JPWO2004080484A1

JPWO2004080484A1 - Adipocyte differentiation inhibitor

Info

Publication number: JPWO2004080484A1
Application number: JP2004569339A
Authority: JP
Inventors: 浩司田原; 山嵜　肇史; 肇史山嵜; 久麻生; 高野　昇一; 昇一高野; 広志長石; 斉藤　剛; 剛斉藤
Original assignee: BML Inc
Current assignee: BML Inc
Priority date: 2003-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2006-06-08
Also published as: AU2003213327A1; WO2004080484A1

Abstract

本発明者は、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際には、驚くべきことに、神経伝達物質として知られているセロトニンが深く関わっていることを見出した。本発明は、この知見を原理として用いた、抗肥満剤を提供する発明である。具体的には、本発明は、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する抑制物質を有効成分とする、抗肥満剤として用い得る、脂肪細胞の分化抑制剤を提供する発明である。The inventor has surprisingly found that serotonin, which is known as a neurotransmitter, is deeply involved in the differentiation of preadipocytes into adipocytes. The present invention provides an anti-obesity agent using this finding as a principle. Specifically, the present invention is an invention that provides an adipocyte differentiation inhibitor that can be used as an anti-obesity agent, containing an inhibitory substance for serotonin receptor 5-HT2A as an active ingredient.

Description

本発明は、抗肥満剤として用い得る、脂肪細胞の分化抑制剤に関する発明である。 The present invention relates to an adipocyte differentiation inhibitor that can be used as an anti-obesity agent.

元来、人間は、飢えに抵抗して生き抜くために、エネルギー源となる脂肪を、効率よく脂肪組織として蓄えることが可能な仕組みを獲得している。しかしながら、特に、先進国においては、近年、食料に不自由することはほとんどなくなり、逆に、過剰摂食による肥満が、社会問題化しつつある。
すなわち、肥満は、耐糖能異常（糖尿病）、高脂血症、高血圧と合併することが多く、これが、心筋梗塞等の虚血性疾患のリスクファクターとして働き、個々人の快適な人生設計に暗い影を落とすだけでなく、国家単位で、中高年における医療費を急増させる原因となっている。
そこで、近年、先進諸国では、いかに肥満を防止するかが、国家政策上においても非常に重要な課題となっている。肥満を防止するには、食事や運動による生活改善が、第一段階として挙げられるが、重篤な場合等には、薬剤による治療も重要な選択肢として用いられるべきである。
本発明の課題は、肥満と関連する脂質代謝の働きを深く究明して、この働きを原理として用いる抗肥満剤を提供することにある。Originally, humans have acquired a mechanism that can efficiently store fat as an energy source as adipose tissue in order to survive hunger and survive. However, especially in developed countries, in recent years, there has been almost no inconvenience in food. On the contrary, obesity due to overeating is becoming a social problem.
In other words, obesity often accompanies glucose intolerance (diabetes), hyperlipidemia, and hypertension, which acts as a risk factor for ischemic diseases such as myocardial infarction, and has a dark shadow on the comfortable life design of individuals. Not only does it drop, but it also causes a surge in medical costs for middle-aged and older people on a national basis.
Therefore, in recent years, how to prevent obesity in developed countries has become a very important issue in national policy. In order to prevent obesity, improvement of life through diet and exercise can be mentioned as the first step, but in severe cases, treatment with drugs should be used as an important option.
An object of the present invention is to deeply investigate the action of lipid metabolism associated with obesity and to provide an anti-obesity agent that uses this action as a principle.

