JPWO2008015841A1 - Kinase inhibitory fusion proteins and pharmaceutical compositions - Google Patents

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Abstract

本願発明は、キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとを有し、細胞内オルガネラ特異的にキナーゼ活性化を阻害することを特徴とするキナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質は、細胞内オルガネラにおいて局所的に活性化するキナーゼを、そのオルガネラにおいて特異的に阻害することを作用機序とする。The present invention provides a kinase-inhibiting fusion protein comprising a kinase inhibitory peptide and an intracellular organelle localization peptide, wherein the kinase activation is specifically inhibited by intracellular organelles. This fusion protein has a mechanism of action that specifically inhibits a kinase that is activated locally in an intracellular organelle in the organelle.

Description

本願発明は、細胞内オルガネラ(脂質ラフト、ミトコンドリア、ゴルジ体等)において特異的なキナーゼ(Src、Akt、PKC等)の活性化を阻害することによって、キナーゼの活性化に依存する細胞機能を阻害または低下させることができるキナーゼ阻害性融合タンパク質と、このキナーゼ阻害性融合タンパク質を含有する医薬組成物に関するものである。
The present invention inhibits cellular functions that depend on kinase activation by inhibiting the activation of specific kinases (Src, Akt, PKC, etc.) in intracellular organelles (lipid rafts, mitochondria, Golgi, etc.) Alternatively, the invention relates to a kinase-inhibitory fusion protein that can be reduced and a pharmaceutical composition containing the kinase-inhibitory fusion protein.

リン酸化によるタンパク質活性の制御は、細胞内での情報伝達経路において大きな役割を占めている。   Control of protein activity by phosphorylation plays a major role in the signal transduction pathway in cells.

チロシンキナーゼSrcの活性化は、インテグリンリガンドへの細胞の接着及び増殖因子によって誘発される有糸分裂生起等の腫瘍細胞の機能に必要であり（非特許文献１、２）、これらの機能は腫瘍形成および転移と密接に関連していることが知られている（非特許文献３）。そこでチロシンキナーゼSrcの阻害剤を投与することによって癌を治療する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。   Activation of the tyrosine kinase Src is required for cell adhesion to integrin ligands and tumor cell functions such as mitogenesis induced by growth factors (Non-Patent Documents 1 and 2), and these functions are It is known to be closely related to formation and metastasis (Non-patent Document 3). Therefore, a method for treating cancer by administering an inhibitor of tyrosine kinase Src has been proposed (for example, Patent Document 1).

しかしながら、従来のSrc阻害剤を用いた治療法は必ずしも有効性が確認されていない。例えば、非特許文献４は、Srcに対する様々な擬似基質性の阻害性ペプチド（MIYKYYF等の約30種類ほどのペプチド）をv-Srcで形質転換した3T3細胞内に取り込ませても細胞内のリン酸化は阻害されず、また形態的な変化も引き起こされないことを報告している。このことは、Src阻害剤を単独で癌細胞に投与しても、癌細胞の効果的な増殖抑制や転移抑制が期待できないことを示している。   However, the effectiveness of conventional treatments using Src inhibitors has not been confirmed. For example, Non-Patent Document 4 shows that even if various pseudo-substrate inhibitory peptides against Src (about 30 types of peptides such as MIYKYYF) are incorporated into 3T3 cells transformed with v-Src, the intracellular phosphorus It has been reported that oxidation is not inhibited and morphological changes are not caused. This indicates that even when an Src inhibitor alone is administered to cancer cells, effective growth suppression and metastasis suppression of cancer cells cannot be expected.

一方、細胞内オルガネラの一つである脂質ラフト(lipid raft)と呼ばれるコレステロールが豊富なナノドメインは、細胞内のタンパク質シグナル伝達のためのプラットフォームとして機能すると考えられているが、チロシンキナーゼSrcは、細胞膜中の脂質ラフト領域と非ラフト領域の両方に分布することが知られている（非特許文献５、６）。   On the other hand, a cholesterol-rich nanodomain called lipid raft, one of the intracellular organelles, is thought to function as a platform for intracellular protein signaling, but tyrosine kinase Src It is known that it is distributed in both lipid raft regions and non-raft regions in cell membranes (Non-Patent Documents 5 and 6).

また、セリン／スレオニンキナーゼAktは、細胞生存（cell survival）の促進やアポトーシス抑制などの細胞機能制御に関わっており、特に疾患細胞では、ガン化や動脈硬化などに関与していることが知られている。さらに本願発明者らは、新しい蛍光プローブを開発し、Aktの活性化はさまざまな細胞小器官で起きていることを明らかにしている（非特許文献７）。しかし、各細胞小器官におけるAktの活性化がそれぞれどういった細胞機能を担っているのかは不明である。

特表2003-525862号公報 Playford, M.P. & Schaller, M.D. The interplay between Src and integrins in normal and tumor biology. Oncogene. 23, 7928-7946. (2004). Bromann, P.A., Korkaya, H. & Courtneidge, S.A. The interplay between Src family kinases and receptor tyrosine kinases. Oncogene. 23, 7957-7968. (2004). Summy, J.M. & Gallick, G.E. Src family kinases in tumor progression and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 22, 337-358. (2003). Kamath, J.R., Liu, R., Enstrom, A.M., Lou, Q. & Lam, K.S. Development and characterization of potent and specific peptide inhibitors of p60c-src protein tyrosine kinase using pseudosubstrate-based inhibitor design approach. J. Pept. Res.62, 260-268, 2003 Sargiacomo, M., Sudol, M., Tang, Z. & Lisanti, M.P. Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol. 122, 789-807. (1993). Liang, X. et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction. J. Biol. Chem. 276, 30987-30994. (2001). Sasaki et al. J. Biol. Chem. 273 30945-30951 (2003). In addition, serine / threonine kinase Akt is involved in cell function control such as promotion of cell survival and suppression of apoptosis, and is particularly known to be involved in canceration and arteriosclerosis in disease cells. ing. Furthermore, the present inventors have developed a new fluorescent probe and have revealed that Akt activation occurs in various organelles (Non-patent Document 7). However, it is unclear what cell function each activation of Akt plays in each organelle.

Special Table 2003-525862 Publication Playford, MP & Schaller, MD The interplay between Src and integrins in normal and tumor biology.Oncogene. 23, 7928-7946. (2004). Bromann, PA, Korkaya, H. & Courtneidge, SA The interplay between Src family kinases and receptor tyrosine kinases.Oncogene. 23, 7957-7968. (2004). Summy, JM & Gallick, GE Src family kinases in tumor progression and metastasis.Cancer Metastasis Rev. 22, 337-358. (2003). Kamath, JR, Liu, R., Enstrom, AM, Lou, Q. & Lam, KS Development and characterization of potent and specific peptide inhibitors of p60c-src protein tyrosine kinase using pseudo substrate-based inhibitor design approach.J. Pept. Res .62, 260-268, 2003 Sargiacomo, M., Sudol, M., Tang, Z. & Lisanti, MP Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells.J. Cell Biol. 122, 789-807. (1993). Liang, X. et al. Heterogeneous fatty acylation of Src family kinases with polyunsaturated fatty acids regulates raft localization and signal transduction.J. Biol. Chem. 276, 30987-30994. (2001). Sasaki et al. J. Biol. Chem. 273 30945-30951 (2003).

腫瘍形成や転移に密接に関連している各種キナーゼそれぞれが細胞内のどのオルガネラで活性化したときに、どの細胞機能が生起するのかが特定されれば、キナーゼ活性に依存する各種の細胞機能（特に疾患に関係する細胞機能）を効果的に阻害または低減することが可能となり、キナーゼを標的とする疾患治療（例えば癌治療）が大きく前進する。   If it is specified which organelle in each cell activates each of the various kinases closely related to tumorigenesis and metastasis, various cell functions that depend on the kinase activity ( In particular, cell functions related to diseases can be effectively inhibited or reduced, and disease treatment targeting kinases (for example, cancer treatment) is greatly advanced.

本願発明者らは、生細胞の各種オルガネラにおけるキナーゼ活性化部位を検出するための、新しいオルガネラ局在型蛍光インジケーターを開発し、これを用いた解析によって、個々のキナーゼが特定のオルガネラで活性化し、その局在的な活性化を阻害することによって細胞機能（特に、疾患に関連した機能）を阻害または低下させることができることを見いだした。   The present inventors have developed a new organelle-localized fluorescent indicator for detecting kinase activation sites in various organelles of living cells, and by using this analysis, individual kinases are activated by specific organelles. It has been found that cell function (especially disease related functions) can be inhibited or reduced by inhibiting its localized activation.

本願発明は、以上のとおりの新規な知見に基づき、細胞内オルガネラにおいて局所的に活性化するキナーゼを、そのオルガネラにおいて特異的に阻害することを作用機序とする、新しい疾患治療手段を提供することを課題としている。

前記の課題を解決するため、本願発明は、キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとを有し、細胞内オルガネラ特異的にキナーゼ活性化を阻害することを特徴とするキナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。The present invention provides a novel means for treating diseases based on the novel findings as described above, which specifically inhibits a kinase that is locally activated in intracellular organelles in the organelle. It is an issue.

In order to solve the above-mentioned problems, the present invention has a kinase inhibitory fusion comprising an inhibitor peptide of kinase and an intracellular organelle localization peptide, wherein the kinase activation is specifically inhibited by intracellular organelle. Provide protein.

このキナーゼ阻害性融合タンパク質の一つの具体的態様は、キナーゼの阻害ペプチドがチロシンキナーゼSrcの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドが脂質ラフト局在化ペプチドである融合タンパク質である。以下、このSrcに対するキナーゼ阻害性融合タンパク質を「Src阻害性融合タンパク質」あるいは「SIFP」（Src Inhibitory Fusion Protein）と記載することがある。また、後記の実施例では、コントロール（非ラフト局在型の融合タンパク質）と区別するため、SIFPを特に「脂質ラフト局在型SIFP」と記載している。One specific embodiment of this kinase-inhibitory fusion protein is a fusion protein in which the kinase inhibitor peptide is a tyrosine kinase Src inhibitor peptide and the intracellular organelle localization peptide is a lipid raft localization peptide. Hereinafter, may be described kinase inhibitory fusion protein against the Src and "Src inhibitor fusion protein" or "SIFP" (S rc I nhibitory F usion P rotein). In the examples described later, in order to distinguish from the control (non-raft localized fusion protein), SIFP is specifically described as “lipid raft localized SIFP”.

このSIFPにおける一つの好ましい態様は、チロシンキナーゼSrcの阻害性ペプチドとして配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することであり、脂質ラフト局在化ペプチドとして配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することである。   One preferred embodiment of this SIFP is to use a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an inhibitory peptide of tyrosine kinase Src, and a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as a lipid raft localization peptide. Is to use.

また、このSIFPは、その脂質ラフト局在化ペプチドがパルミトイル基によって修飾されていることを別の好ましい態様としている。   This SIFP has another preferred embodiment in which the lipid raft localization peptide is modified with a palmitoyl group.

キナーゼ阻害性融合タンパク質の別の具体的態様は、キナーゼの阻害ペプチドがセリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドがミトコンドリア局在化ペプチドである阻害性融合タンパク質である。以下、このAktに対するキナーゼ阻害性融合タンパク質を「Akt阻害性融合タンパク質」あるいは「AIFP」（Akt Inhibitory Fusion Protein）と記載することがある。Another specific embodiment of the kinase inhibitory fusion protein is an inhibitory fusion protein wherein the kinase inhibitor peptide is a serine / threonine kinase Akt inhibitor peptide and the intracellular organelle localization peptide is a mitochondrial localization peptide . Hereinafter, may be described kinase inhibitory fusion proteins for the Akt as "Akt inhibitory fusion protein" or "AIFP" (A kt I nhibitory F usion P rotein).

このAIFPにおける一つの好ましい態様は、セリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドの阻害性ペプチドとして配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することであり、ミトコンドリア局在化ペプチドとして配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドを使用することである。   One preferred embodiment in this AIFP is to use a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as the inhibitory peptide of the serine / threonine kinase Akt inhibitor peptide, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as the mitochondrial localization peptide. Is to use a peptide consisting of

なお、本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、その具体例であるSrc阻害性融合タンパク質（SIFP）およびAkt阻害性融合タンパク質（AIFP）に限定されるものではない。本願発明によって提供されるキナーゼ阻害性融合タンパク質の基本構造に従って、各種キナーゼの阻害ペプチドと各種オルガネラ局在化ペプチドとの組合せからなる融合タンパク質を作成し、本願発明に開示された試験方法に従ってそれぞれの有効性を確認することによって、任意のキナーゼに対する最も有効な活性阻害を実現することができる。   The kinase-inhibiting fusion protein of the present invention is not limited to Src-inhibiting fusion protein (SIFP) and Akt-inhibiting fusion protein (AIFP), which are specific examples thereof. In accordance with the basic structure of the kinase-inhibiting fusion protein provided by the present invention, a fusion protein comprising a combination of an inhibitory peptide of various kinases and various organelle-localizing peptides is prepared, and each of them is prepared according to the test method disclosed in the present invention. By confirming the effectiveness, the most effective inhibition of activity against any kinase can be realized.

本願発明はまた、前記キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結した、細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。この細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質の具体的態様は、SIFPまたはAIFPのN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結した「細胞膜透過性SIFP」または「細胞膜透過性AIFP」である。なお細胞膜透過性SIFPは、その脂質ラフト局在化ペプチドがパルミトイル基によって修飾されていてもよく、あるいは修飾されていなくてもよい。パルミトイル修飾されたものは、そのままの状態で脂質ラフトに局在化することができ、パルミトイル修飾されていないものは、細胞内の酵素によってパルミトイル修飾され、同じく脂質ラフトに局在化する。   The present invention also provides a cell membrane permeable kinase inhibitory fusion protein in which a cell membrane permeable peptide is linked to the N-terminal side of the kinase inhibitor fusion protein. A specific embodiment of this cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein is “cell membrane permeable SIFP” or “cell membrane permeable AIFP” in which a cell membrane permeable peptide is linked to the N-terminal side of SIFP or AIFP. The cell membrane-permeable SIFP may or may not be modified with a palmitoyl group in the lipid raft localization peptide. Palmitoyl-modified compounds can be localized in lipid rafts as they are, and those that are not palmitoyl-modified are palmitoyl-modified by intracellular enzymes and are also localized in lipid rafts.

