JPWO2007061132A1 - Terpene compounds - Google Patents
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Abstract
本発明は、アズキゾウムシの性誘引フェロモン、その製造方法並びに該フェロモンを有効成分として含むアズキゾウムシの誘引剤を提供することを目的とする。本発明は、下記式（Ｘ）で表されるテルペン化合物、その製造方法並びに式（Ｘ）で表されるテルペン化合物を有効成分として含むアズキゾウムシの誘引剤である。An object of the present invention is to provide a sex attractant pheromone for azuki beetle, a method for producing the same, and an attractant for azuki beetle containing the pheromone as an active ingredient. The present invention is a weevil attractant containing, as an active ingredient, a terpene compound represented by the following formula (X), a production method thereof, and a terpene compound represented by formula (X).
Description
本発明は、新規なテルペン化合物、その製造方法および該テルペン化合物を有効成分として含むアズキゾウムシの誘引剤に関する。 The present invention relates to a novel terpene compound, a method for producing the same, and an attractant for azuki beetle containing the terpene compound as an active ingredient.
鞘翅目マメゾウムシ科に属するアズキゾウムシ（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）は、東南アジア、インド、オーストラリア、アフリカ等、世界各地に分布している。体長は２〜３ｍｍ程度で、宿主となる豆にはアズキ（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、ササゲ（Ｖ．ｕｎｇｕｌｃｕｌａｔａ）、緑豆（Ｖ．ｒａｄｉａｔａ）などがある。
アズキゾウムシの雌成虫は宿主となる豆の表面に産卵し、孵化した幼虫は豆の内部へ摂食しながら進入する。幼虫期を豆の内部で過ごし、羽化すると豆から脱出、再び交尾し別の豆に卵を産み付けるというサイクルを繰り返す。摂食の被害にあった豆は栄養価の変性等商品としての価値を失う。このような被害は特に豆類を主要なタンパク源としている国にとっては深刻で、アズキゾウムシをはじめとするマメゾウムシ科に属する害虫による貯蔵豆のロスは２０〜６０％にまで及ぶという報告もある。
アズキゾウムシに対する防除法として、殺虫剤の散布および燻蒸剤が使用されているがいずれも神経系をターゲットとしているため安全性には限界がある。また、環境に対する残留性や薬剤耐性虫を生み出すなどデメリットも多く、必ずしもニーズにあっているとは言えない。
近年、これら害虫を直接殺すことなくその行動を制御することにより作物の被害を防止する手法が開発されている。すなわち、害虫による寄主の発見や摂食行動を人為的に制御できれば食害を防ぐことができる。また交尾にいたる一連の配偶行動や、産卵行動を制御することができれば、次世代の生育密度を低く抑えることができる。
アズキゾウムシの生殖行動には、フェロモンと言われる化学的刺激が関与している。アズキゾウムシの生殖行動に関与するフェロモンとして、交尾解発フェロモンと性誘引フェロモンの２種類のフェロモンが存在すると言われている。そのうち交尾解発フェロモンは、既にその構造が明らかにされている（非特許文献１参照）。一方、性誘引フェロモンは、その存在が示唆されながら現在まで構造の決定に至っていない。
The adult female weevil lays eggs on the surface of the host bean, and the hatched larva enters the bean while feeding. The larva stage is spent inside the beans, and when they emerge, they escape from the beans, mate again and lay eggs on other beans. Beans that were damaged by eating lose their value as a product such as nutritional value modification. Such damage is particularly serious in countries where beans are the main protein source, and there is a report that the loss of stored beans by pests belonging to the weevil family including Azuki beetles ranges from 20 to 60%.
Insecticide sprays and fumigants are used as a control method against weevil weevil, but they are targeted at the nervous system and have limited safety. In addition, there are many disadvantages, such as the persistence to the environment and the creation of drug-resistant insects.
In recent years, methods have been developed to prevent crop damage by controlling the behavior of these pests without directly killing them. That is, if the host's discovery by a pest and feeding behavior can be artificially controlled, the food damage can be prevented. Moreover, if a series of mating behavior and spawning behavior leading to mating can be controlled, the next-generation growth density can be kept low.
A chemical stimulus called pheromone is involved in the reproductive behavior of the weevil weevil. It is said that there are two types of pheromones that are involved in the reproductive behavior of Azuki beetle: a copulation-resolved pheromone and a sex attracting pheromone. Among them, the structure of the copulation-resolved pheromone has already been clarified (see Non-Patent Document 1). On the other hand, the sex-attracting pheromone has not been determined to date, although its existence is suggested.
そこで、本発明は、現在まで構造の決定に至っていない、アズキゾウムシの性誘引フェロモンの化学構造を明らかにし、新規化合物を提供することを目的とする。また本発明は、該新規化合物の製造方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、該新規化合物を有効成分として含むアズキゾウムシの誘引剤を提供することを目的とする。
本発明者は、アズキゾウムシの分泌物を、高度に精製し、ＧＣ−ＥＡＤ（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ−Ｅｌｅｃｔｒｏａｎｔｅｎｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）によりスクリーニングを行うことにより、性誘引フェロモンを効率的に分離できることを見出し本発明を完成した。ここで、ＧＣ−ＥＡＤとは、活性物質を感知したとき、触角に発生する生物電位を測定するための触角電位検出器を装着したガスクロマトグラフィーのことをいう（Ｎｏｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．（２００３）２９，３２１−３３６．）。
即ち本発明は、下記式（Ｘ）
また本発明は、下記式（Ｉ）
下記式（Ｘ）
さらに本発明は、下記式（Ｘ）
The present inventor has found that the secretory weevil secretion can be highly purified and screened by GC-EAD (Gas Chromatographic-Electronic Tennographic Detector), thereby efficiently separating the sex-inducing pheromone and completed the present invention. . Here, GC-EAD means gas chromatography equipped with a antenna potential detector for measuring a biopotential generated at the antenna when an active substance is sensed (Nojima, S. et al.,). J. Chem. Ecol. (2003) 29, 321-336.).
That is, the present invention provides the following formula (X)
The present invention also provides the following formula (I):
Furthermore, the present invention provides the following formula (X)
図１は、本発明の式（Ｘ）で表される化合物の合成の手順を示す。 FIG. 1 shows the procedure for synthesizing a compound represented by the formula (X) of the present invention.
