JPWO2004094638A1

JPWO2004094638A1 - Vasculitis antigen peptide and vasculitis diagnostic method

Info

Publication number: JPWO2004094638A1
Application number: JP2005505770A
Authority: JP
Inventors: 加藤　智啓; 智啓加藤; 西岡　久寿樹; 久寿樹西岡; 承一尾崎; 里江唐澤
Original assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; St Marianna University School of Medicine
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; St Marianna University School of Medicine
Priority date: 2003-04-21
Filing date: 2004-04-21
Publication date: 2006-11-24
Also published as: WO2004094638A1

Abstract

ペルオキシレドキシンであるヒト血管炎抗原ペプチドと、被験者の血清中に、この抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験する血管炎診断方法。A method for diagnosing vasculitis, which tests whether a human vasculitis antigen peptide, which is peroxiredoxin, and an antibody that binds to the antigen peptide are present in the serum of a subject.

Description

この出願の発明は、ヒト血管炎の抗原ペプチドと、このペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらを用いた血管炎診断方法に関するものである。 The invention of this application relates to an antigenic peptide for human vasculitis, a polynucleotide encoding the peptide, and a method for diagnosing vasculitis using these.

結節性多発動脈炎などの血管炎症を主体とする一群の疾患（いわゆる血管炎症候群）は、一般に難治性かつ予後不良であり、その病因解明が社会的要請となっている。血管炎に含まれる疾患として、結節性多発動脈炎の他、ウエゲナー肉芽腫症、顕微鏡的結節性多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、結節性多発動脈炎、側頭動脈炎、高安動脈炎、悪性関節リウマチ、バージャー病、抗リン脂質抗体症候群、川崎病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、リベドー紫斑病、半月体形成腎炎、肺毛細血管炎、チャーグ−ストラウス症候群等、多くの疾病が知られている。また、皮膚筋炎、混合性結合組織病、強皮症、ベーチェット病、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデスなどの膠原病において血管炎を合併しうることが知られている。発症の機序としては自己免疫機序の関与が考えられているが、その詳細は不明である。
一方、各種のヒト疾患に対して、その疾患に特異的な血清マーカーを指標とする分子生物学的診断が普及しつつある。この方法は、抗体と反応性を有する患者血清中の自己抗原ペプチドの存在、または抗原ペプチドに反応する自己抗体の存在を検出するものであり、大がかりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。血管炎においても、例えばＡＮＣＡ等の診断的価値のある自己抗体が報告されているが（ＢａｒｔｕｎｋｏｖａＪ，ＴｅｓａｒＶ，ＳｅｄｉｖａＡ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃｒｏｌｅｏｆａｎｔｉｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ２００３；１０６：７３−８２）、ＡＮＣＡ陰性の血管炎も多くあり、診断指標として不十分である。A group of diseases mainly composed of vascular inflammation such as polyarteritis nodosa (so-called vasculitis syndrome) is generally refractory and has a poor prognosis, and elucidation of the etiology has become a social request. Diseases included in vasculitis include nodular polyarteritis, Wegener's granulomatosis, microscopic nodular polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, nodular polyarteritis, temporal arteritis, Takayasu artery Many diseases are known, such as inflammation, malignant rheumatoid arthritis, Buerger's disease, antiphospholipid antibody syndrome, Kawasaki disease, Henoch-Schenlein purpura, Ribedo purpura, crescent nephritis, pulmonary capillaritis, Churg-Strauss syndrome It has been. It is also known that vasculitis can be associated with collagen diseases such as dermatomyositis, mixed connective tissue disease, scleroderma, Behcet's disease, Sjogren's syndrome, and systemic lupus erythematosus. Involvement of autoimmune mechanism is considered as the onset mechanism, but the details are unknown.
On the other hand, for various human diseases, molecular biological diagnosis using a serum marker specific for the disease as an index is becoming widespread. This method detects the presence of an autoantigen peptide in a patient's serum reactive with an antibody or the presence of an autoantibody that reacts with an antigen peptide, and does not require a large facility, and the burden on the subject is also reduced. Since the number is small, it can be widely applied to many subjects who have no subjective symptoms. In vasculitis, for example, autoantibodies with diagnostic value such as ANCA have been reported (Bartunkova J, Tesar V, Sediva A. Diagnostic and pathogenetic role of antineurotrophic cytoplasmic 82. ), Many ANCA-negative vasculitis, which is insufficient as a diagnostic index.

