JPWO2006085411A1 - Novel adjuvants for raising immune responses and use thereof - Google Patents

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松本　美佐子
美佐子 松本
忠志 辻田
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Abstract

本発明は、免疫応答を惹起するためのアジュバントおよびその利用に関するものである。１つの局面において、本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバントを提供する。他の局面において、本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むワクチン組成物を提供する。The present invention relates to an adjuvant for eliciting an immune response and use thereof. In one aspect, the present invention provides an adjuvant comprising an rtTLR5S polypeptide or an rtTLR5S polynucleotide. In another aspect, the invention provides a vaccine composition comprising an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide or rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component.

Description

本発明は、免疫応答を惹起するためのアジュバントおよびその利用に関するものである。  The present invention relates to an adjuvant for eliciting an immune response and use thereof.

マクロファージや樹状細胞などの自然免疫担当細胞は、ウイルスおよび／または細菌に対する初期の免疫応答に関与する微生物レセプターと呼ばれるレセプターファミリーを介して外来異物を識別し、サイトカインの放出および／または副刺激分子の発現を誘導してリンパ球を活性化する。  Innate immune cells such as macrophages and dendritic cells identify foreign substances through a family of receptors called microbial receptors involved in the initial immune response against viruses and / or bacteria, and release of cytokines and / or costimulatory molecules Induces the expression of and activates lymphocytes.

Ｔｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）において発生と免疫の両者に関与する膜タンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ Ｔｏｌｌ）のホモログであり、微生物レセプターの１つである。ＴＬＲは、ヒトでは１０種類、マウスでは１２種類見つかっており、これらは、ＴＬＲファミリーと呼ばれる一群のレセプターファミリーを形成している。  Toll-like receptor (TLR) is a homologue of a membrane protein (Drosophia Toll) involved in both development and immunity in Drosophila and is one of microbial receptors. Ten types of TLRs have been found in humans and 12 types in mice, and they form a group of receptor families called TLR families.

ＴＬＲは、外来性物質を認識し、全身性様式でクリアランスおよび免疫応答を惹起する（非特許文献１を参照のこと）。免疫応答に重要なＮＦ−κＢ活性化経路およびＩ型ＩＦＮ産生経路は、通常、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と称される細菌性構成物に応答して活性化される（非特許文献２を参照のこと）。ＴＬＲは、ｃａｔｃｈ−ｕｐレセプター（オプソニンレセプターなど）とともに自然免疫（先天性免疫）系に関与するシグナル伝達レセプターであり、ＴＬＲシグナルは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む獲得免疫（後天性免疫）系の活性化よりも先に生じる。自然免疫系（ＴＬＲを含む）は脊椎動物および無脊椎動物全てにおいて存在する。そのため、ＴＬＲの機能的特性は、ヒトおよびマウスにおいて広範に調べられている。これらの研究は、総じてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの相同物と比較されているが、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＴｏｌｌファミリータンパク質の機能的特性は、ヒトまたはマウスのものとはかなり異なっている（非特許文献３を参照のこと）。また、下等脊椎動物におけるＴＬＲの機能的特性は未だ報告されていない。  TLRs recognize foreign substances and elicit clearance and immune responses in a systemic manner (see Non-Patent Document 1). The NF-κB activation pathway and type I IFN production pathway important for immune responses are usually activated in response to bacterial constituents called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) (see Non-Patent Document 2). See TLR is a signal transduction receptor involved in innate immunity (innate immunity) system together with catch-up receptor (such as opsonin receptor), and TLR signal is acquired immunity (acquired immunity) including T lymphocytes and B lymphocytes. Occurs prior to system activation. The innate immune system (including TLRs) exists in all vertebrates and invertebrates. Therefore, the functional properties of TLRs have been extensively investigated in humans and mice. Although these studies are generally compared to Drosophila homologs, the functional properties of Drosophila Toll family proteins are quite different from those of humans or mice (see Non-Patent Document 3). In addition, the functional properties of TLRs in lower vertebrates have not yet been reported.

ヒトにおいて、ＴＬＲファミリーの１０個のメンバー（ＴＬＲ１〜１０）が同定されている（非特許文献１〜４を参照のこと）。全てのＴＬＲが、Ｃ末端領域に隣接するロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む細胞外ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプターホモロジードメイン（ＴＩＲ））を有している（非特許文献１〜４を参照のこと）。各ＴＩＲが、異なるリガンドを認識し、異なる（しかし時折重複する）免疫応答を惹起する（非特許文献２を参照のこと）。主要な抗原提示細胞である樹状細胞（ＤＣ）において、種々の免疫応答がＴＬＲを介して誘導される（非特許文献１を参照のこと）。抗原提示細胞は、最初に外来物質に遭遇してリンパ球に提示するためにその抗原をマウントする。ＤＣの活性化は、ＴＬＲ、およびＴＬＲのＴＩＲドメインを結合するアダプターによって差示的に調節され、適切なシグナル伝達経路を選択しそして出力を生じる（非特許文献２を参照のこと）。  In humans, 10 members of the TLR family (TLR1-10) have been identified (see Non-Patent Documents 1-4). All TLRs have an extracellular domain containing a leucine rich repeat (LRR) adjacent to the C-terminal region and an intracellular signaling domain (Toll / IL-1 receptor homology domain (TIR)) (non-patented) See references 1-4). Each TIR recognizes a different ligand and elicits a different (but occasionally overlapping) immune response (see Non-Patent Document 2). In dendritic cells (DC) which are major antigen-presenting cells, various immune responses are induced via TLR (see Non-Patent Document 1). Antigen presenting cells first mount their antigen to encounter foreign material and present it to lymphocytes. DC activation is differentially regulated by TLRs and adapters that bind the TIR TIR domain to select appropriate signaling pathways and produce output (see Non-Patent Document 2).

フグ（Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）ゲノムプロジェクトによると、ＴＩＲドメインの特性は進化を超えて保存されている（非特許文献５を参照のこと）。ヒトと比較した場合の主要な３つの差異が、フグＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｆｇＴＬＲ）において同定された：（１）魚類にはＴＬＲ５の可溶性形態が存在するが、ヒトには存在しない；（２）魚類においてＴＬＲ４オルソログは同定されなかった；および、（３）ＴＬＲ２１およびＴＬＲ２２と名付けられたＴＬＲが魚類において新規に見出され、これらは魚類に特異的であった。ｆｇＴＬＲ２、ｆｇＴＬＲ３、ｆｇＴＬＲ５、ｆｇＴＬＲ７、ｆｇＴＬＲ８およびｆｇＴＬＲ９は、哺乳動物ＴＬＲのｆｇＴＬＲ２、ｆｇＴＬＲ３、ｆｇＴＬＲ５、ｆｇＴＬＲ７、ｆｇＴＬＲ８およびｆｇＴＬＲ９と構造的に対応する。ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ２１およびＴＬＲ２２が、魚類および哺乳動物の両方で、共通の祖先ゲノムにおいて存在すると解釈され得る。ＴＬＲ４は、魚類系統において欠損するが、ＴＬＲ２１およびＴＬＲ２２は、哺乳動物系統において欠損する。唯一ホヤ類（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）が、３つの推定のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅタンパク質を有し、このＴｏｌｌ−ｌｉｋｅタンパク質は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ Ｔｏｌｌと同様に、Ｔｏｌｌファミリーに広がる前の原始形態を示す（非特許文献６および７を参照のこと）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは９つのＴＬＲを有し、これらの機能的特性は、ほとんどがボディパタニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）および宿主防御に関する（非特許文献８を参照のこと）。最近の証拠は、ＴＬＲ遺伝子の発生は魚類の発生より早いがホヤ類の発生より遅く、哺乳動物とは分かれているということを示唆する。種々の調査の結果は、哺乳動物の自然免疫系が、獲得免疫のアセンブリより前またはそれと同時に確立されたということを結論付ける。  According to the Fugue rubripes genome project, the properties of TIR domains are conserved across evolutions (see Non-Patent Document 5). Three major differences compared to humans were identified in the puffer fish Toll-like receptor (fgTLR): (1) soluble forms of TLR5 are present in fish but not in humans; (2) TLR4 orthologs were not identified in fish; and (3) TLRs named TLR21 and TLR22 were newly found in fish and were specific for fish. fgTLR2, fgTLR3, fgTLR5, fgTLR7, fgTLR8 and fgTLR9 structurally correspond to the mammalian TLRs fgTLR2, fgTLR3, fgTLR5, fgTLR7, fgTLR8 and fgTLR9. TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, TLR21 and TLR22 can be interpreted to be present in a common ancestral genome in both fish and mammals. TLR4 is deficient in fish strains, whereas TLR21 and TLR22 are deficient in mammalian strains. The only squirt (Ciona intestinalis) has three putative Toll-like proteins, and this Toll-like protein, like Caenorhabditis elegans Toll, shows a primitive form before spreading into the Toll family (Non-patent Document 6) And 7). Drosophila has nine TLRs, and these functional properties are mostly related to body patterning and host defense (see Non-Patent Document 8). Recent evidence suggests that TLR gene development is earlier than fish development but later than ascidian development and separate from mammals. The results of various studies conclude that the mammalian innate immune system was established before or at the same time as the assembly of acquired immunity.

本発明者らは、ニジマスが、ｆｇＴＬＲ５Ｓに類似する２つのＴＬＲアイソフォーム（膜結合形態（ＴＬＲ５Ｍ）および可溶性形態（ＴＬＲ５Ｓ））を有することを見出している（非特許文献９を参照のこと）。しかし、魚類ＴＬＲの機能的特性に関する情報はほとんど得られていない。
Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，１３５−１４５ Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４９９−５１１ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ，Ｊ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，１２１−１２６ Ａｋｉｒａ，Ｓ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３８１０５−３８１０８ Ｏｓｈｉｕｍｉ，Ｈ．，Ｔｓｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｉｋｅｏ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓｅｙａ，Ｔ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４，７９１−８００ Ａｚｕｍｉ，Ｋ．，Ｄｅ Ｓａｎｔｉｓ，Ｒ．，Ｄｅ Ｔｏｍａｓｏ，Ａ．，Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓ，Ｉ．，Ｙｏｓｈｉｚａｋｉ，Ｆ．，Ｐｉｎｔｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｒｉｎｏ，Ｒ．，Ｓｈｉｄａ，Ｋ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．，Ａｒａｉ，Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．，Ｓａｔｏｈ，Ｎ．，Ｒｏｋｈｓａｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｄｕ Ｐａｓｑｕｉｅｒ，Ｌ．，Ｋａｓａｈａｒａ，Ｍ．，Ｓａｔａｋｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｎｏｎａｋａ，Ｍ．（２００３）Ｉｍｍｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５５，５７０−５８１ Ｐｕｊｏｌ，Ｎ．，Ｌｉｎｋ，Ｅ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｌ．Ｘ．，Ｋｕｒｚ，Ｃ．Ｌ．，Ａｌｌｏｉｎｇ，Ｇ．，Ｔａｎ，Ｍ．Ｗ．，Ｒａｙ，Ｋ．Ｐ．，Ｓｏｌａｒｉ，Ｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ Ｅｗｂａｎｋ，Ｊ．Ｊ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１，８０９−８２１ Ｉｍｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１，３０４−３１１ Ｔｓｕｋａｄａ，Ｈ．，Ｏｓｈｉｕｍｉ，Ｈ．，Ｆｕｋｕｉ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓｅｙａ，Ｔ．（２００１）Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，１０２（ａｂｓｔｒ．）。 The present inventors have found that rainbow trout has two TLR isoforms similar to fgTLR5S (membrane-bound form (TLR5M) and soluble form (TLR5S)) (see Non-Patent Document 9). However, little information is available on the functional properties of fish TLRs.
Medzitov, R.M. (2001) Nat. Rev. Immunol. 1,135-145 Akira, S.A. , And Takeda, K .; (2004) Nat. Rev. Immunol. 4,499-511 Hoffmann, J.M. A. , And Reichhard, J .; M.M. (2002) Nat. Immunol. 3, 121-126 Akira, S.A. (2003) J. Org. Biol. Chem. 278, 38105-38108 Oshiumi, H .; Tsujita, T .; , Shida, K .; Matsumoto, M .; Ikeo, K .; , And Seya, T .; (2003) Immunogenetics 54, 791-800 Azumi, K .; , De Santis, R.A. De Tomaso, A .; Rigoutos, I .; Yoshizaki, F .; Pinto, M .; R. Marino, R .; , Shida, K .; Ikeda, M .; Ikeda, M .; Arai, M .; Inoue, Y .; Shimizu, T .; , Satoh, N .; Rochsar, D .; S. , Du Pasquier, L .; , Kasahara, M .; Satake, M .; , And Nonaka, M .; (2003) Immunogenics 55, 570-581 Pujol, N .; Link, E .; M.M. Liu, L .; X. Kurz, C .; L. Alloing, G .; Tan, M .; W. Ray, K .; P. , Solari, R .; Johnson, C .; D. , And Ewbank, J.M. J. et al. (2001) Curr. Biol. 11,809-821 Imler, J.M. L. , And Hoffmann, J .; A. (2001) Trends Cell Biol. 11,304-311 Tsukada, H .; Oshiumi, H .; , Fukui, A .; Matsumoto, M .; , And Seya, T .; (2001) Jpn. Soc. Mol. Biol. 16, 102 (abstr.).

本発明者らは、ニジマスにおけるＴＬＲ５様タンパク質についてその特性を調べたところ、ニジマスの有する２つのＴＬＲ５の形態は、細菌の鞭毛タンパク質であるフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識することを見出した。本発明者らはさらに、ニジマスにおけるＴＬＲ５依存性免疫応答を調べたところ、２段階のフラジェリン応答が、サカナにおける細菌感染に対する宿主防御のために生じることを見出した：（ａ）フラジェリンは先ず膜ＴＬＲ５を介してＮＦ−κＢの基本的な活性化を誘導し、可溶性ＴＬＲ５および最小限の急性期タンパク質の産生を容易にした；（ｂ）誘導可能な可溶性ＴＬＲ５が、ポジティブフィードバック様式で、膜ＴＬＲ５媒介性細胞応答を増幅する。また、より詳細な検討を重ねた結果、ニジマスの可溶性ＴＬＲ５はフラジェリンに結合し、ニジマスの膜ＴＬＲ５だけでなくヒトのＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５）を媒介するＮＦ−κＢ活性化を顕著に増強することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ニジマス内におけるＴＬＲ５関連シグナル伝達の制御機構を明らかにしたにとどまらず、ニジマスタンパク質が種を越えてヒトにおいても機能するという、従来予想し得なかった画期的な効果を奏することが見出されたことに基づいて完成されたものである。このように、本発明は、種を越えて機能する、ＴＬＲ５シグナル伝達の増強因子として作動し得る魚類可溶性形態のＴＬＲ５およびその利用に関するものである。  When the present inventors investigated the characteristic about TLR5-like protein in rainbow trout, it discovered that two forms of TLR5 which rainbow trout has recognized flagellin (flagellin) which is a bacterial flagellar protein. The inventors further examined the TLR5-dependent immune response in rainbow trout and found that a two-stage flagellin response occurs due to host defense against bacterial infection in fish: (a) Flagellin is first a membrane TLR5. Induced basic activation of NF-κB, facilitating the production of soluble TLR5 and minimal acute phase proteins; (b) Inducible soluble TLR5 is membrane TLR5-mediated in a positive feedback manner Amplify sex cell response. Furthermore, as a result of repeated detailed studies, it was found that rainbow trout soluble TLR5 binds to flagellin and remarkably enhances not only rainbow trout membrane TLR5 but also human TLR5 (huTLR5) NF-κB activation. The present invention has been completed. That is, the present invention not only elucidated the control mechanism of TLR5-related signal transduction in rainbow trout, but also an epoch-making effect that could not be expected in the past, that rainbow trout proteins function across species. It was completed based on what was found to play. Thus, the present invention relates to a fish soluble form of TLR5 that functions across species and can act as a potentiator of TLR5 signaling and uses thereof.

本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むことを特徴としている。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。  The adjuvant according to the present invention is characterized in that it contains an rtTLR5S polypeptide. In the present invention, the rtTLR5S polypeptide is a polypeptide having rtTLR5S activity, and is (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted, substituted or added is preferred. In the present invention, the polypeptide having rtTLR5S activity is (1) a polypeptide consisting of positions 29 to 597 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (2) 29 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It may be a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added at the position ˜597.

本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。  The adjuvant according to the present invention preferably further comprises an rtTLR5M polypeptide. In the present invention, the rtTLR5M polypeptide is a polypeptide having rtTLR5M activity, and is (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted, substituted or added is preferred. In the present invention, the polypeptide having rtTLR5M activity is (1) a polypeptide consisting of positions 21 to 596 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or (2) 21 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. It may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added at position 596.

本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。  The adjuvant according to the present invention is characterized by containing an rtTLR5S polynucleotide. In the present invention, the rtTLR5S polynucleotide is a polynucleotide that encodes a polypeptide having rtTLR5S activity, and is (1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (2) a base represented by SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added; (3) one or several bases in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1; A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a deleted, inserted, substituted, or added nucleotide sequence, or (4) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. At least 80% identical, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 9 %, 97%, is preferably a polynucleotide, consisting of 98% or 99% identical to a nucleotide sequence.

本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であっても、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位からなるポリペプチド、または、（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。  The adjuvant according to the present invention preferably further comprises an rtTLR5M polynucleotide. In the present invention, the rtTLR5M polynucleotide is a polynucleotide that encodes a polypeptide having rtTLR5M activity, and is (1) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and (2) a base shown in SEQ ID NO: 3. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added; (3) one or several bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3; A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a deleted, inserted, substituted, or added nucleotide sequence, or (4) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 At least 80% identical, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 9 %, 97%, is preferably a polynucleotide, consisting of 98% or 99% identical to a nucleotide sequence. In the present invention, the polypeptide having rtTLR5M activity is (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or (2) one or several in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. (3) a polypeptide consisting of positions 21 to 596 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or (3) a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the amino acid is deleted, inserted, substituted or added 4) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added at positions 21 to 596 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 may be used.

本発明に係るアジュバントは、注入可能な形態であることが好ましい。  The adjuvant according to the present invention is preferably in an injectable form.

本発明に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。  The vaccine composition according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component.

本発明に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。  In the vaccine composition according to the present invention, the immunogenic component preferably contains a polynucleotide encoding an antigenic peptide.

本発明に係るワクチン組成物において、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましい。  In the vaccine composition according to the present invention, the antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium.

本発明に係るワクチン組成物において、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。  In the vaccine composition according to the present invention, the polynucleotide is preferably a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7.

本発明に係るワクチン組成物において、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。  In the vaccine composition according to the present invention, the adjuvant component preferably further contains an rtTLR5M polynucleotide.

本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。  The vaccine composition according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polynucleotide. The vaccine composition according to the present invention may include a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

本発明に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。  The vaccine composition according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing the rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of the immunogenic component.

本発明に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。  In the vaccine composition according to the present invention, the immunogenic component preferably contains an antigenic peptide.

本発明に係るワクチン組成物において、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であってもよい。  In the vaccine composition according to the present invention, the antigenic peptide may be flagellar bacteria.

本発明に係るワクチン組成物において、上記抗原性ペプチドは、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。  In the vaccine composition according to the present invention, the antigenic peptide may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8.

本発明に係るワクチン組成物において、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。  In the vaccine composition according to the present invention, the adjuvant component preferably further contains an rtTLR5M polypeptide.

本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでもよい。  The vaccine composition according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polypeptide. The vaccine composition according to the present invention may contain huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of the huTLR5 polypeptide.

本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。  The vaccine kit according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。  In the vaccine kit according to the present invention, the immunogenic component preferably contains a polynucleotide encoding an antigenic peptide.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であってもよい。  In the vaccine kit according to the present invention, the antigenic peptide may be flagellar bacteria.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記ポリヌクレオチドは、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。  In the vaccine kit according to the present invention, the polynucleotide may be a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。  In the vaccine kit according to the present invention, the adjuvant component preferably further includes an rtTLR5M polynucleotide.

本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。  The vaccine kit according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polynucleotide. The vaccine composition according to the present invention may include a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。  The vaccine kit according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing an rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of an immunogenic component.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。  In the vaccine kit according to the present invention, the immunogenic component preferably contains an antigenic peptide.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましい。  In the vaccine kit according to the present invention, the antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記抗原性ペプチドは、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。  In the vaccine kit according to the present invention, the antigenic peptide is preferably a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8.

本発明に係るワクチン用キットにおいて、上記アジュバント成分は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。  In the vaccine kit according to the present invention, the adjuvant component preferably further contains an rtTLR5M polypeptide.

本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。  The vaccine kit according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polypeptide. The vaccine composition according to the present invention may comprise huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of the huTLR5 polypeptide.

本発明に係る薬学的組成物は、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。  The pharmaceutical composition according to the present invention is characterized in that it contains an adjuvant component containing an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component to prevent cancer or infection.

本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。  The pharmaceutical composition according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polynucleotide. The pharmaceutical composition according to the present invention may comprise a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

本発明に係る薬学的組成物は、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含むことを特徴としている。  The pharmaceutical composition according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing an rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of an immunogenic component to prevent cancer or infection.

本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含むことが好ましい。本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでもよい。  The pharmaceutical composition according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polypeptide. The pharmaceutical composition according to the present invention may comprise huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of huTLR5 polypeptide.

本発明に係るキットは、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。  The kit according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component in order to prevent cancer or infection.

本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。  The kit according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polynucleotide. The kit according to the present invention may include a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

本発明に係るキットは、ガンまたは感染症を予防するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えていることを特徴としている。  The kit according to the present invention is characterized by comprising an adjuvant component containing an rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of an immunogenic component in order to prevent cancer or infection.

本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていることが好ましい。本発明に係るキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。  The kit according to the present invention preferably further comprises a huTLR5 polypeptide. The kit according to the present invention may comprise huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of the huTLR5 polypeptide.

本発明に係る検出薬は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。  The detection agent according to the present invention is characterized by containing an rtTLR5S polynucleotide in order to detect flagellar bacteria in a subject sample.

本発明に係る検出薬は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むことを特徴としている。  The detection agent according to the present invention is characterized by containing an rtTLR5S polypeptide in order to detect flagellar bacteria in a subject sample.

本発明に係る検出キットは、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。  The detection kit according to the present invention is characterized by comprising an rtTLR5S polynucleotide in order to detect flagellar bacteria in a subject sample.

本発明に係る検出キットは、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを備えていることを特徴としている。  The detection kit according to the present invention is characterized by comprising an rtTLR5S polypeptide in order to detect flagellar bacteria in a subject sample.

本発明に係る検出方法は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを導入した細胞を、被験体サンプルとインキュベートする工程を包含することを特徴としている。  The detection method according to the present invention includes a step of incubating a cell into which a rtTLR5S polynucleotide has been introduced with a subject sample in order to detect flagellar bacteria in the subject sample.

本発明に係る検出方法は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを、被験体サンプルから単離した血球細胞とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。  The detection method according to the present invention includes a step of incubating an rtTLR5S polypeptide with blood cells isolated from a subject sample in order to detect flagellar bacteria in the subject sample.

本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明に明白になるであろう。  Other objects, features, and advantages of the present invention will be fully understood from the following description. The advantages of the present invention will be apparent from the following description with reference to the accompanying drawings.

