JPWO2007069604A1 - Method for producing modified protein - Google Patents
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Abstract
基質タンパク質を酵素タンパク質によって修飾することからなる修飾タンパク質の製造方法であって、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質が、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質である、前記修飾タンパク質の製造方法。本発明は、タンパク質間相互作用を利用してタンパク質の修飾反応を効率的に行う方法であり、基質タンパク質と酵素タンパク質の間にタンパク質間相互作用を発生させることで、基質タンパク質と酵素の親和性を高め、それにより少ない酵素量で効率的に基質タンパク質を修飾することができる。A method for producing a modified protein comprising modifying a substrate protein with an enzyme protein, wherein the substrate protein and / or the enzyme protein is added with a protein binding domain capable of increasing the affinity between the substrate protein and the enzyme protein. A method for producing the modified protein, which is a chimeric protein. The present invention is a method for efficiently performing a protein modification reaction utilizing protein-protein interaction. By generating a protein-protein interaction between the substrate protein and the enzyme protein, the affinity between the substrate protein and the enzyme is achieved. The substrate protein can be efficiently modified with a small amount of enzyme.
Description
この発明は、基質タンパク質と酵素タンパク質とを用いてタンパク質を修飾する方法ないし修飾タンパク質を製造する方法に関し、より詳細には、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質として、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質を用いる前記修飾方法ないし修飾タンパク質の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for modifying a protein using a substrate protein and an enzyme protein or a method for producing a modified protein. More specifically, the substrate protein and / or the enzyme protein includes a substrate protein and an enzyme protein. The present invention relates to the above-mentioned modification method or method for producing a modified protein using a chimeric protein to which a protein binding domain capable of increasing affinity is added.
また本発明は、基質タンパク質をキナーゼ（リン酸化酵素）を用いてリン酸化する方法に関し、より詳細には、基質タンパク質またはキナーゼのどちらか一方にSH3ドメインを含み、他方にプロリンリッチ配列などのSH3ドメイン結合配列すなわち蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列を含むことを特徴とし、SH3ドメインとSH3ドメイン結合配列との間の相互作用で両分子が会合して基質タンパク質のリン酸化反応を効果的に行う基質タンパク質のリン酸化方法ならびにリン酸化タンパク質を製造する方法に関する。また本発明は、基質タンパク質をミリストイルトランスフェラーゼを用いてミリストイル化する方法に関する。さらに本発明は、基質タンパク質をタンパク質脱リン酸化酵素を用いて脱リン酸化する方法に関する。 The present invention also relates to a method for phosphorylating a substrate protein using a kinase (phosphorylating enzyme). More specifically, either the substrate protein or the kinase contains an SH3 domain, and the other is an SH3 such as a proline-rich sequence. Domain binding sequence, that is, protein binding domain contains amino acid sequence showing affinity, and interaction between SH3 domain and SH3 domain binding sequence brings both molecules together to effectively phosphorylate substrate protein The present invention relates to a method for phosphorylating a substrate protein and a method for producing a phosphorylated protein. The present invention also relates to a method for myristoylating a substrate protein using myristoyltransferase. Furthermore, the present invention relates to a method for dephosphorylating a substrate protein using a protein dephosphorylating enzyme.
細胞の増殖、分化、形態形成などは全ての多細胞生物が成り立つための基本過程である。それらの過程は細胞外からシグナルを細胞表面の受容体が認識し、それを細胞内シグナル伝達因子に伝え、適正に処理されることによりなされる。シグナル伝達は膜上の受容体を介した生体膜直下の反応を契機として行われるが、その過程の制御はタンパク質間相互作用によりなされる。その過程においてリン酸化及び脱リン酸化を介したタンパク質間相互作用の制御が重要な役割を果たしている。 Cell proliferation, differentiation, morphogenesis, etc. are fundamental processes for the establishment of all multicellular organisms. These processes are performed by a cell surface receptor that recognizes a signal from outside the cell, transmits it to an intracellular signal transduction factor, and is processed appropriately. Signal transduction is triggered by a reaction directly under the biological membrane via a receptor on the membrane, and the process is controlled by protein-protein interaction. In that process, the control of protein-protein interactions through phosphorylation and dephosphorylation plays an important role.
たとえば細胞の増殖反応や薬物に対する細胞の反応は、ほとんどの場合、細胞内シグナル伝達機構において、Ｇタンパク質などのリン酸化が細胞のシグナル伝達の実態であることが知られている。細胞増殖に関して言えば、正常細胞ではリン酸化の制御は厳密に行われているが癌細胞ではタンパク質リン酸化が亢進して、制御が効かなくなっている。このことからも、細胞内リン酸化を制御することは、細胞の恒常性の維持や疾患の治療につながることが期待できる。しかしながら、基質タンパク質を効率的にリン酸化するための人為的操作や制御分子の利用は、実質的はほとんど実現しておらず、もっぱらキナーゼのタイピングや反応機構の研究が主体である。 For example, in most cases, the proliferation reaction of cells and the reaction of cells to drugs are known to be phosphorylation of G protein or the like in the intracellular signal transduction mechanism. Regarding cell proliferation, phosphorylation is strictly controlled in normal cells, but protein phosphorylation is enhanced in cancer cells, and the regulation is no longer effective. From this, it can be expected that controlling intracellular phosphorylation will lead to maintenance of cell homeostasis and treatment of diseases. However, artificial manipulation and use of control molecules for efficiently phosphorylating a substrate protein have hardly been realized, and mainly research on kinase typing and reaction mechanism.
非リン酸化状態のタンパク質に関しては大腸菌や酵母や昆虫細胞系を用いて大量に調製され、基礎研究、創薬研究、応用研究がなされ、実際に医薬品等にも利用されてきた。 Non-phosphorylated proteins have been prepared in large quantities using E. coli, yeast, and insect cell systems, and have undergone basic research, drug discovery research, and application research, and have actually been used for pharmaceuticals and the like.
しかしリン酸化状態のタンパク質に関してはその大量調製の困難さが研究及び利用の妨げとなってきた。 However, the difficulty in large-scale preparation of phosphorylated proteins has hindered research and utilization.
従来、試料を大量(数mgから)に用いる研究を行う場合にはリン酸化部位周辺のみから構成される10残基程度のペプチドを化学的に合成したものがモデルとして用いられてきたが（非特許文献１等）、リン酸化ペプチドの化学合成は通常のペプチドの化学合成に比べて高額であり、また、多くのシグナル伝達タンパク質は複数の機能ドメインから構成され、それらを介したシグナル伝達の制御機構を明らかにするにはペプチドを用いた研究は不十分であった。 Conventionally, when conducting research using a large amount of sample (from several mg), a chemically synthesized peptide of about 10 residues composed only around the phosphorylation site has been used as a model (non- Patent Document 1, etc.), the chemical synthesis of phosphorylated peptides is expensive compared to the chemical synthesis of ordinary peptides, and many signal transduction proteins are composed of multiple functional domains, and control of signal transduction via them Studies with peptides have been insufficient to elucidate the mechanism.
また、ホスト内で両者を共発現させることでリン酸化タンパク質を大量に得る試みはなされてきたが（非特許文献２等）、リン酸化の効率が低く、更にリン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質を分離する必要があった。また、試験管内でキナーゼと基質タンパク質を反応させることでリン酸化タンパク質を得る方法も試みられてはいるが（非特許文献３等）、リン酸化の効率が低いために大量の高価なキナーゼを必要としていた。 In addition, attempts have been made to obtain a large amount of phosphorylated protein by co-expressing both in the host (Non-patent Document 2, etc.), but phosphorylation protein and non-phosphorylated protein are further reduced. It was necessary to separate. In addition, although a method of obtaining phosphorylated protein by reacting a kinase with a substrate protein in a test tube has been tried (Non-patent Document 3, etc.), a large amount of expensive kinase is required due to low phosphorylation efficiency. I was trying.
また、本発明で利用可能なSH3ドメインが、PxxPで表されるアミノ酸配列（Pはプロリン、ｘは任意のアミノ酸を表し、以下Pro Rich Region：PRRとする）を有するタンパク質に親和性を示すことに関してはよく知られている（特許文献１、２等）。なお、本明細書では、アミノ酸を適宜１文字又は３文字表記で示すこととする。また例外的に、一部のSH3ドメインはPRR以外のアミノ酸配列に親和性を示すことが報告されている。例えばGrb2、Gads、Hbp、STAM2などのSH3ドメインは、PX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP (ただしＸは任意のアミノ酸残基である）を含むアミノ酸配列に（非特許文献４、５、６、１３、１４）、Fyn、Fyb、LckのSH3ドメインはNef (非特許文献７、８、９)およびRKXXZXXZ (ただしＸは任意のアミノ酸残基であり、ＺはＫまたはＲである)を含むアミノ酸配列に（非特許文献１０）、Pex13pのSH3ドメインはWXXXFXXLE（ただしＸは任意のアミノ酸残基である）を含むアミノ酸配列に（非特許文献６、１１、１２）、Eps8のSH3ドメインはPXXDY（ただしＸは任意のアミノ酸残基を示す）を含むアミノ酸配列に（非特許文献１５）、それぞれ親和性を示す。本発明では、蛋白質結合ドメインであるこれらSH3ドメインが親和性を示すアミノ酸配列を、SH3ドメイン結合配列とする。
従来のリン酸化タンパク質を得るための方法は、主にリン酸化反応の効率が低いため、大量のキナーゼを用いて行なわれていた。本発明は、このような問題を解決するために、互いの親和性を高めた基質タンパク質とキナーゼを、宿主細胞中で共発現させたりあるいはインビトロで混合したりすることを含む、リン酸化タンパク質を得るための効率的な手法を提供することを目的とする。 Conventional methods for obtaining phosphorylated proteins have been carried out using a large amount of kinase because of the low efficiency of the phosphorylation reaction. In order to solve such a problem, the present invention provides a phosphorylated protein comprising co-expressing a substrate protein and a kinase having enhanced affinity with each other in a host cell or mixing them in vitro. It aims to provide an efficient way to obtain.
本発明者等は、蛋白質結合ドメインと該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列、例としてSH3ドメインとSH3ドメイン結合配列を利用して、基質タンパク質あるいはキナーゼのどちらか一方にSH3ドメインを保有させ、他方にSH3ドメイン結合配列を保有させた構造を形成して、基質タンパク質とキナーゼの親和性を高めることにより、リン酸化反応などの修飾反応を効率的に行うことができることを見出し、下記の各発明を完成した。 The present inventors use a protein binding domain and an amino acid sequence in which the protein binding domain has an affinity, for example, an SH3 domain and an SH3 domain binding sequence, so that either the substrate protein or the kinase has the SH3 domain. In addition, by forming a structure having a SH3 domain binding sequence on the other side and increasing the affinity between the substrate protein and the kinase, it was found that a modification reaction such as a phosphorylation reaction can be performed efficiently. Completed the invention.
（１）基質タンパク質を酵素タンパク質によって修飾することからなる修飾タンパク質の製造方法であって、該基質タンパク質及び／又は該酵素タンパク質が、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質である、前記修飾タンパク質の製造方法。 (1) A method for producing a modified protein comprising modifying a substrate protein with an enzyme protein, wherein the substrate protein and / or the enzyme protein can increase the affinity between the substrate protein and the enzyme protein. A method for producing the modified protein, which is a chimeric protein to which a domain is added.
（２）蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質と結合する基質タンパク質又は酵素タンパク質が、該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列が付加されたキメラタンパク質である、前記（１）に記載の製造方法。 (2) The production according to (1) above, wherein the substrate protein or enzyme protein that binds to the chimeric protein to which the protein binding domain is added is a chimeric protein to which an amino acid sequence to which the protein binding domain has affinity is added. Method.
（３）蛋白質結合ドメイン及び／又は該蛋白質結合ドメインが親和性を示すアミノ酸配列が、酵素的に若しくは化学的に切断可能なアミノ酸配列を介して基質タンパク質及び／又は酵素タンパク質に付加されている、前記（１）または（２）に記載の製造方法。 (3) A protein binding domain and / or an amino acid sequence to which the protein binding domain shows affinity is added to a substrate protein and / or an enzyme protein via an amino acid sequence that can be cleaved enzymatically or chemically. The manufacturing method as described in said (1) or (2).
（４）酵素タンパク質がキナーゼである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。 (4) The method for producing a modified protein according to any one of (1) to (3), wherein the enzyme protein is a kinase.