（１） Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ（シクロプロピルメチルケトン）
（２） Ｅｔｈｙｌ ３−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ−３−ｏｘｏｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（３−シクロプロピル−３−オキソプロパン酸エチル）
（３） Ｅｔｈｙｌ α−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−β−ｏｘｏ−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（α−（３−メチル−２−ブテニル）−β−オキソ−シクロプロピルプロパン酸エチル）
（４） Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ ４−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｅｎｔｅｎｙｌ ｋｅｔｏｎｅ（シクロプロピル４−メチル−３−ペンテニルケトン）
（５） ３−Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ−７−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｏｃｔｅｎ−３−ｏｌ（３−シクロプロピル−７−メチル−６−オクテン−３−オール）
（６） ９−Ｂｒｏｍｏ−６−ｅｔｈｙｌ−２−ｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎｅ（９−ブロモ−６−エチル−２−メチル−２，６−ノナジエン）
（７） ５−Ｅｔｈｙｌ−９−ｍｅｔｈｙｌ−４，８−ｄｅｃａｄｉｅｎｅｎｉｔｒｉｌｅ（５−エチル−９−メチル−４，８−デカジエンニトリル）
（８） ６−Ｅｔｈｙｌ−１０−ｍｅｔｈｙｌ−５，９−ｕｎｄｅｃａｄｉｅｎ−２−ｏｎｅ（６−エチル−１０−メチル−５，９−ウンデカジエン−２−オン）
（Ｉ） Ｍｅｔｈｙｌ ７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎｏａｔｅ（７−エチル−３，１１−ジメチル−２，６，１０−ドデカトリエン酸メチル）
（ＩＩ） ７−Ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎ−１−ｏｌ（７−エチル−３，１１−ジメチル−２，６，１０−ドデカトリエン−１−オール）
（Ｘ） ７−Ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌ（７−エチル−３，１１−ジメチル−２，６，１０−ドデカトリエナール）(1) Cyclopropyl methyl ketone (cyclopropyl methyl ketone)
(2) Ethyl 3-cyclopropyl-3-oxopropanoate (ethyl 3-cyclopropyl-3-oxopropanoate)
(3) Ethyl α- (3-methyl-2-butenyl) -β-oxo-cyclopropylpropanoate (α- (3-methyl-2-butenyl) -β-oxo-cyclopropylpropanoic acid ethyl ester)
(4) Cyclopropyl 4-methyl-3-pentenyl ketone (cyclopropyl 4-methyl-3-pentenyl ketone)
(5) 3-Cyclopropyl-7-methyl-6-octen-3-ol (3-cyclopropyl-7-methyl-6-octen-3-ol)
(6) 9-Bromo-6-ethyl-2-methyl-2,6-nonadiene (9-bromo-6-ethyl-2-methyl-2,6-nonadiene)
(7) 5-Ethyl-9-methyl-4,8-decadienenitrile (5-ethyl-9-methyl-4,8-decadienenitrile)
(8) 6-Ethyl-10-methyl-5,9-undecadien-2-one (6-ethyl-10-methyl-5,9-undecadien-2-one)
(I) Methyl 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrienoate (methyl 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrienoate)
(II) 7-Ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-ol (7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-ol)
(X) 7-Ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrienal (7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrienal)
（性誘引フェロモンの単離）
本発明の性誘引フェロモンは、未交尾雌から分泌物を捕集し、精製し、ＧＣ−ＥＡＤによりスクリーニングを行うことにより、単離することができる。
分泌物の捕集は、アズキゾウムシを飼育し、性誘引フェロモンをろ紙などに捕集することにより行う。アズキゾウムシの雌は最初の交尾前にしか性誘引フェロモンを放出しないと考えられ、アズキゾウムシは羽化直後に雌雄分別する必要がある。
ろ紙などに捕集した分泌物は、ｎ−ペンタンなどの溶媒に抽出した後、濃縮し、精製する。シリカゲルなど充填したカラムにより行うことができる。精製したサンプルについて、未交尾のオスの触角を設置しＧＣ−ＥＡＤを用いてスクリーニングし、フェロモン含有フラクションを特定した後、フェロモン含有フラクションを精製しアズキゾウムシ由来のフェロモンを得ることができる。ＧＣ−ＥＡＤによるフェロモン含有フラクションの特定と精製を繰り返すことが好ましい。精製はＨＰＬＣ、ＧＣなどにより行うこと出来る。
（構造決定）
単離したフェロモンは、ＧＣ−ＥＩ−ＭＳ、ＧＣ−ＣＩ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲによる機器分析を行い、さらに微量誘導体処理によるジメチルヒドラゾン化、オゾン酸化を行い、構造を決定することができる。
その結果、アズキゾウムシの性誘引フェロモンは、下記式（Ｘ）
（合成）
同定したフェロモンは、下記式（Ｉ）
（誘引剤）
本発明のアズキゾウムシの誘引剤は、式（Ｘ）で表されるテルペン化合物を有効成分として含む。該誘引剤は、式（Ｘ）で表されるテルペン化合物を有効量含有する。該誘引剤は、他の成分として、溶媒、分散媒、担体、添加剤などを含有してもよい。(Isolation of sex attracting pheromone)
The sex-attracting pheromone of the present invention can be isolated by collecting and purifying secretions from unmated females, purifying them, and screening by GC-EAD.
The secretions are collected by raising weevil and collecting the sex attracting pheromone on filter paper. Azuki beetle females are thought to release sex-induced pheromones only before the first mating, and the weevil must be sexed immediately after emergence.
The secretion collected on a filter paper or the like is extracted with a solvent such as n-pentane, and then concentrated and purified. It can be performed by a column packed with silica gel or the like. About the refined sample, an unmating male antenna is installed and screened using GC-EAD, and after identifying a pheromone-containing fraction, a pheromone-derived pheromone can be obtained by purifying the pheromone-containing fraction. It is preferable to repeat the identification and purification of the pheromone-containing fraction by GC-EAD. Purification can be performed by HPLC, GC or the like.
(Structure determination)
The isolated pheromone can be subjected to instrumental analysis by GC-EI-MS, GC-CI-MS, and 1 H-NMR, and further subjected to dimethylhydrazone formation by ozone treatment and ozone oxidation to determine the structure.
As a result, the sex attractant pheromone of Azuki beetle has the following formula (X)
(Synthesis)
The identified pheromone has the following formula (I)
(Attractant)
The attracting agent for Azuki beetle of the present invention contains a terpene compound represented by the formula (X) as an active ingredient. The attractant contains an effective amount of a terpene compound represented by the formula (X). The attractant may contain a solvent, a dispersion medium, a carrier, an additive and the like as other components.
