JPWO2005038023A1

JPWO2005038023A1 - Expression method of active membrane protease protein complex using germinated baculovirus

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Publication number: JPWO2005038023A1
Application number: JP2005514875A
Authority: JP
Inventors: 岩坪　威; 威岩坪; 浜窪　隆雄; 隆雄浜窪; 泰輔富田; 児玉　龍彦; 龍彦児玉; 泰臣浦野; 幾雄林
Original assignee: Todai TLO Ltd
Current assignee: Todai TLO Ltd
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2006-12-28
Also published as: WO2005038023A1

Abstract

本発明は、膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法を提供する。The present invention relates to a method for culturing or breeding a host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane-type protease protein and a gene encoding a complex constituent, and in the germinated baculovirus released from the host, the membrane-type protease There is provided a method for expressing a membrane protease protein complex, characterized by expressing a complex of a protein and a complex constituent factor.

Description

本発明は、発芽バキュロウィルスを用いた膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法に関する。より詳細には、本発明は、宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型蛋白質複合体を発現させることを特徴とする、プロテアーゼ活性を有する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法に関する。 The present invention relates to a method for expressing a membrane protease protein complex using a germinated baculovirus. More specifically, the present invention relates to a method for expressing a membrane-type protease protein complex having protease activity, which comprises expressing a membrane-type protein complex in a germinated baculovirus released from a host.

バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルスの高発現蛋白質、特に多角体蛋白質（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子のプロモーターなどを利用して、目的遺伝子を昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）で組換えを起こさせて大量に発現させる系である。多角体遺伝子に組換えタンパク質をコードする遺伝子を導入し、発現したタンパク質を精製するバキュロウイルス発現系は、大腸菌やイースト菌を用いる発現系に比べ、膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも発現タンパク質が凝集を作りにくく、また糖鎖の付加や金属イオンの配位等のタンパク質の機能に必要な翻訳後修飾が生じるなど利点が多いため、膜受容体蛋白質の発現系として多用されている（ＴａｔｅＣＧ，ＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒＲ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９６，１４，ｐｐ４２６−４３０，ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；及び、ＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒＲ，ＴａｔｅＣＧ，ＱｕａｒｔｅｒｌｙＲｅｖｉｅｗｓｏｆＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ１９９５，２８，ｐｐ３１５−４２２，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｇｒａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｔｕｄｉｅｓ）。
バキュロウイルスには、多角体蛋白質を被った多角体ウイルスとなって核内に存在する他に、もう一つの生活環がある。すなわち、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に感染するために発芽型のウイルス（Ｂｕｄｄｅｄｖｉｒｕｓ）となり、この発芽型ウイルスがＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外に出るというものである。この際に、上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイルスのエンベロープ上に回収されることがＬｏｉｓｅｌらによって報告された（ＬｏｉｓｅｌＴＰ，ＡｎｓａｎａｙＨ，Ｓｔ−ＯｎｇｅＳ，ＧａｙＢ，ＢｏｕｌａｎｇｅｒＰ，ＳｔｒｏｓｂｅｒｇＡＤ，ＭａｒｕｌｌｏＳ，ＢｏｕｖｉｅｒＭ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ．１５（１２），ｐｐ１３００−１３０４，Ｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｒｏｍｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容体は、糖鎖構造など機能的でないものが多いのに対し、ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な蛋白質のみであることが報告されている。
また、ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）２、ＨＭＧ−ＣｏＡ（ヒドロキシメチルクルタリルコエンザイムＡ）還元酵素、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１Ｐ（ｓｉｔｅ１ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの小胞体（ＥＲ）膜又はゴルジ体膜に分布する膜蛋白質群（例えば細胞内コレステロールフィードバック調節に関与するもの）も、機能を保ったままウイルスエンベロープ上に発現されることが報告された（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｇ．，Ｓｈｉｒａｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．，Ｈａｍａｋｕｂｏ，Ｔ．，ａｎｄＫｏｄａｍａ，Ｔ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１５１，ｐ２９０，２０００，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎｓｏｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）。さらに、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ；Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、膜貫通ドメインを７つ持ち、３量体Ｇ蛋白質と共役（カップリング）しているが、受容体蛋白質とＧ蛋白質のサブユニットとを発現するウイルスを作成し、発芽ウイルス上で再構成することにより、親和性の高い受容体を得る事が可能であることが報告されている（ＭａｓｕｄａＫ，ＩｔｏｈＨ，ＳａｋｉｈａｍａＴ，ＡｋｉｙａｍａＣ，ＴａｋａｈａｓｈｉＫ，ＦｕｋｕｄａＲ，ＹｏｋｏｍｉｚｏＴ，ＳｈｉｍｉｚｕＴ，ＫｏｄａｍａＴ，ＨａｍａｋｕｂｏＴ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００３２７８（２７）：２４５５２−２４５６２，ＡｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＧｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｂｕｄｄｅｄｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ．ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒＧａｌｐｈａａｎｄＧａｌｐｈａｏｃｏｕｐｌｉｎｇｔｏａｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅＢ４ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）。
ところで、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は、大脳皮質の神経細胞の変性・脱落により、記憶を中心に広汎な知的機能の障害を呈する神経変性疾患であり、老年者に生じる痴呆の原因としては最も頻度が高い。ＡＤ脳においては、神経細胞脱落と表裏一体の関係をもってβアミロイドと呼ばれる異常タンパク質が蓄積することが特徴である（ＳｅｌｋｏｅＤＪ，ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ２００１，８１（２）：７４１−７６６．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ：ｇｅｎｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄｔｈｅｒａｐｙ．）。βアミロイドは、ＡＤ脳に老人斑、血管アミロイドの病理学的形態をとって蓄積し、生化学的には４０〜４２アミノ酸からなるＡβペプチドから構成される。Ａβは前駆体ＡＰＰから２段階の切断を受けて生成され、細胞外に分泌される。この第２段階目において、γ−セクレターゼと呼ばれる酵素の蛋白質分解活性によりＡＰＰのＣ末端断片は膜内部分で切断を受け、Ａβが形成されて細胞外に放出される。その切断部位には多様性があり、ＡβのＣ末端の９０％は４０位、１０％は４２位で生じるが（ＳｕｚｕｋｉＮｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４：１３３６，１９９４）、βアミロイドとしての凝集性はＡβ４２がより高く、ＡＤ脳においても初期から優先的に蓄積する（ＩｗａｔｓｕｂｏＴ，ＯｄａｋａＡ，ＳｕｚｕｋｉＮ，ＭｉｚｕｓａｗａＨ，ＮｕｋｉｎａＮ，ＩｈａｒａＹ．Ｎｅｕｒｏｎ．１９９４，１３（１）：４５−５３，ＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｂｅｔａ４２（４３）ａｎｄＡｂｅｔａ４０ｉｎｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅｓｗｉｔｈｅｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＡｂｅｔａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔａｎｉｎｉｔｉａｌｌｙｄｅｐｏｓｉｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓｉｓＡｂｅｔａ４２（４３）．）。
家族性ＡＤの主要な病因遺伝子の産物であるプレセニリン蛋白質（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ；ＰＳ）は、膜結合型アスパラギン酸性プロテアーゼであるγ−セクレターゼの触媒サブユニットに一致することが示されている（ＷｏｌｆｅＭＳ，ＸｉａＷ，ＯｓｔａｓｚｅｗｓｋｉＢＬ，ＤｉｅｈｌＴＳ，ＫｉｍｂｅｒｌｙＷＴ，ＳｅｌｋｏｅＤＪ（１９９９）Ｔｗｏｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｓｐａｒｔａｔｅｓｉｎｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１ｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓａｎｄｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ３９８（６７２７）：５１３−５１７；ＬｉＹＭ，ＸｕＭ，ＬａｉＭＴ，ＨｕａｎｇＱ，ＣａｓｔｒｏＪＬ，ＤｉＭｕｚｉｏＭｏｗｅｒＪ，ＨａｒｒｉｓｏｎＴ，ＬｅｌｌｉｓＣ，ＮａｄｉｎＡ，ＮｅｄｕｖｅｌｉｌＪＧ，ＲｅｇｉｓｔｅｒＲＢ，ＳａｒｄａｎａＭＫ，ＳｈｅａｒｍａｎＭＳ，ＳｍｉｔｈＡＬ，ＳｈｉＸＰ，ＹｉｎＫＣ，ＳｈａｆｅｒＪＡ，ＧａｒｄｅｌｌＳＪ（２０００）Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｄｉｒｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｌａｂｅｌｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１．Ｎａｔｕｒｅ２０００Ｊｕｎ８，４０５（６７８７）：６８９−９４．）。
また、γ−セクレターゼは、フラグメント型プレセニリンを含む、分子量２５０〜５００キロダルトン以上の巨大膜内複合体を形成し、膜蛋白質である複合体構成因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）と結合してプロテアーゼ活性を発揮することが明らかとなっている。そして、本発明者らは、プレセニリンに加えて、ニカストリン（ＮＣＴ）、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２と呼ばれる３種類の膜蛋白質が共同してγ−セクレターゼ複合体の基本骨格を形成することを明らかにした（ＴａｋａｓｕｇｉＮ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＨａｙａｓｈｉＩ，ＴｓｕｒｕｏｋａＭ，ＮｉｉｍｕｒａＭ，ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ＴｈｉｎａｋａｒａｎＧ，ＩｗａｔｓｕｂｏＴＮａｔｕｒｅ２００３，４２２：４３８−４４１Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｃｏｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅ γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ．）。さらに最近、プレセニリン様の膜蛋白質ファミリー分子が多数報告され、それらのうちひとつが新規プロテアーゼＳＰＰであることが明らかにされ、γ−セクレターゼ同様の膜結合型プロテアーゼが多数存在することが示唆されている（ＷｅｉｈｏｆｅｎＡ，ＭａｒｔｏｇｌｉｏＢ．Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｌｉｂｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．（２００３）ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３（２）：７１−７８）。
このような状況のもと、γ−セクレターゼはＡＤの治療標的として重視され、その阻害剤開発及び活性測定法の確立が重要と考えられてきた。しかし、膜内で蛋白質分解酵素活性を示し、複数の膜蛋白質からなるプロテアーゼ複合体として形成されるγ−セクレターゼを、活性を保った状態で再構成することは従来困難とされてきた。The baculovirus expression system uses a high expression protein of baculovirus, particularly a polyhedrin gene promoter, etc. to cause the target gene to be recombined in insect cells (Sf9 cells, etc.) and expressed in large quantities. It is a system. The baculovirus expression system, which introduces a gene encoding a recombinant protein into a polyhedron gene and purifies the expressed protein, is also expressed in proteins with many hydrophobic regions, such as membrane proteins, compared to expression systems using Escherichia coli and yeast. It is widely used as a membrane receptor protein expression system because it is difficult to form aggregates and has many advantages such as post-translational modifications necessary for protein functions such as addition of sugar chains and metal ion coordination ( Tate CG, Grisshammer R., Trends in Biotechnology 1996, 14, pp 426-430, Heterologous expression of G-protein-coupled receptors, and Grishammer R, TQ. eviews of Biophysics 1995,28, pp315-422, Overexpression of integral membrane proteins for structural studies).
Baculoviruses have another life cycle in addition to being present in the nucleus as polyhedron viruses covered with polyhedron proteins. That is, since the virus grows and infects other cells and individuals, it becomes a budding virus, and this budding virus covers the cell membrane of Sf9 cells and goes out of the cell. At this time, it was reported by Loisel et al. That the 7-transmembrane receptor recombined with the polyhedron protein was expressed on the Sf9 cell membrane and recovered on the germinated baculovirus envelope (Loisel TP). , Ananay H, St-Onge S, Gay B, Boulanger P, Strasberg AD, Marullo S, Bouvier M., Nat Biotechnol. 1997, Nov. 15 (12), pp1300-1304, Recovery of fever. (receptors from extracellular bacterial cells). It has been reported that seven-transmembrane receptors expressed in host cells are not functional, such as sugar chain structures, whereas the receptors recovered on the viral envelope are only functional proteins. ing.
In addition, SREBP (sterol regulatory element binding protein) 2, HMG-CoA (hydroxymethylcurtalyl coenzyme A) reductase, SCAP (SREBP cleavage activating protein), S1P (site 1 protein body) It has been reported that a group of membrane proteins distributed in the body membrane (for example, those involved in intracellular cholesterol feedback regulation) are also expressed on the viral envelope while maintaining the function (Ishihara, G., Shirai, H.,). Yamaguchi, M., Fukuda, R., Hamakubo, T., and Kodama, T., Atherosclerosis, 151, p290, 20 00, Expression of cholesterol regulatory proteins on extracellular baculoviruses). Furthermore, the G protein coupled receptor (GPCR) has seven transmembrane domains and is coupled (coupled) with the trimeric G protein. The receptor protein and the G protein are coupled to each other. It has been reported that a high-affinity receptor can be obtained by preparing a virus expressing a subunit and reconstituting on a budding virus (Masuda K, Itoh H, Sakihama T, Akiyama C, Takahashi K, Fukuda R, Yokomi T, Shimizu T, Kodama T, Hamabo T., J Biol Chem. 20037478 (27): 24552-2456, A ro te p reconstitution system on budded baculovirus.Evidence for Galpha and Galphao coupling to a human leukotriene B4 receptor.).
By the way, Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that presents a wide range of intellectual functional disorders centering on memory due to degeneration and loss of neurons in the cerebral cortex, and is a dementia that occurs in the elderly. The most frequent cause. In the AD brain, abnormal protein called β-amyloid accumulates in a relation of neuronal loss and inversion (Selkoe DJ, Physiol Rev 2001, 81 (2): 741-766. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy.). β-amyloid accumulates in the AD brain taking pathological forms of senile plaques and vascular amyloid, and is biochemically composed of Aβ peptides consisting of 40 to 42 amino acids. Aβ is produced from the precursor APP through two-step cleavage and is secreted extracellularly. In the second stage, the proteolytic activity of an enzyme called γ-secretase causes the C-terminal fragment of APP to be cleaved at the inner membrane portion, and Aβ is formed and released out of the cell. The cleavage sites are diverse, with 90% of the C-terminus of Aβ occurring at position 40 and 10% at position 42 (Suzuki Net al. Science 264: 1336, 1994), but the aggregation as β-amyloid is Aβ42 Is preferentially accumulated in the AD brain from the beginning (Iwatsubo T, Odaka A, Suzuki N, Mizuwa H, Nukina N, Ihara Y. Neuron. 1994, 13 (1): 45-53, Visualization of A beta 42 (43) and A beta 40 in Sensitive Plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially specified species A b ta 42 (43).).
Presenilin protein (PS), the product of the major etiology gene of familial AD, has been shown to match the catalytic subunit of γ-secretase, a membrane-bound aspartic protease (Wolfe MS, Xia W, Ostaszewski BL, Diehl TS, Kimberly WT, Selkoe DJ (1999) Two transmembrane aspartates in presenilin-1 required for presenilin endoproteolysis and gamma-secretase activity.Nature 398 (6727): 513-517; Li YM, Xu M, Lai MT, Huang Q, Castro JL, DiMuzio M wer J, Harrison T, Lellis C, Nadin A, Neduvelil JG, Register RB, Sardana MK, Shearman MS, Smith AL, Shi XP, Yin KC, Shafer sto stag sto sto site covalently label presenilin 1. Nature 2000 Jun 8, 405 (6787): 689-94.).
In addition, γ-secretase forms a giant intramembrane complex containing fragment-type presenilin and having a molecular weight of 250 to 500 kilodaltons or more, and binds to a complex factor (cofactor) that is a membrane protein to exert protease activity. It has become clear. And the present inventors have revealed that in addition to presenilin, three kinds of membrane proteins called nicastrin (NCT), APH-1 and PEN-2 jointly form the basic skeleton of the γ-secretase complex. (Takasugi N, Tomita T, Hayashi I, Tsuruoka M, Niimura M, Takahashi Y, Thinakaran G, Iwatsubo T Nature 2003, 422: 438-441 Ther. More recently, many presenilin-like membrane protein family molecules have been reported, and one of them has been revealed to be a novel protease SPP, suggesting that there are many membrane-bound proteases similar to γ-secretase. (Weifofen A, Martoglio B. Intrambrane-cleaving protocols: controlled liberation of proteins and bioactive peptides. (2003) Trends Cell Biol. 13: 2).
Under such circumstances, γ-secretase is regarded as an important therapeutic target for AD, and it has been considered important to develop an inhibitor and establish an activity measurement method. However, it has heretofore been difficult to reconstitute γ-secretase that exhibits proteolytic enzyme activity in the membrane and is formed as a protease complex composed of a plurality of membrane proteins while maintaining the activity.