（５）蛋白質結合ドメインがSH3ドメインである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。 (5) The method for producing a modified protein according to any one of (1) to (4), wherein the protein binding domain is an SH3 domain.
（６）前記SH3ドメインが以下（ａ）又は（ｂ）のペプチドであり、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記SH3ドメイン結合配列はPXXPXZあるいはZXXPXXPあるいはPXXXRXXK（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるプロリンリッチ配列を有する、前記（５）に記載の製造方法。(6) The SH3 domain is the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and affinity for the SH3 domain binding sequence The SH3 domain binding sequence has a proline-rich sequence represented by PXXPXZ, ZXXPXXP, or PXXXRXXK (wherein X represents any amino acid and Z represents K or R), The manufacturing method as described in said (5).
（７）前記SH3ドメインが以下（ｃ）又は（ｄ）のペプチドであり、
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記SH3ドメイン結合配列はPX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列を有する、前記（５）に記載の製造方法。(7) the SH3 domain is a peptide of the following (c) or (d),
(C) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (d) an amino acid sequence comprising one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and affinity for the SH3 domain binding sequence The SH3 domain binding sequence has a sequence represented by PX [V or I] [D or N] RXXKP (wherein X represents any amino acid), (5) The manufacturing method as described in.
（８）前記基質タンパク質がSH3ドメインを有し、前記キナーゼがSH3ドメイン結合配列を有する、前記（６）又は（７）のいずれかに記載の製造方法。 (8) The production method according to any one of (6) and (7), wherein the substrate protein has an SH3 domain and the kinase has an SH3 domain binding sequence.
（９）前記基質タンパク質がSH3ドメイン結合配列を有し、前記キナーゼがSH3ドメインを有する、前記（６）又は（７）のいずれかに記載の製造方法。 (9) The production method according to any one of (6) and (7), wherein the substrate protein has an SH3 domain binding sequence, and the kinase has an SH3 domain.
（１０）基質タンパク質と酵素タンパク質との反応後に酵素的に若しくは化学的に切断可能なアミノ酸配列を切断して修飾タンパク質を回収する段階を含む、前記（３）に記載の製造方法。 (10) The production method according to (3), comprising a step of cleaving an amino acid sequence that can be cleaved enzymatically or chemically after the reaction between the substrate protein and the enzyme protein to recover the modified protein.
（１１）キメラタンパク質である基質タンパク質及び／又は酵素タンパク質と該キメラタンパク質が結合する基質タンパク質又は酵素タンパク質とを発現するベクターを用いて宿主を形質転換し、基質タンパク質と酵素タンパク質とを宿主細胞内で共発現させることからなる、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。 (11) A host is transformed using a vector that expresses a substrate protein and / or enzyme protein that is a chimeric protein and a substrate protein or enzyme protein to which the chimeric protein binds, and the substrate protein and the enzyme protein are transformed into the host cell. The manufacturing method in any one of said (1)-(3) which consists of co-expressing by.
（１２）酵素タンパク質がミリストイルトランスフェラーゼである、（１）〜（３）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。 (12) The method for producing a modified protein according to any one of (1) to (3), wherein the enzyme protein is myristoyltransferase.
（１３）酵素タンパク質がタンパク質脱リン酸化酵素である、（１）〜（３）のいずれかに記載の修飾タンパク質の製造方法。 (13) The method for producing a modified protein according to any one of (1) to (3), wherein the enzyme protein is a protein phosphatase.
以下、本発明の基質タンパク質の修飾を、タンパク質リン酸化反応を例示として説明するが、本発明における基質タンパク質の修飾はこれに限られるものではなく、脱リン酸化、ミリスチル化、パルミトイル化、ユビキチン化、ユビキチン様タンパク質修飾、ＡＤＰリボシル化、ＰＥ化、糖鎖付加を含めた、酵素タンパク質によるタンパク質翻訳後修飾に有効である。従って、基質及び／又は酵素タンパク質に付加する蛋白質結合ドメインや該ドメインが親和性を示すアミノ酸配列の組み合わせもSH3ドメインとSH3ドメイン結合配列に限定されるものではなく、その他カルモジュリンとカルモジュリン相互作用配列、PDZドメインとPDZドメイン相互作用配列など、あらゆる蛋白質結合ドメインと該ドメインが親和性を示すアミノ酸配列を利用することができる。また、ファージディスプレイ等によって得た任意のタンパク質に対して結合性を有するアミノ酸配列の使用も可能である。 Hereinafter, the modification of the substrate protein of the present invention will be described using protein phosphorylation as an example, but the modification of the substrate protein in the present invention is not limited to this, and dephosphorylation, myristylation, palmitoylation, ubiquitination It is effective for post-translational modification by enzyme proteins, including ubiquitin-like protein modification, ADP ribosylation, PE formation, and glycosylation. Therefore, the protein binding domain to be added to the substrate and / or enzyme protein and the combination of amino acid sequences to which the domain has affinity are not limited to the SH3 domain and SH3 domain binding sequence, and other calmodulin and calmodulin interaction sequences, Any protein binding domain, such as a PDZ domain and a PDZ domain interaction sequence, and an amino acid sequence that exhibits affinity for the domain can be used. In addition, it is possible to use an amino acid sequence having a binding property to any protein obtained by phage display or the like.
また本発明は、基質タンパク質をキナーゼによりリン酸化して、リン酸化タンパク質を製造する方法であって、該基質タンパク質及び／またはキナーゼに相補的なSH3ドメイン及びSH3ドメイン結合配列を持たせることにより、両分子の親和性を高め、効率的にリン酸化反応を行わせることよりなる。 The present invention is also a method for producing a phosphorylated protein by phosphorylating a substrate protein with a kinase, wherein the substrate protein and / or the kinase has a complementary SH3 domain and SH3 domain binding sequence, It consists in increasing the affinity of both molecules and allowing the phosphorylation reaction to be carried out efficiently.
リン酸化反応における「基質タンパク質」は、リン酸化されるタンパク質であって、リン酸化部位（Thr、Ser又はTyr）を有するタンパク質を意味する。このようなタンパク質は、生体内や細胞内の存在するもの、又は単離されたもの等如何なる形態のものであってもよい。またこのような基質タンパク質としては、それ自身がもともとSH3ドメインを有するものであっても、あるいはその様なSH3ドメインをもともと有しないものであってもよい。 The “substrate protein” in the phosphorylation reaction means a protein that is phosphorylated and has a phosphorylation site (Thr, Ser, or Tyr). Such a protein may be in any form such as a protein present in a living body or a cell, or an isolated protein. Further, such a substrate protein may itself have an SH3 domain or may not have such an SH3 domain.
自身がもともとSH3ドメインを有するものとしては、CrkIIやp130Cas等が挙げられる。またSH3ドメインをもともと有しないものとしては、パキシリンやAKT等が挙げられる。 CrkII, p130Cas, etc. are mentioned as those having an SH3 domain. Moreover, paxillin, AKT, etc. are mentioned as those having no SH3 domain.
本発明における「SH3ドメイン」とは、50〜70程度のアミノ酸残基より構成され、ほぼ直角で互いに詰め込まれた２つの小さいβシートを有する、SH3ドメイン結合配列に親和性を示す機能性ドメインを意味する。 In the present invention, the “SH3 domain” refers to a functional domain that has an affinity for an SH3 domain binding sequence, which is composed of about 50 to 70 amino acid residues and has two small β sheets packed at right angles to each other. means.
このようなSH3ドメインを含むタンパク質として、Abl、Tec、Btk、Lyn、Frk、Srms、Blk、Hck、Txk、Vav、Crk、CrkL、JNK、CSK、CasL、p130Cas、p47phox、p40phox、Pex13、Grb2、RasGAP、RhoGAP、Fyb、Fyn、PLCganmma、Intersectin、Ctk、ArfGAP、PI3K、PSD-95、Yes、Srk、Fgr、Nck、Gads、Zo-1、Zo-2、Zo-3、Spectrin、Drk、Sem-5等が挙げられる。本発明の「SH3ドメイン」はこれらのタンパク質のいずれかの機能性ドメインを用いることができる。 Proteins containing such SH3 domains include Abl, Tec, Btk, Lyn, Frk, Srms, Blk, Hck, Txk, Vav, Crk, CrkL, JNK, CSK, CasL, p130Cas, p47phox, p40phox, Pex13, Grb2, RasGAP, RhoGAP, Fyb, Fyn, PLCganmma, Intersectin, Ctk, ArfGAP, PI3K, PSD-95, Yes, Srk, Fgr, Nck, Gads, Zo-1, Zo-2, Zo-3, Spectrin, Drk, Sem- 5 etc. are mentioned. As the “SH3 domain” of the present invention, any functional domain of these proteins can be used.
本願発明で利用可能な「SH3ドメイン」の例は、以下（ａ）又は（ｂ）のペプチドである。 Examples of the “SH3 domain” that can be used in the present invention are the following peptides (a) or (b).
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を示すペプチド。(A) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and affinity for the SH3 domain binding sequence Peptide showing sex.
また本発明で利用可能なSH3ドメインの別の例は、以下（ｃ）又は（ｄ）のペプチドである。 Another example of the SH3 domain that can be used in the present invention is the peptide (c) or (d) below.
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつSH3ドメイン結合配列への親和性を示すペプチド。(C) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (d) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and affinity for the SH3 domain binding sequence Peptide showing sex.
また、本発明で利用可能なSH3ドメインとしては、配列番号１または２５のアミノ酸配列に60％相同、好ましくは80％相同、より好ましくは90％相同、更に好ましくは95％相同のアミノ酸配列からなり、かつSH3ドメイン結合配列に親和性を示すペプチドであってもよい。 The SH3 domain that can be used in the present invention consists of an amino acid sequence of 60% homology, preferably 80% homology, more preferably 90% homology, more preferably 95% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 25. And a peptide showing affinity for the SH3 domain binding sequence.
本発明におけるSH3ドメイン結合配列は、上記のSH3ドメインがそれぞれ特異的に、あるいは共通して認識し、親和性を示すアミノ酸配列を意味する。SH3ドメイン結合配列はSH3ドメインの配列により異なる場合もあれば、あらゆるSH3ドメインが共通して結合する場合もある。あらゆるSH3ドメインが結合するアミノ酸配列の例としては、PxxP（ただしｘは任意のアミノ酸残基を示す）を含む10残基程度のアミノ酸配列が挙げられる。このアミノ酸配列は、５〜100μMの解離定数でSH3ドメインに結合する。 The SH3 domain binding sequence in the present invention means an amino acid sequence that recognizes each SH3 domain specifically or in common and exhibits affinity. The SH3 domain binding sequence may vary depending on the sequence of the SH3 domain, or all SH3 domains may bind in common. Examples of amino acid sequences to which all SH3 domains bind include amino acid sequences of about 10 residues including PxxP (where x represents an arbitrary amino acid residue). This amino acid sequence binds to the SH3 domain with a dissociation constant of 5-100 μM.
このSH3ドメイン結合配列は、さらに限定するとXΦPXΦPX（Ｒ，Ｋ）Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Φは疎水性アミノ酸残基、さらに限定するとＩ、Ｌ、Ｖ、Ｐのいずれかを表す。）で表される。 This SH3 domain binding sequence is further limited to XΦPXΦPX (R, K) X (X represents any amino acid residue, Φ is a hydrophobic amino acid residue, and further limited to any one of I, L, V, and P) Represented.)
例えば、上記ａ）ｂ）のSH3ドメインが親和性を示すSH3ドメイン結合配列は、PXXPXZあるいはZXXPXXPあるいはPXXXRXXK（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるアミノ酸配列である。また、上記ｃ）ｄ）のSH3ドメインが親和性を示すSH3ドメイン結合配列は、PX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列である。 For example, the SH3 domain binding sequence in which the SH3 domain of a) and b) shows affinity is represented by PXXPXZ, ZXXPXXP, or PXXXRXXK (wherein X represents an arbitrary amino acid and Z represents K or R). Amino acid sequence. In addition, the SH3 domain binding sequence in which the SH3 domain of c) d) shows affinity is a sequence represented by PX [V or I] [D or N] RXXKP (wherein X represents any amino acid). It is.
