JPWO2007097273A1 - Resin cell culture container and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
培養する細胞の生存率を高めることができる樹脂製細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。本発明にかかる樹脂製細胞培養容器は、少なくとも細胞が培養される面に、厚さ0.002μm〜5μmの無機膜1を備え、乾燥状態20℃での酸素透過率が500fmol/m2・s・Pa以下のものである。これにより、樹脂製細胞培養容器から、培養液中への毒性物質の放出を抑止し、培養が難しいとされる細胞種においても、その生存率を飛躍的に高められる樹脂製細胞培養容器を提供できる。It is an object of the present invention to provide a resin-made cell culture container capable of increasing the survival rate of cells to be cultured and a method for producing the same. The resin-made cell culture container according to the present invention includes an inorganic membrane 1 having a thickness of 0.002 μm to 5 μm on at least a surface on which cells are cultured, and has an oxygen permeability of 500 fmol / m 2 · s · at 20 ° C. in a dry state. Pa or less. This provides a resinous cell culture container that can significantly increase the survival rate of cell types that are difficult to culture by inhibiting the release of toxic substances from the resinous cell culture container into the culture medium. it can.
Description
本発明は、樹脂製細胞培養容器およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a resin cell culture vessel and a method for producing the same.
細胞死は、アポトーシス(apoptosis)と、ネクローシス(necrosis)に大別される。アポトーシスとは、多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種で、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる、管理・調節された細胞の自殺のことをいう。他方、ネクローシスとは、血行不良、外傷などによる細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死、すなわち壊死(えし)をいう。 Cell death is roughly divided into apoptosis and necrosis. Apoptosis is a type of death of cells that make up the body of a multicellular organism, and refers to suicide of controlled and regulated cells that are actively triggered to keep an individual in a better state. On the other hand, necrosis refers to cell death caused by deterioration of the environment inside and outside the cell due to poor blood circulation, trauma, etc., that is, necrosis.
壊死は、生物の組織の一部分が死ぬことである。壊死は通常の死とは違い、体の一部分を構成する細胞だけが死滅する。感染、物理的破壊、化学的損傷、血流の減少などが原因となる。血流減少によるものを特に梗塞と呼ぶ。細胞の死ではあっても、血球、皮膚、消化管の粘膜上皮のように正常な細胞、組織が次々に補充され機能的な障害、組織学的な異常を残さないものは壊死と呼ばない。壊死した組織は、生体の免疫系によって最終的には取り除かれ、欠損部分は元の組織が再生したり線維化したりすることで補われる。 Necrosis is the death of a portion of a living tissue. Necrosis differs from normal death in that only the cells that make up part of the body die. Caused by infection, physical destruction, chemical damage, decreased blood flow, etc. Those caused by decreased blood flow are called infarctions. Even if the cells are dead, normal cells such as blood cells, skin, and mucosal epithelium of the digestive tract, and tissues that are replenished one after another and do not leave functional disorders or histological abnormalities are not called necrosis. The necrotic tissue is finally removed by the living body's immune system, and the defective part is compensated by the regeneration or fibrosis of the original tissue.
このような細胞についての試験・研究には、組織から単離した細胞を培養する必要がある。近年、この細胞培養は、創薬開発、薬剤の産生、再生医療での基礎試験、薬物の効果判定等、多様な目的で実施され、バイオテクノロジー関連分野において欠かせない方法となっている。細胞培養器で培養される細胞の接着能は、細胞の増殖能にとって極めて重要な因子であるため、研究開発のスピードを左右する。また、培養試験に用いられる細胞培養株は極めて高額であるため、試験コストにも直接影響する。 For testing and research on such cells, it is necessary to culture cells isolated from tissues. In recent years, this cell culture has been carried out for various purposes such as drug discovery development, drug production, basic tests in regenerative medicine, and drug effect determination, and has become an indispensable method in biotechnology-related fields. The adhesion ability of cells cultured in a cell incubator is an extremely important factor for the proliferation ability of cells, and thus affects the speed of research and development. Moreover, since the cell culture strain used for the culture test is very expensive, it directly affects the test cost.
プラスチック製シャーレ、ガラス製シャーレ、容器内に固定されたガラスプレート、ウェルプレート等の細胞培養容器で細胞を培養する場合、培養細胞から排出される炭酸ガスなどによるpH変化は、培養細胞の活性に大きく影響することが知られている。このため、従来の長期間培養においては、研究者が定期的に培養液を交換することで、培養細胞の活性を保っている。 When cells are cultured in cell culture containers such as plastic petri dishes, glass petri dishes, glass plates fixed in containers, well plates, etc., pH changes due to carbon dioxide discharged from the cultured cells may affect the activity of the cultured cells. It is known to have a significant effect. For this reason, in conventional long-term culture, researchers maintain the activity of cultured cells by periodically exchanging the culture solution.
また、特許文献1には、細胞培養容器の表面に、相当直径が10nm〜1mmである突起群が形成されていることを特徴とする細胞培養容器が提案されている。これは、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進するとともに、細胞と容器の接触を点接触にすることにより細胞の剥離時に生じる細胞の損傷を防ぐものである。
しかしながら、神経細胞や心筋、骨格筋のように再生しない組織の壊死や、神経細胞や心筋、肝臓細胞といった培養が難しいとされる組織の細胞死を抑制するためには、新鮮な培養液の交換だけでは、細胞死の抑制が実現できていないのが現状である。特に、培養が難しいとされる培養種では、新鮮な培養液の交換を行っても、最初に配置した細胞数に対する生存率は20〜40%程度である。 However, in order to suppress necrosis of tissues that do not regenerate, such as nerve cells, cardiac muscle, and skeletal muscle, and cell death of tissues that are difficult to culture, such as nerve cells, cardiac muscle, and liver cells, replacement of fresh culture fluid However, the present situation is that suppression of cell death cannot be realized by itself. In particular, in a culture species that is difficult to culture, the survival rate with respect to the number of initially placed cells is about 20 to 40% even if the fresh culture medium is replaced.
また、特許文献1に示す方法によれば、突起群の形成により、培養液を細胞の下部に行き渡らせ、細胞の必要とする栄養物の供給と細胞の放出する老廃物の排出を促進することはできる。しかしながら、プラスチック材料から、低分子量成分、可塑剤、重合触媒等の添加剤またはプラスチック材料の熱成形時に材料が分解したガスが培養液中に放出されるのを防止することはできない。これらの放出成分は、培養細胞に対して極めて毒性が高く、細胞死をもたらす直接の原因となる。そのため、新鮮な培養液の供給の前に、細胞培養容器の表面から、毒性物質が培養液中に放出されることを防止する必要がある。特に、神経細胞や心筋細胞等の培養が難しい細胞種では、プラスチック材料よりも、ガラス材料が使用されている。なぜなら、プラスチック製の細胞培養容器を使用した場合、最初に配置した細胞の80%近くが死滅してしまうからである。同様に、市販されているプラスチック製シャーレ、容器内に固定されたプラスチック製プレート、ウェルプレート等の細胞培養容器においても、毒性物質の培養液中への放出が防止できていない問題点を有している。
In addition, according to the method shown in
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであり、培養する細胞の生存率を高めることができる樹脂製細胞培養容器およびその製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a resin-made cell culture container and a method for producing the same, which can increase the survival rate of cells to be cultured.