実施例１
以下の手順で、アズキゾウムシの性誘引フェロモンを捕集、精製し、その構造を同定した。
（アズキゾウムシの飼育）
アズキゾウムシは、タッパーの上面にステンレス網をかけ通気性を持たせた容器を用い飼育した。容器中に、一度水洗いし一晩乾燥させた小豆（Ｖ．ａｎｇｕｌａｒｉｓ，Ｄａｉｎａｇｏｎ）を二層になるくらい引きつめ飼育した。飼育中はインキュベータ内を気温２７℃、湿度５０％、２４時間暗期に維持した。本条件下においてアズキゾウムシはアズキの表面に卵が産卵されてからおよそ２５日で成虫が羽化した。
（性誘引フェロモンの捕集）
アズキゾウムシの雌は、実験室レベルにおいて羽化後一度しか交尾行動を示さないため、雌は最初の交尾前にしか性誘引フェロモンを放出しないと考えられる。そのため、アズキゾウムシを羽化直後に雌雄分別した。分別した雌のアズキゾウムシは３００〜４００個体ごとに一つの腰高シャーレ（外径９０ｍｍ、高さ１２０ｍｍ）の中に入れた。腰高シャーレ内には上底と下底それぞれにろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．２，９０ｍｍ）をはりつけ、さらにひだ付ろ紙状に折ったろ紙をパイル上に積み上げたものを設置し、目的フェロモンを吸着した。フェロモンは各シャーレについて１４〜２０日間に亘って捕集し、計３２，２７７匹のバージン雌から捕集した。
（抽出）
性誘引フェロモンを吸着したろ紙を細かく破砕し、円筒ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．８４，４０×１５０ｍｍ）に詰め込みソックスレー抽出器により溶媒抽出した。溶媒はｎ−ｐｅｎｔａｎｅ ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、抽出時間は２４時間とした。得られた粗抽出液を１サンプルあたり約１，５００匹相当量分になるように調整し、計２０本のサンプルＳ１〜Ｓ２０を得た。
（濃縮）
各サンプルをクデルナ−ダニッシュ濃縮器により濃縮した。約５ｍｌまで濃縮し、使用するまで−３０℃でストックした。
（オープンカラムによる精製）
各サンプルを氷上で窒素により１ｍｌまで濃縮し、シリカゲルを充填剤に用いたオープンカラムにより精製した。カラムは２ｍｌのピペットを用い、充填剤はＷａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００（Ｗａｋｏ）１ｇを用いた。溶媒はｎ−ｐｅｎｔａｎｅ，ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ残留農薬試験ｇｒａｄｅ（Ｋｏｋｕｓａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い、ステップワイズ法でｐｅｎｔａｎｅ／ｅｔｈｅｒ＝１０ｍｌ／０ｍｌ，９．５ｍｌ／０．５ｍｌ，９ｍｌ／１ｍｌ，８ｍｌ／２ｍｌ，５ｍｌ／５ｍｌ，０ｍｌ／１０ｍｌで溶出させた。Ｓ１について、各フラクション１０ｍｌずつ分取し、Ｓ１−１，Ｓ１−２，Ｓ１−３，Ｓ１−４，Ｓ１−５，Ｓ１−６の計６本のフラクションを得た。他のサンプルＳ２〜Ｓ２０についても同様にフラクションを得た。
（ＧＣ−ＥＡＤによるスクリーニング）
各フラクションから約１．５匹雌相当量の試料をＧＣにインジェクションし、ＧＣ−ＥＡＤによるスクリーニングを行った。
ＧＣ−ＥＡＤ（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ−Ｅｌｅｃｔｒｏａｎｔｅｎｎｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）は、ＨＰ５８９０ ｓｅｒｉｅｓ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、カラムはＤＢ−５（３０ｍ×０．２５ｍｍ，０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ）を用いた。インジェクションはスプリットレス法で行い、サンプリングタイムは１分とした。ＧＣコンディションはインジェクター側（ｉｎｊ）が２５０℃、検出器側（ｄｅｔ）はＦＩＤ，ＥＡＤとも２８０℃に設定し、カラムオーブンは６０℃で３分保持後、１０℃／ｍｉｎで２８０℃まで昇温させ１０分間保持した。キャリアガスにはＮ２を用い、カラムヘッドプレッシャーは１４５ｋＰａとした。
カラムは検出器側の出口においてヒューズドシリカユニバーサル三方コネクター（Ｊ＆Ｗ）を用い、ラインをスプリットした。また、コネクター直前においてキャリアーガスを追加するために、ＴＣＤキャピラリー用アダプタメークアップガスライン付（Ａｇｉｌｅｎｔ）を接続し、Ｎ２を３０ｍｌ／ｍｉｎ追加した。スプリット後のラインは不活性処理済溶融シリカキャピラリーカラム（１ｍ×０．２５ｍｍ；Ａｌｌｔｅｃｈ）により一方をＦＩＤポートに、もう一方をカラムオーブンからＮＰＤポートを経由して外に出し、流出物が触角に受容するようにした。カラム出口から流出物を触角上まで運ぶために、３００ｍｌ／ｍｉｎの空気を流した。この空気は活性炭を通し、バブリング、氷による冷却により、湿度を持たせた。
オペアンプにはＴＬ０８２ＣＰ（ＴＥＸＡＳ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ）を使い、０．５Ｈｚのｈｉｇｈ ｐａｓｓ ｆｉｌｔｅｒを用いた。そしてアンプ用に±１５Ｖの定電圧直流電源を用いた。電極はＡｇ電極を０．２Ｍ ＮａＣｌ溶液中で３０分通電させＡｇ−Ｃｌメッキした。その上に０．５％ ＮａＣｌ溶液のドロップをのせ、アッセイ直前に切断した未交尾のオスの触角を設置した。なお、ＧＣ−ＥＡＤ用のＧＣの改造はＮｏｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．（２００３）２９，３２１−３３６．を参照した。
その結果、サンプルＳ１〜Ｓ２０いずれにおいても２番目のフラクション（Ｓ１−２，Ｓ２−２，Ｓ３−２，・・・・，Ｓ２０−２）にのみ活性がみられた。また、一回のアッセイでわずかにリテンションタイムの異なる２回の脱分極を検出した。しかしながら精製度が低いため夾雑物が多く、ＦＩＤ側でどのピークがフェロモン由来のピークであるか同定できなかった。
（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）による精製）
ＧＣ−ＥＡＤによるスクリーニングの結果、サンプルＳ１について活性のあったＳ１−２をさらにＨＰＬＣにより精製した。あらかじめフラクション中の溶媒を氷上で窒素により完全に留去させた後、ｐｅｎｔａｎｅ１００μｌで溶解させておいた。装置はＬＣ−５Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いた。検出器はＳＰＤ−２Ａを用い検出波長は２５４ｎｍとした。溶媒はｎ−ｐｅｎｔａｎｅ，ｄｉｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒを用い、ｐｅｎｔａｎｅ１００％から１％／ｍｉｎでｐｅｎｔａｎｅ／ｅｔｈｅｒ＝５０％／５０％までグラジェント法で溶出させた。トータル流量は１ｍｌで、各１ｍｌずつ分取した。
Ｓ１−２について、Ｓ１−２−１からＳ１−２−５０までの５０本のフラクションを分取し、各フラクションをＧＣ−ＥＡＤによりスクリーニングにかけた。その結果Ｓ１−２−２１〜２３付近に活性が集中していた。サンプルＳ２−２〜Ｓ２０−２についても同様に精製とスクリーニングを行なった結果、各サンプルの２１〜２３のフラクションに活性が集中していた。
ＨＰＬＣ精製により精製度が上がったため、各サンプルのフラクション２１〜２３をＧＣにかけて得られるＦＩＤ上においてＥＡＤシグナルと比較しフェロモン由来の２つのピークを同定でき、それぞれを別のフラクションに分取することができた。（以下ＧＣのＦＩＤ上でリテンションタイムの早いほうからフェロモンＡ，Ｂとする）。
（ＧＣ−ＥＩ−ＭＳによる解析）