さらに本願発明は、前記の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に、細胞膜非透過性ペプチドと癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列とを連結した、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を提供する。この癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質の具体的態様は、「癌細胞膜透過性SIFP」または「細胞膜透過性AIFP」である。   Furthermore, the present invention provides a cancer cell membrane permeable kinase inhibitory fusion protein in which a cell membrane impermeable peptide and a cancer cell specific protease recognition sequence are linked to the N-terminal side of the cell membrane permeable kinase inhibitor fusion protein. To do. A specific embodiment of the cancer cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein is “cancer cell membrane permeable SIFP” or “cell membrane permeable AIFP”.

またさらに、本願発明は、前記キナーゼ阻害性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを提供する。   Furthermore, the present invention provides an expression vector having a polynucleotide encoding the kinase-inhibiting fusion protein.

本願発明は、さらにまた、前記の発現ベクター、細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質、および癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のそれぞれ含有する医薬組成物を提供する。

本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、キナーゼが局所的に活性化する細胞内オルガネラにおいて特異的にその活性化を阻害することによって、そのキナーゼ活性に依存する細胞機能（特に、疾患に関連した機能）を阻害または低下させることができる。例えば、具体例として提供するSrc阻害性融合タンパク質（SIFP）は、生体膜の脂質ラフトにおけるチロシンキナーゼSrcの活性化を特異的に阻害することによって、癌細胞の細胞周期を停止させ、また癌細胞の細胞接着を阻害することができる。また、Akt阻害性融合タンパク質（AIFP）は、細胞のミトコンドリアにおけるセリン／スレオニンキナーゼAktの活性化を特異的に阻害することによって、少なくとも癌細胞の細胞周期を停止させることができる。従って、例えばSIFP発現ベクターやAIFP発現ベクターを癌細胞に導入して癌細胞内でSIFPやAIFPを発現させれば、癌細胞の増殖や転移を効果的に防止することができる。The present invention further provides a pharmaceutical composition containing each of the expression vector, the cell membrane permeable kinase inhibitory fusion protein, and the cancer cell membrane permeable kinase inhibitory fusion protein.

The kinase-inhibitory fusion protein of the present invention specifically inhibits the activation in intracellular organelles where the kinase is locally activated, thereby causing cellular functions dependent on the kinase activity (particularly functions related to diseases). ) Can be inhibited or reduced. For example, the Src inhibitory fusion protein (SIFP) provided as a specific example arrests the cell cycle of cancer cells by specifically inhibiting the activation of tyrosine kinase Src in lipid rafts of biological membranes. Cell adhesion can be inhibited. Akt-inhibitory fusion protein (AIFP) can also arrest at least the cell cycle of cancer cells by specifically inhibiting the activation of serine / threonine kinase Akt in the mitochondria of cells. Therefore, for example, if SIFP expression vector or AIFP expression vector is introduced into cancer cells and SIFP or AIFP is expressed in the cancer cells, proliferation and metastasis of the cancer cells can be effectively prevented.

また本願発明の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質の場合には、それ自体が細胞内に取り込まれるので、より簡便かつ有効な薬剤形態として癌組織等の疾患組織に適用できる。   In addition, since the cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein of the present invention itself is taken into cells, it can be applied to diseased tissues such as cancerous tissues as a simpler and more effective drug form.

さらに、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、癌細胞にのみ取り込まれるので、例えば全身性に投与することによっても、癌細胞に特異的な作用を発揮することができる。
Furthermore, since the cancer cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein is taken up only by cancer cells, for example, it can exert a specific action on cancer cells even when administered systemically.

図１は、生体膜におけるSrc活性を検出するための蛍光インディケーター（TM-Srcus）。(a)は細胞膜のSrc活性を可視化するためのTM-Srcusの原理。Srcの活性化に伴い、チロシンリン酸化認識（SH2）ドメインがリン酸化Src基質（Y314）ドメインに結合することによって、TM-Srcusの構造変化が生じ、これによって分子内FRET反応が発生する。(b)はTM-SrcusおよびTM-Srcus314AのcDNA構成。TM-Srcusは直列状の融合タンパク質であり、７つの部分：膜貫通ドメイン、シアン蛍光タンパク質（CFP）、チロシンリン酸化部位（赤色Y）を含むY314、柔軟性リンカー（Ln）、SH2ドメイン、黄色蛍光タンパク質（YFP）、核外シグナル配列（NES）からなっている。Y314ドメインは、アラニン変異部位（赤色A）を含む変異Src基質ドメインである。FIG. 1 is a fluorescence indicator (TM-Srcus) for detecting Src activity in biological membranes. (a) TM-Srcus principle for visualizing Src activity in cell membranes. Upon activation of Src, the tyrosine phosphorylation recognition (SH2) domain binds to the phosphorylated Src substrate (Y314) domain, resulting in a structural change in TM-Srcus, which causes an intramolecular FRET reaction. (b) cDNA composition of TM-Srcus and TM-Srcus314A. TM-Srcus is a tandem fusion protein with seven parts: transmembrane domain, cyan fluorescent protein (CFP), Y314 containing tyrosine phosphorylation site (red Y), flexible linker (Ln), SH2 domain, yellow It consists of fluorescent protein (YFP) and extranuclear signal sequence (NES). The Y314 domain is a mutant Src substrate domain containing an alanine mutation site (red A). 図２は、MCF7細胞の脂質ラフトにおけるSrcの活性化。（a）の左、中央は、MCF7細胞の基底細胞膜におけるTM-SrcusのCFP/YFP発光率の全反射型蛍光顕微鏡（TIRFM）による疑似カラー像である。白線で囲んだ領域は、単一MCF7細胞の基底細胞膜を示す。対象領域（ROI 1）はTM-SrcusのCFP/YFP発光率の変化を示す青にシフトした領域を含んでいる。対象領域（ROI 2）は、TM-SrcusがCFP/YFP発光率の変化を示さない場所に位置している。(a)の右は、単一MCF7細胞の基底細胞膜における脂質ラフトマーカーAlexa-647 CTXBの蛍光強度のTIRFMによる疑似カラー像である。Alexa-647 CTXBはROI 1に集中している。TM-Srcusを発現するMCF7細胞は、E2刺激の前にAlexa-647 CTXBで染色した。(b)はTM-Srcusを発現するMCF7細胞の基底細胞膜のROI 1およびROI 2における、１μM E2刺激に対するCFP/YFP発光率の時間経過である。(c)は、TM-Srcus（68 kDa）を発現するMCF7細胞の低密度および高密度画分のウェスタンブロット分析である。画分は、CTXBを結合したHRP、またはGFP、リン酸化チロシン、caveolin1およびSrcのそれぞれの抗体によってブロットした。脂質ラフトの低密度画分と、非ラフト＆細胞質画分の高密度画分がそれぞれ認められた。(d)は、脂質ラフトへのSrcのエストロジェンによる細胞内局在の変化を示す。E2刺激の有無による、高密度（非ラフト＆細胞質）画分に対する低密度画分（脂質ラフト）におけるSrc量の比率を示す（mean±S.D. n=3）。(e)は、脂質ラフトへのEGFPおよびERのエストロジェンによる細胞内局在の変化を示す。低密度および高密度画分は、CTXBを結合したHRP、またはEGFPおよびERのそれぞれの抗体によってブロットした。なお、この図２に示した結果は、独立した３回の測定結果の代表例を示す。FIG. 2 shows Src activation in lipid rafts of MCF7 cells. The left and center of (a) are pseudo-color images of the TM-Srcus CFP / YFP emission rate in the basal cell membrane of MCF7 cells using a total reflection fluorescence microscope (TIRFM). The area surrounded by a white line shows the basal cell membrane of a single MCF7 cell. The region of interest (ROI 1) includes a blue-shifted region indicating the change in CFP / YFP emission rate of TM-Srcus. The region of interest (ROI 2) is located where TM-Srcus does not show changes in CFP / YFP luminescence. The right side of (a) is a pseudo color image by TIRFM of the fluorescence intensity of lipid raft marker Alexa-647 CTXB in the basal cell membrane of a single MCF7 cell. Alexa-647 CTXB is focused on ROI 1. MCF7 cells expressing TM-Srcus were stained with Alexa-647 CTXB prior to E2 stimulation. (b) is the time course of CFP / YFP luminescence rate with respect to 1 μM E2 stimulation in ROI 1 and ROI 2 of the basal cell membrane of MCF7 cells expressing TM-Srcus. (c) Western blot analysis of low and high density fractions of MCF7 cells expressing TM-Srcus (68 kDa). Fractions were blotted with CRPB-conjugated HRP or GFP, phosphorylated tyrosine, caveolin1 and Src antibodies, respectively. A low-density fraction of lipid rafts and a high-density fraction of non-raft and cytoplasmic fractions were observed, respectively. (d) shows changes in intracellular localization by Src estrogen to lipid rafts. The ratio of the amount of Src in the low-density fraction (lipid raft) to the high-density (non-raft & cytoplasm) fraction with or without E2 stimulation (mean ± S.D. N = 3) is shown. (e) shows changes in intracellular localization by EGFP and ER estrogen to lipid rafts. Low density and high density fractions were blotted with CRPB-conjugated HRP, or EGFP and ER antibodies, respectively. The results shown in FIG. 2 are representative examples of three independent measurement results. 図３は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型Src阻害性融合タンパク質（SIFP）(a)は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP、SIFP Y6A、YFPコントロールとしてのSIFP DelのそれぞれのcDNA構成である。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPは、YFP、フラッグタグ (flag tag)、チロシンリン酸化部位（赤色Y）を含むSrcの阻害性ペプチド、および局在化配列からなる。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP Y6Aは、アラニン変異部位（赤色A）を含むアラニン変異阻害性ペプチドを有している。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP Del（YFPコントロール）では、Srcに対する阻害性ペプチドが除去されている。(b)は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPを発現するMCF7細胞の、共焦点蛍光顕微鏡による蛍光像である。脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPにおけるYFP像は緑で示した。Alexa-647 CTXBによる染色は赤である。合併像と透過像を併せて示す。(c)は、密度勾配画分を用いて分析したMCF7細胞における脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPの細胞内局在と阻害効果である。脂質ラフトまたは非ラフト局在型のSIFPを発現するMCF7細胞の溶解物を密度勾配に供し、低密度および高密度の画分を得た。低密度および高密度画分は抗フラッグ抗体または抗pTy抗体で免疫沈降させ、抗GFP抗体でイムノブロッティングした。Src特異的阻害剤PP2の処置は１０μMで１０時間行った。(b)(c)の結果は、独立した３回の測定結果の代表例を示す。Fig. 3 shows that the lipid raft or non-raft localized Src inhibitory fusion protein (SIFP) (a) is composed of the lipid raft or non-raft localized SIFP, SIFP Y6A, and SIFP Del as YFP controls. is there. Lipid raft or non-raft localized SIFP consists of YFP, flag tag, Src inhibitory peptide containing tyrosine phosphorylation site (red Y), and localization sequence. Lipid raft or non-raft localized type SIFP Y6A has an alanine mutation-inhibiting peptide containing an alanine mutation site (red A). In lipid raft or non-raft localized SIFP Del (YFP control), the inhibitory peptide against Src is removed. (b) is a fluorescence image of MCF7 cells expressing lipid rafts or non-raft localized SIFPs using a confocal fluorescence microscope. YFP images in lipid raft or non-raft localized SIFP are shown in green. Staining with Alexa-647 CTXB is red. The merged image and the transmission image are shown together. (c) shows the intracellular localization and inhibitory effect of lipid raft or non-raft localized SIFP in MCF7 cells analyzed using density gradient fraction. Lysates of MCF7 cells expressing lipid rafts or non-raft localized forms of SIFP were subjected to a density gradient to obtain low and high density fractions. Low density and high density fractions were immunoprecipitated with anti-flag antibody or anti-pTy antibody and immunoblotted with anti-GFP antibody. Treatment with the Src-specific inhibitor PP2 was performed at 10 μM for 10 hours. The results of (b) and (c) are representative examples of the results of three independent measurements. 図４は、脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPの細胞機能に対する生理的効果を示す。(a)は脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFPを発現したMCF7細胞の接着能である。脂質ラフト局在型SIFPはMCF7細胞の接着性を低減させた。接着指標は、蛍光陽性の接着細胞数をはじめにプレーティングしてあった蛍光陽性の細胞数で割ったものである。この結果は、6回以上の独立した測定結果を示す。(b)は脂質ラフトまたは非ラフト局在型SIFP、SIFP Y6A、YFPコントロールをそれぞれ発現するMCF7細の細胞周期の分析結果である。PI（propidium iodide）染色を用いたフローサイトメトリーは、細胞周期のG1、SおよびG2/M期におけるYFP陽性細胞数を示す。脂質ラフト局在型SIFPのみが、MCF7細胞の細胞周期停止を誘導した。(b)の結果は、独立した３回の測定結果の代表例を示す。FIG. 4 shows the physiological effects of lipid rafts or non-raft localized SIFPs on cell function. (a) is the adhesion ability of MCF7 cells expressing lipid raft or non-raft localized SIFP. Lipid raft-localized SIFP reduced the adhesion of MCF7 cells. The adhesion index is obtained by dividing the number of fluorescence-positive adherent cells by the number of fluorescence-positive cells plated first. This result shows 6 or more independent measurement results. (b) shows the results of analysis of the cell cycle of MCF7 that expresses lipid raft or non-raft localized type SIFP, SIFP Y6A, and YFP control, respectively. Flow cytometry using PI (propidium iodide) staining shows the number of YFP positive cells in the G1, S and G2 / M phases of the cell cycle. Only lipid raft-localized SIFP induced cell cycle arrest in MCF7 cells. The result of (b) shows a representative example of three independent measurement results. 図５は、実施例２で作成したAkt阻害性融合タンパク質（AIFP）の構成（上段）と、Akt阻害ペプチドを持たないコントロールAIFPの構成（下段）である。FIG. 5 shows the configuration of the Akt-inhibitory fusion protein (AIFP) prepared in Example 2 (top) and the configuration of the control AIFP without the Akt-inhibiting peptide (bottom). 図６は、AIFPを導入した乳癌細胞（MCF-7細胞）をミトコンドリアマーカーで染色し、またAIFPのGFPを可視化した顕微鏡像である。上段左はミトコンドリアマーカーによる染色像、上段右はGFPシグナルの像（AIFPの位置を示す）、下段左は透過光による像、下段右はミトコンドリアマーカーによる染色像とGFPシグナル像の重ね合わせである。FIG. 6 is a microscopic image obtained by staining breast cancer cells (MCF-7 cells) introduced with AIFP with a mitochondrial marker and visualizing GFP of AIFP. The upper left is an image stained with a mitochondrial marker, the upper right is an image of a GFP signal (indicating the position of AIFP), the lower left is an image with transmitted light, and the lower right is a superimposed image of the stained image with a mitochondrial marker and a GFP signal image. 図７は、AIFPを発現するMCF-7細胞の細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーにより測定した結果である。左はAIFP発現細胞、右はコントロールAIFP発現細胞の結果である。FIG. 7 shows the results obtained by measuring the cell cycle profile of MCF-7 cells expressing AIFP by flow cytometry. The left is the result of AIFP-expressing cells, and the right is the result of control AIFP-expressing cells. 図８は、脂質ラフト局在型SIFPを発現するヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞接着アッセイの結果である。黒バーが脂質ラフト局在型SIFPの結果、白バーが脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）の結果である。FIG. 8 shows the results of cell adhesion assay of normal human cells (HEK293 cells) expressing lipid raft-localized SIFP. The black bar is the result of lipid raft localized SIFP, and the white bar is the result of lipid raft localized SIFP Del (control). 図９は、脂質ラフト局在型SIFPを発現するヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞周期アッセイの結果である。左図が脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）の結果、右図が脂質ラフト局在型SIFPの結果であるFIG. 9 shows the results of cell cycle assay of normal human cells (HEK293 cells) expressing lipid raft-localized SIFP. The left figure shows the results of lipid raft localized SIFP Del (control), and the right figure shows the results of lipid raft localized SIFP 図１０は、実施例３で作成した癌細胞膜透過性SIFPの構成である。「targeting」は脂質ラフト局在化ペプチドであり、「inhibitory」はSrc阻害ペプチドである。「HA」はインフルエンザウィルス由来の蛋白質hemagglutininの一部である。黒枠で示した領域が癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列である。FIG. 10 shows the structure of the cancer cell membrane-permeable SIFP prepared in Example 3. “Targeting” is a lipid raft localization peptide and “inhibitory” is a Src inhibitory peptide. “HA” is part of the protein hemagglutinin derived from influenza virus. A region indicated by a black frame is a cancer cell-specific protease recognition sequence. 図１１は、精製した癌細胞膜透過性SIFPがMMP処理によって切断されることを確認したウェスタンブロット分析の結果である。MMP処理（MMP+）の場合にのみ切断されたバンド（矢印）が観察された。FIG. 11 shows the results of Western blot analysis confirming that purified cancer cell membrane-permeable SIFP is cleaved by MMP treatment. A cleaved band (arrow) was observed only with MMP treatment (MMP +). 図１２は、上段は、MCF-7細胞の培地に癌細胞膜透過性SIFPのみを添加して3.5時間後の細胞を免疫染色した結果である。下段は、MCF-7細胞の培地に癌細胞膜透過性SIFPとMMPを添加して3．5時間後の細胞を免疫染色した結果である。左側は抗flag抗体による染色画像を示し、右側は透過光による画像を示している。FIG. 12 shows the result of immunostaining the cells 3.5 hours after adding only cancer cell membrane permeable SIFP to the medium of MCF-7 cells. The lower row shows the result of immunostaining the cells 3.5 hours after adding cancer cell membrane-permeable SIFP and MMP to the medium of MCF-7 cells. The left side shows a stained image with an anti-flag antibody, and the right side shows an image with transmitted light. 図１３は、MCF-7細胞の培地に癌細胞膜透過性SIFPを添加した場合の細胞増殖の程度を、MMPの有無で比較した結果である。FIG. 13 shows the results of comparison of the degree of cell growth when cancer cell membrane-permeable SIFP was added to the medium of MCF-7 cells, with and without MMP.