本発明に言う「親和性を示す」とは、蛋白質−蛋白質間の特異的な相互作用を発揮させる程度の結合（解離）定数をもって、蛋白質結合ドメインが該ドメイン結合配列に結合する性質をいう。この親和性は、例えばSH3ドメインを有するペプチドに任意のアミノ酸配列を有するペプチドを添加して、核磁気共鳴（NMR）スペクトル、蛍光スペクトル、紫外吸収スペクトル、蛍光偏光法、表面プラズモン共鳴、プルダウンアッセイやELISAなど、またFRETを用いる方法（特許文献１および２）等で測定しその変化等を測定することにより、調べることができる。 The term “showing affinity” as used in the present invention refers to the property that a protein-binding domain binds to the domain-binding sequence with a binding (dissociation) constant that allows a specific interaction between protein and protein. This affinity can be obtained by adding a peptide having an arbitrary amino acid sequence to a peptide having an SH3 domain, for example, nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum, fluorescence spectrum, ultraviolet absorption spectrum, fluorescence polarization method, surface plasmon resonance, pull-down assay, It can be examined by measuring the change and the like by ELISA or the method using FRET (Patent Documents 1 and 2).
本発明の酵素タンパク質の例である「キナーゼ」は、タンパク質中のＴ（Thr）、Ｓ（Ser）又はＹ（Tyr）のOH基にリン酸基を付加する反応を触媒する酵素タンパク質である。その特異性により、Ser及びThrをリン酸化するSer／Thrリン酸化酵素とTyrをリン酸化するTyrリン酸化酵素の２種類に分類される。Tyrリン酸化酵素としては、Abl、Lyn、Fyn、Hck、Jak、CSK、Flk、Syk、EGFR、VEGFR、ZAP-70、Blk、Ryk、Btk、Tec、Src、Frk、Itk、Lck、Yes、Kit、Fes、Mer、Fgr、IGFR、FGFR、FAK、EPHR、Alk、Met、Trk、Eck、Hek、Sek、Mdk、Esk、Htk、Rek、erbB等が挙げられる。またSer／Thrリン酸化酵素としては、CK II、nPKC、aPKC、PKC、PKA、PKB、ROCK、STE20、CAMK、MAPK、アーク、Cdk、Chk、Drp、Zip、MAPKK、MAPKKK、JNK、MEKK、MLCK、KIN、YAK、SAT4、PAK等が挙げられる。いずれの酵素も複数の機能ドメインにより構成され、そのうちのキナーゼドメインが触媒機能を担い、キナーゼドメインのみでも活性を示すことが知られている。本発明においては、キナーゼ全体でも、リン酸化活性を有するドメインでも利用することが出来、また本発明にいう「キナーゼ」は、特に断らない限り両者を意味するものとする。 “Kinase”, which is an example of the enzyme protein of the present invention, is an enzyme protein that catalyzes the reaction of adding a phosphate group to the OH group of T (Thr), S (Ser), or Y (Tyr) in the protein. Depending on its specificity, it is classified into two types: Ser / Thr phosphorylase that phosphorylates Ser and Thr, and Tyr phosphorylase that phosphorylates Tyr. Tyr kinases include Abl, Lyn, Fyn, Hck, Jak, CSK, Flk, Syk, EGFR, VEGFR, ZAP-70, Blk, Ryk, Btk, Tec, Src, Frk, Itk, Lck, Yes, Kit Fes, Mer, Fgr, IGFR, FGFR, FAK, EPHR, Alk, Met, Trk, Eck, Hek, Sek, Mdk, Esk, Htk, Rek, erbB and the like. Ser / Thr kinases include CK II, nPKC, aPKC, PKC, PKA, PKB, ROCK, STE20, CAMK, MAPK, ARC, Cdk, Chk, Drp, Zip, MAPKK, MAPKKK, JNK, MEKK, MLCK , KIN, YAK, SAT4, PAK and the like. It is known that any enzyme is composed of a plurality of functional domains, of which the kinase domain has a catalytic function, and the kinase domain alone exhibits activity. In the present invention, the entire kinase or a domain having phosphorylation activity can be used, and “kinase” in the present invention means both unless otherwise specified.
本発明の一態様では、SH3ドメイン結合配列又はSH3ドメインのいずれかをアミノ酸配列レベルで付加させたキメラタンパク質である基質タンパク質（リン酸化部位を含む）と、該基質タンパク質のSH3ドメイン結合配列又はSH3ドメインに親和性を示すアミノ酸配列を付加させたキメラタンパク質であるキナーゼを使用する。好ましくは、SH3ドメインを基質タンパク質に、SH3ドメイン結合配列をキナーゼに、それぞれアミノ酸レベルで付加させたキメラタンパク質を使用する。それぞれのキメラタンパク質は、適当なアミノ酸配列、好ましくは特定のアミノ酸配列を認識して切断することの出来るプロテアーゼで切断可能なアミノ酸配列を、基質タンパク質または酵素タンパク質と付加されるアミノ酸配列との間に設けてもよい。また、基質タンパク質または酵素タンパク質と付加されるアミノ酸配列との順序には特に制限はなく、いずれがＮ末端側に位置していてもよい。 In one embodiment of the present invention, a substrate protein (including a phosphorylation site) that is a chimeric protein in which either an SH3 domain binding sequence or an SH3 domain is added at the amino acid sequence level, and the SH3 domain binding sequence or SH3 of the substrate protein Kinase, which is a chimeric protein with an amino acid sequence showing affinity for the domain, is used. Preferably, a chimeric protein in which an SH3 domain is added to a substrate protein and an SH3 domain binding sequence is added to a kinase at the amino acid level is used. Each chimeric protein has an appropriate amino acid sequence, preferably an amino acid sequence cleavable with a protease capable of recognizing and cleaving a specific amino acid sequence, between the substrate protein or the enzyme protein and the amino acid sequence to be added. It may be provided. Moreover, there is no restriction | limiting in particular in the order of a substrate protein or an enzyme protein, and the amino acid sequence added, Any may be located in the N terminal side.
本発明の方法を用いてリン酸化を行なう方法に特に制限はないが、以下の方法が例示される：
（１）基質タンパク質にSH3ドメインを付加してキメラタンパク質を用意する。SH3ドメインは基質タンパク質又は酵素タンパク質の内在性のドメインを利用してもよいが、他のタンパク質由来のSH3ドメインとのキメラタンパク質としても良い。その場合、前述の通り、目的とする基質タンパク質のアミノ酸配列とSH3ドメインのアミノ酸配列との間に、プロテアーゼなどの酵素的方法により、又はCNBrなどの化学的手法により切断することのできるアミノ酸配列、例えばTev ProteaseやThrombin Proteaseなどのタンパク質分解酵素の切断配列を挿入すれば、リン酸化反応終了後に該切断配列をタンパク質分解酵素などで消化ないし切断することで、目的とするアミノ酸配列のみから構成されるリン酸化タンパク質を得ることができる。The method for carrying out phosphorylation using the method of the present invention is not particularly limited, but the following method is exemplified:
(1) A chimeric protein is prepared by adding an SH3 domain to a substrate protein. The SH3 domain may use an endogenous domain of a substrate protein or an enzyme protein, but may be a chimeric protein with an SH3 domain derived from another protein. In that case, as described above, between the amino acid sequence of the target substrate protein and the amino acid sequence of the SH3 domain, an amino acid sequence that can be cleaved by an enzymatic method such as a protease or a chemical method such as CNBr, For example, if a proteolytic enzyme cleavage sequence such as Tev Protease or Thrombin Protease is inserted, the cleavage sequence is digested or cleaved with a proteolytic enzyme after the phosphorylation reaction, so that it is composed only of the target amino acid sequence. A phosphorylated protein can be obtained.
一方、キナーゼのアミノ酸配列のＣ端側にSH3ドメイン結合配列を有するキメラタンパク質を用意し、これを基質タンパク質に作用させてもよいし、またこのペプチドを発現するようなベクター等を用意して、基質タンパク質の近傍で発現ないし共発現させてもよい。後者の場合、ベクターとしてpET系、pGEX系、pPRO系等を含むあらゆるベクターを用いることができ、常法に従って発現ベクターを構成すればよい。 On the other hand, a chimeric protein having an SH3 domain binding sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence of the kinase is prepared, and this may act on a substrate protein, or a vector or the like that expresses this peptide is prepared, Expression or co-expression may be performed in the vicinity of the substrate protein. In the latter case, any vector including a pET system, pGEX system, pPRO system, etc. can be used as the vector, and the expression vector may be constructed according to a conventional method.
（２）基質タンパク質がもともとSH3ドメインを有している場合には、上記と同様にしてキナーゼにSH3ドメイン結合配列をアミノ酸レベルで付加させたキメラタンパク質を基質タンパク質に作用させればよい。 (2) When the substrate protein originally has an SH3 domain, a chimeric protein obtained by adding an SH3 domain binding sequence to the kinase at the amino acid level may be allowed to act on the substrate protein in the same manner as described above.
（３）キナーゼ、特にキナーゼのＣ末端側にSH3ドメイン結合配列をアミノ酸レベルで付加させたペプチドをコードするDNAとSH3ドメインを含んだ基質タンパク質をコードするDNAを導入した形質転換体を用いて、これらを共発現させる。大腸菌、酵母、哺乳細胞、昆虫細胞等を含むあらゆる宿主を用いることができ、プロモーターとしてはT7、Taq、lac等を含むあらゆるプロモーターを用いることができる。 (3) Using a transformant in which a DNA encoding a kinase, particularly a peptide in which an SH3 domain binding sequence is added to the C-terminal side of the kinase at the amino acid level and a DNA encoding a substrate protein containing the SH3 domain, are introduced. These are co-expressed. Any host including E. coli, yeast, mammalian cells, insect cells and the like can be used, and any promoter including T7, Taq, lac and the like can be used as the promoter.
上記のSH3ドメインを含む基質タンパク質とSH3ドメイン結合配列を含むキナーゼの組み合わせのほかに、逆にSH3ドメインを含むキナーゼとSH3ドメイン結合配列を含む基質タンパク質の組み合わせでも、同様に基質タンパク質とキナーゼの親和性を高めることができる。 In addition to the above-mentioned combination of a substrate protein containing an SH3 domain and a kinase containing an SH3 domain binding sequence, the combination of a kinase containing an SH3 domain and a substrate protein containing an SH3 domain binding sequence also has the same affinity for the substrate protein and the kinase. Can increase the sex.
リン酸化された基質タンパク質の検出は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)を用いて行うことができる。基質タンパク質がリン酸化されるとリン酸化部位１箇所あたり負電荷が２個増えることになり、リン酸化の前後で電気泳動における移動度が変化する。そのため、リン酸化されていない基質タンパク質とリン酸化された基質タンパク質の移動度を比較することで、リン酸化を確認できる。また、SDS-PAGEを行った後に、リン酸化された標的タンパク質に特異的な抗体、又はリン酸化されたアミノ酸を特異的に認識する抗体を用いた免疫染色を用いることで、より確実にリン酸化された基質タンパク質を検出できる。通常のSDS-PAGEではリン酸化された基質タンパク質と未反応の基質タンパク質の両方が検出されるが、免疫染色ではリン酸化された基質タンパク質しか検出されないため、リン酸化の反応効率を決定するためには、通常のSDS-PAGEを行うことが好ましい。 Phosphorylated substrate protein can be detected using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). When the substrate protein is phosphorylated, two negative charges increase per phosphorylated site, and the mobility in electrophoresis changes before and after phosphorylation. Therefore, phosphorylation can be confirmed by comparing the mobility of the non-phosphorylated substrate protein and the phosphorylated substrate protein. In addition, after performing SDS-PAGE, phosphorylation can be performed more reliably by using immunostaining with an antibody specific to the phosphorylated target protein or an antibody that specifically recognizes the phosphorylated amino acid. The detected substrate protein can be detected. Normal SDS-PAGE detects both phosphorylated and unreacted substrate protein, but immunostaining detects only phosphorylated substrate protein, so to determine the reaction efficiency of phosphorylation It is preferable to perform normal SDS-PAGE.