この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、血管炎の診断に有効な新規抗原ペプチドを提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、前記の抗原ペプチドをコードする遺伝子材料と、抗原ペプチドに対する抗体を提供することを課題としている。
さらにこの出願の発明は、前記のペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体等を用いた血管炎診断方法を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１７）の発明を提供する。
（１）ヒト・ペルオキシレドキシンである血管炎抗原ペプチド。
（２）配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト・ペルオキシレドキシン２相同体である前記発明（１）の血管炎抗原ペプチド。
（３）前記発明（１）の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（４）配列番号１の塩基配列を有し、前記発明（２）のヒト・ペルオキシレドキシン２相同体をコードする前記発明（３）のポリヌクレオチド。
（５）前記発明（３）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセット。
（６）前記発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体。
（７）前記発明（６）の抗体とは異なるエピトープと結合する抗体。
（８）被験者から採取した生体試料中の前記発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体を検出し、生体試料中にその抗体が健常者よりも多く存在する被験者を血管炎患者または血管炎ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト血管炎診断方法。
（９）抗原ペプチドを固定化した担体上において被験者から採取した生体試料中の抗体と抗原ペプチドとの結合を試験する前記発明（８）の診断方法。
（１０）被験者から採取した生体試料中の前記発明（６）の抗体と結合する抗原ペプチドを検出し、生体試料中にその抗原ペプチドが健常者よりも多く存在する被験者を血管炎患者または血管炎ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト血管炎診断方法。
（１１）前記発明（６）の抗体を固定化した担体上において、抗体と抗原ペプチドの結合を試験する前記発明（１０）の診断方法。
（１２）被験者から採取した生体試料における前記発明（３）のポリヌクレオチドの存在量を試験し、ポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を血管炎患者または血管炎ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト血管炎診断方法。
（１３）少なくとも以下の要素：
（ａ）前記発明（１）の抗原ペプチド；および
（ｂ）前記発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体に特異的に結合する標識化抗体
からなることを特徴とする血管炎診断キット。
（１４）少なくとも以下の要素：
（ａ）前記発明（１）の抗原ペプチドを固定化した担体；および
（ｂ）前記発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体に特異的に結合する標識化抗体
からなることを特徴とする血管炎診断キット。
（１５）少なくとも、前記発明（６）の抗体および／または標識化した前記発明（７）の抗体を含むことを特徴とする血管炎診断キット。
（１６）少なくとも以下の要素：
（ａ）前記発明（６）の抗体；および
（ｂ）標識化した前記発明（７）の抗体
からなることを特徴とする血管炎診断キット。
（１７）少なくとも以下の要素：
（ａ）前記発明（６）の抗体を固定化した担体；および
（ｂ）標識化した前記発明（７）の抗体
からなることを特徴とする血管炎診断キット。
（１８）血液に不溶性の担体に固定化されたヒトのペルオキシレドキシンまたはその抗原決定基を含む断片を含む、血管炎の治療剤。
（１９）次の工程を含む、血管炎の治療または予防方法。
（ａ）患者から採取した血液または抗体を含むその分画を、血液に不溶性の担体に固定化されたヒトのペルオキシレドキシンまたはその抗原決定基を含む断片に接触させる工程、および
（ｂ）工程（ａ）の後に当該血液またはその分画を、患者に戻す工程。
（２０）抗体を含む分画が血漿である前記発明（１９）に記載の方法。
すなわち、この出願の発明者らは、２次元電気泳動法（例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２２：３０１９−３０２５，２００１）により血管内皮細胞に特異的な自己抗原ペプチドを網羅的に解析することによって、血管炎患者血清が反応する血管炎抗原ペプチドを同定し、それがペルオキシレドキシンまたはチオレドキシンペルオキシダーゼであることを見出してこの発明を完成させた。ペルオキシレドキシンまたはチオレドキシンペルオキシダーゼはその抗酸化作用や、酸素ストレスに対する細胞反応等に関係する酵素タンパク質として知られているが、血管炎との関係、特に血管炎患者血清中の抗体と特異的に反応することは、従来全く知られていない。
この出願の発明は、以上のとおりの新規抗原ペプチドと、そのペプチドに対する抗体、それらをコードするポリヌクレオチドを基礎とするものである。
なお、この発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
また、配列表に示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含するものである。
さらに、「ペルオキシレドキシンを認識する抗体」とは、発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体を意味するが、ペルオキシレドキシンと非特異的に結合する抗体は含まない。また、発明（６）および（７）の「抗体」は、発明（１）の抗原ペプチドを免疫原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を意味する。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の診断方法等に使用可能な薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
発明（１）の血管炎抗原ペプチドは、ペルオキシレドキシン（Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ：ＰＲＤＸ）である。このＰＲＤＸはまた、チオレドキシンペルオキシダーゼ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）と呼称されることもある。ＰＲＤＸとしては、ＰＲＤＸ１（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００２５７４）、ＰＲＤＸ２（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００５８０９）、ＰＲＤＸ３（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００６７９３）、ＰＲＤＸ４（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００６４０６）、ＰＲＤＸ５（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０１２０９４）、ＰＲＤＸ６（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿００４９０５）が公知である。またチオレドキシンペルオキシダーゼとしてはＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ００３６０９、ＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ００７１０７等が公知である。さらに、ＰＲＤＸ２（チオレドキシンペルオキシダーゼ１）の相同体としてはＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ００３０２２、ＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ０００４５２が公知である。従って、この発明（１）の血管炎抗原はこれら公知のＰＲＤＸを全て包含するが、特に配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＲＤＸ２相同体（ＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ０００４５２）が好ましい（発明（２））。
これらの抗原ペプチド（ＰＲＤＸ）は、例えば、発明（３）のポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでペプチドを発現できる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からペプチドを発現させることができる。
抗原ペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
抗原ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている抗原ペプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＭＡＬ発現システムなどが例示できる。
抗原ペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、抗原ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原ペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の抗原ペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
抗原ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも第１発明の抗原ペプチドの範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
以上の方法により得られた抗原ペプチドは、この発明によって提供される血管炎診断方法の材料として使用される。
発明（３）は、発明（１）の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片）である。具体的には、各ペプチド（タンパク質）をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡである。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。またさらに、ゲノムＤＮＡの場合には、その発現制御領域（プロモーター、エンハンサー、サプレッサー領域）をも含む。
これらのポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、ｃＤＮＡの場合には、公知の方法（Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２，１６１−１７０，１９８２；Ｊ．Ｇｅｎｅ２５，２６３−２６９，１９８３；Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０，１９９４）を用いてｃＤＮＡを合成し、それぞれ公知の塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを用いて、それぞれのｃＤＮＡを単離する方法によって取得することができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても必要量の各ｃＤＮＡを得ることができる。
このようにして取得されるポリヌクレオチドの好ましい態様は、ＰＲＤＸ２相同体をコードする配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）である（発明（４））。
またさらに、この発明（３）ポリヌクレオチドには、その一部連続配列からなるオリゴヌクレオチドも含まれる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば前記のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断することによっても得ることができる。あるいは、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）ＦｒｅｅＲａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば発明（１）のポリヌクレオチドを単離するためのプローブとして使用することができる。従って、このオリゴヌクレオチドは、標識物質によって標識化されたものも含まれる。標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅ^ＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ^２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
発明（５）は、発明（３）のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットであり、これはそれぞれ公知の塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効果的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１〜約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
発明（６）の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、発明（１）の抗原ペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。また、発明（７）の抗体は、前記発明（６）の抗体とは異なるエピトーブに結合する抗体である。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。
また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年；″ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ″ＪａｍｅｓＷ．Ｇｏｄｉｎｇ，ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９６）に従い作製することができる。
発明（７）の抗体は、前記発明（６）の抗体とは異なるエピトープに結合する抗体である。このような抗体は、前記発明（６）の抗体作製のための抗原ペプチド断片とは異なる断片を免疫原とすることによって、前記と同様のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として作製される。
発明（６）および（７）の抗体には、それぞれ標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のイムノアッセイに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いたり、アクリジニウム・エステルによって標識することもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、^１２５Ｉや^３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。
発明（８）のヒト血管炎診断方法は、被験者から採取した生体試料中の、前記発明（１）の抗原ペプチドと結合する抗体を検出し、生体試料中にその抗体が健常者よりも多く存在する被験者を血管炎患者または血管炎ハイリスク者と判定する。すなわち、発明（１）の抗原ペプチドは、血管炎患者の生体試料中の抗体と結合するペプチドであるから、被験者の生体試料と反応させ、この抗原ペプチドと結合する抗体を健常者よりも多く含む生体試料を、血管炎患者またはそのハイリスク患者の生体試料として判定することができる。抗体の検出は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ、ルシフェラーゼアッセイ等の各種公知イムノアッセイとして実施することができる。本発明における検出は、定性的であっても定量的であってもよく、抗体を定量する場合は、血管炎の診断、スクリーニング目的のほか、血管炎治療のモニタリング目的としても使用できる。生体試料としては、血液、血清、血漿や血液細胞（単核球等）、尿、骨髄液、唾液等を用いることができる。なおその際に、すでに知られている他の血管炎マーカーを併用することもできる。
具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験者血清を接触させ、抗原ペプチドと被験者血清中のＩｇＧ抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中のＩｇＧ抗体と特異的に結合する標識化抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させて、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体のシグナルを検出すればよい。標識化抗ヒトＩｇＧ抗体の標識物質は、前記の標識化抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素等を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射性同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。化学発光法の場合はアクリジニウム・エステル発光の量を測定すればよい。
シグナルの検出は、例えば、ウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ペプチド＋生体試料中抗体＋標識化抗ヒトＩｇＧ抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、固相法等）によって分離し、標識化抗ヒトＩｇＧ抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。なお、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１３）の診断キットが提供される。
発明（８）の診断方法はまた、抗原ペプチドの１種類以上を担体に固定化し、この担体上において被験者生体試料の担体との結合を試験する方法（発明（９））として実施することもできる。抗原ペプチドを担体上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。担体としては、ビーズ、容器内壁、微粒子、多孔質担体、あるいは磁性粒子などが用いられる。これらの固相は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、ガラス、金属、あるいはセラミック等の素材を利用して成型されたものを利用できる。これらの固相素材の表面に、抗体等を化学的に結合するための官能基を導入した固相素材も知られている。固相と抗体（あるいは抗原）についても、ポリ−Ｌ−リジンやグルタールアルデヒド処理といった化学的な結合や、物理吸着といった公知の結合方法を応用することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１４）の診断キットが提供される。また特に、数十種類の抗原ペプチドを固定化したメンブレンを用いるプロテインアレイ法では、０．０１ｍｌ程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。
この出願の発明（１０）の診断方法は、被験者の生体試料中の、前記発明（６）の抗体、またはその標識化抗体と結合する抗原ペプチドを検出し、試料中にその抗原ペプチドが健常者よりも多く存在する被験者を血管炎患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、血管炎を呈した血管内皮細胞で発現している抗原ペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ペプチドを含む生体試料を、血管炎患者またはそのハイリスク患者の試料として判定することができる。生体試料としては、血液、血清、血漿、血液細胞（単核球等）、尿、骨髄液、唾液等を対象とすることができる。
