JPWO2006019187A1

JPWO2006019187A1 - Kidney disorder treatment

Info

Publication number: JPWO2006019187A1
Application number: JP2006531961A
Authority: JP
Inventors: 英世野入; 康介根岸; 敏郎藤田
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2008-05-08
Also published as: WO2006019187A1

Abstract

この発明は、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害の予防または治療剤に関する。この発明により、虚血あるいは虚血−再灌流による腎疾患の治療や腎不全の進行の抑制、あるいは腎移植時等の虚血または虚血−再灌流障害の予防または治療、慢性虚血病態の軽減を通して移植腎の長期的腎機能の温存を実現することが可能である。The present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for ischemia-related renal injury and renal injury associated with renal ischemia-reperfusion, comprising granulocyte colony-stimulating factor as an active ingredient. According to the present invention, treatment of renal diseases caused by ischemia or ischemia-reperfusion, suppression of progression of renal failure, prevention or treatment of ischemia or ischemia-reperfusion injury at the time of kidney transplantation, etc. Through reduction, it is possible to preserve the long-term renal function of the transplanted kidney.

Description

本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと略記する）を有効成分とする虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害の治療剤に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for ischemia-related renal injury and renal injury associated with renal ischemia-reperfusion, comprising granulocyte colony-stimulating factor (hereinafter abbreviated as G-CSF) as an active ingredient.