本発明は、バキュロウイルスと昆虫細胞発現システムを用いて、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を発現させるための方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、γ−セクレターゼ複合体の構成分子であるプレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２を発現するウイルスを作成し、発芽ウイルス（Ｂｕｄｄｅｄｖｉｒｕｓ）上で再構成することにより、活性型γ−セクレターゼ複合体を得ることに成功した。このとき共感染によりγ−セクレターゼ複合体構成因子を発現させたＳｆ９細胞の膜画分では不活性型の蛋白質が大量に発現されているため、再構成された活性を測定しにくいという可能性があった。ところが、発芽型ウイルスには、活性型γ−セクレターゼ複合体が選択的に集積していた。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法。
（２）膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、培養物又は宿主個体から発芽バキュロウイルスを回収し、得られる回収物から活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の製造方法。
（３）上記（１）又は（２）記載の発明において、膜型プロテアーゼ蛋白質としてはプレセニリンが挙げられ、複合体構成因子としてはニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が挙げられる。これらのプロテアーゼ及び複合体構成因子により形成される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体は、γ−セクレターゼである。
また、上記（１）又は（２）記載の方法において、宿主として昆虫細胞又は昆虫幼虫が使用される。
（４）膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主が放出する、発芽バキュロウイルス。
ここで、膜型プロテアーゼ蛋白質としては、プレセニリンが挙げられ、複合体構成因子としてはニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が挙げられる。
上記発芽バキュロウイルスは、膜型プロテアーゼ蛋白質及び複合体構成因子により形成される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）を含有する。
また、宿主として昆虫細胞又は昆虫幼虫が使用される。
（５）上記発芽バキュロウイルスから採取される、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体。膜型プロテアーゼ蛋白質複合体としては、例えばγ−セクレターゼが挙げられる。
（６）活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）と相互作用する物質を分析する方法であって、標識された被験物質と上記複合体とを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを含む前記方法。
さらに、本発明は、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）の酵素活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、被験物質と上記複合体とを接触させた後、当該複合体のプロテアーゼ活性を測定することを含む方法を提供する。
（７）上記活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）が配列されたプロテインチップ。An object of the present invention is to provide a method for expressing an active membrane protease protein complex using a baculovirus and an insect cell expression system.
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have created a virus that expresses presenilin, nicastrin, APH-1 and PEN-2, which are constituent molecules of the γ-secretase complex. reconstituted on virus) and succeeded in obtaining an active γ-secretase complex. At this time, since a large amount of inactive protein is expressed in the membrane fraction of Sf9 cells in which the γ-secretase complex constituent factor is expressed by co-infection, there is a possibility that it is difficult to measure the reconstituted activity. there were. However, the active γ-secretase complex was selectively accumulated in the germinating virus. The present invention has been completed based on these findings.
That is, the present invention is as follows.
(1) A host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane-type protease protein and a gene encoding a complex-constituting factor is cultured or raised, and the membrane-type protease protein is contained in the germinated baculovirus released from the host A method for expressing a membrane-type protease protein complex, characterized in that a complex of a protein and a complex constituent factor is expressed.
(2) It is obtained by culturing or rearing a host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane protease protein and a gene encoding a complex component, and recovering the germinated baculovirus from the culture or the host individual. A method for producing an active membrane protease protein complex, which comprises collecting an active membrane protease protein complex from a collected product.
(3) In the invention described in (1) or (2) above, examples of the membrane protease protein include presenilin, and examples of the complex constituent factors include nicastrin, APH-1 and PEN-2. The membrane protease protein complex formed by these proteases and complex constituent factors is γ-secretase.
In the method described in (1) or (2) above, insect cells or insect larvae are used as the host.
(4) A germinating baculovirus released by a host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane protease protein and a gene encoding a complex constituent factor.
Here, the membrane protease protein includes presenilin, and the complex constituent factors include nicastrin, APH-1 and PEN-2.
The germinating baculovirus contains a membrane protease protein complex (for example, γ-secretase) formed by a membrane protease protein and a complex constituent factor.
Insect cells or insect larvae are used as hosts.
(5) An active membrane protease protein complex collected from the germinated baculovirus. An example of the membrane protease protein complex is γ-secretase.
(6) A method for analyzing a substance that interacts with an active membrane protease protein complex (for example, γ-secretase), comprising contacting a labeled test substance with the complex, and then the test substance Detecting said signal.
Furthermore, the present invention is a method for screening a substance that promotes or inhibits the enzyme activity of an active membrane protease protein complex (for example, γ-secretase), wherein the test substance is contacted with the complex. Providing a method comprising measuring the protease activity of the complex.
(7) A protein chip on which the above active membrane protease protein complex (for example, γ-secretase) is arranged.