この発明（１０）の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、発明（６）の標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体を前記発明（８）と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１５）の診断キットが提供される。
液相系での診断の別の方法は、発明（６）の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体に標識化した発明（７）の抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体＋抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記発明（８）と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１６）の診断キットが提供される。
発明（１０）の診断方法における別の態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原ペプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、発明（６）の抗体を樹脂プレート、ビーズ、メンブレン等の担体に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、担体上に残った抗体＋抗原ペプチド結合体に発明（７）の標識化抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）」として広く用いられている方法である。２種類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は前記発明（８）と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（１７）の診断キットが提供される。
発明（１３）〜（１７）の診断キットは、前記発明（８）〜（１１）の診断方法を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ペプチド、抗体および／または標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。
発明（１２）の診断方法は、被験者の生体試料における前記発明（３）のポリヌクレオチドの存在量を試験し、ポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を血管炎患者またはそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれと比較して、１０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上である場合である。
生体試料としては、便や血液、血液細胞（リンパ球等）を対象とすることができる。ポリヌクレオチドの検出、測定は公知のＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等によって行うことができ、その場合のＰＣＲは発明（５）のプライマーセットを用いることができる。
またさらに、発明（１２）の診断方法は、この発明によって提供されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを備えたＤＮＡマイクロアレイによっても実施することができる。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明で使用するマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７，１９９１）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４９１３，１９９６）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１１１９−１１２３，１９９７）。このマイクロアレイを使用して血管炎を診断する場合には、例えば被験者の細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとする。この標識ｃＤＮＡをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注して標識ｃＤＮＡ水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
発明（１９）の血管炎の治療または予防方法は、患者から血液を取り出して血液中の抗ヒトペルオキシレドキシン抗体を選択的に除去した後、血液を再び患者に戻す方法である。発明（１９）の方法は、「（ａ）患者から採取した血液または抗体を含むその分画を、血液に不溶性の担体に固定化されたヒトのペルオキシレドキシンまたはその抗原決定基を含む断片に接触させる工程」（以下、「接触工程」と略称する。）および「（ｂ）工程（ａ）の後に当該血液またはその分画を、患者に戻す工程」を含む。実施例に後述するように、本発明者らは血管炎患者の血清中には抗ヒトペルオキシレドキシン抗体が有意に高く存在することを初めて確認した。この結果からは、抗ヒトペルオキシレドキシン抗体が血管炎の発症または進展に強く関連することが示唆される。したがって、血液中の抗ヒトペルオキシレドキシン抗体を除去することにより血管炎の症状の改善または予防が可能になると考えられる。発明（１９）の方法では、接触工程において、固定化されたヒトのペルオキシレドキシンまたはその抗原決定基を含む断片によって抗ヒトペルオキシレドキシン抗体が吸着されることによって、上記抗体が血液中から除去される。
患者から取り出した血液は、ヒトペルオキシレドキシン等と接触させる前に、いくつかの分画に分ける処理を施してもよい。例えば発明（２０）のように、血液を血漿分離機で血漿分画と細胞分画に分離し、抗ヒトペルオキシレドキシン抗体が存在する血漿分画のみを上記接触工程に付すことができる。抗ヒトペルオキシレドキシン抗体が除去された血漿は、細胞分画と共に再び患者の体内へ戻される。
発明（１９）の方法を実施するには、発明（１８）の治療剤を用いることができる。発明（１８）の治療剤は、ヒトペルオキシレドキシンまたはその抗原決定基を含んだ断片が血液に不溶性の担体に固定化された状態で含まれている。したがって、患者から取り出された血液を該治療剤に通過させると、血液中の抗ヒトペルオキシレドキシン抗体を選択的に除去することが可能である。血液に不溶性の担体として、セルロース、アガロース、セファロース、デキストラン、キチン、キトサン、これらの誘導体、有機または無機の多孔性材料、磁気ビーズ、マイクロビーズなどを使用することができるが、血液に不溶性である限りこれらに限定されない。上記担体にヒトペルオキシレドキシンまたはその抗原決定基を含んだ断片を物理的吸着や共有結合による不溶化によって固定化させ、発明（１８）の治療剤とすることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。The invention of this application has been made in view of the circumstances as described above, and an object thereof is to provide a novel antigen peptide effective for diagnosing vasculitis.
Another object of the invention of this application is to provide a genetic material encoding the antigen peptide and an antibody against the antigen peptide.
Furthermore, an object of the invention of this application is to provide a method for diagnosing vasculitis using the aforementioned peptides, polynucleotides, antibodies and the like.
This application provides the following inventions (1) to (17) to solve the above problems.
(1) A vasculitis antigen peptide which is human peroxiredoxin.
(2) The vasculitis antigen peptide of the invention (1) which is a human peroxiredoxin 2 homolog having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
(3) A polynucleotide encoding the antigenic peptide of the invention (1).
(4) The polynucleotide of the invention (3) having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and encoding the human peroxiredoxin 2 homologue of the invention (2).
(5) A primer set for PCR amplification of the polynucleotide of the invention (3).
(6) An antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1).
(7) An antibody that binds to an epitope different from the antibody of the invention (6).
(8) An antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1) in a biological sample collected from a subject is detected, and a subject in which more of the antibody is present in the biological sample than a healthy subject is identified as a vasculitis patient or vasculitis high A method for diagnosing human vasculitis, characterized in that it is determined as a risk person.
(9) The diagnostic method according to the invention (8), wherein the binding between an antibody and an antigen peptide in a biological sample collected from a subject on a carrier on which an antigen peptide is immobilized is tested.
(10) An antigenic peptide that binds to the antibody of the invention (6) in a biological sample collected from a subject is detected, and a subject in which the antigenic peptide is present in a biological sample more than a healthy subject is treated as a vasculitis patient or vasculitis A method for diagnosing human vasculitis, characterized by determining a high-risk person.
(11) The diagnostic method of the invention (10), wherein the binding of the antibody and the antigenic peptide is tested on a carrier on which the antibody of the invention (6) is immobilized.
(12) The presence of the polynucleotide of the invention (3) in a biological sample collected from a subject is tested, and a subject having a higher amount of polynucleotide compared to those of a healthy subject is treated with a vasculitis patient or vasculitis high risk. A method for diagnosing human vasculitis, characterized in that it is determined as a person.
(13) At least the following elements:
(A) the antigenic peptide of the invention (1); and
(B) a labeled antibody that specifically binds to an antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1)
A diagnostic kit for vasculitis, comprising:
(14) At least the following elements:
(A) a carrier on which the antigenic peptide of the invention (1) is immobilized; and
(B) a labeled antibody that specifically binds to an antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1)
A diagnostic kit for vasculitis, comprising:
(15) A vasculitis diagnostic kit, comprising at least the antibody of the invention (6) and / or the labeled antibody of the invention (7).
(16) At least the following elements:
(A) the antibody of the invention (6); and
(B) Labeled antibody of the invention (7)
A diagnostic kit for vasculitis, comprising:
(17) At least the following elements:
(A) a carrier on which the antibody of the invention (6) is immobilized; and
(B) Labeled antibody of the invention (7)
A diagnostic kit for vasculitis, comprising:
(18) A therapeutic agent for vasculitis, comprising human peroxiredoxin or a fragment containing an antigenic determinant thereof immobilized on a carrier insoluble in blood.
(19) A method for treating or preventing vasculitis, comprising the following steps.
(A) contacting a blood sample collected from a patient or a fraction thereof containing an antibody with a fragment containing human peroxiredoxin or an antigenic determinant thereof immobilized on a carrier insoluble in blood; and
(B) A step of returning the blood or a fraction thereof to the patient after the step (a).
(20) The method according to the above (19), wherein the fraction containing the antibody is plasma.
That is, the inventors of the present application comprehensively analyze autoantigenic peptides specific for vascular endothelial cells by two-dimensional electrophoresis (for example, Electrophoresis 22: 3019-3025, 2001), thereby providing a patient with vasculitis. The present invention was completed by identifying an angiitis antigen peptide to which serum reacts and finding that it is peroxiredoxin or thioredoxin peroxidase. Peroxiredoxin or thioredoxin peroxidase is known as an enzyme protein related to its antioxidant activity and cellular response to oxygen stress, etc., but it specifically reacts with vasculitis, especially with antibodies in sera of vasculitis patients It has never been known before.
The invention of this application is based on the novel antigen peptide as described above, an antibody against the peptide, and a polynucleotide encoding them.
In the present invention, “protein” and “peptide” mean molecules composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by amide bonds (peptide bonds). “Polynucleotide” refers to a molecule in which 100 or more phosphosides (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dUTP) of nucleoside in which purine or pyrimidine is β-N-glycoside-linked to a sugar. And “oligonucleotide” refers to a 2-99 linked molecule.
For the base sequences and amino acid sequences shown in the sequence listing, addition or deletion of one or more bases, substitution with other bases, or addition or deletion of one or more amino acid residues based on these base mutations And substitutions with other amino acids are also included.
