO: 37), VPGL (SEQ ID NO: 38), PGLY (SEQ ID NO: 39), GLYY (SEQ ID NO: 40), LYYF (SEQ ID NO: 41)). Peptides, or peptides consisting of less amino acids are mentioned.
ＣＫＶＰＧＬＹＹＦ（配列番号２）の９残基のペプチドがＣ１ｑエピトープであるかどうかを決定するため、さらに以下の実験を行った。配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド（Ｒ２）、およびかかるペプチドより短いアミノ酸配列ＰＧＬＹＹＦ（配列番号１）を有するペプチド（Ｒ１）をＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）社に委託して作製した。これらのペプチドを表２に示す。それぞれのペプチドを１０ｍｇ／ｍｌとなるようジメチルスルホキシドに溶解し、保存した。 In order to determine whether the 9-residue peptide of CKVPGLYYF (SEQ ID NO: 2) is a C1q epitope, the following experiment was further conducted. A peptide (R2) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a peptide (R1) having an amino acid sequence PGLYYF (SEQ ID NO: 1) shorter than the peptide were prepared by consigning to GL Biochem (Shanghai). These peptides are shown in Table 2. Each peptide was dissolved in dimethyl sulfoxide to a concentration of 10 mg / ml and stored.
ヒトＣ１ｑタンパク質（Carbiochem社製）を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４０％ グリセロール（ｐＨ７．２）に溶解し、２００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌ ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を調製した。ヒトＣ１ｑタンパク質溶液を５ｍｍ×１５ｍｍの大きさのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ；アマシャム社製）に表３の通りスポットし、室温にて約１時間風乾した。ニトロセルロース膜をＴＢＳに浸し、５分ほどなじませてから５％ブロッキング剤（Amersham ECL blocking reagent；GE Healthcare社製）を含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて室温にて１時間ブロッキングを行った。ブロッキングを行ったニトロセルロース膜をＴＢＳで軽く洗浄し、各抗Ｃ１ｑ抗体および合成ペプチドを含む溶液（２０μｌ）に浸して室温にて１時間反応させた。ＴＴＢＳ（ＴＢＳに最終濃度０．０５％で Ｔｗｅｅｎ ２０を加えたもの）にてニトロセルロース膜を一度軽く洗浄した後、十分量のＴＴＢＳで１０分×３回振盪しながら洗浄した。結合の検出を以下の通り行った。 Human C1q protein (Carbiochem) was dissolved in 10 mM HEPES, 300 mM NaCl, 40% glycerol (pH 7.2) to prepare 200 μg / ml and 50 μg / ml human C1q protein solutions. The human C1q protein solution was spotted on a nitrocellulose membrane (Hybond C; manufactured by Amersham) having a size of 5 mm × 15 mm as shown in Table 3, and air-dried at room temperature for about 1 hour. The nitrocellulose membrane is soaked in TBS, allowed to acclimate for about 5 minutes, and then brought to room temperature using TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) containing 5% blocking agent (Amersham ECL blocking reagent; manufactured by GE Healthcare). For 1 hour. The blocked nitrocellulose membrane was gently washed with TBS, immersed in a solution (20 μl) containing each anti-C1q antibody and synthetic peptide, and allowed to react at room temperature for 1 hour. The nitrocellulose membrane was lightly washed once with TTBS (TBS added with Tween 20 at a final concentration of 0.05%), and then washed with a sufficient amount of TTBS while shaking for 10 minutes × 3 times. Binding detection was performed as follows.
ＡＬＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体を用いた場合の検出方法
ニトロセルロース膜をＡＬＰ発色バッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２入りＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５）で軽く洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（プロメガ社製）を含むＡＬＰ発色バッファー３０μｌに浸し、室温で１０分間発色させた。染色像が得られたところでニトロセルロース膜を十分量の蒸留水に浸し、発色バッファーを洗い流した。洗浄後、ニトロセルロース膜を風乾してエプソン社製デジタルスキャナＧＴ−８３００ＵＦを用いて染色像の取り込みを行った。Detection method using ALP-labeled anti-C1q antibody The nitrocellulose membrane was lightly washed with ALP color buffer (Tris-HCl, pH 9.5 containing 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ), and then a BCIP / NBT solution (Promega) was used. The plate was immersed in 30 μl of the ALP color developing buffer and developed for 10 minutes at room temperature. When a stained image was obtained, the nitrocellulose membrane was immersed in a sufficient amount of distilled water to wash away the coloring buffer. After washing, the nitrocellulose membrane was air-dried and a stained image was captured using an Epson digital scanner GT-8300UF.
ＨＲＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体を用いた場合の検出方法
ニトロセルロース膜をAmersham ECL Advance Western Blotting Detectionキット（GE healthcare社製）中のＡ液・Ｂ液等量混合液に浸し、室温にて１分間反応させた。その後、反応液を軽く振り払い、ニトロセルロース膜をプラスチックフィルムで挟み、ポラロイドフィルムに感光させることで膜上の化学発光の検出を行った。Detection method using HRP-labeled anti-C1q antibody The nitrocellulose membrane is immersed in a mixed solution of A and B in the Amersham ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE healthcare) and allowed to react at room temperature for 1 minute. It was. Thereafter, the reaction solution was lightly shaken, the nitrocellulose film was sandwiched between plastic films, and the polaroid film was exposed to light to detect chemiluminescence on the film.
ＡＬＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体（１／１０００希釈）とＣ１ｑの結合が、ペプチドにより阻害されるかどうかを検討した。ペプチドＲ１およびＲ２を添加した系は、ペプチドを添加していない対照と比べて、色濃度が低く、Ｃ１ｑへの結合が大幅に阻害されていることがわかった。９残基のアミノ酸からなるペプチドＲ２だけでなく、６残基のアミノ酸からなるペプチドＲ１でも結合が阻害されていることから、Ｃ１ｑのエピトープは、９残基のアミノ酸、または６残基のアミノ酸からなることが確認できた。 It was examined whether the binding between ALP-labeled anti-C1q antibody (1/1000 dilution) and C1q was inhibited by the peptide. It was found that the system to which peptides R1 and R2 were added had a lower color density and the binding to C1q was significantly inhibited compared to the control to which no peptide was added. Since the binding is inhibited not only by peptide R2 consisting of 9 amino acids but also peptide R1 consisting of 6 amino acids, the epitope of C1q is derived from 9 amino acids or 6 amino acids. It was confirmed that
次に、ＨＲＰ標識抗Ｃ１ｑ抗体（１／２０，０００希釈）とＣ１ｑの結合の阻害に必要なペプチドの濃度を検討した。１２５、６２．５、３１．３、および１５．６μｇ／ｍｌ ペプチドＲ１を抗Ｃ１ｑ抗体と混合し、Ｃ１ｑとの結合を発色強度で評価した。１５．６μｇ／ｍｌの濃度のペプチドを用いた場合に、抗Ｃ１ｑ抗体とＣ１ｑの結合が見られたが、それ以上の濃度のペプチドを用いた場合には、抗Ｃ１ｑ抗体とＣ１ｑの結合が阻害され、発色強度が下がっていることを確認した。この結果から、抗Ｃ１ｑ抗体とＣ１ｑとの結合は抗体濃度にも依存するが、１５．６〜３１．３μｇ／ｍｌの濃度範囲のＲ１ペプチドで阻害されることがわかった。 Next, the concentration of the peptide required for inhibition of binding between HRP-labeled anti-C1q antibody (diluted 1/2000) and C1q was examined. 125, 62.5, 31.3, and 15.6 μg / ml Peptide R1 was mixed with anti-C1q antibody, and the binding to C1q was evaluated by color intensity. When a peptide at a concentration of 15.6 μg / ml was used, binding between the anti-C1q antibody and C1q was observed, but when a peptide at a higher concentration was used, the binding between the anti-C1q antibody and C1q was inhibited. It was confirmed that the color intensity was lowered. From this result, it was found that the binding between the anti-C1q antibody and C1q is inhibited by the R1 peptide in a concentration range of 15.6 to 31.3 μg / ml, although it also depends on the antibody concentration.
サンドイッチＥＬＩＳＡによるＣ１ｑタンパク質の定量
５μｇ／ｍＬ 抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体（固相抗体）溶液１００μｌをＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに結合させた。１％ スキムミルク／ＰＢＳ １００μｌを添加し、室温にて３０〜６０分間インキュベーションした。次に、１０μｇ／ｍＬ Ｃ１ｑタンパク質抗原２倍連続希釈溶液 １００μｌを添加して、３７℃で１〜２時間反応させた。純水で２回洗浄後、５μｇ／ｍＬ Ｃ１ｑモノクローナル抗体（感作抗体）溶液１００μｌを添加し、４℃にて一晩反応させた。次に、２次抗体（アビジン化ＡＬＰ抗体）を１００μｌ／ウェルにて添加し、４℃〜室温で１〜２時間反応させた。純水で４回洗浄後、ＡＬＰ基質発色液を添加して発色させた。マイクロプレートリーダにて４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した（参照波長：６６０ｎｍ）。結果を図２〜１０に示す。Ｃ１ｑタンパク質濃度と吸光度との間に正の相関関係が認められ、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、試料中のＣ１ｑタンパク質を定量できることが分かった。図示してはいないが、濃度〜４００μｇ／ｍＬのＣ１ｑタンパク質について定量可能であった。Quantification of C1q protein by sandwich ELISA 100 μl of 5 μg / mL anti-C1q monoclonal antibody (solid phase antibody) solution was bound to an ELISA microplate. 100 μl of 1% skim milk / PBS was added and incubated at room temperature for 30-60 minutes. Next, 100 μl of a 10 μg / mL C1q protein antigen two-fold serially diluted solution was added and reacted at 37 ° C. for 1-2 hours. After washing twice with pure water, 100 μl of a 5 μg / mL C1q monoclonal antibody (sensitized antibody) solution was added and reacted at 4 ° C. overnight. Next, a secondary antibody (avidinated ALP antibody) was added at 100 μl / well and reacted at 4 ° C. to room temperature for 1 to 2 hours. After washing 4 times with pure water, an ALP substrate coloring solution was added to cause color development. Absorbance (OD) at 492 nm was measured with a microplate reader (reference wavelength: 660 nm). The results are shown in FIGS. A positive correlation was observed between the C1q protein concentration and the absorbance, and it was found that the C1q protein in the sample could be quantified by sandwich ELISA using an anti-C1q monoclonal antibody. Although not shown, it was possible to quantify C1q protein at a concentration of ˜400 μg / mL.
本発明により、Ｃ１ｑタンパク質の定量に用いることができる、抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体、かかる抗体を用いたＣ１ｑタンパク質の検出および／または定量方法、およびそのためのキットなどが得られるので、ＲＡ患者の予後診断、（ＲＡの病理学的）研究等の分野において極めて有用である。 According to the present invention, an anti-C1q monoclonal antibody that can be used for quantification of C1q protein, a method for detecting and / or quantifying C1q protein using such an antibody, and a kit therefor can be obtained. It is extremely useful in fields such as (RA pathological) research.
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