JPWO2005085223A1 - Composition for prevention and / or treatment of bone disease, functional food or health food containing the composition, and pharmaceutical preparation comprising the composition as an active ingredient - Google Patents

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Abstract

天然物由来の安全なフラボノイド化合物を有効成分とする骨疾患の予防及び/又は治療作用を有する医薬品、機能性食品又は健康食品として提供することを目的とする。少なくとも1種以上の下記式(I)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物を提供する。[化1](式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる基を表す。ここで、R1又はR3には糖又はその誘導体が結合していてもよく、R1、R2、R3及びR5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。なお、R1〜R6が同時に水素原子となることはない。)。It aims at providing as a pharmaceutical, a functional food, or a health food which has the prevention and / or treatment action of the bone disease which uses the safe flavonoid compound derived from a natural product as an active ingredient. Pharmaceutical composition for prevention and / or treatment of bone disease comprising at least one compound represented by the following formula (I), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof: Offer things. [Wherein R1 to R6 each represents a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydroxyl group and a methoxy group. Here, R1 or R3 may be linked to a sugar or a derivative thereof; When R1, R2, R3 and R5 are hydroxyl groups, sugars may be bonded to any of them to form a glycoside, and R1 to R6 simultaneously become hydrogen atoms. No.)

Description

本発明は、生薬成分由来のフラボノイドのうち、下記式(I)で表されるフラボン類の用途に関する。より詳細には、下記式(I)で表されるフラボン類、又は生理学的に許容されるこれらの塩若しくは水和物を少なくとも1種以上含有してなる健康食品、機能性食品、骨疾患の予防及び/又は治療効果を有する医薬組成物、並びに前記医薬組成物を有効成分として含有する医薬製剤に関する。   The present invention relates to the use of flavones represented by the following formula (I) among flavonoids derived from crude drug components. More specifically, a health food, a functional food, or a bone disease containing at least one flavone represented by the following formula (I) or a physiologically acceptable salt or hydrate thereof: The present invention relates to a pharmaceutical composition having a prophylactic and / or therapeutic effect, and a pharmaceutical preparation containing the pharmaceutical composition as an active ingredient.

(式中、R1、R2、R3、R5及びR6はそれぞれ水素原子又は水酸基を表し、R4は水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、R1、R2、R3及びR5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。なお、R1〜R6が同時に水素原子となることはない。)。(Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 5 and R 6 each represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R 4 represents a functional group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydroxyl group and a methoxy group. , R 1 , R 2 , R 3 and R 5 are hydroxyl groups, a sugar may be bonded to any of them to form a glycoside, R 1 to R 6 Are not simultaneously hydrogen atoms.)

骨疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等の外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン(以下、「PTH」ということがある。)血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化とに大別される。   Bone diseases include exogenous diseases such as traumatic fractures and fatigue fractures, osteoporosis, osteoporosis, hypercalcemia, hyperparathyroid hormone (hereinafter sometimes referred to as “PTH”), and bone paget. It is roughly divided into bone tissue weakness caused by diseases, arthritis, rheumatism, breast cancer bone metastasis, osteomalacia, malignant tumors and other diseases, and bone tissue weakness due to nutritional disorders.

ヒトの骨は、骨芽細胞と破骨細胞とによる再形成と吸収とを絶えず繰り返している。このため、骨芽細胞による骨形成を破骨細胞による骨吸収が上回ったときに、骨組織の脆弱化が生じて上記のような骨多孔症や骨粗鬆症をはじめとする内因性の骨疾患が生じるといわれている。   Human bones are constantly remodeling and resorbing with osteoblasts and osteoclasts. Therefore, when bone formation by osteoclasts exceeds bone resorption by osteoclasts, the bone tissue is weakened and endogenous bone diseases such as osteoporosis and osteoporosis as described above occur. It is said that.

こうした内因性の骨疾患の中でも、骨多孔症や骨粗鬆症は高齢化社会の進展に伴って増加しつつある。また、食生活の変化と運動量の低下に伴って、カルシウムの摂取量の低下や骨組織への定着率の低下が生じ、骨組織の脆弱化が加速されている。   Among these endogenous bone diseases, osteoporosis and osteoporosis are increasing with the progress of an aging society. In addition, along with changes in dietary habits and a decrease in exercise, a decrease in calcium intake and a decrease in the rate of colonization of bone tissue occur, and the weakening of bone tissue is accelerated.

骨折は、骨組織のある部分の連絡が外力によって断たれた状態をいい、骨折部位に著明な疼痛を伴う。健常人の場合には、例えば、交通事故等によってかなり大きな外力がかからない限り骨折は起こらないが、骨量が低下して骨組織が弱くなると、歩いたり走ったりしている最中にころんだ等、さほど大きくない外力がかかっただけでも骨折が起こる。また、上記のような骨粗鬆症や骨多孔症等の内因性の疾患に起因して骨量が低下している場合には、階段で躓いたり、咳込んだりしたときにかかるわずかな外力によっても骨折が生じるようになる。   A fracture refers to a state in which communication with a part of bone tissue is disconnected by an external force, and is accompanied by significant pain at the fracture site. In the case of a healthy person, for example, a fracture does not occur unless a considerable external force is applied due to a traffic accident, etc., but when the bone mass decreases and the bone tissue weakens, it falls while walking or running, etc. Even if an external force that is not so great is applied, a fracture occurs. In addition, when bone mass is reduced due to intrinsic diseases such as osteoporosis and osteoporosis as described above, fractures can be caused by slight external force applied when crawling or coughing on stairs. It comes to occur.

骨折が起こると、一般的には、ずれている骨の位置を牽引等によって修正し、ボルトやピンで固定できる場合には固定し、その後は患者の自然治癒力に委ねるという治療方法が採用されている。   When a fracture occurs, a treatment method is generally adopted in which the position of the displaced bone is corrected by traction, etc., and if it can be fixed with bolts or pins, it is fixed and then left to the patient's natural healing power. ing.

一方、骨多孔症や骨粗鬆症の内因性の疾患では骨の石灰質と骨基質とがともに減少しているため自然治癒が遅れ、高齢者の場合にはその間に骨折部位以外の関節が固まって動かなくなり、寝たきりになるといったケースも少なくない。   On the other hand, in endogenous diseases such as osteoporosis and osteoporosis, both bone mineral and bone matrix decrease, so natural healing is delayed. There are many cases where people are bedridden.

特許出願平10−372842Patent application 10-372842 Molteni, A., et al. : In vitro hormonal effects of soybean isoflavones, J. Nutr. 125, 3S, 751 (1995).Molteni, A., et al .: In vitro hormonal effects of soybean isoflavones, J. Nutr. 125, 3S, 751 (1995). Anthony, M.S., et al. : Soybean isoflavones improve cardiovascular risk factors without affecting the reproductive system of peripubertal rhesus monkeys, J. Nutr. 126, 43 (1996).Anthony, M.S., et al .: Soybean isoflavones improve cardiovascular risk factors without affecting the reproductive system of peripubertal rhesus monkeys, J. Nutr. 126, 43 (1996). 奥田拓男:フラボノイド、天然物化学改訂第2版(三橋博他編)、p.203、(南江堂、1986)Takuo Okuda: Flavonoids, Natural Product Chemistry Revision 2nd Edition (Hiroshi Mitsuhashi et al.), P.203, (Nanedo, 1986)

したがって、骨折の治療において治癒に要する期間を短縮することについては、強い社会的な要請がある。そして、医薬品として使用するためには、治療効果が高いものであると同時に、副作用が少ない等の安全性の高いものでなければならない。   Therefore, there is a strong social demand for shortening the time required for healing in the treatment of fractures. And in order to use it as a pharmaceutical, it must have a high therapeutic effect and a high safety such as few side effects.

従来は、活性型ビタミンD3、カルシトニン及びその誘導体や、エストラジオールを初めとするホルモン剤、各種のカルシウム製剤等が臨床的に使用されてきた。Conventionally, active vitamin D 3 , calcitonin and its derivatives, hormonal agents such as estradiol, various calcium preparations and the like have been clinically used.

しかし、こうした薬剤は吸収や代謝の関係から経口投与ができない場合もあり、また、受容体レベルの個人差が大きいために効果の予見性に欠けるといった問題もあった。このため、これらに代わる新たな治療剤が求められていた。   However, there are cases where such drugs cannot be administered orally due to absorption and metabolism, and there is a problem that the predictability of the effect is lacking due to large individual differences in the receptor level. For this reason, a new therapeutic agent to replace these has been demanded.

一方、骨疾患の患者数を減少させる最も有効な手段は、骨疾患の予防である。一般的には、疾患の予防は、どの程度疾患の発症に近い段階にあるかによって、予防用医薬製剤の投与、機能性食品等の食品の摂取等が行われる。   On the other hand, the most effective means for reducing the number of patients with bone disease is prevention of bone disease. Generally, prevention of a disease involves administration of a prophylactic pharmaceutical preparation, intake of food such as a functional food, etc. depending on how close the disease is to the onset.

骨疾患においても、上述したように発症した患者に対する治療手段ばかりでなく、未発症者又は健常人が罹患しないようにするための有効な予防手段に対する社会的な要請がある。   In bone diseases as well, there is a social demand not only for therapeutic means for patients who have developed symptoms as described above, but also for effective preventive means for preventing unaffected or healthy people from being affected.

本発明は、上記のような状況の下で、完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、安全性の高さに留意しつつ、古くから生薬として使用されてきた植物に含まれる成分を中心として、骨吸収抑制作用を有する化合物のスクリーニングを進めた結果、公知の化合物に従来全く知られていなかった活性があることを見出し、本発明を完成したものである。   The present invention has been completed under the above circumstances. That is, the inventors of the present invention have advanced screening of compounds having an inhibitory action on bone resorption, focusing on components contained in plants that have been used as herbal medicines for a long time, while paying attention to high safety. The present inventors have found that a known compound has an activity that has not been known so far, and thus completed the present invention.