本発明にかかる樹脂製細胞培養容器は、少なくとも細胞が培養される面に、厚さ0.002μm〜5μmの無機膜を備え、乾燥状態20℃での酸素透過率が500fmol/m2・s・Pa以下のものである。The resin-made cell culture container according to the present invention includes an inorganic film having a thickness of 0.002 μm to 5 μm on at least a surface on which cells are cultured, and has an oxygen permeability of 500 fmol / m 2 · s · at 20 ° C. in a dry state. Pa or less.
本発明にかかる樹脂製細胞培養容器の製造方法は、基板上にパターンを形成するステップと、前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、前記細胞容器の少なくとも細胞が培養される面に無機膜を形成するステップとを備えたものである。 The method for producing a resin-made cell culture container according to the present invention includes a step of forming a pattern on a substrate, and a step of forming a metal structure by attaching a metal according to the pattern formed on the substrate or a transfer pattern thereof. And a step of transferring a pattern of the metal structure to form a cell culture container, and a step of forming an inorganic film on at least a surface of the cell container on which cells are cultured.
本発明によれば、培養する細胞の生存率を高めることができる樹脂製細胞培養容器およびその製造方法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the resin-made cell culture containers which can improve the survival rate of the cell to culture | cultivate, and its manufacturing method can be provided.
1 無機膜
2 凹部
3 第1の凸部
4 第2の凸部
5 2段の凸部
6 第1の凸部の側壁
7 第2の凸部の側壁
11 基板
12 第1レジスト層
13 マスクA
14 第2レジスト層
15 マスクB
16 レジストパターン
17 導電性膜
18 金属構造体
19 樹脂製成型品DESCRIPTION OF
11
14
16
本発明者らは、鋭意研究した結果、樹脂製細胞培養器の表面に対し、規定値内のガス透過率を有する無機材料を形成することで、プラスチック材料から、培養液中への毒性物質の放出を抑止し、培養が難しいとされる細胞種においても、その生存率を飛躍的に高められる細胞培養容器を提供できることを見出した。以下に、本発明の実施の形態について図を用いて説明する。 As a result of intensive research, the present inventors have formed an inorganic material having a gas permeability within a specified value on the surface of a resin cell culture vessel, so that a toxic substance from a plastic material into a culture solution can be obtained. It has been found that a cell culture vessel can be provided that can significantly increase the survival rate even in cell types that are inhibited from being released and difficult to culture. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
発明の実施の形態1
図1は、実施の形態1にかかる細胞培養容器の構成を示した断面図である。実施の形態1にかかる細胞培養容器は、細胞を培養する面に無機膜1を備えている。
FIG. 1 is a cross-sectional view showing the configuration of the cell culture container according to the first embodiment. The cell culture container according to
樹脂製細胞培養容器の少なくとも細胞を培養する面に被覆する無機膜1の厚みは、毒性物質の培養液中への放出を防止するため、0.002μm〜5μmが好ましく、0.005μm〜1μmがより好ましい。0.002μm以下では毒性物質の培養液中への放出防止が困難となり、5μm以上では成膜時間が長くなり、高コストとなるため実用に適さない。乾燥状態20℃での酸素透過率は、毒性物質の培養液中への放出を防止するため、500fmol/m2・s・Pa以下が好ましく、250fmol/m2・s・Pa以下がより好ましい。酸素透過率が低ければ、細胞培養容器から培養液中への毒性物質の放出をより抑制できる。一方、膜厚を厚くする必要があるため、成膜時間が長くなり、高コストとなる。そのため、用途に応じ適宜選択することが好ましい。The thickness of the
無機膜1の形成法について述べる。以下にあげる方法は一例であり、これに限定されるものではない。無機膜1の形成法には、真空装置を用いたスパッタリング法、真空蒸着法、電子線蒸着法、電気メッキ、無電解メッキ、カニゼンメッキ等による無機材料形成法があげられる。形成した無機膜1の均一性、緻密性が要求される場合は、スパッタリング法が好ましいが、設備費が高額であることおよび0.1μm以上の膜厚になると膜応力により、剥離しやすい傾向がある。真空蒸着法は、設備費も比較的安価であり、膜応力も低くなるため厚膜化が可能であるが、膜厚の均一性、緻密性は、スパッタリング法に劣る。スパッタリング法または真空蒸着法で形成可能な無機膜1は、一例として、Cu、Al、Au、Ag、SiO2、Ni、Mg、Fe、Cr等があげられる。これらの無機膜1は、分子構造でガス透過率が大きく異なるプラスチック材料と異なり、一定の膜厚とすることで、所望のガス透過率を達成することができる。A method for forming the
培養細胞の観察では、倒立顕微鏡を用いた透過光観察が主流である。このため、細胞培養容器に被覆する無機膜には、波長450nm〜600nmの可視光を散乱させないこと、すなわち透明性が要求される。毒性物質の培養液中への放出の防止と透明性を両立する範囲として、膜厚を400nm以下とするか、SiO2等の透明無機材料を用いることが好ましい。In observing cultured cells, transmitted light observation using an inverted microscope is the mainstream. For this reason, the inorganic film coated on the cell culture container is required not to scatter visible light having a wavelength of 450 nm to 600 nm, that is, to have transparency. As a range that satisfies both prevention of release of toxic substances into the culture solution and transparency, it is preferable to set the film thickness to 400 nm or less or to use a transparent inorganic material such as SiO 2 .
透過光観察を可能にするため、樹脂プレートをガラスプレートと同等の光透過率とするには、紫外線領域を含む波長300nm〜800nmの光透過率を80%以上、ヘイズ値を10%以内とすることが好ましい。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、紫外線吸収剤が含まれないアクリル樹脂を用いるか、PC(ポリカーボネイト)、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有さない材料を選択する必要がある。また、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物には、紫外線吸収剤が含まれていない必要がある。 To make the resin plate have the same light transmittance as that of the glass plate in order to enable the transmitted light observation, the light transmittance at a wavelength of 300 nm to 800 nm including the ultraviolet region is set to 80% or more and the haze value is set to 10% or less. It is preferable. In order to satisfy the above requirements, it is necessary to use an acrylic resin that does not contain an ultraviolet absorber for the cell culture container, or select a material that does not have a ring structure in its chemical structure, such as PC (polycarbonate), polystyrene, or the like. In addition, additives such as an antioxidant, a viscosity improver, a heat stabilizer, and an anti-sticking agent need not contain an ultraviolet absorber.