フェロモンＡ，Ｂの各フラクションのＧＣ−ＥＩ−ＭＳ解析を行った。装置はＱＰ５０００（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いた。カラムはＤＢ−５（３０ｍ×０．２５ｍｍ，０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ）を用いた。ｉｎｊ，ｄｅｔの温度はそれぞれ２５０℃，２８０℃とし、オーブン温度は６０℃で３分保持後、１０℃／ｍｉｎで２８０℃までの昇温プログラムを用いた。キャリアガスはＨｅを用い、カラムヘッドプレッシャーは１００ｋＰａとした。インジェクション法はスプリットレス法を用い、サンプリングタイムは１分とした。
その結果、どちらのフェロモンにおいても顕著な分子イオンピーク（Ｍ＋）を検出することができなかった。フラグメントイオンのパターンについてもフェロモンＡ，Ｂ間におけるパターンに顕著な差は見られなかった。また、ＮＩＳＴライブラリにおいてシミラリティー検索を行った結果、ｆａｒｎｅｓｏｌやｃｉｔｒａｌといったテルペン系の化合物に高い類似度を示した。以上よりフェロモンがテルペン系化合物であることが示唆された。
（ＧＣ−ＣＩ−ＭＳによる解析）
次に分子量を決定するために各フラクションのＧＣ−ＣＩ−ＭＳ解析を行った。
装置はＱＰ２０１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により測定した。カラムはＤＢ−５（３０ｍ×０．２５ｍｍ，０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ）を用いた。ｉｎｊ，ｄｅｔの温度はそれぞれ２５０℃，２８０℃とし、オーブン温度は６０℃、３分保持後、１０℃／ｍｉｎで２８０℃までの昇温プログラムを用いた。キャリアガスはＨｅを用い、カラムヘッドプレッシャーは１００ｋＰａとした。反応ガスはｉｓｏ−ｂｕｔａｎｅを用いた。
その結果どちらのフェロモンにおいてもｍ／ｚ＝２３５にＭ＋＋１の分子イオンピークを検出した。またｍ／ｚ＝２１７にＭ＋−Ｈ２Ｏと予想される顕著なフラグメントピークを検出した。以上の結果から、フェロモンＡ，Ｂの分子量が２３４であることがわかり、その構造中に−ＯＨもしくは−ＣＨＯ、もしくはその両方を有することが推定された。以上ＧＣ−ＣＩ−ＭＳ，ＧＣ−ＥＩ−ＭＳの結果からフェロモンＡとＢは異性体であることが推定されたので、以下フェロモンＡについて解析を行った。
（ＧＣによる精製）
誘導体化、ＮＭＲ等更なる解析を行っていくために、ＧＣにより精製を行った。装置はＨＰ５８９０ ｓｅｒｉｅｓ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、カラムはＺＢ−１（３０ｍ×０．５３ｍｍ，１．５０μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた。インジェクションはスプリットレス法で行ったが、インジェクションボリュームを増やすために、容量９００μｌの注入口ライナを用いた。サンプリングタイムは２分とした。カラムは検出器側にヒューズドシリカユニバーサル二方コネクター（Ｊ＆Ｗ）を接続し、コレクター用に不活性処理済溶融シリカキャピラリーカラム（４０ｃｍ×０．５３ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を接続した。そして目的のリテンションタイムでカラムを引き上げ、氷により冷却した鞘を被せてカラム上に保持させ、溶媒により溶出させた。ＧＣコンディションはｉｎｊ側が２５０℃，ｄｅｔ側は１５０℃に設定し、カラムオーブンは、６０℃で３分保持後、１０℃／ｍｉｎで２８０℃まで昇温させ１０分保持した。キャリアガスにはＮ２を用い、カラムヘッドプレッシャーは２ｐｓｉとした。なお、ＧＣによる分取の手法はＮｏｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．（２００４）３０，２１５３−２１６１．を参照した。
フェロモンＡを含むフラクションのうち、ＦＩＤより得られたクロマトグラム上でフェロモン由来のピーク付近に夾雑物の少ないフラクションを選抜し、一つのフラクションにまとめた。その際、ｐｅｎｔａｎｅ，ｅｔｈｅｒでは作業中に溶媒が留去してしまうため、溶媒を蒸留したｎ−ｈｅｘａｎｅ（Ａｌｄｒｉｃｈ）に置換した。フェロモンＡについてあらかじめ測定しておいたリテンションタイムに合わせてサンプリングを行った結果、ほぼフェロモン単一のピークを得ることができた。
（１Ｈ−ＮＭＲによる解析）
ＧＣにより精製したフェロモンＡを１Ｈ−ＮＭＲによる解析を行った。装置はＪＮＭ−ＥＣＡ ４００ＭＨｚ（ＪＥＯＬ）を用いて測定した。ミクロ試料管を用い溶媒はＣＤＣｌ３を用いた。その結果９．９０ｐｐｍにホルミル基プロトン由来のダブレット（１Ｈ）を検出した。しかしながら解析にまわすことができたフェロモン量自体がおよそ数μｇと少ないことから特に高磁場側において夾雑物由来のシグナルが多くなり、単独でのシグナルの帰属はこれ以上困難であった。
そのため、これまでに得られた情報から構造が類似すると予想できたテルペン系の他種由来のフェロモンや、幼若ホルモン等の文献から１Ｈ−ＮＭＲの解析データを集積し、考察した。その結果今回得られたシグナルを次のように帰属した。
０．９５ｐｐｍに７位もしくは１１位にエチル側鎖を有する場合の末端メチルプロトン由来のトリプレット（３Ｈ）を検出し、２．６０ｐｐｍにγ位のメチレン基プロトン由来のトリプレット（２Ｈ）を検出した。そして５．０５−５．１４ｐｐｍに６位と１０位のビニルプロトン由来のマルチプレット（２Ｈ）を検出し、５．８７ｐｐｍに２位のビニルプロトン由来のダブレット（１Ｈ）を検出した。これらの結果から、フェロモンＡの推定構造は、３，７，１１−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｔｒｉｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌ、もしくは７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌであると推定された。
（誘導体化による解析）
ＧＣにより精製したフェロモンＡに対し、誘導体処理を行いＧＣ−ＥＩ−ＭＳにより解析を行った。ＧＣ−ＥＩ−ＭＳの条件は上述と同様に測定した。
アセチル化
２μｌ ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｉｎ １００μｌ ｂｅｎｚｅｎｅと１００ｎｌ ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｉｎ １００μｌ ｂｅｎｚｅｎｅを混ぜ、フェロモンを加え、６０℃で１２時間インキュベートした。その後ｂｅｎｚｅｎｅ ２００μｌとｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ２００μｌを加え攪拌し、水層を除去した（２回繰り返した）。その結果、全く反応が起こらなかった。
ＴＭＳ化
１００μｌ ＢＳＡ（Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）中にフェロモンを加え、６０℃で１２時間インキュベートした。その結果、全く反応が起こらなかった。アセチル化およびＴＭＳ化の結果より、フェロモンＡの構造中には−ＯＨを有しないことがわかった。
ジメチルヒドラゾン化
次に構造中の−ＣＨＯの有無を確認するために、５０μｇ Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｏｒａｚｉｎｅ ｉｎ ５０μｌ ｈｅｘａｎｅ中にフェロモンＡを加え、撹枠しジメチルヒドラゾン化を行った。その結果、ｍ／ｚ＝２７６にＭ＋＋４２の分子イオンピークを検出した。この結果、フェロモンＡの構造中には−ＣＨＯを有することがわかった。また、ｍ／ｚ＝１２５に顕著なフラグメントピークを検出した。