Furthermore, “an antibody recognizing peroxiredoxin” means an antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1), but does not include an antibody that binds nonspecifically to peroxiredoxin. The “antibodies” of the inventions (6) and (7) mean polyclonal antibodies or monoclonal antibodies prepared using the antigenic peptide of the invention (1) as an immunogen.
Other terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description of the embodiments and examples of the invention. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and surely implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for a technique that clearly indicates the source. For example, preparation of a drug that can be used in the diagnostic method of the present invention is described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990, genetic engineering and molecular biology techniques are described in Sambrook and Maniatis, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989A; M.M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N .; Y, 1995, and the like.
Hereinafter, embodiments will be described in detail for each invention.
The vasculitis antigen peptide of the invention (1) is peroxiredoxin (PRDX). This PRDX may also be referred to as thioredoxin peroxidase. PRDX includes PRDX1 (GenBank / NM_002574), PRDX2 (GenBank / NM_006793), PRDX4 (GenBank / NM_006406), PRDX5 (GenBank / NMPR01 / Gen. Further, as thioredoxin peroxidase, GenBank / BC003609, GenBank / BC007107 and the like are known. Furthermore, GenBank / BC003022 and GenBank / BC000452 are known as homologues of PRDX2 (thioredoxin peroxidase 1). Therefore, the vasculitis antigen of the present invention (1) includes all of these known PRDX, but a PRDX2 homologue (GenBank / BC000452) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is particularly preferred (Invention (2)).
These antigen peptides (PRDX) can be expressed in vitro by, for example, preparing RNA by in vitro transcription from the recombinant expression vector having the polynucleotide of invention (3) and performing in vitro translation using this as a template. . Moreover, if a recombinant expression vector is introduced into prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, or eukaryotic cells such as yeast, insect cells and mammalian cells to produce transformed cells, the peptide is expressed from the transformed cells. be able to.
When expressing an antigenic peptide by in vitro translation, a polynucleotide is inserted into a vector having an RNA polymerase promoter to produce a recombinant expression vector, and this vector is lysed with rabbit reticulocyte containing RNA polymerase corresponding to the promoter. And in vitro translation systems such as wheat germ extract, the antigenic peptide can be produced in vitro. Examples of the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like. Examples of vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T718, pT7 / 319, pBluescript II, and the like.
When an antigenic peptide is expressed in a microorganism such as E. coli, an expression vector is prepared by recombining the polynucleotide with a vector having an origin, promoter, ribosome binding site, DNA cloning site, terminator, etc. that can replicate in the microorganism. Then, after transforming a host cell with this expression vector and culturing the resulting transformant, the antigenic peptide encoded by the polynucleotide can be expressed from a microorganism. At this time, it can also be expressed as a fusion protein with another protein. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system, pMAL expression system and the like.
When an antigenic peptide is expressed in a eukaryotic cell, a polynucleotide is inserted into an eukaryotic expression vector having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, etc., to produce a recombinant vector. When introduced into nuclear cells, the antigenic peptide can be expressed in transformed eukaryotic cells. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like. Moreover, if pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, a fusion protein to which various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, GFP are added. An antigenic peptide can also be expressed as: As eukaryotic cells, cultured mammalian cells such as monkey kidney cells COS7 and Chinese hamster ovary cells CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, Xenopus egg cells and the like are generally used, and the antigenic peptide of the present invention can be expressed. Any eukaryotic cell can be used. In order to introduce an expression vector into a eukaryotic cell, a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method can be used.
In order to isolate and purify the target peptide from the culture after the antigen peptide is expressed in prokaryotic cells or eukaryotic cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
In addition, the recombinant antigen peptide obtained by the above method includes a fusion protein with any other protein. Examples thereof include a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) and green fluorescent protein (GFP). Furthermore, the peptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated. Therefore, modified peptides are also included in the scope of the antigenic peptide of the first invention. Examples of such post-translational modifications include elimination of N-terminal methionine, acetylation, glycosylation, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, phosphorylation, and the like.
The antigenic peptide obtained by the above method is used as a material for the vasculitis diagnostic method provided by the present invention.
Invention (3) is a polynucleotide (DNA fragment, RNA fragment) encoding the antigenic peptide of invention (1). Specifically, genomic DNA encoding each peptide (protein), mRNA transcribed from genomic DNA, and cDNA synthesized from mRNA. Further, it may be double-stranded or single-stranded. Furthermore, the sense strand and antisense strand of these genomic DNA, mRNA, and cDNA are also included. Furthermore, in the case of genomic DNA, its expression control region (promoter, enhancer, suppressor region) is also included.
Each of these polynucleotides can be easily obtained by a known method. For example, in the case of cDNA, cDNA can be obtained using a known method (Mol. Cell Biol. 2, 161-170, 1982; J. Gene 25, 263-269, 1983; Gene, 150, 243-250, 1994). Can be obtained by a method of isolating each cDNA using probe DNA prepared based on each known base sequence. The obtained cDNA can be obtained by, for example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transscription-mediated amplification) method and SDA (Strandment amplification method). Can be amplified. In addition, using the primer set provided by the present invention, a necessary amount of each cDNA can also be obtained by the RT-PCR method using mRNA isolated from human cells as a template.
A preferred embodiment of the polynucleotide thus obtained is a polynucleotide (cDNA) having the base sequence of SEQ ID NO: 1 encoding the PRDX2 homologue (Invention (4)).
Furthermore, the polynucleotide of the present invention (3) includes an oligonucleotide having a partially continuous sequence. Such an oligonucleotide can also be obtained, for example, by cleaving the polynucleotide (cDNA) with an appropriate restriction enzyme. Alternatively, Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Adams (1983) J. MoI. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Bloomers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; can be synthesized in vitro by well-known chemical synthesis techniques such as those described in US Pat. No. 4,458,066. These oligonucleotides can be used as probes for isolating the polynucleotide of the invention (1), for example. Therefore, this oligonucleotide includes those labeled with a labeling substance. The labeling can be performed by a radioisotope (RI) method or a non-RI method, but it is preferable to use a non-RI method. Examples of the non-RI method include a fluorescence labeling method, a biotin labeling method, a chemiluminescence method, and the like, but it is preferable to use a fluorescence labeling method. As the fluorescent substance, those capable of binding to the base moiety of the oligonucleotide can be appropriately selected and used. However, cyanine dyes (for example, Cy Dye) can be used. ^TM Series Cy3, Cy5, etc.), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N ² -Acetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) and the like can be used.
The invention (5) is a primer set for PCR amplification of the polynucleotide of the invention (3), which can be designed based on a known base sequence and prepared through synthesis and purification steps. In addition, the following can be pointed out as points to keep in mind when designing the primer. The size (number of bases) of the primer is 15-40 bases, preferably 15-30 bases in consideration of satisfying specific annealing with the template DNA. However, when LA (long accumulate) PCR is performed, at least 30 bases are effective. In order not to anneal one pair or one pair (two strands) of the sense strand (5 ′ end side) and the antisense strand (3 ′ end side) to each other, avoid complementary sequences between both primers and Avoid self-complementary sequences to prevent the formation of hairpin structures. Further, in order to ensure stable binding with the template DNA, the GC content is set to about 50% so that GC-rich or AT-rich is not unevenly distributed in the primer. Since the annealing temperature depends on Tm (melting temperature), in order to obtain highly specific PCR products, primers having Tm values of 55 to 65 ° C. that are close to each other are selected. It is also necessary to pay attention to adjusting the final concentration of primers used in PCR to be about 0.1 to about 1 μM. Also, commercially available software for primer design, such as Oligo ™ [National Bioscience Inc. (Manufactured by (USA)], GENETYX [manufactured by Software Development Co., Ltd. (Japan)], and the like can also be used.