図１は、発芽型バキュロウイルスを用いて活性型膜型プロテアーゼ蛋白質を回収する概要を示す。
図２は、ヒトプレセニリン１発現のタイムコース（抗ヒトプレセニリン１抗血清ウェスタンブロット）を示す。
図３は、ＢＶ画分における各抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。
図４は、ＢＶ画分に再構成されたγ−セクレターゼ複合体の免疫共沈法による解析の結果を示す。
図５は、Ｓｆ９膜画分及びＢＶ画分におけるフラグメント型プレセニリン発現量の比較（各抗体によるウェスタンブロット）を示す。
図６は、可溶化されたＢＶ画分におけるインビトロγ−セクレターゼ活性の比較を示す。
図７は、ＢＶ画分に再構成されたγ−セクレターゼ活性の酵素学的解析結果を示す。FIG. 1 shows an outline of recovering an active membrane protease protein using a germinating baculovirus.
FIG. 2 shows the time course of human presenilin 1 expression (anti-human presenilin 1 antiserum western blot).
FIG. 3 shows the results of Western blotting with each antibody in the BV fraction.
FIG. 4 shows the results of analysis by co-immunoprecipitation of the γ-secretase complex reconstituted in the BV fraction.
FIG. 5 shows a comparison of the expression level of fragment type presenilin in the Sf9 membrane fraction and the BV fraction (Western blotting with each antibody).
FIG. 6 shows a comparison of in vitro γ-secretase activity in the solubilized BV fraction.
FIG. 7 shows the enzymological analysis results of the γ-secretase activity reconstituted in the BV fraction.

以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を発現させることを特徴とするものである。
図１に示すように、膜型プロテアーゼをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をバキュロウイルスにトランスフェクトし、これを昆虫細胞（例えばＳｆ９）又は昆虫に感染させると、感染細胞内又は感染昆虫の体内にプロテアーゼが蓄積される。感染細胞等に蓄積されるプロテアーゼには活性型と不活性型が含まれているのに対し、感染細胞等から発芽するウイルス中に含まれるプロテアーゼを採取すると、採取されたプロテアーゼは活性型のもののみとなる（不活性型のプロテアーゼが含まれていたとしてもごくわずかである）。本発明は、発芽型のバキュロウイルス中に活性型となるプロテアーゼが含まれている点に着目して完成されたものであり、発芽型バキュロウイルスにプロテアーゼ蛋白質複合体を発現させることを特徴とし、また、発芽型バキュロウイルスから活性型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする。
膜型プロテアーゼ蛋白質の中には、特定の蛋白質と複合体を形成して活性化するものが存在する。このように、プロテアーゼ蛋白質と複合体を形成する蛋白質を、本発明において「複合体構成因子」という。複合体構成因子及び膜型プロテアーゼ蛋白質は、複合体構成因子同士で、あるいは複合体構成因子と膜型プロテアーゼ蛋白質との間で、それぞれ相互作用して膜型プロテアーゼ蛋白質の機能を発揮（つまり活性化）させる。
本発明では、複合体構成因子等の複数種類の蛋白質を共発現させて得られる蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）を含む。複数種類の蛋白質を共発現させる場合は、これらの蛋白質をコードする遺伝子を同一のバキュロウイルス中に含めてもよいし、異なるバキュロウイルス中に含めてもよい。
本発明においては、上記膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子、及び複合体構成因子をコードする遺伝子（１種又は複数種）をバキュロウィルスに導入して組換えバキュロウイルスを作製し、これを昆虫細胞又は昆虫に感染させて培養又は飼育する。これらの宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を発現させる。そして、培養物又は宿主個体から発芽バキュロウイルスを回収する。さらに、バキュロウイルスから当該複合体を採取することで、活性化された膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を得ることができる。
ここで、本発明において「膜型」とは、対象の蛋白質が膜、例えば細胞膜、ウイルス膜及び細胞内小器官（例えば、小胞体やゴルジ体等）の形質膜に存在することを広く意味する。また、「プロテアーゼ」とは蛋白質を加水分解する能力を有する酵素を広く意味する。そして、「活性型」とは、プロテアーゼとしての機能を有することを意味する。「発芽バキュロウイルス中」とは、発芽バキュロウイルスの内部だけでなく、ウイルス膜上も意味する。
２．膜型プロテアーゼ蛋白質複合体
膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との組み合わせは特に限定されず、例えば、膜型プロテアーゼ蛋白質であるプレセニリンと、複合体構成因子であるニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２と呼ばれる３種の蛋白質とにより構成される複合体が挙げられる。この複合体はγ−セクレターゼと呼ばれている。すなわち、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２がプレセニリンと複合体を形成することによってγ−セクレターゼとなり、プレセニリンのプロテアーゼとしての機能が発揮される。
プレセニリンは、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として同定された膜蛋白質であり、γ−セクレターゼの活性中心サブユニットであると考えられている。（ＳｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎＲ，ＲｏｇａｅｖＥＩ，ＬｉａｎｇＹ，ＲｏｇａｅｖａＥＡ，ＬｅｖｅｓｑｕｅＧ，ＩｋｅｄａＭ，ＣｈｉＨ，ＬｉｎＣ，ＬｉＧ，ＨｏｌｍａｎＫ，ｅｔａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｇｅｎｅｂｅａｒｉｎｇｍｉｓｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔｆａｍｉｌｉａｌＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９５，３７５（６５３４）：７５４−７６０）。ヒトプレセニリン１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ヒトプレセニリン１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ヒトプレセニリン２をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に、ヒトプレセニリン２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
プレセニリンは、細胞内でニカストリン、ＡＰＨ−１、ＰＥＮ−２と共役して活性化され、プロセシングを受けてフラグメントとなる。（ＴａｋａｓｕｇｉＮ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＨａｙａｓｈｉＩ，ＴｓｕｒｕｏｋａＭ，ＮｉｉｍｕｒａＭ，ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ＴｈｉｎａｋａｒａｎＧ，ＩｗａｔｓｕｂｏＴＮａｔｕｒｅ２００３，４２２：４３８−４４１Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｃｏｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅ γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ．）。このフラグメント型プレセニリンが活性型γ−セクレターゼの活性中心サブユニットを構成しているものと考えられている（ＬｉＹＭ，ＸｕＭ，ＬａｉＭＴ，ＨｕａｎｇＱ，ＣａｓｔｒｏＪＬ，ＤｉＭｕｚｉｏＭｏｗｅｒＪ，ＨａｒｒｉｓｏｎＴ，ＬｅｌｌｉｓＣ，ＮａｄｉｎＡ，ＮｅｄｕｖｅｌｉｌＪＧ，ＲｅｇｉｓｔｅｒＲＢ，ＳａｒｄａｎａＭＫ，ＳｈｅａｒｍａｎＭＳ，ＳｍｉｔｈＡＬ，ＳｈｉＸＰ，ＹｉｎＫＣ，ＳｈａｆｅｒＪＡ，ＧａｒｄｅｌｌＳＪ．Ｎａｔｕｒｅ２０００，４０５：６８９−６９４Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｄｉｒｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｌａｂｅｌｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１．）。
ニカストリンは、プレセニリン結合分子の一つとして同定された蛋白質である（ＹｕＧ，ＮｉｓｈｉｍｕｒａＭ，ＡｒａｗａｋａＳ，ＬｅｖｉｔａｎＤ，ＺｈａｎｇＬ，ＴａｎｄｏｎＡ，ＳｏｎｇＹＱ，ＲｏｇａｅｖａＥ，ＣｈｅｎＦ，ＫａｗａｒａｉＴ，ＳｕｐａｌａＡ，ＬｅｖｅｓｑｕｅＬ，ＹｕＨ，ＹａｎｇＤＳ，ＨｏｌｍｅｓＥ，ＭｉｌｍａｎＰ，ＬｉａｎｇＹ，ＺｈａｎｇＤＭ，ＸｕＤＨ，ＳａｔｏＣ，ＲｏｇａｅｖＥ，ＳｍｉｔｈＭ，ＪａｎｕｓＣ，ＺｈａｎｇＹ，ＡｅｂｅｒｓｏｌｄＲ，ＦａｒｒｅｒＬＳ，ＳｏｒｂｉＳ，ＢｒｕｎｉＡ，ＦｒａｓｅｒＰ，ＳｔＧｅｏｒｇｅＨｙｓｌｏｐＰＮｉｃａｓｔｒｉｎｍｏｄｕｌａｔｅｓｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｎｏｔｃｈ／ｇｌｐ−１ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｂｅｔａＡＰＰｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ２０００，４０７（６８００）：４８−５４．）。ヒトニカストリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に、ヒトニカストリンのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２は、線虫を用いた遺伝学的スクリーニングにより、γ−セクレターゼ活性に必須の蛋白質をコードする遺伝子として同定されたものである（ＧｏｕｔｔｅＣ，ＴｓｕｎｏｚａｋｉＭ，ＨａｌｅＶＡ，ＰｒｉｅｓｓＪＲ（２００２）ＡＰＨ−１ｉｓａｍｕｌｔｉｐａｓｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓｅｍｂｒｙｏｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ２００２Ｊａｎ２２，９９（２）：７７５−７７９；ＦｒａｎｃｉｓＲ，ＭｃＧｒａｔｈＧ，ＺｈａｎｇＪ，ＲｕｄｄｙＤＡ，ＳｙｍＭ，ＡｐｆｅｌｄＪ，ＮｉｃｏｌｌＭ，ＭａｘｗｅｌｌＭ，ＨａｉＢ，ＥｌｌｉｓＭＣ，ＰａｒｋｓＡＬ，ＸｕＷ，ＬｉＪ，ＧｕｒｎｅｙＭ，ＭｙｅｒｓＲＬ，ＨｉｍｅｓＣＳ，ＨｉｅｂｓｃｈＲ，ＲｕｂｌｅＣ，ＮｙｅＪＳ，ＣｕｒｔｉｓＤ（２００２）ａｐｈ−１ａｎｄｐｅｎ−２ａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＮｏｔｃｈｐａｔｈｗａｙｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆｂｅｔａＡＰＰ，ａｎｄｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．ＤｅｖＣｅｌｌ３：８５−９７）。ヒトＡＰＨ−１ａをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７に、ヒトＡＰＨ−１ａのアミノ酸配列（２５１個のアミノ酸配列を有するもの：「２５１型」という）を配列番号８に示す。
ここで、ＡＰＨ−１ａには、そのＣ末端部分が選択的スプライシングにより生じた変異体（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｖａｒｉａｎｔ）が存在する。この変異体は２４７個のアミノ酸配列（「２４７型」という）及び２６５個のアミノ酸配列（「２６５型」という）を有している。２４７型をコードする遺伝子を配列番号９に、２４７型のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。また、２６５型をコードする遺伝子を配列番号１１に、２６５型のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
ヒトＡＰＨ−１ｂをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、ヒトＡＰＨ−１ｂのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。また、ヒトＰＥＮ−２をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、ヒトＰＥＮ−２のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２をコードする遺伝子の塩基配列、並びにこれらの蛋白質のアミノ酸配列の配列番号を表１にまとめた。