本発明者は、この課題の解決に向けて、脂肪細胞が、脂肪前駆細胞から分化する際に、どのような要素が関わっているかについて、深く検討を行った。
その結果、本発明者は、脂肪前駆細胞が、脂肪細胞に分化する際には、驚くべきことに、神経伝達物質として知られているセロトニンが深く関わっていることを、下記の過程において見出した。
脂肪細胞への分化とセロトニン受容体の関係
脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際に、どのような因子が働くかを検討するために、脂肪前駆細胞株において脂肪細胞への誘導を行い、誘導の前後におけるｃＤＮＡの配列を比較して、脂肪細胞への分化における特有の遺伝子の検索を行った。
［脂肪前駆細胞株］
脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際に、どのような因子が働くかを検討するために、下記の手順で樹立した脂肪前駆細胞株（以下、ＢＩＰ細胞ともいう）を使用した。
ウシの脂肪組織を細断し、５００ｍｇ脂肪組織／ｍｌの比率で、コラゲナーゼ溶液（ＤＭＥＭ，２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ，２％ＢＳＡ）を加え、３７℃で４５分間ゆっくりと攪拌し、上記脂肪組織を、個々の細胞単位に分け、１５０μｍ径のステンレスメッシュで濾過を行い、コラゲナーゼ処理で消化しきれなかった細胞残渣を除いた。次に、このコラゲナーゼ処理物に遠心分離処理（８００×ｇ，１０分間）を施し、遠心分離処理物の上清に認められる油滴を多く含む脂肪細胞を除き、油滴を含まない脂肪前駆細胞を含む沈殿物を、細胞懸濁液（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン，３３μＭビオチン，１７μＭパントテン酸，１ｍＭオクタン酸，１００μＭアスコルビン酸）で懸濁し、φ３５ｍｍディッシュに、１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの細胞密度で培養（５％ＣＯ_２・３７℃）した。培養開始から２日後、ディッシュを５回リンスし、脂肪細胞およびディッシュに接着しなかった細胞を除去して、引き続き培養を行った。培養開始６〜７日後に細胞がディッシュ一面に増殖した段階で、トリプシン溶液（ＰＢＳ，０．０４％トリプシン，０．０２％ＥＤＴＡ）で細胞をはがして、新しいφ３５ｍｍディッシュで、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの細胞密度で培養（５％ＣＯ_２・３７℃）した。４日毎に、この継代培養を繰り返し、７回目の継代の際に、限界希釈法により、細胞のクローニングを行った。なお、限界希釈法を行う際には、ウシｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂｏｖｉｎｅＦＧＦ）を１０ｎｇ／ｍｌ、培地に添加した。
このようにして得られたクローンから、接触阻害がかかり（接触阻害がかからない癌化細胞等の異常細胞を除去するため）、かつ、高い効率で脂肪細胞に分化するものを選んで、その中の１株を、脂肪前駆細胞株（ＢＩＰ細胞）とした。
［発現遺伝子の検索］
ウシ脂肪前駆細胞における発現遺伝子の検索
上述のようにして得られたＢＩＰ細胞に対して、脂肪細胞への誘導を行い、誘導の前後におけるｃＤＮＡの配列を比較して、脂肪細胞への分化における特有の遺伝子の検索を行った。
具体的には、ＢＩＰ細胞を、８．５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度でディッシュに播き、細胞増殖用培地（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で継代培養を、上記と同条件で行った。この継代培養により得られるＢＩＰ細胞を、２．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度でディッシュに播き、前記の増殖用培地で２日間培養を行った。次いで、培地を分化誘導培地（前記の増殖用培地に、５０ｎｇ／ｍｌインシュリン，０．２５μＭデキサメタゾン，１〜５ｍＭオクタン酸，１０ｍＭ酢酸を添加した培地：一般的な脂肪分化誘導培地として、例えば、ＦＲＡＮＣＩＮＥＭ．ＧＲＥＧＯＩＲＥ，ｅｔａｌ．，ＵｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇＡｄｉｐｏｃｙｔｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡ）ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．３，７８３−８０９，１９９８に具体的に記載されている）で、上記と同条件で培養し、脂肪細胞への分化誘導を行った。
前記の増殖培養２日目の脂肪前駆細胞と、分化誘導後４日目の脂肪細胞との間で、発現に違いが認められる遺伝子の検索を、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を用いて行った。すなわち、ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。
具体的には、下記のＦｉｒｓｔＳｃｒｅｅｎｉｎｇとＳｅｃｏｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇを行った。
（１）ＦｉｒｓｔＳｃｒｅｅｎｉｎｇ
前記の増殖培養２日目の脂肪前駆細胞と、分化誘導４日目の脂肪細胞から、ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを抽出し、それぞれを”ｄｒｉｖｅｒ”および”ｔｅｓｔｅｒ”として用いた。２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、”ｔｅｓｔｅｒ”ｃＤＮＡは２等分し、それぞれに異なるアダプターをライゲーションした。
次に、”ｔｅｓｔｅｒ”ｃＤＮＡと”ｄｒｉｖｅｒ”ｃＤＮＡを、２回ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたｃＤＮＡ（”ｔｅｓｔｅｒ”と”ｄｒｉｖｅｒ”のどちらでも発現している遺伝子が、互いにハイブリダイズする）を除去した。
ここで、ハイブリダイズせずに残ったｃＤＮＡが、”ｔｅｓｔｅｒ”と”ｄｒｉｖｅｒ”のそれぞれにおいてのみ発現している遺伝子である。この中から、”ｔｅｓｔｅｒ”に特異的に発現する遺伝子を増幅するために、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＰＣＲを行った。ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＰＣＲは、”ｔｅｓｔｅｒ”ｃＤＮＡにのみライゲーションしたアダプターの塩基配列を基に、２回のＰＣＲを行い、”ｔｅｓｔｅｒ”に特異的に発現する遺伝子のみを増幅する。
このようにして得られた”ｔｅｓｔｅｒ”特異的に発現する遺伝子群を、さらに、３００ｂｐ以上の遺伝子断片にサイズセレクションした。
これらの遺伝子断片をクローニングベクターに組み込み、これを用いて大腸菌を形質転換して、クローニングを行った。
（２）ＳｅｃｏｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇ
前記の増殖培養２日目の脂肪前駆細胞と、分化誘導後４日目の脂肪細胞から、ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを行い、分化誘導後４日目の脂肪細胞でのみ発現または発現増強している遺伝子を選択した。
（３）全長遺伝子のクローニング
さらに、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により得られた遺伝子断片についての知見を基に、全長遺伝子のクローニングを行った。
すなわち、分化誘導後４日目の脂肪細胞から、ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを抽出し、λＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリーを作製した。ここから２ｎｄ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇにより得られた遺伝子配列をプローブとして、公知のプラークハイブリダイゼーション法により、全長のｃＤＮＡを含む組み換えファージをクローニングした。λＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＧＥＮＥ社）は、ｅｘｃｉｓｉｏｎすることにより、ｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔクローニングベクターに組み込まれ、大腸菌に形質転換した状態で得ることができる。
このようにして得られた形質転換大腸菌から、公知の方法により、ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを精製し、ｃＤＮＡの塩基配列を解析した。
解析した塩基配列を基に、データベース上でホモロジー検索を行った結果、６−３と命名したクローンが、ウシのセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの全長（配列番号１）をコードしていることが判明した。
この結果により、脂肪前駆細胞が、脂肪細胞に分化する際には、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａが発現することが明らかとなり、脂肪細胞への分化と神経伝達物質等として知られているセロトニンが、深い関わりを持っていることが推察された。
ヒト脂肪前駆細胞における発現遺伝子の検索
東洋紡株式会社よりヒト脂肪前駆細胞を購入し、前駆細胞分化誘導培地（東洋紡株式会社）を用いて脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導前と分化誘導後３，６，９，１２日目にｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａをコードする遺伝子の増幅を、既知のヒトセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａをコードする遺伝子の塩基配列の一部に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、常法により行い、脂肪細胞への分化の過程における、このセロトニン受容体サブタイプの発現を検討した。その結果を示す、遺伝子増幅産物の電気泳動像を第１図に示す［第１図において、左端はマーカー、続いて、分化誘導前、分化誘導後３日目、分化誘導後６日目、分化誘導後９日目、分化誘導後１２日目、のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａをコードする遺伝子の増幅産物（４４０ｂｐ）のバンドを示している。マーカーの分子量は、上から、８００、６００、４００、２００ｂｐである］。
第１図に示す結果より、ヒトにおいても、脂肪前駆細胞の分化誘導後に、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの発現が誘導されていることが確認できた。すなわち、ヒトの場合においてもＢＩＰｃｅｌｌ，３Ｔ３−Ｌ１ｃｅｌｌと同様、脂肪細胞への分化に、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａが関与していることがわかる。
なお、第１図の分化誘導前のレーンにも、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの存在を示すバンドが、わずかながら認められる。これは、購入したヒト脂肪前駆細胞において、分化誘導前から細胞内に油滴が存在している細胞が観察されることから、このヒト脂肪前駆細胞の市販品が、完全な脂肪前駆細胞ではなく、すでに脂肪細胞に分化しかけた細胞が混入している細胞集団であることを示している。よって、このような脂肪細胞の脂肪前駆細胞中における混入が、分化誘導前においてもセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの発現が微量検出される原因となっていると考えられる。
これらの結果より、本発明者は、脂肪分化の際に脂肪前駆細胞において、セロトニン受容体サブタイプの一つであるセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの発現が誘導され、このセロトニン受容体サブタイプを介した何らかの作用が、セロトニンにより脂肪前駆細胞におよぼされ、脂肪細胞への分化が促進されることを見出した。
本発明の抗肥満剤
上述した知見から、本発明者は、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの働きを阻害するアンタゴニストは、脂肪前駆細胞から、脂肪細胞への分化を抑制し、抗肥満剤の有効成分として用い得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対する抑制物質を有効成分とする、抗肥満剤として用い得る、脂肪細胞の分化抑制剤（以下、本抑制剤ともいう）を提供する発明である。In order to solve this problem, the present inventor has conducted a deep study on what elements are involved in the differentiation of adipocytes from preadipocytes.
As a result, the present inventor found that serotonin, known as a neurotransmitter, is deeply involved in the following process, when adipose precursor cells differentiate into adipocytes. .
Relationship between adipocyte differentiation and serotonin receptors In order to study what factors work when adipocytes differentiate into adipocytes, induction into adipocytes in the adipocyte cell line, induction The cDNA sequences before and after were compared to search for genes specific to differentiation into adipocytes.
[Adipose precursor cell line]
In order to study what factors work when preadipocytes differentiate into adipocytes, a preadipocyte cell line (hereinafter also referred to as BIP cells) established by the following procedure was used.
Shred bovine adipose tissue, add collagenase solution (DMEM, 2 mg / ml collagenase, 2% BSA) at a ratio of 500 mg adipose tissue / ml, and gently stir at 37 ° C. for 45 minutes. The cells were divided into individual cell units and filtered through a 150 μm diameter stainless steel mesh to remove cell residues that could not be digested by collagenase treatment. Next, this collagenase-treated product is subjected to centrifugation (800 × g, 10 minutes) to remove adipocytes containing many oil droplets found in the supernatant of the centrifuged product, and adipose precursor cells not containing oil droplets Is suspended in a cell suspension (DMEM, 10% FBS, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 33 μM biotin, 17 μM pantothenic acid, 1 mM octanoic acid, 100 μM ascorbic acid) in a φ35 mm dish, The cells were cultured at a cell density of 10 ⁵ cells / dish (5% CO ₂ · 37 ° C.). Two days after the start of the culture, the dish was rinsed five times to remove adipocytes and cells that did not adhere to the dish, and the culture was continued. 6-7 days after the start of the culture, when the cells grew on the entire surface of the dish, the cells were detached with a trypsin solution (PBS, 0.04% trypsin, 0.02% EDTA), and 2 × 10 ⁵ cells in a new φ35 mm dish. The cells were cultured at a cell density of / dish (5% CO ₂ · 37 ° C.). This subculture was repeated every 4 days, and the cells were cloned by the limiting dilution method at the 7th passage. When performing the limiting dilution method, bovine fibroblast growth factor (bovineFGF) was added to the medium at 10 ng / ml.