また、本発明は実施例に示すように、酵素タンパク質として、ミリストイルトランスフェラーゼやタンパク質脱リン酸化酵素を利用することもできる。ミリストイル化は、脂肪酸によるタンパク質の修飾反応の一つであり、ミリストイルトランスフェラーゼがミリストイル化を受けるタンパク質に存在する共通配列、例えばG(Eなど)XX(Sなど)Pを認識し、ミリストイルCoAから当該タンパク質のN末端グリシンのアミノ基にミリストイル基を転位して酸アミド結合を形成する反応である。このミリストイル化を触媒する酵素であるミリストイルトランスフェラーゼ（NMT）は、ヒトを含む15種以上の真核生物から19のNMT が同定、報告されている。ヒトにはNMT1とNMT2の存在が報告されており、NMT2はSDS-PAGEで単一の65 kDaのバンドとして検出される一方、NMT1は多様なisoformを示す。本発明では、これらのNMTを適宜利用することができるが、ヒトNMT１又はNMT2の利用が好ましい。 In the present invention, as shown in the examples, myristoyltransferase and protein dephosphorylating enzyme can also be used as the enzyme protein. Myristoylation is one of protein modification reactions with fatty acids. Myristoyltransferase recognizes a common sequence present in a protein that undergoes myristoylation, such as G (E, etc.), XX (S, etc.) P, and the myristoyl CoA This is a reaction in which a myristoyl group is transferred to the amino group of the N-terminal glycine of a protein to form an acid amide bond. As for myristoyltransferase (NMT), an enzyme that catalyzes this myristoylation, 19 NMTs have been identified and reported from 15 or more eukaryotes including humans. The presence of NMT1 and NMT2 has been reported in humans, and NMT2 is detected as a single 65 kDa band by SDS-PAGE, while NMT1 exhibits various isoforms. In the present invention, these NMTs can be used as appropriate, but use of human NMT1 or NMT2 is preferable.
ミリストイル化は、細胞内シグナル伝達、タンパク質の細胞内局在性の決定、特にタンパク質の細胞膜へのターゲティング、タンパク質の立体構造の安定化等に関与していると考えられている。またHIV-1においては、ウイルス構造タンパク質p17gag及びウイルス性調節タンパク質p27nefのミリストイル化が、ウイルス粒子形成のためのアセンブリに必須の修飾であることが示唆されている。特に、NMTは脳、神経で最も発現レベルが高く、脳神経系の研究の進展によってミリストイル化による制御を受ける分子が今後多数発見されることが期待される。この様に、ミリストイル化を受ける、すなわちミリストイル化配列を有するタンパク質は多岐にわたっており、本発明はそれらのタンパク質が有するミリストイル化配列を適宜使用することができる。 Myristoylation is thought to be involved in intracellular signal transduction, determination of intracellular localization of proteins, particularly targeting of proteins to cell membranes, stabilization of protein steric structures, and the like. In HIV-1, myristoylation of the viral structural protein p17gag and the viral regulatory protein p27nef has been suggested to be an essential modification for assembly for virus particle formation. In particular, NMT has the highest expression level in the brain and nerves, and it is expected that many molecules that will be controlled by myristoylation will be discovered in the future as research on the cranial nervous system progresses. Thus, there are a wide variety of proteins that are subjected to myristoylation, that is, having a myristoylated sequence, and the present invention can appropriately use the myristoylated sequence of these proteins.
また、本発明は、前記の様にリン酸化された基質タンパク質のみならず、脱リン酸化された基質タンパク質を簡便に提供することもできる。タンパクの脱リン酸化反応は、細胞内のタンパク質リン酸化酵素と共役して働くことで、細胞増殖と分化、細胞の形態と運動、細胞周期、代謝、転写活性など、細胞内情報伝達を精密にコントロールしていることが広く知られており、リン酸化シグナルを正、負の両方に制御するための基本技術として、遺伝子治療等へも応用することも可能である。 In addition, the present invention can easily provide not only a phosphorylated substrate protein as described above but also a dephosphorylated substrate protein. Protein dephosphorylation works in conjunction with intracellular protein phosphatases to precisely transfer intracellular information such as cell growth and differentiation, cell morphology and movement, cell cycle, metabolism, and transcriptional activity. It is widely known that it is controlled, and can be applied to gene therapy as a basic technique for controlling phosphorylation signals to both positive and negative.
また本発明の方法は、リン酸化、脱リン酸化、ミリストイル化以外のタンパク質の修飾反応を行う酵素タンパク質と、該酵素タンパク質が認識する特的な配列を組み合わせて使用することで、修飾されたタンパク質を簡便且つ効率的に製造することができる。
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。In addition, the method of the present invention uses a combination of an enzyme protein that performs a protein modification reaction other than phosphorylation, dephosphorylation, and myristoylation, and a special sequence that is recognized by the enzyme protein. Can be easily and efficiently produced.
The following examples illustrate the invention, but are not intended to limit the invention.
本実施例では以下の３種のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpProEX-CrkII：基質タンパク質であるCrkII（配列番号２）を発現させるためのプラスミドである。
２．プラスミドpET-Duet-SK-CrkII：図１に示すキナーゼを含むがプロリンリッチ配列を含まないSKをコードするDNA断片（配列番号４）とCrkIIとを含むプラスミドであり、CrkIIとSKとを共発現させる。
３．プラスミドpET-Duet-SKP1-CrkII：図２に示すキナーゼとプロリンリッチ配列を含むSKP1をコードするDNA断片（配列番号５）とCrkIIとを含むプラスミドであり、CrkIIとSKP1とを共発現させる。In this example, the following three plasmids were prepared.
1. Plasmid pProEX-CrkII: A plasmid for expressing the substrate protein CrkII (SEQ ID NO: 2).
2. Plasmid pET-Duet-SK-CrkII: a plasmid containing SK-containing DNA fragment (SEQ ID NO: 4) containing the kinase shown in FIG. 1 but not containing a proline-rich sequence, and CrkII and co-expressing CrkII and SK Let
3. Plasmid pET-Duet-SKP1-CrkII: a plasmid containing CrkII and a DNA fragment (SEQ ID NO: 5) encoding SKP1 containing the kinase and proline-rich sequence shown in FIG. 2, and coexpressing CrkII and SKP1.
本実施例においては、リン酸化の基質としてヒトのCrkII（配列番号２）を用いた。図３にそのドメイン構造を示す。図３に示すようにCrkIIは１つのSH2ドメイン（配列番号２の５〜120番目）とそれに続く２つのSH3ドメイン（配列番号２の134〜191番目及び238〜293番目）により構成される。この２つのSH3ドメインに挟まれた領域にリン酸化部位（配列番号２の221番目のTyr)がある。 In this example, human CrkII (SEQ ID NO: 2) was used as a phosphorylation substrate. FIG. 3 shows the domain structure. As shown in FIG. 3, CrkII is composed of one SH2 domain (positions 5 to 120 of SEQ ID NO: 2) followed by two SH3 domains (positions 134 to 191 and 238 to 293 of SEQ ID NO: 2). There is a phosphorylation site (221th Tyr of SEQ ID NO: 2) in a region sandwiched between these two SH3 domains.
CrkIIのＮ端側のSH3ドメイン（配列番号２の134〜191番目）は−PXXPXK−（ただしＸは任意のアミノ酸残基を表す。ＫはＲでもよい)に対して特異的に結合する。 The SH3 domain on the N-terminal side of CrkII (positions 134 to 191 in SEQ ID NO: 2) specifically binds to -PXXPXK- (where X represents any amino acid residue, K may be R).
一方、本実施例においては、キナーゼとしてヒトのAbl（配列番号３）を用いた。図４にそのドメイン構造を示す。図４に示すように、Ablは１つのSH3ドメイン（配列番号３の80〜140番目）とそれに続く１つのSH2ドメイン（配列番号３の141〜239番目）、キナーゼドメイン（配列番号３の247〜253番目）、SH3結合配列（配列番号３の545〜550、589〜594および778〜783番目）、DNA結合ドメイン、及びアクチン結合ドメインにより構成される。上記CrkIIのＮ端側SH3ドメインはこのSH3ドメイン結合配列を認識して結合する。 On the other hand, in this example, human Abl (SEQ ID NO: 3) was used as the kinase. FIG. 4 shows the domain structure. As shown in FIG. 4, Abl consists of one SH3 domain (positions 80 to 140 of SEQ ID NO: 3), followed by one SH2 domain (positions 141 to 239 of SEQ ID NO: 3), kinase domain (247 to SEQ ID NO: 3). 253), SH3 binding sequence (positions 545 to 550, 589 to 594 and 778 to 783 of SEQ ID NO: 3), a DNA binding domain, and an actin binding domain. The N-terminal SH3 domain of CrkII recognizes and binds to this SH3 domain binding sequence.
（１）プラスミドpProEX-CrkIIの調製
CrkIIのcDNAは既報記載の方法により調製した（Mol. Cell. Biol.、第12巻、第3482-3489頁、1992年）。CrkIIのcDNA、dNTP 200μM、塩化マグネシウム１mM、２種のプライマー（配列番号６、７）それぞれ300nM、KOD-Plus-に添付されたバッファー（１×）、KOD-Plus-polymerase １Ｕを含む反応溶液100μｌでPCR反応を行った。(1) Preparation of plasmid pProEX-CrkII
CrkII cDNA was prepared by the method described previously (Mol. Cell. Biol., Vol. 12, pages 3482-3489, 1992). CrkII cDNA, dNTP 200 μM, magnesium chloride 1 mM, 2 primers (SEQ ID NOs: 6 and 7), 300 nM each, buffer (1 ×) attached to KOD-Plus-, 100 μl of reaction solution containing 1 U of KOD-Plus-polymerase PCR reaction was performed.
得られたDNA断片をNcoI（NEB社)及びXhoI（NEB社）により切断し、PCR purification kit (Quiagen社)により精製した。pProEXCrkII Htb(Quiagen社)をNcoI及びXhoIで切断処理して得たpProEX Htbのベクター断片と、上記で得たCrkII遺伝子（配列番号２）を含むPCR断片の両者をTakara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、このベクターを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。これを培養した後、MiniPrep kit（Quiagen社）を用いて、図５に示すプラスミド（pProEX-CrkII）を得た。 The obtained DNA fragment was cleaved with NcoI (NEB) and XhoI (NEB) and purified with a PCR purification kit (Quiagen). Takara DNA Ligation kit (Takara Co., Ltd.) was used to obtain both the pProEX Htb vector fragment obtained by cleaving pProEXCrkII Htb (Quiagen) with NcoI and XhoI and the PCR fragment containing the CrkII gene (SEQ ID NO: 2) obtained above. The vector was used to transform E. coli DH5α. After culturing this, the plasmid (pProEX-CrkII) shown in FIG. 5 was obtained using MiniPrep kit (Quiagen).
得られたプラスミドpProEX-CrkIIを用いてCrkIIを大腸菌で発現させ、６×Hisタグを利用して、CrkIIを精製した。これをSDS-PAGEにより分子量34kDaのCrkIIが純度高く精製されていることを確認した（図６）。 CrkII was expressed in E. coli using the resulting plasmid pProEX-CrkII, and CrkII was purified using a 6 × His tag. It was confirmed by SDS-PAGE that CrkII having a molecular weight of 34 kDa was purified with high purity (FIG. 6).
（２）プラスミドpET-Duet-SK-CrkIIの調製
AblのcDNAは既報記載の方法により調製した（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第84巻、第8200-8204頁、1987年）。AblのcDNAとプライマー（配列番号１０、１１）を用いて、同様にしてPCR反応を行い、SH2ドメイン及びキナーゼドメインのみを含むPCR断片（図１、SK）をpET Duet (Novagen社)に組み込んだプラスミド（図７、pET-Duet-SK）を得た。このプラスミド（pET-Duet-SK）に、プライマー（配列番号８、９）を用いたPCRにより得たCrkIIを同様に挿入して、プラスミド（pET-Duet-SK-CrkII）を得た（図８）。(2) Preparation of plasmid pET-Duet-SK-CrkII
Abl cDNA was prepared by the method described previously (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8200-8204, 1987). Using the Abl cDNA and primers (SEQ ID NOs: 10 and 11), PCR was performed in the same manner, and a PCR fragment containing only the SH2 domain and kinase domain (FIG. 1, SK) was incorporated into pET Duet (Novagen). A plasmid (FIG. 7, pET-Duet-SK) was obtained. CrkII obtained by PCR using the primers (SEQ ID NOs: 8 and 9) was similarly inserted into this plasmid (pET-Duet-SK) to obtain a plasmid (pET-Duet-SK-CrkII) (FIG. 8). ).