蛍光観察法では、蛍光色素を光らせるための光(励起光)は、細胞培養容器を透過しなければ、それにより発生した蛍光(蛍光放射光)を識別できない。したがって、細胞培養容器には高い光透過性が要求される。蛍光(蛍光放射光)を識別するために必要な透明性は、可視光の全光線透過率80%以上、ヘイズ値10%以内とする必要がある。上記要求を満たすため、細胞培養容器には、例えば、ポリメチルメタクリレート等の光学特性に優れる材料を用いることが好ましく、結晶性樹脂であるポリオレフィン系樹脂を用いる場合は、非結晶状態で用いることが好ましい。 In the fluorescence observation method, the light (excitation light) for causing the fluorescent dye to shine cannot be discriminated from the fluorescence (fluorescence radiation light) generated unless it passes through the cell culture vessel. Therefore, the cell culture container is required to have high light transmittance. The transparency necessary for identifying the fluorescence (fluorescence emission light) needs to be 80% or more of the total light transmittance of visible light and within 10% of the haze value. In order to satisfy the above requirements, it is preferable to use a material having excellent optical properties such as polymethylmethacrylate for the cell culture container, and when using a polyolefin-based resin which is a crystalline resin, it should be used in an amorphous state. preferable.
自家蛍光とは、ポリマー分子が紫外・可視光を吸収した後、光を放出して自ら蛍光を発することをいう。ガラスプレートは自家蛍光を発しないのに対し、樹脂プレートの多くは自家蛍光するため、サンプルから発生した蛍光(蛍光放射光)を識別できなくなり、蛍光分析の特徴である微量分析が困難となる。 Autofluorescence means that after a polymer molecule absorbs ultraviolet / visible light, it emits light and emits fluorescence. While glass plates do not emit autofluorescence, many resin plates do autofluorescence, making it impossible to identify fluorescence (fluorescent radiation) generated from the sample, making it difficult to perform microanalysis, which is a feature of fluorescence analysis.
自家蛍光の影響を受けないためには、波長230nm〜800nmの光を照射することで自家蛍光しないことが要求される。そのため、細胞培養容器には、PC(ポリカーボネイト)、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。また、自家蛍光の可能性を極力排除するため、酸化防止剤、粘度向上剤、耐熱安定剤、膠着防止剤等の添加物は、できる限り少量とするか、添加しないことが好ましい。 In order not to be affected by the autofluorescence, it is required that the autofluorescence does not occur by irradiating light with a wavelength of 230 nm to 800 nm. Therefore, it is necessary to select a resin material that does not have a ring structure in the chemical structure such as PC (polycarbonate) or polystyrene for the cell culture container. Further, in order to eliminate the possibility of autofluorescence as much as possible, it is preferable that the additives such as antioxidants, viscosity improvers, heat stabilizers, and anti-sticking agents be as small as possible or not added.
微分干渉観察法のコントラストを低下させずに、偏光顕微鏡や微分干渉顕微鏡により観察するために、光学ひずみの小さい材料が要求される。そのため、細胞培養容器には、PC(ポリカーボネイト)、ポリスチレン等の化学構造に環構造を有しない樹脂材料を選択する必要がある。 In order to observe with a polarizing microscope or a differential interference microscope without reducing the contrast of the differential interference observation method, a material having a small optical distortion is required. Therefore, it is necessary to select a resin material that does not have a ring structure in the chemical structure such as PC (polycarbonate) or polystyrene for the cell culture container.
細胞培養容器に有機膜または無機膜を被覆することで、親水化または疎水化することができる。これにより、細胞培養面への気泡の付着防止や細胞の接着度合いを制御することができる。有機膜を被覆する方法として、例えば、スピンコート法、ディッピング法により、細胞の付着を促すタンパク質であるコラーゲン、ポリリジン等を塗布する方法、蒸着重合、プラズマ重合等が挙げられる。無機膜を被覆する方法として、例えば、スパッタリング法、蒸着法等が挙げられる。また、細胞培養容器の一部分をマスクすることにより、他の部分のみを有機膜または無機膜により被覆することもできる。これにより、培養試験条件の幅をさらに広くすることができる。 By coating the cell culture vessel with an organic film or an inorganic film, it can be made hydrophilic or hydrophobic. Thereby, the adhesion prevention of the bubble to a cell culture surface and the adhesion degree of a cell are controllable. Examples of the method for coating the organic film include a method of applying collagen, polylysine or the like, which is a protein that promotes cell adhesion, by spin coating or dipping, vapor deposition polymerization, plasma polymerization, and the like. Examples of the method for coating the inorganic film include a sputtering method and a vapor deposition method. In addition, by masking a part of the cell culture container, only the other part can be covered with an organic film or an inorganic film. Thereby, the range of culture test conditions can be further widened.
スパッタリング法、蒸着法等の無機膜形成法は、油浸レンズ観察法への適用もできる。通常、油浸レンズに使用するオイルには、細胞を培養するガラスプレートおよび光学レンズと光学物性を適合させるため、有機溶剤が配合されている。有機溶剤は、樹脂製細胞培養容器に浸透し、白化や溶解の問題を発生させるため、適用できない可能性がある。無機材料は、ガスバリヤー効果と同時に、耐有機溶剤性を有するため、油浸レンズのオイルが接触する細胞培養容器の底面に、無機膜を形成することで、油浸レンズ観察法への適用も可能となり、樹脂製細胞培養容器の適用範囲を広げることができる。透過光観察を行う場合、膜厚を400nm以下とするか、SiO2等の透明無機材料を用いることが好ましい。Inorganic film formation methods such as sputtering and vapor deposition can also be applied to oil immersion lens observation methods. Usually, an oil used for an oil immersion lens is mixed with an organic solvent in order to make optical properties compatible with a glass plate for culturing cells and an optical lens. Organic solvents may not be applicable because they penetrate into resinous cell culture vessels and cause whitening and dissolution problems. Inorganic materials are resistant to organic solvents at the same time as the gas barrier effect, so by forming an inorganic film on the bottom of the cell culture vessel that comes in contact with the oil in the oil immersion lens, it can also be applied to oil immersion lens observation methods. It becomes possible, and the application range of the resin-made cell culture container can be expanded. When performing transmitted light observation, it is preferable that the film thickness is 400 nm or less, or a transparent inorganic material such as SiO 2 is used.