腎不全は腎機能不全、すなわち腎臓の障害により、正常な腎臓が行っている体液あるいは腎から分泌・排泄される各種生理活性物質の量的・質的恒常性に変調を来たしたり、あるいは維持することが困難になった状態である。腎不全は通常数日以内に発症する急性腎不全と、数ヶ月から数年以上の経過をたどり、徐々に腎不全に至る慢性腎不全に大別される。
急性腎不全の一部は可逆性であり、治癒可能な症例と、その他の不可逆性へ移行する症例があり、その一部では血液浄化療法（血液透析や腹膜透析等）を導入しなければならない場合もある。一方、慢性腎不全（保存期腎不全）は非可逆性で、進行性の疾患であり、腎機能の低下が著しくなると血液浄化療法の対象となる。このような代替療法により腎不全が直接の死因となることは少ないが、患者の生活や労働時間の制限を受ける血液浄化療法に至らないことが切望されている。また、透析患者数は日本で２０万人超、人口の１０％強が早期の腎疾患に罹患しており、医療費は全体医療費約１２兆円のうちの１兆円を占めている。従って医療経済的側面からも進行性腎障害のコントロールが切望されている。
腎不全の原因としては、循環動態・血行動態的な原因（たとえば高血圧、動脈硬化、血管炎、血管の過収縮などによる腎組織への血流量の低下、過剰な圧負荷）、炎症・免疫的な原因（たとえば自己抗体、免疫グロブリンの沈着、補体の活性化、炎症細胞の浸潤）、薬物による障害（たとえば抗がん剤や抗生物質、造影剤による直接的な腎組織の障害）などが知られている。このように腎不全の原因は様々であるが、進行性腎障害に共通な主な現象（ｆｉｎａｌｃｏｍｍｏｎｐａｔｈｗａｙ）として、組織の酸素分圧の低下（即ち虚血）の関与があり、例えば、急性腎不全の一つである造影剤による腎障害は虚血が原因であることが報告されている（非特許文献１参照）。また、慢性腎不全においても同様に腎障害に虚血が関係することが報告されている（非特許文献２及び３参照）。すなわち、虚血による腎組織障害をコントロールできれば、種々の腎疾患の治療あるいは腎不全の進行の抑制ができる可能性が考えられる。
一方、著しく腎機能が低下した末期腎不全の治療には、血液浄化療法以外には腎移植が施されている。腎移植は生体腎移植及び死体腎移植が行われているが、死体腎移植は、生体腎移植と比較して、ドナーから腎臓が摘出されてから移植されるまでの時間が一般的に長い。したがって、死体腎移植ではドナーの死亡後、腎への血流が途絶えるため、腎臓が虚血状態となり、虚血による腎組織の障害が生じる。さらに、虚血になった腎臓をレシピエントに移植した後、腎臓に血液が再灌流することにより生じる虚血−再灌流による障害も生じることとなる。これらの虚血障害あるいは虚血−再灌流障害は腎臓の生着率の低下を招くとともに、移植直後からの腎機能の発現低下を生じる（非特許文献４及び５参照）。
ところで、Ｇ−ＣＳＦに関して、シスプラチン誘発マウス急性尿細管性腎不全モデルにおいて、Ｇ−ＣＳＦの投与が腎機能の改善傾向を示したことが報告されている（非特許文献６）。また、Ｇ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子を有効成分とする腎疾患治療剤が開示されている（特許文献１）が、ここでは虚血−再灌流による急性の腎障害に対する治療効果しか確認されていない。
リス（ＰＬｉｓｓ）等、「キドニーインターナショナル（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」（米国）１９９８年、第５３巻、ｐｐ．６９８−７０２ナンガク（ＭＮａｎｇａｋｕ）、「インターナルメディシン（ＩｎｔｅｒｎＭｅｄ．）」２００４年、第４３巻、ｐｐ．９−１７エカート（ＫＵＥｃｋａｒｄｔ）等、「ブラッドピューリフィケイション（ＢｌｏｏｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（スイス）２００３年、第２１巻、ｐｐ．２５３−２５７シャウン（ＤＳｔＰｅｔｅｒＳｈａｗｎ）等、「ザランセット（ＴｈｅＬａｎｃｅｔ）」（米国）２００２年、第３５９巻、ｐｐ．６０４−６１３アイカワ（ＡＡｉｋａｗａ）、「腎と透析」（日本）２０００年、第４９巻、Ｎｏ３増刊号、ｐｐ．４７２−４７７西田眞佐志等、第４７回日本腎臓学会誌２００４年第４６巻、Ｎｏ．３ｐ２７０国際公開ＷＯ２００５／０３４９８６ Renal failure is due to renal dysfunction, that is, due to renal failure, modulates or maintains the quantitative and qualitative homeostasis of various physiologically active substances secreted and excreted from the body fluids or kidneys that normal kidneys perform It has become difficult. Renal failure is broadly divided into acute renal failure that usually develops within a few days and chronic renal failure that gradually progresses from several months to several years and gradually leads to renal failure.
Some acute renal failure is reversible, and there are cases that can be cured and other cases that can be transferred to irreversibility, some of which require blood purification therapy (such as hemodialysis or peritoneal dialysis) In some cases. On the other hand, chronic renal failure (conservative renal failure) is an irreversible and progressive disease that becomes a target for blood purification therapy when the renal function is significantly reduced. Although such alternative therapies rarely cause direct death due to renal failure, there is an urgent need for a blood purification therapy that limits the lives and working hours of patients. The number of dialysis patients exceeds 200,000 in Japan, and more than 10% of the population suffers from early kidney disease. Medical expenses account for 1 trillion yen out of the total medical expenses of approximately 12 trillion yen. Therefore, control of progressive kidney injury is also eagerly desired from a medical economic aspect.
Causes of renal failure include circulatory and hemodynamic causes (eg, decreased blood flow to kidney tissue due to hypertension, arteriosclerosis, vasculitis, vascular hyperconstriction, excessive pressure load), inflammation, and immune Causes (eg autoantibodies, immunoglobulin deposition, complement activation, infiltration of inflammatory cells), drug damage (eg direct renal tissue damage due to anticancer drugs, antibiotics, contrast agents) Are known. As described above, there are various causes of renal failure, but as a common phenomenon in progressive renal injury (final common pathway), there is a reduction in the partial pressure of oxygen in the tissue (ie, ischemia). It has been reported that renal damage caused by a contrast medium, which is one of renal failure, is caused by ischemia (see Non-Patent Document 1). Similarly, it has been reported that ischemia is related to renal damage in chronic renal failure (see Non-Patent Documents 2 and 3). That is, if renal tissue damage due to ischemia can be controlled, there is a possibility that various renal diseases can be treated or the progression of renal failure can be suppressed.
On the other hand, kidney transplantation is performed in addition to blood purification therapy for the treatment of end-stage renal failure in which the renal function is remarkably reduced. Liver transplantation and cadaveric kidney transplantation are performed for kidney transplantation, but cadaveric kidney transplantation generally requires a longer time from the removal of the kidney from the donor to the transplantation. Therefore, in cadaveric kidney transplantation, blood flow to the kidney is interrupted after the death of the donor, so that the kidney becomes ischemic and damage to the renal tissue due to ischemia occurs. Furthermore, after transplanting an ischemic kidney into a recipient, an ischemia-reperfusion injury caused by reperfusion of blood into the kidney also occurs. These ischemic injury or ischemia-reperfusion injury leads to a decrease in the engraftment rate of the kidney and a decrease in the expression of renal function immediately after transplantation (see Non-Patent Documents 4 and 5).
By the way, regarding G-CSF, it has been reported that administration of G-CSF showed a tendency to improve renal function in a cisplatin-induced mouse acute tubular renal failure model (Non-patent Document 6). Moreover, although the therapeutic agent for renal diseases which uses colony stimulating factors, such as G-CSF, as an active ingredient is disclosed (patent document 1), only the therapeutic effect with respect to acute kidney injury by ischemia-reperfusion is confirmed here. Absent.
P. Liss et al., “Kidney International” (USA) 1998, Vol. 698-702 M. Nangaku, “Internal Med.” 2004, Vol. 43, pp. 196. 9-17 KU Eckert et al., “Blood Purification” (Switzerland) 2003, Vol. 253-257 D. St Peter Shann et al., “The Lancet” (USA) 2002, Vol. 604-613 A Aikawa, “Kidney and Dialysis” (Japan) 2000, Vol. 49, No.3 Special Issue, pp. 472-477 Nishida, K. et al., 47th Annual Meeting of the Japanese Nephrological Society, Volume 46, No. 3 p270 International Publication WO 2005/034986