本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、前記のとおり、キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとが融合化したタンパク質である。   As described above, the kinase-inhibitory fusion protein of the present invention is a protein in which a kinase inhibitor peptide and an intracellular organelle localization peptide are fused.

例えば、その具体例であるSrc阻害性融合タンパク質（SIFP）は、Src阻害ペプチドと脂質ラフト局在化ペプチドとが融合化したタンパク質である。   For example, the Src inhibitory fusion protein (SIFP), which is a specific example thereof, is a protein in which an Src inhibitory peptide and a lipid raft localization peptide are fused.

Src阻害性ペプチドとは、Srcに作用してその活性（チロシン残基のリン酸化）を特異的に阻害するペプチドであり、例えば、Srcに対する擬似基質性の阻害性ペプチド（MIYKYYF：配列番号１）（非特許文献４）を用いることができる。   The Src inhibitory peptide is a peptide that acts on Src and specifically inhibits its activity (phosphorylation of tyrosine residues). For example, a pseudo-substrate inhibitory peptide against Src (MIYKYYF: SEQ ID NO: 1) (Non-Patent Document 4) can be used.

また、脂質ラフト局在化ペプチドは、細胞内の脂質ラフトに特異的に結合するペプチドであり、例えば、H-Rasタンパク質のC末端の9アミノ酸(CMSCKCVLS：配列番号２)からなるペプチドを用いることができる。   The lipid raft localization peptide is a peptide that specifically binds to intracellular lipid rafts. For example, a peptide consisting of 9 amino acids at the C-terminus of the H-Ras protein (CMSCKCVLS: SEQ ID NO: 2) is used. Can do.

なお、H-Rasタンパク質のような脂質ラフトに局在するタンパク質は、哺乳動物細胞内の酵素（パルミトイル転移酵素）による翻訳後修飾によってC末側のシステイン残基にパルミトイル酸のついた構造をとることで脂質ラフトへと局在する（例えば、Prior, I.A. et al. GTP-dependent segregation of H-ras from lipid rafts is required for biological activity. Nat. Cell Biol. 3, 368-375, 2001）。従って、本願発明のSIFPにおいては、Src阻害ペプチドのC末側に脂質ラフト局在ペプチドが位置するように両者を融合する。   Proteins localized in lipid rafts, such as H-Ras protein, have a structure in which palmitoyl acid is attached to the C-terminal cysteine residue by post-translational modification by an enzyme (palmitoyltransferase) in mammalian cells. Thus, it is localized to lipid rafts (for example, Prior, IA et al. GTP-dependent segregation of H-ras from lipid rafts is required for biological activity. Nat. Cell Biol. 3, 368-375, 2001). Therefore, in the SIFP of the present invention, both are fused so that the lipid raft localization peptide is located on the C-terminal side of the Src inhibitory peptide.

Src阻害ペプチドや脂質ラフト局在ペプチドは、これらに限定されるものではなく、Src阻害ペプチドとしては、FVGFLGFLG(L. Ramdas, N.U. Obeyesekere, G. Sun, J.S. McMurray, R.J. Budde, N-myristoylation of a peptide substrate for Src converts it into an apparent slow-binding bisubstrate-type inhibitor, J. Pept. Res. 53(1999) 569-577.)、EFLYGVFF(T. Nishi, R.J. Budde, J.S. McMurray, N.U. Obeyesekere, N. Safdar, V.A. Levin, H. Saya, Tight-binding inhibitory sequences against pp60(c-src)identified using a random 15-amino-acid peptide library, FEBS Lett. 399 (1996) 237-240.)等を使用することができ、脂質ラフト局在ペプチドとしては、MLCCMRRTKQ（N末端側に融合）(Zacharias, D.A., J.D. Violin, A.C. Newton, and R.Y. Tsien. 2002. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296:913-6)等を使用することができる。   Src inhibitory peptides and lipid raft localization peptides are not limited to these, and SVG inhibitory peptides include FVGFLGFLG (L. Ramdas, NU Obeyesekere, G. Sun, JS McMurray, RJ Budde, N-myristoylation of a peptide substrate for Src converts it into an apparent slow-binding bisubstrate-type inhibitor, J. Pept. Res. 53 (1999) 569-577.), EFLYGVFF (T. Nishi, RJ Budde, JS McMurray, NU Obeyesekere, N. Safdar, VA Levin, H. Saya, Tight-binding inhibitory sequences against pp60 (c-src) identified using a random 15-amino-acid peptide library, FEBS Lett. 399 (1996) 237-240.) As a lipid raft localized peptide, MLCCMRRTKQ (fused to the N-terminal side) (Zacharias, DA, JD Violin, AC Newton, and RY Tsien. 2002. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296: 913-6) can be used.

また、本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質の別の具体例であるAkt阻害性融合タンパク質（AIFP）は、Akt阻害ペプチドとミトコンドリア局在化ペプチドとが融合化したタンパク質である。   An Akt inhibitory fusion protein (AIFP), which is another specific example of the kinase inhibitory fusion protein of the present invention, is a protein in which an Akt inhibitory peptide and a mitochondrial localization peptide are fused.

Akt阻害性ペプチドとは、Aktに作用してその活性（セリン／スレオニン残基のリン酸化）を特異的に阻害するペプチドであり、例えば、Aktに対する擬似基質性の阻害性ペプチド（ARKRERTYSFGHHA：配列番号３）を用いることができる。   An Akt inhibitory peptide is a peptide that acts on Akt and specifically inhibits its activity (phosphorylation of serine / threonine residues). For example, a pseudo-substrate inhibitory peptide for Akt (ARKRERTYSFGHHA: SEQ ID NO: 3) can be used.

また、ミトコンドリア局在化ペプチドは、細胞内のミトコンドリアに特異的に結合するペプチドであり、例えば、ミトコンドリアタンパク質Tom20の1〜35番目のアミノ酸配列(MVGRNSAIAAGVCGALFIGYCIYFDRKRRSDPNFK：配列番号４)からなるペプチドを用いることができる。   The mitochondrial localization peptide is a peptide that specifically binds to intracellular mitochondria. For example, a peptide consisting of the amino acid sequence 1 to 35 of the mitochondrial protein Tom20 (MVGRNSAIAAGVCGALFIGYCIYFDRKRRSDPNFK: SEQ ID NO: 4) may be used. it can.

また、他のキナーゼ阻害性ペプチドやオルガネラ局在化ペプチドについても、既存のタンパク質データベース（例えば、GenBankデータベースなど）等から配列情報を入手して、各種のキナーゼ阻害性融合タンパク質を作成することができる。   In addition, for other kinase-inhibiting peptides and organelle-localized peptides, various kinase-inhibiting fusion proteins can be created by obtaining sequence information from existing protein databases (eg, GenBank database). .

本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質を作成する場合には、キナーゼ阻害ペプチドとオルガネラ局在化ペプチドは、両者を直接に連結させてもよく、あるいは両者の間にリンカーを介在させてもよい。   When preparing the kinase-inhibiting fusion protein of the present invention, the kinase-inhibiting peptide and the organelle-localizing peptide may be linked directly to each other, or a linker may be interposed between the two.

本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質は、例えば、遺伝子工学的方法により作成することができる。すなわち、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロで目的の融合タンパク質を得ることができる。また発現ベクターによって組換えられた大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞から、キナーゼ阻害性融合タンパク質を大量に得ることができる。   The kinase-inhibiting fusion protein of the present invention can be prepared, for example, by a genetic engineering method. That is, a target fusion protein can be obtained in vitro by preparing RNA from a vector carrying a polynucleotide encoding the fusion protein by in vitro transcription and performing in vitro translation using this as a template. In addition, a large amount of a kinase-inhibiting fusion protein can be obtained from prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis recombined with an expression vector and eukaryotic cells such as yeast, insect cells and mammalian cells.

また、周知の化学合成法（例えば、Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）等に準じてキナーゼ阻害性融合タンパク質を合成することもできる。   In addition, well-known chemical synthesis methods (for example, Merrifield, RBJ Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, WC and White, PD, Oxford University Press, 2000) can also be used to synthesize kinase-inhibiting fusion proteins.

次に、本願発明の医薬組成物について説明する。   Next, the pharmaceutical composition of the present invention will be described.

本願発明の医薬組成物は、前記のキナーゼ阻害性融合タンパク質を有効成分として含有し、細胞局在的なキナーゼ阻害の効果に従って、特定の疾患に対する治療効果または症状の改善効果を有している。例えば、キナーゼ阻害性融合タンパク質の具体例であるSIFPやAIFPは、癌細胞の細胞周期を停止させるなどの優れた作用によって、抗癌剤の有効成分として使用することができる。   The pharmaceutical composition of the present invention contains the above-mentioned kinase-inhibiting fusion protein as an active ingredient, and has a therapeutic effect or symptom-improving effect on a specific disease according to the effect of cell-localized kinase inhibition. For example, SIFP and AIFP, which are specific examples of kinase-inhibiting fusion proteins, can be used as an active ingredient of an anticancer agent due to excellent actions such as stopping the cell cycle of cancer cells.