こうしたスクリーニングの結果、カテキンとフラボノールに、破骨細胞の分化を阻害する活性があることが明らかになった。しかし、上記の化合物は阻害活性が低かったり、細胞のDNAを損傷するといった問題点があり、医薬品や食品成分として使用することには適さないものであった。   As a result of such screening, it was revealed that catechin and flavonol have an activity of inhibiting osteoclast differentiation. However, the above compounds have problems such as low inhibitory activity and damage to cellular DNA, and are not suitable for use as pharmaceuticals or food ingredients.

一方、ダイゼイン(Daidzein)、グリシチン(Glycitin)、及びゲニスチン(Genistein)等の大豆由来のイソフラボン類に女性ホルモン様作用があることが見出され、これらには心筋梗塞を予防する作用があることが報告されている(非特許文献1及び2)。   On the other hand, soy-derived isoflavones such as daidzein, glycitin, and genistin have been found to have a female hormone-like action, and they have the effect of preventing myocardial infarction. It has been reported (Non-Patent Documents 1 and 2).

また、フラボン類について見ると、生薬であるオウゴン(scutellariae radix)由来のフラボノイドであるバイカレイン(Baicalein)、オウゴニン(Wogonin)等には、培養細胞における血管平滑筋細胞の増殖抑制作用があることが知られている(特許文献1)。   As for flavones, baicalein, wogonin, and other flavonoids derived from the herbal medicine scutellariae radix have an inhibitory effect on the proliferation of vascular smooth muscle cells in cultured cells. (Patent Document 1).

さらに、ルテオリン(luteolin)、アピゲニン(apigenin)等のフラボン類を食品成分として摂取すると、血液、循環器、消化器等の代謝性疾患を予防するということが報告されている(非特許文献3)。   Furthermore, when flavones such as luteolin and apigenin are ingested as food ingredients, it is reported that metabolic diseases such as blood, circulatory organs, digestive organs, etc. are prevented (Non-patent Document 3). .

しかし、上記のようなフラボン類が破骨細胞の活性を抑制するや骨吸収抑制効果を有することについては、これまで報告されたものはない。   However, there has been no report on flavones such as those described above that suppress the activity of osteoclasts or suppress bone resorption.

本発明の発明者らは、以上のような状況の下で、破骨細胞による骨吸収を抑制する化合物のスクリーニングを進め、こうした作用を持ち、かつ安全性が高い、天然由来の化合物を見出し、本発明を完成したものである。   Under the circumstances as described above, the inventors of the present invention proceeded with screening for a compound that suppresses bone resorption by osteoclasts, and found a naturally occurring compound having such an action and high safety. The present invention has been completed.

すなわち、本発明は、少なくとも1種以上の下記式(I)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物である。   That is, the present invention relates to prevention and prevention of bone diseases comprising at least one compound represented by the following formula (I), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof. / Or a therapeutic pharmaceutical composition.

式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる基を表す。ここで、R1又はR3には糖又はその誘導体が結合していてもよく、R1、R2、R3及びR5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。前記糖は、グルコース、アピオース−グルコース、及びグルコピラノシドウロン酸からなる群から選ばれる糖である。なお、R1〜R6が同時に水素原子となることはない。In the formula, R 1 to R 6 each represent a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydroxyl group, and a methoxy group. Here, sugar or a derivative thereof may be bonded to R 1 or R 3, and when R 1 , R 2 , R 3, and R 5 are hydroxyl groups, sugar is present in any of them. It may combine to form a glycoside. The sugar is a sugar selected from the group consisting of glucose, apiose-glucose, and glucopyranoside uronic acid. R 1 to R 6 do not simultaneously become hydrogen atoms.

ここで、上記式(I)で表される化合物は、下記式(II)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、   Here, the compound represented by the above formula (I) is a compound represented by the following formula (II), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof,

下記式(III)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、 A compound represented by the following formula (III), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof,

下記式(IV)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、 A compound represented by the following formula (IV), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof,

及び下記式(V)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体 And a compound represented by the following formula (V), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof:

からなる群から選ばれる少なくとも1種以上の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を含有してなるものであることが好ましい。 It is preferable to contain at least one compound selected from the group consisting of these, or a physiologically acceptable salt or hydrate thereof.

さらに、上述した化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を2種以上混合して組成物とする場合には、上記式(I)〜(V)の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を含有するものとすることが好ましい。   Further, when two or more of the above-mentioned compounds, or physiologically acceptable salts or hydrates thereof are mixed to form a composition, the compounds of the above formulas (I) to (V), or these It preferably contains a physiologically acceptable salt or hydrate.

また、本発明は、上述した医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び/又は治療用医薬製剤である。   Moreover, this invention is a pharmaceutical formulation for the prevention and / or treatment of the bone disease which uses the pharmaceutical composition mentioned above as an active ingredient.

ここで、前記骨疾患の予防及び/又は治療用医薬製剤中における前記有効成分の含量は、製剤の1用量当たり0.1〜100mgであることが好ましく、0.1〜50mgであることがより好ましく、0.3〜10mgであることが特に好ましい。   Here, the content of the active ingredient in the pharmaceutical preparation for the prevention and / or treatment of the bone disease is preferably 0.1 to 100 mg, more preferably 0.1 to 50 mg per dose of the preparation. Preferably, it is 0.3-10 mg.

また、前記骨疾患の予防及び/又は治療用医薬製剤は、経口投与可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。   In addition, the pharmaceutical preparation for the prevention and / or treatment of bone disease is preferably an orally administrable dosage form, and is from the group consisting of tablets, powders, capsules, granules, pills, troches, and solutions. It is preferable to be selected.

ここで、前記骨疾患は、内因性骨疾患、外因性骨疾患、又は栄養障害のいずれに起因するものであってもよく、前記内因性骨疾患の場合には、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高PTH血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳癌の骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍、及び栄養障害からなる群から選ばれる疾患に起因する骨組織の脆弱化に起因するものである場合に、本発明の骨疾患の予防及び/又は治療用医薬製剤を好適に使用することができる。また、前記外因性骨疾患の場合には、外傷性骨折又は疲労骨折等の場合に好適に使用することができる。   Here, the bone disease may be caused by an endogenous bone disease, an exogenous bone disease, or a nutritional disorder. In the case of the endogenous bone disease, osteoporosis, osteoporosis, high Due to weakening of bone tissue due to a disease selected from the group consisting of calciumemia, hyper-PTHemia, Paget's disease of bone, arthritis, rheumatism, bone metastasis of breast cancer, osteomalacia, malignant tumor, and nutritional disorder Therefore, the pharmaceutical preparation for prevention and / or treatment of bone disease of the present invention can be preferably used. Moreover, in the case of the said exogenous bone disease, it can use suitably in the case of a traumatic fracture, a fatigue fracture, etc.

本発明はまた、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる機能性食品である。   The present invention is also a functional food comprising a composition comprising the compound described above, a physiologically acceptable salt thereof, a glycoside thereof and a hydrate.

機能性食品に添加するものとしては、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの水和物及び配糖体のうち、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものであることが好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩及びこれらの一水和物又は二水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。   Among the above-mentioned compounds, their physiologically acceptable salts, their hydrates and glycosides, those added to functional foods are those physiologically acceptable salts and hydrates. Are preferably selected from the group consisting of sodium salts, potassium salts, ammonium salts, magnesium salts and monohydrates or dihydrates thereof.

上記の機能性食品はまた、骨疾患の予防及び/又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。ここで、前記化合物、それらの生理学的に許容される塩、配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、100g当たり0.1〜5mgであることが好ましく、0.1〜3mgであることがより好ましい。これらの含有量を0.3〜1mgとすると、骨疾患の予防及び/又は治療を補助する効果が最も高くなる。   The functional food is also preferably used for assisting in the prevention and / or treatment of bone diseases. Here, the content of the compound, a physiologically acceptable salt thereof, a glycoside and a hydrate is preferably 0.1 to 5 mg per 100 g, More preferably, it is ˜3 mg. When the content is 0.3 to 1 mg, the effect of assisting the prevention and / or treatment of bone disease is the highest.

上記健康食品は、骨疾患の予防及び/又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。前記化合物、それらの生理学的に許容される塩、配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、100g当たり0.1〜5mgであることが好ましく、0.1〜3mgであることがより好ましい。これらの含有量を0.3〜1mgとすると、骨疾患の予防及び/又は治療を補助する効果が最も高くなる。   It is preferable that the health food is used for assisting the prevention and / or treatment of bone diseases. The content of the compound, those selected from the group consisting of physiologically acceptable salts, glycosides and hydrates thereof is preferably 0.1 to 5 mg per 100 g, preferably 0.1 to 3 mg. More preferably. When the content is 0.3 to 1 mg, the effect of assisting the prevention and / or treatment of bone disease is the highest.

本発明によれば、優れた破骨細胞形成の抑制作用並びに骨吸収抑制作用を有する、機能性食品、健康食品、骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物、健康食品、骨疾患の予防及び/又は治療剤が提供される。   According to the present invention, functional food, health food, pharmaceutical composition for prevention and / or treatment of bone disease, health food, bone disease prevention, which have excellent osteoclast formation inhibitory activity and bone resorption inhibitory effect. And / or therapeutic agents are provided.