虚血あるいは虚血−再灌流による障害に対する保護効果を有する新規薬剤の開発によって、種々の腎疾患の治療あるいは腎不全の進行の抑制が期待できる。また、腎移植時の虚血あるいは虚血−再灌流障害を予防することにより、移植機会の増加、初期腎機能低下の軽減が実現でき、結果的に移植数の増加や成功率を上げることができ、さらには長期的には移植グラフトにおけるネフロン機能の保持に必要な尿細管周囲血流の確保が、移植腎の生着率の上昇に直接的に関与すると考えられる。またこれは、慢性腎障害の病態に総じて関連したｆｉｎａｌｃｏｍｍｏｎｐａｔｈｗａｙであるといっても過言ではない。
Ｇ−ＣＳＦは好中球を増加させる薬剤として臨床適用されているが、腎臓において、虚血あるいは虚血−再灌流による障害に対して保護作用のあることは知られていない。また上記のような薬剤性の腎不全モデルは必ずしも虚血による腎障害あるいは虚血−再灌流に伴う腎障害を反映しているとは言えず、こうした腎障害に対する効果についてはまったく未知であった。
本発明者等は、虚血および虚血−再灌流による腎障害を反映したラットモデルにおいて、その腎機能が改善されるかどうかを検討したところ、Ｇ−ＣＳＦの投与によって腎不全期における腎機能が改善することを確認した。また、Ｇ−ＣＳＦが葉酸による慢性腎障害モデルにおいて、組織障害を軽減することを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、その一の態様において、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、虚血関連腎障害または腎虚血−再灌流に伴う腎障害の予防または治療剤を提供する。
本発明において、好ましい腎障害は慢性腎障害である。
本明細書書中、慢性腎障害とは、腎間質の線維化および慢性虚血の少なくともいずれかを呈した状態をいう。また、ここでいう慢性腎障害には、急性の腎障害から慢性の腎障害に進行していく過程の進行性腎障害も含まれる。
慢性虚血とは、例えば、尿細管周囲血管網の減少等で特徴付けられる状態であり、抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）抗体を用いて検出される。その結果が間質の線維化として組織学的に評価されうる。
本発明は更に、別の態様において、本発明の予防または治療剤を、虚血関連腎障害または腎虚血−再灌流に伴う腎障害をもつ患者に投与することを含む、前記腎障害を予防または治療するための方法を提供する。The development of a novel drug having a protective effect against ischemia or ischemia-reperfusion injury can be expected to treat various renal diseases or suppress the progression of renal failure. In addition, by preventing ischemia or ischemia-reperfusion injury at the time of kidney transplantation, it is possible to increase transplantation opportunities and reduce initial renal function decline, resulting in an increase in the number of transplants and an increased success rate. In addition, in the long term, securing peritubular blood flow necessary for maintaining nephron function in the graft graft is considered to be directly involved in increasing the survival rate of the transplanted kidney. Moreover, it is no exaggeration to say that this is a final common pathway generally related to the pathology of chronic kidney injury.
Although G-CSF has been clinically applied as a drug that increases neutrophils, it is not known to have a protective effect against damage caused by ischemia or ischemia-reperfusion in the kidney. Moreover, it cannot be said that the above-mentioned drug-induced renal failure models necessarily reflect renal damage due to ischemia or renal damage associated with ischemia-reperfusion, and the effects on such renal damage were completely unknown. .
The present inventors examined whether or not the renal function is improved in a rat model reflecting ischemia and ischemia-reperfusion-induced renal damage. As a result, administration of G-CSF revealed renal function during renal failure. Was confirmed to improve. Further, G-CSF was found to reduce tissue damage in a chronic renal injury model caused by folic acid, and the present invention was completed.
That is, in one aspect thereof, the present invention provides a preventive or therapeutic agent for ischemia-related renal injury or renal injury associated with renal ischemia-reperfusion, comprising granulocyte colony stimulating factor as an active ingredient.
In the present invention, the preferred renal disorder is chronic renal disorder.
In the present specification, the term “chronic kidney injury” refers to a condition exhibiting at least one of renal interstitial fibrosis and chronic ischemia. The term “chronic kidney injury” as used herein also includes progressive kidney injury in the process of progressing from acute kidney injury to chronic kidney injury.
Chronic ischemia is a condition characterized by, for example, a decrease in the peritubular vascular network, and is detected using an anti-CD31 (PECAM) antibody. The result can be evaluated histologically as interstitial fibrosis.
The present invention further provides, in another aspect, the prevention or treatment of the renal injury, comprising administering the prophylactic or therapeutic agent of the present invention to a patient having ischemia-related renal injury or renal injury associated with renal ischemia-reperfusion. A method for treating is provided.