キナーゼ阻害性融合タンパク質を医薬組成物として用いるための一つの方法は、これらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを、遺伝子治療において使用されているようなウイルスベクターを用いて構築することである。ウイルスベクターとしては、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノムに由来するものとすることができる。各々の親ベクターの都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる（例えば、Feng（1997）Nature Biotechnology 15:866-870参照）。このようなウイルスゲノムは、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されてもよい。別の態様においては、ベクターはアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクターである。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。   One method for using kinase-inhibitory fusion proteins as pharmaceutical compositions is to construct expression vectors carrying polynucleotides encoding these fusion proteins using viral vectors such as those used in gene therapy. That is. The viral vector can be derived from the genome of a virus selected from the family Baculoviridae, Parvoviridae, Picornoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae, or Picornaviridae . Chimeric vectors that take advantage of the advantages of each parent vector can also be used (see, eg, Feng (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870). Such viral genomes may be replication defective, replicate according to conditions, or further processed to become replication competent. In another embodiment, the vector is an adenovirus (eg, a replicating noncompetent vector derived from the human adenovirus genome, see, eg, US Pat. Nos. 6,096,718; 6,110,458; 6,113,913; 5,631,236); adeno-associated viruses and retroviruses A vector derived from a genome. Retroviral vectors include those based on murine leukemia virus (MuLV), gibbon leukemia virus (GaLV), simian immunodeficiency virus (SIV), human immunodeficiency virus (HIV), and combinations thereof ( See, e.g., U.S. Patent Nos. 6,117,681; 6,107,478; 5,658,775; 5,449,614; Buchscher (1992) J. Virol. 66: 2731-2739; Johann (1992) J. Virol. 66: 1635-1640).

また、前記の組換えウイルスベクターにおいては、キナーゼ阻害性融合タンパク質が疾患組織特異的に発現するように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、疾患遺伝子のプロモーター支配下に連結させることもできる。   In the above recombinant virus vector, the polynucleotide encoding the fusion protein can be linked under the control of the promoter of the disease gene so that the kinase-inhibiting fusion protein is expressed specifically in the disease tissue.

以上のような組換えウイルスベクターによって細胞内で発現したキナーゼ阻害性融合タンパク質は、そのキナーゼ阻害性ペプチドとオルガネラ局在化ペプチドの種類に応じて、細胞内の所与の部位において特定キナーゼの活性を特異的に阻害する。例えば、SIFPの場合には、細胞内の酵素による翻訳後修飾によって脂質ラフト局在ペプチドがパルミトイル化され、脂質ラフトにおいてSrcの活性化を選択的に阻害する。またAIFPはミトコンドリアにおいて特異的にAktの活性を阻害する。これによって、SIFPまたはAIFPが発現した癌細胞の増殖や転移が効果的に防止される。   A kinase-inhibiting fusion protein expressed in a cell by the recombinant virus vector as described above has a specific kinase activity at a given site in the cell, depending on the types of the kinase-inhibiting peptide and the organelle-localizing peptide. Is specifically inhibited. For example, in the case of SIFP, a lipid raft-localized peptide is palmitoylated by post-translational modification by an intracellular enzyme, and selectively inhibits Src activation in the lipid raft. AIFP specifically inhibits Akt activity in mitochondria. This effectively prevents the growth and metastasis of cancer cells expressing SIFP or AIFP.

本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質を医薬組成物として用いるための別の方法は、キナーゼ阻害性融合タンパク質それ自体を細胞に取り込ませる方法である。すなわち、本願発明の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を疾患組織の細胞に接触させる方法である。具体的には、細胞膜透過性SIFPまたは細胞膜透過性AIFPを癌細胞に接触させる方法である。   Another method for using the kinase-inhibiting fusion protein of the present invention as a pharmaceutical composition is a method of incorporating the kinase-inhibiting fusion protein itself into cells. That is, it is a method of bringing the cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein of the present invention into contact with cells of a diseased tissue. Specifically, it is a method of bringing a cell membrane permeable SIFP or a cell membrane permeable AIFP into contact with a cancer cell.

細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結することによって作成される。細胞膜透過性ペプチドは、アルギニンを多く含む約10アミノ酸配列からなるペプチドであり、このペプチドを付加したタンパク質は細胞膜を透過し、細胞内に進入することが知られている。これまでに、例えば、Hiv-tat（Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. and Dowdy, S. F. (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285, 1569-1572）、herpes virus tegument protein VP22（Elliott, G. and O’Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by herpesvirus structural protein. Cell (Cambridge, Mass.) 88, 223-233）、Drosophila melanogaster antennapedia (penetratin)（Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193）、the protegrin 1(PG-1) antimicrobial peptide SynB（Kokryakov, V. N., Harwig, S. S., Panyutich, E. A., Shevchenko, A. A., Aleshina, G. M., Shamova, O. V., Korneva, H. A. and Lehrer, R. I. (1993) Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyplesins. FEBS Lett. 327, 231-236）、the basic fibroblast growth factor（Jans, D. A. (1994) Nuclear signaling pathways for polypeptide ligands and their membrane receptors. FASEB J. 8, 841-847）等の細胞膜透過性ペプチドが知られている。   A cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein is made by linking a cell membrane-permeable peptide to the N-terminal side of a kinase-inhibiting fusion protein. The cell membrane permeable peptide is a peptide consisting of about 10 amino acid sequences containing a large amount of arginine, and it is known that a protein to which this peptide is added penetrates the cell membrane and enters the cell. To date, for example, Hiv-tat (Schwarze, SR, Ho, A., Vocero-Akbani, A. and Dowdy, SF (1999) In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285, 1569-1572), herpes virus tegument protein VP22 (Elliott, G. and O'Hare, P. (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by herpesvirus structural protein. Cell (Cambridge, Mass.) 88, 223-233), Drosophila melanogaster antennapedia (penetratin) (Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. and Prochiantz, A. (1996) Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor -independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193), the protegrin 1 (PG-1) antimicrobial peptide SynB (Kokryakov, VN, Harwig, SS, Panyutich, EA, Shevchenko, AA, Aleshina, GM, Shamova, OV, Korneva, HA and Lehrer, RI (1993) Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides that combine features of corticostatic defensins and tachyple sins. FEBS Lett. 327, 231-236), the basic fibroblast growth factor (Jans, DA (1994) Nuclear signaling pathways for polypeptide ligands and their membrane receptors. FASEB J. 8, 841-847) It has been known.

これらの細胞膜透過性ペプチドはキナーゼ阻害性融合タンパク質と直接融合させることによって細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を作成することができる。また、遺伝子工学的方法や化学合成法によって別個に調製したキナーゼ阻害性融合タンパク質と細胞膜透過性ペプチドとを、公知の方法によってペプチド結合するなどの方法によっても作成することができる。   These cell membrane permeable peptides can be directly fused with a kinase inhibitor fusion protein to produce a cell membrane permeable kinase inhibitor fusion protein. It can also be prepared by a method such as peptide binding of a kinase-inhibitory fusion protein and a cell membrane-permeable peptide separately prepared by a genetic engineering method or a chemical synthesis method by a known method.

以上のような細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、細胞膜を透過して細胞内に取り込まれた後、そのオルガネラ局在化ペプチドの種類に応じて細胞内の所定部位に局在化し、そこで特定キナーゼの活性を阻害する。例えば、癌細胞に接触した細胞膜透過性SIFPは、脂質ラフト局在ペプチドのシステインがパルミトイル転移酵素によりパルミトイル修飾を受け、脂質ラフトへと局在化し、脂質ラフト特異的にSrcの活性化が阻害される。また、癌細胞に接触した細胞膜透過性AIFPはミトコンドリアへと局在化し、ミトコンドリア特異的にAktの活性化を阻害する。これによって、SIFPやAIFPを取り込んだ癌細胞の増殖や転移が効果的に防止される。   The cell membrane-permeable kinase-inhibiting fusion protein as described above is permeated through the cell membrane and taken into the cell, and then localized at a predetermined site in the cell depending on the type of organelle-localizing peptide. Inhibits kinase activity. For example, in a cell membrane-permeable SIFP that has contacted cancer cells, the lipid raft-localized peptide cysteine is palmitoyl-modified by palmitoyltransferase, and is localized to lipid rafts. Src activation is specifically inhibited in lipid rafts. The Cell membrane-permeable AIFP in contact with cancer cells localizes to mitochondria and specifically inhibits Akt activation. This effectively prevents the growth and metastasis of cancer cells incorporating SIFP and AIFP.

また、細胞膜透過性SIFPの場合には、細胞内のパルミトイル転移酵素の働きに依存することなく、予め脂質ラフト局在化ペプチドのシステインをパルミトイル化した状態で細胞に取り込ませることもできる。例えば大腸菌等で発現させたり、あるいは化学合成したSIFPに、そのC末側のシステインをパルミトイル基で化学修飾することによって、脂質ラフトに特異的なSrc阻害活性を付与することができる。具体的には、マレイミド基のついたパルミトイルエステルを新たに合成し、SIFPと反応させる。システインのチオール基とマレイミド基は選択的に結合することが知られているので、この反応によりパルミトイル基をSIFPのシステインに人為的に結合させることができる。   In the case of cell membrane-permeable SIFP, the lipid raft-localized peptide cysteine can be incorporated into cells in a state of being palmitoylated in advance without depending on the action of intracellular palmitoyltransferase. For example, SFP inhibitory activity specific to lipid rafts can be imparted to SIFPs expressed in Escherichia coli or the like or chemically modified with a palmitoyl group at the C-terminal cysteine. Specifically, a palmitoyl ester with a maleimide group is newly synthesized and reacted with SIFP. Since the thiol group and maleimide group of cysteine are known to bind selectively, this reaction can artificially bind the palmitoyl group to the cysteine of SIFP.

本願発明の医薬組成物における別の形態は、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質（特に、SIFPまたはAIFP）の使用である。この癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質は、前記の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に、さらに細胞膜非透過性ペプチドと、癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列とを連結している。具体的には、N末端から順に、「細胞膜非透過性ペプチド」＋「癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列」＋細胞膜透過性ペプチド」＋「キナーゼ阻害性融合タンパク質」という構成を有している。すなわち、細胞膜非透過性ペプチド（例えば、ポリグルタミンからなるペプチド）の存在によって、その内側にある細胞膜透過性ペプチドは不活性化し、正常細胞に取り込まれることはない。ところが、癌細胞に接触した場合には、癌細胞特異的に発現するプロテアーゼ（例えば、MMP2）によって、その特異的認識配列（MMP2 cleavable site）が切断される。これによって細胞膜透過性ペプチドがN末端に露出し、細胞膜透過活性を獲得することになる。   Another form in the pharmaceutical composition of the present invention is the use of a cancer cell membrane permeable kinase inhibitory fusion protein (especially SIFP or AIFP). This cancer cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein has a cell membrane-impermeable peptide and a cancer cell-specific protease recognition sequence linked to the N-terminal side of the cell membrane-permeable kinase-inhibiting fusion protein. Specifically, in order from the N-terminal, it has a configuration of “cell membrane impermeable peptide” + “cancer cell-specific protease recognition sequence” + cell membrane permeable peptide ”+“ kinase-inhibiting fusion protein ”. That is, due to the presence of a cell membrane-impermeable peptide (for example, a peptide composed of polyglutamine), the cell membrane-permeable peptide inside it is inactivated and is not taken up by normal cells. However, when it comes into contact with a cancer cell, its specific recognition sequence (MMP2 cleavable site) is cleaved by a protease (for example, MMP2) expressed specifically in the cancer cell. As a result, the cell membrane permeable peptide is exposed at the N-terminus, and cell membrane permeability activity is acquired.

従って、この癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質（SIFPまたはAIFP）の場合には、全身性または癌細胞を含む広範な組織に投与しても、その作用を癌細胞に対してのみ発揮させることができる。   Therefore, in the case of this cancer cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein (SIFP or AIFP), even when administered to a wide range of tissues including systemic or cancer cells, the effect is exerted only on cancer cells. Can do.

なお、本願発明のキナーゼ阻害性融合タンパク質の具体例であるSIFPおよびAIFPは、例えば、食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頚部癌、骨・軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等のSrc活性化またはAkt活性化に伴って増殖や転移する癌細胞に対して治療効果を発揮することができる。   SIFP and AIFP, which are specific examples of the kinase-inhibiting fusion protein of the present invention, include, for example, esophageal cancer, stomach cancer, lung cancer, kidney cancer, thyroid cancer, parotid cancer, head and neck cancer, bone / soft tissue sarcoma, urine A therapeutic effect can be exerted on cancer cells that proliferate or metastasize with Src activation or Akt activation such as duct cancer, bladder cancer, uterine cancer, liver cancer, breast cancer, ovarian cancer, fallopian tube cancer and the like.

本願発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、本願発明において使用する遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等の記載を、薬剤（医薬組成物）の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990等の記載を参考にすることができる。
Various techniques used for carrying out the invention of the present application can be easily and reliably implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for a technique that clearly indicates the source. For example, the genetic engineering and molecular biological techniques used in the present invention are Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995, etc., and the preparation of the drug (pharmaceutical composition) is Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Etc. can be referred to.

以下、実施例を示して本願発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、本願発明は以下の例に限定されるものではない。

実施例１
チロシンキナーゼSrcの活性化部が脂質ラフトであることを確認した試験、および本願発明のSIFPが癌細胞特異的にその細胞周期の停止を誘導し、またその細胞接着を抑制することを確認した実施例について説明する。なお、以下の説明では、コントロール（非ラフト局在型SIFP）と区別するため、本願発明のSIFPを「脂質ラフト局在型SIFP」と記載する。

（1）材料および方法
1．プラスミド構築
TM-Srcus及びTM-Srcus Y314Aの発現ベクターとして、膜貫通リンタンパク質由来の膜貫通ドメイン（Cbp、アミノ酸1-5：Kawabuchi, M. et al. Transmembrane phosphoprotein Cbp regulates the activities of Src-family tyrosine kinases. Nature 404, 999-1003, 2000）、リンカーと融合させたCbpのTyr-314を含むリンペプチド由来のY314ドメイン、リンカーと融合させたY314Aドメイン、Srcキナーゼのカルボキシル末端由来のSH2ドメイン（Csk、アミノ酸80-162：Takeuchi, S., Takayama, Y., Ogawa, A., Tamura, K. & Okada, M. Transmembrane phosphoprotein Cbp positively regulates the activity of the carboxyl-terminal Src kinase, Csk. J. Biol. Chem. 275, 29183-29186, 2000）、CFP、ヒト免疫不全症ウイルス由来のタンパク質（Ullman, K.S., Powers, M.A. & Forbes, D.J. Nuclear export receptors: from importin to exportin. Cell 90, 967-970, 1997）に由来するNESを有するYFPのそれぞれのcDNA断片をPCRによって調製し、pBlueScript SK(+)にクローニングした。EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely and in detail, this invention is not limited to the following examples.

