JPWO2004078963A1

JPWO2004078963A1 - Test method for steroid responsiveness

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Publication number: JPWO2004078963A1
Application number: JP2005503071A
Authority: JP
Inventors: 真由美玉利; 耕一長谷川; 朗品川; 杉田　雄二; 雄二杉田
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2006-06-08
Also published as: WO2004078963A1

Abstract

アリル炭化水素受容体（ＡＨＲ）遺伝子における多型と吸入ステロイド応答性との関連が明らかにされた。ＡＨＲ遺伝子のＳＮＰｓの解析によって吸入ステロイド応答性の検査が可能である。たとえば、ＡＨＲ遺伝子の９０１０番目の塩基および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方の多型のジェノタイピングにより、吸入ステロイド応答性が予測される。本発明の方法により、プロピオン酸ベクロメタゾンなどの吸入ステロイドに対する被検者の応答性を予測することができる。An association between polymorphisms in the allyl hydrocarbon receptor (AHR) gene and inhaled steroid responsiveness has been elucidated. Analysis of inhaled steroid responsiveness is possible by analysis of AHR gene SNPs. For example, inhaled steroid responsiveness is predicted by genotyping of either or both of the 9010th base and 9231st base of the AHR gene. By the method of the present invention, the responsiveness of a subject to an inhaled steroid such as beclomethasone propionate can be predicted.

Description

本発明は、ステロイド耐性の検査方法に関する。 The present invention relates to a test method for steroid resistance.

