JPWO2005094889A1 - Joint inflammation treatment or prevention agent - Google Patents

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Abstract

本発明は、変形性関節症などの関節炎症に対する新しい治療剤または予防剤を提供する。具体的には、本発明は、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、変形性関節炎症などの関節炎症の治療剤、予防剤または関節軟骨細胞増殖促進剤、あるいは、ＧＣ−Ｂを活性化することによる関節炎症の抑制方法又は関節軟骨細胞の増殖促進方法、あるいは、ＧＣ−Ｂの活性を指標とした関節軟骨細胞増殖促進剤又は関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。The present invention provides a novel therapeutic or preventive agent for joint inflammation such as osteoarthritis. Specifically, the present invention includes a therapeutic agent, preventive agent, or articular chondrocyte proliferation for joint inflammation such as degenerative joint inflammation, characterized by comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient. Promoter, method for suppressing joint inflammation by activating GC-B or method for promoting proliferation of articular chondrocytes, or agent for promoting articular chondrocyte proliferation or therapeutic agent for joint inflammation using GC-B activity as an index A screening method is provided.

Description

本発明は、グアニルシクラーゼＢ（以下「ＧＣ−Ｂ」とも称する）活性化物質による関節炎症、特に変形性関節症及びその類似関節炎症、の治療剤、予防剤又は関節軟骨増殖促進剤、あるいは該関節炎症の抑制方法、関節軟骨細胞の増殖促進方法に関する。本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標とする、関節炎症治療剤又は関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法に関する。  The present invention relates to a therapeutic agent, prophylactic agent or articular cartilage growth promoter for joint inflammation, particularly osteoarthritis and similar joint inflammation caused by a guanylcyclase B (hereinafter also referred to as “GC-B”) activator, The present invention relates to a method for suppressing joint inflammation and a method for promoting proliferation of articular chondrocytes. The present invention further relates to a method for screening a therapeutic agent for joint inflammation or an agent for promoting proliferation of articular chondrocytes using the activity of GC-B as an index.

関節炎症は、関節の炎症性疾患であり、症例数の最も多い疾患が慢性関節リウマチ及び変形性関節症（骨関節症）である。
慢性関節リウマチは、自己免疫疾患と考えられており、関節の疼痛、こわばり、腫脹の症状を伴うが、病状が進行すると、しばしば変形性関節症様の関節軟骨表面の変性に導き、ついには関節の骨や軟骨の重度の破壊が起こる。
変形性関節症は高齢者において多発する関節軟骨の変性疾患である。変形性関節症（ＯＡ）とは、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨、軟骨の増殖性変化を来たす疾患であり、さらに上記変化により二次的（続発性）に関節炎（滑膜炎）を来たすものである。変形性関節症は荷重関節である膝関節、肘関節および股関節にて多く認められるが（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ １９９６；２６０：５２１−６６３）、肩関節・肘関節・手関節のような非荷重関節においても発生が認められる。さらに顎関節においても同様の病態を示す顎関節症が知られている（Ｊ Ｏｒｏｆａｃ Ｐａｉｎ １９９９；１３（４）：２９５−３０６）。
変形性関節症においては、軟骨はその機能本体である軟骨基質蛋白が減じるとともに、軟骨細胞数が減少していることが知られている（Ａｒｔｈ Ｒｈｅｕｍ ２００２；４６（８）：１９８６−１９９６）。しかし、軟骨には血管が分布していないこと、軟骨細胞の数が少なく高度に分化していること、軟骨前駆細胞が乏しいこと、軟骨基質の代謝回転が遅いことなどの理由から、軟骨の自己再生能力は低く変形性関節症における関節軟骨基質と軟骨細胞数の減少が自然治癒する可能性は非常に低い（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２００３；２４９：２−１６）。また、変形性関節症においては、軟骨変性とともに関節炎症も同時に生じ、関節疼痛の原因となっている（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００１；２８（６）：１３３０−１３３７）。
慢性関節リウマチ、変形性関節症などの関節炎の治療剤・予防剤としては、例えばプロテインチロシンキナーゼインヒビター（特表平１１−５１２７０８号公報）、Ｎ−アシル化−２−グルコスアミン誘導体（特表２００４−５０７４９０公報）、キノリン・キナゾリン系誘導体（特開平９−１６９６４６号公報）、などが報告されている。また、現在広く用いられている標準的な変形性関節症の治療剤は、経口で投薬される消炎鎮痛剤や、関節内に注射されるヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどで、いずれも関節疼痛の抑制剤であり、関節軟骨変性に対する抑制作用を有する薬剤が求められている（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ Ｂａｓｅ ７，２００２）。
グアニルシクラーゼ（ＧＣ）は、ＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒する酵素ファミリーに属する膜蛋白質であり、ＧＣ−Ａ，ＧＣ−Ｂ，…，ＧＣ−Ｆが知られている。ＧＣ−Ｂは主に血管内皮細胞に見出され、平滑筋の弛緩に関与すると考えられている。ＧＣを活性化する物質としてナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）が知られている。ＮＰ類は、ＡＮＰ（心房性ナトリウムペプチド）、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）およびＣＮＰ（Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド）の３種類からなり、２種類のグアニルシクラーゼ共役受容体（ＡＮＰおよびＢＮＰに対するＮＰＲ−Ａ、ＣＮＰに対するＮＰＲ−Ｂ）を介して、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させることにより、生物学的活性を示すと考えられている（Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１；６０：２２９−２５５）。
グアニルシクラーゼ共役受容体でないＮＰＲ−Ｃは、シグナル伝達に関与しないＮＰ類のクリアランス受容体として理解されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；２３８：６７５−６７８）。しかし、マウス骨髄マクロファージをリポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激したときのシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）誘導によるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を亢進させる系において、ＡＮＰおよびＣＮＰがＮＰＲ−Ｃを介した細胞内ｃＡＭＰ量低下作用にもとづいてＡＮＰおよびＣＮＰがＰＧＥ２産生抑制作用を示すことが報告されており、ＮＰＲ−ＣのＮＰ類のシグナル伝達への関与が示唆されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２；１４３（３）：８４６−８５２）。この文献では、マウス骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）のＬＰＳ刺激によるＰＧＥ２産生亢進に対して、ＡＮＰが最大約７０％の抑制効果を示すのに対して、ＣＮＰは最大約２０％の抑制効果であり、ＣＮＰの同作用が弱いことが記載されている。ｃＡＭＰやｃＧＭＰなどのｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを介したＣＯＸ−２の産生の制御は、細胞の種類や刺激の種類により促進／抑制と正反対の反応を取ることが知られているため、ＣＮＰによるＢＭＭ細胞でのＬＰＳ誘導のＰＧＥ２産生抑制がその他の細胞や刺激に対して適用できるかは不明である。また、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００２；１４３（３）：８４６−８５２には、ＡＮＰはマウスにＬＰＳを投与して血中トロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）濃度が上昇する系において抑制効果を示すことが報告されており、同じ機序のｃＡＮＦでは逆に亢進させるという相反する結果が得られている。またこの文献ではＡＮＰを関節炎や敗血症などの免疫関連疾患に適応することが記載されているものの、ＣＮＰの関節疾患への適応について何ら言及していない。従ってＣＮＰの関節炎症に対する作用については、現在まで全く知られていない。
ＮＰ類は、体液の恒常性の制御や血圧の調節に重要な役割を果たすと報告されているが（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８７；９３：１９１１−１９２１、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９４；８７：１４０２−１４１２）、心臓血管系以外の様々な組織での発現とその生理活性も知られている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９１；１２９：１１０４−１１０６、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９１；６０：５５３−５７５）。軟骨に関しては、ＢＮＰ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：２３３７−２３４２）またはＣＮＰの過剰発現トランスジェニックマウスにおける成長軟骨の伸長と軟骨無形成症の治療へのＣＮＰの使用が報告されている（Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００４；１０（１）：８０−８６、特開２００３−１１３１１６公報）。しかし、成長軟骨は石灰化を経て骨に置換されて最終的に消失する一時性軟骨であり、関節軟骨や気管軟骨のように、生涯にわたり存在する永久軟骨とは異なる生物学的性質を有することが知られている（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９８９；１３６（２）：５００−５０７、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；１５３（１）：８７−１００）。さらに、永久軟骨である関節軟骨細胞に対するＣＮＰの肥大化促進作用がｉｎ ｖｉｔｒｏで報告されているが（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８（２１）：１８８２４−１８８３２）、正常動物の関節軟骨に対するｉｎ ｖｉｖｏでの作用や変形性関節症における関節軟骨の変性破壊に対する作用や同疾患における関節炎症に対する作用については現在まで知られていない。
変形性関節症においては、関節軟骨は病態のごく初期にいったん肥大化して軟骨組織容量が増加するものの（Ｊ Ｒｈｅｕｍ １９９１；１８（３）：１９０５−１９１５）、病態の進展とともに軟骨基質の変性・破壊が進行して容量は減少する（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００４；５０（２）：４７６−４８７）。このとき、関節軟骨細胞の数はアポトーシスにより減少している（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ２００４；５０（２）：５０７−５１５）。一方、残存している個々の関節軟骨細胞はＸ型コラーゲンを発現して肥大軟骨細胞に分化し、一時性軟骨の性質をもつことが知られている（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ １９９２；３５（７）：８０６−８１１）。また、関節軟骨の破壊に伴い関節炎症も生じており、臨床的に罹患関節における疼痛の要因であると考えられている（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００１；２８（６）：１３３０−１３３７）。変形性関節症におけるこれらの変化の抑制、すなわち関節軟骨基質および関節軟骨細胞数の減少抑制又は復元、および関節炎抑制は、治療薬開発において有用であると考えられる。
本発明の目的は、変形性関節症を含む関節炎症に対する新しい治療剤又は予防剤、あるいは該関節炎症の治療方法、を提供することである。
本発明の別の目的は、関節軟骨細胞の増殖を促進する薬剤又は方法を提供することである。
本発明の別の目的は、変形性関節症を含む関節炎症を抑制する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供することである。
本発明の別の目的は、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供することである。
発明の概要
本発明者らは、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質の一種であるＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）を過剰発現するＣＮＰ トランスジェニックマウスを作製し、関節軟骨への影響を検証した結果、ＣＮＰ トランスジェニックマウスでは、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加していること、さらにＣＮＰ トランスジェニックマウスを用いて作製した変形性関節症モデルでは関節腫脹に抵抗性であることおよび関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、関節軟骨中のプロテオグリカン含量は低下しなかったこと、これに対し、正常マウスを用いた変形性関節症モデルでは、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が顕著であったことを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ＧＣ−Ｂ活性化物質が関節炎抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。
したがって、本発明は、以下の発明からなる。
本発明は、第１の態様において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性膝関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が変形性股関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記変形性関節症が顎関節症である。
本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が関節リウマチに起因するものである。
本発明の別の実施態様において、上記関節炎症が変形性関節症に起因するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施形態において、上記関節炎症の治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第２の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施形態において、上記関節軟骨細胞増殖促進剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第３の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂは、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。
本発明はさらに、第４の態様において、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂは、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される。
本発明はさらに、第５の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明の別の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法は、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、第６の態様において、ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明の一の実施態様において、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明の別の実施態様において、前記ＧＣ−Ｂの活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される。
本発明の別の実施態様において、上記方法は、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明はさらに、第７の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記変形性関節症の治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第８の態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記関節リウマチの治療剤又は予防剤が、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含むものである。
本発明はさらに、第９の態様において、非ステロイド性活性化剤を含む、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。
本発明の実施態様において、上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される。
本発明の別の実施態様において、上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明の別の実施態様において、上記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である。
本発明の別の実施態様において、上記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される。
本発明はさらに、第１０の態様において、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法を提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−１０７９２４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。Joint inflammation is an inflammatory disease of the joint, and the most common diseases are rheumatoid arthritis and osteoarthritis (osteoarthritis).
Rheumatoid arthritis is considered an autoimmune disease and is accompanied by symptoms of joint pain, stiffness, and swelling, but as the disease progresses, it often leads to osteoarthritis-like degeneration of the articular cartilage surface, and eventually joints Severe destruction of bone and cartilage occurs.
Osteoarthritis is a degenerative disease of articular cartilage that occurs frequently in the elderly. Osteoarthritis (OA) is a disease in which cartilage destruction and bone and cartilage proliferative changes occur due to degenerative degeneration of joint components, and secondary (secondary) arthritis due to the above changes. Synovitis). Osteoarthritis is frequently observed in the load joints such as the knee joint, elbow joint and hip joint (Virchows Arch 1996; 260: 521-663), but also in non-load joints such as shoulder joints, elbow joints and wrist joints. Occurrence is observed. Furthermore, temporomandibular disorders showing similar pathological conditions are also known in the temporomandibular joint (J Orofac Pain 1999; 13 (4): 295-306).
In osteoarthritis, it is known that cartilage has a reduced number of cartilage matrix proteins, and the number of chondrocytes is reduced (Arth Rheum 2002; 46 (8): 1986-1996). However, cartilage self-relevance is due to the fact that blood vessels are not distributed in cartilage, the number of chondrocytes is small and highly differentiated, cartilage progenitor cells are scarce, and the turnover of cartilage matrix is slow. The regenerative capacity is low, and it is very unlikely that a reduction in the number of articular cartilage matrix and chondrocytes in osteoarthritis will spontaneously heal (Novartis Found. Symp. 2003; 249: 2-16). In osteoarthritis, joint inflammation occurs simultaneously with cartilage degeneration, causing joint pain (J Rheumatol 2001; 28 (6): 1330-1337).
Examples of therapeutic / preventive agents for arthritis such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis include protein tyrosine kinase inhibitors (Japanese Patent Publication No. 11-512708), N-acylated-2-glucosamine derivatives (Japanese Patent Publication No. 2004). 507490), quinoline / quinazoline derivatives (Japanese Patent Laid-Open No. 9-169646), and the like have been reported. Standard treatments for osteoarthritis that are widely used at present include anti-inflammatory analgesics administered orally, hyaluronic acid and corticosteroids injected into joints, all of which are associated with joint pain. A drug that is an inhibitor and has an inhibitory effect on articular cartilage degeneration is required (Decision Base 7, 2002).
Guanyl cyclase (GC) is a membrane protein belonging to the enzyme family that catalyzes the synthesis of cGMP, a second messenger, from GTP, and GC-A, GC-B,..., GC-F are known. GC-B is mainly found in vascular endothelial cells and is thought to be involved in smooth muscle relaxation. Natriuretic peptide (NP) is known as a substance that activates GC. NPs consist of three types, ANP (atrial sodium peptide), BNP (brain natriuretic peptide), and CNP (C-type natriuretic peptide). Two types of guanyl cyclase-coupled receptors (NPR-A for ANP and BNP) , NPR-B against CNP), and is believed to exhibit biological activity by increasing intracellular cGMP concentration (Ann Rev Biochem 1991; 60: 229-255).
NPR-C, which is not a guanyl cyclase-coupled receptor, is understood as a clearance receptor for NPs that are not involved in signal transduction (Science, 1987; 238: 675-678). However, in the system that enhances prostaglandin E 2 (PGE 2 ) production induced by cyclooxygenase 2 (COX-2) when mouse bone marrow macrophages are stimulated with lipopolysaccharide (LPS), ANP and CNP mediated NPR-C. It has been reported that ANP and CNP show a PGE 2 production inhibitory action based on the effect of reducing intracellular cAMP amount, and it is suggested that NPR-C is involved in signal transmission of NPs (Endocrinology 2002; 143). (3): 848-852). In this document, CNP has an inhibitory effect of up to about 20%, whereas ANP shows an inhibitory effect of up to about 70% against the enhancement of PGE 2 production by LPS stimulation of mouse bone marrow macrophages (BMM). It is described that the same action of CNP is weak. It is known that the control of COX-2 production via cyclic nucleotides such as cAMP and cGMP takes the opposite reaction to the promotion / suppression depending on the type of cell and the type of stimulation. Whether LPS-induced suppression of PGE 2 production can be applied to other cells and stimuli is unknown. Endocrinology 2002; 143 (3): 846-852 reports that ANP has an inhibitory effect in a system in which LPS is administered to mice and the blood thromboxane B 2 (TXB 2 ) concentration increases. In contrast, cANF with the same mechanism has a contradictory result that it is enhanced. Although this document describes that ANP is applied to immune-related diseases such as arthritis and sepsis, it does not mention any indication of CNP to joint diseases. Therefore, the effect of CNP on joint inflammation is not known at all.
NPs have been reported to play an important role in controlling body fluid homeostasis and blood pressure (J Clin Invest 1987; 93: 1911-1921, J Clin Invest 1994; 87: 1402-1412), Expression in various tissues other than the cardiovascular system and its physiological activity are also known (Endocrinol 1991; 129: 1104-1106, Ann Rev Biochem 1991; 60: 553-575). With respect to cartilage, BNP (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 2337-2342) or CNP overexpressing transgenic mice in the treatment of growth cartilage elongation and achondroplasia The use of CNP has been reported (Nat Med 2004; 10 (1): 80-86, JP 2003-113116 A). However, growing cartilage is a temporary cartilage that eventually disappears after being replaced by bone through calcification, and has biological properties that are different from permanent cartilage that exists throughout life, such as articular cartilage and tracheal cartilage. Are known (Dev Biol 1989; 136 (2): 500-507, J Cell Biol 2001; 153 (1): 87-100). Furthermore, although CNP hypertrophy promoting action on articular chondrocytes, which are permanent cartilage, has been reported in vitro (J Biol Chem 2003; 278 (21): 18824-18832), in vivo on articular cartilage in normal animals. To date, there are no known effects on the joint cartilage degenerative destruction in osteoarthritis or joint inflammation in the disease.
In osteoarthritis, articular cartilage is enlarged in the very early stages of the disease and the cartilage tissue volume is increased (J Rheum 1991; 18 (3): 1905-1915). As the destruction progresses, the capacity decreases (Arthritis Rheum 2004; 50 (2): 476-487). At this time, the number of articular chondrocytes is decreased by apoptosis (Arthritis Rheum 2004; 50 (2): 507-515). On the other hand, the remaining individual articular chondrocytes are known to express type X collagen, differentiate into hypertrophic chondrocytes, and have the properties of temporary cartilage (Arthritis Rheum 1992; 35 (7): 806). -811). In addition, joint inflammation has occurred with the destruction of articular cartilage, and it is clinically considered to be a cause of pain in affected joints (J Rheumatol. 2001; 28 (6): 1330-1337). Suppression of these changes in osteoarthritis, ie, reduction or restoration of articular cartilage matrix and articular chondrocyte numbers, and arthritis suppression are considered useful in therapeutic drug development.
An object of the present invention is to provide a new therapeutic agent or preventive agent for joint inflammation including osteoarthritis, or a method for treating the joint inflammation.
Another object of the present invention is to provide an agent or method that promotes the proliferation of articular chondrocytes.
Another object of the present invention is to provide a method for suppressing joint inflammation including osteoarthritis.
Another object of the present invention is to provide a screening method for a therapeutic agent for joint inflammation.
Another object of the present invention is to provide a screening method for an articular chondrocyte proliferation promoter.
SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have produced a CNP transgenic mouse that overexpresses C-type natriuretic peptide (CNP), which is a kind of guanyl cyclase B (GC-B) activator, and has demonstrated its effect on articular cartilage. As a result of the verification, the thickness of articular cartilage and the number of articular chondrocytes were significantly increased in CNP transgenic mice, and the osteoarthritis model prepared using CNP transgenic mice was resistant to joint swelling. Inhibition of articular cartilage degeneration, synovial cell increase, granulation tissue formation, changes in inflammatory cell infiltration were extremely weak, proteoglycan content in articular cartilage was not reduced, In the osteoarthritis model using normal mice, synovial cell hypertrophy, granulation tissue formation, and changes in inflammatory cell infiltration are prominent. I found out. From these findings, the present inventors have found that the GC-B activator has both an arthritis inhibitory action and an anabolic action on articular cartilage.
Therefore, this invention consists of the following invention.
In the first aspect, the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for joint inflammation, characterized by containing a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient.
In one embodiment of the invention, the joint inflammation is osteoarthritis.
In another embodiment of the present invention, the osteoarthritis is a load joint osteoarthritis or a non-load joint osteoarthritis.
In another embodiment of the present invention, the osteoarthritis is knee osteoarthritis.
In another embodiment of the invention, the osteoarthritis is hip osteoarthritis.
In another embodiment of the invention, the osteoarthritis is temporomandibular arthrosis.
In another embodiment of the invention, the joint inflammation is due to rheumatoid arthritis.
In another embodiment of the invention, the joint inflammation is due to osteoarthritis.
In another embodiment of the present invention, the GC-B activator is C-type natriuretic peptide (CNP) or a derivative thereof.
In another embodiment of the present invention, the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
In another embodiment of the invention, the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
In another embodiment of the present invention, the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity.
In another embodiment of the present invention, the agent for treating or preventing joint inflammation further comprises at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
The present invention further provides, in the second aspect, an articular chondrocyte proliferation promoter comprising a GC-B activator as an active ingredient.
In one embodiment of the present invention, the GC-B activator is CNP or a derivative thereof.
In another embodiment of the present invention, the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
In another embodiment of the invention, the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
In another embodiment of the present invention, the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity.
In another embodiment of the present invention, the articular chondrocyte proliferation promoter further comprises at least one non-steroidal anti-inflammatory drug.
The present invention further provides, in the third aspect, a method for suppressing joint inflammation, which comprises suppressing joint inflammation by activating GC-B.
In one embodiment of the invention, the GC-B is activated by CNP or a derivative thereof.
In another embodiment of the present invention, the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
In another embodiment of the invention, the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
In another embodiment of the present invention, the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity.
In another embodiment of the invention, the GC-B is activated by a combination of CNP or a derivative thereof and at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
The present invention further provides, in the fourth aspect, a method for promoting the proliferation of articular chondrocytes, characterized by promoting the proliferation of articular chondrocytes by activating GC-B.
In one embodiment of the invention, the GC-B is activated by CNP or a derivative thereof.
In another embodiment of the present invention, the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
In another embodiment of the invention, the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
In another embodiment of the present invention, the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity.
In another embodiment of the invention, the GC-B is activated by a combination of CNP or a derivative thereof and at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
The present invention further provides, in the fifth aspect, a method for screening an agent for promoting articular chondrocyte proliferation, which comprises screening a candidate agent for promoting articular chondrocyte proliferation using the activity of GC-B as an index.
In one embodiment of the present invention, a cultured cell or a cell derived from articular chondrocytes expressing GC-B is prepared, the cell is cultured in the presence of a candidate drug, and the GC-B activity of the cell is used as an index. Screening candidate drugs for promoting proliferation of articular chondrocytes.
In another embodiment of the present invention, the activity of GC-B is measured as the amount of intracellular cGMP produced.
In another embodiment of the present invention, the method comprises preparing a cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed, culturing the cell line in the presence or absence of a candidate drug, and The method includes measuring the production amount of internal cGMP and screening the candidate agent for promoting proliferation of articular chondrocytes using as an index the difference in intracellular cGMP production amount in the presence and absence of the candidate drug.
In the sixth aspect, the present invention further includes screening a candidate drug for a therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using the activity of GC-B as an index, or osteoarthritis, rheumatoid arthritis or A screening method for a therapeutic agent for joint inflammation is provided.
In one embodiment of the present invention, a cultured cell or a cell derived from articular chondrocytes expressing GC-B is prepared, the cell is cultured in the presence of a candidate drug, and the GC-B activity of the cell is used as an index. Screening for candidate drugs for the treatment of osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation.
In another embodiment of the present invention, the activity of GC-B is measured as the amount of intracellular cGMP produced.
In another embodiment of the present invention, the method comprises preparing a cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed, culturing the cell line in the presence or absence of a candidate drug, and Measuring the amount of cGMP produced in the body, and screening for candidate drugs for the treatment of osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using the difference in the amount of intracellular cGMP produced in the presence and absence of the candidate drug as an index Including.
In the seventh aspect, the present invention further provides a therapeutic or prophylactic agent for osteoarthritis comprising a GC-B activator as an active ingredient.
In an embodiment of the present invention, the therapeutic or prophylactic agent for osteoarthritis further comprises at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
In the eighth aspect, the present invention further provides a therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis comprising a GC-B activator as an active ingredient.
In an embodiment of the present invention, the therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis further comprises at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
In the ninth aspect, the present invention further provides an activation accelerator for a guanyl cyclase B (GC-B) activator comprising a nonsteroidal activator.
In an embodiment of the present invention, the GC-B activator is CNP or a derivative thereof.
In another embodiment of the invention, the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 from mammals or birds, including humans.
In another embodiment of the invention, the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
In another embodiment of the present invention, the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity.
In another embodiment of the invention, the non-steroidal activator is a cyclooxygenase enzyme inhibitor.
In another embodiment of the invention, the cyclooxygenase enzyme inhibitor is selected from the group consisting of indomethacin, ibuprofen, piroxicam, salicylic acid, diclofenac, ketoprofen, naproxen and piroxicam.
The present invention further provides, in the tenth aspect, a method for activating a GC-B activator, characterized by using the activation promoter described above.
This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2004-107924, which is the basis of the priority of the present application.