（３）プラスミドpET-Duet-SKP1-CrkIIの調製
AblのcDNAとプライマー（配列番号１２、１３）を用いて、同様にしてPCR反応を行い、SH2ドメイン、キナーゼドメイン及び最もＮ末端側にあるSH3ドメイン結合配列のみを含むPCR断片（図２、SKP1）をpET Duet (Novagen社)に組み込んだプラスミド（pET-Duet-SKP1）を得た（図９）。このプラスミドに、プライマー（配列番号８、９）を用いたPCRにより得たCrkIIを同様にして挿入して、プラスミド（pET-Duet-SKP1-CrkII）を得た（図１０）。(3) Preparation of plasmid pET-Duet-SKP1-CrkII
PCR was performed in the same manner using Abl cDNA and primers (SEQ ID NOs: 12 and 13), and a PCR fragment containing only the SH2 domain, kinase domain and SH3 domain binding sequence located at the N-terminal end (FIG. 2, SKP1). ) Was obtained in pET Duet (Novagen) (pET-Duet-SKP1) (FIG. 9). CrkII obtained by PCR using primers (SEQ ID NOs: 8 and 9) was similarly inserted into this plasmid to obtain a plasmid (pET-Duet-SKP1-CrkII) (FIG. 10).
本実施例では、大腸菌内でCrkII／Ablを共発現させ、CrkIIのリン酸化を観察した。
プラスミドpET-Duet-SKP1-CrkIIで大腸菌BL-21（DE3）を形質転換した。この大腸菌を、アンピシリン含有LB寒天培地に広げ、一晩37℃でインキュベートすることで形質転換体を選択した。形成されたコロニーの一つを100μg／mlのアンピシリンを含んだLB培地20mlに植え37℃で一晩培養した。この培養液を100μｇ／mlのアンピシリンを含んだ２×YT培地１Ｌに植え継ぎし、600nmの濁度が0.4〜1.0の間で終濃度0.5mMイソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシドを添加し、さらに25℃で一晩培養した。培養液を3600×ｇ、４℃で15分遠心分離し、菌体を回収した。菌体をPBS緩衝液（NaCl ８ｇ、KCl 0.2ｇ、Na２HPO４・12H２O 14.5ｇ、KH２PO４ １gを合計１Ｌの蒸留水中に溶解させたもの）に縣濁し、氷中で超音波破砕した。これを11900×ｇ、４℃で60分遠心分離し、可溶性画分と不溶性画分に分離した。In this example, CrkII / Abl was co-expressed in E. coli, and phosphorylation of CrkII was observed.
Escherichia coli BL-21 (DE3) was transformed with the plasmid pET-Duet-SKP1-CrkII. The Escherichia coli was spread on ampicillin-containing LB agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to select transformants. One of the formed colonies was planted in 20 ml of LB medium containing 100 μg / ml ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. This culture solution was transferred to 1 L of 2 × YT medium containing 100 μg / ml ampicillin, and the final concentration of 0.5 mM isopropyl-β-D (−)-thiogalactopyrano was obtained at a turbidity of 600 nm between 0.4 and 1.0. Sid was added and further cultured overnight at 25 ° C. The culture solution was centrifuged at 3600 × g and 4 ° C. for 15 minutes to recover the cells. The cells were suspended in PBS buffer (NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 14.5 g, KH 2 PO 4 1 g dissolved in a total of 1 L of distilled water). Sonicated. This was centrifuged at 11900 × g and 4 ° C. for 60 minutes to separate into a soluble fraction and an insoluble fraction.
これを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。その結果を図１１に示す。対照として泳動を行ったCrkIIに比べてバンドが高分子量側にシフトしており、リン酸化反応が行われたことが確認できる。また、非リン酸化CrkIIの分子量のところにはバンドが見られず、発現したCrkIIはほとんど全てがリン酸化されていることが確認された。 This was electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). The result is shown in FIG. The band was shifted to the higher molecular weight side compared to CrkII that had been electrophoresed as a control, confirming that phosphorylation was performed. In addition, no band was observed at the molecular weight of non-phosphorylated CrkII, and it was confirmed that almost all expressed CrkII was phosphorylated.
次に、泳動後のポリアクリルアミドゲルとPVDF膜を転写用緩衝液に浸して５分ほど振盪した。転写用緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 15.14ｇ、グリシン72.07ｇを合計１Ｌの蒸留水中に溶解させたものを４Ｌとメタノール１Ｌを混合したものを用いた。次に、ろ紙を転写用緩衝液に浸し、転写装置 (Bio-Rad社)にのせる。次に、PVDF膜、ゲル、ろ紙の順に重ね、定電圧10Ｖで転写を行った。このときの電流は0.1〜0.15Ａになるように電圧を調節し、約１時間転写を行った。次に、転写後のPVDF膜をブロッキング用緩衝液に浸し、１時間ほど振盪した。その後、TBS-T緩衝液で３回洗浄した。この間にマウス抗リン酸化CrkII抗体 (Zymed社)をブロッキング用緩衝液で1000倍に希釈し、この溶液５mlにPVDF膜を浸し、１時間振盪し、TBS-Tで３回洗浄した。この間に２次抗体をTBS-T緩衝液で5000倍(anti-mouse抗体)に希釈した２次抗体液５mlにPVDF膜を浸して１時間振盪し、TBS-T緩衝液で３回洗浄した。２次抗体はPeroxidase Labeled Anti-Mouse Antibody (Santa Cruz社)を用いた。その後、ペルオキシダーゼ染色DABキット(ナカライテスク社) を用いて染色を行った。 Next, the polyacrylamide gel after migration and the PVDF membrane were immersed in a transfer buffer and shaken for about 5 minutes. The transfer buffer used was a mixture of 4 L and 1 L of methanol prepared by dissolving 15.14 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane and 72.07 g of glycine in a total of 1 L of distilled water. Next, the filter paper is immersed in a transfer buffer and placed on a transfer device (Bio-Rad). Next, PVDF membrane, gel, and filter paper were stacked in this order and transferred at a constant voltage of 10V. The voltage was adjusted so that the current at this time was 0.1 to 0.15 A, and transfer was performed for about 1 hour. Next, the transferred PVDF membrane was immersed in a blocking buffer and shaken for about 1 hour. Then, it was washed 3 times with TBS-T buffer. During this period, mouse anti-phosphorylated CrkII antibody (Zymed) was diluted 1000 times with blocking buffer, PVDF membrane was immersed in 5 ml of this solution, shaken for 1 hour, and washed 3 times with TBS-T. During this time, the PVDF membrane was immersed in 5 ml of a secondary antibody solution diluted with a TBS-T buffer 5000 times (anti-mouse antibody), shaken for 1 hour, and washed 3 times with TBS-T buffer. As a secondary antibody, Peroxidase Labeled Anti-Mouse Antibody (Santa Cruz) was used. Thereafter, staining was performed using a peroxidase staining DAB kit (Nacalai Tesque).
その結果、図１２に示すように、ＣｒｋＩＩがリン酸化されたバンドが確認された。 As a result, as shown in FIG. 12, a band in which CrkII was phosphorylated was confirmed.
比較例１
市販のAbl（New England Biolabs社、SH2ドメインとキナーゼドメインの領域のみを有する)を用いて、CrkIIのリン酸化反応を試みた。
リン酸化反応は、10mg／ml CrkII／20mM Tris-HCl/１mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、添付の10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、溶液の体積を１mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で４日間静置することで行った。これを電気泳動装置 (日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。その結果、図１３より、対照として泳動を行ったCrkIIとバンドの位置が同じであり、リン酸化反応がほとんど行われていないことが確認された。
泳動後のポリアクリルアミドゲルについて、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった。その結果を図１２に示す。リン酸化CrkIIのバンドが検出されないことを確認した。Comparative Example 1
A commercially available Abl (New England Biolabs, which has only the SH2 domain and kinase domain) was used to attempt phosphorylation of CrkII.
Phosphorylation was performed by adding 10 mg / ml CrkII / 20 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA / 150 mM NaCl (pH 7.5) 100 μl, attached 10 × Abl buffer 100 μl, and ATP to a final concentration of 0.1 mM. The solution volume was adjusted to 1 ml with H 2 O and left at 25 ° C. for 4 days. This was electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). As a result, it was confirmed from FIG. 13 that the position of the band was the same as that of CrkII subjected to electrophoresis as a control, and the phosphorylation reaction was hardly performed.
The polyacrylamide gel after electrophoresis was confirmed for phosphorylation by immunostaining similar to Example 2. The result is shown in FIG. It was confirmed that no phosphorylated CrkII band was detected.
比較例２
プラスミドpET-Duet-SK-CrkIIで大腸菌BL-21（DE3）を形質転換し、実施例２と同様の方法によりCrkIIを含む画分を得た。
泳動後のポリアクリルアミドゲルについて、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった。その結果を図１２に示す。リン酸化CrkIIのバンドが検出されないことを確認した。Comparative Example 2
Escherichia coli BL-21 (DE3) was transformed with the plasmid pET-Duet-SK-CrkII, and a fraction containing CrkII was obtained in the same manner as in Example 2.
The polyacrylamide gel after electrophoresis was confirmed for phosphorylation by immunostaining similar to Example 2. The result is shown in FIG. It was confirmed that no phosphorylated CrkII band was detected.
本実施例では、SKP1（図２）を６×Hisタグをコードする塩基配列とのキメラタンパク質（配列番号１４）として大腸菌体内に発現させた。プラスミドpET-Duet-SKP1（図９）で大腸菌BL-21（DE3）を形質転換し、実施例２と同様の方法によりSKP1を含む画分を得、さらにSKP1を精製した。精製したSKP1を含む溶出画分に同体積のグリセロールを加えた。 In this example, SKP1 (FIG. 2) was expressed in E. coli as a chimeric protein (SEQ ID NO: 14) with a base sequence encoding a 6 × His tag. Escherichia coli BL-21 (DE3) was transformed with the plasmid pET-Duet-SKP1 (FIG. 9), a fraction containing SKP1 was obtained in the same manner as in Example 2, and SKP1 was further purified. The same volume of glycerol was added to the elution fraction containing purified SKP1.
この様にして得られたSKP1を用いて、試験管内でCrkIIのリン酸化反応を試みた。このCrkIIには実施例１で得たCrkIIを用いた。10mg／ml CrkII／20mM Tris-HCl／1mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、比較例１にて用いた10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、溶液の体積を1mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で６時間以上静置することで行った。Using SKP1 thus obtained, phosphorylation of CrkII was attempted in a test tube. CrkII obtained in Example 1 was used as CrkII. Add 100 mg of 10 mg / ml CrkII / 20 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA / 150 mM NaCl (pH 7.5), 100 μl of 10 × Abl buffer used in Comparative Example 1 and ATP to a final concentration of 0.1 mM. The solution volume was adjusted to 1 ml with H 2 O and allowed to stand at 25 ° C. for 6 hours or longer.
リン酸化反応を行ったCrkIIを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。
泳動後のポリアクリルアミドゲルについて、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった。その結果を図１４に示す。CrkIIがリン酸化されたバンドが確認された。The phosphorylated CrkII was electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido).
The polyacrylamide gel after electrophoresis was confirmed for phosphorylation by immunostaining similar to Example 2. The result is shown in FIG. A band in which CrkII was phosphorylated was confirmed.
本実施例では以下のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpET22-Crk-Vav(170-375)：図１５に示すCrkIIのＮ末端側SH3ドメインとHis-タグおよびプレシジョンプロテアーゼ切断配列とVavのアミノ酸配列の170番目〜375番目のアミノ酸残基（以下、Vav（170-375）とする）からなるキメラタンパク質の遺伝子（配列番号１５）を含むプラスミドである。本実施例ではVav（170-375）（配列番号１６）を基質としてリン酸化を試みた。In this example, the following plasmids were prepared.
1. Plasmid pET22-Crk-Vav (170-375): N-terminal SH3 domain and His-tag and precision protease cleavage sequence of CrkII shown in FIG. 15 and amino acid residues 170 to 375 of the amino acid sequence of Vav (hereinafter, Vav (170-375)) is a plasmid containing a chimeric protein gene (SEQ ID NO: 15). In this example, phosphorylation was attempted using Vav (170-375) (SEQ ID NO: 16) as a substrate.