発明の実施の形態2
上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器を用いることもできる。実施の形態2にかかる細胞培養容器の構成について図2Aおよび図2Bを用いて説明する。図2Aは、実施の形態2にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。図2Bは、図2AのIIB−IIB'断面図である。
A resin-made cell culture vessel having a plurality of micro-space structures can also be used on the surface on which the cells are cultured. The configuration of the cell culture container according to
細胞培養容器には、図2Aに示すように、複数のマイクロ空間構造を構成する凹凸パターンが形成されている。凹凸パターンは、図2Bに示すように、2段の階段状に形成されている。すなわち、細胞培養容器の細胞を培養する面に、格子状に形成された第1の凸部3と、その上に形成された直方体状の第2の凸部4からなる2段の凸部5が形成されている。この2段の凸部5により形成される空間が凹部2となる。すなわち、凹部2は、第1の凸部3により完全に囲まれた凹部と第2の凸部4により形成される凹部とからなる。第1の凸部3の側壁6および第2の凸部4の側壁7は底面に対して略垂直に形成されている。さらに、細胞培養容器の表面全体に無機膜1が形成されている。
In the cell culture container, as shown in FIG. 2A, an uneven pattern constituting a plurality of micro space structures is formed. The concavo-convex pattern is formed in a two-step shape as shown in FIG. 2B. That is, a two-step
第1の凸部3は、図2Aに示すように矩形状の凹部2の四辺を囲むよう格子状に配置されている。第2の凸部4は、隣接する凹部2の間の第1の凸部3の上に島状に配置されている。第2の凸部4は、矩形状の凹部2の四辺のそれぞれに設けられている。そのため、凹部2は完全には仕切られておらず、矩形状の凹部2の4つの頂点部分において、隣接する凹部2と連通している。なお、凹凸パターンを2段以上の階段状に形成することが好ましいが、1段でもよい。
The 1st convex part 3 is arrange | positioned at the grid | lattice form so that the four sides of the rectangular recessed
上記の複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製細胞培養容器の少なくとも細胞を培養する面に、所望の厚さおよび酸素透過率を有する無機膜1を形成することで、細胞の接着能、増殖機能に加え、細胞の伸展方向や形態の制御試験等、幅広い用途に提供することができる。また、この細胞培養容器は、従来のパターン付きガラス製プレートと対比しても充分に高い精度を発揮することができる。さらに、安価に形成することができるため、その利点を発揮できるような産業上大量に使用される用途に、特に適している。
By forming the
上記の細胞が培養される面に、複数のマイクロ空間構造を有する樹脂製の細胞培養容器の製造方法について説明する。この製造方法は、基板上にマイクロ空間構造を形成するステップと、基板上に形成されたマイクロ空間構造パターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、前記樹脂製プレートの構造パターンの反対パターンを有する金属構造体を形成するステップと、前記金属構造体のパターンを転写して樹脂製プレートを形成するステップとを備える。 A method for producing a resin-made cell culture vessel having a plurality of micro-space structures on the surface on which the cells are cultured will be described. The manufacturing method includes a step of forming a micro space structure on a substrate, a metal is attached according to the micro space structure pattern formed on the substrate or a transfer pattern thereof, and has a pattern opposite to the structure pattern of the resin plate. Forming a metal structure; and transferring a pattern of the metal structure to form a resin plate.
詳細には以下の通りである。
(i)基板上への第1レジスト層の形成
(ii)基板とマスクAとの位置合わせ
(iii)マスクAを用いた第1レジスト層の露光
(iv)第1レジスト層の熱処理
(v)第1レジスト層上への第2レジスト層の形成
(vi)基板とマスクBとの位置合わせ
(vii)マスクBを用いた第2レジスト層の露光
(viii)第2レジスト層の熱処理
(ix)レジスト層の現像
を行い、所望のレジストパターンを形成する。
(x)さらに、形成されたレジストパターンを導電化処理した後、形成されたレジストパターンにしたがって、基板上に金属構造体をメッキにより形成する。
(xi)この金属構造体を型として、樹脂成形品を形成する
ことによって、細胞培養容器が製造される。
(v)〜(viii)の工程は任意であり、省略できる。一方、(v)〜(viii)の工程を複数回繰り返すこともできる。Details are as follows.
(I) Formation of first resist layer on substrate (ii) Position alignment between substrate and mask A (iii) Exposure of first resist layer using mask A (iv) Heat treatment of first resist layer (v) Formation of second resist layer on first resist layer (vi) Alignment of substrate and mask B (vii) Exposure of second resist layer using mask B (viii) Heat treatment of second resist layer (ix) The resist layer is developed to form a desired resist pattern.
(X) Further, after conducting the conductive treatment on the formed resist pattern, a metal structure is formed on the substrate by plating according to the formed resist pattern.
(Xi) A cell culture container is manufactured by forming a resin molded product using this metal structure as a mold.
The steps (v) to (viii) are optional and can be omitted. On the other hand, the steps (v) to (viii) can be repeated a plurality of times.
レジストパターン形成処理についてさらに詳細に説明する。
基板上に、例えば、深さ30μmと深さ100μmの構造体を得ようとした場合、第1レジスト層(厚さ70μm)、第2レジスト層(厚さ30μm)順に形成し、各層に露光、または露光、熱処理を行う。現像工程では、最初に第2レジスト層である深さ30μmのパターンが得られ、次に第1レジスト層と第2レジスト層を合わせた深さ100μmのパターンが得られる。深さ100μmのパターンが得られた時点で、第2レジスト層である深さ30μmのパターンを現像液に溶解、または変形させないためには、各層の現像液への溶解性を制御させることが要求される。The resist pattern forming process will be described in more detail.
For example, when a structure having a depth of 30 μm and a depth of 100 μm is to be obtained on the substrate, a first resist layer (thickness 70 μm) and a second resist layer (thickness 30 μm) are formed in this order, and each layer is exposed. Alternatively, exposure and heat treatment are performed. In the development step, a pattern having a depth of 30 μm, which is the second resist layer, is first obtained, and then a pattern having a depth of 100 μm is obtained by combining the first resist layer and the second resist layer. When a pattern having a depth of 100 μm is obtained, it is necessary to control the solubility of each layer in the developer so as not to dissolve or deform the pattern of the second resist layer having a depth of 30 μm in the developer. Is done.
光分解型のポジ型レジストを用いて、耐アルカリ性を発現させる方法の一つとして、ベーク時間(溶剤の乾燥時間)を長くし、レジストを硬化させることがあげられる。通常、レジストは膜厚、シンナー等の溶剤濃度および感度に応じてベーク時間を設定している。この時間を長くすることによって耐アルカリ性を持たせることができる。また、第1レジスト層のベークが進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像において光が照射された部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。ベークに用いる装置は、溶剤を乾燥できれば特に限定されるものではなく、オーブン、ホットプレート、熱風乾燥機等があげられる。光分解型のポジ型レジストは光架橋型のネガ型レジストと比較して、耐アルカリ性の発現幅は制限されるため、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて5〜200μmの範囲内が好ましく、10〜100μmの範囲内であることがより好ましい。 One method of developing alkali resistance using a photolytic positive resist is to increase the baking time (solvent drying time) and cure the resist. Usually, the baking time is set according to the film thickness, solvent concentration such as thinner, and sensitivity. By increasing this time, alkali resistance can be provided. In addition, if the baking of the first resist layer proceeds too much, the resist is extremely hardened, and it becomes difficult to form a pattern by dissolving the portion irradiated with light in the subsequent development. It is preferable to select as appropriate. The apparatus used for baking is not particularly limited as long as the solvent can be dried, and examples thereof include an oven, a hot plate, and a hot air dryer. The photodegradable positive resist has a limited range of alkali resistance as compared with the photocrosslinking negative resist, so the resist thickness to be set is preferably within the range of 5 to 200 μm in total for each layer. More preferably, it is in the range of 10 to 100 μm.