ｒｔＴＬＲ５Ｍを単離するための縮重プライマーの設計を示した図である。FIG. 5 shows the design of degenerate primers for isolating rtTLR5M. ｒｔＴＬＲ５ＭおよびｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ配列に基づく推定のアミノ酸配列の整列を示した図である。FIG. 5 shows the alignment of deduced amino acid sequences based on the rtTLR5M and rtTLR5S cDNA sequences. ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのドメイン配向を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the domain orientation of rtTLR5S and rtTLR5M. ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの組織分布を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示した図である。It is the figure which showed the result of RT-PCR which shows the tissue distribution of rtTLR5S and rtTLR5M. ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのエクソン−イントロン構造を示した図である。It is the figure which showed the exon-intron structure of rtTLR5S and rtTLR5M. プローブＳによって検出したサザン分析の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the Southern analysis detected by the probe S. プローブＭによって検出したサザン分析の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the Southern analysis detected by the probe M. 死菌Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍでの細胞刺激後のｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βのｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに対するＲＴＨ−１４９細胞の応答を示した図である。Dead bacteria V. rtTLR5M, rtTLR5S and rtIL-1β mRNA after cell stimulation with angulararum was monitored by RT-PCR, It is the figure which showed the response of RTH-149 cell with respect to anguillarum. 精製したＧＳＴ融合フラジェリン（ＧＳＴ−ＦｌａＡおよびＧＳＴ−ＦｌａＣ）を示した図である。It is the figure which showed the purified GST fusion flagellin (GST-FlaA and GST-FlaC). ＧＳＴをトロンビン消化して除去したｒＦｌａＡおよびｒＦｌａＣを示した図である。It is the figure which showed rFlaA and rFlaC which removed GST by thrombin digestion. ｒＦｌａＡで刺激したＲＴＨ−１４９細胞およびＲＴＧ−２細胞におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。The results of RT-PCR in RTH-149 cells and RTG-2 cells stimulated with rFlaA are shown. 誘導性ｒｔＴＬＲ５Ｓの定量的ＰＣＲ分析を示した図である。FIG. 6 shows quantitative PCR analysis of inducible rtTLR5S. Ｈｅｌａ形質転換体におけるＳ−キメラのシグナル伝達を示す。Ｈｅｌａ Ｓ−キメラ形質転換体およびｈｕＴＬＲ５形質転換体におけるＮＦ−κＢ活性を測定するためのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示した図である。Figure 3 shows S-chimera signaling in Hela transformants. It is the figure which showed the result of the luciferase reporter gene assay for measuring NF- (kappa) B activity in a Hela S-chimeric transformant and a huTLR5 transformant. Ｈｅｌａ Ｓ−キメラ形質転換体を種々のＴＬＲリガンドで刺激した際のルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the luciferase reporter gene assay when stimulating a Hela S-chimeric transformant with various TLR ligands. Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左）およびＨｅｌａ細胞（右）におけるＮＦ−κＢ活性測定についてのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示した図である。It is the figure which showed the result of the luciferase reporter gene assay about the NF- (kappa) B activity measurement in the CHO cell (left) and Hela cell (right) which express M-chimera. Ｍ−キメラまたはｈｕＴＬＲ５を発現する細胞を種々のＴＬＲリガンドで刺激した結果を示した図である。It is the figure which showed the result of having stimulated the cell which expresses M-chimera or huTLR5 with various TLR ligands. Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左パネル）またはＨｅｌａ細胞（右パネル）において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現細胞の上清を添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を示した図である。It is the figure which showed the effect of flagellin-dependent NF- (kappa) B activation by adding the supernatant of a rtTLR5S expression cell in the CHO cell (left panel) or Hela cell (right panel) which expresses an M-chimera. 精製したＨｉｓタグ化ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンと結合することを示した図である。FIG. 5 shows that purified His-tagged rtTLR5S binds to flagellin. Ｍ−キメラを発現する細胞において、精製したｒｔＴＬＲ５Ｓを添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を示した図である。It is the figure which showed the effect of flagellin-dependent NF-κB activation by adding purified rtTLR5S in cells expressing M-chimera. ｒｔＴＬＲ５Ｓとｈｕ／ｍｏ／ｆｇＴＬＲ５の細胞外ＬＲＲドメインとを比較したアラインメントを示した図である。It is the figure which showed the alignment which compared rtTLR5S and the extracellular LRR domain of hu / mo / fgTLR5. ｒｔＴＬＲ５のＫ−Ｄプロット分析の結果を示した図である。It is the figure which showed the result of KD plot analysis of rtTLR5. ｒｔＴＬＲ５Ｓキメラレセプターを発現するＨｅｌａ細胞におけるキメラレセプターを介したフラジェリン応答性ＮＦ−κＢ活性化を示す。FIG. 6 shows flagellin-responsive NF-κB activation through chimeric receptors in Hela cells expressing rtTLR5S chimeric receptors. キメラレセプターが種々の起源のフラジェリンに応答してＮＦ−κＢを活性化することを示す。We show that the chimeric receptor activates NF-κB in response to flagellins of various origins. ｈｕＴＬＲ５およびＳ−キメラを種々のＴＬＲリガンドで刺激した際のＮＦ−κＢレポーター活性を示した図である。It is the figure which showed the NF-κB reporter activity when huTLR5 and S-chimera were stimulated with various TLR ligands. ｒｔＴＬＲ５Ｓありまたはなしの条件下でｈｕＴＬＲ２，ｈｕＴＬＲ４またはｈｕＴＬＲ５のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞を種々のＴＬＲリガンドで刺激した際のＮＦ−κＢレポーター活性を示した図である。It is the figure which showed NF-κB reporter activity when cells transfected with huTLR2, huTLR4 or huTLR5 cDNA were stimulated with various TLR ligands with or without rtTLR5S. ｈｕＴＬＲ５のみを発現するＨｅｌａ細胞またはｈｕＴＬＲ５およびｒｔＴＬＲ５Ｓを発現するＨｅｌａ細胞をフラジェリンＡで刺激した際のＮＦ−κＢレポーター活性を示した図である。It is the figure which showed NF-κB reporter activity when Hela cells expressing only huTLR5 or Hela cells expressing huTLR5 and rtTLR5S were stimulated with flagellin A. 免疫沈降を用いてフラジェリンとｒｔＴＬＲ５Ｓとの直接的な相互作用を示した図である。It is the figure which showed the direct interaction of flagellin and rtTLR5S using immunoprecipitation. 免疫沈降を用いてフラジェリンとｒｔＴＬＲ５Ｓとの直接的な相互作用を示した図である。It is the figure which showed the direct interaction of flagellin and rtTLR5S using immunoprecipitation.

運動性を有する細菌は、スピロヘータを除いて、鞭毛（ｆｌａｇｅｌｌａ）という１本以上の線維状の付属物を有する。鞭毛は、その大部分または全部がタンパク質で構成されている。鞭毛のタンパク質はフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）と呼ばれ、動物の菌線維の構成タンパク質であるミオシンと同種であると考えられている。  Motile bacteria, with the exception of spirochetes, have one or more fibrous appendages called flagella. Most or all of flagella are composed of proteins. The flagellar protein is called flagellin and is considered to be the same species as myosin, a constituent protein of animal fungal fibers.

グラム陰性通性嫌気性桿菌であるＶｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅに属するＶｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ（Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）は、養殖魚にしばしば大きな被害をもたらす重要な魚病細菌である。Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍによる感染症は、ビブリオ病と呼ばれ、急性では出血性敗血症、慢性感染では体表に潰瘍または斑状出血を生じる。  Vibrio anguillarum (V. anguillarum) belonging to Vibrionaceae, a gram-negative facultative anaerobe, is an important fish disease bacterium that often causes great damage to farmed fish. V. Anguillarum infection is called Vibrio disease, which results in hemorrhagic sepsis in acute cases and ulcers or ecchymosis on the body surface in chronic infections.

哺乳動物ＴＬＲは種々の微生物パターン分子を認識する。例えば、ヒトＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５）およびマウスＴＬＲ５（ｍｏＴＬＲ５）は、フラジェリンを認識し、転写因子ＮＦ−κＢを活性化するシグナルを送達する（Ｈａｙａｓｈｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０：１０９９−１１０３（２００１）を参照のこと）。ＴＬＲ５およびＴＬＲ４はまた、フラジェリンに応答してインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）を活性化する（Ｍｉｚｅｌ ＳＢ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：６２１７−６２２３（２００３）を参照のこと）。  Mammalian TLRs recognize a variety of microbial pattern molecules. For example, human TLR5 (huTLR5) and mouse TLR5 (moTLR5) recognize flagellin and deliver a signal that activates the transcription factor NF-κB (Hayashi F et al., Nature 410: 1099-1103 (2001)). See TLR5 and TLR4 also activate interferon regulatory factor 3 (IRF3) in response to flagellin (see Mize SB et al., J. Immunol. 170: 6217-6223 (2003)).

フラジェリンはまた、ヒトＴＬＲ５またはマウスＴＬＲ５を活性化して樹状細胞応答を惹起することが知られている。ＴＬＲ５は、単独では主にＮＦ−κＢを、ＴＬＲ４と複合体を形成した場合はＩＦＮ−α／βを活性化して、炎症性サイトカインを惹起する。  Flagellin is also known to activate human TLR5 or mouse TLR5 to elicit a dendritic cell response. TLR5 alone activates NF-κB alone, and when complexed with TLR4, activates IFN-α / β to induce inflammatory cytokines.

上述したように、ニジマスは、フグのｆｇＴＬＲ５Ｓに類似する２つのＴＬＲアイソフォーム（膜結合形態（ＴＬＲ５Ｍ）および可溶性形態（ＴＬＲ５Ｓ））を有する（非特許文献９を参照のこと）。これらの知見に基いて、本発明者らは、魚類のＴＬＲ５がフラジェリンに起因する感染症の制御に関与していると考えた。  As described above, rainbow trout has two TLR isoforms (membrane-bound form (TLR5M) and soluble form (TLR5S)) similar to pufferfish fgTLR5S (see Non-Patent Document 9). Based on these findings, the present inventors considered that fish TLR5 is involved in the control of infection caused by flagellin.

本発明者らは、ＴＬＲ５とフラジェリンとの応答を魚類（ニジマス）において観察すると、微量のフラジェリン刺激によって、弱いサイトカイン産生が最初に誘起され、６時間以上経過すると、強力なサイトカイン産生が生じることを見出した。この機構をニジマスの細胞株においてさらに調べると、フラジェリン投与後４時間以内に可溶性形態であるｒｔＴＬＲ５Ｓが最初に発現し、続いて強いサイトカイン誘導が生じることが判明した。  When the present inventors observed the response of TLR5 and flagellin in fish (rainbow trout), weak cytokine production was first induced by a slight amount of flagellin stimulation, and after 6 hours or more, strong cytokine production occurred. I found it. Further examination of this mechanism in rainbow trout cell lines revealed that rtTLR5S, a soluble form, was first expressed within 4 hours after flagellin administration, followed by strong cytokine induction.

さらなる研究によって、本発明者らは、ｒｔＴＬＲ５Ｓが弱いフラジェリンシグナルを感知する能力を有し、フラジェリンｒｔＴＬＲ５Ｓ複合体が膜結合形態ＴＬＲ５を強力に活性化し、その結果、顕著なＮＦ−κＢ活性化および強いサイトカイン産生誘導が生じることを見出した。すなわち、本発明者らは、魚類の可溶性形態ＴＬＲ５は、鞭毛細菌に対する強力なアジュバントであることを見出した。本発明者らはまた、この魚類の可溶性形態ＴＬＲ５による効果が、魚類における特殊現象ではなく、ヒトＴＬＲ５発現細胞においてもまた同様にもたらされることを見出した。  By further studies, we have the ability of rtTLR5S to sense weak flagellin signals, and the flagellin rtTLR5S complex strongly activates membrane-bound form TLR5, resulting in significant NF-κB activation and strong It was found that cytokine production induction occurs. That is, the present inventors have found that the soluble form of fish TLR5 is a powerful adjuvant against flagellar bacteria. The inventors have also found that this effect of the soluble form of fish TLR5 is not a special phenomenon in fish, but also in human TLR5-expressing cells as well.

本明細書中において使用される場合、用語「鞭毛細菌」は、鞭毛を有する細菌が意図される。鞭毛細菌としては、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい鞭毛細菌は、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍである。  As used herein, the term “flagellar bacterium” intends a bacterium having flagella. Examples of flagella bacteria include, but are not limited to, Vibrio, Salmonella, Shigella and the like. Preferred flagellar bacteria are Anguillarum.

本明細書中において使用される場合、用語「鞭毛タンパク質」は、鞭毛を構成するタンパク質であり、主にフラジェリンであることが意図される。フラジェリンには、ＦｌａＡ、ＦｌａＣなどのアイソフォームがあり、本明細書中において使用される場合、これらのいずれかに限定されない。  As used herein, the term “flagellar protein” is a protein that constitutes flagella and is primarily intended to be flagellin. Flagellin includes isoforms such as FlaA and FlaC, and is not limited to any of these when used herein.

〔１〕ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを提供する。[1] rtTLR5S polypeptide and polynucleotide The present invention provides an rtTLR5S polypeptide.

本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチド」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいはこれらの変異体が意図される。本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドが意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチド」は、膜結合形態のＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５、ｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｍｏＴＬＲ５など）の活性を増幅する機能（すなわち、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性）を有するポリペプチドが意図される。また、用語「ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチド」は、フラジェリンを認識して、強いサイトカイン誘導および／または樹状細胞の成熟化を引き起こす機能を有するポリペプチドが意図される。なお、「ｈｕＴＬＲ５」および「ｍｏＴＬＲ５」は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号「ＡＢ０６０６９５」および「ＡＦ１８６１０７」によって提供されることを、当業者は容易に認識する。よって、本明細書中で使用される場合、「ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド」および「ｍｏＴＬＲ５ポリペプチド」は、上記データベース情報に記載のポリペプチドであり、「ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチド」および「ｍｏＴＬＲ５ポリヌクレオチド」は、上記データベース情報に記載のポリヌクレオチドであることが意図される。  As used herein, “rtTLR5S polypeptide” means a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or These variants are contemplated. As used herein with respect to a protein or polypeptide, the term “variant” intends a polypeptide having rtTLR5S activity. As used herein, the term “polypeptide having rtTLR5S activity” refers to a polypeptide having a function (ie, rtTLR5S activity) that amplifies the activity of a membrane-bound form of TLR5 (huTLR5, rtTLR5M, moTLR5, etc.). Is intended. In addition, the term “polypeptide having rtTLR5M activity” intends a polypeptide having a function of recognizing flagellin and causing strong cytokine induction and / or maturation of dendritic cells. Those skilled in the art will readily recognize that “huTLR5” and “moTLR5” are provided by GenBank accession numbers “AB060695” and “AF186107”, respectively. Therefore, as used herein, “huTLR5 polypeptide” and “moTLR5 polypeptide” are polypeptides described in the above database information, and “huTLR5 polynucleotide” and “moTLR5 polynucleotide” It is intended to be a polynucleotide described in database information.

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。  As used herein, the term “polypeptide” is used interchangeably with “peptide” or “protein”. In addition, “fragment” of a polypeptide is intended to be a partial fragment of the polypeptide. The polypeptides according to the invention may also be isolated from natural sources or chemically synthesized.

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。  The term “isolated” polypeptide or protein is intended to be a polypeptide or protein that has been removed from its natural environment. For example, recombinantly produced polypeptides and proteins expressed in a host cell can be isolated in the same manner as natural or recombinant polypeptides and proteins that have been substantially purified by any suitable technique. It is thought that there is.

本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。  Polypeptides according to the present invention include natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). ) From recombinantly produced products. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides according to the invention may be glycosylated or non-glycosylated. Furthermore, the polypeptides according to the invention may also contain an initiating modified methionine residue in some cases as a result of host-mediated processes.

本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。  The polypeptide according to the present invention may be a polypeptide in which amino acids are peptide-bonded, but is not limited thereto, and may be a complex polypeptide including a structure other than the polypeptide. As used herein, examples of the “structure other than the polypeptide” include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.

また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。  The polypeptide according to the present invention may include an additional polypeptide. Examples of the additional polypeptide include epitope-tagged polypeptides such as His, Myc, and Flag.

一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。  In one embodiment, the polypeptide according to the present invention is an rtTLR5S polypeptide or a variant thereof, wherein the variant is a polypeptide having rtTLR5S activity, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It is preferably a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted or added.

このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。  Such variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions (eg, replacement of one hydrophilic residue with another, but usually strongly hydrophilic residues strongly hydrophobic In which the residues are not substituted). In particular, “neutral” amino acid substitutions in a polypeptide generally have little effect on the activity of the polypeptide.

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。  It is well known in the art that some amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Furthermore, it is also well known that there are variants in natural proteins that do not significantly alter the structure or function of the protein, not only artificially modified.

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するか否かを容易に決定し得る。  One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of a polypeptide using well-known techniques. For example, according to a known point mutation introduction method, an arbitrary base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated. In addition, a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide. Furthermore, using the methods described herein, it can be readily determined whether the mutants produced have the desired rtTLR5S activity.

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を変化させない。  Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not change the rtTLR5S activity of the polypeptides according to the invention.

代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。  Representative conservative substitutions are substitutions of one amino acid for another in the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and Ile; exchange of hydroxyl residues Ser and Thr, acidic residues Asp and Glu exchange, substitution between amide residues Asn and Gln, exchange of basic residues Lys and Arg, and substitution between aromatic residues Phe, Tyr.

このように、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列の２９〜５９７位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。  Thus, the rtTLR5S polypeptide according to the present invention is a polypeptide having rtTLR5S activity, and is (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (2) shown in SEQ ID NO: 2. In the amino acid sequence, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted or added is preferred. As is apparent from the examples described later, the rtTLR5S polypeptide is (1) a polypeptide consisting of positions 29 to 597 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or (2) shown in SEQ ID NO: 2. It may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted or added at positions 29 to 597 of the amino acid sequence.

他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。  In another embodiment, the polypeptide according to the present invention is an rtTLR5S polypeptide or a variant thereof, wherein the variant is a polypeptide having rtTLR5S activity, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. In this case, it is preferable that one or several bases are encoded by a polynucleotide having a base sequence deleted, inserted, substituted, or added.

他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。  In another embodiment, the polypeptide according to the present invention is an rtTLR5S polypeptide or a variant thereof, wherein the variant is a polypeptide having rtTLR5S activity, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. In this case, it is preferable that one or several bases are encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence that has been deleted, inserted, substituted, or added.

ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。  Hybridization is described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a more homologous polynucleotide can be obtained. The appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.

本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。  As used herein, the term “stringent hybridization conditions” refers to hybridization solution (50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate. (Containing pH 7.6), 5 × Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA) overnight at 42 ° C., then 0.1 × at about 65 ° C. It is intended to wash the filter in SSC. Depending on the polynucleotide that hybridizes to a “portion” of the polynucleotide, at least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more preferably about Polynucleotides (either DNA or RNA) that hybridize to polynucleotides longer than 30 nt are contemplated. Polynucleotides (oligonucleotides) that hybridize to “parts” of such polynucleotides are also useful as detection probes as discussed in more detail herein.

他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。  In another embodiment, the polypeptide according to the present invention is an rtTLR5S polypeptide or a variant thereof, wherein the variant is a polypeptide having rtTLR5S activity, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that is at least 80% identical to the complementary base sequence, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical It is preferred that

例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。  For example, the target base sequence encodes the polypeptide according to the present invention by “a polynucleotide comprising a base sequence at least 95% identical to the reference (QUERY) base sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention”. It is intended to be identical to the reference sequence, except that it may contain up to 5 mismatches per 100 nucleotides (bases) of the reference sequence of the polynucleotide. In other words, up to 5% of the bases in the reference sequence can be deleted or replaced with another base to obtain a polynucleotide comprising a base sequence that is at least 95% identical to the reference base sequence, or Many bases up to 5% of the total bases in the reference sequence can be inserted into the reference sequence. These discrepancies in the reference sequence are distributed either individually at the 5 ′ or 3 ′ end position of the reference base sequence or at the base in the reference sequence or in one or more adjacent groups within the reference sequence. Can occur anywhere between the end parts of

任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。  Any particular nucleic acid molecule is, for example, at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% relative to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 Whether or not they are identical is determined by a known computer program (for example, Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix (registered trademark), Genetics Computer Recruit 75, University Science 75). Bestfit is the best homology between two sequences using the local homology algorithm of Smith and Waterman. Finding sex segments (Advanceds in Applied Mathematicas 2: 482-489 (1981)) Using Bestfit or any other sequence alignment program, a particular sequence may be, for example, 95% relative to a reference sequence according to the present invention. When determining whether or not they are identical, the percent identity is calculated over the entire length of the reference sequence, and the parameters are such that gaps in homology of up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence are allowed. Is set.

特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。  In certain embodiments, the identity (also referred to as global sequence alignment) between a reference (QUERY) sequence (sequence according to the invention) and a subject sequence is determined by the algorithm of Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6). : 237-245 (1990)). Preferred parameters used in FASTDB alignment of DNA sequences to calculate% identity are: Matrix = Unity, k-tuple = 4, Mismatch Penalty = 1, Joining Penalty = 30, Randomization Group Length = 0, Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty = 0.05, Window Size = 500, or the length of the target base sequence (whichever is shorter). According to this embodiment, if the subject sequence is shorter than the QUERY sequence (due to an internal deletion) due to a 5 ′ or 3 ′ deletion, the FASTDB program calculates the percent identity, Manual corrections are made to the results in view of the fact that 5 ′ and 3 ′ shortenings of the subject sequence are not considered. For subject sequences that are truncated at the 5 'end or 3' end relative to the QUERY sequence, the percent identity is the number of bases in the QUERY sequence that are 5 'and 3' of the subject sequence that are not matched / aligned Is calculated as a percentage of the total base of the QUERY sequence. The determination of whether a nucleotide is matched / aligned is determined by the result of the FASTDB sequence alignment. This percentage is then subtracted from the percent identity calculated by the above FASTDB program using the specified parameters to arrive at a final percent identity score. This corrected score is used for the purpose of this embodiment. Only bases outside the 5 'and 3' bases of the subject sequence that do not match / align with the QUERY sequence are calculated for the purpose of manually adjusting the percent identity score, as shown in the FASTDB alignment. For example, a 90 base subject sequence is aligned with a 100 base QUERY sequence to determine percent identity. The deletion occurs at the 5 'end of the subject sequence, so the FASTDB alignment does not show a match / alignment of the first 10 bases at the 5' end. Ten unpaired bases represent 10% of the sequence (number of bases at unmatched 5 'and 3' ends / total number of bases in the QUERY sequence), so 10% is converted by the FASTDB program Subtracted from the calculated percent identity score. If the remaining 90 residues are perfectly matched, the final percent identity is 90%. In another example, a 90 residue subject sequence is compared to a 100 base QUERY sequence. In this case, the deletion is an internal deletion, so there is no base at the 5 'or 3' end of the subject sequence that is not aligned / aligned with the QUERY sequence. In this case, the percent identity calculated by FASTDB is not manually corrected. Again, only the 5 'and 3' terminal bases of the subject sequence that do not match / align with the QUERY sequence are manually corrected. No other manual correction is made for the purposes of this embodiment.

このように、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであってもよい。  Thus, the rtTLR5S polypeptide according to the present invention is a polypeptide having rtTLR5S activity, (1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (2) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added, (3) one or several bases are missing in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a deleted, inserted, substituted, or added base sequence, or (4) at least a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 80% identical, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence 99% identical, preferably a polypeptide encoded by the DNA. As will be apparent from the examples described later, the polypeptide having rtTLR5S activity is (1) a polynucleotide consisting of positions 88 to 1791 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (2) shown in SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added at positions 88 to 1791 of the base sequence, (3) 88 to 80 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 At position 1791, a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, inserted, substituted, or added, or (4) SEQ ID NO: 1 At least 80% identical to the nucleotide sequence complementary to positions 88 to 1791 of the nucleotide sequence shown in FIG. , 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, a polynucleotide consisting of 98% or nucleotide sequence 99% identical, or may be a polypeptide encoded by.

本発明はまた、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを提供する。  The present invention also provides rtTLR5S polynucleotides.

本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチド」は、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図される。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。  As used herein, “rtTLR5S polynucleotide” is intended to be a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a variant thereof. As used herein with respect to DNA or polynucleotide, the term “variant” intends a polynucleotide that encodes a polypeptide having rtTLR5S activity.

本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。  As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides. As used herein, the term “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and refers to the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T). As shown. The “polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof” means a polynucleotide containing the sequence shown by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof Is intended.

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。  The polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (eg, mRNA) or in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA). DNA can be double-stranded or single-stranded. Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。  As used herein, the term “oligonucleotide” is intended to be a combination of several to several tens of nucleotides, and is used interchangeably with “polynucleotide”. Oligonucleotides are called dinucleotides (dimers) and trinucleotides (trimers) as short ones, and are represented by the number of nucleotides polymerized such as 30 mers or 100 mers as long ones. Oligonucleotides can be produced as fragments of longer polynucleotides or synthesized.

本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。  The polynucleotide according to the present invention can also be fused to the polynucleotide encoding the tag tag (tag sequence or marker sequence) described above on the 5 'or 3' side.

一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体はｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが好ましい：
・配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。In one embodiment, the polynucleotide according to the present invention is an rtTLR5S polynucleotide or a variant thereof, wherein the variant encodes an rtTLR5S polypeptide and is preferably any of the following polynucleotides:
A polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. In the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence in which several bases have been deleted, inserted, substituted, or added; a base sequence that is complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 A polynucleotide comprising a base sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical.

このように、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドは、（１）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号１に示される塩基配列の８８〜１７９１位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であってもよい。  Thus, the rtTLR5S polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide that encodes a polypeptide having rtTLR5S activity, and is (1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, (2) SEQ ID NO: 1 A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added, (3) one or several in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one base is deleted, inserted, substituted, or added, or (4) complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 At least 80%, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 9 %, 96%, 97%, is preferably a polynucleotide, consisting of 98% or 99% identical to a nucleotide sequence. As will be apparent from the examples described later, the rtTLR5S polynucleotide is (1) a polynucleotide consisting of positions 88 to 1791 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and (2) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted, or added, (3) at positions 88 to 1791 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted, or added, or (4) shown in SEQ ID NO: 1. At least 80% identical to the nucleotide sequence complementary to positions 88-1791 of the nucleotide sequence, more preferably at least 85%, 90 , 92%, 95%, 96%, 97%, may be a polynucleotide, consisting of 98% or nucleotide sequence 99% identical.