From clones obtained in this way, contact inhibition is applied (to remove abnormal cells such as cancerous cells that do not undergo contact inhibition) and those that differentiate into adipocytes with high efficiency are selected. One strain was designated as a preadipocyte cell line (BIP cell).
[Search for expressed genes]
Search for expressed genes in bovine preadipocytes BIP cells obtained as described above were induced into adipocytes, and the cDNA sequences before and after induction were compared to adipocytes. We searched for unique genes in the differentiation.
Specifically, BIP cells are seeded in a dish at a density of 8.5 × 10 ³ cells / cm ² and subcultured with a cell growth medium (DMEM, 10% FBS, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin). Culture was performed under the same conditions as described above. BIP cells obtained by this subculture were seeded in a dish at a density of 2.1 × 10 ⁴ cells / cm ² and cultured for 2 days in the aforementioned growth medium. Subsequently, the culture medium was a differentiation induction medium (medium in which 50 ng / ml insulin, 0.25 μM dexamethasone, 1 to 5 mM octanoic acid, and 10 mM acetic acid was added to the above-mentioned growth medium: a typical fat differentiation induction medium, for example, FRANCINE M. GREGOIRE, et al., Understanding Adiposite Difference. PHYSIOLOGICA) REVIEWS, Vol. 78, no. 3,783-809, 1998), and cultured under the same conditions as above to induce differentiation into adipocytes.
A gene having a difference in expression between the adipocyte on the second day of the proliferation culture and the adipocyte on the fourth day after the differentiation induction was searched using the suppression subtractive hybridization method. That is, it was performed using PCR-selection subtraction kit (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA).
Specifically, the following First Screening and Second Screening were performed.
(1) First Screening
Poly (A) ⁺ RNA was extracted from the adipose progenitor cells on the second day of proliferation culture and the adipocytes on the fourth day of differentiation induction, and used as “driver” and “tester”, respectively. CDNA was synthesized from 2 μg of poly (A) ⁺ RNA, “tester” cDNA was divided into two equal parts, and different adapters were ligated to each.
Next, “tester” cDNA and “driver” cDNA were hybridized twice, and the hybridized cDNA (genes expressed by both “tester” and “driver” hybridize to each other) was removed. .
Here, cDNA remaining without being hybridized is a gene expressed only in each of “tester” and “driver”. In order to amplify a gene specifically expressed in “tester”, suppression PCR was performed. In the suppression PCR, the PCR is performed twice based on the base sequence of the adapter ligated only to the “tester” cDNA, and only the gene specifically expressed in the “tester” is amplified.
The thus obtained “tester” -specific gene group was further size-selected into gene fragments of 300 bp or more.
These gene fragments were incorporated into a cloning vector, and Escherichia coli was transformed using the gene fragment for cloning.
(2) Second Screening
Poly (A) ⁺ RNA is extracted from the adipocytes on the second day of proliferation culture and the adipocytes on the fourth day after differentiation induction, Northern blotting is performed, and only on the adipocytes on the fourth day after differentiation induction. A gene that was expressed or enhanced was selected.
(3) Cloning of the full-length gene Furthermore, the full-length gene was cloned based on the knowledge about the gene fragment obtained by the suppression subtractive hybridization method.
That is, poly (A) ⁺ RNA was extracted from adipocytes on the 4th day after induction of differentiation to prepare a λZAPII cDNA library. From here, 2nd. A recombinant phage containing a full-length cDNA was cloned by a known plaque hybridization method using the gene sequence obtained by screening as a probe. λZAPII (STRATGENE) can be obtained by excision so that the cDNA is incorporated into the pBlueScript cloning vector and transformed into E. coli.
From the transformed Escherichia coli thus obtained, pBlueScript in which the cDNA was incorporated was purified by a known method, and the base sequence of the cDNA was analyzed.
As a result of homology search on the database based on the analyzed base sequence, the clone named 6-3 encodes the full length of bovine serotonin receptor 5-HT _2A (SEQ ID NO: 1). found.
This result reveals that when adipose precursor cells differentiate into adipocytes, serotonin receptor 5-HT _2A is expressed, and serotonin known as a fat cell differentiation and neurotransmitter is It was inferred that it has a deep connection.
Search for genes expressed in human adipose precursor cells Human adipose precursor cells were purchased from Toyobo Co., Ltd., and differentiation into adipocytes was performed using a precursor cell differentiation induction medium (Toyobo Co., Ltd.). Total RNA was extracted before differentiation induction and on days 3, 6, 9, and 12 after differentiation induction, and amplification of a gene encoding serotonin receptor 5-HT _2A was performed by RT-PCR to obtain known human serotonin receptor 5 -HT _2A PCR primers complementary to a portion of the nucleotide sequence of the gene encoding, carried out by a conventional method, in the course of differentiation into adipocytes were examined the expression of the serotonin receptor subtypes. An electrophoretic image of the gene amplification product showing the result is shown in FIG. 1. [In FIG. 1, the left end is a marker, followed by differentiation induction, 3 days after differentiation induction, 6 days after differentiation induction, differentiation The band of the amplification product (440 bp) of the gene encoding serotonin receptor 5-HT _2A on day 9 after induction and day 12 after differentiation induction is shown. The molecular weight of the marker is 800, 600, 400, 200 bp from the top].
From the results shown in FIG. 1, it was confirmed that expression of serotonin receptor 5-HT _2A was also induced in humans after induction of differentiation of preadipocytes. That is, it can be seen that, in the case of humans, serotonin receptor 5-HT _2A is involved in differentiation into adipocytes as in BIP cell and 3T3-L1 cell.
A slight band indicating the presence of serotonin receptor 5-HT _2A is also observed in the lane before differentiation induction in FIG. This is because, in the purchased human adipose precursor cells, cells with oil droplets in the cells are observed before differentiation induction, so this commercial product of human adipose precursor cells is not a complete adipose precursor cell. This shows that the cell population is already contaminated with cells that have already differentiated into adipocytes. Thus, it is considered that such contamination of adipocytes in the preadipocytes causes a slight amount of serotonin receptor 5-HT _2A expression to be detected even before differentiation induction.
From these results, the present inventor induced the expression of serotonin receptor 5-HT _2A , which is one of serotonin receptor subtypes, in adipose precursor cells during adipogenic differentiation. It was found that serotonin exerts some action on the preadipocytes and promotes differentiation into adipocytes.
The anti-obesity agent of the present invention From the above-mentioned findings, the present inventor has shown that an antagonist that inhibits the action of serotonin receptor 5-HT _2A suppresses differentiation of adipose precursor cells into adipocytes, and is effective in anti-obesity agents. The present invention was completed by finding that it can be used as a component.
That is, the present invention provides an adipocyte differentiation inhibitor (hereinafter also referred to as “the inhibitor”), which can be used as an anti-obesity agent, containing an inhibitor against serotonin receptor 5-HT _{2A as} an active ingredient. .