The antibody of the invention (6) is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is a whole molecule capable of binding to an epitope of the antigenic peptide of the invention (1), and Fab, F (ab ′) ₂ , Fv fragments, etc. are all included. The antibody of the invention (7) is an antibody that binds to an epitope different from the antibody of the invention (6). For example, in the case of a polyclonal antibody, such an antibody can be obtained from serum after immunizing an animal using an antigen peptide or a partial fragment thereof as an immunogen. Alternatively, it can be prepared by introducing the expression vector for eukaryotic cells into animal muscle or skin by injection or gene gun, and then collecting serum. As the animal, mouse, rat, rabbit, goat, chicken and the like are used.
Monoclonal antibodies are known monoclonal antibody production methods (“monoclonal antibodies”, Kamei Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Godding, third edition, Academic Press, 1996). Can be manufactured according to
The antibody of the invention (7) is an antibody that binds to a different epitope from the antibody of the invention (6). Such an antibody is prepared as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody similar to the above by using, as an immunogen, a fragment different from the antigen peptide fragment for preparing the antibody of the invention (6).
The antibodies of the inventions (6) and (7) include antibodies labeled with a labeling substance, respectively. As the labeling substance, an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent dye can be used. The enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloration of a substrate, and it is used for a normal immunoassay. Enzymes such as peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, luciferase and the like can also be used. Further, it can be labeled with an enzyme inhibitor, a coenzyme or the like, or with an acridinium ester. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used according to the type of enzyme used. For example, when peroxidase is used as the enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine can be used, and when alkaline phosphatase is used as the enzyme, paranitrophenol or the like can be used. As a radioisotope, ¹²⁵ I and ³ What is used by normal RIA, such as H, can be used. As the fluorescent dye, those used in usual fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
The method for diagnosing human vasculitis of the invention (8) detects an antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1) in a biological sample collected from a subject, and the antibody is present in the biological sample more than a healthy subject. The subject to be determined is a vasculitis patient or a high-risk vasculitis patient. That is, since the antigenic peptide of the invention (1) is a peptide that binds to an antibody in a biological sample of a patient with vasculitis, the antibody reacts with a biological sample of a subject and contains more antibody that binds to the antigenic peptide than a healthy person The biological sample can be determined as a biological sample of a vasculitis patient or its high-risk patient. Antibody detection can be carried out as various known immunoassays such as RIA, ELISA, EIA, CLIA, CLEIA, and luciferase assay. The detection in the present invention may be qualitative or quantitative. When the antibody is quantified, it can be used not only for the diagnosis and screening of vasculitis but also for the monitoring of vasculitis treatment. As the biological sample, blood, serum, plasma, blood cells (mononuclear cells, etc.), urine, bone marrow fluid, saliva and the like can be used. At that time, other known vasculitis markers can be used in combination.
Specifically, for example, the subject serum is brought into contact with the antigen peptide, and the antigen peptide and the IgG antibody in the subject serum are reacted in a liquid phase. Furthermore, a labeled anti-human IgG antibody that specifically binds to an IgG antibody in serum may be reacted to detect the signal of the labeled anti-human IgG antibody. As the labeling substance of the labeled anti-human IgG antibody, an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, or the like as exemplified in the labeled antibody can be used. When using an enzyme, add a substrate that decomposes due to enzymatic action and develops color, optically measures the amount of degradation of the substrate, obtains the enzyme activity, converts this to the amount of bound antibody, and compares it with the standard value. From this, the antibody amount is calculated. When a radioisotope is used, the radiation dose emitted by the radioisotope is measured with a scintillation counter or the like. In addition, when a fluorescent dye is used, the amount of fluorescence may be measured by a measuring device combined with a fluorescence microscope. In the case of the chemiluminescence method, the amount of acridinium ester luminescence may be measured.
For detection of the signal, for example, Western blot analysis can be employed. Alternatively, a conjugate of antigen peptide + antibody in biological sample + labeled anti-human IgG antibody is separated by known separation means (chromatography, solid phase method, etc.) to detect the signal of labeled anti-human IgG antibody. It may be. It should be noted that the diagnostic kit of the invention (13) is provided as enabling simple and wide-ranging implementation of such a diagnostic method.
The diagnostic method of the invention (8) can also be carried out as a method (invention (9)) of immobilizing one or more types of antigen peptides on a carrier and testing the binding of the subject biological sample with the carrier. . By immobilizing the antigen peptide on the carrier, unbound labeled binding molecules can be easily removed. As the carrier, beads, inner walls of containers, fine particles, porous carriers, magnetic particles, or the like are used. These solid phases must be molded using materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, glass, metal, or ceramic. Available. There is also known a solid phase material in which a functional group for chemically binding an antibody or the like is introduced on the surface of these solid phase materials. For the solid phase and the antibody (or antigen), a known binding method such as chemical binding such as poly-L-lysine or glutaraldehyde treatment or physical adsorption can be applied. Moreover, the diagnostic kit of the invention (14) is provided as one that enables simple and wide-ranging implementation of such a diagnostic method. In particular, in the protein array method using a membrane on which several tens of types of antigen peptides are immobilized, the expression of various types of antibodies can be analyzed in a short time using about 0.01 ml of subject serum.
The diagnostic method of the invention (10) of this application is to detect the antigen peptide bound to the antibody of the invention (6) or its labeled antibody in a biological sample of a subject, and the antigen peptide is healthy in the sample. The subjects who are present more than are determined to be vasculitis patients or their high-risk individuals. That is, since the antibody or labeled antibody used here is an antibody that specifically binds to an antigen peptide expressed in vascular endothelial cells exhibiting vasculitis, a biological sample containing the antigen peptide that binds to this antibody Can be determined as a sample of a vasculitis patient or its high-risk patient. As biological samples, blood, serum, plasma, blood cells (mononuclear cells, etc.), urine, bone marrow fluid, saliva and the like can be targeted.
One embodiment of the diagnostic method of the invention (10) is a method in which the antibody and the antigen peptide are bound in a liquid phase system. For example, the labeled antibody of the invention (6) is contacted with the biological sample to bind the labeled antibody and the antigen peptide, the conjugate is separated by the same method as the invention (8), and the labeled signal is the same. Detect by method. The diagnostic kit of the invention (15) is provided as one that enables simple and wide-ranging implementation of such a diagnostic method.