通常、小児喘息患者の治療初期はプロピオン酸ベクロメタゾンが処方されることが多い。しかし重症患者では徐々にプロピオン酸ベクロメタゾンに耐性となるため、プロピオン酸フルチカゾンに処方を変更する。プロピオン酸ベクロメタゾンの代謝に、ＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写制御を受けている薬物代謝酵素が関わっているならば、ＡＨＲのＳＮＰｓを持つ重症小児患者群では代謝活性が亢進し、徐々にプロピオン酸ベクロメタゾン耐性になる機構が想定される。したがって、小児喘息患者のＡＨＲにあるＳＮＰｓの有無の診断は、プロピオン酸フルチカゾンのようなＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写調節を受けない代謝酵素により分解される薬剤を選定するための指標となる可能性がある。これらの指標を使うことにより、副作用の予防や、医療費の軽減が期待される。
ダイオキシン類による転写刺激に関与する核内受容体として、アリル炭化水素受容体（ＡｒｙｌＨｙｄｒｏｃａｒｂｏｎＲｅｃｅｐｔｏｒ；以下ＡＨＲと省略する）が知られている。ＡＨＲは、そのリガンドである２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ（ＴＣＤＤ）との結合によって核内に移行する。核内に移行したＡＨＲは、アリル炭化水素受容体核移行因子（Ａｈｒｅｃｅｐｔｏｒｍｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ；以下ＡＲＮＴと省略する）とヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーは、異物応答配列（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ；以下ＸＲＥと記載する）を認識する。その結果、プロモーター領域にＸＲＥを含む遺伝子の転写を活性化する。ＸＲＥの塩基配列は公知である（ＴＮＧＣＧＴＧ，Ｎは任意）。
ＸＲＥによる転写制御を受けている代表的な遺伝子には、ＣＹＰ１Ａ１等の薬物代謝酵素遺伝子が挙げられる。また、ＡＨＲ関連遺伝子群の一つであるＡＨＲ抑制因子（ＡＨＲｒｅｐｒｅｓｓｏｒ；以下ＡＨＲＲと記載する）は、核内でＡＲＮＴと結合することから、ＡＨＲとは互いに競合的な関係にある。ＡＨＲＲ遺伝子もＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写制御を受けることから、ＡＨＲＲはＡＨＲのネガティブフィードバック制御に働くことが示唆されている（ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＡｈ（ｄｉｏｘｉｎ）ｒｅｃｅｐｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＭｉｕｒａＪｅｔａｌ．ＧＥＮＥＳ＆ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ１３，２０−２５（１９９９））。
ＡＨＲにある非同義置換を伴う１塩基多型（ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ；以下ＳＮＰｓと記載する）として、例えば次のような多型が報告されている。
Ｐｒｏ５１７Ｓｅｒ（５１７位のプロリン→セリンへの置換）
Ａｒｇ５５４Ｌｙｓ（５５４位のアルギニン→リジンへの置換）
Ｖａｌ５７０Ｉｌｅ（５７０位のバリン→イソロイシンへの置換）
これらのＳＮＰｓのうち、次の組み合せを有する場合に、ＴＣＤＤによるＣＹＰ１Ａ１の発現が抑制されたことが報告されている（ＨｕｍａｎＡｒｙｌＨｙｄｒｏｃａｒｂｏｎＲｅｃｅｐｔｏｒＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓＴｈａｔＲｅｓｕｌｔｉｎＬｏｓｓｏｆＣＹＰ１Ａ１Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ＷｏｎｇＪＭＹｅｔａｌ．ＢＢＲＣ２８８，９９０−９９６（２００１））。
Ｓｅｒ５１７／Ｌｙｓ５５４／Ｉｌｅ５７０、または
Ｌｙｓ５５４／Ｉｌｅ５７０
なお本発明者らの解析によると、日本人にはＰｒｏ５１７Ｓｅｒ、あるいはＶａｌ５７０Ｉｌｅの多型は確認できていない。
一般に、ＣＹＰ１Ａ１等の薬物代謝酵素遺伝子の多型と、薬物に対する患者の応答性の関連性を示唆する報告は多い。しかし、その転写制御に関与する因子の多型と薬剤応答性との関連性は未知である。
ＡＨＲ遺伝子の多型について、いくつかの研究成果が報告されている。たとえば、フランス人におけるＡＨＲのＳＮＰｓ解析（肺癌患者でのＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙ）において、次のような多型が見出された。しかし肺癌のケースコントロールスタディで疾患との有意な関連はない。またＣＹＰ１Ａ１の誘導能とも相関しなかった（ＣａｕｃｈｉＡｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆｈｕｍａｎａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｈＲ）ｇｅｎｅｉｎａＦｒｅｎｃｈｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＣＹＰ１Ａ１ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００１２２：１８１９−２４）。
アミノ酸置換ＳＮＰｓ：
Ａｒｇ５５４Ｌｙｓ（１７２１Ｇ／Ａ）、および
Ｍｅｔ７８６Ｖａｌ（２４１７Ａ／Ｇ）
５’ＵＴＲ中のＳＮＰｓ：１５７Ｇ／Ａ（頻度０．００５の稀なＳＮＰｓ）
多種の人種におけるＡＨＲのＳＮＰｓ解析も実施されている。その結果、最も高い頻度のＳＮＰｓとして、Ａｒｇ５５４Ｌｙｓ（Ｌｙｓ３５％）、およびＰｒｏ５１７Ｓｅｒがアフリカ人で検出された。また、Ｖａｌ５７０Ｉｌｅがアフリカ人とアメリカ人で検出された。更にｉｎｖｉｔｒｏでＬｙｓ５５４／Ｉｌｅ５７０、Ｓｅｒ５１７／Ｌｙｓ５５４／Ｉｌｅ５７０変異を有するＡＨＲのリガンド結合能が調べられている。これらの変異体の、ＡＲＮＴとのダイマー形成能、およびＤＮＡ結合能には野生型との変化は見られなかった。一方、ｉｎｖｉｖｏでＨｅｐａ１細胞に変異ＡＨＲを発現させてＴＣＤＤで刺激した実験においては、Ｌｙｓ５５４／Ｉｌｅ５７０を持つ変異ＡＨＲで、ＣＹＰ１Ａ１の誘導が抑制された（ＷｏｎｇＪＭｅｔ．ａｌ．ＨｕｍａｎａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｔｈａｔｒｅｓｕｌｔｉｎｌｏｓｓｏｆＣＹＰ１Ａ１ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２００１２８８：９９０−６）。
ＡＨＲで高頻度に検出されるアミノ酸置換ＳＮＰｓであるＡｒｇ５５４Ｌｙｓについて、人種間での頻度が調査されている。その結果、以下に示すような頻度情報が報告された。
Ｊａｐａｎｅｓｅ：０．４３
ＩｖｏｒｙｃｏａｓｔＡｆｒｉｃａｎ：０．５７
Ａｆｒｉｃａｎ：０．５３
Ｃａｒｂｂｅａｎ−ａｆｒｉｃａｎ：０．３９
ＣａｎａｄｉａｎＣｈｉｎｅｓｅ：０．３２
ＮａｔｉｖｅＩｎｄｉａｎ：０．１４
ＦｒｅｎｃｈＣａｎａｄｉａｎ：０．１２
ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ（ｍｉｘｅｄｅｔｈｎｉｃｉｔｙ）：０．１１
ＣａｎａｄｉａｎＩｎｕｉｔ：０．０９
Ｇｅｒｍａｎ：０．０７
更にＡＨＲに見出されたアミノ酸置換を伴うＳＮＰｓについて、アミノ酸の置換による生物学的な活性に与える影響が調べられている。ｉｎｖｉｔｒｏでＡｒｇ５５４Ｌｙｓ変異を有するＡＨＲのリガンド結合能、ＡＲＮＴとのダイマー形成能、およびＤＮＡ結合能には変化は見られなかった。ｉｎｖｉｖｏでＨｅｐａ１細胞に変異ＡＨＲを発現させてＴＣＤＤで刺激した実験においては、Ａｒｇ５５４、あるいはＡｒｇ５５４Ｌｙｓを持つ変異ＡＨＲで、ＣＹＰ１Ａ１の誘導能には変化がなかった（ＷｏｎｇＪＭｅｔ．ａｌ．Ｅｔｈｎｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｉｎｔｈｅａｌｌｅｌｉｃｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎａｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏｄｏｎ５５４ａｎｄａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｖａｒｉａｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００１，１１：８５−９４）。