ここで、本発明においては、表１の配列番号に示すアミノ酸配列のみならず、プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が複合体を形成したときに活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体としての機能を有する限り、これらのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６）において１個又は数個（例えば１個〜１０個、好ましくは１個〜５個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列（変異型アミノ酸配列）を含むものであってもよい。「活性型膜型プロテアーゼ蛋白質としての機能」とは、疎水性環境にある膜内配列を切断するプロテアーゼ機能（特にγ−セクレターゼ機能）を意味する。
さらに、プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２のアミノ酸配列をそれぞれコードする遺伝子に限らず、上記表１の配列番号に示す塩基配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５）に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が複合体を形成したときに膜型プロテアーゼ蛋白質としての活性を有するときのそれぞれの蛋白質をコードする遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、温度が５５〜７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が２５０〜４５０ｍＭであり、温度が６８℃での条件（ハイブリダイズ後の洗浄時の条件）をいう。
上記変異型アミノ酸配列は、通常の部位特異的突然変異誘発法によって変異を導入することができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ^ＴＭＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓＫｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
本発明において、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とその触媒の対象となる物質との間の相互作用として、プレセニリン複合体と基質（ＡＰＰ、Ｎｏｔｃｈ、ＥｒｂＢ４、カドヘリンなど）との相互作用、プレセニリン複合体と結合蛋白質（カテニン、ＫＣｈｉＰなど）との相互作用、ＳｐｏＩＶＦＢと結合蛋白質（ＢｏｆＡ，ＳｐｏＩＶＦＡなど）との相互作用などが挙げられる。（ＵｒｂａｎＳ，ＦｒｅｅｍａｎＭ．Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｃｏｎｔｒｏｌｓｄｉｖｅｒｓｅｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．（２００２）ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ．１２（５）：５１２−５１８．）（ＷｅｉｈｏｆｅｎＡ，ＭａｒｔｏｇｌｉｏＢ．Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｌｉｂｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．（２００３）ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３（２）：７１−７８）
上記相互作用は、例えばＳｆ９細胞に未知の分子をコードするｃＤＮＡを感染させ、細胞内でプレセニリン複合体と相互作用ないし何らかの活性化を促進または阻害して、得られたバキュロウイルス中の活性を変化させる物質について検討すればよい。
３．組換えウイルスの作製及びプロテアーゼの発現
本発明において、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を取得するために、プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを使用することができる。バキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスであり、昆虫に感染して病気を起こすウイルスである。そして、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量に作る一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成されており、感染後期に大量に作られ、その中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないため、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
本発明で用いられるバキュロウイルスとしては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、カイコのボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などが挙げられ、これらのウイルスをベクターとして用いることができる。
ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、ＢｍＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することから、Ｓｆ−ＡｃＮＰＶ系の宿主−ベクターが好ましい。
ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＦｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統のＳｆ９およびＳｆ２１は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫の卵巣組織から確立しており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社若しくはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、又はＡＴＣＣなどから入手可能である。さらに、生きている昆虫幼虫（例えばカイコ）を宿主細胞系として使用することもできる。
本発明で用いる組換えウイルスを構築する方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、トランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こされる。
また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されるものではなく、例えばＡｃＮＰＶ系又はＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターを使用することができる。
ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、例えばｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ，Ｂ，Ｃ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、例えばｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズなどが挙げられる。これらのトランスファーベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から容易に入手可能である。
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後（トランスフェクション）、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築する。
ここで宿主として培養細胞を用いる場合は、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞など）が採用される。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いるときは、１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培養することが好ましい。このようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており、多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
本発明の方法では、前記の組換えバキュロウイルスを、上記の適当な宿主（Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養物から細胞外発芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄｖｉｒｕｓ，ＢＶ）を遠心などの分離操作によって回収することにより、その発芽バキュロウイルス画分中に含有される目的蛋白質複合体を得ることができる。「培養物」とは、培養上清及び細胞のいずれをも意味する。なお、組換えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共感染させてもよい。
細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行うことができる。先ず感染細胞の培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができる。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルスは、生理活性を有する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を含むものである。なお、当該発芽バキュロウイルス自体も本発明の範囲内である。
この細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を適当な緩衝液に懸濁し、再度、適当な濃度勾配（例えば、スクロースの連続勾配等）の上にウイルスの懸濁物を重ね、１００，０００ｇで遠心分離して分画する。得られた画分の中から所望の蛋白質複合体を含む画分を採取することができる。
さらに、発現させた蛋白質複合体を可溶化した形態で得る場合には、感染細胞の培養液から例えば４０，０００ｇで遠心分離することにより細胞外発芽ウイルスを回収する。この回収されたペレットを適当な緩衝液に懸濁し、ＣＨＡＰＳＯ等の溶解剤で処理し、さらに３０，０００ｒｐｍで遠心分離を行うことにより上清と沈澱に分離する。可溶化された目的蛋白質複合体は上清中から得ることができる。
宿主として昆虫（例えばカイコ幼虫）を用いる場合は、組換えウイルスを例えば５齢カイコ幼虫に接種して感染させ、４〜６日後にカイコの個体の体液中に分泌したプロテアーゼ蛋白質複合体を採取・分離し、精製すればよい。プロテアーゼ蛋白質複合体は、絹糸腺と呼ばれる器官から大量に得ることができる。
上記発現蛋白質複合体（特にＣＨＡＰＳＯ等の溶解剤で処理した後の蛋白質複合体）は、その活性化形態として採取される。本発明の蛋白質複合体は、好ましくは少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上が活性化形態である。
本発明の蛋白質複合体は、適当な精製手段、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを単独で又は適宜組み合わせてさらに精製することも可能である。このようにして採取又は精製した活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体も、本発明に含まれる。採取又は精製された蛋白質複合体が目的のものであることの確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
なお、このような活性化形態の膜プロテアーゼ蛋白質複合体を高い割合で得ることは従来法では極めて困難であった。
４．相互作用の分析
本発明はさらに、標識された被験物質（例えばリガンド又は基質）と活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することによって、前記蛋白質複合体と相互作用する物質を分析する方法を提供する。
蛋白質複合体は、バキュロウイルス中に存在する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を使用することも可能であるが、バキュロウイルスから採取した活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を使用することが好ましい。
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と被験物質との相互作用の測定方法は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、標識したリガンドを用いてリガンド結合能を測定する。標識は、蛍光標識、放射標識のいずれを採用してもよい。蛍光物質としては、例えばＡｌｅｘａ系、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ、Ｃｙ２、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ５などが挙げられる。放射標識物質としては、^３Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^３２Ｐ等が挙げられる。
具体的には、上記標識物質で標識したリガンドを含む緩衝液（結合に適した緩衝液を使用）に、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を含む発芽バキュロウイルス、又は前記の通り回収若しくは精製した活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を接触（反応）させる。なお、反応条件はプロテアーゼとリガンドとの組み合わせの種類により適宜選択する。反応後の反応液を適当なフィルター等の固相担体に吸着ろ過させて反応を停止し、当該固相担体を洗浄および乾燥させ、複合体のみを固相担体上に固定する。シンチレーションカウンターを用いて固相担体の放射活性を測定し、又は蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定することにより、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とリガンドとの相互作用（即ち、リガンド結合能）を測定することができる。
また、本発明は、被験物質と本発明の複合体とを接触させた後、複合体のプロテアーゼ活性を測定することにより、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の酵素活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
スクリーニングに供される被験物質としては、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供される化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離することも可能である。
さらに、本発明においては、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体に作用する分子ないしリガンド様の物質が、その複合体のうちどの分子に作用しているかについて、バキュロウイルス上の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を用いてアッセイすることも可能である。
これらの被験物質は、膜型プロテアーゼ蛋白質（複合体）と基質との相互作用、あるいは膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との相互作用を促進又は阻害することが予想される物質であることが好ましい。本発明のスクリーニング方法により、膜型プロテアーゼ蛋白質または膜型プロテアーゼ蛋白質複合体に対する阻害薬または活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本発明のスクリーニング方法により得られる、膜型プロテアーゼ蛋白質（複合体）と基質との相互作用、あるいは膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との相互作用を促進又は阻害する物質も本発明の範囲内である。
５．プロテインチップ
本発明のバキュロウイルスから採取される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の中には、活性型のものが含まれている。この活性型蛋白質複合体を基板上に固定すると、プロテインチップを得ることができる。このようにして作製されたプロテインチップは、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と相互作用する物質をスクリーニングするために使用することができる。活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を、イオン交換樹脂や金属イオンなどをコーティングしたチップに結合させ、スクリーニングの対象となる試料をチップに添加し、質量分析器（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型、ＥＳＩ／Ｑ−ＴＯＦ型のもの等）を使用して質量を測定する。質量の変化により、相互作用した物質を同定することが可能である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Overview
The present invention relates to a method for culturing or breeding a host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane protease protein and a gene encoding a complex constituent factor, and in the germinated baculovirus released from the host, the membrane protease It is characterized by expressing a protein complex.
As shown in FIG. 1, when a gene (cDNA) encoding a membrane protease is transfected into a baculovirus and infected with an insect cell (for example, Sf9) or an insect, the protease is contained in the infected cell or the body of the infected insect. Is accumulated. While proteases accumulated in infected cells include active and inactive forms, when proteases contained in viruses that germinate from infected cells are collected, the collected proteases are active. (Though little if any inactive protease is included). The present invention has been completed by paying attention to the fact that an active protease is contained in a germinating baculovirus, and is characterized by allowing a germinating baculovirus to express a protease protein complex, In addition, an active protease protein complex is collected from the germinating baculovirus.
Some membrane protease proteins are activated by forming a complex with a specific protein. As described above, a protein that forms a complex with a protease protein is referred to as a “complex constituent factor” in the present invention. Complex component factor and membrane protease protein interact with each other or between complex component factor and membrane protease protein, respectively, to exert the function of membrane protease protein (ie, activation) )
In this invention, the protein complex (for example, (gamma) -secretase) obtained by co-expressing multiple types of proteins, such as a complex constituent factor, is included. When a plurality of types of proteins are co-expressed, the genes encoding these proteins may be included in the same baculovirus or in different baculoviruses.
In the present invention, a recombinant baculovirus is produced by introducing a gene encoding the membrane protease protein and a gene (one or a plurality of species) encoding a complex constituent factor into a baculovirus, which is then used as an insect cell. Or, it is cultured or raised by infecting insects. Membrane protease protein complexes are expressed in germinating baculoviruses released from these hosts. Then, the germinated baculovirus is recovered from the culture or the host individual. Furthermore, an activated membrane protease protein complex can be obtained by collecting the complex from baculovirus.
Here, in the present invention, the “membrane type” broadly means that the target protein exists in the plasma membrane of a membrane, for example, a cell membrane, a viral membrane, and an intracellular organelle (for example, endoplasmic reticulum or Golgi body). . “Protease” broadly means an enzyme having the ability to hydrolyze proteins. The “active form” means having a function as a protease. “In germinating baculovirus” means not only inside germinating baculovirus but also on the viral membrane.
2. Membrane protease protein complex
The combination of the membrane protease protein and the complex constituent factor is not particularly limited. For example, presenilin, which is a membrane protease protein, and three types of proteins called nicastrin, APH-1, and PEN-2, which are complex constituent factors. And a complex composed of: This complex is called γ-secretase. That is, nicastrin, APH-1 and PEN-2 form a complex with presenilin to become γ-secretase, and the function of presenilin as a protease is exhibited.
Presenilin is a membrane protein identified as a causative gene of familial Alzheimer's disease, and is considered to be an active center subunit of γ-secretase. (Sherlington R, Rogaev EI, Liang Y, Rogaeva EA, Levsue G, Ikeda M, Chi H, Lin C, Li G, Holman K, et al. Cloning of the genesis bees. Nature.1995, 375 (6534): 754-760). The base sequence of the gene encoding human presenilin 1 is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of human presenilin 1 is shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence of the gene encoding human presenilin 2 is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of human presenilin 2 is shown in SEQ ID NO: 4.
Presenilin is activated in combination with nicastrin, APH-1, and PEN-2 in cells, and is processed into a fragment. (Takasugi N, Tomita T, Hayashi I, Tsuruoka M, Niimura M, Takahashi Y, Thinakaran G, Iwatsubo re in 2003, 422: 438-441 Thero les. This fragment type presenilin is considered to constitute the active center subunit of active γ-secretase (Li YM, Xu M, Lai MT, Huang Q, Castro JL, DiMuzio Mower J, Harrison T, Lellis). C, Nadin A, Neduvelil JG, Register RB, Sardana MK, Shearman MS, Smith AL, Shi XP, Yin KC, Shafer JA, Gardell SJ. Nature 2000, 405: 689-694. covalently label presenilin 1.).
Nicastrin is a protein identified as one of the presenilin-binding molecules (Yu G, Nishimura M, Arawaka S, Levitan D, Zhang L, Tandon A, Song YQ, Rogaeva E, Chen F, TawaSawap. Levesque L, Yu H, Yang DS, Holmes E, Milman P, Liang Y, Zhang DM, Xu DH, Sato C, Rogaev E, Smith M, Janus C, Zhang Y, Abersold R, Abersold R, Abersold R , Fraser P, St George Hyslope P Nicastrin modulateds presenilin-modified notch / glp-1 s signal, transduction and betaAPP processing. Nature 2000, 407 (6800): 48-54.). The nucleotide sequence of the gene encoding human nicastrin is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of human nicastrin is shown in SEQ ID NO: 6.
APH-1 and PEN-2 have been identified by genetic screening using nematodes as genes encoding proteins essential for γ-secretase activity (Goutte C, Tsunozaki M, Hale VA, Priess). JR (2002) APH-1 is a multipass membrane protein essential for the Not a signaling pathway in Caenorabditis elegans embryos. Proc Natl. J, Ruddy DA, Sym M, Apfeld J, Nicoll M, Maxwell M, Ha B, Elis MC, Parks AL, Xu W, Li J, Gurney M, Myers RL, Himes CS, Hiebsch R, Ruble C, Nye JS, Curtis D (2002) aph-1 and pen-2 area retouring. , Gamma-secretase cleavage of beta APP, and presenilin-protein accumulation. Dev Cell 3: 85-97). The nucleotide sequence of the gene encoding human APH-1a is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of human APH-1a (having 251 amino acid sequences: “251 type”) is shown in SEQ ID NO: 8.
Here, APH-1a has a mutant (Alternative splicing variant) in which the C-terminal portion is generated by alternative splicing. This variant has a 247 amino acid sequence (referred to as “247 type”) and a 265 amino acid sequence (referred to as “265 type”). The gene encoding type 247 is shown in SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of type 247 is shown in SEQ ID NO: 10. The gene encoding type 265 is shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of type 265 is shown in SEQ ID NO: 12.
The base sequence of the gene encoding human APH-1b is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence of human APH-1b is shown in SEQ ID NO: 14. The base sequence of the gene encoding human PEN-2 is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence of human PEN-2 is shown in SEQ ID NO: 16.
Table 1 summarizes the base sequences of the genes encoding presenilin, nicastrin, APH-1 and PEN-2, and the amino acid sequences of these proteins.