Another method for diagnosis in a liquid phase system is the invention (7) in which the antibody (primary antibody) of the invention (6) is contacted with a biological sample to bind the primary antibody and the antigenic peptide, and this conjugate is labeled. The antibody (secondary antibody) is bound, and the labeled signal in the triple conjugate is detected. Alternatively, in order to further enhance the signal, an unlabeled secondary antibody may first be bound to an antibody + antigen peptide conjugate, and a labeling substance may be bound to this secondary antibody. Such binding of the labeling substance to the secondary antibody can be performed, for example, by biotinylating the secondary antibody and avidinizing the labeling substance. Alternatively, an antibody (tertiary antibody) that recognizes a partial region (for example, Fc region) of the secondary antibody may be labeled and this tertiary antibody may be bound to the secondary antibody. The primary antibody and the secondary antibody may both be monoclonal antibodies, or one of the primary antibody and the secondary antibody may be a polyclonal antibody. Separation of the conjugate from the liquid phase and detection of the signal can be performed in the same manner as in the invention (8). Moreover, the diagnostic kit of the invention (16) is provided as one that enables simple and wide-ranging implementation of such a diagnostic method.
Another embodiment of the diagnostic method of the invention (10) is a method of testing the binding between an antibody and an antigen peptide in a solid phase system. This method in the solid phase system is a preferable method for detecting an extremely small amount of antigen peptide and simplifying the operation. That is, in this solid phase system, the antibody of the invention (6) is immobilized on a carrier such as a resin plate, a bead, or a membrane, an antigenic peptide is bound to this immobilized antibody, unbound peptide is washed away, In this method, the labeled antibody of the invention (7) is bound to the remaining antibody + antigen peptide conjugate, and the signal of the labeled antibody is detected. This method is a so-called “sandwich method”. When an enzyme is used as a marker, this method is widely used as “ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)”. Both of the two types of antibodies can be monoclonal antibodies, or one of them can be a polyclonal antibody. Signal detection can be performed in the same manner as in the invention (8). In addition, the diagnostic kit of the invention (17) is provided as one that enables simple and wide-ranging implementation of such a diagnostic method.
The diagnostic kit of invention (13)-(17) is a reagent kit for performing the diagnostic method of said invention (8)-(11). Various types of such kits are commercially available depending on the type of test component, and the diagnostic kit of the present invention also uses the antigen peptide, antibody and / or labeled antibody provided by the present invention. Except for the above, each element used in a publicly known kit can be configured.
The diagnostic method of the invention (12) tests the abundance of the polynucleotide of the invention (3) in a biological sample of a subject, and treats a subject with a greater amount of polynucleotide as compared with those of a healthy subject as a vasculitis patient or Judge as a high-risk person. As a specific criterion, the amount of polynucleotide present in the subject is 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 100% or more, compared with that of a healthy subject It is.
As biological samples, feces, blood, and blood cells (such as lymphocytes) can be targeted. The detection and measurement of the polynucleotide can be carried out by a known PCR method, RT-PCR method, quantitative RT-PCR method, etc. In that case, the primer set of the invention (5) can be used for PCR.
Furthermore, the diagnostic method of the invention (12) can also be carried out by a DNA microarray provided with the polynucleotide or oligonucleotide provided by this invention. As a method for producing a microarray, a method of directly synthesizing oligonucleotides on the surface of a solid support (on-chip method) and a method of fixing a prepared oligonucleotide on the surface of a solid support are known. The microarray used in the present invention can be produced by any of these methods. As an on-chip method, a combination of the use of a protective group that is selectively removed by light irradiation and the photolithography technology and solid-phase synthesis technology used in semiconductor manufacturing can be combined in a predetermined area of a minute matrix. It can be performed by a method of performing selective synthesis (masking technique: for example, Fodor, SPA Science 251: 767, 1991). On the other hand, when immobilizing an oligonucleotide prepared in advance on the surface of a solid phase carrier, an oligonucleotide into which a functional group has been introduced is synthesized, and the oligonucleotide is spotted on the surface of the surface of the solid phase carrier and covalently bonded (for example, Lamture, JB et al. Nucl. Acids Res.22: 2121-2215, 1994; Guo, Z. et al.Nucl.Acids Res.22: 5456-5465, 1994). Oligonucleotides are generally covalently bonded to a surface-treated solid support via a spacer or a crosslinker. A method is also known in which polyacrylamide gel pieces are aligned on a glass surface and a synthetic oligonucleotide is covalently bonded thereto (Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4913, 1996). ). In addition, an array of microelectrodes was prepared on a silica microarray, an agarose permeation layer containing streptavidin was provided on the electrode as a reaction site, and this site was charged positively to immobilize the biotinylated oligonucleotide. There is also known a method that enables high-speed and precise hybridization by controlling the charge of the site (Sosnowski, RG et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1119-1123, 1997). When diagnosing vasculitis using this microarray, for example, cDNA is synthesized and PCR amplified using mRNA isolated from a subject's cells as a template. At that time, labeled dNTP is incorporated into labeled cDNA. The labeled cDNA is brought into contact with the macroarray, and the hybridized cDNA to the microarray capture probe (oligonucleotide or polynucleotide) is detected. Hybridization can be carried out by dispensing a 96-well or 384-well plastic plate and spotting a labeled cDNA aqueous solution on the microarray. The amount of spotting can be about 1 to 100 nl. Hybridization is preferably carried out in the temperature range of room temperature to 70 ° C. for 6 to 20 hours. After completion of hybridization, washing is performed using a mixed solution of a surfactant and a buffer to remove unreacted labeled cDNA. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, or the like can be used, and a citrate buffer solution is preferably used.
The method for treating or preventing vasculitis of the invention (19) is a method for removing blood from a patient, selectively removing anti-human peroxiredoxin antibodies in the blood, and then returning the blood to the patient again. According to the method of the invention (19), “(a) a blood sample collected from a patient or a fraction thereof containing an antibody is converted into a fragment containing human peroxiredoxin or an antigenic determinant thereof immobilized on a carrier insoluble in blood. A step of contacting (hereinafter abbreviated as “contacting step”) and “(b) a step of returning the blood or a fraction thereof to the patient after step (a)”. As will be described later in the Examples, the present inventors have confirmed for the first time that anti-human peroxiredoxin antibodies are significantly higher in the serum of vasculitis patients. This result suggests that anti-human peroxiredoxin antibodies are strongly associated with the development or progression of vasculitis. Therefore, it is considered that the symptom of vasculitis can be improved or prevented by removing the anti-human peroxiredoxin antibody in the blood. In the method of the invention (19), in the contacting step, the anti-human peroxiredoxin antibody is adsorbed by the immobilized human peroxiredoxin or a fragment containing an antigenic determinant thereof, thereby removing the antibody from the blood. Is done.
The blood removed from the patient may be subjected to a process of dividing into several fractions before contacting with blood such as human peroxiredoxin. For example, as in the invention (20), blood can be separated into a plasma fraction and a cell fraction with a plasma separator, and only the plasma fraction in which the anti-human peroxiredoxin antibody is present can be subjected to the contact step. The plasma from which the anti-human peroxiredoxin antibody has been removed is returned to the patient's body together with the cell fraction.
In order to carry out the method of the invention (19), the therapeutic agent of the invention (18) can be used. The therapeutic agent of the invention (18) includes human peroxiredoxin or a fragment containing an antigenic determinant thereof immobilized on a carrier insoluble in blood. Therefore, when blood taken from a patient is passed through the therapeutic agent, it is possible to selectively remove anti-human peroxiredoxin antibodies in the blood. Cellulose, agarose, sepharose, dextran, chitin, chitosan, derivatives thereof, organic or inorganic porous materials, magnetic beads, microbeads, etc. can be used as blood insoluble carriers, but they are insoluble in blood As long as it is not limited to these. A fragment containing human peroxiredoxin or an antigenic determinant thereof can be immobilized on the carrier by physical adsorption or insolubilization by covalent bonding to provide the therapeutic agent of the invention (18).
It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.