Example 1
Tests confirming that the activation part of tyrosine kinase Src is lipid raft, and confirming that SIFP of the present invention induces cell cycle arrest specifically and suppresses its cell adhesion An example will be described. In the following description, the SIFP of the present invention is referred to as “lipid raft localized SIFP” in order to distinguish it from control (non-raft localized SIFP).

(1) Materials and methods
1． Plasmid construction
TM-Srcus and TM-Srcus Y314A expression vectors include transmembrane phosphoprotein-derived transmembrane domains (Cbp, amino acids 1-5: Kawabuchi, M. et al. Transmembrane phosphoprotein Cbp regulates the activities of Src-family tyrosine kinases. Nature 404, 999-1003, 2000), Y314 domain derived from a phosphopeptide containing Cbp Tyr-314 fused to a linker, Y314A domain fused to a linker, SH2 domain derived from the carboxyl terminus of Src kinase (Csk, amino acid) 80-162: Takeuchi, S., Takayama, Y., Ogawa, A., Tamura, K. & Okada, M. Transmembrane phosphoprotein Cbp positively regulates the activity of the carboxyl-terminal Src kinase, Csk. J. Biol. Chem 275, 29183-29186, 2000), CFP, protein derived from human immunodeficiency virus (Ullman, KS, Powers, MA & Forbes, DJ Nuclear export receptors: from importin to exportin. Cell 90, 967-970, 1997) PCR of each cDNA fragment of YFP with NES derived from Prepared me, was cloned into the pBlueScript SK (+).

脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFP、そのアラニン変異体及び欠失変異体のそれぞれの発現ベクターを構築するために、リンカーと融合させた脂質ラフト局在化ペプチド（C末端H-Ras、CMSCKCVLS）、リンカーと融合させた非ラフト局在化ペプチド（C末端Rho-A、GCLVL）、フラッグタグと融合させたSrc阻害ペプチド(MIYKYYF)、フラッグタグと融合させたSrc阻害ペプチドのアラニン変異体(MIYKYAF)及びYFPのそれぞれのcDNA断片をPCRによって調製し、pBlueScript SK(+)にクローニングした。   Lipid raft localization peptides (C-terminal H-Ras, CMSCKCVLS) fused with linkers to construct expression vectors for lipid raft and non-raft localized SIFP, their alanine mutants and deletion mutants , Non-raft localized peptide fused with linker (C-terminal Rho-A, GCLVL), Src inhibitory peptide fused with flag tag (MIYKYYF), alanine mutant of Src inhibitory peptide fused with flag tag (MIYKYAF) ) And YFP cDNA fragments were prepared by PCR and cloned into pBlueScript SK (+).

全てのクローニング用酵素（Takara Biochemical）は製造者の説明書にしたがって使用した。PCR断片は、ABI 310遺伝子分析機(genetic analyzer)(Applied Biosystems社)により配列決定した。このコンストラクトを、pcDNA3.1(+)(Invitrogen社)のKozak配列の後のHindIII−XhoI部位にサブクローニングした。

２．細胞のイメージング
TM-Srcusを発現している乳癌細胞（MCF-7）細胞を、ステロイド非含有培地（2％活性炭処理済みウシ胎児血清を含むフェノールレッド非含有Eagle最小必須培地）により12時間の飢餓培養し、Hankの平衡化培地（HBSS）（Sigma社）を用いて2回洗浄した。全反射蛍光イメージングのために、CCDカメラCoolSnap ES(Roper Scientific社)を備え、MetaFluor(Universal Imaging社)により制御された全反射型蛍光顕微鏡IX70(Olympus社)のもとで前記の細胞を観察した。励起光の波長は440±10nm、露光時間は300msであった。60×油浸対物 PlanApo60(Olympus社)を用いて、480±15nm及び535±12.5nmにおけるフィルターを通し、CFP及びYFPの蛍光イメージを得た。通常の蛍光イメージングのために、細胞をPP2(Calbiochem社)で前処理し、17β−エストラジオール(E2)(Sigma社)で刺激して、冷却CCDカメラMicroMax(Roper Scientific社)を備え、MetaFluorにより制御されたCarl Zeiss Axiovert 135顕微鏡(Carl Zeiss社)上で、室温にてイメージングした。励起光の波長は440±10nm、露光時間は200msであった。40×油浸対物(Carl Zeiss社）を用いて、480±15nm及び535±12.5nmにおけるフィルターを通し、蛍光イメージを得た。

3．密度勾配分画
TM-Srcus、及び、脂質ラフト及び非脂質ラフト局在型SIFPを発現している3枚の10cm径ディッシュ中のMCF-7細胞を氷冷HBSS中に掻き取り、2,000rpm、4℃において遠心分離して沈殿させ、180μlのTNE(10mM Tris-HCl、pH7.6、500mM NaCl、1mM EDTA）、1％ TritonX、10％シュークロース、2mMオルトバナジウム酸塩を用いて、200μlイエローチップを通したピペッティングによって4℃にて完全に溶解させ、20分間氷上でインキュベートした。360μlの冷した0％OptiprepTM(Axis-Shield PoC AS社)をこの抽出物に添加し、10分間氷上でインキュベートした。この抽出物と60％OptiprepTMの混合物をポリカーボネート製厚肉管（Beckman Coulter社）に移した。このサンプルに各層540μlずつの35％、30％、25％、20％、0％のOptiprepTM(TNE、1％ TritonX、１０％シュークロース、2mMオルトバナジウム酸塩中に溶解）を重層した。この勾配を200,000×g、4℃にて4時間遠心分離した。画分4は低密度画分、画分5は高密度画分であり、及び画分6は核成分を分画した後の上清画分である。

４．免疫沈降およびイムノブロット分析
免疫沈降用に、低密度及び高密度画分を等量のTNE、1％ TritonX、10％シュークロース、2mMオルトバナジウム酸塩を用いて希釈した。希釈されたサンプルを抗フラッグ抗体（Sigma社）、又は抗ホスホチロシン抗体（PY20、Santa Cruz Biotechnology社）を用いて免疫沈降させた。イムノブロッティング用に、前記サンプルを10％アクリルアミドSDSゲル上での電気泳動により分離し、電気泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜へと転写した。その膜を1％ドライミルク又は3％BSAのTBST溶液を用いてブロックし、1次抗体；抗ホスホチロシン抗体（PY20、Santa Cruz Biotechnology社）、抗GFP抗体（Clontech社）、抗カベオリン1（BD Transduction Laboratories社）抗体、及び抗Src抗体（GD11、Upstate Biotechnology社）中でインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ又は抗マウスIgG(Amersham Life Science社)を用いて、バンドを視覚化した。

５．細胞培養及びトランスフェクション
10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び0.1mMの非必須アミノ酸を添加した最小必須培地（Sigma社）中で、5％CO2条件下、37℃においてMCF-7細胞を培養した。細胞をLipofectAMINE 2000(Invitrogen社）を用いてトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクトする24〜36時間前に、蛍光イメージングのためにガラス底面のディッシュ上に、あるいはイムノブロット分析のためにプラスチックディッシュ上に、それぞれプレーティングした。

６．免疫染色
TM-Srcusを発現しているMCF-7細胞を、4％パラホルムアルデヒドを用いて固定化した。固定化された細胞をSrcに対する1次抗体(sc18、Santa Cruz Biotechnology社）、次いでCy-5コンジュゲート抗IgG 2次抗体を用いて染色した。共焦点レーザー顕微鏡 LSM 510(Carl Zeiss社)のもと、室温にて、カバースライド上の細胞を観察した。

７．CTXB-Alexa647による細胞染色
TM-Srcus及び、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞を、HBSSで洗浄し、2μg/mlのAlexa647-CTXB (Molecular probes社)と共に、0.01％BSA、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、25mM HEPES及び0.1mMの非必須アミノ酸を添加した最小必須培地中で、37℃、1時間インキュベートした。染色後、細胞をHBSSで2度洗浄し、TIRFM又は共焦点顕微鏡のもとで室温にて観察した。露光時間は633±10nm、励起は200msであった。60×油浸対物レンズPlanApo 60及び100×油浸対物レンズをそれぞれ用いて、TIRFM又は共焦点顕微鏡を通じたAlexa647-CTXBの蛍光イメージを得た。

８．細胞接着アッセイ
脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、PBSに再懸濁した。この細胞懸濁物（106細胞/ml）を24×24mmのマイクロカバーグラス（Matsunami社）上、及び6ウェルプレート（Nunc社）の底にまいた。24時間インキュベートした後、カバースライド上及びウェル底上の両方における80％のコンフルエントな細胞を、それぞれSIFPをコードして構築されたDNAにてトランスフェクトし、37℃、24時間インキュベートした。最初にプレーティングされた蛍光陽性の細胞を計数するために、カバースライド上のトランスフェクトされた細胞をHBSSにて洗浄し、メタノールで20分間、-20℃にて固定化した。カバースライド上の蛍光陽性の細胞は、蛍光顕微鏡（×40）下で直接計数した。接着した蛍光陽性の細胞を計数するために、ウェル底上のトランスフェクトされた細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁した。全細胞懸濁液（106細胞/ml）を、33μg/mlのフィブロネクチンPBS溶液にて4℃で一晩コーティングされたカバースライド上に置き、37℃、4時間インキュベートした。フィブロネクチンでコーティングされたカバースライド上に接着した細胞をHBSSにて洗浄し、メタノールで20分間、-20℃にて固定化した。接着した蛍光陽性の細胞を、蛍光顕微鏡（×40）下で直接計数した。接着指数は接着した蛍光陽性の細胞数を最初にプレーティングされた蛍光陽性の細胞数で割ったものである。

９．PI染色及びFACS分析
脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞（1.5×106細胞）を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、氷冷したPBSに再懸濁した。この細胞懸濁物を70％エタノールで30分間、4℃にて固定化した。固定化された細胞をPBSで2度洗浄し、100μg/mlのRNase A(Qiagen社)PBS溶液と共に室温にて30分間インキュベートし、4℃、30分間のPI染色（50μg/ml）に供した。PI染色された細胞をFACS(Beckman Coulter社)により分析した。

（2） Src活性化部位の確認
1．方法
生細胞の細胞膜中におけるSrc活性化部位を調べるため、膜貫通型蛍光インジケーターTM-Srcus（図1a）を使用した。All cloning enzymes (Takara Biochemical) were used according to the manufacturer's instructions. PCR fragments were sequenced with an ABI 310 genetic analyzer (Applied Biosystems). This construct was subcloned into the HindIII-XhoI site after the Kozak sequence of pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

2. Cell imaging
Breast cancer cells (MCF-7) expressing TM-Srcus were starved for 12 hours in a steroid-free medium (Phenol Red-free Eagle's minimum essential medium containing 2% activated charcoal-treated fetal calf serum) Washed twice using Hank's equilibrated medium (HBSS) (Sigma). For total reflection fluorescence imaging, the cells were observed under a total reflection fluorescence microscope IX70 (Olympus) equipped with a CCD camera CoolSnap ES (Roper Scientific) and controlled by MetaFluor (Universal Imaging) . The wavelength of the excitation light was 440 ± 10 nm, and the exposure time was 300 ms. Fluorescence images of CFP and YFP were obtained using a 60 × oil immersion objective PlanApo60 (Olympus) through filters at 480 ± 15 nm and 535 ± 12.5 nm. For normal fluorescence imaging, cells are pretreated with PP2 (Calbiochem), stimulated with 17β-estradiol (E2) (Sigma), equipped with a cooled CCD camera MicroMax (Roper Scientific) and controlled by MetaFluor Imaging at room temperature on a Carl Zeiss Axiovert 135 microscope (Carl Zeiss). The wavelength of the excitation light was 440 ± 10 nm, and the exposure time was 200 ms. Using a 40 × oil immersion objective (Carl Zeiss), fluorescence images were obtained by passing filters at 480 ± 15 nm and 535 ± 12.5 nm.

3． Density gradient fractionation
MCF-7 cells in three 10cm dishes expressing TM-Srcus and lipid raft and non-lipid raft localized SIFP are scraped into ice-cold HBSS and centrifuged at 2,000rpm at 4 ° C The precipitate was filtered through 200 μl yellow tip using 180 μl TNE (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA), 1% TritonX, 10% sucrose, 2 mM orthovanadate. It was completely dissolved at 4 ° C. by petting and incubated on ice for 20 minutes. 360 μl of cold 0% Optiprep ™ (Axis-Shield PoC AS) was added to this extract and incubated on ice for 10 minutes. A mixture of this extract and 60% Optiprep ™ was transferred to a polycarbonate thick-walled tube (Beckman Coulter). This sample was overlaid with 540 μl of each layer of 35%, 30%, 25%, 20%, 0% Optiprep ™ (TNE, 1% TritonX, 10% sucrose, dissolved in 2 mM orthovanadate). This gradient was centrifuged at 200,000 × g at 4 ° C. for 4 hours. Fraction 4 is the low density fraction, fraction 5 is the high density fraction, and fraction 6 is the supernatant fraction after fractionation of the nuclear components.

4). Immunoprecipitation and immunoblot analysis For immunoprecipitation, the low and high density fractions were diluted with an equal volume of TNE, 1% TritonX, 10% sucrose, 2 mM orthovanadate. The diluted sample was immunoprecipitated using an anti-flag antibody (Sigma) or an anti-phosphotyrosine antibody (PY20, Santa Cruz Biotechnology). For immunoblotting, the sample was separated by electrophoresis on a 10% acrylamide SDS gel, and the electrophoresed protein was transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane was blocked with TBST solution of 1% dry milk or 3% BSA. Primary antibody; anti-phosphotyrosine antibody (PY20, Santa Cruz Biotechnology), anti-GFP antibody (Clontech), anti-caveolin 1 (BD Transduction Laboratories) antibody and anti-Src antibody (GD11, Upstate Biotechnology). Bands were visualized using horseradish peroxidase conjugated anti-rabbit or anti-mouse IgG (Amersham Life Science).