光架橋型のネガ型レジストを用いて耐アルカリ性を発現させる方法として、ベーク時間の最適化の他に、架橋密度の最適化があげられる。通常、ネガ型レジストの架橋密度は、露光量によって設定することができる。化学増幅系ネガ型レジストの場合、露光量および熱処理時間によって架橋密度を設定することができる。この露光量、または熱処理時間を長くすることによって、耐アルカリ性を発現させることができる。光架橋型のネガ型レジストの場合、設定するレジスト厚さは、各層を合わせて5〜500μmの範囲内が好ましく、10〜300μmの範囲内であることがより好ましい。 As a method of developing alkali resistance using a photo-crosslinking negative resist, optimization of the crosslinking density can be mentioned in addition to optimization of the baking time. Usually, the crosslinking density of the negative resist can be set by the exposure amount. In the case of a chemically amplified negative resist, the crosslinking density can be set by the exposure amount and the heat treatment time. By increasing the exposure amount or the heat treatment time, alkali resistance can be exhibited. In the case of a photo-crosslinking negative resist, the resist thickness to be set is preferably in the range of 5 to 500 μm, more preferably in the range of 10 to 300 μm, for each layer.
(i)基板11上への第1レジスト層12の形成について説明する。
図3Aに基板11上に第1レジスト層12が形成された状態を示す。成形品形成ステップで得られる樹脂製細胞容器の平面度は、基板11上へ第1レジスト層12を形成する工程で決定づけられる。すなわち、基板11上に第1レジスト層12を形成した時点の平面度が金属構造体、ひいては細胞培養容器の平面度に反映される。(I) The formation of the first resist
FIG. 3A shows a state where the first resist
基板11上に第1レジスト層12を形成する方法は何ら限定されないが、一般的にスピンコート方式、ディッピング方式、ロール方式、ドライフィルムレジストの貼り合わせ等を挙げることができる。なかでも、スピンコート方式は、回転しているガラス基板上にレジストを塗布する方法で、直径300mmを超えるガラス基板にレジストを高い平面度で塗布する利点がある。従って、高い平面度を実現できる観点から、スピンコート方式が好ましい。
The method for forming the first resist
第1レジスト層12として用いられるレジストは、ポジ型レジスト、ネガ型レジストのいずれもでもよい。いずれの場合も、レジストの感度、露光条件により、レジストの焦点深度が変わる。そのため、例えば、UV露光装置を使用した場合、露光時間、UV出力値をレジスト厚さ、感度に応じて種類を選択するのが好ましい。
The resist used as the first resist
第1レジスト層12として用いるレジストがウェットレジストの場合、例えば、スピンコート方式で所定のレジスト厚さを得る方法としては、スピンコート回転数の変更や粘度調整による方法がある。スピンコート回転数の変更による方法は、スピンコーターの回転数を適宜設定することによって所望のレジスト厚さを得るものである。粘度調整による方法は、レジスト厚さが厚い場合や塗布面積が大きい場合に、平面度が低下することが懸念されるため、実際使用上で要求される平面度に応じて粘度を調整するものである。
When the resist used as the first resist
例えばスピンコート方式の場合、1回で塗布するレジスト層の厚さは、高い平面度を保持することを考慮し、好ましくは10〜50μm、さらに好ましくは、20〜50μmの範囲内であることが好ましい。高い平面度を保持したうえで、所望のレジスト層の厚さを得るためには、レジスト層を複数回に分けて形成することができる。 For example, in the case of the spin coat method, the thickness of the resist layer applied at one time is preferably in the range of 10 to 50 μm, more preferably in the range of 20 to 50 μm in consideration of maintaining high flatness. preferable. In order to obtain a desired resist layer thickness while maintaining high flatness, the resist layer can be formed in a plurality of times.
第1レジスト層12にポジ型レジストを使用した場合、ベーク時間(溶剤の乾燥)が過度に進行しすぎると、レジストが極度に硬化し、後の現像においてパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが100μm以上でない場合、ベーク時間を短くする等、適宜選択することが好ましい。
When a positive resist is used for the first resist
(ii)基板11とマスクA13との位置合わせについて説明する。
第1レジスト層12のパターンと、第2レジスト層14のパターンにおける位置関係を所望の設計通りにするためには、マスクA13を用いた露光時に、正確な位置合わせを行うことが必要となる。位置合わせには、基板11とマスクA13の同位置に切削加工を施しピン固定する方法、レーザー干渉計を用い位置だしする方法、基板11とマスクA13の同位置に位置マークを作製、光学顕微鏡で位置合わせをする方法等があげられる。光学顕微鏡で位置合わせをする方法は、例えば、フォトリソグラフ法にて基板11に位置マークを作製し、マスクA13にはレーザー描画装置で位置マークを描画する。光学顕微鏡を用いた手動操作においても、5μm以内の精度が簡単に得られる点で有効である。(Ii) The alignment between the
In order to make the positional relationship between the pattern of the first resist
(iii)マスクA13を用いた第1レジスト層12の露光について説明する。
図3Bに示される工程で使用するマスクA13は何ら限定されないが、エマルジョンマスク、クロムマスク等を挙げることが出来る。レジストパターン形成ステップでは、使用するマスクA13によって寸法、および精度が左右される。そして、その寸法、および精度は、樹脂製細胞培養容器にも反映される。したがって、樹脂製細胞培養容器の各寸法、および精度を所定のものとするためには、マスクA13の寸法、および精度を規定する必要がある。マスクA13の精度を高める方法は何ら限定されないが、例えば、マスクA13のパターン形成に使用するレーザー光源をより波長の短いものに変えることを挙げることができるが、設備費用が高額であり、マスクA13製作費が高額となるため、樹脂製細胞培養容器が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。(Iii) The exposure of the first resist
The mask A13 used in the step shown in FIG. 3B is not limited in any way, and examples thereof include an emulsion mask and a chrome mask. In the resist pattern forming step, the size and accuracy depend on the mask A13 used. And the dimension and precision are reflected also in a resin-made cell culture container. Therefore, in order to make each dimension and accuracy of the resin-made cell culture container predetermined, it is necessary to define the size and accuracy of the mask A13. The method for increasing the accuracy of the mask A13 is not limited at all. For example, the laser light source used for pattern formation of the mask A13 can be changed to one having a shorter wavelength, but the equipment cost is high, and the mask A13 is expensive. Since the production cost is high, it is preferable to appropriately define the resin-made cell culture container according to the accuracy required for practical use.