図１は、ＣＮＰ トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築を示す。図１Ａ：ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクターに組み込まれたマウスＣＮＰのｃＤＮＡをＰｓｔＩで切り出し両末端を平滑化した。図１Ｂ：ｐＳＧ１をＥｃｏ ＲＩで処理して断端を平滑化した。図１Ｃ：図１Ａで得られたマウスＣＮＰのｃＤＮＡを図１Ｂで得られたｐＳＧ１に組み込んだ。
図２は、インジェクション用ＤＮＡフラグメントを示す。図１ＣのｐＳＧ１−ＣＮＰから、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出し、インジェクション用のフラグメントとした。
図３は、サザンブロット法による導入遺伝子の存在に関するＣＮＰ トランスジェニックマウスの遺伝子型解析結果を示す。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）で野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。
図４は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおける関節軟骨の肥厚を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨の厚さについて、正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）とＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）の間で比較した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは統計学的に有意に関節軟骨が厚いことを示している。＊＊：ｐ＜０．０１、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図５は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおける関節軟骨細胞数の増加を示す。大腿骨膝蓋面の関節軟骨における光学顕微鏡下（対物１０倍）１視野あたりの軟骨細胞数について、正常同腹仔（Ｗｉｌｄ）とＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）の間で比較した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは統計学的に有意に１視野あたりの軟骨細胞数が多いことを示す。＊：ｐ＜０．０５、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図６は、ＣＮＰ トランスジェニックマウスのコラゲナーゼＯＡモデルにおける関節腫脹抵抗性を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）および野生型マウス（ＷＴ）の右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、左右の膝関節幅を計測し、その左右差を膝関節腫脹の指標として推移（図６Ａ）とその曲線下面積（ＡＵＣ）（図６Ｂ）を評価した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスは右膝関節の腫脹が弱い傾向にあり、ＡＵＣは野生型に対して有意に小さかった。＊＊：ｐ＜０．０１，Ｎ．Ｓ．：有意差なし。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図７は、コラゲナーゼＯＡモデルにおける右膝関節滑膜の組織学的変化を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、２８日での右膝関節滑膜の組織像である。野生型マウスに３％コラゲナーゼを投与すると、滑膜上皮細胞の増生、肉芽組織形成および炎症性細胞浸潤が認められた（図７Ｂ）。一方、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではこれら所見はきわめて軽微であった（図７Ｃ）。図７Ａは正常滑膜組織を示す。
図８は、コラゲナーゼＯＡモデルにおける右大腿骨内顆関節軟骨の組織学的変化を示す。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび野生型マウスの右膝関節に３％コラゲナーゼ生理食塩液を投与後、２８日での右大腿骨内顆関節軟骨の組織像である。野生型マウスでは軟骨基質のサフラニン０染色性が低下し、プロテオグリカン含量低下が認められた（図８Ｂ）のに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではサフラニン０染色性は保たれていた（図８Ｃ）。図８Ａは正常関節軟骨を示す。
図９は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与したＣＮＰのマウスコラゲナーゼＯＡモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスにＣＮＰ−２２を皮下に持続投与し、右膝関節に１．５％コラゲナーゼ生理食塩液を投与して６日後に測定した右膝関節腫脹を示す。ＣＮＰ−２２は６０，６００ｎｇ／日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１０は、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ投与したＣＮＰのマウス外科的ＯＡモデルにおける関節腫脹抑制効果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスにＣＮＰ−２２を皮下に持続投与し、右膝関節に前十字靭帯切除、内側則副靭帯切除および内側半月板全切除の外科処置を加えて変形性関節症を惹起した。術後４、８、１１日後に左右膝関節幅を測定、その差のＡＵＣを示した。ＣＮＰ−２２は６０，６００ｎｇ／日群ともに溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。
図１１は、Ｃ５７ＢＬ／６ Ｊ Ｊｃｌ系マウスコラゲナーゼＯＡモデルにおける膝関節腫脹に対する、ＣＮＰ−２２（６ｎｇ／日、皮下持続投与）、インドメタシン（Ｉｎｄｏ．，１ｍｇ／ｋｇ、経口投与）、およびこれらを併用した場合の抑制効果を示す。図１１Ａはマウス右膝関節に０．１５％と１．５％コラゲナーゼ生理食塩液を投与したあとの７日間の経日的な右膝関節腫脹推移を表す。図１１Ｂは、図１１Ａのグラフの曲線下面積（ＡＵＣ）を表す。ＡＵＣの比較において、ＣＮＰ−２２は溶媒対照群（ビヒクル）に対して有意に右膝関節の腫脹を抑制したが、インドメタシンは抑制しなかった。一方、ＣＮＰ−２２とインドメタシンを併用した群は顕著な抑制を示し、ＣＮＰ−２２単独群に対しても有意な抑制を示した。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル），＊＊：ｐ＜０．０１（ｖｓ．ビヒクル）。
図１２は、ラットアジュバント関節炎モデルに対する、ＣＮＰ−２２の四肢末端の関節炎と体重推移に対する効果を示す。図１２Ａは四肢末端の関節炎スコアの推移を表しており、ＣＮＰ−２２群では関節炎スコアが低い傾向が認められる。図１２Ｂは体重の推移を表しており、抗原感作後７、１０日においてＣＮＰ−２２群が溶媒対照群（ビヒクル）に比して有意に体重が重いことが示されている。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル）。
図１３は、ラットコラーゲン関節炎モデル体重に対するＣＮＰ−２２の作用を示す。正常群に対して、溶媒対照群（ビヒクル）は抗原感作後２１，２４，２８日で有意に体重が軽かったが、このときＣＮＰ−２２群（ＣＮＰ ６μｇ／日）では溶媒対照群に対して有意に体重が重かったことが示されている。対応のないＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定。＃＃：ｐ＜０．０１（ｖｓ．正常），＊：ｐ＜０．０５（ｖｓ．ビヒクル）。
発明の詳細な説明
図面を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明者らが後述の実施例２に記載のように作製したＣＮＰ−トランスジェニックマウス（ＣＮＰＴｇｍ）についてサザンブロット法を用いて遺伝子型解析を行ったところ、図３に示されるように、野生型マウスでは３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、ＣＮＰＴｇｍでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来の２本のシグナル（トランスジーン）が検出された。ＣＮＰＴｇｍでのＣＮＰの発現を検討するため、導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓および血漿でのＣＮＰの濃度を調べたところ、ＣＮＰ Ｔｇｍは野生型に対し、肝臓で約１０倍、血漿で約２４倍のＣＮＰ濃度を示しており、統計学的に有意にＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された（実施例４の表１）。
さらにＣＮＰＴｇｍの関節軟骨の組織学的解析を行うために、関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に調べたところ、関節軟骨の厚さは、ＣＮＰＴｇｍにおいて統計学的に有意に厚いこと（図４）、また関節軟骨細胞数もＣＮＰＴｇｍにおいて統計学的に有意に多いこと（図５）が確認された。これらの結果から、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ活性化物質は軟骨細胞数を増加させることによって関節軟骨の厚さを増加させることが示された。
後述の実施例６では、マウスを用いて膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させて変形性関節症を惹起する変形性関節炎病態モデル動物を作製した（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８９；１３５：１００１−１４）。ＣＮＰＴｇｍの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価する目的で、ＣＮＰＴｇｍおよび正常マウスを用いて作製した各変形性関節炎モデル動物を用いて検討を行ったところ、ＣＮＰＴｇｍを用いて作製したモデル動物では、正常マウスを用いて作製したモデル動物と比べて、膝関節腫脹が有意に小さかったこと、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったこと、および関節軟骨中のプロテオグリカン含量にはほとんど変化はなかったことが確認された（図６〜図８）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質が、変形性関節症において関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。
さらにまた、オスモティックポンプを移植した正常マウスを用いて、変形性関節炎モデルを作製し、インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。ＣＮＰ投与群では膝関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が有意に抑制されていたこと、滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱かったことが確認された（図９）。これらの結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質は変形性関節症に対する治療効果を有することが判明した。
さらに、オスモティックポンプを移植した正常マウスの右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起し、インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果の検討を行った。その結果、ＣＮＰ投与群のＡＵＣ（曲線下面積）はいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかったことが確認された（図１０）。この結果から、ＧＣ−Ｂ活性化物質が外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになった。
さらにまた、コラゲナーゼＯＡモデルマウスに、ＣＮＰを単独でまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と併用して投与したとき、使用したＮＳＡＩＤ単独では膝関節腫張を抑制しなかったが、ＣＮＰ単独投与では有意に膝関節腫張を抑制し、ＣＮＰとＮＳＡＩＤとの併用投与では、より大きい相乗的腫張抑制効果を示すことが判った（実施例９、図１１）。
さらにまた、関節リウマチ（ＲＡ）モデルとしてラボで汎用されているアジュバント関節炎モデルおよびコラーゲン関節炎モデル（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２７：７９７−８０６，１９８４；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３３：７９８−８０７，１９９４）を用いて、ＣＮＰの効果をさらに調べた結果、ＣＮＰ投与群（ラット）では、関節炎が有意に抑制されるとともに、対照と比べて体重増加が観察され、一般状態の有意な改善が認められた（実施例１０、１１、及び図１２、１３）。これらの結果は、ＣＮＰが関節リウマチによる関節炎に対して効能があることを示している。
このような実証例に基づき、本発明者らは、特定の理論や特定の実験例に拘束されることなく、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ活性化物質が関節炎症抑制作用と関節軟骨に対する同化的作用の両者を併せもつことを見出した。
したがって、本発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤を提供する。
本発明において治療又は予防可能な関節炎症は、特に関節軟骨に関わる疾患であり、例えば、変形性関節症に起因する関節炎症、滑膜炎、関節リウマチ（例えば慢性関節リウマチ（成人）や若年性関節リウマチ（子供））、骨関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、痛風、強皮症、乾癬（乾癬性関節炎）、ブラストミセス症などの真菌感染、強直性脊推炎、ライター症候群、敗血症性関節炎、成人スティル病、第三次ライム病（後期）、結核（結核性関節炎）、ウイルス感染（ウイルス性関節炎）、淋疾（淋菌性関節炎）もしくはバクテリアによる感染（非りん菌性細菌性関節炎）などに起因する関節炎症が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施態様において、好ましい関節炎症は変形性関節症、あるいは、変形性関節症に起因する関節炎症である。
変形性関節症は、関節軟骨の変性と破壊に起因する疾患であり、適応可能な変形性関節症には例えば、（１）荷重関節である膝関節、股関節、足関節、脊椎などにおける変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性足関節症、及び変形性脊椎症などの荷重関節における変形性関節症、並びに（２）非荷重関節である肩関節、肘関節、手関節、顎関節などにおける変形性肩関節症、変形性肘関節症、変形性手関節症（例えばヘバーデン結節、ブシャール結節、変形性母指ＣＭ関節症など）、顎関節症などの非荷重関節における変形性関節症が含まれる。
本発明の実施態様において、変形性関節症は、荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは変形性膝関節症及び変形性股関節症である。
本発明の別の実施態様において、変形性関節症は、非荷重関節における変形性関節症であり、好ましくは顎関節症である。
本発明の治療剤又は予防剤はまた、関節リウマチの治療又は予防にも適応可能である。関節リウマチは、自己免疫疾患であると考えられており、変形性関節症とは病因を異にするが、その病状の進行に伴って変形性関節症と同様に関節軟骨表面の変性と軟骨の破壊が起こる。このため、本発明の治療剤を投与することによって、関節炎症を抑制又は軽減することができる。
本明細書中で使用する「治療」、「治療方法」、「治療剤」なる用語は、本発明に係る関節炎症をもつ患者の症状を除去、抑制又は軽減すること、あるいはそのための方法又は医薬を意味する。また、「予防」、「予防剤」なる用語は、関節炎症を予防すること、あるいはそのための医薬を意味する。
本発明においてグアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）とは、ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）と同義の用語として使用する。
本発明においてＧＣ−Ｂ活性とは、グアニルシクラーゼ活性と同義の用語として使用する。本発明において、グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質又はＧＣ−Ｂ活性化物質は、ＣＮＰの受容体として知られるＧＣ−Ｂと結合してこれを活性化するペプチド又は非ペプチド性低分子化合物であり、好ましくはＣＮＰペプチド又はその誘導体である。ここでペプチドは、複数の（Ｌ−、Ｄ−及び／又は修飾）アミノ酸のアミド結合連鎖からなる物質を指し、この中にはポリペプチド及び蛋白質も包含される。ＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分後）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明の実施態様において、ＧＣ−Ｂ活性化物質は、ペプチドでありＣＮＰ又はその誘導体である。好ましいＣＮＰは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択されるものであり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。
本発明の別の実施態様において、上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。あるいは、上記ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と約７０％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を有する配列を含みかつＣＮＰ活性を有するものである。
本明細書中で使用される「１〜数個」という用語は、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の任意の整数を表す。また、２つのアミノ酸配列間の「％同一性」は、当業者に公知のＢＬＡＳＴタンパク質検索などの手法を用いて決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。
本発明で使用可能なＣＮＰには、ヒトを含む哺乳類由来ＣＮＰ（ＣＮＰ−２２：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１６８：８６３−８７０，国際公開ＷＯ９１／１６３４２、ＣＮＰ−５３：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０；１７０：９７３−９７９，特開平４−７４１９８号公報、特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報）、鳥類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９４号公報）、両生類由来ＣＮＰ（特開平４−１２００９５号公報）、並びに、特開平６−９６８８号公報、国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に開示されるＣＮＰ類似体ペプチドのようなＣＮＰ誘導体が含まれる。
天然由来ＣＮＰとして、２２及び５３アミノ残基からなるＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３が知られており、鳥類及びヒトを含む哺乳類由来の各ＣＮＰを比較すると種を超えて配列相同が高いため、本発明においては、鳥類又はヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、好ましくはヒトを含む哺乳類由来のＣＮＰ、さらに好ましくはヒト由来のＣＮＰが使用されうる。ヒトＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３のアミノ酸配列は、下記の配列番号１及び配列番号２：
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−２２：配列番号１）；
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ヒトＣＮＰ−５３：配列番号２）
として示される配列を有しており、いずれも分子内ジスルフィド結合を有し、すなわちヒトＣＮＰ−２２では６位のシステイン残基と２２位のシステイン残基との間で、またヒトＣＮＰ−５３では３７位のシステイン残基と５３位のシステイン残基との間でそれぞれ分子内ジスルフィド結合を有し、環状ペプチド構造を形成している。
ブタＣＮＰ−２２及びラットＣＮＰ−２２は、ヒトＣＮＰ−２２と同一のアミノ酸配列を有するが、一方、ブタＣＮＰ−５３及びラットＣＮＰ−５３では１７位及び２８位のアミノ酸残基がそれぞれＨｉｓ及びＧｌｙであるのに対しヒトＣＮＰ−５３ではそれぞれＧｌｎ及びＡｌａであり、２つのアミノ酸が相違する（特開平４−１３９１９９号公報、特開平４−１２１１９０号公報、特開平４−７４１９８号公報）。さらにまた、ニワトリＣＮＰ−２２は、９位のアミノ酸残基ＶａｌのみがヒトＣＮＰ−２２と異なる以外は同じ一次構造を有している（特開平４−１２００９４号公報）。
本発明で使用しうる上記ＣＮＰは、天然からの精製ＣＮＰ、既知の遺伝子工学的手法で製造された遺伝子組換えＣＮＰ、既知の化学合成法（例えばペプチド合成機を用いる固相合成法）で製造されたＣＮＰを含み、好ましくは遺伝子工学的手法で製造されたヒトＣＮＰ−２２およびヒトＣＮＰ−５３である。遺伝子工学的手法によるヒトＣＮＰの製造は、例えば、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３のＤＮＡ配列（特開平４−１３９１９９号公報）をプラスミド、ファージなどのベクターに組み込み、大腸菌や酵母などの原核もしくは真核生物宿主細胞に形質転換したのち、適する培地中で発現し、好ましくは細胞外にＣＮＰペプチドを分泌させ、産生したＣＮＰペプチドを回収し精製する各工程を含む。また、目的ＤＮＡの増幅のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。
遺伝子組換え技術、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ技術などの基本的な手法は当業者には公知であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９８）などに記載されており、そこに開示される技術を本発明のために利用することができる。またベクターとしては、市販のベクターあるいは刊行物記載のベクターが使用できる。
本発明で使用しうるＣＮＰ誘導体は、ＣＮＰ活性を有するとともに、ヒトＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３と同一の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合による環状ペプチド構造を有するものであって、上記ＣＮＰのフラグメント、上記ＣＮＰ又はそのフラグメントの構成アミノ酸の少なくとも１つをその他のアミノ酸に置換したペプチド、上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸の少なくとも１つを欠失したペプチド、及び上記ＣＮＰそのもの又はその部分ペプチドの構成アミノ酸に１つ以上のアミノ酸を付加したペプチドを含む。アミノ酸の置換、欠失、付加とは、ＣＮＰ活性を損なわない限り、部位特異的突然変異誘発法などの周知の方法にてアミノ酸の置換、欠失又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されることを意味する。このようなＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３の誘導体は例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
アミノ酸の置換については、一般的に保存的アミノ酸置換が好ましい。保存的アミノ酸は、例えば極性度（または疎水性度）や電荷の種類によって分類されることができる。例えば、非極性の非電荷型アミノ酸にはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンなど、芳香族アミノ酸にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、極性の非電荷型アミノ酸にはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンなど、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、正電荷アミノ酸にはリジン、アルギニン、ヒスチジンが、それぞれ含まれる。
本発明においてＣＮＰ活性とは、ＧＣ−Ｂに作用してグアニルシクラーゼ活性を上昇させる活性や変形性関節症を含む関節炎症を除去、抑制又は軽減する活性あるいは関節軟骨の増殖を促進させる活性をいう。ＣＮＰ活性は、細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定することによること、及び／又は、マウス、ラットなどの関節炎症、変形性関節症もしくは関節リウマチモデル動物に一定期間ＣＮＰ又はその誘導体を投与したのち、後述の実施例７から１０に記載されるように関節炎症抑制効果又は関節軟骨変性抑制効果の程度を測定すること、によって決定しうる。
ＣＮ−２２類似ペプチドには、例えば特開平６−９６８８号公報や国際公開ＷＯ０２／０７４２３４に記載されるような下記の環状ペプチドが含まれる（なお、配列中の下線はヒトＣＮＰ−２２からの変異を表す）。
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号３）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号４）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号５）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号６）
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（配列番号７）
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ（配列番号８）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ（配列番号９）
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｘｂｂ ＸｃｃＡｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｘｄｄ Ｘｅｅ Ｓｅｒ Ｘｆｆ Ｘｇｇ Ｇｌｙ Ｃｙｓ（ここで、Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｘｂｂ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；Ｘｃｃ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；Ｘｄｄ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；Ｘｅｅ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；Ｘｆｆ：Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；Ｘｇｇ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔである。）（配列番号１０）
また、ＣＮＰ−５３類似ペプチドには、上記のＣＮＰ−２２類似ペプチドに対応するアミノ酸の同様の変異を含む環状ペプチドが含まれる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤を提供する。この発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質が関節軟骨細胞を増加させる働きがあることに基づく。ＧＣ−Ｂ活性化物質の具体例は、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体である。ＣＮＰは、好ましくは、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３であり、さらに好ましくは、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰ誘導体は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものを含む。他のＧＣ−Ｂ活性化物質は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂ受容体を発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分後）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって同定されうる。すなわち、このようなアッセイ系を使用して細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標としてＧＣ−Ｂ活性化物質を同定し、それを本発明に使用することができる。
本発明はまた、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法を提供する。さらに本発明は、ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法を提供する。これらの発明は、ＧＣ−Ｂ活性化物質によって、言い換えればＧＣ−Ｂを活性化することによって、上記定義の関節炎症、好ましくは変形性関節症を抑制することができるという知見、また関節軟骨細胞の増殖を促進するという知見に基づく。本発明の実施態様により、ＧＣ−Ｂは、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体によって活性化されうる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法を提供する。ＧＣ−Ｂは、グアニルシクラーゼ活性によりＧＴＰからセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰの合成を触媒することが知られているので、ＧＣ−Ｂの活性は、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、ＧＣ−Ｂを発現する細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることからなる工程を含むことができる。
本発明の実施態様においてより好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって関節軟骨細胞増殖促進剤をスクリーニングすることができる。
本発明はさらに、ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法を提供する。上記と同様に、ＧＣ−Ｂの活性は、グアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定されうる。
本発明の実施態様において、上記スクリーニング方法は、ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞や関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のグアニルシクラーゼ活性、たとえば細胞内ｃＧＭＰの産生量を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることからなる方法を含むことができる。
本発明の実施態様においてより好ましくは、ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＯＳ−７等の培養細胞株にＧＣ−Ｂを発現させ、培地に候補薬剤を添加し、一定の温度及び一定の時間（例えば３７℃、５分間）細胞株を培養したのち、細胞内のｃＧＭＰ産生量を測定する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５２：１２０−１２３）によって変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤をスクリーニングすることができる。
本発明の変形性関節症等の関節炎症の治療剤又は予防剤は、有効成分としての上記定義のＧＣ−Ｂ活性化物質を、製薬上許容可能な担体、賦形剤、添加剤などと組み合わせて、経口投与用又は非経口投与用に製剤化される。
製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の治療剤又は予防剤は、医薬に一般に使用されている経口投与方法又は非経口投与方法のいずれかによって投与される。好ましくは非経口投与方法、例えば注射による投与（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹腔内への注射などによる投与）、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、経直腸投与など）、経肺投与などであるが、経口投与方法による投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分であるＧＣ−Ｂ活性化物質、好ましくは上記定義のＣＮＰ又はその誘導体、の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般に０．００５μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、０．０２μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。さらに０．０２μｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇでの投与が好ましい。しかしながら本発明のＣＮＰを含有する薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の治療剤又は予防剤は、抗炎症薬、ヒアルロン酸や副腎皮質ステロイドなどの従来又は新規の治療剤と組み合わせたり、また関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と組み合わせて使用することができる。
特に、抗炎症薬、例えば少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をＧＣ−Ｂ活性化物質（例えば、上記定義のＣＮＰ又はその誘導体）と併用するときには、関節炎に対する相乗的抑制効果がある（実施例１０）。
本明細書で使用する「非ステロイド性抗炎症薬」は、ステロイド骨格をもたない抗炎症薬を指し、プロスタグランジンの産生に関わるシクロオキシゲナーゼ酵素を抑制する作用をもつものが好ましい。本発明で使用可能な非ステロイド性抗炎症薬には、以下のものに限定されないが、例えばインドメタシン（インダシン（商標）など）、イブプロフェン（ブルフェン（商標）など）、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク（ボルタレン（商標）など）、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどを含む。
さらにまた、上記のＧＣ−Ｂ活性化物質を非ステロイド性抗炎症薬と併用するときの相乗効果は、ＧＣ−Ｂ活性化物質を単独に使用したときと比べてＧＣ−Ｂの活性化が促進されること、言い換えれば、上記の非ステロイド性抗炎症薬の有効成分がＧＣ−Ｂ活性化物質によるＧＣ−Ｂの活性化の際の活性化促進剤となること、を示している。
したがって、本発明はさらに、非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤を提供する。
ＧＣ−Ｂ活性化物質には、上述したような、ＣＮＰ又はその誘導体が含まれる。ＣＮＰの例は、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３であり、さらに具体的には、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である。また、ＣＮＰの誘導体の例は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである。
本発明において、上記非ステロイド性活性化剤は、好ましくはシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である。シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤には、例えばインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカムなどが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の活性化促進剤の剤型、用量、投与方法は、本発明の治療剤及び予防剤について上で説明した事項をそのまま適用できる。
本発明はまた、上記の活性化促進剤を使用することを特徴とするＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法も提供する。
上記の本発明の活性化促進剤および方法は、患者において、例えばＧＣ−Ｂ活性化を介して関節炎症などの疾患を治療する場合などに有効に使用することができる。
本発明として以下の事項を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（１）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。
（２）上記関節炎症が変形性関節症である、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（３）上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（２）に記載の治療剤又は予防剤。
（４）上記変形性関節症が変形性膝関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（５）上記変形性関節症が変形性股関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（６）上記変形性関節症が顎関節症である、上記（３）に記載の治療剤又は予防剤。
（７）上記関節炎症が関節リウマチに起因する、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（８）上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（１）に記載の治療剤又は予防剤。
（９）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。
（１０）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１１）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１２）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（９）に記載の治療剤又は予防剤。
（１３）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の治療剤又は予防剤。
（１４）ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤。
（１５）前記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、上記（１４）に記載の増殖促進剤。
（１６）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１７）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１８）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（１５）に記載の増殖促進剤。
（１９）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の増殖促進剤。
（２０）ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法。
（２１）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（２０）に記載の抑制方法。
（２２）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（２１）に記載の抑制方法。
（２３）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（２１）に記載の抑制方法。
（２４）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項２１に記載の抑制方法。
（２５）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の抑制方法。
（２６）ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法。
（２７）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、上記（２６）に記載の増殖促進方法。
（２８）前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（２９）前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（３０）前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（２７）に記載の増殖促進方法。
（３１）前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、上記（２６）〜（３０）のいずれかに記載の増殖促進方法。
（３２）ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
（３３）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３２）に記載のスクリーニング方法。
（３４）前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（３２）又は（３３）に記載のスクリーニング方法。
（３５）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３２）〜（３４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（３６）ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法。
（３７）ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３６）に記載のスクリーニング方法。
（３８）前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、上記（３６）又は（３７）に記載のスクリーニング方法。
（３９）ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、上記（３６）〜（３８）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（４０）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤。
（４１）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、上記（４０）に記載の変形性関節症の治療剤又は予防剤。
（４２）グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤。
（４３）少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項４２に記載の、関節リウマチの治療剤又は予防剤。
（４４）関節炎症の治療を必要とする患者にＧＣ−Ｂ活性化物質を投与することを含む、該関節炎症の治療方法。
（４５）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質がＣＮＰ又はその誘導体である、上記（４４）に記載の治療方法。
（４６）上記関節炎症が変形性関節症である、上記（４４）又は（４５）に記載の治療方法。
（４７）上記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、上記（４６）に記載の治療方法。
（４８）上記変形性関節症が変形性膝関節症、変形性股関節症又は顎関節症である、上記（４７）に記載の治療方法。
（４９）上記関節炎症が関節リウマチに起因する、上記（４４）に記載の治療方法。
（５０）上記関節炎症が変形性関節症に起因する、上記（４４）に記載の治療方法。
（５１）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５２）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５３）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（４５）〜（５０）のいずれかに記載の治療方法。
（５４）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質を、少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて含む、上記（４４）〜（５３）のいずれかに記載の治療方法。
（５５）非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤。
（５６）上記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、上記（５５）に記載の活性化促進剤。
（５７）上記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（５８）上記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（５９）上記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、上記（５６）に記載の活性化促進剤。
（６０）上記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である、上記（５５）に記載の活性化促進剤。
（６１）上記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される、上記（６０）に記載の活性化促進剤。
（６２）上記（５５）〜（６１）のいずれかに記載の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法。
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示を目的としたものであって、本発明を制限するものではない。それゆえ、本発明は、これらの実施例によって制限されないものとする。  FIG. 1 shows the construction of a vector for producing CNP transgenic mice. FIG. 1A: Mouse CNP cDNA incorporated into pGEM-T Easy vector was excised with PstI and blunted at both ends. FIG. 1B: pSG1 was treated with Eco RI to smooth the stump. FIG. 1C: The mouse CNP cDNA obtained in FIG. 1A was incorporated into pSG1 obtained in FIG. 1B.
  FIG. 2 shows the DNA fragment for injection. After treatment with HindIII and XhoI from pSG1-CNP in FIG. 1C, a fragment (about 2.3 kb) containing the CNP gene was excised and used as a fragment for injection.
  FIG. 3 shows the genotype analysis results of CNP transgenic mice regarding the presence of the transgene by Southern blotting. Three signals (wild-type CNP gene) are detected in the wild-type mouse (WT), and two transgene-derived signals (transgene) are detected in addition to the wild-type CNP gene in the transgenic mouse (Tgm). It was.
  FIG. 4 shows articular cartilage thickening in CNP transgenic mice. The thickness of the femoral patella articular cartilage was compared between normal littermates (Wild) and CNP transgenic mice (CNP tgm). CNP transgenic mice show statistically significant thickening of articular cartilage. **: p <0.01, unpaired Student t test.
  FIG. 5 shows an increase in the number of articular chondrocytes in CNP transgenic mice. The number of chondrocytes per visual field in the articular cartilage on the femoral patellar surface was compared between normal litters (Wild) and CNP transgenic mice (CNP tgm) under an optical microscope (10x objective). CNP transgenic mice show a statistically significantly higher number of chondrocytes per field. *: P <0.05, unpaired Student t test.
  FIG. 6 shows joint swelling resistance in a collagenase OA model of CNP transgenic mice. After 3% collagenase saline was administered to the right knee joint of CNP transgenic mice (Tgm) and wild type mice (WT), the width of the left and right knee joints was measured, and the difference between the left and right was used as an indicator of knee joint swelling ( FIG. 6A) and the area under the curve (AUC) (FIG. 6B) were evaluated. CNP transgenic mice tended to have weak swelling of the right knee joint and AUC was significantly smaller than wild type. **: p <0.01, N.I. S. : No significant difference. Unpaired Student t test.
  FIG. 7 shows histological changes of the right knee joint synovium in the collagenase OA model. It is a histological image of the right knee joint synovium on the 28th day after 3% collagenase physiological saline was administered to the right knee joint of CNP transgenic mice and wild type mice. When 3% collagenase was administered to wild-type mice, synovial epithelial cell proliferation, granulation tissue formation and inflammatory cell infiltration were observed (FIG. 7B). On the other hand, these findings were very slight in the CNP transgenic mice (FIG. 7C). FIG. 7A shows normal synovial tissue.
  FIG. 8 shows the histological changes of the right femoral condyle articular cartilage in the collagenase OA model. It is a histological image of the right femoral condylar joint cartilage on the 28th day after administration of 3% collagenase physiological saline to the right knee joint of CNP transgenic mice and wild type mice. In the wild type mouse, safranin 0 staining of the cartilage matrix was reduced and the proteoglycan content was reduced (FIG. 8B), whereas in the CNP transgenic mice, safranin 0 staining was maintained (FIG. 8C). FIG. 8A shows normal articular cartilage.
  FIG. 9 shows the joint swelling-suppressing effect of CNP administered with Infusion in the mouse collagenase OA model. The C57BL / 6 J Jcl mouse is continuously administered with CNP-22 subcutaneously and 1.5% collagenase physiological saline is administered to the right knee joint, and the right knee joint swelling measured 6 days later is shown. CNP-22 significantly suppressed swelling of the right knee joint in the 60,600 ng / day group compared to the solvent control group (vehicle). Unpaired Student t test.
  FIG. 10 shows the joint swelling-inhibiting effect of CNP administered with Infusion in a mouse surgical OA model. C57BL / 6 J Jcl mice were continuously administered with CNP-22 subcutaneously, and anterior cruciate ligament resection, medial collateral ligament resection, and medial meniscal resection were added to the right knee joint to induce osteoarthritis did. The left and right knee joint widths were measured 4, 8, and 11 days after the operation, and the AUC of the difference was shown. CNP-22 significantly suppressed swelling of the right knee joint in the 60,600 ng / day group compared to the solvent control group (vehicle). Unpaired Student t test.
  FIG. 11 shows CNP-22 (6 ng / day, subcutaneous subcutaneous administration), indomethacin (Indo., 1 mg / kg, oral administration), and a combination thereof, for knee joint swelling in the C57BL / 6 J Jcl mouse collagenase OA model The suppression effect in the case of doing is shown. FIG. 11A shows changes in swelling of the right knee joint over 7 days after administration of 0.15% and 1.5% collagenase saline to the mouse right knee joint. FIG. 11B represents the area under the curve (AUC) of the graph of FIG. 11A. In the AUC comparison, CNP-22 significantly suppressed swelling of the right knee joint compared to the solvent control group (vehicle), but not indomethacin. On the other hand, the group in which CNP-22 and indomethacin were used in combination showed significant suppression, and also showed significant suppression with respect to the CNP-22 single group. Unpaired Student t test. *: P <0.05 (vs. vehicle), **: p <0.01 (vs. vehicle).
  FIG. 12 shows the effect of CNP-22 on the arthritis of the extremities of the extremities and the body weight transition in the rat adjuvant arthritis model. FIG. 12A shows the transition of the arthritis score at the extremities of the extremities. In the CNP-22 group, the arthritis score tends to be low. FIG. 12B shows the change in body weight, which shows that the CNP-22 group is significantly heavier than the solvent control group (vehicle) at 7 and 10 days after antigen sensitization. Unpaired Student t test. *: P <0.05 (vs. vehicle).
  FIG. 13 shows the effect of CNP-22 on rat collagen arthritis model body weight. In contrast to the normal group, the solvent control group (vehicle) was significantly lighter at 21, 24, and 28 days after antigen sensitization. At this time, in the CNP-22 group (CNP 6 μg / day), the body weight was significantly lower. It was shown that the body weight was significantly heavy. Unpaired Student t test. ##: p <0.01 (vs. normal), *: p <0.05 (vs. vehicle).
Detailed Description of the Invention
  The present invention will be described more specifically with reference to the drawings.
  When the present inventors performed genotype analysis using the Southern blotting method for the CNP-transgenic mouse (CNPTgm) prepared as described in Example 2 described later, as shown in FIG. In mouse, three signals (wild type CNP gene) were detected, and in CNPTgm, in addition to the wild type CNP gene, two signals derived from the transgene (transgene) were detected. In order to examine the expression of CNP in CNPTgm, the concentration of CNP in liver and plasma, which are organs where high expression of the introduced gene is expected, was examined. CNP Tgm was about 10 times in liver compared to wild type. The CNP concentration was about 24-fold in plasma, and it was confirmed that the CNP peptide was statistically significantly overexpressed (Table 1 in Example 4).
  Furthermore, in order to perform histological analysis of CNPTgm articular cartilage, the thickness of articular cartilage and the number of chondrocytes were examined histologically. The thickness of articular cartilage was statistically significantly thicker in CNPTgm. (FIG. 4) It was also confirmed that the number of articular chondrocytes was statistically significantly higher in CNPTgm (FIG. 5). From these results, it was shown that a GC-B activator such as CNP increases the thickness of articular cartilage by increasing the number of chondrocytes.
  In Example 6 to be described later, a model animal for osteoarthritis pathological condition in which osteoarthritis is induced by destabilizing the ligament and meniscus of the knee joint by injecting collagenase into the knee joint using a mouse was prepared (Am). J. Pathol. 1989; 135: 1001-14). For the purpose of evaluating the resistance of CNPTgm to joint inflammation and articular cartilage degeneration, examination was performed using each model animal for osteoarthritis prepared using CNPTgm and normal mice. In the model animal prepared using CNPTgm, Compared with model animals prepared using normal mice, knee joint swelling was significantly smaller, articular cartilage degeneration was significantly suppressed, synovial cell increase in the synovium, granulation tissue formation, inflammatory It was confirmed that the change in cell infiltration was remarkably weak and that there was little change in the proteoglycan content in articular cartilage (FIGS. 6 to 8). From these results, it was found that the GC-B activator has a joint inflammation inhibitory effect and a joint cartilage degeneration inhibitory effect in osteoarthritis.
  Furthermore, an osteoarthritis model was prepared using normal mice transplanted with an osmotic pump, and the therapeutic effect of the infused CNP on the osteoarthritis model was examined. In the CNP administration group, it was resistant to swelling of the knee joint, articular cartilage degeneration was significantly suppressed, and synovial cell increase in the synovium, granulation tissue formation, and changes in inflammatory cell infiltration were remarkably weak It was confirmed (FIG. 9). From these results, it was found that the GC-B activator has a therapeutic effect on osteoarthritis.
  Furthermore, surgical treatment of anterior cruciate ligament cutting, medial collateral ligament cutting and medial meniscal resection was performed on the right knee joint of a normal mouse transplanted with an osmotic pump to induce osteoarthritis and infusion administration The therapeutic effect on the osteoarthritis model of CNP was investigated. As a result, it was confirmed that the AUC (area under the curve) of the CNP administration group was significantly smaller than that of the solvent control group at any dose (FIG. 10). From this result, it became clear that the GC-B activator has an inhibitory effect on joint inflammation in osteoarthritis caused by physical overload to the knee joint, which is induced by surgical treatment.
  Furthermore, when CNP was administered to collagenase OA model mice alone or in combination with a nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID), the NSAID used did not inhibit knee joint swelling, but CNP alone was administered. It was found that the knee joint swelling was significantly suppressed, and the combined administration of CNP and NSAID showed a greater synergistic swelling suppression effect (Example 9, FIG. 11).
  Furthermore, an adjuvant arthritis model and a collagen arthritis model (Arthritis & Rheumatism, 27: 797-806, 1984; British Journal of Rheumatology, 33: 798-807, 1994) widely used in the laboratory as rheumatoid arthritis (RA) models. In addition, as a result of further examining the effect of CNP, arthritis was significantly suppressed in the CNP-administered group (rat), and weight gain was observed compared to the control, and a significant improvement in general condition was observed ( Examples 10 and 11 and FIGS. 12 and 13). These results indicate that CNP is effective against arthritis due to rheumatoid arthritis.
  Based on such demonstrative examples, the present inventors are not bound by a specific theory or a specific experimental example, and a GC-B activator such as CNP is capable of suppressing joint inflammation and anabolic effects on articular cartilage. It was found that both of these were combined.
  Therefore, the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for joint inflammation, comprising a GC-B activator as an active ingredient.