図1は、50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)で刺激したMφRAW264細胞株に対するルテオリンの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果を示す図である。FIG. 1 is a graph showing the effect of luteolin concentration-inhibiting osteoclast differentiation on the MφRAW264 cell line stimulated with 50 ng / mL osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL). 図2は、50ng/mLのODF/RANKLで刺激したマウス骨髄由来M-CSF依存性細胞に対するルテオリンの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果の結果を示す図である。FIG. 2 is a graph showing the results of the concentration-dependent osteoclast differentiation inhibitory effect of luteolin on mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells stimulated with 50 ng / mL of ODF / RANKL. 図3Aは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン非存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 3A is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation and microscopic observation by a TRAP staining method after culturing the actin ring formed from the MφRAW264 cell line for 1 day in the absence of luteolin. 図3Bは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン3μM存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 3B is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation by a TRAP staining method and microscopic observation after culturing the actin ring formed from the MφRAW264 cell line for 1 day in the presence of 3 μM luteolin. 図3Cは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン10μM存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 3C is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation by a TRAP staining method and microscopic observation after culturing the actin ring formed from the MφRAW264 cell line for 1 day in the presence of 10 μM luteolin. 図3Dは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン30μM存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 3D is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation by a TRAP staining method and microscopic observation after culturing the actin ring formed from the MφRAW264 cell line for 1 day in the presence of 30 μM luteolin. 図4Aは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン非存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 4A is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation and microscopic observation by a TRAP staining method after culturing actin rings formed from mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells for 1 day in the absence of luteolin. 図4Bは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン3μM存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 4B is a photograph, which substitutes for a drawing, showing the results of confirmation by a TRAP staining method and microscopic observation after culturing an actin ring formed from mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells in the presence of 3 μM luteolin for 1 day. 図4Cは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン10μM存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 4C is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation and microscopic observation by a TRAP staining method after culturing an actin ring formed from mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells in the presence of 10 μM luteolin for 1 day. 図4Dは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン30μM存在下で1日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。FIG. 4D is a drawing-substituting photograph showing the results of confirmation and microscopic observation by a TRAP staining method after culturing an actin ring formed from mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells in the presence of 30 μM luteolin for 1 day. 図5Aは、象牙切片上にマウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞をルテオリン非存在下で12時間培養した後の、骨吸収窩(ピット)の形成を示す図面代用写真である。FIG. 5A substitutes a drawing showing the formation of bone resorption pits after osteoclasts prepared from co-culture of mouse bone marrow cells and osteoblasts on ivory slices for 12 hours in the absence of luteolin. It is a photograph. 図5Bは、象牙切片上にマウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞をルテオリン10μMの存在下で12時間培養した後の、骨吸収窩(ピット)の形成を示す図面代用写真である。FIG. 5B shows the formation of bone resorption pits after osteoclasts prepared from co-culture of mouse bone marrow cells and osteoblasts on ivory slices for 12 hours in the presence of 10 μM luteolin. It is a substitute photo. 図6は、マウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞に対するルテオリンの濃度依存的ピット形成抑制効果の結果を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the results of the luteolin concentration-dependent pit formation inhibitory effect on osteoclasts prepared from co-culture of mouse bone marrow cells and osteoblasts.

以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物に含まれる化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体は、フラボノイドに属し、下記式(I)で表される、フラボン類と称される化合物である。   The present invention is described in further detail below. The compound contained in the pharmaceutical composition for prevention and / or treatment of bone disease of the present invention, or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof, belongs to a flavonoid, and is represented by the following formula (I): It is a compound called flavones represented.

式中、R1、R2、R3、R5及びR6はそれぞれ水素原子又は水酸基を表し、R4は水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、R1、R2、R3及びR5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。なお、R1〜R6が同時に水素原子となることはない。In the formula, R 1 , R 2 , R 3 , R 5 and R 6 each represent a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R 4 represents a functional group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydroxyl group and a methoxy group. Here, when R 1 , R 2 , R 3 and R 5 are hydroxyl groups, sugars may be bonded to any of them to form a glycoside. R 1 to R 6 do not simultaneously become hydrogen atoms.

フラボノイドは、植物界に広く分布する、フェニルクロマン環に近いC6−C3−C6炭素骨格を有する化合物群の総称である。代表的な化合物群としては、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン、フラバン−3,4−ジオール、フラバン−3−オール、アントシアニジン、ネオフラバノイド、オーロン、カルコン、ジヒドロカルコン等が知られている。Flavonoid is a general term for a group of compounds having a C 6 -C 3 -C 6 carbon skeleton close to the phenylchroman ring widely distributed in the plant kingdom. As typical compound groups, flavones, isoflavones, flavonols, flavanones, flavans, flavan-3,4-diols, flavan-3-ols, anthocyanidins, neoflavanoids, aurones, chalcones, dihydrochalcones, etc. are known. .

フラボン類は、フラボンの骨格に、ヒドロキシル基、メトキシ基が結合した一群の化合物及びアルコキシ誘導体を含む物質群をいう。フラボン類は、その大部分が配糖体として高等植物及び下等植物のほぼ全組織に分布している。フラボン類は、それ以外のフラボノイドと異なり、O−グリコシドの他に、C−グリコシドが存在することが知られている。   The flavones refer to a group of substances including a group of compounds in which a hydroxyl group and a methoxy group are bonded to the flavone skeleton and an alkoxy derivative. Most of the flavones are distributed as glycosides in almost all tissues of higher plants and lower plants. Unlike other flavonoids, flavones are known to have C-glycosides in addition to O-glycosides.

上記式(I)で表される化合物又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体としては、例えば、下記式(II)で表されるルテオリン、   Examples of the compound represented by the above formula (I) or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof include, for example, luteolin represented by the following formula (II),

下記式(III)で表されるバイカレイン Baicalein represented by the following formula (III)

下記式(IV)で表されるアピゲニン Apigenin represented by the following formula (IV)

及び、下記式(V)で表されるオウゴニン And ougonin represented by the following formula (V)

又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を挙げることができる。これら以外にも、下記表1に示す化合物を例示することができる。 Or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof. In addition to these, the compounds shown in Table 1 below can be exemplified.

ルテオリンはマメ科の針葉樹Aspalathus linealisの葉(ルイボス茶)と小枝、アピゲニンはイネ科コウリャン(高粱、Sorghum nervosum)の実もしくは殻、バイカレインとオウゴニンはコガネバナ(Labiatae Scutellaria baicalensis Georgi)の根に豊富に含まれるフラボン類である。また、アピインはパセリやセロリの葉中に、ガルテオリンはスギナの葉中に含まるフラボン類である。   Luteolin is found in the leaves and branches of Aspalathus linealis, a leguminous conifer, apigenin is found in the roots or shells of sorghum nervosum, and baicalein and ougonin are abundant in the roots of Labiatae Scutellaria baicalensis Georgi Flavones. Apiin is a flavone contained in parsley and celery leaves, and garteolin is contained in horsetail leaves.

これらの生理学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。水和物としては、例えば、一水和物、二水和物等を挙げることができる。また、配糖体を形成するために結合する糖としては、例えば、グルコース、マンノース、グルコピラノース、アピオース−グルコース(アピオシルグルコース)等を挙げることができ、配糖体としては、例えば、ルテオリン 7−グルコシド及び上記表1及び2に示すアピゲニンの配糖体であるアピゲトリン(7−D−グリコシルアピゲニン)、アピイン(アピゲニン−7−アピオシルグルコシド)等を挙げることができる。   Examples of these physiologically acceptable salts include sodium salt, potassium salt, ammonium salt and the like. Examples of hydrates include monohydrate and dihydrate. Examples of sugars that are bonded to form glycosides include glucose, mannose, glucopyranose, and apiose-glucose (apiosylglucose). Examples of glycosides include luteolin 7 Examples include -glucoside and apigenin (7-D-glycosylapigenin), which is a glycoside of apigenin shown in Tables 1 and 2 above, apine (apigenin-7-apiosylglucoside), and the like.

上述した各種のフラボンは、単独で本発明の医薬組成物の製造に使用することもでき、必要に応じて2種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、これらの化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有する生薬を、単独で又は2種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。   The various flavones described above can be used alone for the production of the pharmaceutical composition of the present invention, and two or more kinds may be used in appropriate combination as necessary. In addition, these compounds, or herbal medicines containing these physiologically acceptable salts, hydrates or glycosides, can be used alone or in appropriate combination of two or more.

こうした生薬としては、例えば、オウゴン(scutellariae radix)、黄耆等を挙げることができる。   Examples of such herbal medicines include dragon (scutellariae radix) and jaundice.

上述した、式(II)で表されるルテオリン、式(III)で表されるバイカレイン、式(IV)で表されるアピゲニン、式(V)で表されるオウゴニン等のフラボン類は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造し、入手してもよく、市販品を購入して使用してもよい。   The above-mentioned flavones such as luteolin represented by formula (II), baicalein represented by formula (III), apigenin represented by formula (IV), and ougonin represented by formula (V) are known. It may be produced and obtained by a method or a method equivalent thereto, or a commercially available product may be purchased and used.

また、上記のフラボン類は、植物材料から抽出、単離することによって入手することもできる。例えば、植物材料からルテオリンを単離する方法の1例を示す。   Moreover, said flavones can also be obtained by extracting and isolating from plant material. For example, an example of a method for isolating luteolin from plant material is shown.

細切したマメ科の針葉樹Aspalathus linealis(ルイボス茶)の葉に含水メタノール又は含水エタノールを加えて抽出物を得る。得られた抽出物水に溶解したのち、石油エーテル、ベンゼン等の低極性溶媒を用いて脱脂する。ついで、ブタノールで抽出することにより、ブタノール相にルテオリン及びその類縁化合物が抽出される。ここで、ルテオリンの類縁化合物には、ルテオリンの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体が含まれる。   Water-containing methanol or water-containing ethanol is added to the leaves of Aspalathus linealis (rooibos tea), which is a finely divided legume, to obtain an extract. After dissolving in the obtained extract water, it is degreased using a low polarity solvent such as petroleum ether or benzene. Next, by extracting with butanol, luteolin and its related compounds are extracted into the butanol phase. Here, the related compounds of luteolin include physiologically acceptable salts, hydrates or glycosides of luteolin.