直鎖のα，β−不飽和アルデヒドにおいてアリル位での開裂によりｍ／ｚ＝１１１に顕著なフラグメントピークが検出されることが報告されていたため、α，β−不飽和アルデヒドでβ位にメチル側鎖を有するｃｉｔｒａｌを用いて同様の処理を行った。その結果、同様にアリル位での開裂により直鎖のα，β−不飽和アルデヒドによるｍ／ｚ＝１１１より１４多いｍ／ｚ＝１２５に顕著なフラグメントピークを検出した。この結果から、フェロモンＡの末端構造はα，β−不飽和アルデヒドでβ位にメチル側鎖を有すると推定された。また、フェロモンの構造中に−ＯＨをもたず、−ＣＨＯのみ有することから分子中のＯの数は１つであると予想し、さらに分子量が２３４であることから不足水素指標を計算すると４となり、構造中の不飽和結合は４つであるとわかった。
オゾン酸化
フェロモンＡを含有する５０μｌのｈｅｘａｎｅをｄｒｙ ｉｃｅ／ａｃｅｔｏｎｅ浴中で−７８℃に冷却しながら酸素ガスを３ｍｌ／分で吹き込み、テスラ・ランプチェッカーＨＦ−２０（信光電気）を用いて１０〜１５ｋＶの高電圧を２０秒かけた。その後、ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅのｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ溶液（１μｇ／μｌ）を１μｌ加え攪拌し、オゾン酸化を行った。
それぞれの推定構造をオゾン酸化処理した場合に期待される生成物のうち比較的分子量の大きい２種の生成物に着目した。３，７，１１−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｔｒｉｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌからは４−ｏｘｏｐｅｎｔａｎａｌ（ＭＷ１００）のみ生成するが、７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌからは４−ｏｘｏｐｅｎｔａｎａｌと４−ｏｘｏｈｅｘａｎａｌ（ＭＷ１１４）の両化合物が生成する。この差が生じることを期待してフェロモンＡをオゾン酸化処理したところ、ｍ／ｚ＝１００の４−ｏｘｏｐｅｎｔａｎａｌはサンプル量が少なく検出できなかったが、ｍ／ｚ＝１１４の４−ｏｘｏｈｅｘａｎａｌは検出した。この４−ｏｘｏｈｅｘａｎａｌは３，７，１１−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｔｒｉｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌからは生成せず、７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌからのみ生成する。以上の結果からフェロモンＡの構造は式（Ｘ）で表される７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌであることがわかった。
実施例２
以下の手順で、式（Ｘ）で表される化合物を合成した。式（ＩＩ）の化合物、式（Ｉ）の化合物、式（Ｘ）の化合物はそれぞれ以下の通りである。
式（Ｉ）で表される化合物：ｍｅｔｈｙｌ ７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎｏａｔｅ
式（ＩＩ）で表される化合物：７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎ−１−ｏｌ
式（Ｘ）で表される化合物：７−ｅｔｈｙｌ−３，１１−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６，１０−ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎａｌ
（式（Ｉ）で表される化合物の合成）
式（Ｉ）で表される化合物は、森らの手法を参照し調製した（Ｍｏｒｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７１）３５，１１１６−１１２７．）。
（式（ＩＩ）で表される化合物の合成）
式（Ｉ）で表される化合物を以下の手順で還元した。即ち、式（Ｉ）で表される化合物１．６ｇ（６．１ｍｍｏｌ）をｄｒｙ ｈｅｘａｎｅ ２０ｍｌに溶解させ、ｄｒｙ ｉｃｅ／ａｃｅｔｏｎｅ浴中（−７８°Ｃ）で冷却しながら１Ｍの水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）のｈｅｘａｎｅ溶液１６ｍｌ（１６ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下後、１０分撹枠した。反応はＡｒ雰囲気下で行った。Ｍｅｔｈａｎｏｌ ４ｍｌを加え反応を停止した。その後、５％ ＨＣｌ水溶液を加え室温まで戻し、ｅｔｈｅｒにて抽出を行った。抽出液は、水、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒をエバポレータで留去、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅ／ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で精製し、式（ＩＩ）で表される化合物を合成した。収量１．４ｇ（５．９ｍｍｏｌ；９７％）。
（式（Ｘ）で表される化合物の合成）
式（ＩＩ）で表される化合物１．４ｇ（５．９ｍｍｏｌ）をｈｅｘａｎｅ １００ｍｌに溶解し、氷浴中０℃で活性ＭｎＯ２ １６．５ｇを加え、８時間攪拌し酸化した。ろ過後、エバポレータで溶媒を留去し式（Ｘ）で表される化合物を得た。収量１．２ｇ（５．１ｍｍｏｌ；８６％）。
（ＧＣ−ＥＡＤによる確認）
合成した式（Ｘ）で表される化合物についてＧＣ−ＥＡＤによるアッセイを行ったところ、触角上で脱分極が生じ、アズキゾウムシの性誘引フェロモンであることが確認された。
発明の効果
本発明のテルペン化合物は分解されやすく人体に対する害もない。本発明のテルペン化合物を用いて大量の雄成虫を捕獲したり、雌雄の配偶行動を撹乱したりすることができる。Example 1
In the following procedure, the sex attractant pheromone of Azuki beetle was collected and purified, and its structure was identified.
(Azuki beetle breeding)
Azuki beetle was bred using a container made of stainless steel on the upper surface of the tapper for air permeability. Azuki beans (V. angularis, Dainagon) that had been washed once in water and dried overnight were pulled and raised in two layers. During the breeding, the inside of the incubator was maintained at a temperature of 27 ° C., a humidity of 50%, and a dark period for 24 hours. Under this condition, the adult weevil emerged from an adult about 25 days after the egg was laid on the surface of the azuki bean.
(Collecting sex attracting pheromones)