（１） プラスミドpET22-Crk-Vav(170-375)の調製
以下のプライマーを用いて得たCrkIIのＮ端側SH3ドメイン（残基番号130−198）のPCR断片を実施例１と同様の方法によりpET22に挿入する。
CCTCTAGACATATGAGGCAGGAGGAGGCGGAG （Ｆ）（配列番号１７）
CCCTCGAGGAGCTCCGATACTGAGGCGGAGGC （Ｒ）（配列番号１８）
pProEX HtbのTevプロテアーゼ切断サイトをQuick Change（Quiagene）を用いてあらかじめプレシジョンプロテアーゼ切断サイトに変異させておく。このベクターを以下pProEX Htb-Presと呼ぶ。pProEX Htb-Presに対して以下のプライマーを用いて得たVav（170-375）のPCR断片を挿入する。(1) Preparation of plasmid pET22-Crk-Vav (170-375) The PCR fragment of CrkII N-terminal SH3 domain (residue numbers 130-198) obtained using the following primers was prepared in the same manner as in Example 1. To insert into pET22.
CCTCTAGACATATGAGGCAGGAGGAGGCGGAG (F) (SEQ ID NO: 17)
CCCTCGAGGAGCTCCGATACTGAGGCGGAGGC (R) (SEQ ID NO: 18)
The Tev protease cleavage site of pProEX Htb is previously mutated to the precision protease cleavage site using Quick Change (Quiagene). This vector is hereinafter referred to as pProEX Htb-Pres. The PCR fragment of Vav (170-375) obtained using the following primers is inserted into pProEX Htb-Pres.
GCGCCATGGGGGACGAGATCTACGAGG （Ｆ）（配列番号１９）
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG （Ｒ）（配列番号２０）
挿入したものを以下のプライマーを用いて断片を調製する。
CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC （Ｆ）（配列番号２１）
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG （Ｒ）（配列番号２２）
これにより、pProEX Htb-Pres由来のHis−タグ、プレシジョンプロテアーゼ切断サイトが付加したVav（170-375）をコードするDNA断片（配列番号２３）が得られる。GCGCCATGGGGGACGAGATCTACGAGG (F) (SEQ ID NO: 19)
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG (R) (SEQ ID NO: 20)
The inserted fragment is prepared using the following primers.
CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC (F) (SEQ ID NO: 21)
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG (R) (SEQ ID NO: 22)
Thereby, a DNA fragment (SEQ ID NO: 23) encoding Vav (170-375) to which a His-tag derived from pProEX Htb-Pres and a precision protease cleavage site are added is obtained.
上記で作成したCrkII SH3ドメインをコードするDNA断片を挿入されたpET22に対して得られたHis−タグ、プレシジョンプロテアーゼ切断サイトが付加したVavのDNA断片を挿入することでCrkII SH3−His−タグ−プレシジョンプロテアーゼ切断サイト−Vav（170-375）のキメラタンパク質Crk-Vav（170-375）をコードするプラスミドpET-22-Crk-Vav(170-375)（図１６）が構築される。 The His-tag obtained for the pET22 into which the DNA fragment encoding the CrkII SH3 domain created above was inserted, and the Vav DNA fragment to which the precision protease cleavage site was added were inserted into the CrkII SH3-His-tag- Plasmid pET-22-Crk-Vav (170-375) (FIG. 16) encoding the chimeric protein Crk-Vav (170-375) of the precision protease cleavage site-Vav (170-375) is constructed.
VavのcDNAは既報記載の方法により調製した(Coppola J., Bryant SKoda T., Conway D., Barbacid M.;"Mechanism of activation of the vav protooncogene.";Cell Growth Differ.、第2巻、第95-105頁、1991年)。 Vav cDNA was prepared by the method described previously (Coppola J., Bryant SKoda T., Conway D., Barbacid M .; "Mechanism of activation of the vav protooncogene."; Cell Growth Differ., Vol. 2, Vol. 95-105, 1991).
本実施例では、実施例３と同様の方法により精製したSKP1を用いて試験管内でCrk-Vav（170-375）のリン酸化反応を試みた。このCrk-Vav（170-375）は実施例1と同様の方法で調製した。リン酸化反応は実施例３と同様の方法により精製したSKP1を10μｌ、10mg／ml Crk-Vav（170-375）／20mM Tris-HCl／1mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、比較例１にて用いた10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、溶液の体積を1mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で４時間以上静置することで行った。
リン酸化反応を行ったCrk-Vav（170-375）を電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のCrk-Vav（170-375）と比較して移動度の変化が見られ、Vav（170-375）のリン酸化が確認された（図１７）。In this example, phosphorylation of Crk-Vav (170-375) was attempted in a test tube using SKP1 purified by the same method as in Example 3. This Crk-Vav (170-375) was prepared in the same manner as in Example 1. Phosphorylation was carried out in the same manner as in Example 3. 10 μl of SKP1 and 10 μl of 10 mg / ml Crk-Vav (170-375) / 20 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA / 150 mM NaCl (pH 7.5), comparative example Add 100 μl of the 10 × Abl buffer solution used in 1 and ATP to a final concentration of 0.1 mM, and adjust the volume of the solution to 1 ml with H 2 O and leave at 25 ° C. for 4 hours or more. It was done by doing.
Crk-Vav (170-375) subjected to phosphorylation was run on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). A change in mobility was observed compared to Crk-Vav (170-375) before phosphorylation, confirming phosphorylation of Vav (170-375) (FIG. 17).
比較例４
実施例４と同じ方法でVav（170-375）（図１８）のリン酸化を行い、電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のVav（170-375）と比較して移動度の変化が見られず、Vav（170-375）のリン酸化されていないことが確認された（図１７）。Comparative Example 4
Phosphorylation of Vav (170-375) (FIG. 18) was performed in the same manner as in Example 4, and electrophoresis was performed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). No change in mobility was observed compared to Vav (170-375) before phosphorylation, confirming that Vav (170-375) was not phosphorylated (FIG. 17).
本実施例では以下の２種のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpET−Duet−SK-SLP：図１９に示すキナーゼとSLP76由来のRxxK含有配列を含むSK-SLPをコードするDNA断片（配列番号２４）を含むプラスミドである。
２．プラスミドpET22-Grb2−CrkII：図２０に示すGrb2のＣ末端側SH3ドメインとHis−タグ、およびプレシジョンプロテアーゼ切断配列とVav（170-375）のキメラタンパク質をコードするDNA（配列番号２５）を含むプラスミドである。In this example, the following two plasmids were prepared.
1. Plasmid pET-Duet-SK-SLP: A plasmid containing the kinase shown in FIG. 19 and a DNA fragment (SEQ ID NO: 24) encoding SK-SLP containing the SLP76-derived RxxK-containing sequence.
2. Plasmid pET22-Grb2-CrkII: a plasmid containing the Grb2 C-terminal SH3 domain and His-tag shown in FIG. 20, and a DNA encoding the precision protease cleavage sequence and the Vav (170-375) chimeric protein (SEQ ID NO: 25) It is.
本実施例ではCrkIIを基質としてリン酸化を試みた。また、Grb2のＣ末端側SH3ドメイン（配列番号２６）がSLP76やGab1などのタンパク質に含まれるPxxxRxxK（ただしｘは任意のアミノ酸を示す）配列と特異的に結合することを利用し、SKにSLP76由来のPxxxRxxK配列を含ませ、基質タンパク質側にGrb2のＣ末端側SH3ドメインを含ませたものを作成し、リン酸化を試みた。 In this example, phosphorylation was attempted using CrkII as a substrate. Furthermore, by utilizing the fact that Grb2 C-terminal SH3 domain (SEQ ID NO: 26) specifically binds to PxxxRxxK (where x represents any amino acid) sequence contained in proteins such as SLP76 and Gab1, SLP76 is bound to SK. A PxxxRxxK sequence derived from the protein and a substrate protein side containing the C-terminal SH3 domain of Grb2 was prepared, and phosphorylation was attempted.
（１）プラスミドpET−Duet−SK-SLPの調製
AblのcDNAと以下のプライマーを用いて、同様にしてPCR反応を行い、SH2ドメイン、キナーゼドメイン及びSLP76由来配列を含むSK-SLPをコードするPCR断片（図１９）をpET Duet (Novagen社)に組み込んだプラスミド（図２１、pET-Duet-SK-SLP）を得た。
CCGGATCCGAACAGCCTGGAGAAACATTCC （Ｆ）（配列番号２７）
GCGGATCCGCGGCCGCTCACGCCGGTTTGGTGCTGCGATCAATGCTTGGGGCCTGCAGC（Ｒ）（配列番号２８）
本実施例では、SK-SLP（図２）を６×Hisタグをコードする塩基配列とのキメラタンパク質（配列番号１４）として大腸菌体内に発現させた。プラスミドpET-Duet-SK-SLPで大腸菌BL-21（DE3）を形質転換し、実施例２と同様の方法によりSK-SLPを含む画分を得、さらにSK-SLPを精製した。精製したSK-SLPを含む溶出画分に同体積のグリセロールを加えた。(1) Preparation of plasmid pET-Duet-SK-SLP
Using the Abl cDNA and the following primers, PCR was carried out in the same manner, and a PCR fragment (FIG. 19) encoding SK-SLP containing the SH2 domain, kinase domain and SLP76-derived sequence was transferred to pET Duet (Novagen). The integrated plasmid (FIG. 21, pET-Duet-SK-SLP) was obtained.
CCGGATCCGAACAGCCTGGAGAAACATTCC (F) (SEQ ID NO: 27)
GCGGATCCGCGGCCGCTCACGCCGGTTTGGTGCTGCGATCAATGCTTGGGGCCTGCAGC (R) (SEQ ID NO: 28)
In this example, SK-SLP (FIG. 2) was expressed in E. coli as a chimeric protein (SEQ ID NO: 14) with a base sequence encoding a 6 × His tag. Escherichia coli BL-21 (DE3) was transformed with the plasmid pET-Duet-SK-SLP, a fraction containing SK-SLP was obtained in the same manner as in Example 2, and SK-SLP was further purified. The same volume of glycerol was added to the elution fraction containing purified SK-SLP.
（２）プラスミドpET22-Grb2−CrkIIの調製
以下のプライマーを用いてGrb2のＣ末端側SH3ドメイン（残基番号159−217）をコードする遺伝子断片を増幅した。
CCTCTAGACATATGACATACGTCCAGGCC （Ｆ）（配列番号２９）
GGGAGCTCGACGTTCCGGTTCACGGGGG （Ｒ）（配列番号３０）
pET22をNdeI／SacIで切断したベクター断片に対して上記で調製したGrb2のＣ末端側SH3ドメインのDNA断片をNdeI／SacIで切断したものを実施例１と同様の方法により挿入し、pET22-Grb2を作成した。次に、以下のプライマーを用いてPCRを行いCrkIIの遺伝子を増幅し、SacI／XhoIで処理したpET22-Grb2のベクター断片に組み込み、プラスミドpET22-Grb2-CrkIIを得た（図２２）。(2) Preparation of plasmid pET22-Grb2-CrkII A gene fragment encoding the C-terminal SH3 domain (residue numbers 159-217) of Grb2 was amplified using the following primers.
CCTCTAGACATATGACATACGTCCAGGCC (F) (SEQ ID NO: 29)
GGGAGCTCGACGTTCCGGTTCACGGGGG (R) (SEQ ID NO: 30)
A vector fragment obtained by cleaving pET22 with NdeI / SacI was inserted into the Grb2 C-terminal SH3 domain DNA fragment prepared above with NdeI / SacI in the same manner as in Example 1, and pET22-Grb2 It was created. Next, PCR was performed using the following primers to amplify the CrkII gene, which was then incorporated into the vector fragment of pET22-Grb2 treated with SacI / XhoI to obtain plasmid pET22-Grb2-CrkII (FIG. 22).
CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC （Ｆ）（配列番号３１）
GGGCTCGAGTCAGCTGAAGTCCTCTTCGGG （Ｒ）（配列番号３２）
得られたSK-SLPを用いて試験管内でGrb2-CrkIIのリン酸化反応を試みた。リン酸化反応は10mg／mlのGrb2-CrkII／20mM Tris-HCl／1mM EDTA／150mM NaCl（pH7.5）を100μｌ、比較例１にて用いた10×Abl緩衝液を100μｌ、ATPを終濃度0.1mMになるように添加し、SK-SLPを終濃度が0.001μMになるように添加し、溶液の体積を1mlになるようにＨ２Ｏで調製し、25℃で６時間以上静置することで行った。CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC (F) (SEQ ID NO: 31)
GGGCTCGAGTCAGCTGAAGTCCTCTTCGGG (R) (SEQ ID NO: 32)
Using the obtained SK-SLP, phosphorylation of Grb2-CrkII was attempted in a test tube. Phosphorylation was carried out using 100 μl of 10 mg / ml Grb2-CrkII / 20 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA / 150 mM NaCl (pH 7.5), 100 μl of 10 × Abl buffer used in Comparative Example 1, and ATP at a final concentration of 0.1. Add SK-SLP to a final concentration of 0.001 μM, adjust the volume of the solution with H 2 O to 1 ml, and let stand at 25 ° C. for 6 hours or more. I went there.