図１は、腎間質の線維化の組織学的評価を示す。原図（Ｏｒｉｇｉｎａｌｐｉｃｔｕｒｅ）は、マッソン−トリクロム（Ｍａｓｓｏｎ／Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色で線維化部分が青染されている原写真を示す。解析図（Ａｎａｌｙｚｅｄｐｉｃｔｕｒｅ）は、これを、画像解析ソフトで解析した図を示す。
発明の詳細な説明
以下に本発明をより詳細に説明するが、本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２３８５７３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含するものとする。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は好中球前駆細胞に作用し、その分化・増殖を促進させるほか、骨髄からの成熟好中球の放出促進及び好中球機能を亢進させる作用を有することから、造血幹細胞移植後の好中球数の増加促進、あるいはがん化学療法後の好中球減少症治療剤として既に臨床応用されているタンパク質である。また、骨髄中の造血幹細胞を末梢血中へ動員する作用を有することから、同種及び自家末梢血幹細胞採取時における造血幹細胞の末梢血中への動員剤としても臨床応用されている。
本発明者等は、驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦが腎虚血−再灌流によるラット腎障害モデルおよび葉酸によるマウス腎不全モデルにおける腎機能を改善することを見出した。
腎虚血−再灌流によるラット腎障害モデルとしてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、１８０〜２００ｇ、６週齢程度を使用する場合には、全身麻酔下に左腎動脈をクリップで挟み４５分間の腎虚血を起こし、クリップを外す直前に右腎を摘出したのちにクリップを外し、左腎を再灌流させる。なお、再灌流直前に右腎を摘出することで虚血腎の再灌流障害の程度を腎機能の推移として直接とらえることが容易になると考えられる。
上記モデルは虚血−再灌流による腎障害の病態を代表するモデルであり、再灌流後およそ２４時間をピークとする血清クレアチニン濃度、尿素窒素濃度の上昇を示す急性腎不全である。組織学的には腎皮髄境界部周辺を中心に尿細管上皮の脱落、変性と腎間質への炎症細胞浸潤を呈する急性尿細管壊死であり、再灌流後２４時間から９６時間において最も強く現れ、その後数週間に渡って尿細管上皮の修復、再生所見が認められる。
また、Ｇ−ＣＳＦが葉酸による慢性腎障害モデルにおける組織障害を軽減することを見出した。
上記モデルでの有効性が証明されたＧ−ＣＳＦは、虚血あるいは虚血−再灌流による腎組織の障害が関与している急性腎不全、慢性腎不全、各種腎炎、腎移植などに使用できる。これらの疾患に対して、Ｇ−ＣＳＦは、発症防止のために予防的にあるいは発症後の進行を抑制するために治療的に投与するものである。ここで「予防的に」とは、急性症状、腎炎などの非慢性症状から慢性症状に移行することを防止することを意味する。
本発明に用いることができるＧ−ＣＧＦとして、特に好ましいものはヒトＧ−ＣＧＦである。ヒトＧ−ＣＳＦの例としては、例えば配列番号１〜３のアミノ酸配列、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列、で表されるヒトＧ−ＣＳＦ活性（すなわち、好中球増加活性、および虚血関連のまたは腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する予防または治療活性）を有するポリペプチド、又はこれに糖鎖が付された糖タンパク質を挙げることができる。更に、同配列のアミノ酸配列の一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）されたＧ−ＣＳＦ活性を有するＧ−ＣＳＦ誘導体も本発明におけるＧ−ＣＳＦに含まれる。このようなＧ−ＣＳＦ誘導体は、好ましくは、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。上記改変は、例えば公知の部位特異的突然変異誘発法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する方法を含む）によって行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＵＳＡ）。改変には、保存的アミノ酸置換が含まれる。すなわち、このような置換は、電気的または構造的に類似した性質をもつアミノ酸間の置換であり、例えば塩基性アミノ酸間、酸性アミノ酸間、疎水性アミノ酸間、あるいは極性アミノ酸間でのアミノ酸置換である。
これらのＧ−ＣＳＦは天然由来のもの、および遺伝子組換えによって得られたものを含むが、遺伝子組換えで得られたものが好ましい。この場合、宿主細胞としては大腸菌、哺乳動物細胞（Ｃ１２７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞等）を挙げることができる。これらの詳細な製造方法については、例えば、特表昭６３−５００６３６号、特開昭６２−２３６４９７号、特開昭６２−２３６４８８号、及び特開昭６３−２６７２９２号等に開示されている。
また、上記の配列番号１〜３のアミノ酸配列で示されるポリペプチドまたは糖タンパク質およびＧ−ＣＳＦ誘導体に、さらにポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを少なくとも１分子結合させたもの（例えば、ＷＯ９０／０６９５２、ＷＯ９６／１１９５３、特開平１−３１６４００）も含まれる。特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールであり、例えば分子量２，０００〜１００，０００程度、好ましくは６，０００〜２５，０００程度のポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールの付加は、一般にＰＥＧ（ペグ）化と呼ばれているが、Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端アミノ基および／またはリシン残基のεアミノ基に、アシル基やアルデヒド基などのアミノ基と反応性の基を介して結合することによって行うことができる。市販品としては、例えばＡｍｇｅｎ社がＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）として販売しているＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが挙げられる。
更にまた、Ｇ−ＣＳＦの糖鎖結合部位を改変することにより、糖鎖の構造を変えたり、糖鎖を付加あるいは欠失させたようなＧ−ＣＳＦ糖鎖改変体、あるいは、アルブミン、ビタミンＢ１２、または免疫グロブリン等と融合させたタンパク質も含まれる。Ｇ−ＣＳＦ糖鎖改変体は、例えばＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列にＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列（ここで、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸である。）を新たに付加したり、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列から該Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を欠失したりすることによって得ることができる。このような付加や欠失は、例えばＰＣＲを利用する部位特異的突然変異誘発法（Ａｕｓｕｂｅｌら，上記）を用いることによって容易に実施可能である。また、融合タンパク質は、一般的な遺伝子組換え技術を用いて、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと、これに融合させるタンパク質をコードするＤＮＡとを融合したＤＮＡを合成し、プロモーターの調節下にある適当なベクターに該融合ＤＮＡを挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該融合ＤＮＡを発現させることを含む手法によって得ることができる。
本発明の虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する予防または治療剤は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤等を含む医薬組成物として患者に投与することができる。
すなわち、本発明はまた、上記の医薬組成物を、虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害をもつ患者に投与することを含む、前記腎障害を予防または治療するための方法を提供する。
このような医薬組成物は、注射製剤、経口製剤、経粘膜投与製剤等、徐放性製剤の形態をとることができ、当分野で通常用いられている形態のいずれを用いることもできるが、特に注射製剤が好ましい。注射製剤における投与経路としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腎動脈内投与、あるいは徐放化ゲルを用いた投与があるが、特に皮下投与、静脈内投与が好ましい。
本発明の虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する治療剤において、Ｇ−ＣＳＦの投与量、投与回数は患者の状態に応じて決めることができ、特に限定するものではないが、通常０．１〜２００μｇ／ｋｇ／日、好ましくは１〜１００μｇ／ｋｇ／日であり、投与回数は、１〜７日間／週投与することができる。
本発明の虚血関連腎障害および腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する予防または治療剤はまた、生理食塩水やマンニトール、リンゲル液等の補液、あるいは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、血圧降下薬、利尿薬、抗血小板薬、血栓溶解剤、糖尿病治療薬、高脂血症治療薬、抗炎症薬、ステロイド、免疫抑制薬等の従来から腎疾患または原疾患に付随した合併症としての腎疾患に使用されている薬剤１種以上との併用も可能であり、同時に、あるいは別々に投与したり、これらを併せて含有する医薬組成物として投与することもできる。腎疾患に対して単独では効果が認められないこれらの薬剤も、Ｇ−ＣＳＦによって腎機能が保護された状態に対して投与することで、有効に作用させることができる。
腎疾患に対する治療効果は、例えば、血清クレアチニン濃度や血中尿素窒素濃度上昇の軽減、尿中蛋白量や尿中アルブミン量の減少、組織学的な尿細管障害スコアの改善等によって確認することができる（ＪＤＣｏｎｇｅｒ等、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９４年、第４６巻、ｐ．３１８；ＳＰＫｅｌｌｅｈｅｒ等、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９８７年、第３１巻、ｐ．７２５参照）。
本発明の腎虚血−再灌流に伴う腎障害に対する治療剤は、腎臓移植等の処置前に補助療法として行うこともできる。
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。FIG. 1 shows a histological evaluation of renal interstitial fibrosis. The original picture (Original picture) shows an original photograph in which the fibrosis part is stained blue with Masson / Trichrome staining. The analysis figure (Analyzed picture) shows the figure which analyzed this with image analysis software.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The present specification describes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2004-238573, which is the basis of the priority of the present application. It shall be included.
Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) acts on neutrophil progenitor cells and promotes their differentiation and proliferation, as well as promoting the release of mature neutrophils from bone marrow and enhancing neutrophil function. Therefore, it is a protein that has already been clinically applied as an agent for promoting the increase in the number of neutrophils after hematopoietic stem cell transplantation, or as a treatment for neutropenia after cancer chemotherapy. In addition, since it has an action of mobilizing hematopoietic stem cells in bone marrow into peripheral blood, it is also clinically applied as an agent for mobilizing hematopoietic stem cells into peripheral blood when collecting allogeneic and autologous peripheral blood stem cells.
The inventors have surprisingly found that G-CSF improves renal function in a rat renal injury model with renal ischemia-reperfusion and a mouse renal failure model with folic acid.
When using Sprague-Dawley rats, 180-200 g, about 6 weeks of age as a rat kidney injury model due to renal ischemia-reperfusion, the left renal artery is clipped with a clip under general anesthesia, causing 45 minutes of renal ischemia, After removing the right kidney just before removing the clip, remove the clip and reperfuse the left kidney. In addition, it is considered that by removing the right kidney immediately before reperfusion, it is easy to directly grasp the degree of reperfusion injury of ischemic kidney as the transition of renal function.
The above model is a model representative of the pathological condition of renal injury caused by ischemia-reperfusion, and is acute renal failure showing an increase in serum creatinine concentration and urea nitrogen concentration peaking at about 24 hours after reperfusion. Histologically, it is acute tubular necrosis with tubule epithelial shedding, degeneration and inflammatory cell infiltration into the renal interstitium, mainly around the borderline of the renal spinal cord, and is strongest in 24 to 96 hours after reperfusion Appearance and repair of tubular epithelium and renewal findings are observed over several weeks.
In addition, G-CSF was found to reduce tissue damage in a chronic kidney injury model caused by folic acid.
G-CSF proven to be effective in the above model can be used for acute renal failure, chronic renal failure, various types of nephritis, kidney transplantation, etc. in which renal tissue damage due to ischemia or ischemia-reperfusion is involved . For these diseases, G-CSF is administered prophylactically to prevent onset or therapeutically to suppress progression after onset. Here, “preventively” means preventing transition from non-chronic symptoms such as acute symptoms and nephritis to chronic symptoms.
A particularly preferred G-CGF that can be used in the present invention is human G-CGF. Examples of human G-CSF include human G-CSF activity represented by, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, ie, neutrophil increasing activity and ischemia-related Or a polypeptide having a prophylactic or therapeutic activity against renal injury associated with renal ischemia-reperfusion), or a glycoprotein having a sugar chain attached thereto. Furthermore, G-CSF derivatives having G-CSF activity in which a part of the amino acid sequence of the same sequence is modified (substitution, deletion, insertion, and / or addition) are also included in G-CSF in the present invention. Such a G-CSF derivative is preferably a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. The modification can be performed by, for example, a known site-directed mutagenesis method (including a method using polymerase chain reaction (PCR)) (for example, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, USA). Modifications include conservative amino acid substitutions. That is, such a substitution is a substitution between amino acids having electrically or structurally similar properties, such as an amino acid substitution between basic amino acids, acidic amino acids, hydrophobic amino acids, or polar amino acids. is there.
These G-CSFs include those derived from nature and those obtained by gene recombination, but those obtained by gene recombination are preferred. In this case, examples of host cells include Escherichia coli and mammalian cells (C127, CHO, BHK, COS, HEK293 cells, etc.). These detailed production methods are disclosed in, for example, JP-T 63-500466, JP-A 62-236497, JP-A 62-236488, and JP-A 63-267292.
In addition, the polypeptide or glycoprotein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3 above and a G-CSF derivative are further soluble in water such as polyethylene glycol, ethylene glycol / propylene glycol copolymer, carboxymethyl cellulose, dextran, and polyvinyl alcohol. A polymer in which at least one molecule is bonded (for example, WO90 / 06952, WO96 / 11953, JP-A-1-316400) is also included. A particularly preferable water-soluble polymer is polyethylene glycol, for example, polyethylene glycol having a molecular weight of about 2,000 to 100,000, preferably about 6,000 to 25,000. The addition of polyethylene glycol is generally called PEGylation, but reacts with amino groups such as acyl groups and aldehyde groups on the amino terminal amino group of G-CSF and / or the ε-amino group of lysine residues. It can be performed by bonding via a sex group. Examples of commercially available products include PEGylated G-CSF sold by Amgen as Neulasta (registered trademark).
Furthermore, by modifying the sugar chain binding site of G-CSF, the G-CSF sugar chain variant in which the structure of the sugar chain is changed or the sugar chain is added or deleted, or albumin, vitamin B12 Or a protein fused with an immunoglobulin or the like. The modified G-CSF sugar chain may, for example, newly add an Asn-X-Thr / Ser sequence (where X is an amino acid other than Pro) to the amino acid sequence of G-CSF, It can be obtained by deleting the Asn-X-Thr / Ser sequence from the amino acid sequence. Such addition and deletion can be easily performed by using, for example, a site-directed mutagenesis method (Ausubel et al., Supra) using PCR. The fusion protein is synthesized under the control of a promoter by synthesizing a DNA that fuses a DNA encoding G-CSF and a DNA encoding a protein to be fused with a general gene recombination technique. The fusion DNA can be obtained by a technique including inserting the fusion DNA into an appropriate vector, introducing the vector into an appropriate host cell, and expressing the fusion DNA.
The preventive or therapeutic agent for ischemia-related nephropathy and nephropathy associated with renal ischemia-reperfusion according to the present invention is a pharmaceutical composition comprising alone or a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, stabilizer and the like. Can be administered to patients.
That is, the present invention also provides a method for preventing or treating the above-mentioned renal injury, which comprises administering the above pharmaceutical composition to a patient having ischemia-related renal injury and renal injury associated with renal ischemia-reperfusion. I will provide a.
Such a pharmaceutical composition can take the form of sustained-release preparations such as injection preparations, oral preparations, transmucosal preparations, etc., and any form commonly used in the art can be used. Injectable preparations are particularly preferred. The administration route in the injection preparation includes subcutaneous administration, intravenous administration, intramuscular administration, intrarenal artery administration, or administration using a sustained-release gel, and subcutaneous administration and intravenous administration are particularly preferable.
In the therapeutic agent for ischemia-related nephropathy and nephropathy associated with renal ischemia-reperfusion according to the present invention, the dose and frequency of administration of G-CSF can be determined according to the patient's condition and are not particularly limited. However, it is usually 0.1 to 200 μg / kg / day, preferably 1 to 100 μg / kg / day, and can be administered for 1 to 7 days / week.
The prophylactic or therapeutic agent for ischemia-related renal injury and renal injury associated with renal ischemia-reperfusion according to the present invention is also a replacement solution such as physiological saline, mannitol, Ringer's solution, angiotensin converting enzyme inhibitor, angiotensin II receptor antagonist. Drugs, antihypertensive drugs, diuretics, antiplatelet drugs, thrombolytic agents, antidiabetic drugs, antihyperlipidemic drugs, antiinflammatory drugs, steroids, immunosuppressive drugs, etc. It can be used in combination with one or more drugs used for renal disease as a disease, and can be administered simultaneously or separately, or as a pharmaceutical composition containing these in combination. These drugs, which are not effective for renal diseases alone, can be effectively acted by administering them to a state in which the renal function is protected by G-CSF.
The therapeutic effect on kidney disease can be confirmed, for example, by reducing serum creatinine concentration or blood urea nitrogen concentration increase, decreasing urinary protein amount or urinary albumin amount, improving histological tubular damage score, etc. (See JD Conger et al., Kidney International, 1994, 46, p. 318; SP Kelleher et al., Kidney International, 1987, 31, p. 725).
The therapeutic agent for renal injury associated with renal ischemia-reperfusion according to the present invention can also be performed as an adjuvant therapy before treatment such as kidney transplantation.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to these.