マスクA13の材質は温度膨張係数、UV透過吸収性能の面から石英ガラスが好ましいが比較的高価であるため、樹脂成形品が実用的に要求される精度に応じて適宜規定するのが好ましい。設計通りの所望の深さまたは高さが異なる構造体、あるいは、第1レジストパターンと第2レジストパターンが異なる構造体を得るには、第1レジスト層12および第2レジスト層14の露光に用いるマスクのパターン設計(透過/遮光部)が確実であることが必要であり、CAE解析ソフトを使用したシミュレーションもその解決策の一つである。
The material of the mask A13 is preferably quartz glass from the viewpoint of temperature expansion coefficient and UV transmission absorption performance, but is relatively expensive. Therefore, it is preferable to appropriately define the resin molded product according to the accuracy required for practical use. In order to obtain structures having different desired depths or heights as designed, or structures having different first and second resist patterns, they are used for exposure of the first resist
露光に用いられる光源は設備費用が安価である紫外線またはレーザー光であることが好ましい。シンクロトロン放射光は、設備費用が高額であり、実質的に樹脂製プレートの価格が高額となるものの、露光深度が深いものを得たい場合などに用いることができる。 The light source used for the exposure is preferably ultraviolet light or laser light, which has a low equipment cost. Synchrotron radiation can be used when the equipment cost is high and the price of the resin plate is substantially high, but it is desired to obtain a deep exposure depth.
露光時間や露光強度等の露光条件は第1レジスト層12の材質、厚み等により変化するため、得られるパターンに応じて適宜調節することが好ましい。特に空間構造パターンの寸法、および精度に影響を与えるため、露光条件の調節は重要である。また、レジストの種類により焦点深度が変わるため、例えばUV露光装置を使用した場合、露光時間、UV出力値をレジストの厚さ、感度に応じて選択するのが好ましい。
Since exposure conditions such as exposure time and exposure intensity vary depending on the material, thickness, and the like of the first resist
(iv)第1レジスト層12の熱処理について説明する。
露光後の熱処理は、レジストパターンの形状を補正するためにアニールといわれる熱処理が知られている。ここでは、化学架橋を目的とし、化学増幅系ネガ型レジストを使用した場合のみに熱処理を行う。化学増幅系ネガ型レジストとは、主に、2成分系または3成分系からなり、露光時の光によって、例えば、化学構造の末端のエポキシ基が開環し、熱処理によって架橋反応させるものである。熱処理時間は、例えば膜厚100μmの場合、設定温度100℃の条件下においては数分で架橋反応は進行する。(Iv) The heat treatment of the first resist
As heat treatment after exposure, heat treatment called annealing is known in order to correct the shape of the resist pattern. Here, heat treatment is performed only when a chemically amplified negative resist is used for the purpose of chemical crosslinking. The chemically amplified negative resist is mainly composed of a two-component system or a three-component system. For example, an epoxy group at the end of a chemical structure is opened by light at the time of exposure, and a crosslinking reaction is caused by heat treatment. . For example, when the heat treatment time is 100 μm, the crosslinking reaction proceeds in several minutes under the condition of a set temperature of 100 ° C.
第1レジスト層12の熱処理が進行しすぎると、後の現像において未架橋部分を溶解させパターンを形成することが困難になることから、設定するレジスト厚さが100μm以上でない場合、熱処理時間を短くする、または後の第2レジスト層14の熱処理のみとする等、適宜選択することが好ましい。
If the heat treatment of the first resist
(v)第1レジスト層12上への第2レジスト層14の形成について説明する。
図3Cに第2レジスト層14が形成された状態を示す。この第2レジスト層14の形成は、上記(i)において説明した第1レジスト層12の形成と同様の方法による。また、スピンコート方式にて、ポジ型レジストを使用してレジスト層を形成する場合、ベーク時間を通常の1.5〜2.0倍程度とすることで、耐アルカリ性を発現させることができる。これにより、第1レジスト層12と第2レジスト層14の現像終了時、第2レジスト層14のレジストパターンの溶解、または変形を防止することができる。(V) The formation of the second resist
FIG. 3C shows a state where the second resist
(vi)基板11とマスクB15との位置合わせについて説明する。
基板11とマスクB15との位置合わせは、上記(ii)について説明した、基板11とマスクA13との位置合わせと同様の方法による。(Vi) The alignment between the
The alignment between the
(vii)マスクB15を用いた第2レジスト層14の露光について説明する。
マスクB15を用いた第2レジスト層14の露光は、上記(iii)において説明したマスクA13を用いた第1レジスト層12の露光と同様の方法による。図3Dに第2レジスト層14の露光の様子を示す。(Vii) Exposure of the second resist
The exposure of the second resist
(viii)第2レジスト層14の熱処理について説明する。
第2レジスト層14の熱処理は、上記(iv)において説明した第1レジスト層12の熱処理と同様の方法による。また、第2レジスト層14の熱処理は、後の現像において第1レジスト層12のパターンが得られた時点で、第2レジスト層14のパターンが溶解、または変形させないために行う。熱処理によって化学架橋が進行し、架橋密度を高めることで耐アルカリ性が発現する。耐アルカリ性を発現させるための熱処理時間は、通常の1.1〜2.0倍の範囲からレジストの厚さに応じて適宜選択することが好ましい。(Viii) The heat treatment of the second resist
The heat treatment of the second resist
(ix)レジスト層12および14の現像について説明する。
図3Eに示す現像工程では、用いたレジストに対応する所定の現像液を用いることが好ましい。現像時間、現像温度、現像液濃度等の現像条件はレジスト厚みやパターン形状に応じて適宜調節することが好ましい。例えば、必要な深さを得るために現像時間を長くしすぎると、所定の寸法よりも大きくなってしまうため、適宜条件を設定することが好ましい。この現像工程により、レジストパターン16が形成される。(Ix) The development of the resist
In the developing step shown in FIG. 3E, it is preferable to use a predetermined developer corresponding to the resist used. Development conditions such as development time, development temperature, and developer concentration are preferably adjusted as appropriate according to the resist thickness and pattern shape. For example, if the development time is too long in order to obtain the required depth, it becomes larger than a predetermined dimension, so it is preferable to set conditions appropriately. By this development process, a resist
細胞培養容器の上面、または微細パターン底部の平面精度を高める方法としては、例えば、レジスト塗布で使用するレジスト種類(ネガ型、ポジ型)を変更する方法、金属構造体の表面を研磨する方法などがあげられる。 Examples of methods for improving the planar accuracy of the upper surface of the cell culture container or the bottom of the fine pattern include a method of changing the resist type (negative type or positive type) used in resist coating, a method of polishing the surface of the metal structure, etc. Can be given.
なお、所望の造型深さを得るために複数のレジスト層を形成する場合、それら複数のレジスト層を同時に露光・現像処理する、あるいは、一つのレジスト層を形成および露光処理した後、さらにレジスト層の形成および露光処理を行い、2つのレジスト層を同時に現像処理することができる。 When forming a plurality of resist layers in order to obtain a desired molding depth, the resist layers are exposed and developed at the same time, or after forming and exposing one resist layer, a resist layer is further formed. The two resist layers can be developed at the same time.