第１図は、ヒト脂肪前駆細胞が脂肪細胞へ分化する際のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法で検討した結果を示す写真である。
第２図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を検討した結果を示す図面である。
第３Ａ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、無添加誘導群を検討した結果を示す写真である。
第３Ｂ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、セロトニン添加群を検討した結果を示す写真である。
第３Ｃ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ添加群を検討した結果を示す写真である。
第３Ｄ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、非誘導群を検討した結果を示す写真である。FIG. 1 is a photograph showing the results of examining the expression of serotonin receptor 5-HT _2A when human adipose precursor cells differentiate into adipocytes by RT-PCR.
FIG. 2 is a drawing showing the results of examining the regulating effect of an antagonist on serotonin receptor 5-HT _2A in the process of adipocyte differentiation.
FIG. 3A is a photograph showing the results of examining the additive-free induction group by visual observation using a phase-contrast microscope for the antagonistic action of serotonin receptor 5-HT _2A in the process of adipocyte differentiation.
FIG. 3B is a photograph showing the results of examining the serotonin-added group by visual observation using a phase-contrast microscope for the antagonistic action of serotonin receptor 5-HT _2A in the process of adipocyte differentiation.
FIG. 3C is a photograph showing the results of examining the ketanserin addition group by visual observation using a phase-contrast microscope for the antagonistic action of the serotonin receptor 5-HT _2A in the process of adipocyte differentiation.
FIG. 3D is a photograph showing the result of examining the non-induced group by visual observation using a phase-contrast microscope for the antagonistic action of the serotonin receptor 5-HT _2A in the process of adipocyte differentiation.