本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。  The polynucleotide according to the present invention may contain a sequence such as a sequence of an untranslated region (UTR) or a vector sequence (including an expression vector sequence).

本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒトまたはマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、ニジマス血球細胞を用いているが、これに限定されない。  Although it does not specifically limit as a supply source for acquiring the polynucleotide based on this invention, It is preferable that it is a biological material (for example, various organs, such as a human or a mouse | mouth). As used herein, the term “biological material” intends a biological sample (a tissue sample or cell sample obtained from an organism). In the examples described below, rainbow trout blood cells are used, but the present invention is not limited to this.

本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、ガンまたは感染疾患に対する免疫応答を惹起するためのワクチンにおけるアジュバントとして使用され得る。また、本発明を使用すれば、種々の疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症もしくは寄生虫感染症、ガン、アレルギー、または自己免疫疾患など）を罹患する被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）を防御または治療するために、あるいは上記疾患を予防するために適用することができる。さらに、本発明を使用すれば、鞭毛細菌感染を検出することができる。  The polypeptide or polynucleotide according to the present invention can be used as an adjuvant in a vaccine to elicit an immune response against a cancer or infectious disease, as further described herein. In addition, using the present invention, a subject (preferably, a mammal, a disease, such as a viral infection, a bacterial or parasitic infection, a cancer, an allergy, or an autoimmune disease) is used. More preferably, it can be applied to protect or treat humans) or to prevent the above diseases. Furthermore, flagellar bacterial infections can be detected using the present invention.

本発明の目的は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチド、およびｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチド、およびｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。  An object of the present invention is to provide an rtTLR5S polypeptide and an rtTLR5S polynucleotide, and not to the polypeptide production method and the polynucleotide production method specifically described in the present specification. Therefore, it should be noted that rtTLR5S polypeptides and rtTLR5S polynucleotides obtained by methods other than the above methods also belong to the technical scope of the present invention.

〔２〕ベクター
本発明は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。[2] Vector The present invention provides a vector used to produce an rtTLR5S polypeptide. The vector according to the present invention may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.

本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。  The vector according to the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described polynucleotide according to the present invention. Examples thereof include a recombinant expression vector into which a polynucleotide cDNA encoding a polypeptide having rtTLR5S activity has been inserted. A method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage, cosmid or the like.

ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。  The specific type of vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in a host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide according to the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide according to the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it. In addition, transformation of a host with an expression vector can also be performed according to a conventional technique.

上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。  A host transformed with the above expression vector is cultured, cultivated or bred, and then subjected to conventional techniques (eg, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography) from the culture. Etc.), the target protein can be recovered and purified.

発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。  The expression vector preferably contains at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, and E. coli. Examples of culture in E. coli and other bacteria include a tetracycline resistance gene or an ampicillin resistance gene.

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。  A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. . In addition, for example, when the polypeptide according to the present invention is transferred and expressed in insects, an expression system using baculovirus may be used.

本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、ｒｔＴＬＲ５Ｓ活性を有するポリペプチドを合成することができる。  When the vector according to the present invention is used, a polypeptide having rtTLR5S activity can be expressed in the organism or cell by introducing the polynucleotide into the organism or cell. Furthermore, if the vector according to the present invention is used in a cell-free protein synthesis system, a polypeptide having rtTLR5S activity can be synthesized.

このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。  Thus, it can be said that the vector according to the present invention should include at least a polynucleotide encoding the polypeptide according to the present invention. That is, it should be noted that vectors other than expression vectors are also included in the technical scope of the present invention.

〔３〕形質転換体
本発明は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。[3] Transformant The present invention provides a transformant into which a polynucleotide encoding an rtTLR5S polypeptide has been introduced. As used herein, the term “transformant” is intended to include not only cells, tissues or organs, but also individual organisms.

本発明に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが安定的に発現することが好ましい。  The transformant according to the present invention is characterized in that the rtTLR5S polypeptide is expressed. It is preferable that the rtTLR5S polypeptide is stably expressed in the transformant according to the present invention.

一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。本実施形態に係る形質転換体は、原核生物であっても真核生物であってもよい。本実施形態に係る形質転換体は、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドが発現され得るように生物中に導入されてもよい。この場合、ｒｔＴＬＲ５ＳポリヌクレオチドおよびｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドの導入は、同時であっても別々であってもよい。  In one embodiment, the transformant according to the present invention is obtained by introducing a recombinant vector containing an rtTLR5S polynucleotide into an organism so that the rtTLR5S polypeptide can be expressed. The transformant according to this embodiment may be either prokaryotic or eukaryotic. In the transformant according to this embodiment, a recombinant vector containing an rtTLR5M polynucleotide may be introduced into an organism so that the rtTLR5M polypeptide can be expressed. In this case, the introduction of the rtTLR5S polynucleotide and the rtTLR5M polynucleotide may be simultaneous or separate.

本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチド」は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいはこれらの変異体が意図される。用語「ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチド」は、上述したように、フラジェリンを認識して、強いサイトカイン誘導および／または樹状細胞の成熟化を引き起こす機能を有するポリペプチドが意図される。  As used herein, “rtTLR5M polypeptide” means a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, or These variants are contemplated. The term “polypeptide having rtTLR5M activity” intends a polypeptide having the function of recognizing flagellin and causing strong cytokine induction and / or maturation of dendritic cells, as described above.

すなわち、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位からなるポリペプチド、または、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１〜５９６位において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であってもよい。  That is, in the present invention, the rtTLR5M polypeptide is a polypeptide having rtTLR5M activity, and (1) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or (2) an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 In this, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, inserted, substituted or added is preferred. As is apparent from the examples described later, the rtTLR5M polypeptide is (1) a polypeptide consisting of positions 21 to 596 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or (2) shown in SEQ ID NO: 4. It may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted or added at positions 21 to 596 of the amino acid sequence.

また、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであることが好ましい。なお、後述する実施例からも明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドは、（１）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、によってコードされるポリペプチドであってもよい。  Further, in the present invention, the rtTLR5M polypeptide is a polypeptide having rtTLR5M activity, (1) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and (2) the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added; (3) one or several bases have been deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3; A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the inserted, substituted, or added nucleotide sequence, or (4) at least 80% of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 The same, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence is 9% identical, preferably a polypeptide encoded by the DNA. As is clear from the examples described later, the polypeptide having rtTLR5M activity is (1) a polynucleotide consisting of positions 64 to 1788 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and (2) shown in SEQ ID NO: 3. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases are deleted, inserted, substituted or added at positions 64 to 1788 of the nucleotide sequence; (3) 64 to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 Or a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted, or added at position 1788, or (4) SEQ ID NO: 3 At least 80% identical to the base sequence complementary to positions 64 to 1788 of the base sequence shown in FIG. , 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, a polynucleotide consisting of 98% or nucleotide sequence 99% identical, or may be a polypeptide encoded by.

本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチド」は、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図され、ここで当該変異体はｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが意図される：
・配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。As used herein, “rtTLR5M polynucleotide” is intended to be a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a variant thereof, wherein the variant encodes an rtTLR5M polypeptide, And is intended to be any of the following polynucleotides:
A polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence in which several bases have been deleted, inserted, substituted, or added; a base sequence that is complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 A polynucleotide comprising a base sequence that is at least 80% identical, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical.

すなわち、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、（１）配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることが好ましい。なお、本発明において、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドは、（１）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位からなるポリヌクレオチド、（２）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド、（３）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、（４）配列番号３に示される塩基配列の６４〜１７８８位と相補的な塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であってもよい。  That is, in the present invention, the rtTLR5M polynucleotide is a polynucleotide that encodes a polypeptide having rtTLR5M activity, and is (1) a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, (2) represented by SEQ ID NO: 3. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added, (3) one or several nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which a base is deleted, inserted, substituted, or added, or (4) a base that is complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 At least 80% identical to the sequence, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 5%, 96%, 97%, is preferably a polynucleotide, consisting of 98% or 99% identical to a nucleotide sequence. In the present invention, the rtTLR5M polynucleotide is (1) a polynucleotide comprising positions 64 to 1788 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and (2) nucleotide positions 64 to 1788 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, inserted, substituted or added; (3) one or several nucleotides at positions 64 to 1788 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which a base is deleted, inserted, substituted, or added; or (4) positions 64 to 1788 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 At least 80% identical to the complementary base sequence, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95%, 6%, 97%, may be a polynucleotide, consisting of 98% or nucleotide sequence 99% identical.

〔４〕アジュバント
本発明はまた、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバントを提供する。[4] Adjuvant The present invention also provides an adjuvant containing an rtTLR5S polypeptide or an rtTLR5S polynucleotide.

「アジュバント」は、「免疫賦活剤」とも呼ばれ、抗原と混合または組み合わせることによって、抗体産生の増大または免疫応答の増強を生じさせる物質の総称であり、［１］抗原を不溶化することによって組織に長く貯留し、抗原を徐々に長時間遊離させる；［２］抗原をマクロファージに貪食されやすい状態にする；または、［３］免疫に関する細胞を非特異的に活性化する、の少なくともいずれか１つの性質を有する。抗原または他の免疫原性物質を投与する際に用いられるアジュバントの有用性は、以前から認められている。なお、本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」は「アジュバント成分」と交換可能に使用され得る。  “Adjuvant” is also referred to as “immunostimulatory agent” and is a general term for substances that cause an increase in antibody production or an increase in immune response by mixing or combining with an antigen, and [1] tissue by insolubilizing an antigen At least one of the following: [2] making the antigen susceptible to phagocytosis by macrophages; or [3] non-specifically activating cells related to immunity Has one property. The usefulness of adjuvants used in administering antigens or other immunogenic substances has been recognized for some time. As used herein, the term “adjuvant” may be used interchangeably with “adjuvant component”.

種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバント。また、このようなアジュバントは当該分野で周知である。  Various adjuvants can be used to increase the immunological response, depending on the host species. Such adjuvants include, but are not limited to: Freund (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, pluronic ) Polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and potentially useful human adjuvants such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum. Such adjuvants are also well known in the art.

アジュバントは、生成される抗体の量を増加させるとともに、注射に必要な抗原量、すなわち、注射回数を低減させる。ヒトにおいて使用されているアジュバントとしては、日本ではアルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）のみであり、破傷風トキソイド、ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、および蛇毒トキソイドにおいて使用されている。また、フランスでは、リン酸カルシウムが、ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチンやポリオワクチンなどに使用されている。  Adjuvants increase the amount of antibody produced and reduce the amount of antigen required for injection, ie the number of injections. Adjuvants used in humans are only aluminum compounds (aluminum hydroxide, aluminum phosphate) in Japan, and are used in tetanus toxoid, diphtheria / pertussis / tetanus mixed vaccine, hepatitis B vaccine, and snake venom toxoid. Yes. In France, calcium phosphate is used in diphtheria, whooping cough, tetanus mixed vaccines, polio vaccines, and the like.

本発明者らは、上述したように、ｒｔＴＬＲ５Ｓが弱いフラジェリンシグナルを感知する能力を有し、フラジェリンｒｔＴＬＲ５Ｓ複合体が膜結合形態ＴＬＲ５を強力に活性化し、その結果、顕著なＮＦ−κＢ活性化および強いサイトカイン産生誘導が生じることを見出した。すなわち、本発明者らは、魚類の可溶性形態ＴＬＲ５は、鞭毛細菌に対する強力なアジュバントであることを見出した。  As described above, we have the ability of rtTLR5S to sense weak flagellin signals, and the flagellin rtTLR5S complex strongly activates membrane-bound form TLR5, resulting in significant NF-κB activation and It was found that strong cytokine production induction occurs. That is, the present inventors have found that the soluble form of fish TLR5 is a powerful adjuvant against flagellar bacteria.

本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むことが好ましい。一実施形態において、本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリペプチドをさらに含むことが好ましい。  The adjuvant according to the present invention preferably comprises an rtTLR5S polypeptide. In one embodiment, the adjuvant according to the present invention preferably further comprises an rtTLR5M polypeptide.

本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明に係るアジュバントは、当該ポリヌクレオチドによってコードされるｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドが発現することによってアジュバント能を発揮する。一実施形態において、本発明に係るアジュバントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチドをさらに含むことが好ましい。  The adjuvant according to the present invention preferably contains an rtTLR5S polynucleotide. The adjuvant according to the present invention exhibits the adjuvant ability when the rtTLR5S polypeptide encoded by the polynucleotide is expressed. In one embodiment, the adjuvant according to the present invention preferably further comprises an rtTLR5M polynucleotide.

本明細書中において使用される場合、「ｒｔＴＬＲ５Ｍポリヌクレオチド」は、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図される。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ｒｔＴＬＲ５Ｍ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。  As used herein, “rtTLR5M polynucleotide” is intended to be a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or a variant thereof. As used herein with respect to DNA or polynucleotide, the term “variant” intends a polynucleotide that encodes a polypeptide having rtTLR5M activity.

後述する実施例から明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓが有するアジュバント能によってもたらされる効果は、魚類における特殊現象ではなく、ヒトＴＬＲ５発現細胞においてもまた同様にもたらされる。すなわち、本発明に係るアジュバントを使用すれば、これまで困難であったヒトへの応用が可能となる。  As will be apparent from the examples described later, the effect brought about by the adjuvant ability of rtTLR5S is not a special phenomenon in fish but is also brought about in human TLR5-expressing cells as well. That is, if the adjuvant according to the present invention is used, application to humans, which has been difficult until now, becomes possible.

〔５〕ワクチン
本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を含むワクチン組成物を提供する。一実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、免疫原成分をさらに含むことが好ましい。[5] Vaccine The present invention provides a vaccine composition comprising an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide or an rtTLR5S polynucleotide. In one embodiment, the vaccine composition according to the present invention preferably further comprises an immunogenic component.

本明細書中において使用される場合、用語「ワクチン」は、生体の免疫系を刺激することによって疾病（疾患、障害）を予防するために使用される薬剤が意図される。用語「免疫系」は、例えば、インターフェロン産生のような、多細胞生体が生体細胞または生体外液に侵入した抗原性物質に対して抗体を産生する機構を含み、このようにして産生された抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）という免疫学的分類のいずれかに属する。ＩｇＡが温血動物の分泌系統から得られる主要免疫グロブリンであることに注目すれば、特に興味あるワクチンはＩｇＡの産生を刺激するワクチンである。しかし、本明細書中において使用される場合、「ワクチン」はＩｇＡの産生を刺激するワクチンに限定されない。すなわち、「ワクチン」は、広範な免疫反応を起こし得る。  As used herein, the term “vaccine” intends an agent used to prevent a disease (disease, disorder) by stimulating the immune system of the body. The term “immune system” includes a mechanism by which a multicellular organism produces an antibody against an antigenic substance that has entered a living cell or in vitro fluid, such as, for example, interferon production, and the antibody produced in this way Belong to any of the immunological classes of immunoglobulin A, D, E, G or M (IgA, IgD, IgE, IgG or IgM). Of particular interest is the vaccine that stimulates the production of IgA, noting that IgA is the major immunoglobulin obtained from the secretory line of warm-blooded animals. However, as used herein, a “vaccine” is not limited to a vaccine that stimulates the production of IgA. That is, a “vaccine” can cause a wide range of immune responses.

脊椎動物は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を含む脊椎動物亜門の一員であり、いずれも軟骨性脊柱を有することが特徴であり、全ての脊椎動物が免疫系を有する。従って、本明細書中において使用される場合、「ワクチン」の適用対象は、哺乳動物に限定されない。  Vertebrates are members of the vertebrate subphylum, including fish, amphibians, reptiles, birds and mammals, all characterized by having a cartilaginous vertebral column and all vertebrates have an immune system. Therefore, as used herein, the subject of application of the “vaccine” is not limited to mammals.

動物において免疫応答を誘発することができる抗原（主に細菌成分、すなわち、ポリペプチド）を動物系中へ導入することによって動物を感染から防御する伝統的なワクチン接種技術が長年にわたって知られている（本明細書中において使用される場合、このようなワクチンをペプチドワクチンという）。近年、プラスミドＤＮＡを動物細胞にインビボで直接導入することができるようになり、その結果、抗原性ペプチドをコードするＤＮＡを動物中に直接導入することによって動物において免疫応答を誘発するワクチン接種技術が開発されている。このような技術は、「ＤＮＡ免疫化（ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ）」または「ＤＮＡワクチン接種（ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」と呼ばれており、本明細書中において使用される場合、このようなワクチンをＤＮＡワクチンという。  Traditional vaccination techniques have been known for many years to protect animals from infection by introducing antigens (mainly bacterial components, ie polypeptides) that can elicit an immune response in animals into the animal system (As used herein, such a vaccine is referred to as a peptide vaccine). In recent years, it has become possible to introduce plasmid DNA directly into animal cells in vivo, resulting in a vaccination technique that elicits an immune response in animals by directly introducing DNA encoding the antigenic peptide into the animal. Has been developed. Such a technique is referred to as “DNA immunization” or “DNA vaccination” and as used herein, such a vaccine is referred to as a DNA vaccine.

本発明に係るワクチン組成物は、ペプチドワクチンであってもＤＮＡワクチンであってもよい。  The vaccine composition according to the present invention may be a peptide vaccine or a DNA vaccine.

一実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、いわゆるペプチドワクチンであり得る。本実施形態に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。  In one embodiment, the vaccine composition according to the invention may be a so-called peptide vaccine comprising an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. In the vaccine composition according to this embodiment, the immunogenic component preferably contains an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8 (ie, FlaA protein or FlaC protein).

本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでいてもよい。  The vaccine composition according to the present invention may further comprise a huTLR5 polypeptide. Moreover, the vaccine composition according to the present invention may contain huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of the huTLR5 polypeptide.

他の実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、通常、強力なプロモーターが挿入される細菌プラスミドベクター、免疫原をコードする目的の遺伝子およびポリアデニル化／転写停止配列から構成される。目的の遺伝子がコードする免疫原は、タンパク質であっても、病原体もしくは腫瘍または防御されることを意図される他の作用物質に関連する抗原性ペプチドであってもよい。プラスミドは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において増殖させた後に単離され、宿主に投与される前に、意図される投与経路に応じて適切な培地中にて調製される。ＤＮＡワクチン接種は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７）（その開示の全てが本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。  In other embodiments, the vaccine composition according to the present invention may be a DNA vaccine. DNA vaccines usually consist of a bacterial plasmid vector into which a strong promoter is inserted, a gene of interest encoding an immunogen, and a polyadenylation / transcription termination sequence. The immunogen encoded by the gene of interest may be a protein or an antigenic peptide associated with a pathogen or tumor or other agent intended to be protected. The plasmid is isolated after growth in bacteria (eg, E. coli) and prepared in an appropriate medium, depending on the intended route of administration, before being administered to the host. DNA vaccination is described in Donnelly, J. et al., Annual Rev. Immunol. 15: 617-648 (1997), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.

本実施形態に係るワクチン組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含み得る。本実施形態に係るワクチン組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。  The vaccine composition according to this embodiment may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. In the vaccine composition according to this embodiment, the immunogenic component preferably includes a polynucleotide encoding an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 (ie, FlaA or FlaC cDNA).

本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係るワクチン組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。  The vaccine composition according to the present invention may further contain a huTLR5 polynucleotide. In addition, the vaccine composition according to the present invention may include a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

フラジェリンは自然免疫のアジュバント機能を介する抗ガン活性および／または抗感染活性を有する。従って、抗原性を有する物質と組み合わせてｒｔＴＬＲ５Ｓをヒトに投与すれば、感作増強されたワクチンを提供することができる。ヒトには可溶性形態のＴＬＲ５は存在しない。にもかかわらず、魚類由来の可溶性形態のＴＬＲ５によって、ヒトＴＬＲ５（ｈｕＴＬＲ５）の機能が増強されるという知見は全く予想し得ないものであった。後述する実施例から明らかなように、ｒｔＴＬＲ５Ｓはフラジェリンと複合体化するので、本発明に係るワクチン組成物は、その投与形態にかかわらずｈｕＴＬＲ５に基づく免疫応答を首尾よく増強し得る。  Flagellin has anti-cancer activity and / or anti-infective activity through the adjuvant function of innate immunity. Therefore, when rtTLR5S is administered to a human in combination with a substance having antigenicity, a vaccine with enhanced sensitization can be provided. There is no soluble form of TLR5 in humans. Nevertheless, the finding that the soluble form of TLR5 derived from fish enhances the function of human TLR5 (huTLR5) was completely unexpected. As will be apparent from Examples described later, since rtTLR5S is complexed with flagellin, the vaccine composition according to the present invention can successfully enhance an immune response based on huTLR5 regardless of its administration form.

本発明に係るワクチン組成物は、アジュバント成分および免疫原成分以外に薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。ワクチン組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、ワクチン組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。  The vaccine composition according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the adjuvant component and the immunogenic component. The pharmaceutically acceptable carrier used in the vaccine composition can be selected depending on the dosage form and dosage form of the vaccine composition.

本明細書中で使用される場合、薬理学的に受容可能なキャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして配合される。  As used herein, pharmacologically acceptable carriers include various organic or inorganic carrier substances that can be used as pharmaceutical materials, and include excipients, lubricants, and binders in solid formulations. Or a disintegrant, or a solvent, a solubilizing agent, a suspending agent, an isotonic agent, a buffering agent, or a soothing agent in a liquid preparation.

賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。  Examples of excipients include lactose, sucrose, D-mannitol, xylitol, sorbitol, erythritol, starch, and crystalline cellulose. Examples of lubricants include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica. Etc.

結合剤としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。  Examples of the binder include pregelatinized starch, methylcellulose, crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, trehalose, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone.

崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。  Examples of the disintegrant include starch, carboxymethyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and the like.

溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。  Examples of the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, tricaprylin and the like.

溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。  Examples of the solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.

懸濁剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子が挙げられる。  As the suspending agent, for example, a surfactant such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, or polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, Examples include hydrophilic polymers such as sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.

等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。  Examples of the isotonic agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.

緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。  Examples of the buffer include buffer solutions of phosphate, acetate, carbonate, citrate, and the like.

無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。  Examples of soothing agents include benzyl alcohol.

防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。  Examples of the preservative include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.

抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。  Examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid.

本実施形態に係るワクチン組成物は、製剤技術分野において慣用的な方法に従って製造することができる。  The vaccine composition according to the present embodiment can be produced according to a method commonly used in the pharmaceutical technical field.

本実施形態に係るワクチン組成物の形態は、血中にて高濃度をもたらすことができる形態、すなわち、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射に適切な「注入可能な形態」であることが好ましいがこれらに限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含むが、徐放性であることが好ましい）、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるいは、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤であってもよい。本発明に係るワクチン組成物は、毒性が低いので経口的または非経口的に投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。  The form of the vaccine composition according to this embodiment is a form capable of producing a high concentration in the blood, i.e. suitable for intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intraarticular injection. Preferably, it is in an injectable form, but is not limited thereto, for example, tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules, preferably sustained release), powders, granules, syrups, etc. Oral preparations, or parenteral preparations such as injections, suppositories, pellets, and drops. Since the vaccine composition according to the present invention has low toxicity, it can be administered orally or parenterally. The term “parenteral” as used herein refers to modes of administration including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous, and intraarticular injection and infusion.

また、ＤＮＡワクチンとしての本発明に係るワクチン組成物の形態は、リポソームまたはポリラクチドコグリコリド粒子内に封入した経口、経鼻または経気管支での投与に適した形態が好ましい。ＤＮＡワクチンとしての本発明に係るワクチン組成物およびワクチン用キットのさらに好ましい投与形態は、遺伝子銃を用いる形態である。遺伝子銃を用いるＤＮＡ導入技術は当該分野において公知であり、例えば、Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：３７−４２（１９９６）（この全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。  Moreover, the form of the vaccine composition according to the present invention as a DNA vaccine is preferably a form suitable for oral, nasal or transbronchial administration enclosed in liposomes or polylactide coglycolide particles. A more preferable administration form of the vaccine composition and vaccine kit according to the present invention as a DNA vaccine is a form using a gene gun. DNA introduction techniques using gene guns are known in the art, see, for example, Haynes et al. Biotechnology 44: 37-42 (1996), which is hereby incorporated by reference in its entirety.

本実施形態に係るワクチン組成物の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによっても異なるが、当業者は、これら投与対象、投与経路、症状などに応じて、最適な条件を適宜設定することができる。  The dose of the vaccine composition according to the present embodiment varies depending on the administration subject, administration route, symptom, etc., but those skilled in the art appropriately set the optimum conditions according to the administration subject, administration route, symptom, etc. be able to.