Here, in the present invention, not only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 but also presenilin, nicastrin, APH-1 and PEN-2 form a complex as an active membrane protease protein complex. As long as it has a function, one or several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 5) of these amino acid sequences (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 or 16) The amino acid sequence may be deleted, substituted, or added to the amino acid sequence (mutated amino acid sequence). “Function as an active membrane protease protein” means a protease function (particularly γ-secretase function) that cleaves an intramembrane sequence in a hydrophobic environment.
Furthermore, not only the genes encoding the amino acid sequences of presenilin, nicastrin, APH-1 and PEN-2, but also the base sequences (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, It hybridizes with a sequence complementary to 13 or 15) under stringent conditions, and has activity as a membrane protease protein when presenilin, nicastrin, APH-1 and PEN-2 form a complex. Also included are genes that encode the respective proteins. “Stringent conditions” means, for example, a salt (sodium) concentration of 150 to 900 mM, a temperature of 55 to 75 ° C., preferably a salt (sodium) concentration of 250 to 450 mM, and a temperature of 68 ° C. Conditions (conditions for washing after hybridization).
Mutation can be introduced into the mutant amino acid sequence by a conventional site-directed mutagenesis method. In order to introduce a mutation into a gene, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis, for example, QuikChange, by a known technique such as the Kunkel method or the Gapped duplex method. ^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor ^TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) can be used.
In the present invention, as an interaction between an active membrane protease protein complex and a substance to be catalyzed, an interaction between a presenilin complex and a substrate (APP, Notch, ErbB4, cadherin, etc.), presenilin The interaction between the complex and the binding protein (catenin, KChiP, etc.) and the interaction between SpoIVFB and the binding protein (BofA, SpoIVFA, etc.) can be mentioned. (. Urban S, Freeman M.Intramembrane proteolysis controls diverse signalling pathways throughout evolution (2002) Curr Opin Genet Dev.12 (5):. 512-518) (Weihofen A, Martoglio B.Intramembrane-cleaving proteases: controlled liberation of proteins and bioactive peptides. (2003) Trends Cell Biol. 13 (2): 71-78).
The above-mentioned interaction changes the activity in the obtained baculovirus by, for example, infecting cDNA encoding an unknown molecule into Sf9 cells and promoting or inhibiting any activation or presenilin complex in the cells. What is necessary is just to examine the substance to make.
3. Production of recombinant virus and expression of protease
In the present invention, in order to obtain an active membrane protease protein complex, at least one kind of recombinant baculovirus containing a gene encoding a protease protein and a gene encoding a complex constituent factor can be used. . A baculovirus is an enveloped virus having a circular double-stranded DNA as a gene, and is a virus that infects insects and causes disease. It is sensitive to insects such as Lepidoptera, Hymenoptera and Diptera. Among the baculoviruses, a group of viruses that make a large number of inclusion bodies called polyhedra in the nucleus of infected cells are nuclear polyhedrosis virus (NPV). The polyhedron is composed of a polyhedrin protein having a molecular weight of 31 kDa, and is produced in a large amount in the late stage of infection, and a large number of virus particles are embedded therein. Polyhedra are essential for the virus to survive in nature, but are not necessary for virus propagation itself, so even if a foreign gene to be expressed is inserted in place of the polyhedron gene, the virus is not affected at all. Multiply.
Examples of baculoviruses used in the present invention include Autographa californica NPV (AcNPV), Bombyx mori NPV (BmNPV), etc. These viruses can be used as vectors.
Examples of AcNPV hosts (infection, passage cells) include Spodoptera frugiperda cells (Sf cells), and examples of BmNPV hosts (infections, passage cells) include BmN4 cells. Since Sf cells have a faster growth rate than BmN4 cells and the like, and AcNPV has the ability to infect human hepatocytes and human fetal kidney cells, Sf-AcNPV host-vectors are preferred.
Spodoptera Frugiperda cell line Sf9 and Sf21 It is established from the ovarian tissue of Frugiperda larvae and is available from Invitrogen or Pharmingen (San Diego, Calif.), ATCC, or the like. Furthermore, live insect larvae (eg silkworms) can also be used as host cell systems.
The method for constructing the recombinant virus used in the present invention may be carried out according to a conventional method, for example, by the following procedure. First, a gene for a protein to be expressed is inserted into a transfer vector to construct a recombinant transfer vector. The overall size of the transfer vector is generally about several kb to 10 kb, of which about 3 kb is a plasmid-derived backbone and contains an antibiotic resistance gene such as ampicillin and a signal for initiation of DNA replication in bacteria. Yes. In addition to this backbone, a normal transfer vector contains 5 'and 3' regions of a polyhedron gene, each of several kb. When transfection is performed, between this sequence and the target gene and the polyhedron gene, Homologous recombination is caused.
The transfer vector preferably contains a promoter for expressing the protein gene. Examples of the promoter include a polyhedron gene promoter, a p10 gene promoter, and a capsid gene promoter.
The type of transfer vector is not particularly limited, and for example, AcNPV or BmNPV transfer vectors can be used.
Examples of AcNPV transfer vectors include pEVmXIV2, pAcSG1, pVL1392 / 3933, pAcMP2 / 3, pAcJP1, pAcUW21, pAcDZ1, pBlueBacIII, pBlueBac4.5, pBlueBac4.5, pAc3Zp3, pAc3Z, pAcBZ4.5. B, C, pVT-Bac33, pAcUW1, pAcUW42 / 43 and the like, and BmNPV transfer vectors include, for example, pBK283, pBK5, pBB30, pBE1, pBE2, pBK3, pBK52, pBKblue, pBKblue, pBKF2, etc. . These transfer vectors are easily available from Invitrogen, Funakoshi Co., Ltd., Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. and the like.
Next, in order to produce a recombinant virus, the above recombinant transfer vector is mixed with the virus (transfection) and then transferred to a cultured cell used as a host, or a culture used as a host previously infected with a virus. A transfer virus is constructed by transferring the above transfer vector into a cell and causing homologous recombination between the recombinant transfer vector and the viral genomic DNA.
Here, when cultured cells are used as the host, insect cultured cells (Sf9 cells, BmN cells, etc.) are usually employed. The culture conditions are appropriately determined by those skilled in the art. Specifically, when using Sf9 cells, it is preferable to culture at about 28 ° C. in a medium containing 10% fetal calf serum. The recombinant virus thus constructed can be purified by a conventional method such as plaque assay. It should be noted that the recombinant virus produced in this way has non-assembled DNA because foreign DNA has been substituted or inserted into the gene region of the polyhedron protein of the nuclear polyhedrosis virus and cannot form a polyhedron. It can be easily distinguished from a replacement virus.
In the method of the present invention, the above-mentioned recombinant baculovirus is infected with the above-mentioned appropriate host (cultured cells such as Sf9 and Sf21), and extracellular germination from the culture after a certain time (for example, after 72 hours). By recovering the virus (budded virus, BV) by a separation operation such as centrifugation, a target protein complex contained in the germinated baculovirus fraction can be obtained. “Culture” means both culture supernatant and cells. Note that only one type of recombinant baculovirus may be infected, or two or more types of recombinant baculovirus may be combined and co-infected.
For example, the extracellular germinated baculovirus can be collected as follows. First, the culture solution of infected cells is centrifuged at 500 to 1,000 g, and the supernatant containing extracellular germinated baculovirus is recovered. The supernatant can be centrifuged at about 30,000 to 50,000 g to obtain a precipitate containing extracellular germinated baculovirus. The germinated baculovirus recovered as described above contains a membrane protease protein complex having physiological activity. The germinated baculovirus itself is also within the scope of the present invention.
The precipitate containing the extracellular germinated baculovirus is suspended in an appropriate buffer, and the virus suspension is again layered on an appropriate concentration gradient (for example, a continuous gradient of sucrose), and centrifuged at 100,000 g. Separate and fractionate. A fraction containing the desired protein complex can be collected from the obtained fractions.
Further, when the expressed protein complex is obtained in a solubilized form, the extracellular germination virus is recovered by centrifuging, for example, at 40,000 g from the culture solution of infected cells. The recovered pellet is suspended in an appropriate buffer, treated with a solubilizing agent such as CHAPSO, and further centrifuged at 30,000 rpm to separate into a supernatant and a precipitate. The solubilized target protein complex can be obtained from the supernatant.
When using an insect (eg, silkworm larvae) as a host, the recombinant virus is inoculated into, for example, 5th instar silkworm larvae, and 4 to 6 days later, the protease protein complex secreted in the body fluid of the silkworm individual is collected What is necessary is just to isolate | separate and refine | purify. Protease protein complexes can be obtained in large quantities from an organ called the silk gland.
The expressed protein complex (particularly the protein complex after being treated with a solubilizing agent such as CHAPSO) is collected as its activated form. The protein complex of the present invention is preferably at least 50% or more, more preferably 60% or more, further preferably 70% or more, further preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. Activated form.
The protein complex of the present invention can be further purified by an appropriate purification means, for example, various chromatographies such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like alone or in appropriate combination. The active membrane protease protein complex collected or purified as described above is also included in the present invention. Confirmation that the collected or purified protein complex is the target can be performed by SDS-PAGE, Western blotting, ELISA or the like.
In addition, it was extremely difficult to obtain such an activated form of membrane protease protein complex in a high ratio by the conventional method.
4). Interaction analysis
The present invention further includes contacting a labeled test substance (eg, a ligand or a substrate) with an active membrane protease protein complex, and then detecting a signal of the test substance to thereby interact with the protein complex. A method for analyzing acting substances is provided.
As the protein complex, a membrane protease protein complex present in baculovirus can be used, but it is preferable to use an active membrane protease protein complex collected from baculovirus.
The method for measuring the interaction between the membrane protease protein complex and the test substance is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art. As an example, the ligand binding ability is measured using a labeled ligand. Either a fluorescent label or a radiolabel may be used as the label. Examples of the fluorescent material include Alexa, Pacific Blue, Cy2, FITC, Cy3, rhodamine, Texas red, and Cy5. As radiolabeled substances, ³ H, ¹³ C, ¹⁵ N, ³² P etc. are mentioned.
Specifically, a germinated baculovirus containing a membrane protease protein complex in a buffer containing a ligand labeled with the labeling substance (using a buffer suitable for binding), or an active form recovered or purified as described above A membrane protease protein complex is contacted (reacted). The reaction conditions are appropriately selected depending on the combination type of protease and ligand. The reaction solution after the reaction is adsorbed and filtered on a solid support such as an appropriate filter to stop the reaction, the solid support is washed and dried, and only the complex is immobilized on the solid support. By measuring the radioactivity of the solid-phase support using a scintillation counter or measuring the fluorescence intensity using a fluorometer, the interaction between the membrane-type protease protein complex and the ligand (ie, ligand binding ability) Can be measured.
The present invention also provides a substance that promotes or inhibits the enzyme activity of an active membrane protease protein complex by contacting the test substance with the complex of the present invention and then measuring the protease activity of the complex. A method for screening is provided.
Examples of test substances to be used for screening include peptides, polypeptides, synthetic compounds, microbial fermentation products, extracts from organisms (including plant or animal tissues, microorganisms, cells, etc.), or libraries thereof. Is mentioned. Examples of the library include a synthetic compound library (such as a combinatorial library) and a peptide library (such as a combinatorial library). The chemicals to be screened may be natural or synthetic, and even if a single candidate chemical is tested independently, a mixture of several candidate chemicals (including libraries, etc.) ) May be tested. It is also possible to screen a fraction obtained by fractionating a mixture such as a cell extract, and to isolate a substance having a desired activity by overlapping fractions.
Furthermore, in the present invention, the membrane-type protease protein complex on the baculovirus is examined as to which molecule or ligand-like substance acting on the active membrane-type protease protein complex acts on the complex. It is also possible to assay using the body.
These test substances are substances that are expected to promote or inhibit the interaction between the membrane protease protein (complex) and the substrate, or the interaction between the membrane protease protein and the complexing factor. preferable. According to the screening method of the present invention, it is possible to screen for an inhibitor or activation drug for a membrane protease protein or a membrane protease protein complex. Substances that promote or inhibit the interaction between the membrane protease protein (complex) and the substrate, or the interaction between the membrane protease protein and the complex constituent, obtained by the screening method of the present invention are also within the scope of the present invention. It is.
5). Protein chip
The membrane protease protein complex collected from the baculovirus of the present invention includes an active form. When this active protein complex is immobilized on a substrate, a protein chip can be obtained. The protein chip thus prepared can be used for screening a substance that interacts with an active membrane protease protein complex. An active membrane protease protein complex is bound to a chip coated with an ion exchange resin or metal ion, a sample to be screened is added to the chip, and a mass spectrometer (for example, MALDI-TOF type, ESI / The mass is measured using a Q-TOF type or the like. It is possible to identify the interacting substance by the change in mass.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited by an Example.