5. Cell culture and transfection
MCF-7 cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 in minimal essential medium (Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, and 0.1 mM non-essential amino acids. Cells were transfected using LipofectAMINE 2000 (Invitrogen). Cells were plated 24-36 hours before transfection on glass bottom dishes for fluorescent imaging or on plastic dishes for immunoblot analysis.

6). Immunostaining
MCF-7 cells expressing TM-Srcus were fixed with 4% paraformaldehyde. Fixed cells were stained with a primary antibody against Src (sc18, Santa Cruz Biotechnology) followed by a Cy-5 conjugated anti-IgG secondary antibody. Under the confocal laser microscope LSM 510 (Carl Zeiss), the cells on the cover slide were observed at room temperature.

7). Cell staining with CTXB-Alexa647
MCF-7 cells expressing TM-Srcus and lipid raft and non-raft localized SIFP were washed with HBSS, and 0.01% BSA, 1% with 2 μg / ml Alexa647-CTXB (Molecular probes) Incubation was performed at 37 ° C. for 1 hour in minimal essential medium supplemented with penicillin / streptomycin, 25 mM HEPES and 0.1 mM non-essential amino acids. After staining, the cells were washed twice with HBSS and observed at room temperature under TIRFM or confocal microscopy. The exposure time was 633 ± 10 nm and excitation was 200 ms. Fluorescence images of Alexa647-CTXB through TIRFM or confocal microscope were obtained using 60 × oil immersion objective PlanApo 60 and 100 × oil immersion objective, respectively.

8). Cell adhesion assay MCF-7 cells expressing lipid raft and non-raft localized SIFP were washed with PBS, trypsinized and resuspended in PBS. This cell suspension (10 6 cells / ml) was spread on a 24 × 24 mm micro cover glass (Matsunami) and on the bottom of a 6-well plate (Nunc). After incubation for 24 hours, 80% confluent cells on both the cover slide and the well bottom were each transfected with DNA constructed encoding SIFP and incubated at 37 ° C. for 24 hours. To count the initially plated fluorescence-positive cells, the transfected cells on the cover slide were washed with HBSS and fixed with methanol for 20 minutes at -20 ° C. Fluorescence positive cells on cover slides were counted directly under a fluorescence microscope (x40). In order to count adherent fluorescence positive cells, the transfected cells on the well bottom were trypsinized and resuspended in media. The whole cell suspension (10 6 cells / ml) was placed on a cover slide coated overnight at 4 ° C. with 33 μg / ml fibronectin PBS solution and incubated at 37 ° C. for 4 hours. The cells adhering onto the cover slide coated with fibronectin were washed with HBSS, and fixed with methanol at -20 ° C. for 20 minutes. Adherent fluorescence positive cells were counted directly under a fluorescence microscope (x40). The adhesion index is the number of fluorescent positive cells attached divided by the number of fluorescent positive cells initially plated.

9. PI staining and FACS analysis MCF-7 cells (1.5 × 10 6 cells) expressing lipid raft and non-raft localized SIFP were washed with PBS, trypsinized and resuspended in ice-cold PBS . The cell suspension was fixed with 70% ethanol for 30 minutes at 4 ° C. The fixed cells were washed twice with PBS, incubated with 100 μg / ml RNase A (Qiagen) PBS solution at room temperature for 30 minutes, and subjected to PI staining (50 μg / ml) at 4 ° C. for 30 minutes. . PI stained cells were analyzed by FACS (Beckman Coulter).

(2) Confirmation of Src activation site
1． Method A transmembrane fluorescent indicator TM-Srcus (FIG. 1a) was used to examine the Src activation site in the cell membrane of living cells.

すなわち、TM-SrcusはSrc基質ドメイン、リン酸化認識ドメイン、リンカー配列、及び２つのGFP変異体を含む融合タンパク質である。活性化されたSrcによってTM-SrcusのSrc基質ドメイン中のチロシンにおいてリン酸化を受けるとき、隣接するリン酸化認識部位はこのリン酸化チロシンと特異的に結合する。この結合が起こるとき、TM-Srcus中のシアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)との間の距離はより短くなることが予想され、分子内蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)応答が生じる（図1a）。発光比率は、CFPの蛍光強度をYFPの傾向強度で割ったものである。FRETが誘発されている場合、CFPの蛍光強度は増加し、YFPの蛍光強度は減少する。発光比率は結果として減少する。これによって、このインジケーターは、FRETによるCFP/YFP発光比率の減少としてin vivoにおけるSrcの活性化を測定する。細胞膜や細胞内オルガネラ膜等の生体膜全領域におけるSrcの活性化を直接検出するために、TM-Srcusは細胞膜に高い親和性を有する膜貫通ドメインを有する。このドメインは、パルミトイル化されたシステイン残基及び疎水性膜貫通配列からなる脂質化シグナル配列と共に、生体膜にこのインジケーターを局在させる。従って、インジケーターは、生体膜全体におけるSrcの活性化をモニターすることができる（図1a）。

2．結果
全反射型蛍光顕微鏡（TIRFM）のもとにおいて、TM-Srcusを発現しているMCF-7細胞を観察した。TIRFMは接触領域から約100nmの奥行きの範囲内における蛍光イメージを提供し、細胞の基底細胞膜の選択的可視化を可能にする（Steyer, J.A. & Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 268-275, 2001）。TM-Srcusを発現している細胞は、エストロゲン受容体を通じてSrcを活性化する17β-エストラジオール（E2）を用いて刺激した。CFP/YFP発光比率を表す疑似カラーイメージは、1μM E2による刺激に反応した基底細胞膜上での局所的な青色へのシフトを示した（図2a左部及び中間部）。このことは、Srcの活性化が細胞質膜の空間的に限られた領域において起こることを示す。That is, TM-Srcus is a fusion protein comprising an Src substrate domain, a phosphorylation recognition domain, a linker sequence, and two GFP variants. When activated Src undergoes phosphorylation at tyrosine in the Src substrate domain of TM-Srcus, the adjacent phosphorylated recognition site specifically binds to this phosphorylated tyrosine. When this binding occurs, the distance between cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) in TM-Srcus is expected to be shorter, resulting in an intramolecular fluorescence resonance energy transfer (FRET) response. (Figure 1a). The emission ratio is the fluorescence intensity of CFP divided by the tendency intensity of YFP. When FRET is induced, the fluorescence intensity of CFP increases and the fluorescence intensity of YFP decreases. As a result, the emission ratio decreases. This indicator thereby measures Src activation in vivo as a decrease in the CFP / YFP luminescence ratio by FRET. TM-Srcus has a transmembrane domain that has high affinity for cell membranes in order to directly detect Src activation in the entire region of biological membranes such as cell membranes and intracellular organelle membranes. This domain localizes this indicator to biological membranes along with a lipidation signal sequence consisting of a palmitoylated cysteine residue and a hydrophobic transmembrane sequence. Thus, the indicator can monitor the activation of Src throughout the biological membrane (FIG. 1a).

2． Results MCF-7 cells expressing TM-Srcus were observed under a total reflection fluorescence microscope (TIRFM). TIRFM provides fluorescent images within a depth of about 100 nm from the contact area, allowing selective visualization of the basal cell membrane of cells (Steyer, JA & Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 268-275, 2001). Cells expressing TM-Srcus were stimulated with 17β-estradiol (E2), which activates Src through the estrogen receptor. The pseudo-color image representing the CFP / YFP luminescence ratio showed a local blue shift on the basal cell membrane in response to stimulation with 1 μM E2 (FIG. 2a left and middle). This indicates that Src activation occurs in a spatially limited region of the cytoplasmic membrane.

次に、脂質ラフトマーカーAlexa 647-コレラトキシンBサブユニット（CTXB2）（Simons, K. & Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39, 2000）を用いてMCF-7細胞を染色した。Srcの活性化を表す青色にシフトした領域は、脂質ラフトマーカーが集中している対象領域1（ROI1）に位置する。一方、脂質ラフトマーカーが集中していない対象領域2（ROI2）は、この青色にシフトした領域を含まなかった（図2a中間部及び右部、及び図2b）。これらの結果から、E2で刺激した際に細胞膜内の空間的に限られた脂質ラフトにおいてSrcの活性化が引き起こされていることが示唆される。このことをさらに裏付けるために、TM-Srcusを発現している細胞の全溶解物を低密度画分、高密度画分、及び核成分を分画した後の上清画分に分離する密度勾配分画を行った。これらの勾配画分を、HRP-結合CTXBと、別のラフトマーカータンパク質（Zajchowski, L.D. & Robbins, S.M. Lipid rafts and little caves. Compartmentalized signalling in membrane microdomains. Eur. J. Biochem. 269, 737-752, 2002）として知られているカベオリン1に対する抗体を用いてブロッティングした。脂質ラフトは低密度画分内に分画され、非ラフト領域及び細胞質は高密度画分に分画されたことを確認した（図2c）。抗pTyr抗体による低密度画分と高密度画分のイムノブロッティングは、1μM E2によって刺激した際の活性化されたSrcによるTM-Srcusのリン酸化が低密度（脂質ラフト）画分（図2c）においてのみ生じることを示す。このことは、E2によって誘発されたSrcの活性化を表す図2a中の青色にシフトした領域が原形質膜中の脂質ラフトを正確に網羅していることを示す。さらに、この低密度画分におけるTM-Srcusのリン酸化が生理学的濃度の10nM E2によって誘導されることを確認した。さらに、このTM-Srcusの脂質ラフトに特異的なリン酸化はその他の性ホルモン（例えば、男性ホルモンのジヒドロテストステロン(DHT)、及びプロゲステロン(P4)（図2c））によって誘導されたが、これらは受容体を通じてSrcを活性化することが知られている（Losel, R. & Wehling, M. Nongenomic actions of steroid hormones. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 46-56, 2003）。したがって、性ホルモンE2、DHT、及びP4はそれぞれ、MCF-7細胞中の脂質ラフトにおいてのみSrcの活性化を誘発することが結論付けられる。Next, lipid raft marker Alexa 647-cholera toxin B subunit (CTXB 2 ) (Simons, K. & Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39, 2000 ) Was used to stain MCF-7 cells. The blue-shifted region representing Src activation is located in region of interest 1 (ROI1) where lipid raft markers are concentrated. On the other hand, the target region 2 (ROI2) where lipid raft markers were not concentrated did not include this blue-shifted region (FIG. 2a middle part and right part, and FIG. 2b). These results suggest that Src activation is caused in spatially limited lipid rafts in the cell membrane when stimulated with E2. To further support this, a density gradient that separates the total lysate of cells expressing TM-Srcus into a low-density fraction, a high-density fraction, and a supernatant fraction after fractionation of nuclear components. Fractionation was performed. These gradient fractions were combined with HRP-conjugated CTXB and another raft marker protein (Zajchowski, LD & Robbins, SM Lipid rafts and little caves. Compartmentalized signaling in membrane microdomains. Eur. J. Biochem. 269, 737-752, 2002) and blotted with an antibody against caveolin-1. It was confirmed that the lipid raft was fractionated in the low density fraction, and the non-raft region and cytoplasm were fractionated in the high density fraction (FIG. 2c). Immunoblotting of low-density and high-density fractions with anti-pTyr antibody shows a low-density (lipid raft) fraction of TM-Srcus phosphorylated by activated Src when stimulated with 1 μM E2 (Figure 2c) It only occurs in This indicates that the blue-shifted region in FIG. 2a, representing Src activation induced by E2, accurately covers lipid rafts in the plasma membrane. Furthermore, it was confirmed that phosphorylation of TM-Srcus in this low density fraction was induced by a physiological concentration of 10 nM E2. Furthermore, the specific phosphorylation of TM-Srcus lipid rafts was induced by other sex hormones (eg, the male hormones dihydrotestosterone (DHT) and progesterone (P4) (Figure 2c)), which are It is known to activate Src through a receptor (Losel, R. & Wehling, M. Nongenomic actions of steroid hormones. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 46-56, 2003). Thus, it can be concluded that sex hormones E2, DHT, and P4 each induce Src activation only in lipid rafts in MCF-7 cells.

次に、細胞膜中のSrc自体の分布を調べるため、低密度画分及び高密度画分に対して抗Src抗体を用いてイムノブロッティングを行った。Srcは、性ステロイドホルモンによる刺激の有無に関わらず、低密度（脂質ラフト）画分及び高密度（非ラフト及び細胞質）画分の両方に分布していることが確認された（図2c）。この結果と抗pTyr抗体を用いたイムノブロッティングの結果により、脂質ラフト中のSrcのみが性ステロイドによって活性化されることが確認された。   Next, in order to examine the distribution of Src itself in the cell membrane, immunoblotting was performed on the low density fraction and the high density fraction using an anti-Src antibody. Src was confirmed to be distributed in both the low-density (lipid raft) and high-density (non-raft and cytoplasmic) fractions regardless of the presence or absence of sex steroid hormone stimulation (FIG. 2c). From this result and the result of immunoblotting using anti-pTyr antibody, it was confirmed that only Src in lipid rafts was activated by sex steroids.