リン酸化反応を行ったGrb2-CrkIIを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のGrb2-CrkIIとの比較より移動度の変化が見られ、リン酸化が確認された（図２３）。 The phosphorylated Grb2-CrkII was electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). A change in mobility was observed by comparison with Grb2-CrkII before phosphorylation, confirming phosphorylation (FIG. 23).
比較例５
実施例５と同じ方法でSKを用いてGrb2-CrkIIのリン酸化を行った。ただし、SKは終濃度が0.1μMになるように添加した。電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。リン酸化反応前のGrb2-CrkIIと比較して移動度の変化が見られず、Grb2-CrkIIのリン酸化されていないことが確認された（図２３）。Comparative Example 5
Grb2-CrkII was phosphorylated using SK in the same manner as in Example 5. However, SK was added so that the final concentration was 0.1 μM. The electrophoresis was performed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). Compared to Grb2-CrkII before phosphorylation, no change in mobility was observed, confirming that Grb2-CrkII was not phosphorylated (FIG. 23).
本実施例では以下のプラスミドを用意した。
１．プラスミドpTYR（図２４）：図２に示すキナーゼとプロリンリッチ配列を含むSKP1をコードするDNA断片（配列番号５）とCrkIIのSH3ドメイン−His−タグ−プレシジョンプロテアーゼ切断サイト−マルチクローニングサイトを含むプラスミドである。マルチクローニングサイトには任意のペプチドおよびタンパク質をコードする遺伝子を挿入することが可能である。In this example, the following plasmids were prepared.
1. Plasmid pTYR (FIG. 24): DNA fragment (SEQ ID NO: 5) encoding SKP1 containing the kinase and proline-rich sequence shown in FIG. 2 and plasmid containing CrkII SH3 domain-His-tag-precision protease cleavage site-multicloning site It is. A gene encoding any peptide and protein can be inserted into the multiple cloning site.
（１）プラスミドpTYRの調製
実施例１にて作成したpET−Duet−SKP1のベクター断片に実施例４で作成したpET22- Crk-Vav(170-375)のNdeI／XhoI断片を組み込む。Quick Change（Quiagene）を用いて組み込みに用いたNdeIサイト（CATATG）の配列をCAGATGに置換し、NdeIサイトを消失させた。次にVav（170−375）をpProExHTb-Presに組み込む際に用いたNcoIサイト（CCATGG）をQuick Change（Quiagene）を用いてATATGGに置換し、新たにNdeIサイトを作成する。このプラスミドをpET−Duet−SKP1−Crkと以下呼ぶこととする。(1) Preparation of plasmid pTYR The NdeI / XhoI fragment of pET22-Crk-Vav (170-375) prepared in Example 4 is incorporated into the vector fragment of pET-Duet-SKP1 prepared in Example 1. The NdeI site (CATATG) sequence used for integration was replaced with CAGATG using Quick Change (Quiagene), and the NdeI site disappeared. Next, the NcoI site (CCATGG) used when Vav (170-375) is incorporated into pProExHTb-Pres is replaced with ATATGG using Quick Change (Quiagene) to create a new NdeI site. This plasmid is hereinafter referred to as pET-Duet-SKP1-Crk.
次に以下のマルチクローニングサイトより構成される合成遺伝子をリン酸化した後に混合して２本鎖DNA断片を調製する。
TATGGCTAGCGAATTCGTCGACCCGCGGGATATCGGTACCC （Ｆ）（配列番号３３）
TCGAGGGTACCGATATCCCGCGGGTCGACGAATTCGCTAGCCA （Ｒ）（配列番号３４）
pET−Duet−SKP1−CrkをNdeI／XhoIで処理したベクター断片に２本鎖化したマルチクローニングサイト断片を挿入する。Next, a synthetic gene composed of the following multicloning sites is phosphorylated and mixed to prepare a double-stranded DNA fragment.
TATGGCTAGCGAATTCGTCGACCCGCGGGATATCGGTACCC (F) (SEQ ID NO: 33)
TCGAGGGTACCGATATCCCGCGGGTCGACGAATTCGCTAGCCA (R) (SEQ ID NO: 34)
A multicloning site fragment that is double-stranded is inserted into a vector fragment obtained by treating pET-Duet-SKP1-Crk with NdeI / XhoI.
（２）プラスミドpTYR−Vav(170-375)の調製
VavのcDNAを鋳型として以下のプライマーを用いてPCRを行い、NdeI／XhoIで処理したpTYRのベクター断片に組み込む。
GCCATATGGGGGACGAGATCTACGAGG （Ｆ）（配列番号３５）
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG（Ｒ）（配列番号３６）
実施例２と同様の方法でSKP1とCrkIIのＮ端側SH3ドメイン、６×Hisタグ、プレシジョンプロテアーゼ切断サイトとVav（170−375）とのキメラタンパク質（配列番号３７）を大腸菌内に共発現させ、精製した。精製したキメラタンパク質を電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。実施例４にて調製した非リン酸化Crk-Vav（170-375）との間に移動度の差が見られ、リン酸化されていることが確認された（図２５）。(2) Preparation of plasmid pTYR-Vav (170-375)
PCR is performed using Vav cDNA as a template and the following primers, and the resultant is incorporated into a vector fragment of pTYR treated with NdeI / XhoI.
GCCATATGGGGGACGAGATCTACGAGG (F) (SEQ ID NO: 35)
GCGCTCGAGTCACCTCTTGACCTCGTTCACG (R) (SEQ ID NO: 36)
A chimeric protein (SEQ ID NO: 37) of SKP1 and CrkII N-terminal SH3 domain, 6 × His tag, precision protease cleavage site and Vav (170-375) was co-expressed in E. coli in the same manner as in Example 2. And purified. The purified chimeric protein was electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido). A difference in mobility was observed with non-phosphorylated Crk-Vav (170-375) prepared in Example 4, confirming phosphorylation (FIG. 25).
（１）プラスミドpTYR（―）の作製
実施例６（１）で作成したｐTYRを(NotI/XhoI)で消化し、CrkII SH3の遺伝子を含む側の断片を、pET-Duetを(NotI/XhoI)で消化したベクター断片に組み込み、プラスミドpTYR（―）（図２６）を作製した。このプラスミドは、pTYRのキナーゼ遺伝子（SKP1）がpET-Duet由来のマルチクローニングサイトへと変換された構造を有する。(1) Preparation of plasmid pTYR (-) The pTYR prepared in Example 6 (1) was digested with (NotI / XhoI), and the fragment containing the CrkII SH3 gene was converted into pET-Duet (NotI / XhoI). The plasmid pTYR (−) (FIG. 26) was prepared by integrating the vector fragment digested with 1. This plasmid has a structure in which the kinase gene (SKP1) of pTYR is converted into a multicloning site derived from pET-Duet.
（２）プラスミドpSH3-NMTの作製
Gloverら（Glover C.J.、”Human N-myristoyltransferase amino-terminal domain involved in targeting the enzyme to the ribosomal subcellular fraction.”;J. Biol. Chem.、第272巻、第28680-28689頁、1997年）の方法に従ってNMT1（N-myristoyltransferase）をコードするcDNAを調製した。このcDNAを鋳型とし、下記のプライマーを用いてPCRを行い、NMT1の触媒ドメイン（NMT1の81番目−496番目のアミノ酸配列からなるドメイン）をコードするDNAを増幅断片として得た。
GGTCTAGACATATG AACTCTTTGCCAGCAGAGAGG （Ｆ）（配列番号３８）
CGCCTCGAGTCATTGTAGCACCAGTCCAACC （Ｒ）（配列番号３９）
NdeI/XhoIで消化した増幅断片を、同じくNdeI/XhoIで消化したpTYR（−）のベクターに組み込んで、pSH3-NMT（図２７）を作製した。(2) Preparation of plasmid pSH3-NMT
Glover et al. (Glover CJ, “Human N-myristoyltransferase amino-terminal domain involved in targeting the enzyme to the ribosomal subcellular fraction.”; J. Biol. Chem., 272, 28680-28689, 1997) According to the above, cDNA encoding NMT1 (N-myristoyltransferase) was prepared. Using this cDNA as a template, PCR was performed using the following primers, and a DNA encoding the catalytic domain of NMT1 (domain consisting of the 81st to 496th amino acid sequences of NMT1) was obtained as an amplified fragment.
GGTCTAGACATATG AACTCTTTGCCAGCAGAGAGG (F) (SEQ ID NO: 38)
CGCCTCGAGTCATTGTAGCACCAGTCCAACC (R) (SEQ ID NO: 39)
The amplified fragment digested with NdeI / XhoI was incorporated into a vector of pTYR (−) that was also digested with NdeI / XhoI to prepare pSH3-NMT (FIG. 27).
（３）プラスミドpGB1-Myrの作製
プラスミドpDEST-532（geneservice社、http://www.geneservice.co.uk/)を鋳型とし、下記のプライマーを用いてPCRを行い、該プラスミドにあるStreptococcal proteinGのB1ドメイン（GB1ドメイン）をコードするDNAを増幅断片として得た。
GACCCATGGAGTACAAACTGATCC （Ｆ）（配列番号４０）
GAGCTCGAGTCAGGTTCTGGTCTTGGTGGGCAGCTCTGGTTCGGTTACCGTGAAGG （Ｒ）（配列番号４１）
また、下記の合成DNAを混合して２本鎖DNA断片を調製した。
TCTAGACATATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAG GGGCAGCAGCCTGGAAAAGTTCTTGGGGACCAAAGAAGGCCTAGTTTGGCCATGGCAC （Ｆ）（配列番号４２）
GTGCCATGGCCAAACTAGGCCTTCTTTGGTCCCCAAGAACTTTTCCAGGCTGCTGCCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAATCGTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACATATGTCTAGA （Ｒ）（配列番号４３）
前記増幅断片をNcoI/XhoIで、２本鎖DNA断片をNdeI/NcoIでそれぞれ処理した両断片を、NdeI/XhoIで処理したpET22-bに組み込んで、プラスミドpGB1-Myr（図２８）を作製した。このプラスミドは、GB1ドメインのN末端側に６ｘHisタグ、TEVプロテアーゼ消化サイト及び１７アミノ酸残基からなるミリストイル化配列（Hantschel Oら、Cell、2003年、第112巻、第6号、第845-857頁）を含み、C末端側にCrkSH3の結合配列を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。(3) Preparation of plasmid pGB1-Myr Using plasmid pDEST-532 (geneservice, http://www.geneservice.co.uk/) as a template, PCR was performed using the following primers, and Streptococcal protein G contained in the plasmid: DNA encoding the B1 domain (GB1 domain) was obtained as an amplified fragment.
GACCCATGGAGTACAAACTGATCC (F) (SEQ ID NO: 40)
GAGCTCGAGTCAGGTTCTGGTCTTGGTGGGCAGCTCTGGTTCGGTTACCGTGAAGG (R) (SEQ ID NO: 41)
In addition, the following synthetic DNA was mixed to prepare a double-stranded DNA fragment.
TCTAGACATATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCCCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAG GGGCAGCAGCCTGGAAAAGTTCTTGGGGACCAAAGAAGGCCTAGTTTGGCCATGGCAC (F) (SEQ ID NO: 42)
GTGCCATGGCCAAACTAGGCCTTCTTTGGTCCCCAAGAACTTTTCCAGGCTGCTGCCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGTCGTTGGGATATCGTAATCGTGATGGTGATGGTGATGGTAGTACGACATATGTCTAGA (R) (SEQ ID NO: 43)
Both the amplified fragments were treated with NcoI / XhoI and the double-stranded DNA fragments were treated with NdeI / NcoI, respectively, and incorporated into pET22-b treated with NdeI / XhoI to prepare plasmid pGB1-Myr (FIG. 28). . This plasmid is a myristoylated sequence consisting of a 6xHis tag, a TEV protease digestion site and 17 amino acid residues at the N-terminal side of the GB1 domain (Hantschel O et al., Cell, 2003, 112, 6, 845-857). And a gene encoding a fusion protein containing a CrkSH3 binding sequence on the C-terminal side.