本抑制剤の有効成分となり得る、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの脂肪前駆細胞における働きを抑制する性質を有する「抑制物質」の、受容体の働きの抑制の態様は、この性質を有している限りにおいて限定されない。すなわち、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａにおけるアンタゴニストであることも可能であり、セロトニン自体の不活性化剤であってもよい。また、抑制物質は、天然物質（生物工学的手法により製造された組換え蛋白質等を含む）であっても、化学合成物質であってもよい。
さらに、抑制物質は、既知のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの働きの抑制物質であってもよく、スクリーニングにより、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの働きの抑制作用が、新たに見出された物質であってもよい。
既知のセロトニン受容体５−ＨＴ _２Ａの働きの抑制物質
例えば、下記の化学式（１）〜（７）からなる物質の群から選ばれる１種または２種以上を挙げることができる。

この化学式（１）で表される物質は、化学名が、３−［２−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｄｉｏｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストとして知られている［Ｌｅｙｓｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１，３０１−３１４（１９８２）等］。また、この物質（１）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されず、例えば、その酒石酸塩が、シグマ社から入手可能である（ＫＥＴＡＮＳＥＲＩＮＴＡＲＴＲＡＴＥ：ＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙＮｏ．８３８４６−８３−７）。

この化学式（２）で表される物質は、化学名が、６−Ｍｅｔｈｙｌ−１−（１−ｍｅｔｈｌｅｔｈｙｌ）−ｅｒｇｏｌｉｎｅ−８−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ（８β）−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌｅｓｔｅｒであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストとして知られている［Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２２７，３２７−３３２（１９８３）等］。また、この物質（２）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されず、例えば、そのマレイン酸塩が、シグマ社から入手可能である（ＬＹ−５３，５８７ＭＡＬＥＡＴＥ：ＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙＮｏ．６０６３４−５１−７）。

この化学式（３）で表される物質は、化学名が、６−［２［４［ｂｉｓ（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］−７−ｍｅｔｈｙｌ−５Ｈ−ｔｈｉａｚｏｌｏ［３，２−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−５−ｏｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２等に対するアンタゴニストとして知られている［Ｎｅｗ，Ｊ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３，１（１９８８）等］。また、この物質（３）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（３）は、シグマ社から入手可能である（ＲＩＴＡＮＳＥＲＩＮ：ＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙＮｏ．８７０５１−４３−２）。

この化学式（４）で表される物質は、化学名が、１−（１−Ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２等に対するアンタゴニストとして知られている［Ｇｌｅｎｎｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９，２３７５−２３８０（１９８６）］。また、この物質（４）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されず、例えば、その塩酸塩が、シグマ社から入手可能である（ＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙＮｏ．５７５３６−８６−４（ｆｒｅｅｂａｓｅ））。

この化学式（５）で表される物質は、化学名が、１−［２−［４−（６−ｆｌｕｏｒｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ９−３，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−１Ｈ，４Ｈ−［１，２，５］ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｏ［４．３．２−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−２，２−ｄｉｏｘｉｄｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストとして知られている［Ｐｕｌｌａｒ，Ｉ．Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０７，３９（２０００）］。また、この物質（４）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（４）は、シグマ社から入手可能である（ＬＹ−３６７，２６５）。

この化学式（６）で表される物質は、化学名が、３−［２−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ−［１，２−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｏｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストとして知られている［Ｆｉｏｒｅｌｌａ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１１９，２２２−２３０（１９９５）］。また、この物質（５）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（５）は、シグマ社から入手可能である（Ｐｉｒｅｎｐｅｒｏｎｅ：ＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙＮｏ．７５４４４−６５−４）。