  The joint inflammation that can be treated or prevented in the present invention is a disease particularly related to articular cartilage, such as joint inflammation caused by osteoarthritis, synovitis, rheumatoid arthritis (for example, rheumatoid arthritis (adult) and juvenile Rheumatoid arthritis (children)), osteoarthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), gout, scleroderma, psoriasis (psoriatic arthritis), blastomysosis and other fungal infections, ankylosing spondylitis, Reiter syndrome, septic arthritis , Adult Still's disease, tertiary Lyme disease (late stage), tuberculosis (tuberculous arthritis), viral infection (viral arthritis), gonorrhea (gonococcal arthritis) or bacterial infection (non-phosphoric bacterial arthritis) Involved joint inflammation includes, but is not limited to.
  In an embodiment of the present invention, the preferred joint inflammation is osteoarthritis or joint inflammation resulting from osteoarthritis.
  Osteoarthritis is a disease caused by degeneration and destruction of articular cartilage. Examples of applicable osteoarthritis include (1) Deformability in load joints such as knee joint, hip joint, ankle joint, and spine. Osteoarthritis in load joints such as knee arthrosis, hip osteoarthritis, osteoarthritis, and osteoarthritis, and (2) shoulder joints, elbow joints, wrist joints, temporomandibular joints that are non-load joints Osteoarthritis in non-loading joints, such as osteoarthritis of the shoulder, osteoarthritis of the elbow, osteoarthritis of the hand (eg, Heberden, Buchard, deformable thumb CM arthropathy) Is included.
  In an embodiment of the invention, the osteoarthritis is osteoarthritis in a load joint, preferably knee osteoarthritis and hip osteoarthritis.
  In another embodiment of the invention, the osteoarthritis is osteoarthritis in an unloaded joint, preferably temporomandibular arthrosis.
  The therapeutic agent or preventive agent of the present invention can also be applied to the treatment or prevention of rheumatoid arthritis. Rheumatoid arthritis is considered to be an autoimmune disease and has a different etiology from osteoarthritis, but as the disease progresses, as with osteoarthritis, degeneration of the articular cartilage surface and cartilage Destruction occurs. For this reason, joint inflammation can be suppressed or reduced by administering the therapeutic agent of this invention.
  As used herein, the terms “treatment”, “treatment method” and “therapeutic agent” are used to eliminate, suppress or alleviate symptoms of a patient with joint inflammation according to the present invention, or a method or medicament for the same. Means. The terms “prevention” and “prophylactic agent” mean prevention of joint inflammation or a medicament for the prevention.
  In the present invention, guanyl cyclase B (GC-B) is used as a term having the same meaning as natriuretic peptide receptor B (NPR-B).
  In the present invention, GC-B activity is used as a term synonymous with guanyl cyclase activity. In the present invention, guanyl cyclase B (GC-B) activator or GC-B activator is a peptide or non-peptide small molecule that binds to and activates GC-B known as a receptor for CNP. A compound, preferably a CNP peptide or a derivative thereof. Here, a peptide refers to a substance composed of an amide bond chain of a plurality of (L-, D- and / or modified) amino acids, and includes a polypeptide and a protein. For example, the GC-B activator can express a GC-B receptor in a cultured cell line such as COS-7, add a candidate drug to the medium, and maintain a certain temperature and a certain time (for example, 37 ° C., 5 minutes). Later) After culturing the cell line, it can be identified by the method of measuring intracellular cGMP production (Science 1991; 252: 120-123). That is, using such an assay system, a GC-B activator can be identified using the amount of intracellular cGMP produced as an index, and can be used in the present invention.
  In an embodiment of the invention, the GC-B activator is a peptide and is CNP or a derivative thereof. Preferred CNPs are those selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans, more preferably CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
  In another embodiment of the present invention, the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. Alternatively, the CNP derivative is about 70% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 95% or more, about 97% or more, about 98 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. % Or more, including sequences having% identity of about 99% or more and having CNP activity.
  As used herein, the term “1 to several” represents an arbitrary integer of usually 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3. In addition, “% identity” between two amino acid sequences can be determined using techniques such as BLAST protein search known to those skilled in the art (Altschul, SF, Gish, W., Miller, W , Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215: 403-410).
  CNPs usable in the present invention include CNP derived from mammals including humans (CNP-22: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 168: 863-870, International Publication WO91 / 16342, CNP-53: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 170: 973-979, JP-A-4-74198, JP-A-4-139199, JP-A-4-121190), bird-derived CNP (JP-A-4-120094) CNP derivatives such as CNP analog peptides disclosed in amphibian-derived CNP (Japanese Patent Laid-Open No. 4-120095) and Japanese Patent Laid-Open No. 6-9688 and International Publication WO02 / 074234.
  As natural-derived CNP, CNP-22 and CNP-53 consisting of 22 and 53 amino residues are known. Compared with mammals including birds and humans, this sequence has high sequence homology across species. In the invention, CNP derived from mammals including birds or humans, preferably CNP derived from mammals including humans, more preferably CNP derived from humans can be used. The amino acid sequences of human CNP-22 and CNP-53 are shown in the following SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2:
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (human CNP-22: SEQ ID NO: 1);
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (human CNP-53: SEQ ID NO: 2)
Each having an intramolecular disulfide bond, ie, between the cysteine residues at positions 6 and 22 for human CNP-22, and for human CNP-53. Each of the cysteine residue at position 37 and the cysteine residue at position 53 has an intramolecular disulfide bond to form a cyclic peptide structure.
  Porcine CNP-22 and rat CNP-22 have the same amino acid sequence as human CNP-22, whereas in porcine CNP-53 and rat CNP-53, the amino acid residues at positions 17 and 28 are His and Gly, respectively. In contrast, human CNP-53 has Gln and Ala, respectively, and the two amino acids are different (Japanese Patent Laid-Open Nos. 4-139199, 4-121190, and 4-74198). Furthermore, chicken CNP-22 has the same primary structure except that only the 9th amino acid residue Val differs from human CNP-22 (Japanese Patent Laid-Open No. 4-120094).
  The above-mentioned CNP which can be used in the present invention is produced by purified CNP from nature, recombinant CNP produced by a known genetic engineering technique, and known chemical synthesis methods (for example, solid phase synthesis using a peptide synthesizer). Human CNP-22 and human CNP-53, which are preferably produced by genetic engineering techniques. For example, human CNP can be produced by genetic engineering techniques by incorporating a human CNP-22 or CNP-53 DNA sequence (Japanese Patent Laid-Open No. 4-139199) into a vector such as a plasmid or a phage, After transforming into a eukaryotic host cell, each step includes expressing in a suitable medium, preferably secreting the CNP peptide outside the cell, and recovering and purifying the produced CNP peptide. In addition, polymerase chain reaction (PCR) technology can be used for amplification of the target DNA.
  Basic techniques such as gene recombination techniques, site-directed mutagenesis, and PCR techniques are known to those skilled in the art. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Ausubel et al., Current Protocols In Mole Techniques can be utilized for the present invention. Moreover, as a vector, a commercially available vector or a vector described in a publication can be used.
  A CNP derivative that can be used in the present invention has CNP activity and a cyclic peptide structure formed by disulfide bonds between two cysteine residues identical to human CNP-22 or CNP-53. A fragment, a peptide in which at least one of the constituent amino acids of the CNP or a fragment thereof is substituted with another amino acid, a peptide in which at least one of the constituent amino acids of the CNP itself or a partial peptide thereof is deleted, and the CNP itself or a part thereof It includes peptides in which one or more amino acids are added to the constituent amino acids of the peptide. Amino acid substitutions, deletions, and additions are the number of amino acids that can be substituted, deleted or added by a known method such as site-directed mutagenesis unless the CNP activity is impaired. Means lost or added. Such derivatives of CNP-22 or CNP-53 are, for example, those in which 1 to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and have CNP activity.
  For amino acid substitution, conservative amino acid substitution is generally preferred. Conservative amino acids can be classified by, for example, polarity (or hydrophobicity) and charge type. For example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, etc. for nonpolar uncharged amino acids, phenylalanine, tyrosine, tryptophan for aromatic amino acids, serine, threonine, cysteine, methionine for polar uncharged amino acids Negatively charged amino acids such as asparagine and glutamine include aspartic acid and glutamic acid, and positively charged amino acids include lysine, arginine and histidine, respectively.
  In the present invention, the CNP activity refers to an activity that acts on GC-B to increase guanyl cyclase activity, an activity to remove, suppress or reduce joint inflammation including osteoarthritis, or an activity to promote proliferation of articular cartilage. . CNP activity is determined by measuring cellular guanyl cyclase activity, for example, the amount of intracellular cGMP produced, and / or CNP or osteoarthritis or rheumatoid arthritis model animals such as mice and rats for a certain period of time. After administration of the derivative, it can be determined by measuring the degree of joint inflammation inhibitory effect or articular cartilage degeneration inhibitory effect as described in Examples 7 to 10 below.
  CN-22-like peptides include the following cyclic peptides as described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-9688 and International Publication WO02 / 074234 (note that the underline in the sequence is a mutation from human CNP-22) Represents).
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile GlyAla  Met Ser Gly Leu Gly Cys (SEQ ID NO: 3)
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerGln  Ser Gly Leu Gly Cys (SEQ ID NO: 4)
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerAla  Ser Gly Leu Gly Cys (SEQ ID NO: 5)
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (SEQ ID NO: 6)
Ser Leu Arg Arg Ser Ser  Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys (SEQ ID NO: 7)
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly CysAsn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO: 8)
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerGln  Ser Gly Leu Gly CysAsn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO: 9)
Cys Phe GlyXaa  Xbb  XccAsp Arg Ile GlyXdd  Xee  SerXff  Xgg  Gly Cys (where Xaa = Leu, Ile, Val; Xbb = Lys, Leu, Met; Xcc = Leu, Ile, Ala, Val; Xdd = Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; Xee = Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; Xff: Gly, Lys, Ala, Leu; Xgg = Leu, Met) (SEQ ID NO: 10)
  In addition, CNP-53-like peptides include cyclic peptides containing the same mutations of amino acids corresponding to the above-mentioned CNP-22-like peptides.
  The present invention further provides an articular chondrocyte proliferation promoter comprising a GC-B activator as an active ingredient. This invention is based on the fact that the GC-B activator has a function of increasing articular chondrocytes. A specific example of the GC-B activator is CNP or a derivative thereof as defined above. The CNP is preferably CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans, more preferably CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. CNP derivatives include those in which 1 to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and have CNP activity. The other GC-B activator, for example, expresses a GC-B receptor in a cultured cell line such as COS-7, adds a candidate drug to the culture medium, and at a certain temperature and a certain time (for example, 37 ° C., 5 minutes later) After culturing the cell line, it can be identified by the method of measuring intracellular cGMP production (Science 1991; 252: 120-123). That is, using such an assay system, a GC-B activator can be identified using the amount of intracellular cGMP produced as an index, and can be used in the present invention.
  The present invention also provides a method for suppressing joint inflammation, which comprises suppressing joint inflammation by activating GC-B. Furthermore, the present invention provides a method for promoting the proliferation of articular chondrocytes, characterized by promoting the proliferation of articular chondrocytes by activating GC-B. These inventions are based on the finding that joint inflammation as defined above, preferably osteoarthritis, can be suppressed by activating GC-B, in other words, by activating GC-B. Based on the knowledge of promoting the growth of According to an embodiment of the present invention, GC-B can be activated by CNP or a derivative thereof as defined above.
  The present invention further provides a screening method for an articular chondrocyte proliferation promoter, which comprises screening a candidate drug for promoting articular chondrocyte proliferation using the activity of GC-B as an index. Since GC-B is known to catalyze the synthesis of cGMP, a second messenger, from GTP by guanyl cyclase activity, the activity of GC-B can be measured as the amount of intracellular cGMP produced.
  In an embodiment of the present invention, the screening method comprises preparing a cell expressing GC-B or a cell derived from articular chondrocytes, culturing the cell in the presence of a candidate drug, and guanyl cyclase activity of the cell, for example, The method may include a step consisting of screening a candidate drug for promoting the proliferation of articular chondrocytes using the amount of intracellular cGMP produced as an index.
  In an embodiment of the present invention, more preferably, a cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed is prepared, the cell line is cultured in the presence or absence of a candidate drug, and the intracellular cGMP of the cell line is The method includes measuring the amount of production and screening the candidate agent for promoting the proliferation of articular chondrocytes using as an index the difference in the amount of intracellular cGMP produced in the presence and absence of the candidate agent.
  In the screening method of the present invention, for example, GC-B is expressed in a cultured cell line such as COS-7, a candidate drug is added to the medium, and the cell line is fixed at a certain temperature and for a certain time (for example, 37 ° C., 5 minutes). After culturing, the articular chondrocyte proliferation promoter can be screened by a method of measuring intracellular cGMP production (Science 1991; 252: 120-123).
  The present invention further comprises screening a therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation, comprising screening a candidate drug for the treatment of osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using the activity of GC-B as an index. Provide a method. Similarly to the above, the activity of GC-B can be measured as guanyl cyclase activity, for example, intracellular cGMP production.
  In an embodiment of the present invention, the above screening method comprises preparing cultured cells expressing articular chondrocytes or cells derived from articular chondrocytes, culturing the cells in the presence of a candidate drug, and guanyl cyclase activity of the cells, For example, it may include a method comprising screening a candidate drug for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using the amount of intracellular cGMP produced as an index.
  In an embodiment of the present invention, more preferably, a cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed is prepared, the cell line is cultured in the presence or absence of a candidate drug, and the intracellular cGMP of the cell line is This includes measuring the amount of production, and screening for a candidate drug for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using as an index the difference in intracellular cGMP production in the presence and absence of the candidate drug.
  In the screening method of the present invention, for example, GC-B is expressed in a cultured cell line such as COS-7, a candidate drug is added to the medium, and the cell line is fixed at a certain temperature and for a certain time (for example, 37 ° C., 5 minutes). Can be screened for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation by a method for measuring intracellular cGMP production (Science 1991; 252: 120-123).
  The therapeutic or preventive agent for joint inflammation such as osteoarthritis of the present invention combines the GC-B activator defined above as an active ingredient with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, additive and the like. And formulated for oral or parenteral administration.
Examples of the carrier and excipient for the preparation include lactose, magnesium stearate, starch, talc, gelatin, agar, pectin, gum arabic, olive oil, sesame oil, cocoa butter, ethylene glycol, and other commonly used ones. be able to.
  As the solid composition for oral administration, tablets, pills, capsules, powders, granules and the like are used. In such solid compositions, at least one active ingredient is at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, aluminate metasilicate. Mixed with magnesium. The composition comprises additives other than inert diluents according to conventional methods, for example lubricants such as magnesium stearate, disintegrants such as calcium calcium glycolate, solubilizing agents such as glutamic acid or aspartic acid May be included. If necessary, the tablets or pills may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin or hydroxypropylmethylcellulose phthalate or a film of a gastric or enteric substance, or may be coated with two or more layers. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, commonly used inert diluents such as purified water. , Ethanol and the like may be contained. In addition to the inert diluent, the composition may contain adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances, preservatives and the like.
  Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of aqueous solutions and suspensions include water for injection and physiological saline for injection. Examples of the non-aqueous solution and suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (registered trademark), and the like. Such compositions may further contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg lactose), solubilizers (eg glutamic acid, aspartic acid). . These can be sterilized by a normal sterilization method such as filtration sterilization using a microfiltration membrane, heat sterilization such as high-pressure steam sterilization, or blending of a bactericide. The injection may be a solution preparation or may be lyophilized for dissolution and reconstitution before use. As an excipient for lyophilization, sugar alcohols and sugars such as mannitol and glucose can be used.
  The therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention is administered by either an oral administration method or a parenteral administration method generally used in medicine. Preferably, parenteral administration methods, for example, administration by injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal administration, transmucosal administration (nasal administration, rectal administration, etc.), Although it is pulmonary administration, administration by an oral administration method is also possible.
  The amount of the GC-B activator which is an active ingredient contained in the preparation of the present invention, preferably CNP or a derivative thereof as defined above, depends on the type of disease to be treated, the severity of the disease, the age of the patient, etc. Generally, it can be administered in the range of 0.005 μg / kg to 100 mg / kg, but is preferably administered in the range of 0.02 μg / kg to 5 mg / kg. Furthermore, administration at 0.02 μg / kg to 0.25 mg / kg is preferable. However, the drug containing CNP of the present invention is not limited to these doses.
  The therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention is combined with conventional or novel therapeutic agents such as anti-inflammatory drugs, hyaluronic acid and corticosteroids, and orthopedic surgery such as arthroscopic surgery, artificial joint replacement and osteotomy. Can be used in combination with surgery.
  In particular, when an anti-inflammatory drug, such as at least one non-steroidal anti-inflammatory drug, is used in combination with a GC-B activator (eg, CNP or a derivative thereof as defined above), there is a synergistic inhibitory effect on arthritis (Examples) 10).
  As used herein, “non-steroidal anti-inflammatory drug” refers to an anti-inflammatory drug having no steroid skeleton, and preferably has an action of suppressing a cyclooxygenase enzyme involved in the production of prostaglandins. Non-steroidal anti-inflammatory drugs that can be used in the present invention are not limited to the following, but include, for example, indomethacin (such as Indacin (trademark)), ibuprofen (such as Brufen (trademark)), piroxicam, salicylic acid, diclofenac (voltaren ( Trademark)), ketoprofen, naproxen, piroxicam and the like.
  Furthermore, the synergistic effect when the above-mentioned GC-B activator is used in combination with a non-steroidal anti-inflammatory drug is that the activation of GC-B is promoted compared with the case where the GC-B activator is used alone. In other words, it indicates that the active ingredient of the non-steroidal anti-inflammatory drug is an activation accelerator for the activation of GC-B by the GC-B activator.
  Accordingly, the present invention further provides an activation promoter for a GC-B activator comprising a non-steroidal activator.
  The GC-B activator includes CNP or a derivative thereof as described above. Examples of CNP are CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans, and more specifically, CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. Examples of CNP derivatives are those in which 1 to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 and have CNP activity.
  In the present invention, the non-steroidal activator is preferably a cyclooxygenase enzyme inhibitor. Cyclooxygenase enzyme inhibitors include, but are not limited to, for example, indomethacin, ibuprofen, piroxicam, salicylic acid, diclofenac, ketoprofen, naproxen, piroxicam and the like.
  As the dosage form, dose, and administration method of the activation promoter of the present invention, the matters described above for the therapeutic agent and prophylactic agent of the present invention can be applied as they are.
  The present invention also provides a method for activating a GC-B activator characterized by using the above activation accelerator.
  The above-mentioned activation promoter and method of the present invention can be used effectively in patients, for example, when treating diseases such as joint inflammation through GC-B activation.
  The present invention can include the following matters, but is not limited thereto.
(1) A therapeutic or preventive agent for joint inflammation, comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient.
(2) The therapeutic agent or prophylactic agent according to (1) above, wherein the joint inflammation is osteoarthritis.
(3) The therapeutic or preventive agent according to (2) above, wherein the osteoarthritis is osteoarthritis of a load joint or osteoarthritis of a non-load joint.
(4) The therapeutic or prophylactic agent according to (3) above, wherein the osteoarthritis is knee osteoarthritis.
(5) The therapeutic or preventive agent according to (3) above, wherein the osteoarthritis is osteoarthritis of the hip.
(6) The therapeutic or prophylactic agent according to (3) above, wherein the osteoarthritis is temporomandibular disorder.
(7) The therapeutic or preventive agent according to (1) above, wherein the joint inflammation is caused by rheumatoid arthritis.
(8) The therapeutic agent or prophylactic agent according to (1) above, wherein the joint inflammation is caused by osteoarthritis.
(9) The therapeutic or prophylactic agent according to any one of (1) to (8) above, wherein the GC-B activator is C-type natriuretic peptide (CNP) or a derivative thereof.
(10) The therapeutic or prophylactic agent according to (9) above, wherein the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
(11) The therapeutic or prophylactic agent according to (9) above, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
(12) The therapeutic agent according to (9) above, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. Or a preventive agent.
(13) The therapeutic or prophylactic agent according to any one of (1) to (12) above, further comprising at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
(14) An articular chondrocyte proliferation promoter comprising a GC-B activator as an active ingredient.
(15) The growth promoter according to (14) above, wherein the GC-B activator is CNP or a derivative thereof.
(16) The growth promoter according to (15) above, wherein the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
(17) The growth promoter according to (15) above, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
(18) Growth promotion according to (15) above, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. Agent.
(19) The growth promoter according to any one of (14) to (18), further comprising at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
(20) A method for suppressing joint inflammation, comprising suppressing joint inflammation by activating GC-B.
(21) The suppression method according to (20) above, wherein the GC-B is activated by CNP or a derivative thereof.
(22) The suppression method according to (21), wherein the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
(23) The suppression method according to (21), wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
(24) The suppression method according to claim 21, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity.
(25) The suppression method according to any one of (20) to (24), wherein the GC-B is activated by a combination of CNP or a derivative thereof and at least one non-steroidal anti-inflammatory drug.
(26) A method for promoting articular chondrocyte proliferation, comprising activating GC-B to promote articular chondrocyte proliferation.
(27) The proliferation promoting method according to (26), wherein the GC-B is activated by CNP or a derivative thereof.
(28) The method according to (27) above, wherein the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
(29) The method according to (27) above, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
(30) The growth promotion according to (27), wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. Method.
(31) The method according to any one of (26) to (30), wherein the GC-B is activated by a combination of CNP or a derivative thereof and at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
(32) A screening method for an articular chondrocyte proliferation promoter, comprising screening a candidate drug for promoting the proliferation of articular chondrocytes using the activity of GC-B as an index.
(33) A cultured cell expressing articular chondrocytes or cells derived from articular chondrocytes is prepared, the cells are cultured in the presence of a candidate drug, and proliferation of articular chondrocytes is promoted using the GC-B activity of the cells as an index. The screening method according to (32), comprising screening a candidate drug for.
(34) The screening method according to (32) or (33), wherein the GC-B activity is measured as an intracellular cGMP production amount.
(35) preparing a cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed, culturing the cell line in the presence or absence of a candidate drug, measuring the amount of intracellular cGMP produced in the cell line, The method according to any one of (32) to (34), comprising screening a candidate drug for promoting proliferation of articular chondrocytes using as an index the difference in intracellular cGMP production between the presence and absence of the drug. Screening method.
(36) A screening method for a therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation, comprising screening a candidate drug for a therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using the activity of GC-B as an index.
(37) A cultured cell expressing arterial chondrocytes or cells derived from articular chondrocytes is prepared, and the cells are cultured in the presence of a candidate drug. The screening method according to (36) above, comprising screening a candidate drug for a therapeutic agent for rheumatism or joint inflammation.
(38) The screening method according to (36) or (37) above, wherein the GC-B activity is measured as an intracellular cGMP production amount.
(39) A cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed is prepared, the cell line is cultured in the presence or absence of a candidate drug, and the amount of intracellular cGMP produced in the cell line is measured. Screening the candidate drug for the treatment of osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using as an index the difference in the amount of intracellular cGMP produced in the presence and absence of the drug (36) to (38) The screening method in any one of.
(40) A therapeutic or prophylactic agent for osteoarthritis comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient.
(41) The therapeutic or prophylactic agent for osteoarthritis according to (40), further comprising at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
(42) A therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis, comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient.
(43) The therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis according to claim 42, further comprising at least one non-steroidal anti-inflammatory drug.
(44) A method for treating joint inflammation, comprising administering a GC-B activator to a patient in need of treatment for joint inflammation.
(45) The treatment method according to (44), wherein the GC-B activator is CNP or a derivative thereof.
(46) The method according to (44) or (45), wherein the joint inflammation is osteoarthritis.
(47) The treatment method according to (46), wherein the osteoarthritis is osteoarthritis of a load joint or osteoarthritis of a non-load joint.
(48) The treatment method according to (47), wherein the osteoarthritis is knee osteoarthritis, osteoarthritis of the hip, or temporomandibular disorder.
(49) The method according to (44), wherein the joint inflammation is caused by rheumatoid arthritis.
(50) The treatment method according to (44), wherein the joint inflammation is caused by osteoarthritis.
(51) The treatment method according to any one of (45) to (50), wherein the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
(52) The treatment method according to any of (45) to (50), wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
(53) In the above (45) to (50), the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity The treatment method in any one.
(54) The treatment method according to any one of (44) to (53), comprising the GC-B activator in combination with at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug.
(55) An activation accelerator for a GC-B activator comprising a nonsteroidal activator.
(56) The activation accelerator according to (55), wherein the GC-B activator is CNP or a derivative thereof.
(57) The activation promoter according to (56), wherein the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans.
(58) The activation promoter according to (56), wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2.
(59) The activation according to (56), wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. Accelerator.
(60) The activation promoter according to (55), wherein the nonsteroidal activator is a cyclooxygenase enzyme inhibitor.
(61) The activation accelerator according to (60), wherein the cyclooxygenase enzyme inhibitor is selected from the group consisting of indomethacin, ibuprofen, piroxicam, salicylic acid, diclofenac, ketoprofen, naproxen, and piroxicam.
(62) A method for activating a GC-B activator, characterized by using the activation promoter according to any of (55) to (61).
  The present invention is further illustrated by the following examples, which are intended for purposes of illustration only and are not intended to limit the invention. Therefore, the present invention should not be limited by these examples.