本実施形態に係るワクチン組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によって適用することができる。注射剤は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。  The vaccine composition according to this embodiment can be administered by an appropriate administration route according to the preparation form. The administration method is not particularly limited, and can be applied by internal use, external use or injection. The injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally or the like.

本明細書において使用される場合、「ワクチン組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を単一形態中に含む。従って、当該２成分を別々に投与することが意図される場合、「ワクチン組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を別個に備えるワクチン用キットとして提供される。  As used herein, a “vaccine composition” includes an adjuvant component and an immunogenic component in a single form. Accordingly, when the two components are intended to be administered separately, the “vaccine composition” is provided as a vaccine kit comprising an adjuvant component and an immunogenic component separately.

一実施形態において、本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。  In one embodiment, a vaccine kit according to the present invention may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. Preferably, these two components can each be contained in separate containers. In the vaccine kit according to this embodiment, the immunogenic component preferably contains an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8 (ie, FlaA protein or FlaC protein).

本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。  The vaccine kit according to the present invention may further comprise a huTLR5 polypeptide. In addition, the vaccine kit according to the present invention may include huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of the huTLR5 polypeptide.

他の実施形態において、本発明に係るワクチン用キットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るワクチン用キットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。  In other embodiments, a vaccine kit according to the present invention may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. Preferably, these two components can each be contained in separate containers. In the vaccine kit according to this embodiment, the immunogenic component preferably includes a polynucleotide encoding an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 (ie, FlaA or FlaC cDNA).

本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るワクチン用キットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。  The vaccine kit according to the present invention may further comprise a huTLR5 polynucleotide. The vaccine kit according to the present invention may include a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

本発明に係るワクチン用キットにおけるアジュバント成分は、異なる種々の投与経路（例えば、経口、鼻、肺、筋肉内、皮下、皮内または局所経路）によって投与することができる。好ましくは、成分は皮内または局所経路により投与される。当該アジュバント成分は、免疫原成分と異なる経路によって、異なる時期に投与されてもよいが、実質的に同時に同一部位に投与される場合がもっとも好ましい。「実質的に同時」とは、アジュバント成分の投与と免疫原成分の投与とが好ましくは同時、またはいずれかの投与の前後少なくとも数時間以内であることが意図される。  The adjuvant component in the vaccine kit according to the present invention can be administered by various different administration routes (for example, oral, nasal, pulmonary, intramuscular, subcutaneous, intradermal or topical route). Preferably, the component is administered by intradermal or topical route. The adjuvant component may be administered at different times by different routes than the immunogenic component, but is most preferably administered at the same site substantially simultaneously. By “substantially simultaneously” is intended that administration of the adjuvant component and administration of the immunogenic component are preferably simultaneous or within at least several hours before or after any administration.

本発明に係るワクチン組成物およびワクチン用キットは、種々の疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症もしくは寄生虫感染症、ガン、アレルギー、または自己免疫疾患など）を罹患する被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）を防御または治療するために、あるいは上記疾患を予防するために適用することができる。  The vaccine composition and the vaccine kit according to the present invention are subject to various diseases (for example, viral infection, bacterial infection or parasitic infection, cancer, allergy, autoimmune disease, etc.) (preferably , Mammals, and more preferably humans), or for preventing the above diseases.

従来のワクチンには、病原性死菌、病原性細菌から精製された特異成分、生ワクチンとしての病原性細菌の無毒誘導体、または生ワクチンを事前に希釈ホルマリン処理によって弱毒化されるかもしくは部分的に不活性化された、いわゆる弱毒化ワクチンなどが使用されている。しかし、細菌を不活性化させるホルマリン処理は、細菌の一時的な弱毒化に過ぎないので、細菌が途中で回復すると、予防というよりは感染という重大な問題を招くおそれがある。  Traditional vaccines include pathogenic killed bacteria, specific components purified from pathogenic bacteria, non-toxic derivatives of pathogenic bacteria as live vaccines, or live vaccines are attenuated or partially attenuated by prior dilution formalin treatment So-called attenuated vaccines etc., which have been inactivated, are used. However, formalin treatment that inactivates bacteria is only a temporary attenuation of the bacteria, and if the bacteria recover in the middle, it can lead to a serious problem of infection rather than prevention.

さらに、投与経路として最も好ましい経口投与形態を用いると、有効成分のほとんどが、抗原の大部分が胃腸内の酵素によって死滅したり、そのまま体外に放出されたり、または非免疫形態で吸収されてしまう。その結果、有効免疫反応を刺激することのできる物質量が少なくなる。従って、経口投与を用いる場合、必要な抗原の投与量は多くする必要がある。  In addition, when the most preferred oral dosage form is used as the route of administration, most of the active ingredient is killed by enzymes in the gastrointestinal tract, released as it is, or absorbed in a non-immune form. . As a result, the amount of substance that can stimulate an effective immune response is reduced. Therefore, when oral administration is used, it is necessary to increase the dose of the necessary antigen.

本発明に係るワクチン組成物またはワクチン用キットを用いれば、極微量の免疫原物質を用いるだけで所望の免疫効果を得ることができ、上述のような従来のワクチンの有する問題点を克服することができる。本発明に係るワクチン組成物またはワクチン用キットを用いて所望の免疫効果を得ることができたかどうかを確認するための手段は、当該分野において公知の検出方法を用いればよいが、例えば、皮内注射後に免疫反応に基づく腫脹を確認する方法が最も簡便かつ好ましい。  By using the vaccine composition or vaccine kit according to the present invention, a desired immune effect can be obtained only by using a very small amount of an immunogenic substance, and the above-described problems of conventional vaccines are overcome. Can do. As a means for confirming whether or not a desired immune effect could be obtained using the vaccine composition or vaccine kit according to the present invention, a detection method known in the art may be used. A method of confirming swelling based on an immune reaction after injection is most convenient and preferred.

このように、本発明に係るワクチン組成物は、少なくとも、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を含んでいればよいといえる。また、本発明に係るワクチン用キットは、少なくとも、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を備えていればよいといえる。本発明が上記構成を採ることによって、任意の鞭毛細菌感染に対して有効な免疫効果を得ることができる。なぜなら、列挙した疾患は、本発明に係るアジュバント（すなわち、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチド）を含むワクチンが予め投与されていると、該アジュバントが樹状細胞を有意に活性化するので、鞭毛細菌が侵入だけで種々の免疫担当細胞（ＮＫ細胞、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、抗体産生細胞など）が有効に活性化され、目的の免疫効果を得ることができるからである。本明細書を読んだ当業者は、このことを容易に理解することができる。また、鞭毛細菌侵入以外に起因する疾患に対してもまた、免疫原成分を別途投与することによって同様に種々の免疫担当細胞が有効に活性化され、目的の免疫効果を得ることができることを当業者は容易に理解する。またこの場合でも特定の疾患に限定されず、本発明に係るワクチン組成物およびワクチン用キットは、あらゆるウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、ガン、アレルギー、ならびに自己免疫疾患などの疾患に対して有効な免疫効果をもたらすことができることを、本明細書の記載を読んだ当業者は容易に理解する。  Thus, it can be said that the vaccine composition according to the present invention only needs to contain at least an adjuvant component containing an rtTLR5S polypeptide or an rtTLR5S polynucleotide. Moreover, it can be said that the vaccine kit according to the present invention only needs to include at least an adjuvant component containing an rtTLR5S polypeptide or an rtTLR5S polynucleotide. When the present invention adopts the above configuration, an effective immune effect against any flagella bacterial infection can be obtained. This is because the listed diseases are flagellar bacteria because, if a vaccine containing an adjuvant according to the present invention (ie, rtTLR5S polypeptide or rtTLR5S polynucleotide) is pre-administered, the adjuvant significantly activates dendritic cells. This is because various immunocompetent cells (NK cells, cytotoxic T lymphocytes (CTL), antibody-producing cells, etc.) can be effectively activated only by invasion, and the desired immune effect can be obtained. Those skilled in the art who have read this specification can easily understand this. In addition, for diseases caused by other than flagellate bacterial invasion, it is also possible to effectively activate various immunocompetent cells in the same manner by separately administering an immunogenic component and obtain the desired immune effect. Contractors understand easily. Also in this case, the vaccine composition and the vaccine kit according to the present invention are not limited to a specific disease, and the virus composition, bacterial infection and parasitic infection, cancer, allergy, and autoimmune disease, etc. Those skilled in the art who have read the description herein will readily appreciate that an effective immune effect can be produced.

〔６〕ガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物、キットおよび方法
本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を含む、ガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物およびキットを提供する。一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物およびキットは、免疫原成分をさらに含むことが好ましい。さらに本発明は、ｒｔＴＬＲ５ＳポリペプチドまたはｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分を用いる、ガンまたは感染症を予防するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る方法は、さらに免疫原成分を用いることが好ましい。[6] Pharmaceutical composition, kit and method for preventing cancer or infectious disease The present invention comprises a pharmaceutical composition for preventing cancer or infectious disease, comprising an adjuvant component containing rtTLR5S polypeptide or rtTLR5S polynucleotide. Supplies and kits. In one embodiment, the pharmaceutical compositions and kits according to the invention preferably further comprise an immunogenic component. The present invention further provides a method for preventing cancer or infection using an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide or an rtTLR5S polynucleotide. In one embodiment, the method according to the present invention preferably further uses an immunogenic component.

一実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含み得る。本実施形態に係る薬学的組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。  In one embodiment, a pharmaceutical composition for preventing cancer or infection according to the present invention may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. In the pharmaceutical composition according to this embodiment, the immunogenic component preferably contains a polynucleotide encoding an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 (ie, FlaA or FlaC cDNA).

本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を含んでもよい。  The pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a huTLR5 polynucleotide. In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention may include a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

他の実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するための薬学的組成物は、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含み得る。本実施形態に係る薬学的組成物において、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。  In other embodiments, a pharmaceutical composition for preventing cancer or infection according to the present invention may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide, and an immunologically effective amount of an immunogenic component. In the pharmaceutical composition according to this embodiment, the immunogenic component preferably contains an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8 (ie, FlaA protein or FlaC protein).

本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る薬学的組成物は、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を含んでいてもよい。  The pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a huTLR5 polypeptide. Moreover, the pharmaceutical composition according to the present invention may contain huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of the huTLR5 polypeptide.

本明細書において使用される場合、「薬学的組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を単一形態中に含む。従って、当該２成分を別々に投与することが意図される場合、「薬学的組成物」は、アジュバント成分および免疫原成分を別個に備えるキットとして提供される。  As used herein, a “pharmaceutical composition” includes an adjuvant component and an immunogenic component in a single form. Accordingly, when the two components are intended to be administered separately, the “pharmaceutical composition” is provided as a kit comprising the adjuvant component and the immunogenic component separately.

本発明に係る薬学的組成物は、アジュバント成分および免疫原成分以外に薬学的に受容可能なキャリアを含んでもよい。薬学的組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。薬学的に受容可能なキャリア、投与形態、剤型などについては、上記「ワクチン」の項を参照のこと。  The pharmaceutical composition according to the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the adjuvant component and the immunogenic component. The pharmaceutically acceptable carrier used in the pharmaceutical composition can be selected according to the dosage form and dosage form of the pharmaceutical composition. See the above “Vaccines” section for pharmaceutically acceptable carriers, dosage forms, dosage forms, and the like.

一実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るキットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（すなわち、ＦｌａＡまたはＦｌａＣのｃＤＮＡ）によってコードされることがより好ましい。  In one embodiment, a kit for preventing cancer or infection according to the present invention may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polynucleotide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. Preferably, these two components can each be contained in separate containers. In the kit according to this embodiment, the immunogenic component preferably includes a polynucleotide encoding an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably encoded by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7 (ie, FlaA or FlaC cDNA).

本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞を備えていてもよい。  The kit for preventing cancer or infection according to the present invention may further comprise a huTLR5 polynucleotide. Moreover, the kit for preventing cancer or infectious disease according to the present invention may comprise a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced instead of a huTLR5 polynucleotide.

他の実施形態において、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備え得る。好ましくは、これら２成分はそれぞれ別個の容器中に収容され得る。本実施形態に係るキットにおいて、上記免疫原成分は抗原性ペプチドを含むことが好ましい。上記抗原性ペプチドは鞭毛細菌であることが好ましく、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、ＦｌａＡタンパク質またはＦｌａＣタンパク質）であることがより好ましい。  In other embodiments, a kit for preventing cancer or infection according to the present invention may comprise an adjuvant component comprising an rtTLR5S polypeptide and an immunologically effective amount of an immunogenic component. Preferably, these two components can each be contained in separate containers. In the kit according to this embodiment, the immunogenic component preferably contains an antigenic peptide. The antigenic peptide is preferably a flagellar bacterium, and more preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8 (ie, FlaA protein or FlaC protein).

本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えていてもよい。また、本発明に係るガンまたは感染症を予防するためのキットは、ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドの代わりにｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞を備えていてもよい。  The kit for preventing cancer or infection according to the present invention may further comprise a huTLR5 polypeptide. Moreover, the kit for preventing cancer or infectious disease according to the present invention may comprise huTLR5 polypeptide-expressing cells instead of huTLR5 polypeptide.

フラジェリンは自然免疫のアジュバント機能を介する抗ガン活性および／または抗感染活性を有する。従って、抗原性を有する物質と組み合わせてｒｔＴＬＲ５Ｓをヒトに投与すれば、フラジェリン依存性の樹状細胞療法、抗ガン免疫療法などという、安全かつ効果的な療法を提供することができる。また、本明細書の記載に基づけば、本発明に係る薬学的組成物またはキットを用いるガンまたは感染症を予防するための方法もまた、本発明の技術的範囲に属することを、当業者は容易に理解する。  Flagellin has anti-cancer activity and / or anti-infective activity through the adjuvant function of innate immunity. Therefore, when rtTLR5S is administered to humans in combination with a substance having antigenicity, safe and effective therapies such as flagellin-dependent dendritic cell therapy and anti-cancer immunotherapy can be provided. In addition, based on the description of the present specification, those skilled in the art will recognize that methods for preventing cancer or infectious diseases using the pharmaceutical composition or kit according to the present invention also belong to the technical scope of the present invention. Easy to understand.

〔７〕被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬、キットおよび方法
本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドは、鞭毛細菌、特に、鞭毛タンパク質のフラジェリンを認識して、ヒトまたはマウスのような哺乳動物が有するｒｔＴＬＲ５を活性化し、フラジェリンに起因するＮＦ−κＢ活性化およびサイトカイン産生を増強させる。従って、ＮＦ−κＢ活性化およびサイトカイン産生を指標にすれば、ｒｔＴＬＲ５を発現している脊椎動物の被験体サンプル中における鞭毛細菌の存在を、本発明に係るｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを用いて検出することができる。[7] Detection Agent, Kit, and Method for Detecting Flagella Bacteria in a Subject Sample The rtTLR5S polypeptide according to the present invention recognizes flagellin bacteria, particularly flagellin flagellin, and has a human or mouse It activates rtTLR5 in mammals and enhances NF-κB activation and cytokine production caused by flagellin. Therefore, if NF-κB activation and cytokine production are used as indicators, the presence of flagellate bacteria in a vertebrate subject sample expressing rtTLR5 can be detected using the rtTLR5S polypeptide of the present invention. it can.

すなわち、本発明は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬、キットおよび方法を提供する。  That is, the present invention provides detection agents, kits and methods for detecting flagellar bacteria in a subject sample.

被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含む試薬を被験体サンプルに添加してインキュベートし、当該被験体サンプル中に産生されたサイトカインの量を測定し、試薬添加前における被験体サンプル中のサイトカインの量と比較することによって、被験体サンプル中における鞭毛細菌の存在を検出することができる。  In order to detect flagellar bacteria in a subject sample, a reagent containing an rtTLR5S polypeptide is added to the subject sample and incubated, and the amount of cytokine produced in the subject sample is measured, before the addition of the reagent. By comparing with the amount of cytokine in the subject sample, the presence of flagellar bacteria in the subject sample can be detected.

一実施形態において、本発明に係る検出薬は、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを含み得る。  In one embodiment, the detection agent according to the present invention may comprise an rtTLR5S polypeptide for detecting flagellar bacteria in a subject sample.

本発明に係る検出薬はまた、キットの形態で提供され得る。すなわち、一実施形態において、本発明に係る検出キットは、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリペプチドを備え得る。  The detection agent according to the present invention can also be provided in the form of a kit. That is, in one embodiment, the detection kit according to the present invention may comprise an rtTLR5S polypeptide in order to detect flagellar bacteria in a subject sample.

本明細書中の記載に基づけば、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを含む試薬もまた、本発明に係る被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬の技術的範囲に属することを、当業者は容易に理解する。さらに、ｒｔＴＬＲ５Ｓポリヌクレオチドを備えるキットもまた、本発明に係る被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出キットの技術的範囲に属することを、当業者は容易に理解する。  Based on the description herein, those skilled in the art will readily recognize that a reagent containing an rtTLR5S polynucleotide also belongs to the technical scope of a detection agent for detecting flagellar bacteria in a subject sample according to the present invention. To understand. Furthermore, those skilled in the art will readily understand that a kit comprising an rtTLR5S polynucleotide also belongs to the technical scope of a detection kit for detecting flagella bacteria in a subject sample according to the present invention.

本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。  The invention is illustrated in more detail by the following examples, but should not be limited thereto.

〔実施例１：ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのクローニングおよび組織分布〕
Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに曝露したニジマス由来のＥＳＴクローン（ＡＦ２８１３４６）をクローニングし、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥを行い、その結果、ｒｔＴＬＲ５Ｓ ｃＤＮＡの全長を、クローニングした。[Example 1: Cloning and tissue distribution of rtTLR5S and rtTLR5M]
V. A rainbow trout-derived EST clone (AF281346) exposed to angulararum was cloned and 3′-RACE and 5′-RACE were performed using SMART RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences), resulting in the full length of rtTLR5S cDNA. Cloned.

具体的には、肝臓ｃＤＮＡテンプレート、および、プライマー１特異的エンドプライマーまたはプライマー２特異的エンドプライマー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかと対のｒｔＴＬＲ５Ｓ遺伝子特異的内部プライマー（５’−ＲＡＣＥについて：Ｓ−ＧＳＰ／Ｆ（配列番号９）およびＳ−ＮＧＳＰ／Ｆ（配列番号１０）、３’−ＲＡＣＥについて：Ｓ−ＧＳＰ／Ｒ（配列番号１１））（表１）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に直接クローニングし、いくつかの別個の形質転換体を、ＡＢＩ３１００ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用するＤＮＡ配列決定に供して、配列精度を評価した。プライマーＳＦ（配列番号１２）およびＳＲ（配列番号１３）（表１）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって、肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ全長を得た。シグナル配列を除くｒｔＴＬＲ５ＳをコードするｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。  Specifically, a liver cDNA template and an rtTLR5S gene-specific internal primer (for 5'-RACE: S-GSP /) paired with either a primer 1 specific end primer or primer 2 specific end primer (BD Biosciences) PCR was performed using F (SEQ ID NO: 9) and S-NGSP / F (SEQ ID NO: 10), 3′-RACE: S-GSP / R (SEQ ID NO: 11)) (Table 1). PCR products were cloned directly into pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI) and several separate transformants were subjected to DNA sequencing using ABI3100 sequencer (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). The sequence accuracy was evaluated. The full-length rtTLR5S cDNA was obtained from the liver cDNA library by RT-PCR using primers SF (SEQ ID NO: 12) and SR (SEQ ID NO: 13) (Table 1). A cDNA encoding rtTLR5S excluding the signal sequence was inserted into the HindIII-SalI site of the pFLAG-CMV plasmid.

Figure 2006085411
モチーフ検索、Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｐｌｏｔ、およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗ比較の結果は、アミノ酸配列がヒトＴＬＲ５の細胞外ＬＲＲドメインに対応し、驚くことに、膜貫通領域またはＴＩＲドメインを含まないことを示した（図１Ｂ）。ＳＭＡＲＴ分析は、このタンパク質中に１０個のＬＲＲを規定した（図１Ｃ）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、この推定のタンパク質をニジマスの可溶性形態のＴＬＲ５（ｒｔＴＬＲ５Ｓ）と名付けた。また、ｍＲＮＡならびにＳＦプライマー（配列番号１２）およびＳＲプライマー（配列番号１３）（表１）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｓについて７つの別々のＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングした。
Figure 2006085411
 The results of the motif search, Kyte and Doolittle plot, and Clustal W comparison showed that the amino acid sequence corresponds to the extracellular LRR domain of human TLR5 and surprisingly does not contain a transmembrane region or TIR domain (FIG. 1B). ). SMART analysis defined 10 LRRs in this protein (FIG. 1C). Based on these results, we named this putative protein rainbow trout soluble form TLR5 (rtTLR5S). Seven separate RT-PCR products were also cloned for rtTLR5S using mRNA and SF primer (SEQ ID NO: 12) and SR primer (SEQ ID NO: 13) (Table 1).

次いで、ニジマスにおける膜結合形態のＴＬＲ５を同定するために、ヒトＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５およびｆｇＴＬＲ５のＴＩＲの間で保存されている配列に従って、縮重プライマーを設計した（図１Ａ）。縮重プライマーを使用するＰＣＲ、引き続くＲＡＣＥ法によって、さらなるＴＬＲ５様ｃＤＮＡ（ｒｔＴＬＲ５Ｍの部分配列）をクローニングした。得られたフラグメントの配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を使用して整列させた（図１Ａ）。  Degenerate primers were then designed according to sequences conserved among the TIRs of human TLR5, mouse TLR5 and fgTLR5 to identify membrane-bound forms of TLR5 in rainbow trout (FIG. 1A). Additional TLR5-like cDNA (partial sequence of rtTLR5M) was cloned by PCR using degenerate primers followed by RACE method. The sequence of the resulting fragments was aligned using Clustal W (Clustalw.genome.ad.jp/) (FIG. 1A).

図１Ａは、ｒｔＴＬＲ５Ｍを単離するための縮重プライマーの設計を示す。ヒトＴＬＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６０８９５）、マウスＴＬＲ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８６１０７）およびフグＴＬＲ５（Ａｋｉｒａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，４９９−５１１（２００４）を参照のこと）のＴＩＭドメインを、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムによって整列させた。縮重プライマーを、高度に保存された領域（四角で囲む）を参照して設計した。縮重プライマーの配列を整列の下に示す（配列番号３６および３７）。ｈｕはヒト；ｍｏはマウス；ｆｇはフグを示す。  FIG. 1A shows the design of a degenerate primer for isolating rtTLR5M. See human TLR5 (GenBank accession number AB060895), mouse TLR5 (GenBank accession number AF186107) and puffer TLR5 (Akira, S., and Takeda, K. Nat. Rev. Immunol. 4, 499-511 (2004)). The TIM domain was aligned by the ClustalW program. Degenerate primers were designed with reference to highly conserved regions (boxed). The sequence of the degenerate primer is shown below the alignment (SEQ ID NO: 36 and 37). hu is human; mo is mouse; fg is pufferfish.

Ｈ−ＭＬＶ（−）ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ニジマス肝臓より調製したランダムにプライムしたＲＮＡテンプレートから第１鎖ｃＤＮＡを逆転写した。次に、Ｍａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｍ全長配列を得た。肝臓ｃＤＮＡテンプレート、およびアダプタープライマー１（ＡＰ１）またはＡＰ２特異的末端プライマー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに直接連結し、いくつかの別個の形質転換体を以下に記載のようにＤＮＡ配列決定に供した。最終的に、プライマーＭＦ（配列番号１８）およびＭＲ（配列番号１９）（表１）を使用するＲＴ−ＰＣＲによって肝臓ｃＤＮＡから全長ｒｔＴＬＲ５Ｍ ｃＤＮＡを得た。シグナル配列を欠失したｒｔＴＬＲ５ＭをコードするｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶプラスミドのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ部位の間に挿入した。  First strand cDNA was reverse transcribed from randomly primed RNA templates prepared from rainbow trout liver using H-MLV (-) reverse transcriptase (Promega). Next, the full length rtTLR5M sequence was obtained using the Marathon RACE cDNA amplification kit (BD Biosciences). Liver cDNA templates and adapter primer 1 (AP1) or AP2-specific end primers (BD Biosciences) were used. The PCR product was directly ligated into pGEM-T Easy Vector and several separate transformants were subjected to DNA sequencing as described below. Finally, full-length rtTLR5M cDNA was obtained from liver cDNA by RT-PCR using primers MF (SEQ ID NO: 18) and MR (SEQ ID NO: 19) (Table 1). CDNA encoding rtTLR5M lacking the signal sequence was inserted between the SalI-NotI sites of the pFLAG-CMV plasmid.