以上のようにして抽出されたルテオリン及びその類縁化合物は、粗精製物のまま使用することもできるが、必要に応じてさらに精製して精製標品を得ることもできる。この精製は常法によって行うことができる。例えば、シリカゲルを固定相とし、クロロホルム/メタノールを移動相とし、移動相中のメタノール含量を順次上げるステップグラジエントカラムクロマトグラフィーによって、ルテオリン及びその類縁化合物をそれぞれ溶出させ、精製し、黄色の針状結晶又は黄色の柱状結晶等として得ることができる。   The luteolin and its related compounds extracted as described above can be used as a crude product, but can be further purified as necessary to obtain a purified sample. This purification can be performed by a conventional method. For example, luteolin and its related compounds are eluted and purified by step gradient column chromatography using silica gel as the stationary phase, chloroform / methanol as the mobile phase, and sequentially increasing the methanol content in the mobile phase. Alternatively, it can be obtained as yellow columnar crystals.

上述したバイカレイン、アピゲニン、オウゴニンその他の上記式(I)で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体も同様にして抽出、精製することができる。   The baicalein, apigenin, ougonin and other compounds represented by the above formula (I), or physiologically acceptable salts, hydrates or glycosides can be extracted and purified in the same manner.

以上のようにして得られた上記式(I)で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体は、以下のようにして医薬組成物とすることができる。   The compound represented by the above formula (I) obtained as described above, or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside can be made into a pharmaceutical composition as follows. .

ルテオリンを単独で医薬組成物とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合し、医薬組成物とすればよい。   When luteolin is used alone as a pharmaceutical composition, the crystals obtained as described above are treated according to a conventional method and mixed with excipients and the like described later to obtain a pharmaceutical composition.

また、ルテオリンとバイカレインとを組み合わせて使用する場合には、ルテオリン1に対してバイカレインを0.1〜10の割合として適宜混合し、この混合物をルテオリン単独の場合と同様にして医薬組成物とすればよい。   When luteolin and baicalein are used in combination, baicalein is appropriately mixed with luteolin 1 at a ratio of 0.1 to 10, and this mixture is made into a pharmaceutical composition in the same manner as luteolin alone. That's fine.

これらの医薬組成物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また、顆粒剤には、コーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。   Pharmaceutical preparations containing these pharmaceutical compositions as active ingredients include injections, suppositories, aerosols, transdermal absorption agents and other parenterals, tablets, powders, capsules, pills, troches, liquids and other Oral agents and the like can be mentioned. Here, the tablets include sugar-coated tablets, coated tablets, and buccal tablets, and the capsules include both hard capsules and soft capsules. Granules also include coated granules. The above liquid preparations include suspensions, emulsions, syrups, elixirs and the like, and syrups include dry syrups.

なお、上述した各製剤には、徐放化されていないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。 Note that each of the above-mentioned preparations includes not only those that have not been sustained-released but also those that have been sustained-released.

こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製造に際して薬理学的に許容され得る日本薬局方に記載の担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。   Such preparations are produced according to known pharmacological production methods using carriers, excipients, disintegrants, lubricants, coloring agents, etc. described in the Japanese Pharmacopoeia that are pharmacologically acceptable in the production of the preparations. be able to.

こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。   Examples of such carriers and excipients include lactose, glucose, sucrose, mannitol, potato starch, corn starch, calcium carbonate, calcium phosphate, calcium sulfate, crystalline cellulose, licorice powder, and gentian powder.

結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を挙げることができる。   Examples of the binder include starch, tragacanth gum, gelatin, syrup, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinyl pyrrolidone, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, carboxymethyl cellulose and the like.

崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール等を使用することができる。   Examples of disintegrants include starch, agar, gelatin powder, sodium carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium bicarbonate, and sodium alginate. Examples of lubricants include magnesium stearate, talc, and hydrogenation. Vegetable oil, macrogol, etc. can be used.

着色剤、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。   Any colorant can be used as long as it is allowed to be added to pharmaceuticals, and is not particularly limited. In addition to these, flavoring agents, flavoring agents, and the like can be appropriately used as necessary.

錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。   In the case of tablets or granules, as required, sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, purified shellac, gelatin, glycerin, sorbitol, ethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose phthalate acetate, It may be coated with hydroxypropylmethylcellulose phthalate, methyl methacrylate, methacrylic acid polymer, or the like, and may be coated with a plurality of layers.

さらに、顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。   Furthermore, granules and powders can be packed into capsules such as ethyl cellulose and gelatin to form capsules.

上記の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、pH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。   When preparing an injection using the above compounds, or physiologically acceptable salts, hydrates and glycosides thereof, a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, Solubilizing agents can also be added.

上述したような骨疾患予防及び/又は治療剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、成人1日当たり1mg/kg〜2,000mg/kg、好ましくは1mg/kg〜1,000mg/kg程度を、経口又は非経口的に、1日1回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよい。上記のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。   When a bone disease preventive and / or therapeutic agent as described above is administered to a patient, the dosage varies depending on various conditions such as the severity of the patient's symptoms, age, weight, and health status. In general, 1 mg / kg to 2,000 mg / kg, preferably 1 mg / kg to 1,000 mg / kg per day for an adult is administered orally or parenterally once or more times a day. Good. The frequency and amount of administration may be increased or decreased as appropriate according to the above conditions.

ルテオリン単独、またはルテオリンと他のフラボン類、例えば、バイカレインとを含有する医薬組成物が有効成分として製剤中に含まれる場合には、当該組成物中におけるルテオリンの含有量は、0.1〜100mgであることが好ましく、より好ましくは0.1〜50mg、さらに好ましくは0.3〜10mgである。   When a pharmaceutical composition containing luteolin alone or luteolin and other flavones such as baicalein is contained in the preparation as an active ingredient, the content of luteolin in the composition is 0.1 to 100 mg It is preferably 0.1 to 50 mg, more preferably 0.3 to 10 mg.

有効成分であるルテオリンや他のフラボン類の含有量が下限値未満では骨吸収抑制作用が十分に発揮されず、逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を越えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。   When the content of the active ingredient luteolin or other flavones is less than the lower limit value, the bone resorption suppressing action is not sufficiently exhibited. Conversely, even if the content exceeds the upper limit value, the effect corresponding to the added amount is not exhibited. Further, when the upper limit is exceeded, cytotoxicity may be exerted during administration, which may cause undesirable side effects on the living body.

上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、骨疾患の予防及び/又は治療効果を有する機能性食品、若しくは健康食品を提供することができる。   By appropriately adding the above-described composition of the present invention as necessary, a functional food or a health food having a bone disease prevention and / or treatment effect can be provided.

本明細書において、「機能性食品」とは、その食品自体が本来含有している栄養素によって、その食品を摂取した者に供与できる以上の利益を与え得る成分を含有する食品をいう。   In the present specification, the “functional food” refers to a food containing a component that can provide more benefits than can be provided to a person who has consumed the food by the nutrients originally contained in the food.

また、「健康食品」とは、健康の維持・増進に役立つ成分を抽出し、製造した粗生成物又は精製物を主成分とする粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤をいい、日頃不足しがちな栄養成分の摂取を補助するサプリメントも含むものとする。   “Health foods” refers to powders, granules, tablets, and capsules based on crude products or refined products produced by extracting ingredients that are useful for maintaining and improving health. It also includes supplements that assist in the intake of other nutritional components.

本発明の組成物は、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して、機能性食品とすることができる。   The composition of the present invention includes, for example, bread, cookies and biscuits, cooked wheat and millet, udon, buckwheat, pasta and other noodles, cheese, yogurt and other dairy products, jam, mayonnaise, miso, soy sauce and other soy products. , Tea, coffee and cocoa, soft drinks, fruit drinks and other non-alcoholic drinks, medicinal liquors and other alcoholic drinks, candy, chocolate and other snacks, chewing gum, rice crackers, sheepskin and other sweets made from soybeans And it can be set as a functional food.

なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の組成物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。   In addition, when adding to the above-mentioned yogurt, soy sauce, beverages, etc., in order to prevent the composition of the present invention from crystallizing and precipitating among them, a dissolution aid or a stabilizer may be added as appropriate. it can.

また、本発明の組成物を単独で、又は2種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。   Moreover, it can be set as a health food by making the composition of this invention individually or in mixture of 2 or more types, and setting it as a powder agent, a granule, a tablet, and a capsule according to a conventional method.

ここで、本発明の組成物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。   Here, in order to make the composition of the present invention a powder, the extract obtained in the production process is concentrated and dried using a method such as freeze drying, spray drying, vacuum drying, sample mill, blender, The dried solid may be pulverized with a mixer or the like. Moreover, you may add corn starch, potato starch, dextrin, cyclodextrin, oyster shell powder, etc. as needed.

また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。   The powder obtained as described above may be appropriately added with the above-described binder and compressed into tablets. After making into tablets, the above-described coating agents such as sucrose or gelatin may be used to form sugar-coated tablets, or other coating agents may be used to make enteric solvents and the like.

さらに、上述のようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。   Furthermore, the powder obtained as described above can be made into granules according to a conventional method to produce granules. Moreover, it can also be set as a capsule by filling the above-mentioned capsule with the above-mentioned powder and granule in an appropriate amount.

以下に、本発明について、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

(実施例1)
(1−1)破骨細胞形成試験
破骨細胞形成試験には、破骨細胞様細胞に分化する、マクロファージRAW264細胞株(理化学研究所、cell番号RCB0535、以下、「MφRAW264」ということがある。)を使用した。MφRAW264の培養には、10%のウシ胎児血清(旭テクノグラス株式会社(IWAKI)、カタログ番号IWK-500)を含むα-MEM(INVITROGEN社製、カタログ番号11900-024)を使用した。また、破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)はPEPRO TECH INC社製、カタログ番号 310-01を使用した。
Example 1
(1-1) Osteoclast Formation Test In the osteoclast formation test, there is a macrophage RAW264 cell line (RIKEN, cell number RCB0535, hereinafter referred to as “MφRAW264”) that differentiates into an osteoclast-like cell. )It was used. For the cultivation of MφRAW264, α-MEM (manufactured by INVITROGEN, catalog number 11900-024) containing 10% fetal bovine serum (Asahi Techno Glass Co., Ltd. (IWAKI), catalog number IWK-500) was used. As the osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL), catalog number 310-01 manufactured by PEPRO TECH INC was used.