この化学式（７）で表される物質は、化学名が、８−Ｃｈｌｏｒｏ−１１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ，ｅ］［１，４］ｄｉａｚｅｐｉｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２等に対するアンタゴニストとして知られている［Ｏｌｅｓｅｎ，Ｏ．Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．６２２，３９（１９９３）］。また、この物質（７）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（７）は、シグマ社から入手可能である（Ｎ−Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｃｌｏｚａｐｉｎｅ：ＣＡＳＲｅｇｉｓｔｒｙＮｏ．６１０４−７１−８）。
未知のセロトニン受容体５−ＨＴ _２Ａの働きの抑制物質
セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの働きの抑制物質のうち、未知のもののスクリーニングは、このセロトニン受容体サブタイプへの結合と、その既知の働きの抑制を確認することにより行うことができるが、本抑制剤が、脂肪前駆細胞の、脂肪細胞への分化を抑制するものである故に、被験物質を、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに接触させることによる、当該受容体５−ＨＴ_２Ａの変化を検出して、当該変化を、被験物質の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の抑制作用として同定して、当該作用を有する被験物質をスクリーニングする方法を用いることが好適である。
被験物質のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａを介した脂肪前駆細胞等への作用の同定方法は、特に限定されず、当業界周知のアッセイ法を用いて測定することができる。例えば、脂肪細胞内の油滴中に蓄積された中性脂肪（トリグリセライド）を定量する方法、細胞内の油滴を染色する方法（例えば、ＯｉｌＲｅｄＯ染色等）、脂肪細胞の分化マーカーとして知られている遺伝子、または、これに基づく蛋白質（ＰＰＡＲγ２，ａＰ２，ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ等）を検出する方法等を挙げることができる。
被験物質における、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａを介した脂肪前駆細胞等への作用を同定する代表的な手段の一つとして、被験物質の、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対する結合性を指標とする手段を挙げることができる。
この手段を用いる場合、例えば、被験物質の精製セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａへの結合は、表面プラズモン共鳴を測定原理とした装置［例えばＢｉａｃｏｒｅ２０００（アマシャムファルマシア社）］で直接測定することができる（例えばＢｏｒｉｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１１３８４−１１３９１，１９９７に記載された方法を例示できる）。また、被験物質のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａへの結合は、標識した被験物質を用いて直接試験することも可能であり、また、上述したように、標識した公知のリガンド（例えば、［^３Ｈ］標識セロトニン）の結合の阻害を指標に測定することもできる（例えば、Ｂｏｉｅ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１８９１０−１８９１６，１９９５に記載された方法を例示できる）。
この手段により、被験物質に、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対する結合性が認められれば、被験物質が、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａを介した脂肪前駆細胞の脂肪細胞の分化に対して、何らかの作用を及ぼす調整物質である可能性が高くなる。
また、被験物質のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａを介した脂肪前駆細胞に対する働きを検出することにより、所望する調整作用を有する被験物質を選別することができる。
例えば、何らかの調整物質として選別された被験物質による、ｉｎｓｉｔｕの状態の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の抑制を検出することにより、被験物質の脂肪前駆細胞に対する、負の働きを検出することができる。上述したように、この場合、脂肪前駆細胞の細胞株を樹立して、この細胞株を用いて、上記の負の作用を検出することが好適である。
この手段において、被験物質により、ｉｎｓｉｔｕの状態の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化が抑制されることが認められれば、被験物質が、脂肪細胞への分化を抑制する、アンタゴニスト等としてスクリーニングされる。
脂肪細胞への分化を抑制するアンタゴニストは、脂肪組織の増大を抑制する抗肥満剤の有効成分として有用と考えられる。
本抑制剤の態様
本抑制剤には、上述のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａの働きの抑制物質を有効成分として、各種医薬用途に有用な製剤とすることができる。この製剤には、上述の抑制物質と共に、適当な医薬製剤担体を配合して、製剤組成物の形態に調製される。医薬製剤担体としては、使用形態に応じた製剤を調製するために慣用されている、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等を、必要に応じて用いることができる。
製剤組成物の形態は、上述の抑制物質を効果的に含有する形態であれば、特に限定されず、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤、液剤、懸濁剤、乳液剤等、とすることが可能である。
本抑制剤は、その形態に応じた適当な投与経路、例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、固剤形態の医薬製剤は、経口ないし経腸投与により、投与され得る。
本抑制剤中の有効成分の量および製剤の投与量は、有効成分の種類、製剤の投与方法、投与形態、使用目的、これが適用される者の肥満度等の症状に応じて適宜選択されるべきものであり、特に限定されない。また、投与は、１日１〜４回程度の頻度が好適である。The mode of the suppression of the function of the receptor of the “suppressing substance” having the property of suppressing the action of serotonin receptor 5-HT _{2A in} the preadipocytes, which can be an active ingredient of the present inhibitor, has this property. As long as there is no limitation. That is, it can be an antagonist in serotonin receptor 5-HT _2A , and may be an inactivating agent for serotonin itself. Further, the inhibitory substance may be a natural substance (including a recombinant protein produced by a biotechnological technique) or a chemically synthesized substance.
Moreover, inhibitors may be inhibitors of the action of known serotonin receptor 5-HT _2A, screening, inhibitory effect of the action of serotonin receptor 5-HT _2A was newly found substance It may be.
Examples of known substances that suppress the action of serotonin receptor 5-HT _2A include one or more selected from the group of substances consisting of the following chemical formulas (1) to (7).

The substance represented by the chemical formula (1) has a chemical name of 3- [2- [4- (4-Fluorobenzoyl) -1-piperidinyl] ethyl] -2,4 (1H, 3H) -quinazolinedione, Known as an antagonist to serotonin receptor 5-HT2 [Leysen et al. Mol. Pharmacol. 21, 301-314 (1982) etc.]. The salt of the substance (1) is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt. For example, the tartrate salt thereof is available from Sigma (KETENSERIN TARTRATE: CAS Registry No. 83846-83). -7).

The substance represented by the chemical formula (2) has a chemical name of 6-methyl-1- (1-methylethyl) -ergoline-8-carboxylic acid (8β) -2-hydroxy-1-methylpropyester, and serotonin. Known as an antagonist to the receptor 5-HT2 [Cohen, M. et al. L. et al. , J .; Pharmacol. Exp. Ther. 227, 327-332 (1983) etc.]. Moreover, the salt of this substance (2) will not be specifically limited if it is a pharmacologically acceptable salt, For example, the maleate is available from Sigma (LY-53,587 MALEATE: CAS Registry). No. 60634-51-7).

The substance represented by the chemical formula (3) has a chemical name of 6- [2 [4 [bis (4-Fluorophenyl) methylene] -1-piperidinyl] ethyl] -7-methyl-5H-thiazolo [3,2 -A] pyrimidin-5-one, which is known as an antagonist to serotonin receptor 5-HT2 and the like [New, J. et al. S. et al. , Ann. Rep. Med. Chem. 23, 1 (1988) etc.]. Moreover, the salt of this substance (3) will not be specifically limited if it is a pharmacologically acceptable salt. The substance (3) is available from Sigma (RITANSERIN: CAS Registry No. 87051-43-2).