Because weeping weevil females only mate once after emergence at the laboratory level, it is believed that females release sex-induced pheromones only before the first mating. For this reason, azuki beetles were sexed immediately after emergence. The sorted female weevil was placed in one low-height petri dish (outer diameter 90 mm, height 120 mm) for every 300 to 400 individuals. In the waist high petri dish, filter paper (ADVANTEC No. 2, 90 mm) was attached to each of the upper and lower bases, and filter paper folded in a pleated filter paper was stacked on a pile to adsorb the target pheromone. Pheromones were collected for 14-20 days for each petri dish and collected from a total of 32,277 virgin females.
(Extraction)
The filter paper adsorbing the sex attracting pheromone was finely crushed, packed into a cylindrical filter paper (ADVANTEC No. 84, 40 × 150 mm), and extracted with a Soxhlet extractor. The solvent was n-pentane HPLC grade (Aldrich), and the extraction time was 24 hours. The obtained crude extract was adjusted to an amount equivalent to about 1,500 animals per sample to obtain a total of 20 samples S1 to S20.
(concentrated)
Each sample was concentrated with a Kuderna-Danish concentrator. Concentrated to approximately 5 ml and stocked at −30 ° C. until use.
(Purification by open column)
Each sample was concentrated on ice to 1 ml with nitrogen and purified by an open column using silica gel as packing material. The column was a 2 ml pipette and the packing was 1 g Wakogel C-200 (Wako). Solvent was n-pentane, diethyl ether residual agricultural chemical test grade (Kokusan chemical), and stepwise method penten / ether = 10 ml / 0 ml, 9.5 ml / 0.5 ml, 9 ml / 1 ml, 8 ml / 2 ml, 5 ml / 5 ml , 0 ml / 10 ml. For S1, 10 ml of each fraction was collected to obtain a total of 6 fractions of S1-1, S1-2, S1-3, S1-4, S1-5, and S1-6. Fraction was similarly obtained for other samples S2 to S20.
(Screening by GC-EAD)
About 1.5 female samples from each fraction were injected into the GC and screened by GC-EAD.
As GC-EAD (Gas Chromatographic-Electronentronic Detector), HP5890 series II (Agilent) was used, and DB-5 (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm; J & W) was used as a column. The injection was performed by the splitless method, and the sampling time was 1 minute. The GC condition is set to 250 ° C on the injector side (inj), 280 ° C on both the FID and EAD on the detector side (det), the column oven is held at 60 ° C for 3 minutes, and then heated to 280 ° C at 10 ° C / min. Held for 10 minutes. N 2 was used as the carrier gas, and the column head pressure was 145 kPa.
The column was split using a fused silica universal three-way connector (J & W) at the outlet on the detector side. Further, in order to add the carrier gas immediately before the connector, a TCD capillary adapter with make-up gas line (Agilent) was connected, and N 2 was added at 30 ml / min. The line after splitting is discharged through an inert-treated fused silica capillary column (1m x 0.25mm; Alltech), one on the FID port and the other on the column oven via the NPD port. I tried to do it. In order to carry the effluent from the column outlet to the antenna, 300 ml / min of air was flowed. This air was passed through activated carbon, and was humidified by bubbling and cooling with ice.
TL082CP (TEXAS INSTRUMENTS) was used for the operational amplifier, and a high pass filter of 0.5 Hz was used. A ± 15 V constant voltage DC power supply was used for the amplifier. As the electrode, Ag-Cl plating was performed by passing an Ag electrode in a 0.2 M NaCl solution for 30 minutes. A drop of 0.5% NaCl solution was placed on top of it, and an unmated male antennae cut just before the assay was placed. In addition, GC modification for GC-EAD is described in Nojima, S .; et al. , J .; Chem. Ecol. (2003) 29, 321-336. Referred to.