相同性検索分析によって、このｃＤＮＡがヒトＴＬＲ５のオルソログであることがわかった。このオルソログは、推定のシグナルペプチド、１１個のＬＲＲ（ＬＲＲ Ｃ末端隣接領域を含む）、およびＴＩＲドメインを含んだ（図１ＢおよびＣ）。また、ＭＦプライマー（配列番号１８）およびＭＲプライマー（配列番号１９）（表１）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｍについて４つの別々のＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングした。  Homology search analysis revealed that this cDNA is an ortholog of human TLR5. This ortholog contained a putative signal peptide, 11 LRRs (including the LRR C-terminal flanking region), and a TIR domain (FIGS. 1B and C). Also, four separate RT-PCR products were cloned for rtTLR5M using MF primer (SEQ ID NO: 18) and MR primer (SEQ ID NO: 19) (Table 1).

ｒｔＴＬＲ５ＭおよびｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ配列に基づく推定のアミノ酸配列の整列を、図１Ｂに示す。ここで、２つの型のｒｔＴＬＲ５細胞外ドメインの間の相同性を示す。推定のシグナル配列に太い下線を付す。ＥＳＴクローン（ＡＦ２８１３４６．１）の位置に下線を付す。縮重プライマーを用いて得たｃＤＮＡフラグメントに二重下線を付す。保存されたシステインを四角で囲む。ｒｔＴＬＲ５ＭおよびｒｔＴＬＲ５ＳのＬＲＲ領域は、８１．０％の相同性を示した。  The alignment of the deduced amino acid sequence based on the rtTLR5M and rtTLR5S cDNA sequences is shown in FIG. 1B. Here, the homology between the two types of rtTLR5 extracellular domain is shown. The putative signal sequence is underlined. The position of the EST clone (AF2813346.1) is underlined. The cDNA fragment obtained using the degenerate primer is double underlined. The conserved cysteine is boxed. The LRR regions of rtTLR5M and rtTLR5S showed 81.0% homology.

ｒｔＴＬＲ５Ｓの総合的な配列は、１９９２ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および１１６８ｂｐの３’−ＵＴＲからなる。３つのポリアデニル化シグナルを３’−ＵＴＲ中に見出した。その最後の１つの後ろにポリ（Ａ）テールが続く。このｃＤＮＡの推定のアミノ酸配列は、６６４アミノ酸である。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、ヒトＴＬＲ５およびマウスＴＬＲ５とそれぞれ３５．６％および３７．１％の相同性を有する。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、他のヒトＴＬＲまたはマウスＴＬＲの細胞外ドメインと２５％未満の相同性を示した。ｍｏ／ｈｕＴＬＲ５のＬＲＲドメイン中のシステイン１１個中９個が、ｒｔＴＬＲ５Ｓにおいて保存されていた。  The overall sequence of rtTLR5S consists of a 1992 bp open reading frame (ORF) and a 1168 bp 3'-UTR. Three polyadenylation signals were found in the 3'-UTR. The last one is followed by a poly (A) tail. The deduced amino acid sequence of this cDNA is 664 amino acids. rtTLR5S has 35.6% and 37.1% homology with human TLR5 and mouse TLR5, respectively. rtTLR5S showed less than 25% homology with the extracellular domain of other human or mouse TLRs. Nine of 11 cysteines in the LRR domain of mo / huTLR5 were conserved in rtTLR5S.

ｒｔＴＬＲ５Ｍの総合的な配列は、２６８７ｂｐのＯＲＦおよび５４４ｂｐの３’−ＵＴＲからなる。３’−ＵＴＲ中のポリアデニル化シグナルの後ろにポリ（Ａ）テールが続く。このｃＤＮＡの推定のアミノ酸配列は、８７９アミノ酸である（図１Ｂ）。ｒｔＴＬＲ５Ｍは、ヒトＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５およびｆｇＴＬＲ５とそれぞれ４０．１、４０．５％および４８．５％の相同性を有する。ｒｔＴＬＲ５Ｍは、他のヒトＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５およびｆｇＴＬＲ５と２５％未満の相同性を示した。マウスＴＬＲ５およびヒトＴＬＲ５の細胞外ドメイン中に存在する１０個のシステインが、ｒｔＴＬＲ５Ｍにおいて保存されていた。  The overall sequence of rtTLR5M consists of a 2687 bp ORF and a 544 bp 3'-UTR. A poly (A) tail follows the polyadenylation signal in the 3'-UTR. The deduced amino acid sequence of this cDNA is 879 amino acids (FIG. 1B). rtTLR5M has 40.1, 40.5% and 48.5% homology with human TLR5, mouse TLR5 and fgTLR5, respectively. rtTLR5M showed less than 25% homology with other human TLR5, mouse TLR5 and fgTLR5. Ten cysteines present in the extracellular domain of mouse TLR5 and human TLR5 were conserved in rtTLR5M.

図１Ｃは、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのドメイン配向を示す模式図である。各ドメインを、ＳＭＡＲＴプログラムを用いて予測した。ＬＲＲ−ＣＴは、あるＬＲＲドメインと類似するＣ末端隣接領域を示す。  FIG. 1C is a schematic diagram showing the domain orientation of rtTLR5S and rtTLR5M. Each domain was predicted using the SMART program. LRR-CT shows a C-terminal flanking region similar to certain LRR domains.

さらに、表１に示す特異的プライマーセットを使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｍ特異的メッセージおよびｒｔＴＬＲ５Ｓ特異的メッセージについて、７つの組織を調べた。ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの組織分布を示すＲＴ−ＰＣＲの結果を図１Ｄに示す。ｒｔＴＬＲ５Ｍは全ての組織で普遍的に発現していたが、ｒｔＴＬＲ５Ｓは肝臓に優勢に存在した。  In addition, seven tissues were examined for rtTLR5M specific messages and rtTLR5S specific messages using the specific primer sets shown in Table 1. The RT-PCR results showing the tissue distribution of rtTLR5S and rtTLR5M are shown in FIG. 1D. rtTLR5M was ubiquitously expressed in all tissues, while rtTLR5S was predominantly present in the liver.

なお、ｃＤＮＡのアラインメントおよびモチーフ分析を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４上で、ＧＥＮＥＴＹＸ，Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて行った。ニジマス（ｒｔ）の遺伝子配列（ＩＬ−１β（ＡＪ００４８２１）、ＴＮＦ−α（ＡＪ２７７６０４）、およびβ−アクチン（ＡＪ４３８１５８）を、ＮＣＢＩより得た。  CDNA alignment and motif analysis were performed on Macintosh G4 using GENETYX, Clustal W. The rainbow trout (rt) gene sequences (IL-1β (AJ004821), TNF-α (AJ277604), and β-actin (AJ438158) were obtained from NCBI.

〔実施例２：ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの遺伝子特性〕
ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍの遺伝子特性を調べた。ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのエクソン−イントロン構造を、図２Ａに示す。黒バーは、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍのコード領域を示す。挿入領域でのイントロンを、灰色のバー（７５７ｂｐ）で示す。[Example 2: Genetic characteristics of rtTLR5S and rtTLR5M]
The genetic characteristics of rtTLR5S and rtTLR5M were examined. The exon-intron structures of rtTLR5S and rtTLR5M are shown in FIG. 2A. Black bars indicate the coding regions of rtTLR5S and rtTLR5M. Introns at the insertion region are indicated by gray bars (757 bp).

図２Ａに示すように、ｒｔＴＬＲ５Ｓ遺伝子は、シグナルペプチドの近く（ＡＴＧ開始コドンから２０ｂｐ）に７５７ｂｐのイントロンを有したが、ｒｔＴＬＲ５Ｍの遺伝子は、イントロンを有さない。  As shown in FIG. 2A, the rtTLR5S gene had a 757 bp intron near the signal peptide (20 bp from the ATG start codon), whereas the rtTLR5M gene has no intron.

次いで、サザンブロット分析を行うために以下のようなプローブを設計した：ｒｔＴＬＲ５ＭのＴＩＲ領域をカバーするプローブ（プローブＭ：ｒｔＴＬＲ５Ｍの１８６７〜２７０７ｎｔ、８４１ｂｐ）；ならびに、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５Ｍに大きく共通するＬＲＲ領域をカバーするプローブ（プローブＳ：ｒｔＴＬＲ５Ｓの３５４〜１３１４ｎｔ、９６１ｂｐ）。  The following probes were then designed for Southern blot analysis: a probe covering the TIR region of rtTLR5M (probe M: 1867-2707 nt of 841 bp of rtTLR5M); and the LRR region largely common to rtTLR5S and rtTLR5M Probe (probe S: 354-1314nt of rtTLR5S, 961 bp).

サザンブロットを以下のように行った。ニジマス肝臓から抽出した１０μｇのゲノムＤＮＡを、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、標準的な電気泳動分離法によって１．０％アガロースゲル上で分離した。製造業者の指示書に従って、アガロースゲルからナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にＤＮＡを転写した。ＭｅｇａＰｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＰＣＲ増幅したプローブＳおよびＭ（図２Ａ）を、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ブロットを、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて５０℃で２０分間を２回洗浄した。ブロットを、イメージングプレートに供して、ＦＬＡ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）を使用して分析した。Southern blots were performed as follows. 10 μg genomic DNA extracted from rainbow trout liver was digested with various restriction endonucleases and separated on a 1.0% agarose gel by standard electrophoretic separation methods. DNA was transferred from agarose gel onto nylon membrane (Hybond N +, Amersham Biosciences) according to manufacturer's instructions. PCR amplified probes S and M (FIG. 2A) were labeled with [α- 32 P] dCTP using the MegaPrime DNA labeling system (Amersham Biosciences). Hybridization was performed for 1 hour in ExpressHyb Solution (BD Sciences). After hybridization, the blot was washed twice for 20 minutes at 50 ° C. in 0.1 × SSC containing 0.1% SDS. Blots were subjected to imaging plates and analyzed using a FLA imaging analyzer (Fuji Film, Japan).

図２Ｂおよび図２Ｃは、サザン分析の結果を示す。プローブＳおよびプローブＭを、それぞれ図２Ｂおよび図２Ｃでのサザン分析に使用した。１０μｇのニジマスゲノムＤＮＡを、示した制限酵素によって消化した。消化物を、アガロースゲル電気泳動に供し、そしてＨｉ−ｂｏｎｄ Ｎ＋ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅに転写した。プローブＳ（図２Ｂ）およびプローブＭ（図２Ｃ）によって検出したバンドをそれぞれ示す。マーカーを左側に示す。2B and 2C show the results of Southern analysis. Probe S and probe M were used for Southern analysis in FIGS. 2B and 2C, respectively. 10 μg of rainbow trout genomic DNA was digested with the indicated restriction enzymes. The digest was subjected to agarose gel electrophoresis and transferred to Hi-bond N + nylon membrane. Bands detected by probe S (FIG. 2B) and probe M (FIG. 2C) are shown, respectively. Markers are shown on the left.

ｒｔＴＬＲ５のＤＮＡのＯＲＦ、イントロン、および３’−ＵＴのヌクレオチド配列に基づけば、ｒｔＴＬＲ５Ｓ中においてプローブＳの下流にＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩが各々１つ存在する（図中、制限部位を、Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）およびＰｓ（ＰｓｔＩ）で示す）。従って、制限フラグメントの長さに基づけば、フラグメントのサイズは２．４ｋｂｐより長いはずである。各レーンにおいて予想された２つのフラグメントに加え、サザンブロットにおいて得られた実際のフラグメントは、２．４ｋｂｐ未満であった（図２Ｂ）。このことは、同様の配列ではあるが異なる配列を有するさらなる遺伝子の存在を示唆する。ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した場合に、プローブＳを用いて約１．５ｋｂｐのフラグメントを検出した。このことは、さらにこの点を確認する。  Based on the nucleotide sequence of rtTLR5 DNA ORF, intron, and 3′-UT, there is one EcoRI, HindIII, and PstI downstream of probe S in rtTLR5S (in the figure, the restriction site is E (EcoRI ), H (HindIII) and Ps (PstI)). Therefore, based on the length of the restriction fragment, the fragment size should be longer than 2.4 kbp. In addition to the two fragments expected in each lane, the actual fragment obtained in the Southern blot was less than 2.4 kbp (FIG. 2B). This suggests the presence of additional genes with similar but different sequences. When digested with PstI and EcoRI, a probe S was used to detect a fragment of about 1.5 kbp. This further confirms this point.

図２Ｃに示すように、ＥｃｏＲＩで消化したレーンまたはＰｓｔＩで消化したレーンにおいて、約１ｋｂｐのフラグメントを検出した。このことは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ遺伝子の存在を反映する。ＨｉｎｄＩＩＩ消化の際に得た３．５ｋｂｐのフラグメントは、ｒｔＴＬＲ５Ｍ遺伝子に対応し得る。さらに上のバンド（薄いバンド）は、同様のＴＩＲ配列を含むさらなる配列の存在を示唆する。さらに、本発明者らはまた、ｒｔＴＬＲ５Ｍに類似のペプチドをコードする推定のコード領域中に多くの終始コドンを有する偽遺伝子（第３の遺伝子）を配列決定した（データは示さず）。  As shown in FIG. 2C, a fragment of about 1 kbp was detected in the lane digested with EcoRI or the lane digested with PstI. This reflects the presence of the rtTLR5M gene. The 3.5 kbp fragment obtained upon HindIII digestion can correspond to the rtTLR5M gene. The upper band (thin band) suggests the presence of additional sequences including similar TIR sequences. In addition, we also sequenced a pseudogene (third gene) with many stop codons in a putative coding region encoding a peptide similar to rtTLR5M (data not shown).

〔実施例３：ｒｔＴＬＲ５ＳはＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに反応して誘導される〕
次に、ｒｔＴＬＲ５ＳがＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍでの感染によって上方制御されるか否かを調べた。具体的には、死菌Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍでの細胞刺激後のｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βのｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングして、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍに対するＲＴＨ−１４９細胞の応答を調べた。Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍは、Ｄｒ．Ｔａｋａｊｉ Ｉｉｄｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｇｅｎｃｙ）より供与された。Example 3: rtTLR5S induced in response to Anguillarum)
Next, rtTLR5S is V.V. It was investigated whether it was up-regulated by infection with Anguillarum. Specifically, killed bacteria V.I. rtTLR5M, rtTLR5S and rtIL-1β mRNA after cell stimulation with angulararum were monitored by RT-PCR and The response of RTH-149 cells to angulararum was examined. V. angulararum, Dr. Courtesy of Takaji Iids (National Research Institute of Aquaculture, Fisheries Research Agency).

ＲＴ−ＰＣＲを以下のように行った。ＴＲＩｓｏｌ試薬を使用して、総ＲＮＡを、ＲＴＨ−１４９細胞から単離した。精製したＲＮＡサンプルを、逆転写反応のテンプレートとして使用した。各タイプのｒｔＴＬＲ５、ｒｔＩＬ−１β、ｒｔＴＮＦ−α、およびコントロールとしてのｒｔβ−アクチンについて特異的なプライマーを使用して、以下の条件を用いてＰＣＲを行った：９４℃で２分間の最初の変性、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間を２５〜４０サイクル。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列を表２に示す。ＰＣＲ産物を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミド（１μｇ／ｍｌ）で可視化した。３回の独立した実験を行い、代表的な一例を図３に示した。  RT-PCR was performed as follows. Total RNA was isolated from RTH-149 cells using TRIsol reagent. The purified RNA sample was used as a template for the reverse transcription reaction. PCR was performed using primers specific for each type of rtTLR5, rtIL-1β, rtTNF-α, and rtβ-actin as a control using the following conditions: Initial denaturation at 94 ° C. for 2 minutes 25-40 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute. Table 2 shows the primer sequences used in RT-PCR. PCR products were separated on a 1.5% (w / v) agarose gel and visualized with ethidium bromide (1 μg / ml). Three independent experiments were performed, and a representative example is shown in FIG.

Figure 2006085411
図３に示すように、休止期のＲＴＨ−１４９細胞において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ ｍＲＮＡはわずかに検出可能であった。ｒｔＴＬＲ５Ｓ ｍＲＮＡは、細菌刺激４時間後に誘導された。ｍＲＮＡレベルは、６時間で最大となり、次いで、徐々に減少した。一方、ｒｔＴＬＲ５ＭのｍＲＮＡは、この細胞株において刺激に関係なく構成的に発現した。同一の条件下で、急性期のサイトカインであるｒｔＩＬ−１βは、１時間以内に上方制御されそして３〜１０時間にわたるピークを示した。
Figure 2006085411
 As shown in FIG. 3, rtTLR5S mRNA was slightly detectable in resting RTH-149 cells. rtTLR5S mRNA was induced 4 hours after bacterial stimulation. mRNA levels reached a maximum at 6 hours and then gradually decreased. On the other hand, rtTLR5M mRNA was constitutively expressed in this cell line regardless of stimulation. Under the same conditions, the acute phase cytokine rtIL-1β was up-regulated within 1 hour and showed a peak over 3-10 hours.

これらの結果より、ｒｔＴＬＲ５Ｓは、刺激に応答する急性期のタンパク質であることがわかった。生殖系のリンパ細胞株であるＲＴＧ−２においてｒｔＴＬＲ５Ｓの誘導プロファイルを観察し、定量的ＰＣＲによって確認したところ、ＲＴＨ−１４９細胞において得られた結果と同様であった（データは示さず）。  From these results, it was found that rtTLR5S is an acute phase protein that responds to stimulation. The induction profile of rtTLR5S was observed in the germline lymphoid cell line RTG-2 and confirmed by quantitative PCR, which was similar to the results obtained in RTH-149 cells (data not shown).

以上のことから、ｒｔＩＬ−１βおよびｒｔＴＬＲ５Ｓの急性期の応答は、主に細菌刺激によって生じ、おそらくｒｔＴＬＲ５の膜結合形態を介すると考えられた。  From the above, it was considered that the acute phase response of rtIL-1β and rtTLR5S was mainly caused by bacterial stimulation, probably through the membrane-bound form of rtTLR5.

〔実施例４：リコンビナントＶ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍフラジェリンの精製〕
リコンビナントＧＳＴ−ＦｌａＡおよびＧＳＴ−ＦｌａＣをＥ．ｃｏｌｉにおいて生成し、これらのタンパク質を、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて精製した（図４Ａ）。[Example 4: Recombinant V. (Anguillarum flagellin purification)
Recombinant GST-FlaA and GST-FlaC were transformed into E. coli. These proteins were produced in E. coli and purified using glutathione-Sepharose (FIG. 4A).

具体的には、リコンビナントフラジェリンの産生を以下のように行った。Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍのゲノムＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１））によって単離した。ｆｌａＡ（ＡＡＢ０６９９５）およびｆｌａＣ（Ｕ５２１１９）をＧＳＴとインフレームで融合させるために、ゲノムＤＮＡからコード領域を増幅した。ｆｌａＡをクローニングするためにプライマー（５’−ｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇａｃｃａｔｔａｃａｇｔａａａｔａｃｔａａｃｇｔｃｔｃａｇｃａａｔｇ−３’（配列番号３２）および５’−ａｔｃｃｃｇｇｇｔｔａｃｔｇｃａａｔａｇｔｇａｃａｔｔｇｃａｇａａｔｔｔｇｇｃａａｃｔｇ−３’（配列番号３３））を、ｆｌａＣをクローニングするためにプライマー（５’−ｃｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｃｇｇｔｔａａｔｇｔａａａｃａｃｔａａｃｇｔｔｔｃａｇｃ−３’（配列番号３４）および５’−ｃｃｇａａｔｔｃｔｔａａｃｃａａｇｃａａａｃｃａａｇａｇｃａｇｃａｔｔａｇｇ−３’（配列番号３５））を使用した。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に先ずクローニングし、次いで、ｐＧＥＸ−２Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位（ｆｌａＡ）およびＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位（ｆｌａＣ）にクローニングし、それぞれｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＡおよびｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＣと名付けた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞を、ｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＡまたはｐＧＥＸ２Ｔ／ＦｌａＣで形質転換し、ＧＳＴタグ化フラジェリンＡ（ＧＳＴ−ＦｌａＡ）およびＧＳＴタグ化フラジェリンＣ（ＧＳＴ−ＦｌａＣ）を、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示書に従って使用して、可溶化した細胞から精製した。精製したＧＳＴ−ＦｌａＡおよびＧＳＴ−ＦｌａＣを、製造業者の指示書に従ってトロンビンで消化して、リコンビナントフラジェリンＡ（ｒＦｌａＡ）およびリコンビナントフラジェリンＣ（ｒＦｌａＣ）と名付けた。これら産物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。  Specifically, recombinant flagellin was produced as follows. V. Anguillarum genomic DNA was isolated by Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, Cold Spring 1). To fuse flaA (AAB06955) and flaC (U52119) in frame with GST, the coding region was amplified from genomic DNA. Primers to clone the flaA (5'-ccggatccatgaccattacagtaaatactaacgtctcagcaatg-3 '(SEQ ID NO: 32) and 5'-atcccgggttactgcaatagtgacattgcagaatttggcaactg-3' (SEQ ID NO: 33)) and primers for cloning flaC (5'-ccggatccatggcggttaatgtaaacactaacgtttcagc-3 '(SEQ ID NO: 34) and 5'-ccgaattcttaacccaagcaaaaccagcatcattag-3' (SEQ ID NO: 35)) were used. The resulting PCR product was first cloned into a PCR-Blunt vector (Invitrogen), then cloned into the BamHI / SmaI site (flaA) and the BamHI / EcoRI site (flaC) of pGEX-2T vector (Amersham Biosciences), respectively X / FlaA and pGEX2T / FlaC. E. E. coli BL21 (DE3) pLysE cells were transformed with pGEX2T / FlaA or pGEX2T / FlaC, and GST-tagged flagellin A (GST-FlaA) and GST-tagged flagellin C (GST-FlaC) were transformed into glutathione-Sepharose (Amer esmase cAmase cAmase cAmase cAmase cAmase cAma ) Was purified from solubilized cells using the manufacturer's instructions. Purified GST-FlaA and GST-FlaC were digested with thrombin according to the manufacturer's instructions and named recombinant flagellin A (rFlaA) and recombinant flagellin C (rFlaC). The purity of these products was confirmed by SDS-PAGE.

リコンビナントフラジェリン調製物中のＬＰＳ夾雑は、ＬＰＳ検出キットの検出限界未満であった（＜０．０２ｐＭ）。ＬＰＳの影響のわずかな可能性を完全に排除するために、精製した物質を、ポリミキシンＢでさらに試験した。  LPS contamination in the recombinant flagellin preparation was below the detection limit of the LPS detection kit (<0.02 pM). The purified material was further tested with polymyxin B to completely eliminate the slight possibility of LPS effects.

精製したｒＦｌａＡおよびｒＦｌａＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）によって分離し、Ｂｉｏ−ＳａｆｅＴＭクーマシーブルーで染色した結果を、図４Ａおよび図４Ｂに示す。図４Ａは、ＧＳＴ−フラジェリン融合タンパク質を示し、図４Ｂは、トロンビンによってＧＳＴが除かれたフラジェリンタンパク質を示す。精製したＧＳＴ融合タンパク質は６０ｋＤａであり、これは、フラジェリン配列＋ＧＳＴタグから予測される分子量に一致した。Purified rFlaA and rFlaC were separated by SDS-PAGE (10% gel) and stained with Bio-Safe ™ Coomassie Blue. The results are shown in FIGS. 4A and 4B. FIG. 4A shows a GST-flagellin fusion protein and FIG. 4B shows a flagellin protein with GST removed by thrombin. The purified GST fusion protein was 60 kDa, which was consistent with the molecular weight predicted from the flagellin sequence + GST tag.

〔実施例５：リコンビナントフラジェリンタンパク質によるＲＴＨ−１４９細胞またはＲＴＧ−２細胞の刺激〕
血球細胞においてｒｔＴＬＲ５Ｍがフラゲリンを認識するか否かを試験するために、ＲＴＨ−１４９細胞を精製したｒＦｌａＡで刺激した。[Example 5: Stimulation of RTH-149 cells or RTG-2 cells by recombinant flagellin protein]
To test whether rtTLR5M recognizes flagellin in blood cells, RTH-149 cells were stimulated with purified rFlaA.

ＲＴＨ−１４９細胞およびＲＴＧ−２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ｍｉｎｉｍａｌ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ，Ｎｉｓｓｕｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ 非必須アミノ酸溶液および１ｍＭ ＭＥＭ ピルビン酸ナトリウム溶液中で培養し、６ｃｍディッシュプレート中に播種し、２日毎に培地を交換した。細胞（１×１０７細胞）を、凍結融解したｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して単離し、上述したようにＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離し、エチジウムブロミドで染色した。ｉＱ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いて定量的ＰＣＲを行い、増幅したＰＣＲ産物をｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。RTH-149 cells and RTG-2 cells (American Type Pr Culture Collection, Manassas, Va.), Minimal Eagle's medium (MEM, Nissui, Tokyo, Japan), 0.1 mM MEM non-essential amino acid solution and 1 mM MEM pyruvate The cells were cultured in a solution, seeded in a 6 cm dish plate, and the medium was changed every 2 days. Cells (1 × 10 7 cells) were stimulated with freeze thawed rFlaA (1 μg / ml). Total RNA was isolated using the RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) and RT-PCR was performed as described above. PCR products were separated on a 1.5% (w / v) agarose gel and stained with ethidium bromide. Quantitative PCR was performed using iQ SYBER Green Supermix, and the amplified PCR product was measured by iCycler iQ real-time PCR analyzing system (Bio-Rad).