〔実施例１〕
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、１８０〜２００ｇ（埼玉実験動物社製、埼玉、日本）において、麻酔下（塩酸ケタミン）、左腎動脈をクリップで挟み４５分間の腎虚血を起こした。クリップを外す直前に右腎を摘出したのち、クリップを外し、左腎を再灌流した。
再灌流直後にヒトＧ−ＣＳＦ（キリンビール社製（東京、日本）のＦｉｌｇｒａｓｔｉｍ^ＴＭ、配列番号１のアミノ酸配列で示されるペプチド）１００μｇ／ｋｇを皮下に投与し、その後２４時間ごとにＧ−ＣＳＦの同用量を２回皮下に投与した。Ｇ−ＣＳＦ最終投与２４時間後、すなわち、虚血−再灌流後７２時間に採血および腎臓を摘出し、血清クレアチニン濃度と血中尿素窒素濃度を測定した（表１および表２参照）。また、摘出した腎臓の組織標本を作製し、顕微鏡下で尿細管障害を、ＪＤＣｏｎｇｅｒら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９４年、第４６巻、ｐ．３１８及びＳＰＫｅｌｌｅｈｅｒら、ＫｉｄｎｅｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９８７年、第３１巻、ｐ．７２５に記載された方法に準じて評価し、スコア化した（表３参照）。具体的には、各組織ともに対物２００倍で異なる２０視野について尿細管障害スコアの各項目を０，０．５，１．０，１．５，２．０の五段階に評価し、その合計を比較した。障害が高度なほど高値となる。