γ−セクレターゼ構成因子（ヒトプレセニリン１、ヒトニカストリン、ヒトＡＰＨ−１ａ、ヒトＰＥＮ−２）を発現する組換えバキュロウイルスの調製
（１）細胞の培養と感染、および発芽型バキュロウイルスの収集
ヒトプレセニリン１全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ＴＭベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、Ｃ末端側にタグを人工的に付加したヒトニカストリン又はヒトＡＰＨ−１ａ全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に、ヒトＰＥＮ−２全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａへ組み込み、それぞれｐＢｌｕｅＢａｃ−ＰＳ１、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＮＣＴ−Ｖ５／Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＡＰＨ−１ａ−ｍｙｃ／ＨｉｓおよびｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｈｉｓ−ＰＥＮ−２を作製した。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＧｒａｃｅ’ｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｍｅｄｉａ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ））で２７℃で１０ｃｍ径ディッシュに継代培養した。大量培養は、５００ｍＬ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）にて完全培地に０．００１％ｐｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルスの作製は説明書（Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ^ＴＭＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｓｆ９細胞にＢａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＤＮＡ（ＡｐＭＮＰＶ由来）と、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＰＳ１、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＮＣＴ−Ｖ５／Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＡＰＨ−１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ又はｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｈｉｓ−ＰＥＮ−２とを共感染させ、組み換えウイルスを作製した。
本実施例では、タグの付加に関し、以下の通り行った。
（ｉ）ヒトプレセニリン１は、タグ付加はせず、そのままｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。
（ｉｉ）ヒトニカストリンは、ｐＥＦ６−ＴＯＰＯ／Ｖ５／Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｃ末側にベクター由来のＶ５／Ｈｉｓタグを含んだｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。ヒトニカストリンの遺伝子には、Ｖ５タグ部分