The substance represented by the chemical formula (4) has a chemical name of 1- (1-Naphthyl) piperazine and is known as an antagonist to serotonin receptor 5-HT2 and the like [Glennon, R., et al. A. et al. , J .; Med. Chem. 29, 2375-2380 (1986)]. Moreover, the salt of this substance (4) will not be specifically limited if it is a pharmacologically acceptable salt, For example, the hydrochloride can be obtained from Sigma (CAS Registry No. 57536-86-4 ( free base)).

The substance represented by the chemical formula (5) has a chemical name of 1- [2- [4- (6-fluoro-1H-indol-3-yl9-3,6-dihydro-1H, 4H- [1, 2,5] thiadiazolo [4.3.2-ij] quinoline-2,2-dioxide, known as an antagonist to serotonin receptor 5-HT _2A [Pullar, IA, Eur. Pharmacol.407, 39 (2000)] The salt of the substance (4) is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and the substance (4) is available from Sigma (see FIG. LY-367, 265).

The substance represented by the chemical formula (6) has a chemical name of 3- [2- [4- (4-Fluorobenzoyl) -1-piperidinyl] ethyl] -2-methyl-4H-pyrido- [1,2- a] pyrimidin-4-one, known as an antagonist to the serotonin receptor 5-HT2 [Fiorella, D. et al. , Et al. , Psychopharmacology, 119, 222-230 (1995)]. Moreover, the salt of this substance (5) will not be specifically limited if it is a pharmacologically acceptable salt. Substance (5) is available from Sigma (Pirenperone: CAS Registry No. 75444-65-4).

The substance represented by the chemical formula (7) has a chemical name of 8-Chloro-11-piperazinyl-5H-dibenzo [b, e] [1,4] diapinepine and an antagonist for serotonin receptor 5-HT2 and the like. Known as [Olesen, O .; V. , Et al. , J .; Chromatogr. Sci. 622, 39 (1993)]. The salt of the substance (7) is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt. Substance (7) is available from Sigma (N-Demethylclozapine: CAS Registry No. 6104-71-8).
An Inhibitor of Unknown Serotonin Receptor 5-HT _2A Function Among the inhibitors of serotonin receptor 5-HT _2A function, screening of unknown ones involves binding to this serotonin receptor subtype and its known function. However, since the inhibitor suppresses the differentiation of preadipocytes into adipocytes, the test substance is brought into contact with serotonin receptor 5-HT _2A . The change of the receptor 5-HT _2A is detected, and the change is identified as an action of suppressing the differentiation of the test substance into the adipocytes of the preadipocytes, and the test substance having the action is screened. It is preferred to use the method.
The method for identifying the action of the test substance on the preadipocytes and the like via serotonin receptor 5-HT _2A is not particularly limited, and can be measured using an assay method well known in the art. For example, a method for quantifying neutral fat (triglyceride) accumulated in oil droplets in fat cells, a method for staining oil droplets in cells (for example, Oil Red O staining, etc.), known as a differentiation marker for fat cells And a method of detecting a gene or a protein (PPARγ2, aP2, perilipin, etc.) based thereon.
In the test substance, as a representative means for identifying effects on preadipocyte and the like via a serotonin receptor 5-HT _2A, and the test substance, the binding to serotonin receptor 5-HT _2A index The means to do can be mentioned.
When this means is used, for example, the binding of a test substance to purified serotonin receptor 5-HT _2A can be directly measured by an apparatus based on surface plasmon resonance (eg, Biacore 2000 (Amersham Pharmacia)). (For example, the method described in Boris, J. et al., J. Biol. Chem., 272: 11384-11391, 1997 can be exemplified). In addition, the binding of a test substance to serotonin receptor 5-HT _2A can be directly tested using a labeled test substance, and as described above, a known labeled ligand (eg, [ ³ H] -labeled serotonin) can be measured as an index (for example, the method described in Boie, Y. et al., J. Biol. Chem., 270: 18910-18916, 1995 can be exemplified).
By this means, if the test substance has binding property to serotonin receptor 5-HT _2A , the test substance will have some action on the differentiation of adipocytes of the preadipocytes via serotonin receptor 5-HT _2A. The possibility of being a regulating substance that acts is increased.
Further, by detecting the act against preadipocytes via serotonin receptor 5-HT _2A of the test substance, it is possible to screen test substance having a modulating effects desired.
For example, detecting the negative action of a test substance on preadipocytes by detecting the suppression of differentiation of preadipocytes in situ into adipocytes by a test substance selected as a regulator Can do. As described above, in this case, it is preferable to establish a cell line of preadipocytes and use the cell line to detect the negative effect described above.
In this means, if it is recognized that the test substance suppresses the differentiation of preadipocytes in situ into adipocytes, the test substance is screened as an antagonist that suppresses differentiation into adipocytes. The
An antagonist that suppresses differentiation into adipocytes is considered useful as an active ingredient of an anti-obesity agent that suppresses an increase in adipose tissue.
Aspect of the present inhibitor The present inhibitor can be a preparation useful for various pharmaceutical applications, using as an active ingredient a substance that suppresses the action of the serotonin receptor 5-HT _2A . This preparation is prepared in the form of a pharmaceutical composition by blending an appropriate pharmaceutical preparation carrier with the above-mentioned inhibitory substance. As a pharmaceutical preparation carrier, a filler, a bulking agent, a binder, a moistening agent, a disintegrant, a surfactant, etc., which are conventionally used for preparing a preparation according to the use form, should be used as necessary. Can do.
The form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as the above-described inhibitory substance is effectively contained. For example, the solid composition such as a tablet, a powder, a granule, or a pill, a liquid, a suspension, It can be an emulsion or the like.
The inhibitor is administered by an appropriate administration route according to its form, for example, a pharmaceutical preparation in the form of an injection is administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, intraperitoneally, etc. It can be administered by oral or enteral administration.
The amount of the active ingredient in the inhibitor and the dosage of the preparation are appropriately selected according to the type of the active ingredient, the method of administration of the preparation, the mode of administration, the purpose of use, and the symptoms such as obesity of the person to whom this is applied. There is no particular limitation. Moreover, the frequency of administration is preferably about 1 to 4 times a day.