As a result, the activity was observed only in the second fraction (S1-2, S2-2, S3-2,..., S20-2) in any of the samples S1 to S20. Two depolarizations with slightly different retention times were detected in one assay. However, since the degree of purification was low, there were many contaminants, and it was not possible to identify which peak was derived from the pheromone on the FID side.
(Purification by High Performance Liquid Chromatography (HPLC))
As a result of screening by GC-EAD, S1-2 that was active for sample S1 was further purified by HPLC. In advance, the solvent in the fraction was completely distilled off with nitrogen on ice and then dissolved in 100 μl of pentane. The apparatus used was LC-5A (Shimadzu). The detector was SPD-2A and the detection wavelength was 254 nm. Solvents were n-pentane and diethyl ether, and were eluted by a gradient method from pentane 100% to 1% / min until pentane / ether = 50% / 50%. The total flow rate was 1 ml, and 1 ml each was collected.
For S1-2, 50 fractions from S1-2-1 to S1-2-50 were collected and each fraction was screened by GC-EAD. As a result, the activity was concentrated in the vicinity of S1-2-21 to 23. Samples S2-2 to S20-2 were similarly purified and screened. As a result, the activity was concentrated in the fractions 21 to 23 of each sample.
Since the degree of purification was improved by HPLC purification, fractions 21 to 23 of each sample were compared with the EAD signal on FID obtained by GC, and two pheromone-derived peaks could be identified, and each could be fractionated into separate fractions. did it. (Hereinafter referred to as pheromones A and B from the earlier retention time on the FID of GC).
(Analysis by GC-EI-MS)
GC-EI-MS analysis of each pheromone A and B fraction was performed. The apparatus used was QP5000 (Shimadzu Corporation). The column used was DB-5 (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm; J & W). The inj and det temperatures were 250 ° C. and 280 ° C., respectively, and the oven temperature was held at 60 ° C. for 3 minutes, and then a temperature increase program up to 280 ° C. at 10 ° C./min was used. The carrier gas was He, and the column head pressure was 100 kPa. The injection method was a splitless method, and the sampling time was 1 minute.
As a result, no remarkable molecular ion peak (M + ) could be detected in either pheromone. Regarding the pattern of fragment ions, there was no significant difference in the pattern between pheromones A and B. In addition, as a result of the similarity search in the NIST library, a high degree of similarity was shown to terpene compounds such as farnesol and citral. From the above, it was suggested that pheromone is a terpene compound.
(Analysis by GC-CI-MS)
Next, in order to determine molecular weight, GC-CI-MS analysis of each fraction was performed.
The apparatus was measured by QP2010 (Shimadzu Corporation). The column used was DB-5 (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm; J & W). The temperatures of inj and det were 250 ° C. and 280 ° C., respectively, and the temperature of the oven was maintained at 60 ° C. for 3 minutes, and then a temperature increase program up to 280 ° C. at 10 ° C./min was used. The carrier gas was He, and the column head pressure was 100 kPa. Iso-butane was used as the reaction gas.
As a result, a molecular ion peak of M + +1 was detected at m / z = 235 in both pheromones. A prominent fragment peak expected to be M + -H 2 O was detected at m / z = 217. From the above results, it was found that the molecular weights of pheromones A and B were 234, and it was estimated that the structure had —OH, —CHO, or both. As described above, pheromone A and B were estimated to be isomers from the results of GC-CI-MS and GC-EI-MS. Therefore, pheromone A was analyzed below.
(Purification by GC)
In order to perform further analysis such as derivatization and NMR, purification was performed by GC. The apparatus was HP5890 series II (Agilent), and the column was ZB-1 (30 m × 0.53 mm, 1.50 μm; Phenomenex). The injection was performed by the splitless method, but an injection liner having a capacity of 900 μl was used to increase the injection volume. The sampling time was 2 minutes. The column was connected to a fused silica universal two-way connector (J & W) on the detector side, and an inert treated fused silica capillary column (40 cm × 0.53 mm; Agilent) was connected to the collector. Then, the column was pulled up at the desired retention time, covered with a sheath cooled with ice, held on the column, and eluted with a solvent. The GC condition was set to 250 ° C. on the inj side and 150 ° C. on the det side, and the column oven was held at 60 ° C. for 3 minutes, then heated to 280 ° C. at 10 ° C./min and held for 10 minutes. The carrier gas was N 2 and the column head pressure was 2 psi. The GC sorting method is described in Nojima, S .; et al. , J .; Chem. Ecol. (2004) 30, 2153-2161. Referred to.
Among the fractions containing pheromone A, fractions with few impurities were selected in the vicinity of the pheromone-derived peak on the chromatogram obtained from FID, and collected into one fraction. At that time, in the case of pentane and ether, the solvent was distilled off during the operation, and thus the solvent was replaced with distilled n-hexane (Aldrich). As a result of sampling according to the retention time measured in advance for pheromone A, a single peak of pheromone could be obtained.
(Analysis by 1 H-NMR)
Pheromone A purified by GC was analyzed by 1 H-NMR. The apparatus was measured using JNM-ECA 400 MHz (JEOL). CDCl 3 was used as a solvent using a micro sample tube. As a result, doublet (1H) derived from formyl group protons was detected at 9.90 ppm. However, since the amount of pheromone that could be used for the analysis was as small as about several μg, the number of signals derived from contaminants increased especially on the high magnetic field side, making it difficult to assign the signal alone.
Therefore, 1 H-NMR analysis data were collected and considered from literatures such as pheromones derived from other species of terpene series that were predicted to have similar structures from the information obtained so far and juvenile hormones. As a result, the signals obtained this time were assigned as follows.
A triplet (3H) derived from a terminal methyl proton in the case of having an ethyl side chain at the 7-position or the 11-position at 0.95 ppm was detected, and a triplet (2H) derived from a methylene group proton at the γ-position was detected at 2.60 ppm. And the multiplet (2H) derived from the 6th and 10th position vinyl protons was detected at 5.05 to 5.14 ppm, and the doublet (1H) derived from the 2nd position vinyl proton was detected at 5.87 ppm. From these results, the estimated structure of pheromone A is presumed to be 3,7,11-trimethyl-2,6,10-tridecatrial, or 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrial. It was done.
(Analysis by derivatization)
Derivative treatment was performed on pheromone A purified by GC, and analysis was performed by GC-EI-MS. The conditions of GC-EI-MS were measured in the same manner as described above.