(x)金属構造体形成ステップについてさらに詳細に説明する。
金属構造体形成ステップとはレジストパターン形成ステップで得られたレジストパターン16に沿って金属を形成し、金属構造体18のマイクロ空間構造面をレジストパターン16に沿って形成することにより、金属構造体18を得る工程である。(X) The metal structure forming step will be described in more detail.
The metal structure forming step is to form a metal along the resist
図3Fに示すように、この工程では予めレジストパターン16に沿って導電性膜17を形成する。導電性膜17の形成方法は、特には限定されないが、好ましくは、真空蒸着法、スパッタリング法等による。導電性膜17に用いられる導電性材料としては金、銀、白金、銅、アルミニウムなどを挙げることができる。
As shown in FIG. 3F, in this step, a
図3Gに示すように、導電性膜17を形成した後、レジストパターン16に沿って金属をメッキにより形成し、金属構造体18を形成する。メッキ方法は特に限定されないが、例えば電解メッキ、無電解メッキ等を挙げることができる。用いられる金属は特に限定されないが、ニッケル、ニッケル−コバルト合金、銅、金を挙げることができ、経済性・耐久性の観点からニッケルが好ましく用いられる。
As shown in FIG. 3G, after the
金属構造体18はその表面状態に応じて研磨しても構わない。ただし、汚れが造形物に付着することが懸念されるため、研磨後、超音波洗浄を実施することが好ましい。また、金属構造体18はその表面状態を改善するために、離型剤等で表面処理しても構わない。なお、金属構造体18の深さ方向の傾斜角度は、樹脂成形品の形状から50°〜90°であることが望ましく、より望ましくは60°〜87°である。メッキにより形成した金属構造体18はレジストパターン16から分離される。
The
(xi)成形品形成ステップについて詳細に説明する。
成形品形成ステップは、図3Hに示すように、前記金属構造体18を型として、樹脂成形品19を形成する工程である。樹脂成形品19の形成方法は特に限定されないが、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。所定の寸法を選択した金属構造体18を型として射出成形で樹脂成形品19を形成する場合、金属構造体18の形状を高い転写率で樹脂成形品19に再現することができる。転写率を確認する方法としては、光学顕微鏡、走査電子顕微鏡(SEM)、透過電子顕微鏡(TEM)等を用いる方法がある。(Xi) The molded product forming step will be described in detail.
As shown in FIG. 3H, the molded product forming step is a process of forming a resin molded
樹脂成形品19の平面度の最小値は、工業的に再現し易い観点から1μm以上であることが好ましい。樹脂成形品19の平面度の最大値は、例えば、該成形品に反り等が発生して光学系ユニットと接触しない等、支障とならない観点から200μm以下であることが好ましい。樹脂成形品の造形部に対する寸法精度は、工業的に再現し易い観点から±0.5〜10%の範囲内であることが好ましい。
The minimum value of the flatness of the resin molded
以下に、本発明にかかる実施例および比較例を示す。これらの実施例および比較例は、形成する無機膜1の材質・厚さ、酸素透過率を変量し、培養細胞の細胞生存率すなわち接着能および増殖能を解析したものである。無機膜1の厚さは、株式会社アルバック製の表面形状測定器(DEKTAK3030)による触針法にて測定した。乾燥状態20℃での酸素透過率は、東洋精機のガス透過率測定装置(型式:NO.571)を用いて測定した。光学物性値である全光透過率およびヘイズ値は、株式会社スガ試験機製の可視光線透過率計(型式:HA−TR)を用いて測定した。具体的には、全光線透過率をJIS K6714に準拠した方法で2回測定し、その平均値を求めた。また、細胞の接着能は、比色分析法であるCrystal Violet法で解析した。細胞の増殖能は、比色分析法であるMTT法で解析し、比較例1を100%とした。
Below, the Example and comparative example concerning this invention are shown. In these Examples and Comparative Examples, the material / thickness and oxygen permeability of the
Crystal Violet法は、Crystal Violetが生細胞に取り込まれることを利用した比色分析法である。具体的には、5.0×105個のラット脳海馬神経細胞をインキュベーター内で2時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊(死んでいる)細胞とを区分した。次に、Crystal Violetで染色した後、SDS(sodium dodecyl sulfate)溶液を用いて基板に付着している細胞を溶解し、波長540nmの吸光度を測定し、比較例1と比較した。The Crystal Violet method is a colorimetric analysis method that utilizes the incorporation of Crystal Violet into living cells. Specifically, 5.0 × 10 5 rat brain hippocampal neurons were cultured in an incubator for 2 hours, washed with physiological saline, and suspended (dead) from cells adhering to the substrate. Cell). Next, after staining with Crystal Violet, cells adhering to the substrate were lysed using an SDS (sodium dodecyl sulfate) solution, and the absorbance at a wavelength of 540 nm was measured and compared with Comparative Example 1.
MTT法は、MTT(テトラゾリウム塩の一種)が細胞内の脱水素酵素による反応によって、ホルマザンに変化することを利用した染色法である。細胞が元気な場合は酵素活性が高く、ホルマザンへの還元が高く、ホルマザン濃度が高くなる。この濃度差を吸光度として細胞数計測に利用したものである。具体的には、5.0×105個のラット脳海馬神経細胞をインキュベーター内で3時間かけて培養した後、生理食塩水で洗浄し、基板に接着している細胞と、浮遊(死んでいる)細胞とを区分した。インキュベーター内で48時間かけて培養した後、MTTを含む培養液と交換しさらに3時間培養を続けた。そして、イソプロパノールを加えてホルマザンを溶解、波長570nmの吸光度を測定し、比較例1と比較した。The MTT method is a staining method that utilizes the fact that MTT (a kind of tetrazolium salt) is converted into formazan by a reaction with intracellular dehydrogenase. When the cells are healthy, the enzyme activity is high, the reduction to formazan is high, and the formazan concentration is high. This difference in concentration is used as the absorbance for counting the number of cells. Specifically, 5.0 × 10 5 rat brain hippocampal neurons were cultured in an incubator for 3 hours, washed with physiological saline, and suspended (dead) from cells adhering to the substrate. Cell). After culturing in an incubator for 48 hours, the medium was replaced with a culture solution containing MTT and further cultured for 3 hours. Then, isopropanol was added to dissolve formazan, the absorbance at a wavelength of 570 nm was measured, and compared with Comparative Example 1.