ＣＮＰ トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築
図１Ａに示すように、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にマウスＣＮＰ ｃＤＮＡ（５２６ｂｐ；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７６：２０９−２１３，１９９０）をサブクローニングさせたものをＰｓｔ Ｉで切断し、断端を平滑化してマウスＣＮＰ ｃＤＮＡを調製した。ＰＳＧ１ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製；図１Ｂ）をＥｃｏ ＲＩで切断し断端を平滑化して、図１ＣのようにマウスＣＮＰ ｃＤＮＡをｌｉｇａｔｉｏｎし、ＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ）を作製した。Construction of CNP transgenic mouse production vector As shown in FIG. 1A, a mouse obtained by subcloning mouse CNP cDNA (526 bp; FEBS Lett. 276: 209-213, 1990) into pGEM-T easy vector (manufactured by Promega). Mouse CNP cDNA was prepared by cutting with Pst I and blunting the stump. The PSG1 vector (Promega; FIG. 1B) was cleaved with Eco RI to blunt the ends, and the mouse CNP cDNA was ligated as shown in FIG. 1C to prepare a SAP-mCNP vector (pSG1-CNP).

ＣＮＰ トランスジェニックマウスの作製
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、次のようにして調製した。まずＣＮＰ遺伝子を挿入したＳＡＰ−ｍＣＮＰベクター（ｐＳＧ１−ＣＮＰ；図１Ｃ）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで処理した後、ＣＮＰ遺伝子を含む断片（約２．３ｋｂ）を切り出した。この断片を、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により回収し、３ｎｇ／μｌになるようにＰＢＳ−で希釈してインジェクション用ＤＮＡフラグメント（図２）とした。
ＤＮＡフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずＣ５７ＢＬ／６雌マウス（日本クレア）に５ｉ．ｕの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）を腹腔内投与、さらに４８時間後５ｉ．ｕのヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、１９０−２０７、２０００）。ＤＮＡフラグメントを６６０個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚へ注入し、翌日、２細胞期に発生していた胚５６１個を、偽妊娠１日目の受容雌の卵管に片側当たり１０個前後（１匹あたり２０個前後）を移植した。
分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。１３６例の産仔が得られ、そのうちの５例がＣＮＰ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスであった。以下、最初に得られたマウスをＦｏｕｎｄｅｒと記載する。
Ｆｏｕｎｄｅｒは全て雄マウスで、これら５ラインのうち４ラインから、次世代（Ｆ１マウス）の産仔が得られた。Production of CNP transgenic mice A DNA fragment for injection was prepared as follows. First, the SAP-mCNP vector (pSG1-CNP; FIG. 1C) into which the CNP gene was inserted was treated with HindIII and XhoI, and then a fragment (about 2.3 kb) containing the CNP gene was excised. This fragment was recovered by Gel Extraction Kit (QIAGEN) and diluted with PBS − to 3 ng / μl to obtain an injection DNA fragment (FIG. 2).
Mouse pronuclear eggs injected with DNA fragments were collected as follows. That is, first, C57BL / 6 female mice (CLEA Japan) were treated with 5i. u pregnant maternal serum gonadotropin (PMSG) intraperitoneally, 48 hours later 5i. Superovulation was performed by intraperitoneally administering u human chorionic gonadotropin (hCG). This female mouse was bred with a male mouse of the same strain. The next morning after mating, the oviduct of the mouse in which the plug was confirmed was perfused to recover the mouse pronuclear egg.
The DNA fragment for injection was injected into the pronuclear egg using a micromanipulator (the latest technology of gene targeting (Yodosha), 190-207, 2000). The DNA fragment was injected into 660 C57BL / 6J embryos, and the next day, 561 embryos that had developed at the 2-cell stage were placed in the oviducts of recipient females on the first day of pseudopregnancy at around 10 per side (per mouse). Around 20) were transplanted.
Receiving females who did not deliver pups even on the scheduled delivery date were subjected to caesarean section and fostered by foster parents. 136 offspring were obtained, 5 of which were transgenic mice into which the CNP gene was introduced. Hereinafter, the initially obtained mouse is referred to as Founder.
The founders were all male mice, and the next generation (F1 mouse) offspring were obtained from 4 of these 5 lines.