Ｖ５タグ部分の塩基配列：

（ｉｉｉ）ヒトＡＰＨ−１ａは、ｐＥＦ４／ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｃ末側にベクター由来のｍｙｃ／Ｈｉｓタグを含んだｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。なお、ヒトＡＰＨ−１ａは、２５１型を使用した。

ヒトニカストリン及びヒトＡＰＨ−１ａは、終始コドン（ＴＡＧ）を省き、タグを付加したものをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。
（ｉｖ）ヒトＰＥＮ−２は、Ｎ末側付加したＨｉｓタグはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２のベクター由来のものを使用した。ヒトＰＥＮ−２については、開始コドン（ＡＴＧ）を省き、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａに組み込んだ。
（２）発芽型バキュロウイルスにおけるプロテアーゼ発現のウエスタンブロットによる解析
Ｓｆ９細胞を５００ｍＬ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に２×１０^６個／ｍｌ濃度で２５０ｍｌ培養し、上記（１）で作製した組み換えウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）＝５で感染させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液を１，０００×ｇで１０分間遠心し、沈澱及び上清に分離した。沈澱は細胞破砕緩衝液（１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ）））に懸濁しホモジェナイザーにて破砕後、１，５００×ｇ、１０分遠心した。さらに上清を１００，０００×ｇ、１時間超遠心し、沈澱をＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁しＳｆ９細胞膜画分とした。１，０００×ｇの遠心後の上清を４０，０００×ｇで３０分遠心し、沈澱をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した後、さらに４０，０００×ｇ、３０分遠心した。沈澱を１，０００×ｇで１０分遠心し、上清をさらに４０，０００×ｇ、３０分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁して発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。
組み換えウイルス感染後のＳｆ９細胞培養液について、０から９６時間まで２４時間毎に培養液を採取し、細胞膜画分および１，０００×ｇで遠心したＢＶ画分の上清画分を調製し、時間経過におけるプロテアーゼ発現量の変化を確認した（図２）。各時間における細胞膜画分（図２「ｃｅｌｌ」）１μｇ及び上清画分（図２「ＢＶ」）２００μｌを用いて、ヒトプレセニリン１を認識する抗ＰＳ１抗血清（図２「Ｇ１Ｎｒ２」）によるウェスタンブロットを行った。結果を図２に示す。図２の左端の数字は分子量（ｋＤ）を表す。その結果、細胞膜および上清画分いずれにおいても４８時間後からヒトプレセニリン１（ＰＳ１ｗｔ）の発現を確認した（図２の矢頭印）。この結果は、４８時間後の培養液中にプロテアーゼを含むウイルスが発現することを示す。Preparation of recombinant baculovirus expressing γ-secretase component (human presenilin 1, human nicastrin, human APH-1a, human PEN-2) (1) Cell culture and infection and collection of germinating baculovirus Presenilin 1 full-length cDNA is pBlueBac4.5TM vector (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), Human nicastrin or human APH-1a full-length cDNA with a C-terminal artificially added tag is added to pBlueBac4.5, and human PEN-2 full-length The cDNA was incorporated into pBlueBacHis2A to prepare pBlueBac-PS1, pBlueBac-NCT-V5 / His, pBlueBac-APH-1a-myc / His, and pBlueBac-His-PEN-2, respectively. Sf9 cells (Invitrogen) were subcultured in 10 cm diameter dishes at 27 ° C. in complete medium (Grace's supplemented media (GIBCOBRL) containing 10% fetal bovine serum (Sigma), 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin). . Mass culture was performed by adding 0.001% pluronic F-68 (GIBCO BRL) to a complete medium in a 500 mL spinner flask (Wheaton). Recombinant baculoviruses were prepared according to the instructions (Bac-N-Blue ^™ Transfection Kit, Invitrogen), using Sac9 cells with Bac-N-Blue DNA (derived from ApMNPV), pBlueBac-PS1, pBlueBac-NCT-V5 / His, pBlueBac. -APH-1-myc / His or pBlueBac-His-PEN-2 was co-infected to produce a recombinant virus.
In this embodiment, tag addition was performed as follows.
(I) Human presenilin 1 was incorporated into pBlueBac4.5 as it was without tagging.
(Ii) Human nicastrin was cloned into the pEF6-TOPO / V5 / His vector (Invitrogen), and cDNA containing the vector-derived V5 / His tag at the C-terminal side was incorporated into pBlueBac4.5. The human nicastrin gene contains a V5 tag

Base sequence of V5 tag part:

(Iii) Human APH-1a was cloned into the pEF4 / myc / HisA vector (Invitrogen), and cDNA containing the vector-derived myc / His tag at the C-terminal side was incorporated into pBlueBac4.5. As human APH-1a, type 251 was used.

In human nicastrin and human APH-1a, the stop codon (TAG) was omitted and a tag added was incorporated into pBlueBac4.5.
(Iv) As for the human PEN-2, the His tag added to the N-terminal side was derived from the vector of pBlueBacHis2. For human PEN-2, the start codon (ATG) was omitted and incorporated into pBlueBacHis2A.
(2) Analysis of protease expression in germinated baculovirus by Western blot Sf9 cells were cultured in a 500 mL spinner flask (Wheaton) at a concentration of 2 × 10 ⁶ cells / ml in 250 ml, and the recombinant virus prepared in (1) above was cultured. Infection was performed at a multiplicity of infection (MOI) = 5, and the culture solution after 72 hours was used for the experiment. The culture broth was centrifuged at 1,000 × g for 10 minutes, and separated into a precipitate and a supernatant. The precipitate was suspended in a cell disruption buffer (HEPES buffer containing 10% glycerol (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, Complete inhibitor cocktail (Roche Applied Science))), disrupted with a homogenizer, and 1500 ×. g Centrifuged for 10 minutes. Furthermore, the supernatant was ultracentrifuged at 100,000 × g for 1 hour, and the precipitate was suspended in HEPES buffer to obtain an Sf9 cell membrane fraction. The supernatant after centrifugation at 1,000 × g was centrifuged at 40,000 × g for 30 minutes, and the precipitate was suspended in a phosphate buffer (PBS), and further centrifuged at 40,000 × g for 30 minutes. The precipitate was centrifuged at 1,000 × g for 10 minutes, the supernatant was further centrifuged at 40,000 × g for 30 minutes, and the precipitate was suspended in PBS to obtain a germinating virus fraction (BV fraction).
About the Sf9 cell culture solution after the recombinant virus infection, the culture solution is collected every 24 hours from 0 to 96 hours, and the supernatant fraction of the cell membrane fraction and the BV fraction centrifuged at 1,000 × g is prepared, Changes in the amount of protease expression over time were confirmed (FIG. 2). Western with anti-PS1 antiserum recognizing human presenilin 1 (FIG. 2 “G1Nr2”) using 1 μg of cell membrane fraction (FIG. 2 “cell”) and 200 μl of supernatant fraction (FIG. 2 “BV”) at each time Blot was performed. The results are shown in FIG. The number at the left end of FIG. 2 represents the molecular weight (kD). As a result, the expression of human presenilin 1 (PS1 wt) was confirmed after 48 hours in both the cell membrane and the supernatant fraction (arrowhead in FIG. 2). This result indicates that a virus containing a protease is expressed in the culture solution after 48 hours.