次に、Srcは何故、性ステロイドによって独占的に脂質ラフト中で活性化されるのについて検討した。本願発明者らは最近、エストロゲン処理したMCF-7細胞中でSrcが、その活性化のためにER単独とはではなく、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)及びエストロゲン受容体（ER）の両方と一つの複合体を形成することを見出している（未発表）。細胞膜内におけるEGFR/ER/Src複合体の構成成分EGFR、ER、及びSrcの分布を、それぞれ抗Src抗体、抗EGFR抗体、及び抗ER抗体を用いて、MCF-7細胞溶解物由来の低密度画分及び高密度画分に対するウェスタンブロッティングによって分析した。その結果、Srcそれ自体だけでなく、EGFR及びERも、E2によってMCF-7細胞を刺激した際に、脂質ラフト内に移行することが見出された（図2d及びe）。したがって、脂質ラフト特異的なSrcの活性化は、その場所でのEGFR/ER/Src複合体の形成によるものであると結論付けることができる。

（3） 脂質ラフトにおけるSrc活性に対するSIFPの阻害効果
1．方法
脂質ラフト特異的なSrcの活性化を阻害する分子として脂質ラフト局在型SIFPを作成し、その効果を確認した。Next, we examined why Src is activated in lipid rafts exclusively by sex steroids. The present inventors have recently reported that Src in estrogen-treated MCF-7 cells is not both ER alone due to its activation, but both epidermal growth factor receptor (EGFR) and estrogen receptor (ER). And form a single complex (unpublished). Distribution of EGFR, ER, and Src constituents of the EGFR / ER / Src complex in the cell membrane, using anti-Src antibody, anti-EGFR antibody, and anti-ER antibody, respectively, low density derived from MCF-7 cell lysate Fractions and high density fractions were analyzed by Western blotting. As a result, it was found that not only Src itself but also EGFR and ER migrate into lipid rafts when MCF-7 cells were stimulated by E2 (FIGS. 2d and e). It can therefore be concluded that lipid raft-specific Src activation is due to the formation of an EGFR / ER / Src complex at that location.

(3) Inhibitory effect of SIFP on Src activity in lipid rafts
1． Methods Lipid raft-localized SIFP was prepared as a molecule that inhibits lipid raft-specific Src activation, and its effect was confirmed.

この実施例で作成したSIFPは、YFP、フラッグタグ、Src阻害ペプチド、脂質ラフト局在化ペプチド（H-RasのC末端9アミノ酸：CMSCKCVLS）からなる。また、生体膜の非脂質ラフトに局在させる分子として、Src阻害ペプチドのC末端にRho-AのC末端5アミノ酸(GCLVL)を連結した融合タンパク質を作成した（図3a上段）。さらに、Src阻害ペプチドのアラニン変異体を有する融合タンパク質（図3a中段）、Src阻害ペプチドを持たない融合タンパク質（図3a下段）を作成した。   SIFP prepared in this example consists of YFP, flag tag, Src inhibitory peptide, lipid raft localization peptide (C-terminal 9 amino acids of H-Ras: CMSCKCVLS). In addition, a fusion protein in which the C-terminal 5 amino acids (GCLVL) of Rho-A was linked to the C-terminus of the Src inhibitory peptide was prepared as a molecule to be localized in the non-lipid raft of the biological membrane (upper part of FIG. 3a). Furthermore, a fusion protein having an alanine mutant of the Src inhibitory peptide (middle panel in FIG. 3a) and a fusion protein having no Src inhibitory peptide (lower panel in FIG. 3a) were prepared.

これらの融合タンパク質について、Src活性の阻害効果や、癌細胞に対する効果を試験した。

2．結果
脂質ラフトへと局在化するSIFP（以下、脂質ラフト局在型SIFP）は、脂質ラフトマーカーAlexa-647CTXBと共に局在するが、非脂質ラフトへと局在化するSIFP（以下、非ラフト局在型SIFP）はこのラフトマーカーと共に局在しなかった（図3b）。これらのSIFPの細胞内局在は密度勾配分画を用いてさらに確認した。低密度画分及び高密度画分を、抗フラッグ抗体を用いた免疫沈降に供し、次に、抗GFP抗体（Gagnoux-Palacios, L. et al. Compartmentalization of integrin alpha6beta4 signaling in lipid rafts. J. Cell Biol. 162, 1189-1196, 2003）を用いたイムノブロッティングに供した。脂質ラフト局在型SIFPは低密度（脂質ラフト）画分に局在し、非ラフト局在型SIFPは高密度（非ラフト及び細胞質）画分に局在した（図3c）。脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPは、細胞膜の脂質ラフト領域中及び非ラフト領域中にそれぞれ特異的に局在することが、これらの結果から明らかに示される。

次に、脂質ラフトにおけるSrc活性に及ぼす脂質ラフト局在型SIFPの阻害効果について検討するため、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPがMCF-7細胞中でSrcによってリン酸化されるか否かを調べた。脂質ラフト又は非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞由来の低密度画分及び高密度画分を、抗pTyr抗体を用いて免疫沈降し、抗GFP抗体を用いてイムノブロッティングした。脂質ラフト局在型SIFPはMCF-7細胞の脂質ラフト中においてのみリン酸化されており、脂質ラフト中のこのリン酸化は、特異的Srcファミリーキナーゼ阻害剤PP2によってブロックされた（図3c）。この結果から、脂質ラフト局在型SIFPが脂質ラフト中においてのみSrcキナーゼ活性を特異的に阻害することが確認された。非ラフト局在型SIFPは細胞膜中の非ラフト領域でリン酸化されておらず（図3c）、このことはSrcの活性化が細胞膜の非ラフト領域では起こらないことを示す。

次に、脂質ラフト又は非脂質ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞の細胞接着について調べた。SIFPをトランスフェクトしたMCF-7細胞の接着の度合を測定し、接着している蛍光陽性細胞数を最初にプレーティングした蛍光陽性細胞数で割った接着指数(adhesion index)として表した。脂質ラフト局在型SIFPはインテグリンリガンドのひとつであるフィブロネクチンに接着する細胞の数を顕著に減少させた。対照的に、阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Del（図3a下段）はフィブロネクチンに対する細胞接着を損なわなかった（図4a）。脂質ラフト局在型SIFPに比べその阻害効果が１／６０に低減されている脂質ラフト局在型SIFP Y6A（図3a中段）と非ラフト局在型SIFPもMCF-7細胞の細胞接着を抑制しなかった（図4a）。また、前記と同様にして脂質ラフト又は阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）を発現しているヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞接着について調べた。結果は図8に示したとおりであり、HEK293細胞においては脂質ラフト局在型SIFPと阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Delは同程度の接着指数を示した。すなわち、乳癌細胞（MCF-7細胞）における結果（図4）とは明らかに異なり、脂質ラフト局在型SIFPはヒト正常細胞の細胞接着を阻害しないことが確認された。

さらに、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPがMCF-7細胞の細胞周期に影響を与えるか否かについて検討した。脂質ラフト又は非ラフト局在型SIFPをトランスフェクトしたMCF-7細胞のDNA含量をヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いるフローサイトメトリーによりアッセイした。SIFPを発現しているYFP陽性細胞の細胞周期プロファイルをこのアッセイを用いて取得した（図4b）。脂質ラフト及び非ラフト局在型YFPの細胞周期プロファイルを、脂質ラフト及び非ラフト局在型SIFPを発現しているMCF-7細胞における細胞周期の進行に対する対照としてそれぞれ使用した。脂質ラフト局在型SIFPは、G1期にある細胞に対するG2/M期にある細胞の割合を減少させたが、脂質ラフト局在型SIFP Y6Aはこの割合を減少させなかった（図4b上段）。一方、非ラフト局在型SIFPを発現しているYFP陽性細胞の細胞周期プロファイルは、非ラフト局在型YFPを発現しているYFP陽性細胞の細胞周期プロファイルと同様である（図4b下段）。また、非ラフト局在型SIFP Y6Aは非ラフト局在型YFPと同様の細胞周期プロファイルを示した（図4b下段）。一方、ヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞周期に対する脂質ラフト局在型SIFPの効果は、図9に示したとおり、阻害ペプチドを持たない脂質ラフト局在型SIFP Del（コントロール）と同程度であった。These fusion proteins were tested for their inhibitory effect on Src activity and on cancer cells.

2． Results SIFPs localized to lipid rafts (hereinafter lipid raft-localized SIFP) are localized with lipid raft marker Alexa-647CTXB, but SIFPs localized to non-lipid rafts (hereinafter non-raft stations). Tertiary SIFP) did not localize with this raft marker (Figure 3b). The intracellular localization of these SIFPs was further confirmed using density gradient fractionation. The low-density fraction and the high-density fraction are subjected to immunoprecipitation using an anti-flag antibody, followed by anti-GFP antibody (Gagnoux-Palacios, L. et al. Compartmentalization of integrin alpha6beta4 signaling in lipid rafts. J. Cell Biol. 162, 1189-1196, 2003). Lipid raft-localized SIFP was localized in the low-density (lipid raft) fraction, and non-raft-localized SIFP was localized in the high-density (non-raft and cytoplasm) fraction (Fig. 3c). These results clearly show that lipid rafts and non-raft localized SIFPs are specifically localized in lipid raft regions and non-raft regions of cell membranes, respectively.

Next, to investigate the inhibitory effect of lipid raft-localized SIFP on Src activity in lipid rafts, we investigated whether lipid rafts and non-raft-localized SIFPs are phosphorylated by Src in MCF-7 cells. Examined. Low-density fraction and high-density fraction derived from MCF-7 cells expressing lipid raft or non-raft localized SIFP were immunoprecipitated using anti-pTyr antibody and immunoblotted using anti-GFP antibody . Lipid raft-localized SIFP was only phosphorylated in lipid rafts of MCF-7 cells, and this phosphorylation in lipid rafts was blocked by the specific Src family kinase inhibitor PP2 (FIG. 3c). This result confirmed that lipid raft-localized SIFP specifically inhibits Src kinase activity only in lipid rafts. Non-raft localized SIFP is not phosphorylated in the non-raft region of the cell membrane (FIG. 3c), indicating that Src activation does not occur in the non-raft region of the cell membrane.

Next, cell adhesion of MCF-7 cells expressing lipid raft or non-lipid raft localized SIFP was examined. The degree of adhesion of SICF-transfected MCF-7 cells was measured and expressed as an adhesion index obtained by dividing the number of adherent fluorescence-positive cells by the number of fluorescence-positive cells plated first. Lipid raft-localized SIFP significantly reduced the number of cells that adhere to fibronectin, one of the integrin ligands. In contrast, lipid raft-localized SIFP Del without the inhibitory peptide (FIG. 3a bottom) did not impair cell adhesion to fibronectin (FIG. 4a). Lipid raft localized SIFP Y6A (middle in Fig. 3a) and its inhibitory effect reduced to 1/60 compared to lipid raft localized SIFP and non-raft localized SIFP also suppressed cell adhesion of MCF-7 cells Not (Figure 4a). In addition, cell adhesion of human normal cells (HEK293 cells) expressing lipid raft-localized SIFP Del (control) having no lipid raft or inhibitory peptide was examined in the same manner as described above. The results are as shown in FIG. 8. In HEK293 cells, lipid raft-localized SIFP and lipid raft-localized SIFP Del having no inhibitory peptide showed comparable adhesion indices. That is, unlike the results in breast cancer cells (MCF-7 cells) (FIG. 4), it was confirmed that lipid raft-localized SIFP does not inhibit cell adhesion of human normal cells.

Furthermore, we examined whether lipid rafts and non-raft localized SIFPs affect the cell cycle of MCF-7 cells. The DNA content of MCF-7 cells transfected with lipid raft or non-raft localized SIFP was assayed by flow cytometry using propidium iodide (PI) staining. Cell cycle profiles of YFP positive cells expressing SIFP were obtained using this assay (FIG. 4b). Lipid raft and non-raft localized YFP cell cycle profiles were used as controls for cell cycle progression in MCF-7 cells expressing lipid raft and non-raft localized SIFP, respectively. Lipid raft-localized SIFP decreased the proportion of cells in G 2 / M phase relative to cells in G 1 phase, whereas lipid raft-localized SIFP Y6A did not decrease this proportion (FIG. 4b, upper panel). ). On the other hand, the cell cycle profile of YFP-positive cells expressing non-raft-localized SIFP is the same as the cell cycle profile of YFP-positive cells expressing non-raft-localized YFP (lower part of FIG. 4b). Non-raft localized SIFP Y6A showed the same cell cycle profile as non-raft localized YFP (lower part of FIG. 4b). On the other hand, the effect of lipid raft-localized SIFP on the cell cycle of normal human cells (HEK293 cells) was similar to that of lipid raft-localized SIFP Del (control) without inhibitory peptides, as shown in FIG. It was.

これらの結果は、MCF-7細胞の細胞周期が脂質ラフト中におけるSrc活性の阻害により停止することを示す。脂質ラフト局在型SIFPは脂質ラフト中のSrc活性を阻害することができ、それによって、細胞周期の進行と細胞の細胞接着が防止された。これに対して、脂質ラフト局在型SIFPはヒト正常細胞（HEK293細胞）の細胞周期および細胞接着には効果を示さなかった。このことは、脂質ラフト局在型SIFPが、副作用の少ない抗癌剤成分として有望であることを示している。

以前の研究において、Src基質であるインテグリンα6β4を脂質ラフトに局在しないよう改変した非パルミトイル化インテグリンα6β4がERKのリン酸化を低減し、有糸分裂生起を阻害することが示されている（Gagnoux-Palacios, L. et al. Compartmentalization of integrin alpha6beta4 signaling in lipid rafts. J. Cell Biol. 162, 1189-1196, 2003）。しかし、インテグリンα6β4、又はSrc等の上流のキナーゼのどちらのキナーゼが、この脂質ラフト特異的なインテグリンシグナル伝達カスケードの初期ステップを制御するのかは、内在性のSrc及びインテグリンが細胞膜中に遍在的に分布していることから、明確にされていなかった。Srcの活性化が脂質ラフト中で起こり、それにより細胞周期の進行が引き起こされるという知見は、Srcが脂質ラフト中のインテグリンシグナル伝達カスケードを引き起こし、有糸分裂生起により細胞周期の進行を制御するというプロセスを合理的に示唆するものである。These results indicate that the cell cycle of MCF-7 cells is stopped by inhibition of Src activity in lipid rafts. Lipid raft-localized SIFP was able to inhibit Src activity in lipid rafts, thereby preventing cell cycle progression and cell adhesion. In contrast, the lipid raft-localized SIFP had no effect on the cell cycle and cell adhesion of human normal cells (HEK293 cells). This indicates that lipid raft-localized SIFP is promising as an anticancer agent component with few side effects.