ｒＦｌａＡで刺激したＲＴＨ−１４９細胞およびＲＴＧ−２細胞における種々のｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を、図４Ｃに示す。図４Ｃに示すように、精製したｒＦｌａＡでの細胞刺激後のｒｔＴＬＲ５Ｍ、ｒｔＴＬＲ５Ｓ、ｒｔＩＬ−１βおよびｒｔＴＮＦ−αのｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした。ｒｔ−β−アクチンをコントロールに使用した。ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動（１．５％ ＴＡＥアガロース）によって分析し、エチジウムブロミド（１μｇ／ｍｌ）で可視化した。３回の独立した実験のうち、代表的な一例を示した。  The RT-PCR results for various mRNAs in RTH-149 and RTG-2 cells stimulated with rFlaA are shown in FIG. 4C. As shown in FIG. 4C, rtTLR5M, rtTLR5S, rtIL-1β and rtTNF-α mRNA after cell stimulation with purified rFlaA were monitored by RT-PCR. rt-β-actin was used as a control. PCR products were analyzed by gel electrophoresis (1.5% TAE agarose) and visualized with ethidium bromide (1 μg / ml). A representative example of three independent experiments was shown.

ｒＦｌａＡ刺激は、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ刺激の場合と同様に、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βの誘導を導いた。ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルは、実施例３で示した細菌感染によって生じるプロファイルと同様のプロファイルでフラゲリンによって誘導された。しかし、精製したｒＦｌａＡを用いてｒｔＴＬＲ５Ｍを誘導することはできなかった。ＲＴＧ−２細胞を用いた場合もまた、ｒＦｌａＡに反応するサイトカインおよびｒｔＴＬＲ５Ｓに関する同様の誘導プロファイルを観察した。  rFlaA stimulation was performed using V. As with angulararum stimulation, induction of rtTLR5S and rtIL-1β was induced. rtTLR5S and rtIL-1β mRNA levels were induced by flagellin with a profile similar to that produced by bacterial infection shown in Example 3. However, it was not possible to induce rtTLR5M using purified rFlaA. A similar induction profile for rtTLR5S was also observed with RTG-2 cells when using RTG-2 cells.

これらの結果を定量的ＰＣＲによってさらに確認した結果を、図４Ｄに示す。図４Ｄにおいて、ｒＦｌａＡ刺激４８時間後までの示した時間点におけるｒｔＴＬＲ５ＳおよびｒｔＴＬＲ５ＭのｍＲＮＡレベルを示した。図４Ｄに示すように、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ媒介性のｒｔＴＬＲ５Ｓの上方制御が観察された。  The results of further confirming these results by quantitative PCR are shown in FIG. 4D. FIG. 4D shows rtTLR5S and rtTLR5M mRNA levels at the indicated time points up to 48 hours after rFlaA stimulation. As shown in FIG. Anguillarum-mediated upregulation of rtTLR5S was observed.

以上のように、魚類において、血球細胞によるフラゲリン認識は、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ媒介性のｒｔＴＬＲ５Ｓ上方制御の主要な原因であると考えられる。ｒｔＴＬＲ５Ｍはこれらの細胞株において構成的に発現しているので、ｒｔＴＬＲ５Ｍはこれらの細胞株における最初のフラゲリン認識に関与し得る。実際に、ＲＴＨ−１４９細胞でのフラゲリンによるサイトカイン誘導の持続時間は、ヒト樹状細胞において観察されるものと一致した。従って、細菌感染に起因するｒｔＴＬＲ５Ｓの誘導は、外因的に添加されたフラゲリンによって模倣され得る。  As described above, flagellin recognition by blood cells in fish is as follows. It is thought to be a major cause of angulararum-mediated rtTLR5S upregulation. Since rtTLR5M is constitutively expressed in these cell lines, rtTLR5M may be involved in initial flagellin recognition in these cell lines. Indeed, the duration of cytokine induction by flagellin in RTH-149 cells was consistent with that observed in human dendritic cells. Thus, induction of rtTLR5S due to bacterial infection can be mimicked by exogenously added flagellin.

〔実施例６：レポーターアッセイのための構築物〕
フラジェリンはヒトＴＬＲ５およびマウスＴＬＲ５に対するリガンドであるので、ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンを認識するか否かを試験するために、ｒｔＴＬＲ５Ｓと、ヒトＴＬＲ５の膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインとからなる融合レセプターｃＤＮＡを作製した。Example 6: Construct for reporter assay
Since flagellin is a ligand for human TLR5 and mouse TLR5, in order to test whether rtTLR5S recognizes flagellin, a fusion receptor cDNA consisting of rtTLR5S and the transmembrane domain and TIR domain of human TLR5 was prepared.

具体的には、ＦＬＡＧタグ化したｒｔＴＬＲ５Ｓ細胞外ドメイン（アミノ酸２９〜５９７位）をコードするｃＤＮＡを、ｈｕＴＬＲ５のＣ末端隣接領域、膜貫通領域および細胞内ドメイン（アミノ酸５７４〜８５８位）をコードするｃＤＮＡに融合することによって、Ｓ−キメラを構築した。この構築物を、ｐＥＦＢＯＳ発現ベクター中にクローニングした。  Specifically, cDNA encoding FLAG-tagged rtTLR5S extracellular domain (amino acids 29 to 597) encodes huTLR5 C-terminal flanking region, transmembrane region and intracellular domain (amino acids 574 to 858). S-chimeras were constructed by fusing to cDNA. This construct was cloned into the pEFBOS expression vector.

全長ｈｕＴＬＲ５を、プライマーｈｕ５Ｆ（配列番号２０）およびｈｕ５Ｒ（配列番号２１）（表１）を使用するＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト単球ｃＤＮＡから得た。ｈｕＴＬＲ５のｃＤＮＡをｐＥＦＢＯＳプラスミド中に挿入した。  Full length huTLR5 was obtained from human monocyte cDNA by RT-PCR using primers hu5F (SEQ ID NO: 20) and hu5R (SEQ ID NO: 21) (Table 1). The huTLR5 cDNA was inserted into the pEFBOS plasmid.

ヒトＥ−セレクチン（ＥＬＡＭ）のプロモーター領域（−２４１〜−５４）を、ｐＧＶ−Ｅ２（Ｔｏｙｏ Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。このプラスミド（ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃと名付けた）を、ＮＦ−κＢ活性化についてのレポーターとして、以下の実験において使用した。ｐｈＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部標準として使用した。  The promoter region (-241 to -54) of human E-selectin (ELAM) was linked to the KpnI-HindIII site of pGV-E2 (Toyo Inc, Tokyo, Japan). This plasmid (named pELAM-luc) was used in the following experiments as a reporter for NF-κB activation. The phRL-TK vector (Promega) was used as an internal standard.

〔実施例７：Ｓ−キメラタンパク質によるフラジェリンの認識〕
ＮＦ−κＢについてのレポーター遺伝子アッセイを以下のように行って、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。[Example 7: Recognition of flagellin by S-chimeric protein]
A reporter gene assay for NF-κB was performed as follows to test NF-κB activation.

Ｈｅｌａ細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、５〜１０％の熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、２４ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）に播き、１２時間インキュベートした。次いで、Ｓ−キメラ、ｈｕＴＬＲ５（１００ｎｇ）の発現のためのｐＥＦＢＯＳ、またはコントロールとしてのベクター単独を、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、上記細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量（４００ｎｇ）を、空ベクターを添加することによって調整した。ｐｈＲＬ−ＴＫ（０．１ｎｇ）を内部標準として使用した。３６時間培養した後、トランスフェクションを行った。Hela cells (Japan Cell Resource, Osaka, Japan) were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium in vitro medium containing 5-10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS; JRH biosciences, Lenexa, KS). And seeded in 24-well plates (1 × 10 6 cells / well) and incubated for 12 hours. The S-chimera, pEFBOS for expression of huTLR5 (100 ng), or vector alone as a control was then transiently transferred to the cells using LipofectAMINE Plus reagent (Invitrogen) with the pELAM-luc reporter gene (100 ng). Transfected sex. The total amount of transfected DNA (400 ng) was adjusted by adding empty vector. phRL-TK (0.1 ng) was used as an internal standard. After culturing for 36 hours, transfection was performed.

次いで、細胞を、ｒＦｌａＡ（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌ）で、３７℃で５時間処理した。  Cells were then treated with rFlaA (0.01, 0.1, 1 μg / ml) at 37 ° C. for 5 hours.

細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬およびプロトコルを使用して、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ：ＢＬＲ−２０１，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ｒｅｎｉｌａ ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ内部標準を用いる光強度測定より比活性を算出した。値を、別々の３回の実験での最小値からの相対刺激平均±Ｓ．Ｄ．として示した。  Cells are lysed with lysis buffer (Promega) and luminometer (model: BLR-201, Aloka, Tokyo, Japan) reporter using the reagents and protocols of dual-luciferase reporter geneassay kit (Promega). It was. Specific activity was calculated from light intensity measurement using Renila luciferase internal standard. Values are expressed as the relative mean ± S.E. From the minimum in three separate experiments. D. As shown.

ネイティブなＨｅｌａ細胞は、ＴＬＲ５を発現せず、フラジェリンに反応しない（データは示さず）。このキメラのｃＤＮＡをＨｅｌａ細胞にトランスフェクトし、キメラタンパク質の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるイムノブロッティングによって確認した（データは示さず）。ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンに反応する能力を有している場合、このキメラレセプターは、エクトドメインによってフラジェリンの存在を認識し、Ｈｅｌａ細胞においてＴＩＲを介してＮＦ−κＢを活性化し得る。  Native Hela cells do not express TLR5 and do not respond to flagellin (data not shown). This chimeric cDNA was transfected into Hela cells and the expression of the chimeric protein was confirmed by immunoblotting using anti-FLAG antibody (data not shown). If rtTLR5S has the ability to respond to flagellin, this chimeric receptor can recognize the presence of flagellin by the ectodomain and activate NF-κB via TIR in Hela cells.

Ｈｅｌａ Ｓ−キメラ形質転換体およびｈｕＴＬＲ５形質転換体におけるＮＦ−κＢ活性を測定するためのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を、図５Ａに示す。図５Ａにおいて、Ｈｅｌａ細胞に、ＥＬＡＭ−ルシフェラーゼレポータープラスミドとともに、空ベクター（左）、Ｓ−キメラ（中央）、またはｈｕＴＬＲ５（右）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞を、示した濃度のＦｌａＡで５時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化の程度を、細胞溶解物でのルシフェラーゼアッセイによって測定した。  The results of a luciferase reporter gene assay for measuring NF-κB activity in Hela S-chimeric and huTLR5 transformants are shown in FIG. 5A. In FIG. 5A, Hela cells were transfected with an empty vector (left), S-chimera (middle), or huTLR5 (right) along with an ELAM-luciferase reporter plasmid. 36 hours after transfection, cells were stimulated with the indicated concentrations of FlaA for 5 hours. The extent of NF-κB activation was measured by luciferase assay on cell lysates.

図５Ａに示すように、Ｓ−キメラ分子は、Ｈｅｌａ細胞において、同様の発現レベルのヒトＴＬＲ５と同程度にまでＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化した。また、ｒＦｌａＡおよびｒＦｌａＣは、同一のＳ−キメラ刺激能を有した（データは示さず）。  As shown in FIG. 5A, the S-chimeric molecule activated the NF-κB reporter gene in Hela cells to the same extent as human TLR5 with similar expression levels. RFlaA and rFlaC also had the same S-chimera stimulating ability (data not shown).

特異性を試験するために、Ｓ−キメラを、ＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ２のリガンド）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３のリガンド）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４のリガンド）、非メチル化ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＴＬＲ９のリガンド）およびｒＦｌａＡ（ＴＬＲ５のリガンド）で刺激した結果を、図５Ｂに示す。ＬＰＳをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）より購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｈｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）より入手した。ＭＡＬＰ−２をＢｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）において合成した。ペプチドグリカン（ＰＧＮ）をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから精製した。Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ ＢをＳｉｇｍａより入手した。ヌクレオチドプライマーおよびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（ＣｐＧ−ＯＤＮ）の全てをＨｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で合成した。  To test for specificity, S-chimeras were isolated from MALP-2 (a ligand for TLR2), poly (I: C) (a ligand for TLR3), LPS (a ligand for TLR4), unmethylated CpG-ODN (for TLR9). The results of stimulation with (ligand) and rFlaA (TLR5 ligand) are shown in FIG. 5B. LPS was purchased from BD Biosciences (San Jose, CA). poly (I: C) was obtained from Amersham Biosciences (Buchinghamshire, UK). MALP-2 was synthesized at Biologica (Nagoya, Japan). Peptidoglycan (PGN) was purified from Staphylococcus aureus. Polymyxin B was obtained from Sigma. All oligonucleotides (ODN) containing nucleotide primers and CpG motif (CpG-ODN) were synthesized by Hokaido System Sciences (Sapporo, Japan).

図５Ｂは、ｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ）で細胞を６時間刺激し、図５Ａ同様にＮＦ−κＢ活性を測定した結果を示す。実験を三連で行い、結果を平均±Ｓ．Ｄ．で示した。３回の実験のうち１つを示した。  FIG. 5B shows cells treated with rFlaA (1 μg / ml), LPS (0.1 μg / ml), PGN (10 μg / ml), poly (I: C) (2 μg / ml) or CpG-ODN (2 μM) for 6 hours. The result of stimulating and measuring NF-κB activity as in FIG. 5A is shown. Experiments were performed in triplicate and results averaged ± S. D. It showed in. One of three experiments was shown.

Ｓ−キメラまたはｈｕＴＬＲ５を発現する細胞は、排他的にｒＦｌａＡを認識してＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化したが、ＭＡＬＰ−２（１００ｎＭ）（データは示さず）だけでなく他のいずれの刺激にも応答しなかった。  Cells expressing S-chimera or huTLR5 exclusively recognized rFlaA and activated the NF-κB reporter gene, but not only MALP-2 (100 nM) (data not shown) but any other stimuli Also did not respond.

以上の結果より、ｒＦｌａＡとｒｔＴＬＲ５Ｓとの間に機能的な相互作用が存在することがわかった。  From the above results, it was found that a functional interaction exists between rFlaA and rtTLR5S.

〔実施例８：Ｍ−キメラタンパク質はｒｔＴＬＲ５Ｓと組み合わせることによってフラジェリンを認識する〕
全長ｒｔＴＬＲ５Ｍを発現させたＨｅｌａ細胞およびＣＨＯ細胞において、ＮＦ−κＢ応答を検出しなかった（データは示さず）。そこで、ｒｔＴＬＲ５ＭのＬＲＲとｈｕＴＬＲ５のＴＭおよびＴＩＲとからなるキメラを用いて、ＮＦ−κＢ活性化を測定した。[Example 8: M-chimeric protein recognizes flagellin by combining with rtTLR5S]
No NF-κB response was detected in Hela and CHO cells expressing full length rtTLR5M (data not shown). Therefore, NF-κB activation was measured using a chimera consisting of rtTLR5M LRR and huTLR5 TM and TIR.

Ｓ−キメラと同様に、ＦＬＡＧタグ化したｒｔＴＬＲ５Ｍ細胞外ドメイン（アミノ酸２１〜５９６位）をコードするｃＤＮＡを、ｈｕＴＬＲ５のＣ末端隣接領域、膜貫通領域および細胞内ドメイン（アミノ酸５７４〜８５８位）をコードするｃＤＮＡに融合することによって、Ｍ−キメラを構築した。  Similar to the S-chimera, a cDNA encoding the FLAG-tagged rtTLR5M extracellular domain (amino acids 21 to 596) was converted into the huTLR5 C-terminal flanking region, transmembrane region and intracellular domain (amino acids 574 to 858). An M-chimera was constructed by fusing to the encoding cDNA.

チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｉｓｓｕｉ）中で培養した。  Chinese hamster ovary cells (CHO cells, Japan Cell Resource, Osaka, Japan) were cultured in Ham's F12 medium (Nissui).

Ｈｅｌａ細胞またはＣＨＯ細胞を、２４ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）に播き、１２時間インキュベートした。次いで、Ｍ−キメラ、ｈｕＴＬＲ５の発現のためのｐＥＦＢＯＳ（１００ｎｇ）、またはコントロールとしてのベクター単独を、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、上記細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量（４００ｎｇ）を、空ベクターを添加することによって調整した。ｐｈＲＬ−ＴＫ（０．１ｎｇ）を内部標準として使用した。３６時間培養した後、トランスフェクションを行った。また、示したように、Ｍ−キメラ発現細胞におけるＮＦ−κＢプロモーター活性に対する外因的に添加したｒｔＴＬＲ５Ｓの効果を測定した。すなわち、Ｍ−キメラでトランスフェクトした２４時間後、Ｍ−キメラ発現細胞の培養培地を、ｐＥＦＢＯＳ／ｒｔＴＬＲ５Ｓ ｃＤＮＡ（１、１０、１００ｎｇ）を一過性にトランスフェクトして１２時間培養したＣＨＯ細胞またはＨｅｌａ細胞の馴化培地と置換した。Hela or CHO cells were seeded in 24-well plates (1 × 10 6 cells / well) and incubated for 12 hours. The M-chimera, pEFBOS for expression of huTLR5 (100 ng), or the vector alone as a control was then transiently transferred to the cells using LipofectAMINE Plus reagent (Invitrogen) with the pELAM-luc reporter gene (100 ng). Transfected sex. The total amount of transfected DNA (400 ng) was adjusted by adding empty vector. phRL-TK (0.1 ng) was used as an internal standard. After culturing for 36 hours, transfection was performed. In addition, as shown, the effect of exogenously added rtTLR5S on the NF-κB promoter activity in M-chimeric expression cells was measured. That is, 24 hours after transfection with M-chimera, the culture medium of M-chimera expressing cells was transformed into CHO cells that were transiently transfected with pEFBOS / rtTLR5S cDNA (1, 10, 100 ng) and cultured for 12 hours or Replaced with conditioned medium of Hela cells.

次いで、細胞を、ｒＦｌａＡ（０．０１、０．１、１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｕ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ）で、３７℃で５時間処理した。必要に応じて、リコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓ（１、１０、１００ｎｇ／ｍｌ）を、Ｍ−キメラ発現細胞培地に、ｒＦｌａＡの刺激１２時間前に直接添加した。細胞をｒＦｌａＡで５時間刺激した。細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬およびプロトコルを使用して、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ：ＢＬＲ−２０１，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。Ｒｅｎｉｌａ ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ内部標準を用いる光強度測定より比活性を算出した。値を、別々の３回の実験での最小値からの相対刺激平均±Ｓ．Ｄ．として示した。  The cells were then washed with rFlaA (0.01, 0.1, 1 μg / ml), LPS (0.1 μg / ml), PGN (10 μg / ml), polu (I: C) (2 μg / ml), or CpG. Treated with ODN (2 μM) at 37 ° C. for 5 hours. Recombinant rtTLR5S (1, 10, 100 ng / ml) was added directly to M-chimera expressing cell media 12 hours prior to stimulation with rFlaA as needed. Cells were stimulated with rFlaA for 5 hours. Cells are lysed with lysis buffer (Promega) and luminometer (model: BLR-201, Aloka, Tokyo, Japan) reporter using dual-luciferase reporter gene assay kit (Promega) reagents and protocols. went. Specific activity was calculated from light intensity measurement using Renila luciferase internal standard. Values are expressed as the relative mean ± S.E. From the minimum in three separate experiments. D. As shown.

ＥＬＡＭ−ルシフェラーゼレポータープラスミドとともに空ベクター（左バー）またはＭ−キメラ（右バー）をトランスフェクトしたＣＨＯ形質転換体およびＨｅｌａ形質転換体におけるＭ−キメラのシグナル伝達を、図６に示す。図６Ａは、Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左）およびＨｅｌａ細胞（右）におけるＮＦ−κＢ活性測定についてのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果であり、トランスフェクションの３６時間後、細胞を、示した濃度のＦｌａＡで５時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化の程度を、細胞溶解物でのルシフェラーゼアッセイによって測定した。  M-chimera signaling in CHO and Hela transformants transfected with an empty vector (left bar) or M-chimera (right bar) with an ELAM-luciferase reporter plasmid is shown in FIG. FIG. 6A is the result of a luciferase reporter gene assay for measuring NF-κB activity in CHO cells (left) and Hela cells (right) expressing M-chimera, showing cells 36 hours after transfection. Stimulated with a concentration of FlaA for 5 hours. The extent of NF-κB activation was measured by luciferase assay on cell lysates.

Ｍ−キメラのｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）に対する応答（図６Ａ）およびｒＦｌａＣに対する応答（データは示さず）を、ＣＨＯ系におけるＮＦ−κＢ活性化として検出したが、応答の程度は低かった。また、Ｍ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞において検出されたフラジェリン媒介性ＮＦ−κＢ活性化はわずかであったが、これはおそらく、トランスフェクション効率が低いことに起因すると考えられた。  Responses to M-chimera rFlaA (1 μg / ml) (FIG. 6A) and rFlaC (data not shown) were detected as NF-κB activation in the CHO system, but the extent of the response was low. Also, flagellin-mediated NF-κB activation detected in M-chimera expressing Hela cells was negligible, probably due to low transfection efficiency.

Ｍ−キメラまたはｈｕＴＬＲ５を発現する細胞を種々のＴＬＲリガンドで刺激した結果を、図６Ｂに示す。ＣＨＯ（上パネル）またはＨｅｌａ（下パネル）を、ｒＦｌａＡ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ）で６時間刺激し、図６Ａ同様にＮＦ−κＢ活性を測定した。  The results of stimulating cells expressing M-chimera or huTLR5 with various TLR ligands are shown in FIG. 6B. CHO (upper panel) or Hela (lower panel) was added to rFlaA (1 μg / ml), LPS (0.1 μg / ml), PGN (10 μg / ml), poly (I: C) (2 μg / ml) or CpG−. Stimulation was performed for 6 hours with ODN (2 μM), and NF-κB activity was measured in the same manner as in FIG. 6A.

図６Ｂに示すように、ＴＬＲリガンド（ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＰＧＮ（１０μｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２μｇ／ｍｌ）およびＣｐＧ−ＯＤＮ（２μＭ））は、これらの最適な濃度においてでさえＮＦ−κＢの活性化を誘導しなかったことから、Ｍ−キメラ発現細胞におけるＮＦ−κＢの活性化は、ｒＦｌａＡに特異的であることがわかった。  As shown in FIG. 6B, TLR ligands (LPS (0.1 μg / ml), PGN (10 μg / ml), poly (I: C) (2 μg / ml) and CpG-ODN (2 μM)) NF-κB activation in M-chimera expressing cells was found to be specific for rFlaA since it did not induce NF-κB activation even at low concentrations.

以上のことから、哺乳動物のアダプター分子に対してｒｔＴＬＲ５ＭのＴＩＲが適合しないのでＮＦ−κＢ応答を生じないと考えられた。  From the above, it was considered that NF-κB response does not occur because the TIR of rtTLR5M is not compatible with mammalian adapter molecules.

次いで、ｒｔＴＬＲ５ＭとｒｔＴＬＲ５Ｓとを組み合わせた効果を調べた。ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現ＣＨＯ細胞の馴化培地（ｒｔＴＬＲ５Ｓを含む）を、Ｍ−キメラ発現細胞に添加して、ｒＦｌａＡでこの細胞を処理した。Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（左パネル）またはＨｅｌａ細胞（右パネル）において、ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現細胞の上清を添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を、図６Ｃに示す。実験を三連で行い、結果を平均±Ｓ．Ｄ．で示した。  Next, the effect of combining rtTLR5M and rtTLR5S was examined. Conditioned medium of rtTLR5S expressing CHO cells (including rtTLR5S) was added to M-chimera expressing cells and the cells were treated with rFlaA. The effect of flagellin-dependent NF-κB activation by adding supernatant of rtTLR5S expressing cells in CHO cells (left panel) or Hela cells (right panel) expressing M-chimera is shown in FIG. 6C. Experiments were performed in triplicate and results averaged ± S. D. It showed in.