その結果、コントロール群（生理食塩水投与）では腎虚血−再灌流により血清クレアチニン濃度と血中尿素窒素濃度が増加し、腎機能の低下を示したが、Ｇ−ＣＳＦ投与によりそれらの増加は抑えられ、Ｇ−ＣＳＦによる腎機能の改善が認められた。さらに、腎虚血−再灌流７２時間後の尿細管の障害もＧ−ＣＳＦにより改善されていることが示された。
〔実施例２〕
既に葉酸による腎不全のモデルはＷｉｓｔａｒ系ラットやＩＣＲ（ＣＤ１）系マウスで確立されている（ＤＡＶＩＤＡ．ＬＯＮＧら，ＪＡｍＳｏｃＮｅｐｈｒｏｌ１２：２７２１−２７３１，２００１、Ｈａｉ−ＴａｏＹｕａｎら，ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６３，Ｎｏ．６，２２８９−２３０１，２００３）。葉酸２５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与から１４日後には、慢性腎障害の特徴の一つである腎間質の線維化を呈するとともに、慢性腎障害のｆｉｎａｌｃｏｍｍｏｎｐａｔｈｗａｙである慢性虚血を来すことが示されている（Ｈａｉ−ＴａｏＹｕａｎら，上記）。
そこで、慢性腎障害に対するＧ−ＣＳＦの効果を評価するためにこのモデルを作製して以下の検討を行った。
ＩＣＲ系マウス（埼玉実験動物（株）（埼玉、日本）より購入、６週齢、２０〜２５ｇ）に０．３ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム溶液で溶解した葉酸２５０ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内投与し、葉酸投与後７日目よりｒｈＧ−ＣＳＦ５０μｇ／ｋｇを隔日皮下投与し（計４回）、１４日目にと殺して組織学的評価を行ったところ、腎間質の線維化は対照である生理食塩水投与群（Ｎ＝５）に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群（Ｎ＝６）で有意に軽減していた（図１参照）。
また、経時的に血中尿素窒素を測定し、１４日目にはやはりｒｈＧ−ＣＳＦ群で有意に改善していた（表４参照）。更に、間質線維化の評価については線維化領域が青染されるＭａｓｓｏｎ／Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色標本に対して専用画像解析ソフト、ＡＩＳ（イメージングリサーチ社製）により解析した（１標本各１０視野ずつ検討）。具体的には２０×対物レンズで取り込んだ画像全体に対する線維化部分の割合を示すものである（表５参照）。さらに追加実験として、上記と同様の葉酸投与モデルに対して、７日目よりｒｈＧ−ＣＳＦ５０μｇ／ｋｇを隔日皮下投与し（計１１回）２８日目にと殺して組織学的評価を行ったところ、腎間質の線維化は対照である生理食塩水投与群（Ｎ＝２）に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群（Ｎ＝２）で有意に軽減していた。上記と同様に間質線維化の評価を行なった結果を表６に示す。また、尿細管・間質の虚血、低酸素について、１０ｍｍＨｇ以下の組織酸素分圧低下を検出するＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）による免疫染色を行い、ＡＩＳにて解析したところ、生理食塩水投与群（Ｎ＝２）に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群（Ｎ＝２）で有意に軽減していた（表７参照）。また、尿細管周囲毛細血管網の評価についてはＣＤ３１による免疫染色を行いＡＩＳにより解析したところ、生理食塩水投与群に比較してｒｈＧ−ＣＳＦ群で有意に保たれていた（表８参照）。以上から、慢性腎障害に対してもＧ−ＣＳＦの有効性が示された。