ＣＮＰ トランスジェニックマウスの遺伝子型解析
遺伝子型解析は下記に示す手順に従ってサザンブロット法によって行った。３週齢になったマウスの尾（約１５ｍｍ）を採取してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理（５５℃、１００ｒｐｍで１昼夜振盪）して溶解液を得た。この溶解液を核酸自動分離装置（ＫＵＲＡＢＯＮＡ−１０００）にかけてゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡ１５μｇをＰｖｕ ＩＩ（２００Ｕ）で処理してからフェノール・クロロホルム処理によって制限酵素を除いた後にエタノール沈殿でＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを２５μＬのＴＥに溶解して０．７％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ定電圧）にかけ、泳動終了後、ゲルを０．２５Ｍ ＨＣｌ溶液で１５分間処理してＤＮＡを切断し、水洗してから０．４Ｍ ＮａＯＨ溶液でナイロンメンブレンに一晩ブロッティングした。その後、メンブレン上のＤＮＡをＵＶクロスリンク法で固定した。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液（５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ ＳＤＳ、５ｘＳＳＰＥ）で処理（４２℃、２時間）してから、ＣＮＰのｃＤＮＡ（約０．５ｋｂ）を鋳型としてＢｃａＢＥＳＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）で調製した３２ｐ標識プローブを加えて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。その後、洗浄溶液（２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）で５５℃、２０分間処理してからＩｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）に一晩露光し、導入遺伝子のシグナルをＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ）で検出した（図３）。野生型マウス（ＷＴ）では３本のシグナル（野生型ＣＮＰ遺伝子）が検出され、トランスジェニックマウスでは野生型ＣＮＰ遺伝子に加えて、導入遺伝子由来のシグナル（トランスジーン）が２本検出された。Genotyping of CNP transgenic mice Genotyping was performed by Southern blotting according to the following procedure. The tail (about 15 mm) of a 3-week-old mouse was collected and treated with proteinase K (55 ° C., shaken at 100 rpm for one day and night) to obtain a lysate. This lysate was applied to an automatic nucleic acid separation apparatus (KURABONA-1000) to prepare genomic DNA. After 15 μg of genomic DNA was treated with Pvu II (200 U), restriction enzymes were removed by phenol / chloroform treatment, and then DNA was collected by ethanol precipitation. The recovered DNA was dissolved in 25 μL of TE and subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis (50 V constant voltage). After the electrophoresis was completed, the gel was treated with 0.25 M HCl solution for 15 minutes to cleave the DNA, and washed with water. Then, it was blotted overnight on a nylon membrane with 0.4 M NaOH solution. Thereafter, the DNA on the membrane was fixed by the UV cross-linking method. The membrane was treated with a hybridization solution (50% Formamide, 0.5 × Denhardt's, 0.5% SDS, 5 × SSPE) (42 ° C., 2 hours), and then BcaBEST using CNP cDNA (about 0.5 kb) as a template. A 32 p-labeled probe prepared with Labeling Kit (TaKaRa) was added and hybridization was performed overnight at 42 ° C. Thereafter, the plate was treated with a washing solution (2 × SSC, 0.1% SDS) at 55 ° C. for 20 minutes, then exposed to Imaging Plate (Fuji Film) overnight, and the transgene signal was detected with BAS2000 (Fuji Film) (FIG. 3). In the wild type mouse (WT), three signals (wild type CNP gene) were detected, and in the transgenic mouse, in addition to the wild type CNP gene, two signals (transgene) derived from the transgene were detected.

ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおけるＣＮＰの発現
ＣＮＰ濃度の測定には、ＣＮＰ−２２ ＥＩＡ測定キット（ＰＨＯＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣ．社製）を用いた。
７週齢の雌雄ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび雌雄の正常同腹マウス各３例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させた。
導入した遺伝子の高発現が予想される臓器である肝臓を採取し、肝重量０．１ｇに対して、上記測定キットのＥＩＡ ａｓｓａｙバッファー１ｍＬを加え氷冷した。ワーリングブレンダー（ヒスコトロン社製）でホモジナイズし、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分間）した上清をＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
採取した血液に、１ｍｇのエチレンジアミン４酢酸・４ナトリウム塩（純正化学社製）と２トリプシン阻害単位のアプロチニン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して攪拌して血漿を分離し、ＣＮＰ−２２濃度測定サンプルとした。
測定結果を表１に示した。

Figure 2005094889
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ＣＮＰ トランスジェニックマウス（ＣＮＰ ｔｇｍ）は野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）に対する平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）の比較では肝臓（Ｌｉｖｅｒ）で約１０倍、血漿（Ｐｌａｓｍａ）で約２４倍のＣＮＰ−２２濃度を示しており、いずれも統計学的に有意な差であった。これらの結果より、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて、ＣＮＰペプチドが過剰発現されていることが確認された。CNP Expression in CNP Transgenic Mice CNP-22 EIA measurement kit (manufactured by PHOENIX PHARMACEUTICALS INC.) Was used for measurement of CNP concentration.
Three 7-week-old male and female CNP transgenic mice and male and female normal litter mice were euthanized by whole blood collection from the posterior vena cava under ether anesthesia.
The liver, which is an organ expected to have high expression of the introduced gene, was collected, and 1 mL of EIA assay buffer of the above measurement kit was added to the liver weight of 0.1 g, followed by ice cooling. The supernatant obtained by homogenizing with a Waring blender (manufactured by Hiscotron) and centrifuging (2,000 rpm, 5 minutes) was used as a CNP-22 concentration measurement sample.
1 mg of ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt (manufactured by Junsei Chemical Co., Ltd.) and 2 trypsin inhibitory unit aprotinin (manufactured by Sigma) are added to the collected blood and stirred to separate plasma, and a sample for measuring CNP-22 concentration It was.
The measurement results are shown in Table 1.
Figure 2005094889
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CNP transgenic mice (CNP tgm) have a mean value ± standard deviation (mean ± SD) compared to the wild type (Wild type) of about 10 times in the liver (Liver) and about 24 times in the plasma (Plasma). Concentrations are shown and all were statistically significant differences. From these results, it was confirmed that CNP peptide was overexpressed in CNP transgenic mice.

ＣＮＰ トランスジェニックマウス関節軟骨の組織学的解析
関節軟骨の厚さおよび軟骨細胞数を組織学的に解析する目的で、９週齢のＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび同腹の正常マウスの雌各５例、計１０例をエーテル麻酔下で後大静脈から全採血して安楽死させ、大腿骨を２０％ホルマリンにより１週間固定した。その後２０％ＥＤＴＡ−４Ｎａ（純正化学社製）水溶液（ｐＨ７．４）に浸漬して脱灰した後、大腿骨膝蓋面を正中矢状断して常法に従いパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。厚さ４ｍｍの切片をミクロトームを用いて薄切してパラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した。関節軟骨の厚さは、対物レンズ１０倍での１視野を画像解析ソフト（ＩＰＡＰ，住化テクノサービス社製）に取り込み、同ソフトを用いて視野中の５点について長さを計測して平均値を算出し、その個体の関節軟骨の厚さとした。この計測に用いた同一の視野について、軟骨細胞数を計測した。これら項目について、同性の正常マウスとＣＮＰ トランスジェニックマウスの間で平均値および標準偏差を算出し（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ２０００，マイクロソフト社製）、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって統計学的解析を行った（ＳＡＳ ｖｅｒ．６．１２，ＳＡＳ インスティチュートジャパン社製）。
関節軟骨の厚さは、雌雄ともにＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて統計学的に有意に厚いことが判明した（図４）。また、１視野あたりの関節軟骨細胞数も雌雄ともにＣＮＰ トランスジェニックマウスにおいて統計学的に有意に多いことが判明した（図５）。
これらの結果から、ＣＮＰなどのＧＣ−Ｂ（ＮＰＲ−Ｂ）を活性化する物質が、公知である個々の軟骨細胞の肥大化［Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００３；２７８（２１）：１８８２４−３２］による細胞容積の増加でなく、軟骨細胞数の増加を伴って関節軟骨の厚さを増加させることが明らかになった。Histological analysis of CNP transgenic mouse articular cartilage For the purpose of histological analysis of articular cartilage thickness and chondrocyte count, a total of 5 females, 9 weeks old CNP transgenic mouse and littermate normal mouse, Ten patients were anesthetized by ether sampling from the posterior vena cava under ether anesthesia, and the femur was fixed with 20% formalin for 1 week. After that, it was immersed in 20% EDTA-4Na aqueous solution (pH 7.4) and decalcified, then the femur patellar surface was cut in the middle sagittal shape and embedded in paraffin according to a conventional method to prepare a paraffin block. did. A 4 mm thick section was sliced using a microtome to prepare a paraffin section and stained with hematoxylin and eosin. The thickness of the articular cartilage is averaged by taking one field of view with a 10x objective lens into image analysis software (IPAP, manufactured by Sumika Techno Service Co., Ltd.) and measuring the length of five points in the field of view using this software. The value was calculated as the thickness of the individual articular cartilage. The number of chondrocytes was counted for the same visual field used for this measurement. For these items, mean values and standard deviations were calculated between homosexual normal mice and CNP transgenic mice (Microsoft Excel 2000, manufactured by Microsoft Corporation), and statistical analysis was performed by unpaired Student's t test (SAS). ver.6.12, manufactured by SAS Institute Japan).
Articular cartilage thickness was found to be statistically significantly greater in CNP transgenic mice in both sexes (FIG. 4). It was also found that the number of articular chondrocytes per visual field was statistically significantly higher in both male and female CNP transgenic mice (FIG. 5).
From these results, it is known that a substance that activates GC-B (NPR-B), such as CNP, is known to be an enlarged cell of individual chondrocytes [J Biol Chem 2003; 278 (21): 18824-32]. It was found that the thickness of the articular cartilage increases with an increase in the number of chondrocytes but not with an increase in volume.