（４）（２）で作製したpSH3-NMTで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換し、NMT1の触媒ドメインとCrkII SH3および６×Hisタグからなる融合タンパク質（配列番号４４、以下、SH3-NMTと表す）を大腸菌体内に発現させ、実施例２と同様の方法によりSH3-NMTを精製し、SH3-NMTのグリセロール溶液を調製した。また、（３）で作製したpGB1-Myrで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換し、６×Hisタグ、TEVプロテアーゼ消化部位、ミリストイル化配列、GB1ドメイン、CrkII SH3結合配列からなる融合タンパク質（配列番号４５）として大腸菌体内に発現させ、回収した融合タンパク質を含む画分をTEV消化して、修飾残基であるGlyがN末端に露出した融合タンパク質（以下、GB1-Myrと表す）を調製した。 (4) E. coli BL-21 (DE3) is transformed with pSH3-NMT prepared in (2), and a fusion protein comprising SEQ ID NO: 44, CrkII SH3 and 6 × His tag (SEQ ID NO: 44, hereinafter SH3- NMT) was expressed in E. coli, and SH3-NMT was purified by the same method as in Example 2 to prepare a glycerol solution of SH3-NMT. Furthermore, E. coli BL-21 (DE3) is transformed with pGB1-Myr prepared in (3), and a fusion protein comprising a 6 × His tag, a TEV protease digestion site, a myristoylation sequence, a GB1 domain, and a CrkII SH3 binding sequence ( SEQ ID NO: 45) expressed in E. coli, and the fraction containing the recovered fusion protein is digested with TEV to prepare a fusion protein in which the modified residue Gly is exposed at the N-terminus (hereinafter referred to as GB1-Myr) did.
10mg/mlのGB1-Myrを含む20mM Tris-HCl/1mM EDTA/150mM NaCl (pH 7.5)100μlと比較例１で用いた10xAbl緩衝液100μlを混合し、これにミリストイル−CoA（シグマ社）を終濃度0.1mMになるように添加し、SH3-NMT/グリセロール溶液を10μlもしくは１μlもしくは０μl加え、溶液の体積を1mlになるように水で調製し、25℃で２時間インキュベートした。反応後のサンプルを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて18.8％ポリアクリルアミドゲルで泳動した（図２９）。その結果、SH3-NMTを10μl加えたものではミリストイル化に伴うバンドの変化が観測され、SH3-NMTを１μl加えたものではミリストイル化されたGB1-Myrと未反応のGB1-Myrに由来する2本のバンドが観察された。また、SH3-NMTを10μl加えたものとSH3-NMTを加えていないものの２種類のサンプルについてApplied Biosystem社製のMASスペクトロメーターVoeagerにて質量分析を行ったところ、SH3-NMTを10μl加えたものでは分子量210の増大が見られ、GB1-Myr（理論分子量9036.7、実測分子量9038.1625）がミリストイル化されている（理論分子量9246.7、実測分子量9248.4779）ことが確認された。 100 μl of 20 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA / 150 mM NaCl (pH 7.5) containing 10 mg / ml GB1-Myr and 100 μl of 10 × Abl buffer used in Comparative Example 1 were mixed, and Myristoyl-CoA (Sigma) was terminated. The solution was added to a concentration of 0.1 mM, 10 μl, 1 μl or 0 μl of SH3-NMT / glycerol solution was added, the volume of the solution was adjusted to 1 ml with water, and incubated at 25 ° C. for 2 hours. The sample after the reaction was run on a 18.8% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido) (FIG. 29). As a result, a change in the band associated with myristoylation was observed in the case where 10 μl of SH3-NMT was added, and that derived from myristoylated GB1-Myr and unreacted GB1-Myr in the case where 1 μl of SH3-NMT was added 2 A band of books was observed. In addition, mass analysis was performed on two types of samples with and without SH3-NMT added and SH3-NMT added with Applied Biosystem's MAS spectrometer Vogeager, with 10 μl of SH3-NMT added. The molecular weight was increased by 210, and it was confirmed that GB1-Myr (theoretical molecular weight 9036.7, measured molecular weight 9038.1625) was myristoylated (theoretical molecular weight 9246.7, measured molecular weight 9284.47979).
Chernoffらの方法（Chernoff J., Schievella A.R., Jost C.A., Erikson R.L., Neel B.G.;"Cloning of a cDNA for a major human protein-tyrosine-phosphatase.";Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2735-2739(1990)）に従って、ヒトPTB-1B（human protein-tyrosine-phosphatase）をコードするｃDNAを調製した。このｃDNAを鋳型とし、下記のプライマーを用いてPCRを行い、PTP-1BのphosphataseドメインをコードするDNAを、増幅断片として得た。
GCGCCATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC （Ｆ）（配列番号４６）
AGACTCCAGGGTTCTGGTCTTGGTGGGCAGCTCTGGGTCCTCGTGGGAAAG （Ｒ）（配列番号４７）
得られた増幅断片をNcoI/XhoIで処理し、同じくNcoI/XhoI処理したpET21-dに組み込んで、プラスミドｐPTP1B-PxxP（図３０）を作製した。このプラスミドは、ヒトPTP-1B tyrosine phosphataseの触媒ドメイン（PTB-1Bの１−300番目のアミノ酸配列からなるドメイン）のC末端側にCrkII SH3の結合配列および６×Hisタグを含む融合タンパク質（配列番号４８、以下、PTP-1B-PxxPと表す）を発現する。Chernoff et al. (Chernoff J., Schievella AR, Jost CA, Erikson RL, Neel BG; "Cloning of a cDNA for a major human protein-tyrosine-phosphatase."; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2735 -2739 (1990)), cDNA encoding human PTB-1B (human protein-tyrosine-phosphatase) was prepared. Using this cDNA as a template, PCR was performed using the following primers, and DNA encoding the phosphatase domain of PTP-1B was obtained as an amplified fragment.
GCGCCATGGAGATGGAAAAGGAGTTCGAGCAGATC (F) (SEQ ID NO: 46)
AGACTCCAGGGTTCTGGTCTTGGTGGGCAGCTCTGGGTCCTCGTGGGAAAG (R) (SEQ ID NO: 47)
The obtained amplified fragment was treated with NcoI / XhoI and incorporated into pET21-d that was also treated with NcoI / XhoI to prepare plasmid pPTP1B-PxxP (FIG. 30). This plasmid is a fusion protein containing a CrkII SH3 binding sequence and a 6 × His tag on the C-terminal side of the catalytic domain of human PTP-1B tyrosine phosphatase (domain consisting of the 1st to 300th amino acid sequence of PTB-1B). No. 48, hereinafter referred to as PTP-1B-PxxP).
pPTP-1B-PxxPで大腸菌BL-21(DE3)を形質転換し、実施例２と同様の方法によりPTP-1B-PxxPをグリセロール溶液として精製した。実施例２の方法により調製したリン酸化CrkIIを10mg/ml含む20mM Tris-HCl/1mM EDTA/150mM NaCl (pH 7.5)100μlと、比較例１で用いた10×Abl緩衝液100μlとを混合し、これにPTP-1B-PxxP/グリセロール溶液を10μlもしくは１μlもしくは０μl加え、溶液の体積を1mlになるように水で調製し、25℃で２時間インキュベーションした。反応後のサンプルを電気泳動装置(日本エイドー社)を用いて15％ポリアクリルアミドゲルで泳動した（図３１）。その結果、PTP-1B-PxxPを10μl加えたものでは脱リン酸化に伴うバンドの変化が観測され、PTP-1B-PxxPを１μl加えたものでは脱リン酸化されたリン酸化CrkIIと未反応のリン酸化CrkIIに由来する2本のバンドが観察された。また、実施例２と同様の免疫染色によりリン酸化の確認を行なった（図３２）。その結果、PTP-1B-PxxPを10μl加えたものではリン酸化されたCrkIIのバンドの消失が確認され、PTP-1B-PxxPを１μl加えたものではバンドが薄くなっているのが確認され、脱リン酸化が確認された。 Escherichia coli BL-21 (DE3) was transformed with pPTP-1B-PxxP, and PTP-1B-PxxP was purified as a glycerol solution by the same method as in Example 2. 100 μl of 20 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA / 150 mM NaCl (pH 7.5) containing 10 mg / ml phosphorylated CrkII prepared by the method of Example 2 and 100 μl of 10 × Abl buffer used in Comparative Example 1 were mixed, To this, 10 μl, 1 μl or 0 μl of PTP-1B-PxxP / glycerol solution was added, and the volume of the solution was adjusted to 1 ml with water and incubated at 25 ° C. for 2 hours. The sample after the reaction was run on a 15% polyacrylamide gel using an electrophoresis apparatus (Nippon Aido) (FIG. 31). As a result, when PTP-1B-PxxP was added at 10 μl, a band change associated with dephosphorylation was observed, and at 1 μl of PTP-1B-PxxP, dephosphorylated phosphorylated CrkII and unreacted phosphorus were observed. Two bands derived from oxidized CrkII were observed. Further, phosphorylation was confirmed by immunostaining similar to Example 2 (FIG. 32). As a result, the disappearance of the phosphorylated CrkII band was confirmed when 10 μl of PTP-1B-PxxP was added, and the band was thinned when 1 μl of PTP-1B-PxxP was added. Phosphorylation was confirmed.
本発明は、タンパク質間相互作用というごくありふれた現象を用いることでタンパク質の修飾反応を効率的に行う上で画期的な手法である。例えば、通常の方法では全くリン酸化されなかったケースにおいても、基質タンパク質とキナーゼの間にタンパク質間相互作用を発生させることで両者の親和性を高め、それにより少ない酵素量で効率的に基質タンパク質をリン酸化することができる。リン酸化は細胞内及び細胞間のシグナル伝達において重要な過程であり、リン酸化タンパク質を効率的に生産することのできる本発明の方法により、リン酸化タンパク質の利用促進あるいは生体反応の誘導を制御することができる。
すなわち、細胞内にキナーゼ又は基質タンパク質を導入し、細胞内で効率的にリン酸化を行うことでリン酸化を介したシグナル伝達の人為的な制御を可能ならしめる遺伝子治療や、リン酸化反応の制御薬のスクリーニング、医療や産業上有用なリン酸化タンパク質の効率的生産等への応用も期待できる。The present invention is an epoch-making technique for efficiently performing a protein modification reaction by using a common phenomenon called protein-protein interaction. For example, even in the case where phosphorylation was not achieved at all by the usual method, the affinity between the two is increased by generating a protein-protein interaction between the substrate protein and the kinase, thereby efficiently reducing the substrate protein with a small amount of enzyme. Can be phosphorylated. Phosphorylation is an important process in intracellular and intercellular signal transduction, and the use of the phosphorylated protein or the induction of biological reaction is controlled by the method of the present invention capable of efficiently producing phosphorylated protein. be able to.
In other words, gene therapy that enables artificial control of signal transduction through phosphorylation by introducing kinase or substrate protein into cells and efficiently phosphorylating in the cell, and control of phosphorylation reaction It can also be applied to drug screening, efficient production of phosphoproteins useful in medicine and industry.
Claims (13)
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつＳＨ３ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記ＳＨ３ドメイン結合配列はＰＸＸＰＸＺあるいはＺＸＸＰＸＸＰあるいはＰＸＸＸＲＸＸＫ（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるプロリンリッチ配列を有する、請求項５に記載の製造方法。The SH3 domain is the following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (b) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and affinity for the SH3 domain binding sequence The SH3 domain binding sequence has a proline-rich sequence represented by PXXXPXZ or ZXXXPXXP or PXXXRXXK (wherein X represents any amino acid and Z represents K or R). The manufacturing method according to claim 5.
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつＳＨ３ドメイン結合配列への親和性を有するペプチドであって、前記ＳＨ３ドメイン結合配列はＰＸ［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］ＲＸＸＫＰ（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列を有する、請求項５に記載の製造方法。The SH3 domain is a peptide of (c) or (d) below:
(C) a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (d) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26, and affinity for the SH3 domain binding sequence 6. The peptide according to claim 5, wherein the SH3 domain binding sequence has a sequence represented by PX [V or I] [D or N] RXXKP (where X represents any amino acid). The manufacturing method as described.
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