ルテオリンは、和光純薬工業株式会社製、カタログ番号129-04001を使用した。また、96ウェルマイクロプレート及び直径100mmのディッシュは、INVITROGEN社製、カタログ番号161093及び172958をそれぞれ使用した。   For luteolin, catalog number 129-04001 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. Also, catalog numbers 161093 and 172958 manufactured by INVITROGEN were used for the 96-well microplate and the dish having a diameter of 100 mm, respectively.

エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、塩化ナトリウムは和光純薬工業(株)より購入して使用した。   Ethanol, acetone, formaldehyde, and sodium chloride were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and used.

(1−2)破骨細胞形成試験I
骨吸収の抑制を評価するin vitro試験法として、MφRAW264細胞株からの破骨細胞形成試験を行った。破骨細胞試験の評価は、初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)活性の測定とTRAP染色とによって行った。これら2つの指標を用いることにより、MφRAW264細胞の破骨細胞への分化に対するフラボン類の活性を定量的に評価することができる。
(1-2) Osteoclast formation test I
As an in vitro test method for evaluating the inhibition of bone resorption, an osteoclast formation test from the MφRAW264 cell line was performed. The osteoclast test was evaluated by measuring tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, which is an early differentiation marker, and TRAP staining. By using these two indicators, the activity of flavones for differentiation of MφRAW264 cells into osteoclasts can be quantitatively evaluated.

MφRAW264細胞株を10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したα−MEM培地(以下、「10%FBS−MEM」ということがある。)に懸濁し、100mm径のディッシュに1×105 cells/10mLで接種し、5%CO2 存在下、37℃にて3日間培養し、ディッシュ内で当該細胞が集密的(confluent、コンフルエント)になっていることを確認して培養を終了した。ついで、その後、コンフレントになった細胞をディッシュから0.05%のトリプシン、0.53mMのEDTAを含むハンクスバッファー(0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA/HBSS(INVITROGEN社製、カタログ番号25300-054)で処理してはがし、10%FBS-MEMに懸濁して、96ウェルマイクロプレートの各ウェルに0.4×104 cells/0.1mLで接種し、上記と同様の条件で1日間培養した。The MφRAW264 cell line is suspended in α-MEM medium (hereinafter sometimes referred to as “10% FBS-MEM”) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), and 1 × 10 5 cells in a 100 mm diameter dish. / inoculated with 10 mL, 5% CO 2 presence and cultured for 3 days at 37 ° C., the cells in the dish and the culture was terminated after confirming that become confluent (confluent, confluent). Then, the confluent cells were treated with Hanks buffer (0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA / HBSS (INVITROGEN, catalog number 25300-054) containing 0.05% trypsin and 0.53 mM EDTA from the dish. Peeled off, suspended in 10% FBS-MEM, inoculated into each well of a 96-well microplate at 0.4 × 10 4 cells / 0.1 mL, and cultured for 1 day under the same conditions as described above.

破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)を10%FBS-MEMに溶解し、100ng/mLの溶液を調製した。また、ルテオリンを10mMの濃度でメタノールに溶解したものを、ストック溶液として調製し、−20℃で保管した。ルテオリンによる処理を行うに際して、ストック溶液を希釈し、処理濃度のそれぞれの100倍濃度(3mM、1mM、300μM、100μM、及び3μM)の溶液を調製し、溶媒の終濃度が1%未満になるように、各ウェルに(2μLずつ)添加した。対照群には、等量のメタノールを添加した。以下の実験で使用したルテオリンは、上記の各濃度の溶液を使用した。   Osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL) was dissolved in 10% FBS-MEM to prepare a 100 ng / mL solution. A solution obtained by dissolving luteolin in methanol at a concentration of 10 mM was prepared as a stock solution and stored at −20 ° C. When performing treatment with luteolin, dilute the stock solution and prepare solutions with concentrations 100 times the respective treatment concentrations (3 mM, 1 mM, 300 μM, 100 μM, and 3 μM) so that the final concentration of the solvent is less than 1%. (2 μL each) was added to each well. An equal amount of methanol was added to the control group. As the luteolin used in the following experiments, solutions having the respective concentrations described above were used.

ODF/RANKLを96ウェルすべてに0.1mLずつ添加(RANKLの終濃度50ng/mL)するとともに、ルテオリン溶液をウェルに添加した(ルテオリンの終濃度は、それぞれ、0.3μM、1μM、3μM、10μM及び30μM)。対照群となるウェルには、ルテオリンを含まないメタノールを等量添加した。   0.1 mL of ODF / RANKL was added to all 96 wells (final concentration of RANKL 50 ng / mL), and the luteolin solution was added to the wells (the final concentrations of luteolin were 0.3 μM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, and 30 μM, respectively). ). An equal amount of methanol containing no luteolin was added to the control wells.

5%CO2 存在下、37℃にて3日間培養した後に、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)活性を以下のようにして測定した。
96ウェルマイクロプレートの各ウェルの培養液を捨て、このプレートをリン酸緩衝生理食塩水溶液(PBS)で洗浄したのち、10%ホルムアルデヒドを含有するPBS(以下、「10%HCHO-PBS」ということがある。)を各ウェルに満たし、細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液(1:1)を用いて室温で1分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェル内における細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性の測定(以下、「TRAPアッセイ」ということがある。)と、染色とを行った。
After culturing at 37 ° C. for 3 days in the presence of 5% CO 2 , tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity was measured as follows.
Discard the culture solution in each well of the 96-well microplate, wash the plate with phosphate buffered saline solution (PBS), and then PBS containing 10% formaldehyde (hereinafter referred to as “10% HCHO-PBS”). Was filled into each well and the cells were fixed at room temperature for 15 minutes. Furthermore, it fixed for 1 minute at room temperature using the ethanol-acetone solution (1: 1). After fixing, the fixing solution was discarded and dried at room temperature. After drying, measurement of the tartrate-resistant acid phosphatase activity of the cells in each well (hereinafter sometimes referred to as “TRAP assay”) and staining were performed.

培養細胞内のTRAP活性の測定は、3.7mMのp−ニトロフェノール−リン酸水素二ナトリウム及び10mMの酒石酸を含有する50mMのクエン酸緩衝液(pH4.6)を用いて行った。この緩衝液を各ウェル当たり、0.1mLずつ添加し、37℃で30分間反応させた。30分後に、0.1MのNaOHを0.1mLずつ添加することにより反応を停止させ、遊離したp−ニトロフェノールを分光光度計(大日本製薬(株)製)を用いて、測定波長405nmで測定した。   The TRAP activity in the cultured cells was measured using a 50 mM citrate buffer (pH 4.6) containing 3.7 mM p-nitrophenol-disodium hydrogen phosphate and 10 mM tartaric acid. 0.1 mL of this buffer was added to each well and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After 30 minutes, the reaction was stopped by adding 0.1 mL of 0.1 M NaOH, and the released p-nitrophenol was measured at a measurement wavelength of 405 nm using a spectrophotometer (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). .

尚、破骨細胞形成試験の結果は、対照群(コントロール)のTRAP活性を100としたときの対照群に対する相対値(%)で表した。   In addition, the result of the osteoclast formation test was expressed as a relative value (%) with respect to the control group when the TRAP activity of the control group (control) was 100.

さらに、細胞内の酒石酸耐性酸ホスファターゼの状態をTRAP染色法により確認した。TRAP染色液は基質としてNaphtol AS-MX phosphate(SIGMA社製、カタログ番号N-4875)5 mgを0.5 mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、色素としてFast red violet LB salt(SIGMA社製、カタログ番号F-1625)30 mgを50 mlの50 mM 酒石酸ナトリウム/0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)に溶解したものを合わせて使用した。すなわち、TRAPアッセイの場合と同様に、培養後、培地を除去した。PBSで細胞層を洗浄したのち、10%HCHO-PBSを用いて細胞を室温で15分間固定した。ついで、エタノール−アセトン溶液(1:1)を用いて室温でさらに1分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、TRAP染色液(を加え、室温にて20〜30分間染色した。染色後、染色液を捨て、流水により洗浄し、乾燥させた後、顕微鏡で観察した。結果を図1に示す。   Furthermore, the state of intracellular tartrate-resistant acid phosphatase was confirmed by TRAP staining. The TRAP staining solution is obtained by dissolving 5 mg of Naphtol AS-MX phosphate (SIGMA, catalog number N-4875) as a substrate in 0.5 ml of N, N-dimethylformamide, and then using Fast red violet LB salt (SIGMA) as a dye. Manufactured and catalog number F-1625) dissolved in 50 ml of 50 mM sodium tartrate / 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) were used together. That is, as in the case of the TRAP assay, the medium was removed after culturing. After washing the cell layer with PBS, the cells were fixed with 10% HCHO-PBS for 15 minutes at room temperature. Subsequently, it was further fixed at room temperature for 1 minute using an ethanol-acetone solution (1: 1). After the fixation, the fixing solution was discarded and dried at room temperature. After drying, TRAP stain (added and stained for 20 to 30 minutes at room temperature. After staining, the stain was discarded, washed with running water, dried and observed with a microscope. The results are shown in FIG.

図1中、破骨細胞形成試験 Iの結果で得られた細胞内のTRAP活性の測定結果を、黒い棒グラフとして示した。図1から明らかなように、ルテオリンの添加によって濃度依存的にTRAP活性が抑制されることが示された。このことから、ルテオリンによってMφRAW264細胞からの破骨細胞形成が抑制されることが明らかになった。   In FIG. 1, the measurement results of intracellular TRAP activity obtained as a result of osteoclast formation test I are shown as black bar graphs. As apparent from FIG. 1, it was shown that the addition of luteolin suppresses TRAP activity in a concentration-dependent manner. This revealed that luteolin suppressed osteoclast formation from MφRAW264 cells.