Previous studies have shown that the non-palmitoylated integrin α6β4, modified so that the Src substrate integrin α6β4 is not localized to lipid rafts, reduces ERK phosphorylation and inhibits mitogenesis (Gagnoux -Palacios, L. et al. Compartmentalization of integrin alpha6beta4 signaling in lipid rafts. J. Cell Biol. 162, 1189-1196, 2003). However, whether integrin α6β4 or an upstream kinase such as Src controls the initial steps of this lipid raft-specific integrin signaling cascade, endogenous Src and integrins are ubiquitous in the cell membrane. It was not clarified because it was distributed to. The finding that Src activation occurs in lipid rafts, thereby causing cell cycle progression, suggests that Src triggers the integrin signaling cascade in lipid rafts and regulates cell cycle progression through mitogenesis It is a reasonable suggestion of the process.

病理学的な観点からは、細胞周期の進行及び腫瘍細胞の細胞接着は癌細胞の増殖や転移と密接に関連している。例えば、Src活性が結腸直腸腫瘍転移のフィルダーモデル由来転移細胞の細胞接着と関連すること（Jones, R.J. et al. Elevated c-Src is linked to altered cell-matrix adhesion rather than proliferation in KM12C human colorectal cancer cells. Br. J. Cancer. 87, 1128-1135, 2002）、Src依存的な細胞周期進行が腫瘍細胞増殖を促進すること（Summy, J.M. & Gallick, G.E. Src family kinases in tumor progression and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 22, 337-358, 2003）などが知られている。本願発明によって提供される空間的に限定されるSrc活性の阻害は、癌細胞の増殖や転移をより効果的に防止することを可能とする。

実施例２
セリン／スレオニンキナーゼAktの活性化部がミトコンドリアであることを確認した試験、および本願発明のAIFPが癌細胞特異的にその細胞周期の停止を誘導することを確認した実施例について説明する。
（１）材料および方法
基本的に、実施例１と同様の材料および方法に従って、ミトコンドリア局在化配列（配列番号４）とAkt阻害ペプチド（配列番号３）を含むAIFP（図５上段）の発現ベクターと、Akt阻害ペプチドを含まないコントロールAIFP（図５下段）の発現ベクターをそれぞれ構築した。From a pathological point of view, cell cycle progression and tumor cell adhesion are closely related to cancer cell proliferation and metastasis. For example, Src activity is associated with cell adhesion of metastatic cells from the Filder model of colorectal tumor metastasis (Jones, RJ et al. Elevated c-Src is linked to altered cell-matrix adhesion rather than proliferation in KM12C human colorectal cancer cells Br. J. Cancer. 87, 1128-1135, 2002), Src-dependent cell cycle progression promotes tumor cell growth (Summy, JM & Gallick, GE Src family kinases in tumor progression and metastasis. Cancer Metastasis. Rev. 22, 337-358, 2003) are known. The spatially limited inhibition of Src activity provided by the present invention makes it possible to more effectively prevent cancer cell growth and metastasis.

Example 2
A test for confirming that the activation part of serine / threonine kinase Akt is mitochondria and an example for confirming that AIFP of the present invention induces cell cycle arrest specifically for cancer cells will be described.
(1) Material and Method According to the same material and method as in Example 1, expression of AIFP (upper part of FIG. 5) containing a mitochondrial localization sequence (SEQ ID NO: 4) and an Akt inhibitory peptide (SEQ ID NO: 3) A vector and a control AIFP expression vector (bottom of FIG. 5) not containing an Akt inhibitory peptide were constructed.

これらの発現ベクターを実施例１と同様のヒト乳癌細胞由来MCF-7細胞に導入してAIFPおよびそのコントロールを発現させ、実施例１と同様に細胞染色し、またFACS分析した。
（2） 結果
AIFPをMCF-7細胞に導入し、ミトコンドリアマーカーで染色し、またAIFPのGFPを可視化した。結果は図６に示したとおりである。AIFPがミトコンドリアに局在して発現することが確認された。These expression vectors were introduced into human breast cancer cell-derived MCF-7 cells similar to those in Example 1 to express AIFP and its control, and cell staining was performed in the same manner as in Example 1 and FACS analysis was performed.
(2) Results
AIFP was introduced into MCF-7 cells, stained with a mitochondrial marker, and AIFP GFP was visualized. The results are as shown in FIG. It was confirmed that AIFP is localized and expressed in mitochondria.

次に、AIFPを発現するMCF-7細胞の細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーにより測定した。結果は図７に示したとおりであり、コントロールAIFP（図７右）と比較して、AIFP発現細胞では明らかにG2/M期の細胞数が増加していることから、Aktの活性化をミトコンドリアで特異的に抑制することにより、MCF-7細胞の細胞周期をG2/M期で停止可能であることが確認された。

実施例３
脂質ラフト局在型であり、かつ癌細胞膜透過性でるSIFPを作成し、その活性を試験した。
（１）材料
実施例１で作成した脂質ラフト局在型SIFP（図3a上段）のN末端に、細胞膜透過性ペプチド（１1個のアルギニンからなるペプチド）、癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列（PLGLAG：配列番号5）、細胞膜非透過性ペプチド（11個のグルタミンからなるペプチド）を連結した癌細胞膜透過性SIFP（図10）の発現ベクターを構築した。

（２）癌細胞膜透過性SIFPの癌細胞特異的プロテアーゼ（MMP）による切断
癌細胞膜透過性SIFP発現ベクターを大腸菌に導入し、ベクターから発現した癌細胞膜透過性SIFPをHis-tagカラムで生成した。この癌細胞膜透過性SIFPにMMPを添加した後、抗flag抗体を用いてウェスタンブロット分析した。Next, the cell cycle profile of MCF-7 cells expressing AIFP was measured by flow cytometry. The results are shown in Fig. 7. Compared with control AIFP (Fig. 7 right), the number of cells in G2 / M phase is clearly increased in AIFP-expressing cells. It was confirmed that the cell cycle of MCF-7 cells can be arrested in the G2 / M phase by specifically suppressing with.

Example 3
SIFP, a lipid raft localized type and cancer cell membrane permeable, was prepared and tested for its activity.
(1) Materials At the N-terminus of the lipid raft localized SIFP prepared in Example 1 (the upper part of FIG. 3a), a cell membrane-permeable peptide (a peptide consisting of 11 arginines), a cancer cell-specific protease recognition sequence (PLGLAG: An expression vector for cancer cell membrane-permeable SIFP (FIG. 10) linked to SEQ ID NO: 5) and a cell membrane-impermeable peptide (a peptide comprising 11 glutamines) was constructed.

(2) Cleavage of cancer cell membrane-permeable SIFP with cancer cell-specific protease (MMP) A cancer cell membrane-permeable SIFP expression vector was introduced into Escherichia coli, and a cancer cell membrane-permeable SIFP expressed from the vector was generated with a His-tag column. After adding MMP to this cancer cell membrane permeable SIFP, Western blot analysis was performed using an anti-flag antibody.

結果は図11に示したとおりである。MMPで処理した場合のみ、癌細胞膜透過性SIFPから切断されたバンドが観察された。   The results are as shown in FIG. Only when treated with MMP, a band cleaved from cancer cell membrane-permeable SIFP was observed.

この結果から、癌細胞膜透過性SIFPは、MMPが存在する場合には、そのMMP認識配列が切断され、N末端側のポリグルタミン配列が切り離されることが確認された。

（３）癌細胞膜透過性SIFPの乳癌細胞MCF-7への取り込み
大腸菌で発現させ、精製した癌細胞膜透過性SIFP（1μM）を、培養MCF-7細胞の培地に添加した。そして、この培地へのプロテアーゼMMPの添加の有無による癌細胞膜透過性SIFPのMCF-7細胞への取り込みを、抗flag抗体を用いた免疫染色により観察した。From this result, it was confirmed that when MMP is present in the cancer cell membrane-permeable SIFP, its MMP recognition sequence is cleaved and the N-terminal polyglutamine sequence is cleaved.

(3) Incorporation of cancer cell membrane-permeable SIFP into breast cancer cell MCF-7 Cancer cell membrane-permeable SIFP (1 μM) expressed and purified in E. coli was added to the culture medium of cultured MCF-7 cells. And the uptake | capture to the MCF-7 cell of cancer cell membrane permeability | transmittance SIFP by the presence or absence of addition of protease MMP to this culture medium was observed by the immuno-staining using an anti flag antibody.

結果は図12に示したとおりである。MMPを添加しない場合（図12上段）と比較して、MMPを添加した場合（図12下段）には、癌細胞膜透過性SIFPに結合した抗flag抗体からのシグナルが多く観察された。   The results are as shown in FIG. Compared with the case where MMP was not added (the upper part of FIG. 12), when MMP was added (the lower part of FIG. 12), more signals from the anti-flag antibody bound to the cancer cell membrane-permeable SIFP were observed.

この結果から、癌細胞膜透過性SIFPはそのN末端のポリグルタミン配列（細胞膜非透過性ペプチド）がMMPによって切り離され、細胞膜透過性ペプチドが露出することによってMCF-7細胞に効率良く取込まれることが確認された。

（4）癌細胞膜透過性SIFPを取込んだMCF-7細胞の細胞増殖
精製した癌細胞膜透過性SIFP（１μM）、または癌細胞膜透過性SIFP（１μM）とMMPをMCF-7細胞の培地に添加し、それぞれの細胞増殖をした。From this result, cancer cell membrane permeable SIFP is efficiently incorporated into MCF-7 cells by detaching its N-terminal polyglutamine sequence (cell membrane impermeable peptide) by MMP and exposing the cell membrane permeable peptide. Was confirmed.

(4) Cell growth of MCF-7 cells incorporating cancer cell membrane-permeable SIFP Purified cancer cell membrane-permeable SIFP (1 μM), or cancer cell membrane-permeable SIFP (1 μM) and MMP are added to the MCF-7 cell medium. And each cell was grown.

図13は、培養開始から4日目の細胞数を、培養開始時の細胞数で割った値をグラフ化したものである。この図11の結果から明らかなように、癌細胞膜透過性SIFP＋MMPの条件で培養したMCF-7細胞は、培養4日後でもほとんど増殖しなかった。   FIG. 13 is a graph showing the value obtained by dividing the number of cells on the fourth day from the start of culture by the number of cells at the start of culture. As is clear from the results of FIG. 11, MCF-7 cells cultured under conditions of cancer cell membrane-permeable SIFP + MMP hardly proliferated even after 4 days of culture.

以上の結果は、MMPによる切断によって細胞膜透過性となったSIFPがMCF-7細胞に取込まれ、細胞の脂質ラフトでSrc活性を阻害し、その結果、乳癌細胞MCF-7の増殖が抑制されることを示している。   The above results indicate that SIFP, which has become cell membrane permeabilized by cleavage by MMP, is taken up by MCF-7 cells, and Src activity is inhibited by the lipid rafts of the cells. As a result, proliferation of breast cancer cells MCF-7 is suppressed. Which indicates that.

Claims (12)

キナーゼの阻害ペプチドと細胞内オルガネラ局在化ペプチドとを有し、細胞内オルガネラ特異的にキナーゼ活性化を阻害することを特徴とするキナーゼ阻害性融合タンパク質。 A kinase-inhibiting fusion protein comprising a kinase inhibitory peptide and an intracellular organelle localization peptide, wherein the kinase activation is specifically inhibited by intracellular organelles. キナーゼの阻害ペプチドがチロシンキナーゼSrcの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドが脂質ラフト局在化ペプチドである請求項１のキナーゼ阻害性融合タンパク質。 The kinase-inhibiting fusion protein according to claim 1, wherein the kinase inhibiting peptide is a tyrosine kinase Src inhibiting peptide, and the intracellular organelle localization peptide is a lipid raft localization peptide. チロシンキナーゼSrcの阻害性ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなり、脂質ラフト局在化ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなる請求項２のキナーゼ阻害性融合タンパク質。 The kinase-inhibiting fusion protein according to claim 2, wherein the inhibitory peptide of tyrosine kinase Src consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the lipid raft localization peptide consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 脂質ラフト局在化ペプチドが、パルミトイル基によって修飾されている請求項２または３のキナーゼ阻害性融合タンパク質。 The kinase-inhibiting fusion protein according to claim 2 or 3, wherein the lipid raft-localizing peptide is modified with a palmitoyl group. キナーゼの阻害ペプチドがセリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドであり、細胞内オルガネラ局在化ペプチドがミトコンドリア局在化ペプチドである請求項１のキナーゼ阻害性融合タンパク質。 The kinase-inhibitory fusion protein according to claim 1, wherein the kinase inhibitor peptide is a serine / threonine kinase Akt inhibitor peptide, and the intracellular organelle localization peptide is a mitochondrial localization peptide. セリン／スレオニンキナーゼAktの阻害ペプチドの阻害性ペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなり、ミトコンドリア局在化ペプチドが配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項５のキナーゼ阻害性融合タンパク質。 6. The kinase-inhibiting fusion protein according to claim 5, wherein the inhibitory peptide of the serine / threonine kinase Akt inhibitory peptide consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and the mitochondrial localization peptide consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 請求項１から６のいずれかに記載のキナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に細胞膜透過性ペプチドを連結した、細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質。 A cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein, wherein a cell membrane-permeable peptide is linked to the N-terminal side of the kinase-inhibiting fusion protein according to any one of claims 1 to 6. 請求項７に記載の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質のN末側に、細胞膜非透過性ペプチドと、癌細胞特異的プロテアーゼ認識配列とを連結した、癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質。 A cancer cell membrane permeable kinase inhibitory fusion protein, wherein a cell membrane impermeable peptide and a cancer cell specific protease recognition sequence are linked to the N-terminal side of the cell membrane permeable kinase inhibitor fusion protein of claim 7. 請求項１から６のいずれかに記載のキナーゼ阻害性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクター。 An expression vector having a polynucleotide encoding the kinase-inhibiting fusion protein according to any one of claims 1 to 6. 請求項９に記載の発現ベクターを含有する医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the expression vector according to claim 9. 請求項７に記載の細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を含有する医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising the cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein according to claim 7. 請求項８に記載の癌細胞膜透過性キナーゼ阻害性融合タンパク質を含有する抗癌剤。 An anticancer agent comprising the cancer cell membrane permeable kinase-inhibiting fusion protein according to claim 8.
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