ＣＮＰ トランスジェニックマウスの変形性関節炎モデルに対する抵抗性
膝関節内へのコラゲナーゼ注射により膝関節の靭帯および半月板を不安定化させ変形性関節症を惹起する変形性関節炎動物モデル［Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９８９；１３５：１００１−１４］を作成した。ＣＮＰの変形性関節炎に対する予防及び治療効果を確認する目的で、ＣＮＰ トランスジェニックマウスを用いた変形性関節炎動物モデルの関節炎症および関節軟骨変性に対する抵抗性を評価した。ＣＮＰ トランスジェニックマウスおよび同腹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの右膝関節内に６マイクロリットルの３％タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）生理食塩溶液を２回投与（投与開始当日と投与開始後７日）した。左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後２８日まで経時的に測定し、左右の差を算出して膝関節腫脹を表す値とした。その経時的推移曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスと野生型マウスの間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した。その結果、ＣＮＰ トランスジェニックマウスにおけるＡＵＣは野生型よりも有意に小さく、ＣＮＰ トランスジェニックマウスがコラゲナーゼによる膝関節腫脹に抵抗性であることが判明した（図６）。関節炎症および関節軟骨変性を病理組織学的に評価するため、コラゲナーゼ投与後２８日にエーテル麻酔下に全採血による安楽死後に膝関節を採取し、実施例５に記載した方法でヘマトキシリン・エオジン染色標本およびサフラニン０染色標本を作成し、組織学的に解析した。その結果、野生型マウスではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であったのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではこれら変化が著しく弱かった（図７）。関節軟骨変性については、野生型マウスではサフラニン０染色性が低下し、関節軟骨中のプロテオグリカン含量が低下したのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスではその変化は軽微であり、ＣＮＰ トランスジェニックマウスはコラゲナーゼ投与による関節軟骨変性に抵抗性であることが病理組織学的に示された（図８）。このとき、血漿中ＣＮＰ濃度をＥＩＡキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）を用いて測定したところ、野生型マウスの平均値は０．２１ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＣＮＰ トランスジェニックマウスでは０．５０ｎｇ／ｍＬであった。
これらの結果から、ＣＮＰの変形性関節症における関節炎症抑制作用と関節軟骨変性抑制作用を有することが判明した。Resistance of CNP transgenic mice to osteoarthritis model Osteoarthritis animal model that causes osteoarthritis by destabilizing the ligaments and meniscus of the knee joint by injecting collagenase into the knee joint [Am J Pathol 1989; 135: 1001-14]. In order to confirm the preventive and therapeutic effects of CNP on osteoarthritis, the resistance to joint inflammation and articular cartilage degeneration was evaluated in an animal model of osteoarthritis using CNP transgenic mice. Two 6 microliters of 3% type II collagenase (Sigma) physiological saline solution was administered twice into the right knee joint of CNP transgenic mice and wild-type wild type C57BL / 6 mice (7 days after administration and 7 days after administration). Day). The widths of the left and right knee joints were measured over time up to 28 days after administration using calipers (manufactured by Mitutoyo Corporation), and the difference between the left and right sides was calculated as a value representing knee joint swelling. The area under the time course curve (AUC) was calculated by the trapezoidal method, and the CNP transgenic mice and wild type mice were compared by the Student t test. As a result, the AUC in the CNP transgenic mice was significantly smaller than that in the wild type, indicating that the CNP transgenic mice are resistant to collagenase-induced swelling of the knee joint (FIG. 6). For histopathological evaluation of joint inflammation and articular cartilage degeneration, knee joints were collected after euthanasia by whole blood collection under ether anesthesia 28 days after collagenase administration, and stained with hematoxylin and eosin by the method described in Example 5 Samples and safranin 0 stained samples were prepared and analyzed histologically. As a result, in the wild-type mice, collagenase increased synovial cell formation, granulation tissue formation, and inflammatory cell infiltration in the synovium due to collagenase, whereas these changes were remarkably weak in the CNP transgenic mice (FIG. 7). As for articular cartilage degeneration, safranin 0 staining decreased in wild-type mice and proteoglycan content in articular cartilage decreased, whereas the change was slight in CNP transgenic mice, and collagenase administration was performed in CNP transgenic mice. Histopathologically, it was shown to be resistant to articular cartilage degeneration by (Fig. 8). At this time, when the plasma CNP concentration was measured using an EIA kit (manufactured by Phoenix Pharmaceutical), the average value of wild-type mice was 0.21 ng / mL, whereas that of CNP transgenic mice was 0.50 ng. / ML.
From these results, it was found that CNP has an inhibitory effect on joint inflammation and an inhibitory effect on articular cartilage degeneration in osteoarthritis.

インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果（１）
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００ｍｇ／ｍＬ溶液（６００ｎｇ／日）。
移植後６日に１．５％タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液６ｍＬを右膝関節内に投与し、６日後まで膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後２８日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳｖｅｒ．６．１２）。その結果、ＣＮＰ−２２投与群のＡＵＣはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった。また、実施例５に記載した方法でヘマトキシリン・エオジン染色標本およびサフラニン０染色標本を作成し、病理組織学的に解析した。
その結果、溶媒対照群ではコラゲナーゼにより滑膜における滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤が顕著であったのに対し、ＣＮＰ投与群ではこれら変化が著しく弱いことが判明した（図９）。滑膜組織膝関節のこの結果から、ＣＮＰが変形性関節症に対して治療効果を有することが判明した。Therapeutic effect of CNP treated with infusion on osteoarthritis model (1)
An osmotic pump (2004 type, manufactured by Duct) containing the following solution was implanted subcutaneously in the back of a 9-week-old C57BL / 6 J male mouse.
Solvent: Distilled water containing 5% dextrose (manufactured by Junsei Kagaku), 10% mannose (manufactured by Nacalai Tesque) and 5 mmol / L hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
CNP-22 (Calbiochem Novabiochem) 10 mg / mL solution (60 ng / day).
-CNP-22 (Calbiochem Novabiochem) 100 mg / mL solution (600 ng / day).
Six days after transplantation, 6 mL of a 1.5% type II collagenase (Sigma) solution was administered into the right knee joint, and the knee joint widths of the left and right knees were administered using calipers (manufactured by Mitutoyo) until six days later. Measurements were made over time until the day, and the difference between the left and right was calculated. This difference was used as a value representing knee joint swelling, and the AUC was compared by the Student t test between the solvent control group and the CNP administration group (SAS ver. 6.12). As a result, the AUC of the CNP-22 administration group was significantly smaller than the solvent control group at any dose. Further, hematoxylin and eosin stained specimens and safranin 0 stained specimens were prepared by the method described in Example 5 and analyzed histopathologically.
As a result, in the solvent control group, collagenase increased synovial cell formation, granulation tissue formation, and inflammatory cell infiltration in the synovium due to collagenase, whereas these changes were found to be remarkably weak in the CNP administration group (FIG. 9). ). From this result of the synovial tissue knee joint, it was found that CNP has a therapeutic effect on osteoarthritis.

インフュージョン投与したＣＮＰの変形性関節炎モデルに対する治療効果（２）
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウス（日本クレア社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１００ｍｇ／ｍＬ溶液（６００ｎｇ／日）。
移植翌日にマウスをエーテル麻酔し、右膝関節に対して前十字靭帯切断、内側則副靭帯切断および内側半月板全切除の外科処置を施し、変形性関節症を惹起した。左右膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後１１日まで経時的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳ前臨床パッケージ、ＳＡＳインスティチュートジャパン社製）。その結果、ＣＮＰ−２２投与群のＡＵＣはいずれの用量とも溶媒対照群に対し有意に小さかった（図１０）。
この結果から、ＣＮＰが外科処置により惹起される、膝関節への物理的過荷重にもとづく変形性関節症における関節炎症に対しても抑制作用を有することが明らかになった。Therapeutic effect of infused CNP on osteoarthritis model (2)
An osmotic pump (2004 type, manufactured by Duct) containing the following solutions was transplanted subcutaneously into the back of 9-week-old C57BL / 6 J male mice (Clear Japan).
Solvent: Distilled water containing 5% dextrose (manufactured by Junsei Kagaku), 10% mannose (manufactured by Nacalai Tesque) and 5 mmol / L hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
CNP-22 (Calbiochem Novabiochem) 10 mg / mL solution (60 ng / day).
-CNP-22 (Calbiochem Novabiochem) 100 mg / mL solution (600 ng / day).
The day after transplantation, the mice were anesthetized with ether, and the right knee joint was subjected to surgical procedures for anterior cruciate ligament amputation, medial collateral ligament amputation, and total medial meniscal resection to induce osteoarthritis. The left and right knee joint widths were measured over time until 11 days after administration using calipers (manufactured by Mitutoyo Corporation), and the difference between the left and right sides was calculated. This difference was regarded as a value representing knee joint swelling, and the AUC was compared by the Student t test between the solvent control group and the CNP administration group (SAS preclinical package, manufactured by SAS Institute Japan). As a result, the AUC of the CNP-22 administration group was significantly smaller than the solvent control group at any dose (FIG. 10).
From this result, it became clear that CNP also has an inhibitory action against joint inflammation in osteoarthritis caused by physical overload to the knee joint, which is induced by surgical treatment.

コラゲナーゼＯＡモデルにおける非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とＣＮＰの併用効果
９週齢のＣ５７ＢＬ／６ Ｊ系の雄マウスの背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１μｇ／ｍＬ溶液（６ｎｇ／日）。
また、ＮＳＡＩＤであるインドメタシン（Ｓｉｇｍａ社製）の効果と、ＣＮＰと併用したときの効果を検討するために、上記のポンプ移植日から１日１回、連日４日間１ｍｇ／ｋｇの用量でインドメタシンの０．２％カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク社製）溶液への懸濁液を強制経口投与した。
実験群は以下の如く設定した。
溶媒対照（インフュージョン溶媒、経口投与溶媒）
ＣＮＰ ６ｎｇ／日
インドメタシン １ｍｇ／ｋｇ
ＣＮＰ ６ｎｇ／日 ＋ インドメタシン １ｍｇ／ｋｇ
ポンプの移植当日に０．１５％ タイプＩＩコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液６μＬ、翌日に１．５％ タイプＩＩコラゲナーゼ溶液６μＬを右膝関節内に投与し、膝左右の膝関節幅をノギス（ミツトヨ社製）を用いて投与後７日まで経日的に測定し、左右の差を算出した。この差を膝関節腫脹を表す値とし、そのＡＵＣを溶媒対照群とＣＮＰ投与群の間でＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で比較した（ＳＡＳ ｖｅｒ．６．１２）。
その結果、インドメタシン単独では膝関節腫脹を抑制しなかった。このとき、ＣＮＰ ６ｎｇ／日群は有意に膝関節腫脹を抑制した。しかし、ＣＮＰとインドメタシンを併用した群ではＣＮＰ単独群に対しても有意に膝関節腫脹を抑制していた（図１１）。この結果から、ＣＮＰによる膝関節腫脹抑制は、単独投与では関節炎治療の標準薬であるＮＳＡＩＤに比して有意な効果を有することに加え、ＮＳＡＩＤとの併用投与では相乗的な効果を有することが判明した。Combined effect of non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) and CNP in collagenase OA model Osmotic pump (2004 type, manufactured by Durect) containing the following solution subcutaneously in the back of 9-week-old C57BL / 6 J male mice ) Was transplanted.
Solvent: Distilled water containing 5% dextrose (manufactured by Junsei Kagaku), 10% mannose (manufactured by Nacalai Tesque) and 5 mmol / hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
CNP-22 (Calbiochem Novabiochem) 1 μg / mL solution (6 ng / day).
In addition, in order to examine the effect of NSAID indomethacin (manufactured by Sigma) and the combined use with CNP, indomethacin was administered at a dose of 1 mg / kg once a day for 4 days after the above-mentioned pump transplantation day. A suspension in a 0.2% carboxymethylcellulose (Nacalai Tesque) solution was orally administered by gavage.
The experimental group was set as follows.
Solvent control (infusion solvent, solvent for oral administration)
CNP 6 ng / day Indomethacin 1 mg / kg
CNP 6 ng / day + indomethacin 1 mg / kg
On the day of transplantation of the pump, 6 μL of 0.15% type II collagenase (Sigma) solution and 6 μL of 1.5% type II collagenase solution were administered into the right knee joint the next day. The product was measured daily until 7 days after administration, and the difference between the left and right was calculated. This difference was used as a value representing knee joint swelling, and the AUC was compared by the Student t test between the solvent control group and the CNP administration group (SAS ver. 6.12).
As a result, indomethacin alone did not inhibit knee joint swelling. At this time, the CNP 6 ng / day group significantly suppressed knee joint swelling. However, in the group using both CNP and indomethacin, knee joint swelling was significantly suppressed as compared to the CNP alone group (FIG. 11). From these results, suppression of knee joint swelling by CNP has a significant effect compared to NSAID, which is a standard drug for the treatment of arthritis, when administered alone, and may have a synergistic effect when administered in combination with NSAID. found.

ラットアジュバント関節炎モデルに対するＣＮＰの作用
６週齢のＬＥＷ／Ｃｒｊ系オスラット（日本チャールズ・リバー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１０μｇ／ｍＬ溶液（６０ｎｇ／日）。
移植翌日に、結核死菌粉末（Ｍ．ＴＵＢＥＲＣＵＬＯＳＩＳ ＤＥＳ．Ｈ３７ ＲＡ、ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製を３ｍｇ／ｍＬの濃度で流動パラフィン（純正化学社製）に懸濁し、５０μＬをラット尾根部に皮内接種した。接種後、四肢末端の状態を以下の基準に従って経日的にスコア評価し、四肢末端スコアを合計したスコアをその個体の関節炎スコアとした。
スコア０：病変なし
スコア１：１つ以上の指関節に発赤・腫脹が認められる。または甲の部分が赤変しているが腫脹は認められない。
スコア２：前肢または後肢の甲に軽度の腫脹が認められる。
スコア３：前肢または後肢の甲に高度な腫脹が認められるが、全ての指にはそれが認められない。
スコア４：前肢または後肢の甲および指に高度の腫脹が認められる。
その結果、ＣＮＰ投与群では関節炎スコアが溶媒対照群に対して低下する傾向が認められた（図１２Ａ）。
体重の推移も経日的に測定した。その結果、溶媒対照群に対して、ＣＮＰ投与群は有意に体重の増加高かった（図１２Ｂ）。
これらの結果から、ＣＮＰはラットアジュバントモデルにおいても関節炎を抑制し、一般状態を改善することが判明した。Effect of CNP on Rat Adjuvant Arthritis Model An osmotic pump (2004 type, manufactured by Durect) containing the following solutions was implanted subcutaneously in the back of a 6-week-old LEW / Crj male rat (manufactured by Charles River, Japan).
Solvent: Distilled water containing 5% dextrose (manufactured by Junsei Kagaku), 10% mannose (manufactured by Nacalai Tesque) and 5 mmol / L hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
CNP-22 (manufactured by Calbiochem Novabiochem) 10 μg / mL solution (60 ng / day).
The day after transplantation, tuberculosis killed powder (M. TUBERCULOSIS DES. H37 RA, DIFCO Laboratories) was suspended in liquid paraffin (Pure Chemical Co., Ltd.) at a concentration of 3 mg / mL, and 50 μL was inoculated intradermally into the rat ridge. After inoculation, the condition of the extremities was scored daily according to the following criteria, and the total score of the extremities was used as the arthritis score of the individual.
Score 0: No lesion Score 1: Redness or swelling is observed in one or more finger joints. Or the instep is red, but no swelling is observed.
Score 2: Mild swelling is observed on the back of the forelimb or hindlimb.
Score 3: Severe swelling is observed on the forelimbs or hindlimbs but not on all fingers.
Score 4: Severe swelling is observed in the back and fingers of the forelimb or hindlimb.
As a result, the arthritis score tended to decrease in the CNP administration group compared to the solvent control group (FIG. 12A).
The change in body weight was also measured daily. As a result, the body weight gain was significantly higher in the CNP administration group than in the solvent control group (FIG. 12B).
From these results, it was found that CNP suppresses arthritis and improves general condition in a rat adjuvant model.