[比較例1]
市販の滅菌済みのポリスチレン製シャーレ(φ90mm、深さ20mm、板厚1.0mm)を使用した。無機膜1による被覆は実施しなかった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、6500fmol/m2・s・Paであった。培養される面の突起形状は、幅10nm、アスペクト比0.05であった。全光線透過率86%、ヘイズ値2.7%であった。[Comparative Example 1]
A commercially available polystyrene petri dish (φ90 mm, depth 20 mm, plate thickness 1.0 mm) was used. Coating with the
[比較例2]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。無機膜1による被覆は実施しなかった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、9500fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率91%、ヘイズ値2.1%であった。[Comparative Example 2]
A resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm, and a thickness of 1.0 mm was produced by an injection molding method using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., and then sterilized. Coating with the
[比較例3]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック(型式:UEP)の蒸着装置を用い、ニッケル(Ni)膜を形成した。膜厚は、0.001μmであった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、750fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率88%、ヘイズ値5.7%であった。[Comparative Example 3]
A resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm, and a thickness of 1.0 mm was produced by an injection molding method using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., and then sterilized. Next, a nickel (Ni) film was formed using a deposition apparatus of ULVAC, Inc. (model: UEP). The film thickness was 0.001 μm. The oxygen transmission rate in a dry state at 20 ° C. was 750 fmol / m 2 · s · Pa. The optical properties were a total light transmittance of 88% and a haze value of 5.7%.
[比較例4]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック(型式:UEP)の蒸着装置を用い、アルミ(Al)膜を形成した。膜厚は、0.001μmであった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、1500fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率82%、ヘイズ値7.9%であった。[Comparative Example 4]
A resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm, and a thickness of 1.0 mm was produced by an injection molding method using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., and then sterilized. Next, an aluminum (Al) film was formed using a deposition apparatus of ULVAC, Inc. (model: UEP). The film thickness was 0.001 μm. The oxygen transmission rate in a dry state at 20 ° C. was 1500 fmol / m 2 · s · Pa. The optical physical properties were a total light transmittance of 82% and a haze value of 7.9%.
[実施例1]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック(型式:UEP)の蒸着装置を用い、アルミ(Al)膜を形成した。膜厚は、0.02μmであった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、75fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率21%、ヘイズ値1.9%であった。[Example 1]
A resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm, and a thickness of 1.0 mm was produced by an injection molding method using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., and then sterilized. Next, an aluminum (Al) film was formed using a deposition apparatus of ULVAC, Inc. (model: UEP). The film thickness was 0.02 μm. The oxygen transmission rate in a dry state at 20 ° C. was 75 fmol / m 2 · s · Pa. The optical properties were a total light transmittance of 21% and a haze value of 1.9%.
[実施例2]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック(型式:UEP)の蒸着装置を用い、酸化ケイ素(SiO2)膜を形成した。膜厚は、0.10μmであった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、10fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率90%、ヘイズ値3.8%であった。[Example 2]
A resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm, and a thickness of 1.0 mm was produced by an injection molding method using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., and then sterilized. Next, ULVAC, Inc. (model: UEP) using a vapor deposition apparatus, to form a silicon oxide (SiO 2) film. The film thickness was 0.10 μm. The oxygen transmission rate in a dry state at 20 ° C. was 10 fmol / m 2 · s · Pa. The optical physical properties were a total light transmittance of 90% and a haze value of 3.8%.
[実施例3]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレートを作製した後、滅菌を行った。次に、株式会社アルバック(型式:UEP)の蒸着装置を用い、酸化ケイ素(SiO2)膜を形成した。膜厚は、2.0μmであった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、0.5fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率87%、ヘイズ値5.5%であった。[Example 3]
A resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm, and a thickness of 1.0 mm was produced by an injection molding method using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., and then sterilized. Next, ULVAC, Inc. (model: UEP) using a vapor deposition apparatus, to form a silicon oxide (SiO 2) film. The film thickness was 2.0 μm. The oxygen transmission rate in a dry state at 20 ° C. was 0.5 fmol / m 2 · s · Pa. The optical properties were a total light transmittance of 87% and a haze value of 5.5%.
[実施例4]
株式会社クラレ製のアクリル樹脂(パラペットGH−S)を使用し、スタンパーを使用した射出成形法により、幅24mm、長さ74mm、厚さ1.0mmの樹脂プレート上に、高さ20μmの複数の側壁によって形成されたマイクロ空間構造を有するプレートを作製した。図4は、実施例4にかかる細胞培養容器の構成を示す平面図である。これは、図2に示す第1の突起3が無く、第2の突起4のみを有する構成である。この第2の突起4の寸法が、幅10μm、長さ60μm、高さ20μmであり、配列ピッチは縦・横ともに100μmである。この樹脂プレートを、滅菌した。次に、株式会社アルバック(型式:UEP)の蒸着装置を用い、酸化ケイ素(SiO2)膜を形成した。膜厚は、0.3μmであった。乾燥状態20℃での酸素透過率は、15fmol/m2・s・Paであった。光学物性値は、全光線透過率86%、ヘイズ値7.7%であった。[Example 4]
Using an acrylic resin (Parapet GH-S) manufactured by Kuraray Co., Ltd., a plurality of 20 μm high on a resin plate having a width of 24 mm, a length of 74 mm and a thickness of 1.0 mm by an injection molding method using a stamper A plate having a microspace structure formed by sidewalls was produced. FIG. 4 is a plan view showing the configuration of the cell culture container according to Example 4. This is a structure having only the
以上の比較例および実施例の結果を表1にまとめて示す。 The results of the comparative examples and examples are summarized in Table 1.
無機膜1の厚みが0.002μm以下、乾燥状態20℃での酸素透過率が500fmol/m2・s・Paより大きい場合、比較例1よりも接着能および増殖能はともに低下した。接着能に比べ、増殖能は、さらに低下した。比較例3および4では、無機膜1の厚さが薄いため、透明性が保持されている。一方、表面被覆が不完全であるために酸素透過率が高い。特に、比較例4の真空蒸着法では、膜厚が変動するため、表面被覆が不完全になりやすい。そのため、細胞培養容器からの毒性物質の培養液中への放出を防止することができず、培養細胞の細胞生存率が向上しなかったと考えられる。また、増殖能の低下が顕著であるのは、毒性物質が培養液中に長時間放出されたためであると考えられる。When the thickness of the
実施例では、無機膜1の厚みを0.002μm〜5μm、乾燥状態20℃での酸素透過率を500fmol/m2・s・Pa以下とすることで、比較例1よりも飛躍的に高い細胞生存率を示した。実施例3および4では、無機膜1を酸化ケイ素(SiO2)膜とすることで、高い透明性と細胞生存率のいずれの性能も満足しており、透過光での細胞観察用途に特に適している。In the examples, the
本発明は、例えば、組織から単離した細胞を培養し、試験、検査に用いるための細胞培養容器に利用される。 The present invention is used, for example, in a cell culture container for culturing cells isolated from tissues and using them for testing and testing.
Claims (10)
前記基板上に形成されたパターンまたはその転写パターンにしたがって金属を付着させ、金属構造体を形成するステップと、
前記金属構造体のパターンを転写して細胞培養容器を形成するステップと、
前記細胞容器の少なくとも細胞が培養される面に無機膜を形成するステップとを備えた樹脂製細胞培養容器の製造方法。Forming a pattern on the substrate;
Attaching a metal according to a pattern formed on the substrate or a transfer pattern thereof to form a metal structure;
Transferring a pattern of the metal structure to form a cell culture vessel;
And a step of forming an inorganic film on a surface of the cell container on which at least cells are cultured.
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