Ｍ−キメラ発現ＣＨＯ細胞は、ｒＦｌａＡ（左から２番目）にわずかに応答したが、空ベクターを有する細胞（コントロール；左）では効果はなかった。種々の量のｒｔＴＬＲ５Ｓプラスミド（１〜１００μｇ）をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養上清を、刺激１２時間前にＭ−キメラ発現細胞に添加した。ｒＦｌａＡ刺激後５時間のインターバルをおいて、細胞を回収し、細胞溶解物でのＮＦ−κＢ活性を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した（左パネル）。Ｍ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞において、同様の実験を行った。Ｍ−キメラを有するＨｅｌａ細胞は、わずかにｒＦｌａＡに応答したが（左から２番目）、馴化培地存在下で、ｒＦｌａＡに有意に応答した（右パネル）。  M-chimera expressing CHO cells responded slightly to rFlaA (second from left), but had no effect on cells with empty vector (control; left). Culture supernatants of CHO cells transfected with various amounts of rtTLR5S plasmid (1-100 μg) were added to M-chimera expressing cells 12 hours prior to stimulation. At 5 h intervals after rFlaA stimulation, cells were harvested and NF-κB activity in cell lysates was measured by luciferase assay (left panel). Similar experiments were performed in M-chimera expressing Hela cells. Hela cells with M-chimera responded slightly to rFlaA (second from left) but significantly responded to rFlaA in the presence of conditioned medium (right panel).

以上のように、Ｍ−キメラ発現細胞において、トランスフェクトされたｒｔＴＬＲ５Ｓ（ＣＨＯ細胞培地中に存在する）のｃＤＮＡの用量に比例するＮＦ−κＢ活性化を生じた。同一の系においてＭ−キメラ発現細胞の上清を添加しても、このようなＮＦ−κＢ活性化の上方制御を生じなかった（データは示さず）。Ｍ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞において、フラジェリン媒介性ＮＦ−κＢ活性化は、ｒｔＴＬＲ５Ｓ発現Ｈｅｌａ細胞の馴化培地の存在下でより強く生じた。  As described above, M-chimeric expression cells produced NF-κB activation proportional to the dose of transfected rtTLR5S (present in CHO cell medium) cDNA. Addition of M-chimera expressing cell supernatant in the same system did not result in such upregulation of NF-κB activation (data not shown). In M-chimera expressing Hela cells, flagellin-mediated NF-κB activation occurred more strongly in the presence of conditioned medium of rtTLR5S expressing Hela cells.

〔実施例９：フラジェリンに対するｒｔＴＬＲ５Ｓの物理的な結合〕
ＮＦ−κＢ活性化におけるｒｔＴＬＲ５Ｍに対するｒｔＴＬＲ５Ｓの協同効果を確認するために、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、バキュロウイルス系においてリコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓを生成し、ｒｔＴＬＲ５Ｓタンパク質のＧＳＴ−ＦｌａＡに対する物理的な結合を調べた。Example 9: Physical binding of rtTLR5S to flagellin
In order to confirm the cooperative effect of rtTLR5S on rtTLR5M in NF-κB activation, Bac-To-Bac baculovirus expression system (Invitrogen) was used to generate the recombinant rtTLR5T for the recombinant rtTLR5T in the baculovirus system. The physical coupling was examined.

具体的には、Ｈｉｓ６タグをＣ末端に有するｒｔＴＬＲ５Ｓ全長を、ＰＣＲを用いて作製した。ｃＤＮＡを、ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ位の間に挿入し、ｐＦａｓｔ−Ｂａｃ１／ｒｔＴＬＲ５Ｓと名付けた。Ｈｉｓ６タグを有するｒｔＴＬＲ５ＳをコードするＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂａｃ細胞を、この細胞のトランスポジション活性を用いてｐＦａｓｔ−Ｂａｃ１／ｒｔＴＬＲ５Ｓで形質転換した。標準的方法によって細胞からｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを得、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によってＳｆ２１細胞に移入してリコンビナントウイルスを作製した。このリコンビナントウイルスを使用して、多重度５で無血清培地中にて単層のＳｆ２１細胞を感染させた。３日間培養した後、ｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ）およびＭｏｎｏ Ｑイオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｓタンパク質を培地から精製した。抗Ｈｉｓ６タグ抗体を使用するイムノブロッティングによってタンパク質を同定した。この手順で、５００ｍｌの培養培地から５μｇのｒｔＴＬＲ５Ｓを得た。Specifically, the full length rtTLR5S having a His 6 tag at the C-terminus was prepared using PCR. The cDNA was inserted between the SalI-NotI positions of the pFastBac1 plasmid and named pFast-Bac1 / rtTLR5S. To produce Bacmid DNA encoding rtTLR5S with a His 6 tag, E. coli DH10Bac cells were transformed with pFast-Bac1 / rtTLR5S using the transposition activity of the cells. Bacmid DNA was obtained from the cells by standard methods and transferred to Sf21 cells by UniFECTOR (B-Bridge International, San Jose, Calif.) To produce recombinant virus. This recombinant virus was used to infect monolayer Sf21 cells in serum-free medium at a multiplicity of 5. After culturing for 3 days, the rtTLR5S protein was purified from the medium using a nickel-nitrilotritic acid beads (Qiagen) and a Mono Q ion exchange column (Amersham Biosciences). Proteins were identified by immunoblotting using anti-His 6 tag antibody. By this procedure, 5 μg of rtTLR5S was obtained from 500 ml of culture medium.

次いで、フラジェリンに対するｒｔＴＬＲ５Ｓの物理的な結合を、Ｈｉｓ６標識ｒｔＴＬＲ５ＳのＧＳＴ−ＦｌａＡに対する結合能を指標にするＧＳＴ−プルダウンアッセイによって評価した。Then, the physical binding of rtTLR5S to flagellin was evaluated by GST-pulldown assay using the binding ability of His 6- labeled rtTLR5S to GST-FlaA as an index.

簡単には、３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ８．０）中に２０ｎｇのｒｔＴＬＲ５Ｓおよび示した量（０〜５μｇ）のＧＳＴまたはＧＳＴ−ＦｌａＡを、４℃で２時間インキュベートし、１０μｌのｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂとともに穏やかに振騰させながら４℃でインキュベートした。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、遠心分離によって回収し、ＰＢＳで４回洗浄した。還元条件下でＳｅｐｈａｒｏｓｅからタンパク質を溶出した。溶出物を、抗Ｈｉｓ６抗体（０．２μｇ／ｍｌ）を用いてイムノブロッティングに供した。ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｓｅｃｏｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＩＯ−ＳＯＵＲＣＥ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＥＣＬ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発色させた。結果を、図７Ａに示す。Briefly, 20 ng rtTLR5S and the indicated amount (0-5 μg) of GST or GST-FlaA in 300 μl PBS (pH 8.0) were incubated for 2 hours at 4 ° C. and gently with 10 μl glutathione-Sepharose 4B. Incubated at 4 ° C. with shaking. Glutathione-Sepharose was collected by centrifugation and washed 4 times with PBS. Protein was eluted from Sepharose under reducing conditions. The eluate was subjected to immunoblotting using an anti-His 6 antibody (0.2 μg / ml). Color development was performed using a horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG second antibody (BIO-SOURCE, Camarillo, Calif.) and an ECL kit (Amersham Biosciences). The results are shown in FIG. 7A.

また、結合タンパク質の量を、ＧＳＴ−ＦｌａＡとは結合しないｌａｍｐｒｅｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ３（ＡＹ３５９８６１）の量と比較したところ、ｒｔＴＬＲ５ＳとＧＳＴ−ＦｌａＡとの結合は特異的であることがわかった（データは示さず）。すなわち、この結合アッセイは、ｒｔＴＬＲ５Ｓがフラジェリンに対する親和性を有することを示した。  Further, when the amount of the binding protein was compared with the amount of sample component 3 (AY3599861) that does not bind to GST-FlaA, it was found that the binding between rtTLR5S and GST-FlaA was specific (data not shown). . That is, this binding assay showed that rtTLR5S has affinity for flagellin.

〔実施例１０：ｒｔＴＬＲ５Ｓの機能的特性〕
次いで、ｒｔＴＬＲ５Ｓの機能的特性を、Ｍ−キメラ発現細胞において試験した。[Example 10: Functional characteristics of rtTLR5S]
The functional properties of rtTLR5S were then tested in M-chimera expressing cells.

上述したように、Ｍ−キメラ発現ＣＨＯ細胞およびＭ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞を作製した。バキュロウイルス系を用いて作製した上述のリコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓをこれらの細胞に添加して、上述のＮＦ−κＢレポーターアッセイを用いてｒＦｌａＡに対する感受性を調べた。  As described above, M-chimera expressing CHO cells and M-chimera expressing Hela cells were generated. The above recombinant rtTLR5S prepared using the baculovirus system was added to these cells and tested for sensitivity to rFlaA using the above described NF-κB reporter assay.

Ｍ−キメラを発現する細胞において、精製したｒｔＴＬＲ５Ｓを添加することによるフラジェリン依存的ＮＦ−κＢ活性化の効果を。図７Ｂに示す。Ｍ−キメラを発現するＣＨＯ細胞（上パネル）またはＨｅｌａ細胞（左パネル）は、空ベクターを有する細胞（白バー、コントロール）と比較して、わずかにｒＦｌａＡに応答した（斜線バー、右）。種々の量の精製ｒｔＴＬＲ５Ｓ（１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）を、刺激１２時間前にＭ−キメラ発現細胞に添加した。ｒＦｌａＡ刺激後５時間のインターバルをおいて、細胞を回収し、細胞溶解物でのＮＦ−κＢ活性を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。実験を三連で行い、結果を平均±Ｓ．Ｄ．で示した。  Effect of flagellin-dependent NF-κB activation by adding purified rtTLR5S in cells expressing M-chimera. Shown in FIG. 7B. CHO cells expressing M-chimera (upper panel) or Hela cells (left panel) responded slightly to rFlaA (hatched bar, right) compared to cells with empty vector (white bar, control). Various amounts of purified rtTLR5S (1 ng / ml, 10 ng / ml and 100 ng / ml) were added to M-chimera expressing cells 12 hours prior to stimulation. At intervals of 5 hours after rFlaA stimulation, cells were harvested and NF-κB activity in cell lysates was measured by luciferase assay. Experiments were performed in triplicate and results averaged ± S. D. It showed in.

図７Ｂに示すように、可溶性形態であるｒｔＴＬＲ５Ｓタンパク質（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）は、ＮＦ−κＢレポーターアッセイにおいて、Ｍ−キメラ発現ＣＨＯ細胞およびＭ−キメラ発現Ｈｅｌａ細胞をｒＦｌａＡに対してより感受性にした。特に、ｒｔＴＬＲ５Ｍを有するＨｅｌａ細胞は、ｒｔＴＬＲ５Ｓに対して顕著に応答した。すなわち、リコンビナントｒｔＴＬＲ５Ｓの外因的な添加が、Ｍ−キメラ発現細胞におけるｒＦｌａＡ依存的ＮＦ−κＢ活性化を誘導した。  As shown in FIG. 7B, the soluble form of rtTLR5S protein (1-100 ng / ml) makes M-chimeric and CHO cells more sensitive to rFlaA in the NF-κB reporter assay. did. In particular, Hela cells with rtTLR5M responded significantly to rtTLR5S. That is, exogenous addition of recombinant rtTLR5S induced rFlaA-dependent NF-κB activation in M-chimera expressing cells.

以上の結果より、ｒｔＴＬＲ５Ｍによるフラジェリンの最初の認識が、ｒｔＴＬＲ５Ｓおよび炎症性サイトカインを肝臓における基底レベルまで誘導し、次に、ｒｔＴＬＲ５Ｍと誘導された循環系ｒｔＴＬＲ５Ｓとの組み合わせが、強いＮＦ−κＢ活性化を刺激し、全身でのフラジェリンに対する完全な応答を導くと考えられる。  From the above results, the first recognition of flagellin by rtTLR5M induced rtTLR5S and inflammatory cytokines to the basal level in the liver, and then the combination of rtTLR5M and induced circulatory rtTLR5S resulted in strong NF-κB activation Is thought to lead to a complete response to flagellin throughout the body.

〔実施例１１：可溶性形態のニジマスＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５オルソログ〕
可溶性形態のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５オルソログ（ＴＬＲ５Ｓ）は、魚類にのみ存在し、哺乳動物においてはこのような分子は存在しない。このような独特の分子種であるニジマスＴＬＲ５Ｓ（ｒｔＴＬＲ５Ｓ）について、さらなる解析を行った。Example 11: Soluble Form of Rainbow Trout Toll-like receptor 5 Ortholog
The soluble form of Toll-like receptor 5 ortholog (TLR5S) is present only in fish and no such molecule exists in mammals. The rainbow trout TLR5S (rtTLR5S), which is such a unique molecular species, was further analyzed.

ｒｔＴＬＲ５Ｓの推定のアミノ酸配列、およびｒｔＴＬＲ５Ｓと他の種のＴＬＲ５とのアラインメントを図８に示す。  The deduced amino acid sequence of rtTLR5S and the alignment of rtTLR5S with other species of TLR5 are shown in FIG.

図８Ａは、ｒｔＴＬＲ５Ｓとｈｕ／ｍｏ／ｆｇＴＬＲ５の細胞外ＬＲＲドメインとを比較したアラインメントを示す。ｃＤＮＡのアラインメントおよびモチーフ分析を、ＧＥＮＥＴＹＸ，Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて行った。ニジマス（ｒｔ）の遺伝子配列を、ＮＣＢＩより得た。ＢＬＡＳＴ検索分析を、Ｆｕｇｕ ＢＬＡＳＴサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｆｕｇｕ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｂｌａｓｔ／）にてｔｂｌａｓｔｎプログラムを使用して行った。エクソン／イントロン境界を予測するために、ＧｅｎｅＭａｒｋ，ｈｍｍ（ｈｔｔｐ：／／ｏｐａｌ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／）プログラムおよびＧｅｎｅＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／）プログラムを使用した。得られた結果を、哺乳動物ＴＬＲと手動で比較することによってさらに改善した。ドメイン構造を、ＳＭＡＲＴプログラムを使用して予測した。さらに、ＴＭＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）プログラムを使用して、ｒｔＴＬＲ５Ｓ中の膜貫通ドメインを予測した。このプログラムはまた、ｒｔＴＬＲ５Ｓ中に膜貫通ドメインが存在しないことを支持した。ＴＬＲタンパク質配列のアラインメントを、ＤＤＢＪのＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｎｉｇ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）においてＣｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して行った。  FIG. 8A shows an alignment comparing rtTLR5S with the extracellular LRR domain of hu / mo / fgTLR5. cDNA alignment and motif analysis were performed using GENETYX, Clustal W. The gene sequence of rainbow trout (rt) was obtained from NCBI. BLAST search analysis was performed using the tblastn program on the Fugu BLAST server (http://fugu.hgmp.mrc.ac.uk/blast/). The GeneMark, hmm (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/) and GeneScan (http://genes.mit.edu/GeneMark/) programs were used to predict exon / intron boundaries. . The results obtained were further improved by manual comparison with mammalian TLR. Domain structure was predicted using the SMART program. In addition, the transmembrane domain in rtTLR5S was predicted using the TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) program. This program also supported the absence of a transmembrane domain in rtTLR5S. Alignment of TLR protein sequences was performed using Clustal W on DDBJ's WWW server (http://hyperngig.nig.ac.jp).

図８Ａにおいて、哺乳動物および魚類を超えて保存されているシステインを四角で囲む。ＴＭは膜貫通ドメイン、ＴＩＲはＴＩＲドメインを示す。星印は、保存されたアミノ酸を示す。ｈｕＴＬＲ５、ヒトＴＬＲ５（配列番号３９）；ｍｏＴＬＲ５、マウスＴＬＲ５（配列番号４１）；ｒｔＴＬＲ５、ニジマス可溶性形態ＴＬＲ５（配列番号２）；ｆｇＴＬＲ５、ｆｕｇｕ ＴＬＲ５（配列番号４３）；ｆｇＴＬＲ５Ｓ、ｆｕｇｕ可溶性形態ＴＬＲ５（配列番号４５）。各ドメインを、ＳＭＡＲＴプログラムを使用して予測した。いくつかの膜貫通領域をＴＭＨＭＭプログラムによって予測した。  In FIG. 8A, cysteines that are conserved across mammals and fish are boxed. TM indicates a transmembrane domain and TIR indicates a TIR domain. An asterisk indicates a conserved amino acid. huTLR5, human TLR5 (SEQ ID NO: 39); moTLR5, mouse TLR5 (SEQ ID NO: 41); rtTLR5, rainbow trout soluble form TLR5 (SEQ ID NO: 2); fgTLR5, fugu TLR5 (SEQ ID NO: 43); fgTLR5S, fugu5 soluble sequence TL Number 45). Each domain was predicted using the SMART program. Several transmembrane regions were predicted by the TMHMM program.

その結果、ｒｔＴＬＲ５のアミノ酸一次配列（ＡＢ０６２５０４）は、１９９２ｂｐのＯＲＦおよび１２２３ｂｐの３’−ＵＴＲからなる。ＳＭＡＲＴ分析は、このタンパク質中の１１個のＬＲＲが、可溶性形態のｆｇＴＬＲ５と高い相同性（５８％）を有することを示した。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、ｈｕＴＬＲ５およびｍｏＴＬＲ５のＬＲＲドメインとそれぞれ３７％および３８％の相同性を有した。ｒｔＴＬＲ５Ｓは、ヒトまたはマウスの他のＴＬＲのＬＲＲドメインとは２５％未満の相同性を示した。ｍｏ／ｈｕＴＬＲ５のＬＲＲドメイン中のシステイン１１個中９個が、ｒｔＴＬＲ５Ｓにおいて保存されていた。ＢＬＡＳＴ検索解析は、このタンパク質が哺乳動物ではマウスＴＬＲ５に最も類似することを示唆した。  As a result, the primary amino acid sequence of rtTLR5 (AB062504) consists of a 1992 bp ORF and a 1223 bp 3'-UTR. SMART analysis showed that 11 LRRs in this protein had high homology (58%) with the soluble form of fgTLR5. rtTLR5S had 37% and 38% homology with the LRR domains of huTLR5 and moTLR5, respectively. rtTLR5S showed less than 25% homology with other human or mouse TLR LRR domains. Nine of 11 cysteines in the LRR domain of mo / huTLR5 were conserved in rtTLR5S. BLAST search analysis suggested that this protein is most similar to mouse TLR5 in mammals.

図８Ｂは、ｒｔＴＬＲ５のＫ−Ｄプロット分析の結果を示す。モチーフ検索、Ｋ−ＤプロットおよびＣｌｕｓｔａｌ Ｗ比較は、この魚類ＬＲＲタンパク質が膜貫通部分およびＴＩＲを有さないことを示した。  FIG. 8B shows the results of a KD plot analysis of rtTLR5. Motif search, KD plot and Clustal W comparison showed that this fish LRR protein has no transmembrane portion and TIR.

〔実施例１２：ｒｔＴＬＲ５ＳとヒトＴＬＲ５のＴＩＲとのキメラによるフラジェリンの認識〕
フラジェリンは、ｈｕ／ｍｏＴＬＲ５のリガンドであるので、ｒｔＴＬＲ５Ｓが種々の細菌由来のフラジェリンを認識するか否かを試験した。[Example 12: Recognition of flagellin by chimera between rtTLR5S and TIR of human TLR5]
Since flagellin is a ligand of hu / moTLR5, it was tested whether rtTLR5S recognizes flagellin from various bacteria.

本試験のために、本発明者らは、ｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡとｈｕＴＬＲ５の膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインのｃＤＮＡとのキメラレセプターｃＤＮＡ（Ｓ−キメラ）を作製した。  For this study, the present inventors created a chimeric receptor cDNA (S-chimera) of rtTLR5S cDNA and huTLR5 transmembrane domain and TIR domain cDNA.

ｒｔＴＬＲ５Ｓ ｃＤＮＡの全長を、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ロイシンリッチリピートを含むＥＳＴクローン（ＡＦ２８１３４６）よりクローニングした。肝臓ｃＤＮＡテンプレート、および、プライマー１特異的エンドプライマーまたはプライマー２特異的エンドプライマー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかと対のｒｔＴＬＲ５Ｓ遺伝子特異的内部プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲアンプリコンをクローニングして配列精度を評価した。最終的に、プライマーＦ２（ｃａｇｔｇｃｔｔｃａａｇｔｔａｔｃｔｇｃｇａｇｇ（配列番号２４））およびプライマーＲ２（ｔｃｃａｃａｔｃｇｔｔｔｃｃａｇｔｃａａａａｃｃ（配列番号２５））を用いるＲＴ−ＰＣＲによって、肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりｒｔＴＬＲ５ＳのｃＤＮＡ全長を得た。シグナル配列を除くｒｔＴＬＲ５ＳをコードするｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。  The full length of rtTLR5S cDNA was cloned from an EST clone (AF281346) containing a leucine-rich repeat using the SMART RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences). PCR was performed using a liver cDNA template and an rtTLR5S gene specific internal primer paired with either a primer 1 specific end primer or primer 2 specific end primer (BD Biosciences). PCR amplicons were cloned and sequence accuracy was evaluated. Finally, the full-length rtTLR5S cDNA was obtained from the liver cDNA library by RT-PCR using primer F2 (cagtgcttcaagtttatctccgagg (SEQ ID NO: 24)) and primer R2 (tcccatcgtttccagtaaaaaacc (SEQ ID NO: 25)). A cDNA encoding rtTLR5S excluding the signal sequence was inserted into the HindIII-SalI site of the pFLAG-CMV plasmid.

ＦＬＡＧタグ化したｒｔＴＬＲ５Ｓ細胞外ドメイン（アミノ酸２９〜５９７位）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＴＬＲ５のＣ末端隣接領域、膜貫通領域および細胞内ドメイン（アミノ酸５７４〜８５８位）をコードするｃＤＮＡに融合することによって、キメラｃＮＤＡを構築した（Ｓ−キメラを名付けた）。この構築物を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ発現ベクター中にクローニングした。実施例６と同様に、ＲＴ−ＰＣＲによってヒト単球ｃＤＮＡより全長ｈｕＴＬＲ５を得た。ヒトＥ−セレクチン（ＥＬＡＭ）のプロモーター領域（−２４１〜−５４）を、ｐＧＶ−Ｅ２（Ｔｏｙｏ Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。このプラスミド（ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃと名付けた）を、ＮＦ−κＢ活性化についてのレポーターとして使用した。ｐ−１２５ｌｕｃ（ＩＦＮ−β）レポータープラスミドを使用するレポーターアッセイによって、ＩＦＮ−βプロモーターの活性化を測定した。  The cDNA encoding the FLAG-tagged rtTLR5S extracellular domain (amino acids 29 to 597) is fused to the cDNA encoding the human TLR5 C-terminal flanking region, transmembrane region and intracellular domain (amino acids 574 to 858). The chimera cNDA was constructed (named S-chimera). This construct was cloned into the pFLAG-CMV expression vector. Similar to Example 6, full-length huTLR5 was obtained from human monocyte cDNA by RT-PCR. The promoter region (-241 to -54) of human E-selectin (ELAM) was linked to the KpnI-HindIII site of pGV-E2 (Toyo Inc, Tokyo, Japan). This plasmid (named pELAM-luc) was used as a reporter for NF-κB activation. Activation of the IFN-β promoter was measured by a reporter assay using the p-125luc (IFN-β) reporter plasmid.

ヒト子宮頚癌細胞株Ｈｅｌａにおいて、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを行った。  The NF-κB reporter assay was performed in the human cervical cancer cell line Hela.

Ｈｅｌａ細胞およびＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、５〜１０％の熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＪＲＨ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。  Hela cells and HEK293FT cells (Japan Cell Resource, Osaka, Japan), Dulbecco's moderated Inge's moderated Ingredients containing 5-10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS; JRH biosciences, Lenexa, KS) Incubated in.

Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。Ｐ．ａｖｅｎａｅのフラジェリンをＮａｒａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにて精製した。組換えフラジェリンＡおよび組換えフラジェリンＣを、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍのｃＤＮＡより精製した。ＬＰＳをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）より購入した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｈｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）より入手した。ＭＡＬＰ−２をＢｉｏｌｏｇｉｃａ（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）において合成した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびＰｏｌｙｍｙｘｉｎ ＢをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。ヌクレオチドプライマーの全てをＨｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ）で合成した。  E. E. coli DH5α was purchased from Invitrogen. P. Avenae flagellin was purified by Nara Institute of Science and Technology. Recombinant Flagellin A and Recombinant Flagellin C It was purified from angulararum cDNA. LPS was purchased from BD Biosciences (San Jose, CA). poly (I: C) was obtained from Amersham Biosciences (Buchinghamshire, UK). MALP-2 was synthesized at Biologica (Nagoya, Japan). Staphylococcus aureus peptidoglycan (PGN) and Polymyxin B were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). All of the nucleotide primers were synthesized with Hokaido System Sciences (Sapporo, Japan).