ラットコラーゲン関節炎モデルに対するＣＮＰの作用
１０週齢のＤＡ／Ｓｌｃ系メスラット（日本エスエルシー社製）の背部皮下に、以下の溶液を含むオスモティックポンプ（２００４型、Ｄｕｒｅｃｔ社製）を移植した。
・溶媒：５％ デキストロース（純正化学社製）、１０％ マンノース（ナカライテスク社製）および５ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸（和光純薬社製）を含有する蒸留水。
・ＣＮＰ−２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製）１ｍｇ／ｍＬ溶液（６μｇ／日）。
移植直後に、ウシＩＩ型コラーゲン（コラーゲン技術研修会社製）を１．５ｍｇ／ｍＬになるよう０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水に溶解し、等用量のＡｄｊｕｖａｎｔ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）と懸濁した液４００μＬをラット背部に皮内接種した。接種後、体重の推移も経日的に測定した。また、ポンプ移植も接種も行わない正常群も設定し、同様に体重の推移を測定した。
その結果、正常群に対して溶媒対照群は有意に体重が減少するのに対して、ＣＮＰ投与群は溶媒対照群に対して有意に体重減少が少なかった（図１３）。この結果から、ＣＮＰはラットコラーゲン関節炎モデルにおいて、一般状態を改善することが判明した。Effect of CNP on rat collagen arthritis model An osmotic pump (2004 type, manufactured by Durect) containing the following solutions was implanted subcutaneously in the back of a 10-week-old DA / Slc female rat (manufactured by SLC Japan).
Solvent: Distilled water containing 5% dextrose (manufactured by Junsei Kagaku), 10% mannose (manufactured by Nacalai Tesque) and 5 mmol / L hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
-CNP-22 (Calbiochem Novabiochem) 1 mg / mL solution (6 μg / day).
Immediately after transplantation, bovine type II collagen (manufactured by Collagen Technology Training Company) was dissolved in 0.1 mol / L acetic acid water to 1.5 mg / mL, and an equal amount of Adjuvant Incomplete Adjuvant (manufactured by DIFCO Laboratories) and suspended. 400 μL of the resulting solution was inoculated intradermally on the back of the rat. After inoculation, the change in body weight was also measured daily. Moreover, the normal group which does not perform pump transplantation and inoculation was also set, and the transition of the body weight was measured similarly.
As a result, the body weight was significantly decreased in the solvent control group compared to the normal group, whereas the body weight loss was significantly less in the CNP administration group than in the solvent control group (FIG. 13). From this result, it was found that CNP improves the general condition in the rat collagen arthritis model.

本発明の、ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含む治療剤又は予防剤は、関節軟骨の厚さおよび関節軟骨細胞数が有意に増加させること、関節腫脹に抵抗性であること、関節軟骨変性が抑制されること、滑膜細胞増勢、肉芽組織形成、炎症性細胞浸潤の変化が著しく弱いこと、並びに、関節軟骨中のプロテオグリカン含量が低下しないことなどの効能をもつことから、変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性肘関節症、変形性脊椎症、顎関節症などの変形性関節症を含む関節炎症の治療又は予防のために有用である。本発明の医薬の投与によって、関節患部における関節軟骨基質および軟骨細胞数の減少抑制又は再生が起こり、関節軟骨変性と関節部の腫脹が抑制され、これによって関節炎症が抑制又は軽減される。特に本発明の変形性関節症治療剤は、従来の関節鏡視下手術、人工関節置換や骨切り術などの整形外科手術と比べて患者の負担や苦痛が少ないために、患者のＱＯＬに配慮した、優れた治療剤となりうる。
ＧＣ−Ｂ活性化物質が上記のような効能をもつという新規の知見から、ＧＣ−Ｂを活性化することによって、関節炎症を抑制すること及び関節軟骨細胞の増殖を促進させることが可能である。また、ＧＣ−Ｂの活性（たとえば細胞内ｃＧＭＰ産生量）を指標とすることによって、関節軟骨細胞増殖促進剤や関節炎症治療剤をスクリーニングすることも可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。The therapeutic agent or prophylactic agent containing a GC-B activator as an active ingredient of the present invention significantly increases the thickness of articular cartilage and the number of articular chondrocytes, is resistant to joint swelling, articular cartilage Degenerative knee because of its effects such as suppression of degeneration, synovial cell intensification, granulation tissue formation, remarkably weak changes in inflammatory cell infiltration, and no decrease in proteoglycan content in articular cartilage It is useful for the treatment or prevention of joint inflammation including osteoarthritis such as arthropathy, hip osteoarthritis, elbow osteoarthritis, osteoarthritis, and temporomandibular disorders. Administration of the medicament of the present invention suppresses or regenerates the number of articular cartilage matrix and chondrocytes in the joint affected area, thereby suppressing articular cartilage degeneration and swelling of the joint, thereby suppressing or reducing joint inflammation. In particular, the therapeutic agent for osteoarthritis according to the present invention is less burdensome and painful for the patient compared to conventional arthroscopic surgery, orthopedic surgery such as artificial joint replacement and osteotomy, etc. Can be an excellent therapeutic agent.
From the novel finding that the GC-B activator has the above-mentioned effects, it is possible to suppress joint inflammation and promote the proliferation of articular chondrocytes by activating GC-B. . Further, by using the activity of GC-B (for example, intracellular cGMP production amount) as an index, it is possible to screen for an articular chondrocyte proliferation promoter or a joint inflammation therapeutic agent.
All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

配列番号１の説明：６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。
配列番号２の説明：３７−Ｃｙｓと５３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。
配列番号３の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号４の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号５の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号６の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号７の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、７−Ｃｙｓと２３−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号８の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、６−Ｃｙｓと２２−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号９の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される）。
配列番号１０の人工配列の説明：ＣＮＰ−２２誘導体（ここで、４−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ；５−Ｘａａ＝Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ；６−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｖａｌ；１１−Ｘａａ＝Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ；１２−Ｘａａ＝Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｔｒｐ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ；１４−Ｘａａ＝Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ；１５−Ｘａａ＝Ｌｅｕ，Ｍｅｔ。また、１−Ｃｙｓと１７−Ｃｙｓの間でジスルフィド結合が形成される。）。Description of SEQ ID NO: 1: A disulfide bond is formed between 6-Cys and 22-Cys.
Description of SEQ ID NO: 2: A disulfide bond is formed between 37-Cys and 53-Cys.
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 3: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 6-Cys and 22-Cys).
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 4: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 6-Cys and 22-Cys).
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 5: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 6-Cys and 22-Cys).
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 6: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 1-Cys and 17-Cys).
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 7: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 7-Cys and 23-Cys).
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 8: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 6-Cys and 22-Cys).
Description of the artificial sequence of SEQ ID NO: 9: CNP-22 derivative (where a disulfide bond is formed between 1-Cys and 17-Cys).
Description of artificial sequence of SEQ ID NO: 10: CNP-22 derivative (where 4-Xaa = Leu, Ile, Val; 5-Xaa = Lys, Leu, Met; 6-Xaa = Leu, Ile, Ala, Val; 11 -Xaa = Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; 12-Xaa = Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; 14-Xaa = Gly, Lys, Ala, Leu; 15-Xaa = Leu, Met Also, a disulfide bond is formed between 1-Cys and 17-Cys.)

Claims (51)

グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節炎症の治療剤又は予防剤。  A therapeutic or prophylactic agent for joint inflammation, comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient. 前記関節炎症が変形性関節症である、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 1, wherein the joint inflammation is osteoarthritis. 前記変形性関節症が荷重関節の変形性関節症又は非荷重関節の変形性関節症である、請求項２に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 2, wherein the osteoarthritis is a load joint or a non-load joint. 前記変形性関節症が変形性膝関節症である、請求項３に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic agent or prophylactic agent according to claim 3, wherein the osteoarthritis is knee osteoarthritis. 前記変形性関節症が変形性股関節症である、請求項３に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 3, wherein the osteoarthritis is hip osteoarthritis. 前記変形性関節症が顎関節症である、請求項３に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic agent or prophylactic agent according to claim 3, wherein the osteoarthritis is temporomandibular disorder. 前記関節炎症が関節リウマチに起因する、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or preventive agent according to claim 1, wherein the joint inflammation is caused by rheumatoid arthritis. 前記関節炎症が変形性関節症に起因する、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 1, wherein the joint inflammation is caused by osteoarthritis. 前記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）又はその誘導体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to any one of claims 1 to 8, wherein the GC-B activator is C-type natriuretic peptide (CNP) or a derivative thereof. 前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、請求項９に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 9, wherein the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans. 前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項９に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 9, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. 前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項９に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 9, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. 少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent according to claim 1, further comprising at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug. ＧＣ−Ｂ活性化物質を有効成分として含むことを特徴とする、関節軟骨細胞増殖促進剤。  An articular chondrocyte proliferation promoter comprising a GC-B activator as an active ingredient. 前記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、請求項１４に記載の増殖促進剤。  The growth promoting agent according to claim 14, wherein the GC-B activator is CNP or a derivative thereof. 前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、請求項１５に記載の増殖促進剤。  The growth promoter according to claim 15, wherein the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans. 前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項１５に記載の増殖促進剤。  The growth promoter according to claim 15, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. 前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項１５に記載の増殖促進剤。  The growth promoting agent according to claim 15, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. 少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項１４に記載の増殖促進剤。  15. The growth promoter of claim 14, further comprising at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug. ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節炎症を抑制することを特徴とする、関節炎症の抑制方法。  A method for suppressing joint inflammation, comprising suppressing joint inflammation by activating GC-B. 前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、請求項２０に記載の抑制方法。  The suppression method according to claim 20, wherein the GC-B is activated by CNP or a derivative thereof. 前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、請求項２１に記載の抑制方法。  The suppression method according to claim 21, wherein the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans. 前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項２１に記載の抑制方法。  The suppression method according to claim 21, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. 前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項２１に記載の抑制方法。  The suppression method according to claim 21, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. 前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、請求項２０に記載の抑制方法。  21. The method of inhibiting according to claim 20, wherein the GC-B is activated by a combination of CNP or a derivative thereof and at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug. ＧＣ−Ｂを活性化することによって関節軟骨細胞の増殖を促進することを特徴とする、関節軟骨細胞の増殖促進方法。  A method for promoting articular chondrocyte proliferation, comprising activating GC-B to promote articular chondrocyte proliferation. 前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体によって活性化される、請求項２６に記載の増殖促進方法。  27. The method according to claim 26, wherein the GC-B is activated by CNP or a derivative thereof. 前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２又はＣＮＰ−５３である、請求項２７に記載の増殖促進方法。  28. The method according to claim 27, wherein the CNP is CNP-22 or CNP-53 derived from mammals or birds including humans. 前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項２７に記載の増殖促進方法。  28. The method of promoting proliferation according to claim 27, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. 前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項２７に記載の増殖促進方法。  28. The method of promoting proliferation according to claim 27, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. 前記ＧＣ−Ｂが、ＣＮＰ又はその誘導体と少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬との組み合わせによって活性化される、請求項２６に記載の増殖促進方法。  27. The method according to claim 26, wherein the GC-B is activated by a combination of CNP or a derivative thereof and at least one non-steroidal anti-inflammatory drug. ＧＣ−Ｂの活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、関節軟骨細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。  A screening method for an articular chondrocyte proliferation promoter comprising screening a candidate drug for the promotion of articular chondrocyte proliferation using the activity of GC-B as an index. ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項３２に記載のスクリーニング方法。  Preparation of cultured cells expressing articular chondrocytes or cells derived from articular chondrocytes, culturing the cells in the presence of a candidate drug, and using the GC-B activity of the cell as an index, the candidate drug for promoting proliferation of articular chondrocytes The screening method according to claim 32, comprising screening. 前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、請求項３２又は請求項３３に記載のスクリーニング方法。  The screening method according to claim 32 or claim 33, wherein the GC-B activity is measured as an intracellular cGMP production amount. ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として関節軟骨細胞の増殖促進について候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項３２に記載のスクリーニング方法。  A cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed is prepared, the cell line is cultured in the presence or absence of a candidate drug, the amount of intracellular cGMP produced in the cell line is measured, and the presence of the candidate drug 33. The screening method according to claim 32, comprising screening a candidate drug for promoting the proliferation of articular chondrocytes using as an index the difference in the amount of intracellular cGMP produced in the absence and absence. ＧＣ−Ｂの活性を指標として、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤のスクリーニング方法。  A screening method for a therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation, comprising screening a candidate drug for a therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using the activity of GC-B as an index. ＧＣ−Ｂを発現する培養細胞又は関節軟骨細胞由来の細胞を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、該細胞のＧＣ−Ｂ活性を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項３６に記載のスクリーニング方法。  Preparation of cultured cells or articular chondrocyte-derived cells expressing GC-B, culturing the cells in the presence of a candidate drug, and using the GC-B activity of the cells as an index, osteoarthritis, rheumatoid arthritis or arthritis 37. A screening method according to claim 36, comprising screening a candidate drug for treating symptom. 前記ＧＣ−Ｂ活性が、細胞内ｃＧＭＰ産生量として測定される、請求項３６又は３７に記載のスクリーニング方法。  The screening method according to claim 36 or 37, wherein the GC-B activity is measured as an intracellular cGMP production amount. ＧＣ−Ｂを強制発現させた培養細胞株を準備し、該細胞株を候補薬剤の存在下又は非存在下で培養し、該細胞株の細胞内ｃＧＭＰの産生量を測定し、候補薬剤の存在下と非存在化での細胞内ｃＧＭＰ産生量の差を指標として変形性関節症、関節リウマチあるいは関節炎症治療剤の候補薬剤をスクリーニングすることを含む、請求項３６に記載のスクリーニング方法。  A cultured cell line in which GC-B is forcibly expressed is prepared, the cell line is cultured in the presence or absence of a candidate drug, the amount of intracellular cGMP produced in the cell line is measured, and the presence of the candidate drug 37. The screening method according to claim 36, comprising screening a candidate drug for the treatment of osteoarthritis, rheumatoid arthritis or joint inflammation using as an index the difference in the amount of intracellular cGMP produced between the absence and absence. グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、変形性関節症の治療剤又は予防剤。  A therapeutic or prophylactic agent for osteoarthritis comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient. 少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項４０に記載の変形性関節症の治療剤又は予防剤。  41. The therapeutic or prophylactic agent for osteoarthritis according to claim 40, further comprising at least one non-steroidal anti-inflammatory drug. グアニルシクラーゼＢ（ＧＣ−Ｂ）活性化物質を有効成分として含む、関節リウマチの治療剤又は予防剤。  A therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis, comprising a guanyl cyclase B (GC-B) activator as an active ingredient. 少なくとも１つの非ステロイド性抗炎症薬をさらに含む、請求項４２に記載の、関節リウマチの治療剤又は予防剤。  The therapeutic or prophylactic agent for rheumatoid arthritis according to claim 42, further comprising at least one nonsteroidal anti-inflammatory drug. 非ステロイド性活性化剤を含む、ＧＣ−Ｂ活性化物質に対する活性化促進剤。  An activation promoter for a GC-B activator comprising a non-steroidal activator. 前記ＧＣ−Ｂ活性化物質が、ＣＮＰ又はその誘導体である、請求項４４に記載の活性化促進剤。  45. The activation promoter according to claim 44, wherein the GC-B activator is CNP or a derivative thereof. 前記ＣＮＰが、ヒトを含む哺乳類又は鳥類由来のＣＮＰ−２２及びＣＮＰ−５３から選択される、請求項４５に記載の活性化促進剤。  46. The activation promoter according to claim 45, wherein the CNP is selected from CNP-22 and CNP-53 derived from mammals or birds including humans. 前記ＣＮＰが、配列番号１のＣＮＰ−２２又は配列番号２のＣＮＰ−５３である、請求項４５に記載の活性化促進剤。  46. The activation promoter according to claim 45, wherein the CNP is CNP-22 of SEQ ID NO: 1 or CNP-53 of SEQ ID NO: 2. 前記誘導体が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しかつＣＮＰ活性を有するものである、請求項４５に記載の活性化促進剤。  46. The activation promoter according to claim 45, wherein the derivative is one in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and has CNP activity. 前記非ステロイド性活性化剤がシクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤である、請求項４４に記載の活性化促進剤。  45. The activation promoter according to claim 44, wherein the non-steroidal activator is a cyclooxygenase enzyme inhibitor. 前記シクロオキシゲナーゼ酵素抑制剤がインドメタシン、イブプロフェン、ピロキシカム、サリチル酸、ジクロフェナク、ケトプロフェン、ナプロキセン及びピロキシカムからなる群より選択される、請求項４９に記載の活性化促進剤。  50. The activation promoter according to claim 49, wherein the cyclooxygenase enzyme inhibitor is selected from the group consisting of indomethacin, ibuprofen, piroxicam, salicylic acid, diclofenac, ketoprofen, naproxen and piroxicam. 請求項４４〜５０のいずれかに記載の活性化促進剤を使用することを特徴とする、ＧＣ−Ｂ活性化物質の活性化方法。  A method for activating a GC-B activator comprising using the activation promoter according to any one of claims 44 to 50.
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