TMS was added pheromone in 100 μl BSA (N, O-bis (trimethylsilyl) acetamide) and incubated at 60 ° C. for 12 hours. As a result, no reaction occurred. From the results of acetylation and TMS conversion, it was found that the structure of pheromone A does not have —OH.
Next, in order to confirm the presence or absence of —CHO in the structure, pheromone A was added to 50 μg N, N-dimethylhydrazine in 50 μl hexane, and the mixture was stirred to form dimethylhydrazone. As a result, a molecular ion peak of M + +42 was detected at m / z = 276. As a result, it was found that the structure of pheromone A has —CHO. A prominent fragment peak was detected at m / z = 125.
It was reported that a significant fragment peak was detected at m / z = 111 by cleavage at the allylic position in linear α, β-unsaturated aldehydes, so methyl at the β-position with α, β-unsaturated aldehydes was reported. The same treatment was performed using citral having a side chain. As a result, a prominent fragment peak was detected at m / z = 125, which was 14 more than m / z = 111 due to the linear α, β-unsaturated aldehyde, similarly by cleavage at the allylic position. From this result, it was estimated that the terminal structure of pheromone A is an α, β-unsaturated aldehyde and has a methyl side chain at the β-position. In addition, since the pheromone structure does not have —OH and has only —CHO, the number of Os in the molecule is expected to be one, and the molecular weight is 234. Thus, it was found that there were four unsaturated bonds in the structure.
Ozone oxidation 50 μl of hexane containing pheromone A was cooled to −78 ° C. in a dry ice / acetone bath, and oxygen gas was blown at 3 ml / min, and 10 to 10 using Tesla lamp checker HF-20 (Shinko Denki). A high voltage of 15 kV was applied for 20 seconds. Thereafter, 1 μl of a dichloromethane solution of triphenylphosphine (1 μg / μl) was added and stirred to carry out ozone oxidation.
Attention was paid to two types of products having a relatively large molecular weight among products expected when the respective estimated structures were subjected to ozone oxidation treatment. From 3,7,11-trimethyl-2,6,10-tridecatrial, only 4-oxopental (MW100) is generated, but from 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-decatatrial, 4-oxentananal And 4-oxohexanal (MW114). When pheromone A was ozone-oxidized in the hope that this difference would occur, 4-oxopental with m / z = 100 could not be detected due to a small sample amount, but 4-oxohexanal with m / z = 114 was detected. . This 4-oxohexanal is not generated from 3,7,11-trimethyl-2,6,10-tridecatrial, but is generated only from 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-decatatrial. From the above results, it was found that the structure of pheromone A is 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatenial represented by the formula (X).
Example 2
The compound represented by formula (X) was synthesized by the following procedure. The compound of formula (II), the compound of formula (I), and the compound of formula (X) are as follows.
Compound represented by formula (I): methyl 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dedecatrienoate
Compound represented by formula (II): 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-ol
Compound represented by formula (X): 7-ethyl-3,11-dimethyl-2,6,10-dodecatrial
(Synthesis of the compound represented by the formula (I))
The compound represented by the formula (I) was prepared with reference to the method of Mori et al. (Mori, K. et al., Agri. Biol. Chem. (1971) 35, 1116-1127.).
(Synthesis of a compound represented by the formula (II))
The compound represented by formula (I) was reduced by the following procedure. That is, 1.6 g (6.1 mmol) of the compound represented by the formula (I) was dissolved in 20 ml of dry hexane and cooled in a dry ice / acetone bath (−78 ° C.) with 1M diisobutylaluminum hydride ( 16 ml (16 mmol) of a hexane solution of DIBAL-H) was added dropwise. After dropping, the mixture was stirred for 10 minutes. The reaction was performed in an Ar atmosphere. The reaction was stopped by adding 4 ml of methanol. Then, 5% HCl aqueous solution was added, and it returned to room temperature, and extracted by ether. The extract was washed with water, saturated NaHCO 3 aqueous solution, saturated NaCl aqueous solution, dried over MgSO 4 , the solvent was distilled off with an evaporator, and the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane / ethyl acetate). The compound represented by this was synthesized. Yield 1.4 g (5.9 mmol; 97%).
(Synthesis of the compound represented by the formula (X))
1.4 g (5.9 mmol) of the compound represented by the formula (II) was dissolved in 100 ml of hexane, and 16.5 g of active MnO 2 was added at 0 ° C. in an ice bath, followed by stirring for 8 hours to oxidize. After filtration, the solvent was distilled off with an evaporator to obtain a compound represented by the formula (X). Yield 1.2 g (5.1 mmol; 86%).
(Confirmation by GC-EAD)
When the synthesized compound represented by the formula (X) was assayed by GC-EAD, depolarization occurred on the antenna and it was confirmed that it was a sex attractant pheromone of Azuki beetle.
Effect of the Invention The terpene compound of the present invention is easily decomposed and causes no harm to the human body. A large amount of adult males can be captured using the terpene compound of the present invention, or the mating behavior of males and females can be disturbed.
本発明のテルペン化合物は、アズキゾウムシの発生予測調査へ利用したり、交信撹乱剤などに利用することができる。 The terpene compound of the present invention can be used for investigation of the occurrence of azuki bean weevil, or a communication disrupter.
Claims (3)
下記式（Ｘ）
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| KR101963974B1 (en) * | 2017-10-12 | 2019-03-29 | 경상대학교산학협력단 | Synthetic process of the sex pheromone of Callosobruchus chinensis, and development of attraction trap using the pheromone |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60222434A (en) * | 1984-04-17 | 1985-11-07 | Kuraray Co Ltd | Preparation of (2e,6e)-3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-al |
-
2006
- 2006-11-22 JP JP2007511119A patent/JP4512133B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-22 WO PCT/JP2006/324036 patent/WO2007061132A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60222434A (en) * | 1984-04-17 | 1985-11-07 | Kuraray Co Ltd | Preparation of (2e,6e)-3,7,11-trimethyl-2,6,10-dodecatrien-1-al |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6010023264, Ｄｉｗａｎ Ｓ． ＲＡＷＡＴ ｅｔ ａｌ．, Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ, 2002, ４（１８）, ｐｐ．３０２７−３０３０ * |
| JPN6010023265, Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｅ． ＳＥＮ ｅｔ ａｌ．, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 1997, ６２（１１）, ｐｐ．３５２９−３５３６ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4512133B2 (en) | 2010-07-28 |
| WO2007061132A1 (en) | 2007-05-31 |
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