図１ａは、細胞抽出タンパク質を２次元電気泳動法で分離展開し、クマシー染色にて可視化した写真である。図１ｂは、展開したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、血管炎患者４名の血清と反応させた写真である。
図２は、ＭＢＰおよび融合タンパク質ＭＢＰ−ＢＣ４５２を１次元電気泳動し、ペルオキシダーゼ標識Ｎｉ−ＮＴＡで染色した結果を示す写真である。
図３は、組換えＢＣ０００４５２を抗原ペプチドとして固相化したＥＬＩＳＡによる血管炎診断の結果を示す写真である。FIG. 1a is a photograph in which cell-extracted proteins are separated and developed by two-dimensional electrophoresis and visualized by Coomassie staining. FIG. 1b is a photograph of the developed protein transferred to a nitrocellulose membrane and reacted with the sera of four vasculitis patients.
FIG. 2 is a photograph showing the results of one-dimensional electrophoresis of MBP and fusion protein MBP-BC452 and staining with peroxidase-labeled Ni-NTA.
FIG. 3 is a photograph showing the results of vasculitis diagnosis by ELISA in which recombinant BC000452 is immobilized as an antigen peptide.

以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：血管炎抗原ペプチドの同定
ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とＨｅＬａ細胞（対照）を用い、それぞれから尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳを含む溶液でタンパク質を溶出し、これを等電点電気泳動および分子量によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを組み合わせた２次元電気泳動法で分離展開し、クマシー染色にて可視化した（図１ａ）。次いで、展開したタンパク質をさらにニトロセルロース膜に転写し、血管炎患者４名の血清と反応させた（図１ｂ）。患者血清中抗体と反応するタンパク質（自己抗原ペプチド）が、図１ｂ中に番号で示したものを含め、複数個同定された。
次に、図１ａのゲルから、図１ｂで同定された陽性タンパク質スポット２８と一致するタンパク質を切り出して回収し、トリプシン消化によってゲルから抽出した。この消化ペプチドの質量を飛行時間型質量分析器を用いたｍａｓｓ−ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ法により決定し、検索ソフトウエア（マスコット）によるタンパク質データベース検索から質量の一致する候補タンパク質を選択した。
その結果、この抗原ペプチドが、ＰＲＤＸ２相同体（ＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ０００４５２）であることが確認された（以下、このペプチドを「ＢＣ４５２」と記載することがある）。
実施例２：ＢＣ４５２の抗原性の確認
実施例１で同定したＢＣ４５２が、真に患者自己抗体に反応する抗原であるかを確かめるために、組換えＢＣ４５２を作成した。
臍帯静脈由来血管内皮細胞より調整したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、ＢＣ４５２ｃＤＮＡ（配列番号１）のコード領域を増幅し、大腸菌蛋白発現ベクター（ｐＭＡＬ−ｃＨｉｓ）にクローニング後、大腸菌に導入し、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質として発現させた。
結果は図２ａに示したとおりである。この図２ａは、ＭＢＰ（コントロール）および融合タンパク質ＭＢＰ−ＢＣ４５２を精製の後、１次元電気泳動し、さらに、各タンパク質のＣ端に位置するヒスチジンタグを認識するＮｉ−ＮＴＡで染色した結果であり、それぞれのタンパク質が産生精製が確認された。
次いで、ＭＢＰおよび融合タンパク質ＭＢＰ−ＢＣ４５２を同一レーンで展開し、個別に各種血管炎患者血清と反応させた。結果は図２ｂに示したとおりであり、上部のバンド（融合タンパク質ＭＢＰ−ＢＣ４５２）がＭＢＰに比較して格段に濃く染色されたことから、ＢＣ４５２に対する自己抗体が各種血管炎患者血清血清中に存在することが確認された。
実施例３：ＥＬＩＳＡによる診断
実施例２で調製した組換えＢＣ４５２を抗原ペプチドとして固相化し、被検血清を反応させ、さらにペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を反応させて、ペルオキシダーゼの基質を加えて発色させ、抗原ペプチドと血清中抗体との結合を検出した。被験血清として、血管炎患者（ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、結節性多発動脈炎、側頭動脈炎、高安病、悪性関節リウマチ、バージャー病、全身性エリテマトーデス）、血管炎の無い膠原病患者、健常人の血清を用いた。
図３は、発色反応をＯＤ値として数値化したものである。健常人の平均ＯＤ値にその標準偏差の３倍を加えた値を１００単位と定義し、それより単位数の高い血清を陽性と判定した。ＢＣ４５２に対する自己抗体は血管炎患者の６８％で検出され、血管炎の無い膠原病患者では１５％、健常人では０％であった。この結果から、抗原ペプチドＢＣ４５２対する自己抗体の検出は血管炎を診断する上で極めて有用なマーカーとなることが確認された。Hereinafter, the invention of this application will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the invention of this application is not limited by the following examples.
Example 1 Identification of Vasculitis Antigen Peptide Using human umbilical vein-derived endothelial cells (HUVEC) and HeLa cells (control), the protein was eluted from each with a solution containing urea, thiourea and CHAPS, and the isoelectric point They were separated and developed by two-dimensional electrophoresis combining SDS-PAGE with electrophoresis and molecular weight, and visualized by Coomassie staining (FIG. 1a). Next, the developed protein was further transferred to a nitrocellulose membrane and reacted with the serum of 4 patients with vasculitis (FIG. 1b). A plurality of proteins (autoantigen peptides) that react with antibodies in patient serum were identified, including those indicated by numbers in FIG. 1b.
Next, from the gel of FIG. 1a, the protein corresponding to the positive protein spot 28 identified in FIG. 1b was cut out and recovered, and extracted from the gel by trypsin digestion. The mass of the digested peptide was determined by a mass-fingerprinting method using a time-of-flight mass spectrometer, and candidate proteins with the same mass were selected from protein database searches using search software (mascot).
As a result, it was confirmed that this antigen peptide is a PRDX2 homologue (GenBank / BC000452) (hereinafter, this peptide may be referred to as “BC452”).
Example 2: Confirmation of antigenicity of BC452 To confirm whether BC452 identified in Example 1 is truly an antigen that reacts with patient autoantibodies, recombinant BC452 was prepared.
The coding region of BC452 cDNA (SEQ ID NO: 1) is amplified from mRNA prepared from umbilical vein-derived vascular endothelial cells by RT-PCR, cloned into an E. coli protein expression vector (pMAL-cHis), introduced into E. coli, and maltose. It was expressed as a fusion protein with a binding protein (MBP).
The result is as shown in FIG. 2a. Fig. 2a shows the result of purification of MBP (control) and fusion protein MBP-BC452, one-dimensional electrophoresis, and further staining with Ni-NTA that recognizes the histidine tag located at the C-terminus of each protein. The production and purification of each protein was confirmed.
Subsequently, MBP and fusion protein MBP-BC452 were developed in the same lane and individually reacted with sera from various vasculitis patients. The results are as shown in FIG. 2b, and the upper band (fusion protein MBP-BC452) was stained much darker than MBP, so autoantibodies against BC452 are present in the serum serum of various vasculitis patients Confirmed to do.
Example 3: Diagnosis by ELISA Recombinant BC452 prepared in Example 2 was immobilized as an antigen peptide, reacted with test serum, further reacted with peroxidase-labeled anti-human IgG antibody, added with peroxidase substrate, and developed color The binding between the antigenic peptide and the serum antibody was detected. As test serum, patients with vasculitis (Wegener's granulomatosis, microscopic polyangiitis, allergic granulomatous vasculitis, nodular polyarteritis, temporal arteritis, Takayasu disease, rheumatoid arthritis, Buerger's disease, systemic Sera from lupus erythematosus), patients with collagen disease without vasculitis, and healthy individuals.
FIG. 3 shows the chromogenic reaction as an OD value. A value obtained by adding 3 times the standard deviation to the average OD value of healthy persons was defined as 100 units, and sera having a higher number of units were determined to be positive. Autoantibodies against BC452 were detected in 68% of patients with vasculitis, 15% in collagen disease patients without vasculitis and 0% in healthy individuals. From this result, it was confirmed that detection of autoantibodies against the antigen peptide BC452 would be a very useful marker in diagnosing vasculitis.