[Example 1]
In Sprague-Dawley rats, 180-200 g (Saitama Laboratory Animal Co., Ltd., Saitama, Japan), under the anesthesia (ketamine hydrochloride), the left renal artery was sandwiched with clips to cause renal ischemia for 45 minutes. The right kidney was removed just before removing the clip, and then the clip was removed and the left kidney was reperfused.
Immediately after reperfusion, 100 μg / kg of human G-CSF (Filgrasim ^™ manufactured by Kirin Brewery (Tokyo, Japan), peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) was administered subcutaneously, and then G-CSF every 24 hours. Was administered subcutaneously twice. 24 hours after the last administration of G-CSF, that is, 72 hours after ischemia-reperfusion, blood samples and kidneys were removed, and serum creatinine concentration and blood urea nitrogen concentration were measured (see Tables 1 and 2). In addition, an excised kidney tissue specimen was prepared, and tubule injury was observed under a microscope. JD Conger et al., Kidney International, 1994, Vol. 46, p. 318 and SP Kelleher et al., Kidney International, 1987, vol. 31, p. It was evaluated and scored according to the method described in 725 (see Table 3). Specifically, for each tissue, the 20 items of the visual field different from each other with 200 times the objective are evaluated for each item of the tubule injury score in five levels of 0, 0.5, 1.0, 1.5, and 2.0. Compared. The higher the obstacle, the higher the price.