(実施例2)増殖細胞数測定試験
(2−1)材料等
細胞株、培地、血清、96ウェルマイクロプレート、直径100mmのディッシュ、ルテオリン等は、実施例1で使用したのと同様のものを使用した。破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)の10%FBS-MEM溶液、及びルテオリンのメタノール溶液も実施例1と同様に調整した。
(Example 2) Proliferation cell number measurement test (2-1) Materials, etc. Cell lines, medium, serum, 96-well microplate, dish with a diameter of 100 mm, luteolin, etc. are the same as those used in Example 1. used. A 10% FBS-MEM solution of osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL) and a methanol solution of luteolin were prepared in the same manner as in Example 1.

(2−2)増殖細胞数測定実験
細胞増殖および細胞の生存率を定量化するためのnon−RI法としてXTTによる呈色反応を用いた。MφRAW264細胞株を10%FBS-MEM培地に懸濁し、96ウェルマイクロプレートに0.4×104 cells/0.1mLで接種し1日間培養した。この後、破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)の10%FBS-MEM溶液(100ng/mL)を各ウェルに0.1mLずつ添加した(RANKLの終濃度50ng/mL)。これと同時に、ルテオリンの各濃度の溶液をウェルに添加した。なお、対照群には、ルテオリンを含有しないメタノールのみを等量添加した。
(2-2) Proliferating cell number measurement experiment Color reaction by XTT was used as a non-RI method for quantifying cell proliferation and cell viability. The MφRAW264 cell line was suspended in 10% FBS-MEM medium, inoculated into a 96-well microplate at 0.4 × 10 4 cells / 0.1 mL, and cultured for 1 day. Thereafter, 0.1 mL of a 10% FBS-MEM solution (100 ng / mL) of osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL) was added to each well (final concentration of RANKL 50 ng / mL). At the same time, each concentration of luteolin was added to the wells. In the control group, only an equal amount of methanol containing no luteolin was added.

培養開始3日後に、市販のCell Proliferation Kit II(ロシュ・ダイアグノスティクス社製、カタログ番号 1 465 015)を用いて細胞増殖を定量し、細胞生存率を求めた。操作は、添付の取扱説明書に従って実施したが、その概要は以下の通りである。   Three days after the start of culture, cell proliferation was quantified using a commercially available Cell Proliferation Kit II (Roche Diagnostics, catalog number 1 465 015) to determine cell viability. The operation was performed according to the attached instruction manual, and the outline is as follows.

キットに含まれているXTT標識試薬と電子カップリング試薬とを50:1で混ぜ、各ウェルに添加されている培地0.1mL当たり50μLずつを加えて、37℃にて4時間反応させた。反応終了後、ELISAプレートリーダー(大日本製薬(株)製)を用いて、690nmを対照波長として、波長492nmにおける吸光度を測定した。   The XTT labeling reagent and the electronic coupling reagent contained in the kit were mixed at a ratio of 50: 1, 50 μL was added per 0.1 mL of the medium added to each well, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 4 hours. After completion of the reaction, absorbance at a wavelength of 492 nm was measured using an ELISA plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) with 690 nm as the control wavelength.

測定結果は、各濃度のルテオリン処理群の細胞生存率を、対照群の細胞生存率を100としたときの対照群に対する相対値(%)で表した。結果を図1に示す。   The measurement results were expressed as a relative value (%) relative to the control group when the cell viability of the luteolin treatment group at each concentration was 100 as the cell viability of the control group. The results are shown in FIG.

図1中、増殖細胞数測定実験の結果得られた細胞生存率の測定結果を、白抜きの棒グラフとして示した。図1から明らかなように、ルテオリンの濃度が100倍に増加しても細胞生存率は約50%までしか低下しなかった。このことから、ルテオリンはMφRAW264細胞に対して非特異的な細胞毒性は示さないこと、及びMφRAW264細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが明らかにされた(IC50=1μM)。In FIG. 1, the measurement results of the cell viability obtained as a result of the experiment for measuring the number of proliferating cells are shown as white bar graphs. As is apparent from FIG. 1, the cell viability decreased only to about 50% even when the concentration of luteolin was increased 100-fold. From this, it was clarified that luteolin does not show non-specific cytotoxicity to MφRAW264 cells and significantly suppresses differentiation of MφRAW264 cells into osteoclasts by RANKL depending on the concentration. (IC 50 = 1 μM).

(実施例3)破骨細胞形成試験II
(3−1)材料等
実施例3においては、実施例1及び2で使用したMφRAW264細胞に代えて、in vitroにおける骨吸収の抑制を評価するために、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞を使用した。マウス骨髄由来細胞は、6〜9週齢のddYマウス(雄)(中部科学資材(株))から摘出した脛骨および大腿骨より採取した。
(Example 3) Osteoclast formation test II
(3-1) Materials In Example 3, instead of the MφRAW264 cells used in Examples 1 and 2, mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells were used in order to evaluate inhibition of bone resorption in vitro. used. Mouse bone marrow-derived cells were collected from tibias and femurs excised from 6-9 week old ddY mice (male) (Chubu Scientific Materials Co., Ltd.).

硫酸ストレプトマイシン及びペニシシンGナトリウム(INVITROGEN社製、カタログ番号15140-122)、腫瘍増殖因子β(TGF-β、SIGMA社製、カタログ番号T-7039)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、PEPRO TECH INC社製、カタログ番号300-25)以外は、実施例1と同様のものを使用した。実施例1と同様に細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ルテオリンによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。   Streptomycin sulfate and penicin G sodium (INVITROGEN, catalog number 15140-122), tumor growth factor β (TGF-β, SIGMA, catalog number T-7039), macrophage colony stimulating factor (M-CSF, PEPRO TECH INC) Except for catalog number 300-25), the same one as in Example 1 was used. As in Example 1, the activity for differentiation into osteoclasts by luteolin was evaluated using the measurement of intracellular TRAP activity and TRAP staining as indicators.

(3−2)破骨細胞形成試験II
6〜9週齢のddYマウスから脛骨及び大腿骨を摘出した。これらの脛骨及び大腿骨から、22G×1と1/4の注射針をつけた注射器で押し出すことにより、骨髄細胞を採取した。
(3-2) Osteoclast formation test II
The tibia and femur were removed from 6-9 week old ddY mice. Bone marrow cells were collected from these tibia and femur by extruding with a syringe equipped with 22G × 1 and 1/4 needle.

得られた骨髄細胞を、100U/mLのペニシリンGナトリウム塩、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、50ng/mLのM-CSF、及び1ng/mLのTGF-βを含む10%FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに、1×106 cells/0.1mL/ウェルで播種し、5%CO2、37℃の条件下で培養した。The obtained bone marrow cells were suspended in 10% FBS-MEM containing 100 U / mL penicillin G sodium salt, 100 μg / mL streptomycin sulfate, 50 ng / mL M-CSF, and 1 ng / mL TGF-β. A 96-well microplate was seeded at 1 × 10 6 cells / 0.1 mL / well and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.

培養開始3日後、50ng/mLのM-CSF及び50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)を含む培地に交換すると同時に、実施例1と同じ濃度に調整したルテオリンを添加した。なお、対照群としては、M-CSF及びODF/RANKLは含有しているが、ルテオリンを含有していない上記の培地に交換した。5%CO2、37℃の条件下でさらに培養した。Three days after the start of culture, the medium was replaced with a medium containing 50 ng / mL M-CSF and 50 ng / mL osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL), and at the same time, luteolin adjusted to the same concentration as in Example 1 was added. As a control group, the medium was replaced with the above medium containing M-CSF and ODF / RANKL but not containing luteolin. The cells were further cultured under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.

培地交換の後、1.5日後に、破骨細胞初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性を測定した。各ウェルの培養液を捨て、プレートをPBSで洗浄したのち、10%HCHO/PBSを用いて、ウェル内の細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液(1:1)を用い、室温で1分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)活性の測定と染色とを、実施例1と同様に行った。結果を図2に示す。   1.5 days after the medium change, the tartrate-resistant acid phosphatase activity, which is an osteoclast early differentiation marker, was measured. The culture solution in each well was discarded, and the plate was washed with PBS. Then, cells in the well were fixed for 15 minutes at room temperature using 10% HCHO / PBS. Furthermore, it fixed for 1 minute at room temperature using the ethanol-acetone solution (1: 1). After fixing, the fixing solution was discarded and dried at room temperature. After drying, the measurement and staining of the tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity of the cells in each well were performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG.

図2中、ルテオリンを添加した培地中で培養した骨髄細胞内のTRAP活性の測定結果を黒塗りの棒グラフとして示した。   In FIG. 2, the measurement results of TRAP activity in bone marrow cells cultured in a medium supplemented with luteolin are shown as black bars.

また、マウスの骨髄細胞を用いた増殖細胞数測定実験も実施例2と同様に行い、細胞生存率を測定した。結果を図2に示す。図2中、細胞の生存率を白抜きの棒グラフとして示した。TRAP活性及び増殖細胞数測定実験の結果は、いずれも、対照群のこれらを100としたときの対照群に対する相対値(%)で表した。   In addition, an experiment for measuring the number of proliferating cells using mouse bone marrow cells was performed in the same manner as in Example 2 to measure the cell viability. The results are shown in FIG. In FIG. 2, the cell viability was shown as a white bar graph. The results of the TRAP activity and proliferating cell count measurement experiments were all expressed as a relative value (%) relative to the control group when the control group was taken as 100.