以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明する。
［セロトニンのアンタゴニストの脂肪細胞への分化の抑制作用の検討］
セロトニンのアンタゴニストの脂肪細胞への分化の抑制作用について検討するために、脂肪細胞へと分化することが知られている、マウス由来の細胞株（３Ｔ３−Ｌ１細胞：ＡＴＣＣから購入）を用いた。
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、増殖培地［ＤＭＥＭ，１０％ＣＳ（ｃａｌｆｓｅｒｕｍ），１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］で、５％ＣＯ_２、３７℃下で培養後、細胞がディッシュ一面に増殖してから２日後に、分化誘導培地［ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１〜１０μｇ／ｍｌインシュリン，１μＭデキサメタゾン，０．５ｍＭＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ），１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］と、培地交換を行い、同条件で２日間培養した。次いで、分化維持培地［ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１〜１０μｇ／ｍｌインシュリン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］と培地交換を行い、引き続き、培養を継続した。
本試験は、上記の３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導時に、分化誘導培地に、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストであるＫｅｔａｎｓｅｒｉｎ（シグマ社製）もしくはセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストであるＬＹ−５３８５７（シグマ社製）を、それぞれ１μＭ添加した培地を用いた群、また、ポジティブコントロールとして、セロトニンを５μＭ添加した培地を用いた群、ネガティブコントロールとして、誘導培地への交換を行わない群において、培地交換６日後、９日後、１２日後の細胞内におけるトリグリセリドの蓄積量を、トリグリセライドＧテストワコー（和光純薬社製）により定量し、比較検討を行った。その結果を第２図と第３Ａ図〜第３Ｄ図に示す。第２図の結果により、上記のセロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａに対するアンタゴニストを添加した群は、トリグリセリドの細胞内の蓄積が少なくなっており、脂肪細胞への分化が抑制されていることが判明した。また、第３Ａ図〜第３Ｄ図［第３Ａ図：無添加誘導群、第３Ｂ図：セロトニン添加群、第３Ｃ図：Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ添加群、第３Ｄ図：非誘導群］は、分化誘導６日目の細胞を、位相差顕微鏡（５０倍）を用いて、目視による検討を行った結果を示す図面である。この結果も、第２図に示した結果を裏付けている。
これらの結果により、セロトニン受容体５−ＨＴ_２Ａは、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化時において、分化促進に向けて働いていることが明らかになり、さらに、この働きは、セロトニン受容体のアンタゴニストにより抑制されることが明らかになった。すなわち、当該セロトニン受容体サブタイプに対すアンタゴニストは、脂肪細胞への分化に対する抑制作用等を有し、脂肪細胞の蓄積を抑制する抗肥満剤の有効成分として有用であることが明らかとなった。Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[Study of the inhibitory effect of serotonin antagonists on differentiation into adipocytes]
In order to examine the inhibitory effect of serotonin antagonists on differentiation into adipocytes, a mouse-derived cell line (3T3-L1 cells: purchased from ATCC) known to differentiate into adipocytes was used.
3T3-L1 cells were cultured in a growth medium [DMEM, 10% CS (calf serum), 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin] at 5% CO ₂ at 37 ° C., and then the cells grew on the whole dish surface. 2 days later, differentiation induction medium [DMEM, 10% FBS, 1 to 10 μg / ml insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine), 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin] Then, the medium was changed and cultured for 2 days under the same conditions. Subsequently, the medium was exchanged with a differentiation maintenance medium [DMEM, 10% FBS, 1 to 10 μg / ml insulin, 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin], and the culture was continued.
In this test, when differentiation of the above-described 3T3-L1 cells was induced, ket- serine (manufactured by Sigma) which is an antagonist to serotonin receptor 5-HT2 or LY- which is an antagonist to serotonin receptor 5-HT _2A was added to the differentiation-inducing medium. In a group using 53857 (manufactured by Sigma) each with 1 μM added medium, as a positive control, using a medium supplemented with 5 μM serotonin, as a negative control, in a group not replacing the induction medium, The amount of triglyceride accumulated in the cells 6 days, 9 days, and 12 days after the medium exchange was quantified with Triglyceride G Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and a comparative study was performed. The results are shown in FIG. 2 and FIGS. 3A to 3D. From the results shown in FIG. 2, it was found that the group to which the above antagonist for serotonin receptor 5-HT _2A was added had less accumulation of triglycerides in the cells, and differentiation into adipocytes was suppressed. . 3A to 3D [FIG. 3A: additive-free induction group, FIG. 3B: serotonin addition group, FIG. 3C: Ketanserin addition group, FIG. 3D: non-induction group] It is drawing which shows the result of having examined visually of this cell using the phase-contrast microscope (50 times). This result also supports the result shown in FIG.
These results reveal that serotonin receptor 5-HT _2A works to promote differentiation during adipocyte differentiation of preadipocytes, and further, this function is caused by serotonin receptor antagonists. It became clear that it was suppressed. That is, it has been clarified that the antagonist to the serotonin receptor subtype has an inhibitory action on differentiation into adipocytes and is useful as an active ingredient of an anti-obesity agent that suppresses accumulation of adipocytes.

本発明により、肥満と関連する脂質代謝の働きが深く究明され、この働きを原理として用いる抗肥満剤が提供される。 According to the present invention, the action of lipid metabolism related to obesity is deeply investigated, and an anti-obesity agent using this action as a principle is provided.

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

An adipocyte differentiation inhibitor comprising, as an active ingredient, an inhibitory substance for serotonin receptor 5-HT _2A .

The differentiation inhibitor of claim 1, wherein the adipocyte differentiation inhibitor is an anti-obesity agent.

The inhibitory substance for serotonin receptor 5-HT _2A is one or more selected from the group consisting of the following chemical formulas (1) to (7) and salts of these chemical formulas: 3. The adipocyte differentiation inhibitor according to 1 or 2.