以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、血管炎の診断用マーカーとして有用な新規抗原ペプチドと、これらを用いた血管炎診断方法が提供される。これによって、血管炎の早期かつ高精度の診断が可能となる。 As described in detail above, the invention of this application provides a novel antigenic peptide useful as a diagnostic marker for vasculitis and a vasculitis diagnostic method using these. This enables early and highly accurate diagnosis of vasculitis.

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

Vasculitis antigen peptide which is human peroxiredoxin.

The vasculitis antigen peptide of claim 1, which is a human peroxiredoxin 2 homolog having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

A polynucleotide encoding the antigenic peptide of claim 1.

The polynucleotide of Claim 3 which has the base sequence of SEQ ID NO: 1 and encodes the human peroxiredoxin 2 homologue of Claim 2.

A primer set for PCR amplification of the polynucleotide of claim 3.

An antibody that binds to the antigenic peptide of claim 1.

An antibody that binds to a different epitope than the antibody of claim 6.

An antibody that binds to the antigenic peptide of the invention (1) in a biological sample collected from a subject is detected, and a subject in which a greater amount of the antibody is present in the biological sample than a healthy subject is classified as a vasculitis patient or a vasculitis high-risk subject. A method for diagnosing human vasculitis, comprising: determining.

The diagnostic method according to claim 8, wherein the binding between the antibody and the antigenic peptide in a biological sample collected from the subject is tested on a carrier on which the antigenic peptide is immobilized.

An antigenic peptide that binds to the antibody of claim 6 in a biological sample collected from a subject is detected, and a subject in which a larger amount of the antigenic peptide is present in the biological sample than a healthy person is determined as a vasculitis patient or a vasculitis high-risk person A method for diagnosing human vasculitis, comprising:

The diagnostic method according to claim 10, wherein the binding between the antibody and the antigen peptide is tested on a carrier on which the antibody of claim 6 is immobilized.

Test the abundance of the polynucleotide of claim 3 in a biological sample collected from a subject, and determine that a subject having a greater abundance of the polynucleotide than those of a healthy subject is a vasculitis patient or a vasculitis high risk person A method for diagnosing human vasculitis, comprising:

At least the following elements:
A diagnostic kit for vasculitis, comprising: (a) the antigenic peptide of claim 1; and (b) a labeled antibody that specifically binds to the antibody that binds to the antigenic peptide of claim 1.

At least the following elements:
An vasculitis diagnostic kit comprising: (a) a carrier on which the antigenic peptide of claim 1 is immobilized; and (b) a labeled antibody that specifically binds to the antibody that binds to the antigenic peptide of claim 1.

A diagnostic kit for vasculitis comprising at least the antibody of claim 6 and / or the labeled antibody of claim 7.

At least the following elements:
A kit for diagnosing vasculitis, comprising: (a) the antibody of claim 6; and (b) the labeled antibody of claim 7.

At least the following elements:
A diagnostic kit for vasculitis, comprising: (a) a carrier on which the antibody of claim 6 is immobilized; and (b) a labeled antibody of claim 7.

A therapeutic agent for vasculitis, comprising a fragment containing human peroxiredoxin or an antigenic determinant thereof immobilized on a carrier insoluble in blood.

A method for treating or preventing vasculitis, comprising the following steps.
(A) contacting a blood sample collected from a patient or a fraction thereof containing an antibody with a fragment containing human peroxiredoxin or an antigenic determinant thereof immobilized on a carrier insoluble in blood, and (b) step The step of returning the blood or a fraction thereof to the patient after (a).

The method according to claim 19, wherein the fraction containing the antibody is plasma.