発芽型バキュロウイルスにおけるγ−セクレターゼ複合体構成蛋白質の共発現
（１）γ−セクレターゼ複合体構成蛋白質の共感染
ヒトプレセニリン１、ヒトニカストリン、ヒトＡＰＨ−１ａ、ヒトＰＥＮ−２の各発現組み換えウイルスを、２×１０^６細胞／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞２００ｍｌに、さまざまな組み合わせにより各ウイルスあたりＭＯＩ＝２で感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製した。ＢＶ画分におけるγ−セクレターゼ構成因子の発現量は、ヒトプレセニリン１を認識する抗ＰＳ１抗血清、ヒトニカストリンに付加したＶ５タグを認識する抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＨ−１ａに付加したｍｙｃタグを認識する抗ｍｙｃ抗体（ＲｏｃｈｅまたはＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヒトＰＥＮ−２を認識する抗ＰＥＮ−２抗体を用いたウェスタンブロットにより確認した（図３）。図３において、各蛋白質の組合せを「＋」印で示す。図３において、「Ｇ１Ｎｒ２」および「Ｇ１Ｌ３」はヒトプレセニリンに対する抗体、「Ｖ５」はヒトニカストリンに付加したＶ５タグを認識する抗体、「ｍｙｃ」はＡＰＨ−１ａに付加したｍｙｃタグを認識する抗体、「ＰＮＴ−３」はヒトＰＥＮ−２に対する抗体を示す。
４種類の各発現組み換えウイルスをすべてＳｆ９細胞に感染させると、活性型プレセニリンとして考えられているフラグメント型プレセニリンを生じることが観察されたが（図３「ＰＳ１ＮＴＦ」および「ＰＳ１ＣＴＦ」）、他のいずれの組み合わせによってもフラグメント型プレセニリンを生じることはなかった。またこのＢＶ画分を１％ＣＨＡＰＳＯにより可溶化し、それぞれの特異抗体によって免疫沈降（ＩＰ）した後、各抗体でウェスタンブロット解析した。その結果、いずれの分子も相互作用していることが明らかとなった（図４）。図４において、「ａｎｔｉ−Ｇ１Ｌ３」はヒトプレセニリン１（ヒトプレセニリン１のフラグメント型であるＰＳ１ＣＴＦ）に対する抗体、「ａｎｔｉ−Ｖ５」はニカストリン（ＮＣＴ）に付加したＶ５タグを認識する抗体、「ａｎｔｉ−ｍｙｃ」はＡＰＨ−１ａに付加したｍｙｃタグを認識する抗体、「ａｎｔｉ−ＰＮＴ３」はヒトＰＥＮ−２に対する抗体を示す。
４分子を共発現させたＳｆ９細胞の膜画分とそれ由来のＢＶ画分を同時にウェスタンブロット解析したところ、Ｓｆ９細胞においては発現させたヒトプレセニリン１のほとんどが不活性型である全長型（図５「ＰＳ１ＦＬ」）にとどまっていたのに対し（図５「Ｓｆ９ｃｅｌｌｓ」）、ＢＶ画分においては全長型プレセニリンはほとんど見られず（図５「ＢｕｄｄｅｄＶｉｒｕｓ」）、選択的に活性型であるフラグメント型プレセニリンが集積しているのが観察された（図５「ＰＳ１ＮＴＦ」）。
共感染により生じた各ＢＶ画分を１％ＣＨＡＰＳＯにより可溶化し、人工基質を用いたｉｎｖｉｔｒｏ γ−セクレターゼアッセイ系により、γ−セクレターゼ活性をｄｅｎｏｖｏ合成されたＡβの集積を指標に用いて測定した（ＴａｋａｓｕｇｉＮ，ＴｏｍｉｔａＴ，ＨａｙａｓｈｉＩ，ＴｓｕｒｕｏｋａＭ，ＮｉｉｍｕｒａＭ，ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ＴｈｉｎａｋａｒａｎＧ，ＩｗａｔｓｕｂｏＴＮａｔｕｒｅ２００３，４２２：４３８−４４１Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｃｏｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅ γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ；ＴａｋａｈａｓｈｉＹ，ＨａｙａｓｈｉＩ，ＴｏｍｉｎａｒｉＹｅｔａｌ．：Ｓｕｌｉｎｄａｃｓｕｌｆｉｄｅｉｓａｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｇａｍｍａｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔｈａｔｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｒｅｄｕｃｅｓＡｂｅｔａ４２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００３Ｍａｒ２００３，：１０，）。
その結果、４分子を共感染させたＢＶ画分においてのみ人工基質の切断活性が観察された（図６）。この活性は既知のγ−セクレターゼ阻害剤（Ｌ−６８５，４５８およびＤＡＰＴ）によって阻害されたこと、またプレセニリンの活性に必須であると考えられている３８５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体（図７「ＰＳ１Ｄ３８５Ａ」）においては活性が失われていたことなどから、活性を持つγ−セクレターゼ複合体がＳｆ９細胞中で再構成され、選択的にＢＶ画分中に集積したことを表すものと考えられた（図７）。
産業上の利用の可能性
本発明により、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質又は活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体をバキュロウイルスに発現させることができる。本発明によれば、複合体を形成して機能する膜型プロテアーゼ（例えばプレセニリン等）の活性型蛋白質複合体を選択的に発現することが可能となり、基質との結合を阻害又は促進する物質のスクリーニングに使用することができる。Co-expression of γ-secretase complex constituent protein in germinating baculovirus (1) Co-infection of γ-secretase complex constituent protein Recombinant viruses expressing human presenilin 1, human nicastrin, human APH-1a and human PEN-2 Were infected with 200 ml of Sf9 cells at a concentration of 2 × 10 ⁶ cells / ml with MOI = 2 per virus by various combinations, and a BV fraction was prepared 72 hours later. The expression level of γ-secretase component in the BV fraction is as follows: anti-PS1 antiserum recognizing human presenilin 1, anti-V5 antibody recognizing V5 tag added to human nicastrin (Invitrogen), myc added to APH-1a This was confirmed by Western blotting using an anti-myc antibody that recognizes the tag (Roche or Cell Signaling Technology) and an anti-PEN-2 antibody that recognizes human PEN-2 (FIG. 3). In FIG. 3, the combination of each protein is indicated by a “+” mark. In FIG. 3, “G1Nr2” and “G1L3” are antibodies against human presenilin, “V5” is an antibody that recognizes the V5 tag added to human nicastrin, and “myc” is an antibody that recognizes the myc tag added to APH-1a. "PNT-3" indicates an antibody against human PEN-2.
Infection of all four types of recombinant viruses with Sf9 cells was observed to produce fragment-type presenilin, which is considered active presenilin (FIG. 3 “PS1 NTF” and “PS1 CTF”), etc. None of the combinations produced fragmented presenilin. The BV fraction was solubilized with 1% CHAPSO, immunoprecipitated (IP) with each specific antibody, and then subjected to Western blot analysis with each antibody. As a result, it was revealed that all molecules interacted (FIG. 4). In FIG. 4, “anti-G1L3” is an antibody against human presenilin 1 (PS1 CTF, which is a fragment type of human presenilin 1), “anti-V5” is an antibody that recognizes the V5 tag added to nicastrin (NCT), and “anti “-Myc” indicates an antibody that recognizes the myc tag added to APH-1a, and “anti-PNT3” indicates an antibody against human PEN-2.
When the membrane fraction of Sf9 cells co-expressed with 4 molecules and the BV fraction derived therefrom were analyzed simultaneously by Western blot analysis, the full-length type in which most of the human presenilin 1 expressed in Sf9 cells was inactive (Fig. 5 “PS1 FL”) (FIG. 5 “Sf9 cells”), but almost no full-length presenilin was found in the BV fraction (FIG. 5 “Budded Virus”), which is selectively active. Accumulation of some fragment type presenilin was observed (FIG. 5 “PS1 NTF”).
Each BV fraction produced by co-infection was solubilized with 1% CHAPSO, and γ-secretase activity was measured using an in vitro γ-secretase assay system using an artificial substrate using the accumulation of Aβ synthesized de novo as an indicator. the (Takasugi N, Tomita T, Hayashi I, Tsuruoka M, Niimura M, Takahashi Y, Thinakaran G, Iwatsubo T Nature 2003,422: 438-441 the role of presenilin cofactors in the γ-secretase complex; Takahashi Y, Hayashi I , Tominari Y et al .: Sulindac sulfide is a non-competitive ga ma secretase inhibitor that preferentially reduces Abeta 42 generation.J Biol Chem 2003 Mar 2003,: 10,).
As a result, the cleavage activity of the artificial substrate was observed only in the BV fraction co-infected with 4 molecules (FIG. 6). This activity was inhibited by known γ-secretase inhibitors (L-685,458 and DAPT), and a mutant in which the 385th aspartic acid was substituted with alanine, which is considered to be essential for the activity of presenilin. (FIG. 7 “PS1D385A”) indicates that the active γ-secretase complex was reconstituted in Sf9 cells and selectively accumulated in the BV fraction because activity was lost. (Fig. 7).
Industrial Applicability According to the present invention, an active membrane protease protein or an active membrane protease protein complex can be expressed in baculovirus. According to the present invention, an active protein complex of a membrane protease (for example, presenilin) that functions by forming a complex can be selectively expressed, and a substance that inhibits or promotes binding to a substrate. Can be used for screening.

配列番号１７：Ｖ５タグペプチド配列
配列番号１８：Ｖ５タグヌクレオチド配列
配列番号１９：Ｈｉｓタグペプチド配列
配列番号２０：Ｈｉｓタグヌクレオチド配列
配列番号２１：ｍｙｃタグペプチド配列
配列番号２２：ｍｙｃタグヌクレオチド配列SEQ ID NO: 17: V5 tag peptide sequence SEQ ID NO: 18: V5 tag nucleotide sequence SEQ ID NO: 19: His tag peptide sequence SEQ ID NO: 20: His tag nucleotide sequence SEQ ID NO: 21: myc tag peptide sequence SEQ ID NO: 22: myc tag nucleotide sequence

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

A host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane-type protease protein and a gene encoding a complex-constituting factor is cultured or bred and complexed with a membrane-type protease protein in a germinated baculovirus released from the host A method for expressing a membrane protease protein complex, comprising expressing a complex with a constituent factor.

From a collected product obtained by culturing or breeding a host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane protease protein and a gene encoding a complex constituent factor, recovering the germinated baculovirus from the culture or individual host A method for producing an active membrane protease protein complex, which comprises collecting an active membrane protease protein complex.

The method according to claim 1 or 2, wherein the membrane protease protein is presenilin.

The method according to claim 1 or 2, wherein the complex constituents are nicastrin, APH-1 and PEN-2.

The method according to claim 1 or 2, wherein the membrane protease protein complex is γ-secretase.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the host is an insect cell or an insect larva.

A germinating baculovirus released by a host infected with a baculovirus containing a gene encoding a membrane protease protein and a gene encoding a complex constituent factor.

The germinating baculovirus according to claim 7, wherein the membrane protease protein is presenilin.

The germinating baculovirus according to claim 7, wherein the complexing factor is nicastrin, APH-1 and PEN-2.

The germinating baculovirus according to any one of claims 7 to 9, comprising a membrane protease protein complex.

The germinating baculovirus according to claim 10, wherein the membrane protease protein complex is γ-secretase.

The germinating baculovirus according to any one of claims 7 to 11, wherein the host is an insect cell or an insect larva.

An active membrane protease protein complex collected from the germinating baculovirus according to any one of claims 7 to 12.

14. The complex according to claim 13, wherein the membrane protease protein complex is γ-secretase.

15. A method for analyzing a substance that interacts with an active membrane protease protein complex, comprising contacting a labeled test substance with the complex according to claim 13 or 14, and then outputting a signal of the test substance. Said method comprising detecting.

A method for screening a substance that promotes or inhibits an enzyme activity of an active membrane protease protein complex, comprising contacting a test substance with the complex according to claim 13 or 14, and then the protease of the complex Said method comprising measuring activity.

The method according to claim 15 or 16, wherein the membrane protease protein complex is γ-secretase.

A protein chip on which the complex according to claim 13 or 14 is arranged.