図2に示されるように、ルテオリンの添加によって、濃度依存的にTRAP活性が抑制された。このことは、破骨細胞の形成がルテオリンによって濃度依存的に阻害されることを示す。また、XTTアッセイ(増殖細胞数測定実験)の結果から、ルテオリンが非特異的な細胞毒性を示さないことも明らかになった。以上より、ルテオリンは、非特異的な細胞毒性は示さず、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが示された(IC50=3μM)。As shown in FIG. 2, the addition of luteolin inhibited TRAP activity in a concentration-dependent manner. This indicates that osteoclast formation is inhibited in a concentration-dependent manner by luteolin. The results of XTT assay (expanded cell count measurement experiment) also revealed that luteolin did not show nonspecific cytotoxicity. From the above, it was shown that luteolin does not show non-specific cytotoxicity and significantly suppresses the differentiation of mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cells into osteoclasts by RANKL depending on the concentration ( IC 50 = 3 μM).

(実施例4)破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成試験I
(4−1)材料等
MφRAW264細胞、ウシ胎児血清、α―MEM、ODF/RANKL、96ウェルマイクロプレート、ルテオリンは、実施例1と同様のものを使用し、同様に調製して使用した。PD98059は(CALBIOCHEM社製、カタログ番号153000)を使用した。
(Example 4) Formation test I of an actin ring which is an osteoclast activation structure I
(4-1) Materials
MφRAW264 cells, fetal bovine serum, α-MEM, ODF / RANKL, 96-well microplate, and luteolin were prepared in the same manner as in Example 1 and used. PD98059 (CALBIOCHEM, catalog number 153000) was used.

(4−2)アクチンリングの形成試験I
MφRAW264細胞株を、10%FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに0.8×10 cells/0.1mL/ウェルで接種し、5%CO2、37℃の条件で1日間培養した。この後、100ng/mLのODF/RANKLと20μMのPD98059とを含む上記の培地0.1mLを添加し、さらに同じ条件で培養した(RANKLの終濃度50ng/mL、PD98059の終濃度10μM)。
(4-2) Actin ring formation test I
The MφRAW264 cell line was suspended in 10% FBS-MEM, inoculated into a 96-well microplate at 0.8 × 10 5 cells / 0.1 mL / well, and cultured for 1 day under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Thereafter, 0.1 mL of the above medium containing 100 ng / mL ODF / RANKL and 20 μM PD98059 was added, and further cultured under the same conditions (final concentration of RANKL 50 ng / mL, final concentration of PD98059 10 μM).

活性化破骨細胞まで分化を進行させるため、ODF/RANKLとPD98059添加してから2日後に50ng/mLのODF/RANKLを含む上記の培地に交換して、破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成が確認されるまで、同様の条件で培養を続けた。アクチンリングが形成されたところで、実施例1と同様に調製したルテオリン溶液を添加し、さらに1日間培養した。なお、対照群のウェルには化合物を含まないメタノールのみを加えて、さらに1日培養を続けた。   In order to promote differentiation to activated osteoclasts, the osteoclast activation structure is obtained by replacing with the above medium containing 50 ng / mL of ODF / RANKL 2 days after addition of ODF / RANKL and PD98059. The culture was continued under the same conditions until the formation of the actin ring was confirmed. When the actin ring was formed, a luteolin solution prepared in the same manner as in Example 1 was added, and further cultured for 1 day. In addition, only methanol containing no compound was added to the wells of the control group, and the culture was further continued for 1 day.

ルテオリンを添加して1日培養した後に、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色を実施例1と同様に行った。結果を図3A〜Dに示す。   After adding luteolin and culturing for 1 day, the cells in each well were stained with tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIGS.

図3A〜Dに示されるように、対照群ではアクチンリング形成が認められたが(図3A)、ルテオリン処理群では3μM以上の濃度で処理した場合には、アクチンリングが濃度依存的に破壊されていることが示された(図3B〜D)。   As shown in FIGS. 3A to 3D, actin ring formation was observed in the control group (FIG. 3A), but in the luteolin-treated group, the actin ring was destroyed in a concentration-dependent manner when treated at a concentration of 3 μM or more. (FIGS. 3B-D).

アクチンリングはODF/RANKL及びPD98059で処理したMφRAW264細胞株の培養によって形成された破骨細胞の活性化構造体であることから、ルテオリンは、破骨細胞の分化だけでなく、活性化構造体の維持を阻害することによって骨吸収を抑制するものと考えられた。   Since the actin ring is an osteoclast activation structure formed by culturing the MφRAW264 cell line treated with ODF / RANKL and PD98059, luteolin is not only an osteoclast differentiation but also an activation structure It was thought to inhibit bone resorption by inhibiting maintenance.

(実施例5)破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成試験II
(5−1)材料等
硫酸ストレプトマイシン及びペニシシンGナトリウム、TGF-β、M-CSF以外のものは実施例1と同様のものを使用し、これらについては実施例3と同様のものを使用した。
(Example 5) Formation test II of an actin ring which is an osteoclast activation structure II
(5-1) Materials, etc. Except for streptomycin sulfate, penicillin G sodium, TGF-β, and M-CSF, the same ones as in Example 1 were used.

(5−2)アクチンリングの形成試験II
また、実施例3と同様にして、6〜9週齢のddYマウスの脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を採取した。
(5-2) Actin ring formation test II
In the same manner as in Example 3, bone marrow cells were collected from the tibia and femur of 6-9 week old ddY mice.

得られた骨髄細胞を、100U/mLのペニシリンGナトリウム塩、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、50ng/mLのM-CSF、及び1ng/mLのTGF-βを含む10%FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに、1×10 cells/0.1mL/ウェルで播種し、5%CO2、37℃の条件下で培養した。The obtained bone marrow cells were suspended in 10% FBS-MEM containing 100 U / mL penicillin G sodium salt, 100 μg / mL streptomycin sulfate, 50 ng / mL M-CSF, and 1 ng / mL TGF-β. A 96-well microplate was seeded at 1 × 10 6 cells / 0.1 mL / well and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.

培養開始3日後、50ng/mLのM-CSF及び50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)を含む培地に交換して、破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成が確認されるまで、同様の条件で培養を続けた。アクチンリングが形成されたところで、実施例1と同様に調製したルテオリン溶液を添加し、さらに1日間培養した。なお、対照群としては、交換した上記の培地に溶媒だけを添加した。   Three days after the start of the culture, the medium was replaced with a medium containing 50 ng / mL M-CSF and 50 ng / mL osteoclast differentiation inducing factor (ODF / RANKL), and the formation of an actin ring, an osteoclast activation structure, was observed. The culture was continued under the same conditions until confirmed. When an actin ring was formed, a luteolin solution prepared in the same manner as in Example 1 was added, and further cultured for 1 day. As a control group, only the solvent was added to the exchanged medium.

ルテオリンを添加して1日培養した後に、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)染色を実施例1と同様に行った。結果を図4A〜Dに示す。   After adding luteolin and culturing for 1 day, the cells in each well were stained with tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIGS.

図4A〜Dに示されるように、対照群ではアクチンリング形成が認められたが(図4A)、ルテオリン処理群では3μM以上の濃度で処理した場合には、アクチンリングが濃度依存的に破壊されていることが示された(図4B〜D)。   As shown in FIGS. 4A to D, actin ring formation was observed in the control group (FIG. 4A), but in the luteolin-treated group, the actin ring was destroyed in a concentration-dependent manner when treated at a concentration of 3 μM or more. (FIGS. 4B-D).

アクチンリングは、M-CSF及びTGF-β又はODF/RANKLの処理マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞の培養によって形成された破骨細胞の活性化構造体であることから、ルテオリンは、破骨細胞の分化だけでなく、活性化構造体の維持を阻害することによって骨吸収を抑制するものと考えられた。   Since the actin ring is an osteoclast activation structure formed by M-CSF and TGF-β or ODF / RANKL-treated mouse bone marrow-derived M-CSF-dependent cell culture, luteolin is an osteoclast. It was considered that bone resorption was suppressed by inhibiting not only cell differentiation but also maintenance of activated structures.

以上より、ルテオリンは、マクロファージ由来の株化細胞を培養した場合、及びマウスの骨髄細胞を培養した場合のいずれにおいても、それ自身がこれらの細胞に対して非特異的な細胞毒性は示すことなく、濃度依存的にRANKLによる破骨細胞への分化を強く抑制することが証明された。また、ルテオリンが濃度依存的にアクチンリングの維持を阻害したことから、活性化された破骨細胞による骨吸収を顕著に抑制することも示された。   Based on the above, luteolin does not exhibit non-specific cytotoxicity to these cells, either in the case of culturing cell lines derived from macrophages or in the case of culturing mouse bone marrow cells. It was proved that RANKL strongly inhibited osteoclast differentiation in a concentration-dependent manner. It was also shown that luteolin significantly inhibited bone resorption by activated osteoclasts because it inhibited actin ring maintenance in a concentration-dependent manner.

(実施例6)共存培養による破骨細胞形成及び骨吸収窩形成法
共存培養は、オブライエンらの方法(Charles A. O'Brien et al.; J. Biol. Chem. 274(27), 19301-19308 (1999))で樹立した細胞UAMS-32とマウスの大腿骨由来の骨髄細胞を用いて行った。
(Example 6) Osteoclast formation and bone resorption fossa formation method by co-cultivation Co-culture was performed by the method of O'Brien et al. (Charles A. O'Brien et al .; J. Biol. Chem. 274 (27), 19301- 19308 (1999)) and the bone marrow cells derived from mouse femur.