使用したＨｅｌａ細胞のサブラインは、細胞表面上にＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５を発現していない。Ｈｅｌａ細胞を、２４ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播いた。２４時間後に、Ｓ−キメラ、ｈｕＴＬＲ５、ｒｔＴＬＲ５Ｓ（１００ｎｇ）の発現のためのｐＦＬＡＧ−ＣＭＶまたはコントロールとしてのベクター単独を、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃレポーター遺伝子（１００ｎｇ）とともにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって上記細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量（４００ｎｇ）を、空ベクターを添加することによって調整した。ｐｈＲＬ−ＴＫ（１ｎｇ）を内部標準として使用した。The Hela cell subline used does not express TLR2, TLR3, TLR4 and TLR5 on the cell surface. Hela cells were seeded in 24-well plates (1 × 10 5 cells / well). After 24 hours, pFLAG-CMV for expression of S-chimera, huTLR5, rtTLR5S (100 ng) or the vector alone as a control was combined with the above cells by LipofectAMINE Plus reagent (Invitrogen) together with pELAM-luc reporter gene (100 ng). Transiently transfected. The total amount of transfected DNA (400 ng) was adjusted by adding empty vector. phRL-TK (1 ng) was used as an internal standard.

トランスフェクションの３６時間後、細胞を、フラジェリンＡ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリンＣ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１０００ｎｇ／ｍｌ）またはＭＡＬＰ−２（１μＭ）を用いて、３７℃で５時間処理した。これらは、それぞれＴＬＲ５、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３およびＴＬＲ２のリガンドである。  36 hours after transfection, the cells were treated with flagellin A (1000 ng / ml), flagellin C (1000 ng / ml), LPS (100 ng / ml), poly (I: C) (1000 ng / ml) or MALP-2 (1 μM). ) At 37 ° C. for 5 hours. These are ligands for TLR5, TLR4, TLR3 and TLR2, respectively.

ＩＦＮ−βプロモーター活性化の測定のために、２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３細胞（２×１０５細胞）に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐ−１２５ｌｕｃ（ＩＦＮ−β）レポータープラスミド（１００ｎｇ）を、示した量の試薬またはプラスミドとともにトランスフェクトした。For measurement of IFN-β promoter activation, p-125luc (IFN-β) reporter plasmid (100 ng) was used on HEK293 cells (2 × 10 5 cells) in 24-well plates using LipofectAMINE2000 (Invitrogen). Were transfected with the indicated amounts of reagents or plasmids.

Ｈｅｌａ細胞に、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｈｕＴＬＲ５（１００ｎｇ）、種々の量（０〜５０ｎｇ）のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５Ｓ、ｐＥＬＡＭ−ｌｕｃまたはｐ−１２５ｌｕｃ（各１００ｎｇ）およびｐｈＲＬ−ＴＫ（１ｎｇ）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を９６ウェルプレートに移し、次いで、０〜１０００ｎｇのフラジェリンＡで刺激した後、５時間静置した。Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬およびプロトコルを使用して、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ｍｏｄｅｌ：ＢＬＲ−２０１，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で、以前に記されたようにルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。  Hela cells were transfected with pFLAG-CMV / huTLR5 (100 ng), various amounts (0-50 ng) of pFLAG-CMV / rtTLR5S, pELAM-luc or p-125luc (100 ng each) and phRL-TK (1 ng). . After 24 hours, the cells were transferred to a 96-well plate and then stimulated with 0-1000 ng of flagellin A and allowed to stand for 5 hours. Luciferase reporter assays were performed as previously described with the luminometer (model: BLR-201, Aloka, Tokyo, Japan) using the reagents and protocols of the Dual luciferase reporter gene assay kit (Promega).

上記の手順に従って、Ｓ−キメラタンパク質をＨｅｌａ細胞に首尾よく発現させた。また、この発現を、抗ＨｉｓタグＡｂを使用して確認した。ｒｔＴＬＲ５Ｓはフラジェリンを認識する能力を有する場合、このキメラレポーターは、エクトドメインによってフラジェリンの存在を認識し、そしてヒトＴＩＲを介してＨｅｌａ細胞においてＮＦ−κＢを活性化する。このキメラ発現Ｈｅｌａ細胞を使用した代表的な結果を、図９Ａに示す。  The S-chimeric protein was successfully expressed in Hela cells according to the procedure described above. This expression was also confirmed using anti-His tag Ab. If rtTLR5S has the ability to recognize flagellin, this chimeric reporter recognizes the presence of flagellin by the ectodomain and activates NF-κB in Hela cells via human TIR. A representative result using this chimeric expressing Hela cell is shown in FIG. 9A.

図９Ａは、キメラ形質転換体およびｈｕＴＬＲ５形質転換体におけるＮＦ−κＢ活性化の測定のためのルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。ＥＬＡＭ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポータープラスミドを、空ベクター（ベクターコントロール：左）、ｈｕＴＬＲ５（中央）またはキメラ（右側）とともにＨｅｌａ細胞に同時トランスフェクトした。３６時間後、細胞をフラジェリンＡで示した濃度にて５時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化の程度を、細胞溶解物中のルシフェラーゼアッセイによって決定した。  FIG. 9A shows a luciferase reporter assay for measurement of NF-κB activation in chimeric and huTLR5 transformants. ELAM-luciferase reporter plasmid was co-transfected into Hela cells with empty vector (vector control: left), huTLR5 (middle) or chimera (right side). After 36 hours, the cells were stimulated for 5 hours at the concentration indicated by flagellin A. The extent of NF-κB activation was determined by luciferase assay in cell lysates.

図９Ａに示すように、Ｓ−キメラ分子は、Ｈｅｌａ細胞においてｈｕＴＬＲ５と同程度にＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化した。ここで、これらの発現レベルはほぼ同一であった。フラジェリンＡおよびフラジェリンＣは、同一のｒｔＴＬＲ５刺激能を有した。  As shown in FIG. 9A, the S-chimeric molecule activated the NF-κB reporter gene to the same extent as huTLR5 in Hela cells. Here, these expression levels were almost the same. Flagellin A and flagellin C had the same ability to stimulate rtTLR5.

Ｓ−キメラが種々の起源のフラジェリンに応答することを図９Ｂに示す。ｈｕＴＬＲ５またはこのキメラを発現する細胞を、フラジェリンＡ（１０００ｎｇ／ｍｌ）、フラジェリンＣ（１０００ｎｇ／ｍｌ）またはＰ．ａｖｅｎａｅフラジェリンで６時間刺激した。ＮＦ−κＢ活性化を、図９Ａと同様に決定した。  FIG. 9B shows that S-chimeras respond to flagellins of various origins. Cells expressing huTLR5 or this chimera were treated with flagellin A (1000 ng / ml), flagellin C (1000 ng / ml) or P. aeruginosa. Stimulated with avenae flagellin for 6 hours. NF-κB activation was determined as in FIG. 9A.

図９Ｂに示すように、他の植物細菌Ｐ．ａｖｅｎａｅのフラジェリンは、同様にこのキメラを刺激した。これらの結果は、別の細胞株ＨＥＫ２９３において再現可能であった（データは示さず）。一方、ｒｔＴＬＲ５ＳおよびｈｕＴＬＲ５は、そのＬＲＲドメインを介して広範な種々のフラジェリンと相互作用した。  As shown in FIG. Avenae flagellin stimulated this chimera as well. These results were reproducible in another cell line HEK293 (data not shown). On the other hand, rtTLR5S and huTLR5 interacted with a wide variety of flagellins through their LRR domains.

これらの相互作用の特異的を試験するために、本発明者らは、ｈｕＴＬＲ５およびＳ−キメラを、ＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ２のリガンド）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３のリガンド）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４のリガンド）およびフラジェリンＣ（ＴＬＲ５のリガンド）で刺激した（図９Ｃ）。このキメラ分子およびヒトＴＬＲ５は、排他的にフラジェリンを認識してＮＦ−κＢレポーター遺伝子を活性化した。  In order to test the specificity of these interactions, we have identified huTLR5 and S-chimeras as MALP-2 (ligand of TLR2), poly (I: C) (ligand of TLR3), LPS (TLR4). ) And flagellin C (TLR5 ligand) (FIG. 9C). This chimeric molecule and human TLR5 exclusively recognized flagellin and activated the NF-κB reporter gene.

次いで、Ｈｅｌａ細胞におけるｒｔＴＬＲ５Ｓのパートナーの特異性を試験した。ｒｔＴＬＲ５Ｓありまたはなしの条件下でｈｕＴＬＲ２，ｈｕＴＬＲ４（ＭＤ−２およびＣＤ１４と一緒に）またはｈｕＴＬＲ５のｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞を、種々のＴＬＲリガンドで刺激した（図１０）。ｈｕＴＬＲ２発現細胞において、ＭＡＬＰ−２およびＰａｍ３によってＮＦ−κＢレポーター活性を示し、ｈｕＴＬＲ４発現細胞においてＬＰＳによって、ＮＦ−κＢレポーター活性を示した。しかし、この活性は、ｒｔＴＬＲ５Ｓの同時発現によってもたらされたものではなかった。ｈｕＴＬＲ５とフラジェリンを発現する細胞においてのみＴＬＲ５Ｓ媒介性レポーター増幅を観察した（図１０）。よって、ｒｔＴＬＲ５Ｓの活性は、ｈｕＴＬＲ５およびフラジェリンに特異的であることがわかった。  The specificity of the rtTLR5S partner in Hela cells was then tested. Cells transfected with huTLR2, huTLR4 (along with MD-2 and CD14) or huTLR5 cDNA with or without rtTLR5S were stimulated with various TLR ligands (FIG. 10). In huTLR2-expressing cells, MALP-2 and Pam3 showed NF-κB reporter activity, and in huTLR4-expressing cells, LPS showed NF-κB reporter activity. However, this activity was not caused by co-expression of rtTLR5S. TLR5S-mediated reporter amplification was observed only in cells expressing huTLR5 and flagellin (FIG. 10). Thus, the activity of rtTLR5S was found to be specific for huTLR5 and flagellin.

〔実施例１３：ｒｔＴＬＲ５Ｓは、形質転換体におけるｈｕＴＬＲ５媒介性ＮＦ−κＢ活性化を増大させる〕
実施例１０に従うと、ｒｔＴＬＲ５ＳがｒｔＴＬＲ５によるＮＦ−κＢ活性化を誘導した。そこで、この可溶性形態のＴＬＲ５が、ヒト膜結合形態ＴＬＲ５によって誘導されたフラジェリン媒介性ＮＦ−κＢ活性化を増大し得るか否かを試験した。[Example 13: rtTLR5S increases huTLR5-mediated NF-κB activation in transformants]
According to Example 10, rtTLR5S induced NF-κB activation by rtTLR5. Thus, it was tested whether this soluble form of TLR5 could increase flagellin-mediated NF-κB activation induced by human membrane-bound form TLR5.

実施例１２に記載した細胞およびアッセイ方法を用いて、ｈｕＴＬＲ５のみを発現するＨｅｌａ細胞、またはｈｕＴＬＲ５＋ｒｔＴＬＲ５Ｓを発現するＨｅｌａ細胞を、フラジェリンＡで刺激した。図１１に示すように、Ｈｅｌａ細胞に示した組み合わせのベクターをトランスフェクトし、この細胞を、フラジェリンＡ（示した用量）またはコントロールＧＳＴタンパク質（１０００ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。間をおいて（典型的には５時間）、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを行った。  Using the cells and assay methods described in Example 12, Hela cells expressing only huTLR5 or Hela cells expressing huTLR5 + rtTLR5S were stimulated with flagellin A. As shown in FIG. 11, Hela cells were transfected with the indicated combination of vectors, and the cells were stimulated with flagellin A (dose indicated) or control GST protein (1000 ng / ml). At intervals (typically 5 hours), an NF-κB reporter assay was performed.

図１１Ａに示すように、ＮＦ−κＢレポーターは、ｒｔＴＬＲ５Ｓが同時トランスフェクトされた細胞において有意に増大された。ｈｕＴＬＲ５（他のＴＬＲ５ではない）を種々のフラジェリン種とともに天然に発現するＨＥＫ２９３細胞を用いて、同様の結果を得た（データは示さず）。しかし、ｐ−１２５−ｌｕｃを使用する同様のレポーターアッセイにおいて、Ｈｅｌａ細胞におけるＩＦＮ−βプロモーターの活性化をわずかに検出した。  As shown in FIG. 11A, the NF-κB reporter was significantly increased in cells co-transfected with rtTLR5S. Similar results were obtained using HEK293 cells that naturally express huTLR5 (but not other TLR5) with various flagellin species (data not shown). However, in a similar reporter assay using p-125-luc, a slight activation of the IFN-β promoter in Hela cells was detected.

このフラジェリンの機能的様式を物理的に確認するために、本発明者らは、ＧＳＴタグ化フラジェリンとＦＬＡＧタグ化ｒｔＴＬＲ５Ｓとの直敵的な相互作用をＧＳＴ−プルダウンおよびイムノブロッティングによって調べた。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５ＳをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、この細胞および上清からのフラジェリン結合タンパク質を、抗ＦＬＡＧ Ａｂでプローブした。あるいは、このタンパク質を、抗ＦＬＡＧ Ａｂで免疫沈降させて抗ＧＳＴ Ａｂを使用するイムノブロッティングによって分析した。  In order to physically confirm the functional mode of this flagellin, we examined the direct interaction between GST-tagged flagellin and FLAG-tagged rtTLR5S by GST-pulldown and immunoblotting. pFLAG-CMV / rtTLR5S was transfected into HEK293FT cells and flagellin binding protein from this cell and supernatant was probed with anti-FLAG Ab. Alternatively, the protein was analyzed by immunoblotting using an anti-GST Ab immunoprecipitated with an anti-FLAG Ab.

具体的には、６０ｍｍディッシュにて、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５ＳまたはｈｕＴＬＲ２（コントロール）を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００試薬を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に一過性にトランスフェクトし、２４時間静置させた。細胞を溶解し、ＧＳＴ−フラジェリンＡまたはコントロールＧＳＴ（１０００ｎｇ）をこの溶解物または培養上清に添加した。ＧＳＴ−フラジェリンに結合したＦＬＡＧ標識タンパク質を、抗ＧＳＴ Ａｂ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて免疫沈降した。免疫沈降物を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）で分離し、示した抗体を使用するイムノブロッティングによって可視化した。  Specifically, in a 60 mm dish, pFLAG-CMV / rtTLR5S or huTLR2 (control) was transiently transfected into HEK293FT cells using LipofectAMINE2000 reagent and allowed to stand for 24 hours. Cells were lysed and GST-flagellin A or control GST (1000 ng) was added to the lysate or culture supernatant. FLAG-tagged protein bound to GST-flagellin was immunoprecipitated using anti-GST Ab (NeoMarkers, Fremont, Calif.). Immunoprecipitates were washed, separated by SDS-PAGE (7.5% gel) and visualized by immunoblotting using the indicated antibodies.

図１１Ａ（内側のパネル）に示すように、ｈｕＴＬＲ５の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、引き続く抗ＦＬＡＧ Ａｂを用いるイムノブロッティングによって確認した。ｒｔＴＬＲ５ＳとｈｕＴＬＲ５との同時トランスフェクションは、ｈｕＴＬＲ５発現レベルにほとんど影響を与えなかった。ｒｔＴＬＲ５Ｓのバンドは、細胞溶解物または上清中には検出されなかった。  As shown in FIG. 11A (inner panel), the expression of huTLR5 was confirmed by SDS-PAGE followed by immunoblotting with anti-FLAG Ab. Co-transfection of rtTLR5S and huTLR5 had little effect on huTLR5 expression levels. No rtTLR5S band was detected in the cell lysate or supernatant.

フラジェリンのこの機能的態様を物理的に確認するために、免疫沈降を用いて、ＧＳＴタグ化フラジェリンとＦＬＡＧタグ化ｒｔＴＬＲ５Ｓとの直接的な相互作用をチェックした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ／ｒｔＴＬＲ５Ｓでトランスフェクトし、細胞および上清からのタンパク質を、ブロッティング分析によって抗ＦＬＡＧ Ａｂでプローブした。あるいは、これらのタンパク質を、抗ＧＳＴ Ａｂで免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ Ａｂを使用するイムノブロッティングにより分析した（図１１Ｂ）。ｒｔＴＬＲ５Ｓ（矢頭）と７７ｋＤａのマーカーとの位置を示す。これらの結果は、さらなる実験において確認された（図１１Ｃ）。これらのことより、ｒｔＴＬＲ５Ｓはフラジェリンとアセンブリすることによって宿主ＴＬＲ５応答を増幅する、ということを示す。  In order to physically confirm this functional aspect of flagellin, immunoprecipitation was used to check the direct interaction between GST-tagged flagellin and FLAG-tagged rtTLR5S. HEK293T cells were transfected with pFLAG-CMV / rtTLR5S and proteins from cells and supernatants were probed with anti-FLAG Ab by blotting analysis. Alternatively, these proteins were immunoprecipitated with anti-GST Ab and analyzed by immunoblotting using anti-FLAG Ab (FIG. 11B). The positions of rtTLR5S (arrowhead) and the 77 kDa marker are shown. These results were confirmed in further experiments (FIG. 11C). These indicate that rtTLR5S amplifies the host TLR5 response by assembling with flagellin.

これらの結果は、ｒｔＴＬＲ５Ｓの生理学的役割が、ＴＬＲ５の種を超えて生じるフラジェリン／ＴＬＲ５依存的ＮＦ−κＢ応答を増強することであることを示す。すなわち、魚類の可溶性形態ＴＬＲ５は、細胞種に関係なく膜結合形態ＴＬＲ５ポジティブ細胞における強いＮＦ−κＢ活性化を導くフラジェリン応答についてのポジティブフィードバックループに従う。  These results indicate that the physiological role of rtTLR5S is to enhance the flagellin / TLR5-dependent NF-κB response that occurs across TLR5 species. That is, the soluble form of fish TLR5 follows a positive feedback loop for the flagellin response leading to strong NF-κB activation in membrane-bound form TLR5 positive cells regardless of cell type.

尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。  It should be noted that the specific embodiments or examples made in the best mode for carrying out the invention are merely to clarify the technical contents of the present invention, and are limited to such specific examples. The present invention should not be construed as narrowly defined but can be implemented with various modifications within the spirit of the present invention and the scope of the following claims.

本発明は、免疫応答（特に、ガンまたは感染疾患に対する）を惹起するためのワクチンにおけるアジュバントとして使用することができるので、種々の疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症もしくは寄生虫感染症、ガン、アレルギー、または自己免疫疾患など）を罹患する被験体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）の治療の開発に貢献できる。特に、従来のワクチンの有する不利益を克服した新規ワクチンを提供することができる。  Since the present invention can be used as an adjuvant in vaccines to elicit an immune response (especially against cancer or infectious diseases), various diseases (eg, viral infections, bacterial or parasitic infections, Can contribute to the development of treatment for subjects (preferably mammals, more preferably humans) suffering from cancer, allergies, or autoimmune diseases. In particular, a novel vaccine that overcomes the disadvantages of conventional vaccines can be provided.

Claims (51)

配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ワクチン組成物。  A vaccine composition comprising an adjuvant component comprising a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. 前記免疫原成分が抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 1, wherein the immunogenic component comprises a polynucleotide encoding an antigenic peptide. 前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項２に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 2, wherein the antigenic peptide is flagellar bacterium. 前記抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項２に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 2, wherein the polynucleotide encoding the antigenic peptide is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7. 前記アジュバント成分が、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 1, wherein the adjuvant component further comprises a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition of claim 1, further comprising a huTLR5 polynucleotide. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 1, further comprising a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ワクチン組成物。  A vaccine composition comprising an adjuvant component comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. 前記免疫原成分が抗原性ペプチドを含む、請求項８に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition of claim 8, wherein the immunogenic component comprises an antigenic peptide. 前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項９に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 9, wherein the antigenic peptide is flagellar bacterium. 前記抗原性ペプチドが、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項９に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 9, wherein the antigenic peptide is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8. 前記アジュバント成分が、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含む、請求項８に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 8, wherein the adjuvant component further comprises a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含む、請求項８に記載のワクチン組成物。  9. The vaccine composition according to claim 8, further comprising a huTLR5 polypeptide. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに含む、請求項８に記載のワクチン組成物。  The vaccine composition according to claim 8, further comprising huTLR5 polypeptide-expressing cells. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ワクチン用キット。  A vaccine kit comprising an adjuvant component comprising a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. 前記免疫原成分が抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 15, wherein the immunogenic component comprises a polynucleotide encoding an antigenic peptide. 前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項１６に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 16, wherein the antigenic peptide is flagellar bacterium. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号５または７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１６に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 16, wherein the polynucleotide is a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7. 前記アジュバント成分が、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 15, wherein the adjuvant component further comprises a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えている、請求項１５に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 15, further comprising a huTLR5 polynucleotide. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに備えている、請求項１５に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 15, further comprising a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide is introduced. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ワクチン用キット。  A vaccine kit comprising an adjuvant component comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. 前記免疫原成分が抗原性ペプチドを含む、請求項２２に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 22, wherein the immunogenic component comprises an antigenic peptide. 前記抗原性ペプチドが鞭毛細菌である、請求項２３に記載のワクチン用キット。  24. The vaccine kit according to claim 23, wherein the antigenic peptide is flagellar bacterium. 前記抗原性ペプチドが、配列番号６または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項２３に記載のワクチン用キット。  24. The vaccine kit according to claim 23, wherein the antigenic peptide is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8. 前記アジュバント成分が、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含む、請求項２２に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 22, wherein the adjuvant component further comprises a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えている、請求項２２に記載のワクチン用キット。  23. The vaccine kit according to claim 22, further comprising a huTLR5 polypeptide. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに備えている、請求項２２に記載のワクチン用キット。  The vaccine kit according to claim 22, further comprising huTLR5 polypeptide-expressing cells. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ガンまたは感染症を予防するため薬学的組成物。  A pharmaceutical composition for preventing cancer or infectious disease, comprising an adjuvant component comprising a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。  30. The pharmaceutical composition of claim 29, further comprising a huTLR5 polynucleotide. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。  30. The pharmaceutical composition of claim 29, further comprising transformed cells into which a huTLR5 polynucleotide has been introduced. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を含む、ガンまたは感染症を予防するため薬学的組成物。  A pharmaceutical composition for preventing cancer or infection, comprising an adjuvant component comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。  34. The pharmaceutical composition of claim 32, further comprising a huTLR5 polypeptide. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに含む、請求項３２に記載の薬学的組成物。  34. The pharmaceutical composition of claim 32, further comprising huTLR5 polypeptide expressing cells. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ガンまたは感染症を予防するためキット。  A kit for preventing cancer or infectious disease, comprising an adjuvant component comprising a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドをさらに備えている、請求項３５に記載のキット。  36. The kit of claim 35, further comprising a huTLR5 polynucleotide. ｈｕＴＬＲ５ポリヌクレオチドを導入した形質転換細胞をさらに備えている、請求項３５に記載のキット。  36. The kit according to claim 35, further comprising a transformed cell into which a huTLR5 polynucleotide has been introduced. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むアジュバント成分、および免疫学的有効量の免疫原成分を備えている、ガンまたは感染症を予防するためキット。  A kit for preventing cancer or infection, comprising an adjuvant component comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an immunologically effective amount of an immunogenic component. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチドをさらに備えている、請求項３８に記載のキット。  40. The kit of claim 38, further comprising a huTLR5 polypeptide. ｈｕＴＬＲ５ポリペプチド発現細胞をさらに備えている、請求項３８に記載のキット。  40. The kit of claim 38, further comprising huTLR5 polypeptide expressing cells. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬。  A detection agent for detecting flagellar bacteria in a subject sample, comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出薬。  A detection agent for detecting flagellar bacteria in a subject sample, comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを備えている、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出キット。  A detection kit for detecting flagellar bacteria in a subject sample, comprising a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを備えている、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出キット。  A detection kit for detecting flagellar bacteria in a subject sample, comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを導入した細胞を、被験体サンプルとインキュベートする工程を包含する、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出方法。  A detection method for detecting flagellar bacteria in a subject sample, comprising a step of incubating a cell into which the polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has been introduced with the subject sample. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、被験体サンプルとインキュベートする工程を包含する、被験体サンプル中の鞭毛細菌を検出するための検出方法。  A detection method for detecting flagellar bacteria in a subject sample, comprising a step of incubating a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with the subject sample. 配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、アジュバント。  An adjuvant comprising a polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. 配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４７に記載のアジュバント。  The adjuvant of Claim 47 which further contains the polynucleotide which consists of a base sequence shown by sequence number 3. 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、アジュバント。  An adjuvant comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをさらに含む、請求項４９に記載のアジュバント。  The adjuvant according to claim 49, further comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. 注入可能な形態である、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載のアジュバント。  51. The adjuvant according to any one of claims 47 to 50, wherein the adjuvant is in an injectable form.
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