As a result, in the control group (administered with physiological saline), serum creatinine concentration and blood urea nitrogen concentration increased due to renal ischemia-reperfusion, and decreased renal function, but G-CSF administration suppressed these increases. The improvement of renal function by G-CSF was recognized. Furthermore, it was shown that renal tubular ischemia-reperfusion 72 hours later was also improved by G-CSF.
[Example 2]
A model of renal failure due to folic acid has already been established in Wistar rats and ICR (CD1) mice (DAVID A. LONG et al., J Am Soc Nephrol 12: 2721-2731, 2001, Hai-Tao Yuan et al., American Journal. of Pathology, Vol. 163, No. 6, 2289-2301, 2003). 14 days after the intraperitoneal administration of folic acid 250 mg / kg, the renal interstitial fibrosis, which is one of the features of chronic kidney injury, is exhibited, and chronic ischemia, which is a final common pathway of chronic kidney injury, may occur. (Hai-Tao Yuan et al., Supra).
Therefore, in order to evaluate the effect of G-CSF on chronic kidney injury, this model was prepared and the following examination was performed.
A single intraperitoneal administration of 250 mg / kg of folic acid dissolved in a 0.3 mol / L sodium bicarbonate solution to an ICR mouse (purchased from Saitama Experimental Animal Co., Ltd. (Saitama, Japan), 6 weeks old, 20-25 g) From the 7th day after the administration of folic acid, rhG-CSF 50 μg / kg was subcutaneously administered every other day (4 times in total), and the histological evaluation was performed on the 14th day. The fibrosis of the renal stroma was the control. It was significantly reduced in the rhG-CSF group (N = 6) compared to the physiological saline administration group (N = 5) (see FIG. 1).
In addition, blood urea nitrogen was measured over time, and on day 14, it was still significantly improved in the rhG-CSF group (see Table 4). Furthermore, the evaluation of interstitial fibrosis was performed on Masson / Trichrome-stained specimens in which the fibrosis area was blue-stained by using dedicated image analysis software, AIS (manufactured by Imaging Research) (examine 10 visual fields for each specimen). . Specifically, the ratio of the fibrosis portion to the entire image captured by the 20 × objective lens is shown (see Table 5). Furthermore, as an additional experiment, rhG-CSF 50 μg / kg was subcutaneously administered every other day from day 7 (11 times in total) to the folic acid administration model similar to the above, and histological evaluation was performed by killing on day 28. The fibrosis of the renal interstitium was significantly reduced in the rhG-CSF group (N = 2) compared to the physiological saline administration group (N = 2) as a control. The results of evaluation of interstitial fibrosis as described above are shown in Table 6. In addition, immunostaining with Hypoprobe-1 (Chemicon) that detects a decrease in tissue oxygen partial pressure of 10 mmHg or less was analyzed for ischemia and hypoxia of tubules / stroma, and analyzed by AIS. Compared with (N = 2), it was significantly reduced in the rhG-CSF group (N = 2) (see Table 7). As for evaluation of the capillary network around the tubules, immunostaining with CD31 and analysis by AIS were significantly maintained in the rhG-CSF group compared to the physiological saline administration group (see Table 8). From the above, the effectiveness of G-CSF was also shown for chronic kidney injury.

現在、虚血あるいは虚血−再灌流による腎組織障害に対しての保護を主な薬理作用として持つ腎疾患治療薬はない。また、慢性腎不全の進行を緩やかにする薬剤は現存するが、進行を止めるまでには至らず、さらに強力な腎不全進行抑制薬が待ち望まれている。したがって、本発明により単独あるいは現存の他薬剤との併用により急性腎不全の防止あるいは、慢性腎不全の進行抑制の向上が達成できる薬剤を提供できる。さらに、本薬剤を腎移植時の生着率の向上、移植機会の増加のために使用することも可能となる。 At present, there is no therapeutic agent for renal diseases having the main pharmacological action to protect against renal tissue damage caused by ischemia or ischemia-reperfusion. In addition, there are drugs that slow down the progression of chronic renal failure, but the progress has not been stopped, and a more potent renal failure progression inhibitor is awaited. Therefore, the present invention can provide a drug that can achieve prevention of acute renal failure or improvement of progression of chronic renal failure, alone or in combination with other existing drugs. Furthermore, this drug can be used to improve the engraftment rate at the time of kidney transplantation and increase transplantation opportunities.

配列番号１：天然型ヒトＧ−ＣＳＦに関して−１位にＭｅｔ残基を含むアミノ酸配列。
配列番号３：天然型ヒトＧ−ＣＳＦに関して−１位にＭｅｔ残基を含み、かつ、天然型ヒトＧ−ＣＳＦ中の＋１位のＴｈｒ残基、＋３位のＬｅｕ残基、＋４位のＧｌｙ残基、＋５位のＰｒｏ残基及び＋１７位のＣｙｓ残基がそれぞれＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ及びＳｅｒに置換されているアミノ酸配列。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。SEQ ID NO: 1: amino acid sequence comprising a Met residue at position −1 with respect to native human G-CSF.
SEQ ID NO: 3: Met residue at position −1 with respect to native human G-CSF, and Thr residue at position +1, Leu residue at position +3, Gly residue at position +4 in natural human G-CSF The amino acid sequence in which the Pro residue at position +5 and the Cys residue at position +17 are substituted with Ala, Thr, Tyr, Arg and Ser, respectively.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Claims

A prophylactic or therapeutic agent for ischemia-related renal injury or renal injury associated with renal ischemia-reperfusion, comprising granulocyte colony-stimulating factor as an active ingredient.

The preventive or therapeutic agent according to claim 1, wherein the renal disorder is chronic renal disorder.

The preventive or therapeutic agent according to claim 2, wherein the chronic renal disorder is renal interstitial fibrosis or chronic ischemia.

A polypeptide having a granulocyte colony-stimulating factor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence and imparting the same activity as G-CSF. The preventive or therapeutic agent according to claim 1, wherein

The prophylactic or therapeutic agent according to claim 1 or 4, wherein the granulocyte colony-stimulating factor is a PEGylated derivative.

The prophylactic or therapeutic agent according to any one of claims 1 to 5 is administered to a patient having ischemia-related renal injury or renal injury associated with renal ischemia-reperfusion, or the renal injury is prevented or How to treat.