前記実施例3の方法で調製したマウス骨髄細胞(200×104 cells/ディッシュ)と骨芽細胞UAMS-32(100×104 cells/dish)を活性型ビタミンD3(和光純薬工業(株)製、カタログ番号 031−14281)10nM、プロスタグランジンE2(和光純薬工業(株)製、カタログ番号 163−10814)1mMを含むα-MEM培地(20ml)で懸濁した。その後、直径10cmのコラーゲンゲルコート培養ディッシュ上に5%CO2、37℃の条件下で6日間培養することによって破骨細胞分化を誘導させた。Active vitamin D 3 of the mouse bone marrow cells prepared in Example 3 of the method (200 × 10 4 cells / dish) and osteoblasts UAMS-32 (100 × 10 4 cells / dish) ( Wako Pure Chemical Industries (Co. ), Catalog number 031-14281) 10 nM, prostaglandin E 2 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number 163-10814) suspended in α-MEM medium (20 ml) containing 1 mM. Subsequently, osteoclast differentiation was induced by culturing on a collagen gel coat culture dish having a diameter of 10 cm for 6 days under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.

6日間培養後にコラゲナーゼ(和光純薬工業(株)製、カタログ番号 032−10534)を終濃度が0.1%になるように溶解させることによって破骨細胞を回収した。   After culturing for 6 days, osteoclasts were recovered by dissolving collagenase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., catalog number 032-10534) to a final concentration of 0.1%.

象牙切片(厚さ:約0.2m、直径:約4mm)を96穴のプレートに設置し、終濃度が10μMになるようにルテオリンを含んだα-MEM培地(100μl)を添加した。   An ivory slice (thickness: about 0.2 m, diameter: about 4 mm) was placed in a 96-well plate, and α-MEM medium (100 μl) containing luteolin was added to a final concentration of 10 μM.

上記共存培養系で得られた破骨細胞をα-MEM培地で適度に希釈し(約10ml/ディッシュ)、よく懸濁した。この破骨細胞懸濁液を100μl/wellずつ、細胞が象牙切片上に接着するように各ウェルに丁寧に添加した。12時間培養後、象牙切片上の骨吸収窩をトルイジンブル(toluidine blue溶液)(シグマ社製、カタログ番号 T3260-5G)で染色し、その吸収窩(ピット)をカウントした。   Osteoclasts obtained in the above coculture system were appropriately diluted with α-MEM medium (about 10 ml / dish) and well suspended. This osteoclast suspension was carefully added to each well in an amount of 100 μl / well so that the cells adhered onto the ivory slices. After culturing for 12 hours, the bone resorption pits on the ivory sections were stained with toluidine blue solution (manufactured by Sigma, catalog number T3260-5G), and the resorption pits (pits) were counted.

象牙切片上にマウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞を培養すると、培養12時間後に図5Aに示すように多数の骨吸収窩(ピット)を形成した。10μMのルテオリンの存在下で培養すると、図5Bのようにピット数が著しく減少した。   When osteoclasts prepared from co-culture of mouse bone marrow cells and osteoblasts were cultured on ivory slices, a number of bone resorption pits (pits) were formed as shown in FIG. 5A after 12 hours of culture. When cultured in the presence of 10 μM luteolin, the number of pits was significantly reduced as shown in FIG. 5B.

また、添加したルテオリンの濃度とピット数との関係を表したグラフを図6に示した。なお、培養細胞のルテオリンの添加方法及び添加量は、上記実施例1と同様の条件で行った。図6に示すとおり、ルテオリンが濃度依存的に破骨細胞によるピットの形成を抑制し、10μMの添加では95%以上の阻害活性を示した。   A graph showing the relationship between the concentration of added luteolin and the number of pits is shown in FIG. In addition, the addition method and addition amount of luteolin in cultured cells were performed under the same conditions as in Example 1 above. As shown in FIG. 6, luteolin suppressed the formation of pits by osteoclasts in a concentration-dependent manner, and showed an inhibitory activity of 95% or more when added at 10 μM.

上記より、ルテオリンは破骨細胞の初期分化を阻害するのみではなく成熟破骨細胞の骨吸収機能を直接的に抑制することが明らかとなり、骨吸収抑制剤として骨粗鬆症などの骨疾患の予防や改善効果が期待できる。   From the above, it is clear that luteolin not only inhibits the initial differentiation of osteoclasts but also directly suppresses the bone resorption function of mature osteoclasts, and as a bone resorption inhibitor, it prevents and improves bone diseases such as osteoporosis The effect can be expected.

ルテオリンは従来から生薬として使用されてきたフラボノイドの一種であることから、フラボン類を骨疾患の予防及び/又は抑制のための機能性食品、医薬組成物、及び医薬として有用であることが示された。   Luteolin is a kind of flavonoid that has been used as a herbal medicine so far, indicating that flavones are useful as functional foods, pharmaceutical compositions, and medicines for the prevention and / or suppression of bone diseases. It was.

(製剤例)
次に、本発明の組成物を含有する製剤例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(Formulation example)
Next, although the formulation example containing the composition of this invention is shown, this invention is not limited to these.

(製剤例1 錠剤)
(Formulation Example 1 Tablet)

上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後に圧縮打錠して重量300mgの錠剤を製造することができる。   Each of the above components is weighed and mixed uniformly, and then compressed and compressed to produce a tablet having a weight of 300 mg.

(製剤例2 硬カプセル剤)
(Formulation example 2 hard capsule)

上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、硬カプセルに300mgずつ充填することにより、硬カプセル剤を製造することができる。ここで、組成物1は、ルテオリンと乳糖とを1:1で混合したものである。なお、製剤例3〜6で使用する組成物1は上記と同じものである。   Each of the above components is weighed and uniformly mixed, and then hard capsules can be produced by filling hard capsules with 300 mg each. Here, the composition 1 is a mixture of luteolin and lactose at a ratio of 1: 1. In addition, the composition 1 used by the formulation examples 3-6 is the same as the above.

(製剤例3 軟カプセル剤)
(Formulation example 3 soft capsule)

上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、軟カプセルに100mgずつ充填することにより、軟カプセル剤を製造することができる。   Each of the above components is weighed and mixed uniformly, and then soft capsules can be produced by filling 100 mg each into soft capsules.

(製剤例4 顆粒剤)
(Formulation Example 4 Granules)

上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、常法に従って顆粒剤を製造することができる。   After each of the above components is weighed and mixed uniformly, a granule can be produced according to a conventional method.

(製剤例5 シロップ剤)
(Formulation Example 5 Syrup)

上記の成分をそれぞれ秤量し、糖及びサッカリンを注射用蒸留水60mLに溶解した後、グリセリン及びエタノールに溶解された組成物2及び調味料の溶液を加える。この混合物に精製水を加えて、最終容量を100mLにすることにより、経口投与用のシロップ剤を製造することができる。   Each of the above components is weighed, sugar and saccharin are dissolved in 60 mL of distilled water for injection, and then a composition 2 and a seasoning solution dissolved in glycerin and ethanol are added. By adding purified water to this mixture to a final volume of 100 mL, a syrup for oral administration can be produced.

(製剤例6 顆粒剤)
(Formulation example 6 granule)

上記の成分をそれぞれ秤量し、組成物3を常法によって珪酸カルシウムに吸着させて微粒子とし、散剤を製造することができる。   Each of the above components is weighed, and the composition 3 is adsorbed onto calcium silicate by a conventional method to form fine particles, whereby a powder can be produced.

式(I)の化合物を有効成分として含有する医薬組成物、医薬製剤、健康食品、機能性食品等の分野において有用である。
It is useful in the fields of pharmaceutical compositions, pharmaceutical preparations, health foods, functional foods and the like containing the compound of formula (I) as an active ingredient.

Claims (7)

少なくとも1種以上の下記式(I)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物。

(式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる基を表す。ここで、R1又はR3には糖又はその誘導体が結合していてもよく、R1、R2、R3及びR5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。前記糖は、グルコース、アピオース−グルコース、及びグルコピラノシドウロン酸からなる群から選ばれる糖である。なお、R1〜R6が同時に水素原子となることはない。)
Pharmaceutical composition for prevention and / or treatment of bone disease comprising at least one compound represented by the following formula (I), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof: object.

(In the formula, R 1 to R 6 each represents a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a hydroxyl group and a methoxy group. Here, R 1 or R 3 may be bound to a sugar or a derivative thereof; When R 1 , R 2 , R 3 and R 5 are hydroxyl groups, a sugar may be bonded to any of them to form a glycoside, which is glucose, apiose- (It is a sugar selected from the group consisting of glucose and glucopyranoside uronic acid, and R 1 to R 6 do not simultaneously become hydrogen atoms.)
下記式(II)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、
下記式(III)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、

下記式(IV)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、

及び下記式(V)で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体

からなる群から選ばれる少なくとも1種以上の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる、請求項1に記載の骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物。
A compound represented by the following formula (II), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof,
A compound represented by the following formula (III), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof,

A compound represented by the following formula (IV), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof,

And a compound represented by the following formula (V), or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof:

The bone disease prevention and / or claim 1 comprising at least one compound selected from the group consisting of: or a physiologically acceptable salt, hydrate or glycoside thereof. A therapeutic pharmaceutical composition.
請求項1又は2に記載の医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び/又は治療用医薬製剤。 A pharmaceutical preparation for preventing and / or treating a bone disease comprising the pharmaceutical composition according to claim 1 or 2 as an active ingredient. 請求項1に記載の化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる機能性食品。 A functional food comprising a composition comprising the compound according to claim 1, a physiologically acceptable salt thereof, a glycoside thereof, and a hydrate. 骨疾患の予防及び/又は治療を補助するために使用されるものであることを特徴とする、請求項4に記載の機能性食品。 The functional food according to claim 4, wherein the functional food is used for assisting in the prevention and / or treatment of a bone disease. 請求項1に記載の化合物、それらの生理学的に許容される塩、配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる健康食品。 A health food comprising a composition comprising the compound according to claim 1, a physiologically acceptable salt thereof, a glycoside, and a hydrate. 骨疾患の予防及び/又は治療を補助するために使用されるものであることを特徴とする、請求項6に記載の健康食品。
The health food according to claim 6, wherein the health food is used for assisting in the prevention and / or treatment of a bone disease.
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