日本人に見出されるＳＮＰｓを解析した報告もある。日本人のＡＨＲの主要なＳＮＰｓは、Ａｒｇ５５４Ｌｙｓの置換を伴うＳＮＰｓであり、Ａｒｇ５５４の頻度は０．５７、Ｌｙｓ５５４の頻度は０．４３であった。このＳＮＰｓは肺癌の発症には関与していなかった（ＫａｗａｊｉｒｉＫｅｔ．ａｌ．ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｏｆｈｕｍａｎＡｈｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅａｒｅｎｏｔｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９５，５：１５１−８）。Usually, beclomethasone propionate is often prescribed in the early stages of treatment for children with asthma. However, because severe patients gradually become resistant to beclomethasone propionate, the prescription is changed to fluticasone propionate. If drug metabolism enzymes that are regulated by AHR / ARNT are involved in the metabolism of beclomethasone propionate, metabolic activity increases in severely pediatric patients with AHR SNPs and gradually becomes resistant to beclomethasone propionate. A mechanism is assumed. Therefore, the diagnosis of the presence or absence of SNPs in AHR of pediatric asthma patients may be an indicator for selecting drugs that are degraded by metabolic enzymes that are not subject to transcriptional regulation by AHR / ARNT, such as fluticasone propionate. . Use of these indicators is expected to prevent side effects and reduce medical costs.
An allyl hydrocarbon receptor (hereinafter abbreviated as AHR) is known as a nuclear receptor involved in transcriptional stimulation by dioxins. AHR translocates into the nucleus by binding to its ligand 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). AHR translocated into the nucleus forms a heterodimer with an allyl hydrocarbon receptor nuclear translocator (hereinafter abbreviated as ARNT). This heterodimer recognizes a xenobiotic response element (hereinafter referred to as XRE). As a result, transcription of a gene containing XRE in the promoter region is activated. The base sequence of XRE is known (TNGCGTG, N is arbitrary).
Representative genes that are subject to transcriptional control by XRE include drug-metabolizing enzyme genes such as CYP1A1. An AHR suppressor (AHR repressor; hereinafter referred to as AHRR), which is one of the AHR-related genes, binds to ARNT in the nucleus and is in a competitive relationship with AHR. The AHRR gene is also subject to transcriptional control by AHR / ARNT, suggesting that AHRR acts on negative feedback control of AHR (Identification of a novelism of regulation of Ah (dioxin) receptor func. Mir. GENES & DEVELOPMENT 13, 20-25 (1999)).
For example, the following polymorphisms have been reported as single nucleotide polymorphisms (hereinafter referred to as SNPs) with non-synonymous substitution in AHR.
Pro 517 Ser (replacement of proline to serine at position 517)
Arg 554 Lys (arginine at position 554 → substitution with lysine)
Val 570 Ile (Substitution from valine 570 to isoleucine)
Among these SNPs, it has been reported that the expression of CYP1A1 by TCDD was suppressed when it had the following combination (Human Aryl Hydrocarbon Receptor Polymorphisms That Results in LossJW 8B). , 990-996 (2001)).
Ser 517 / Lys 554 / Ile 570, or Lys 554 / Ile 570
According to the analysis by the present inventors, a polymorphism of Pro 517 Ser or Val 570 Ile has not been confirmed in Japanese.
In general, there are many reports suggesting an association between a polymorphism of a drug metabolizing enzyme gene such as CYP1A1 and a patient's responsiveness to the drug. However, the relationship between polymorphisms of factors involved in the transcriptional control and drug responsiveness is unknown.
Several research results have been reported on polymorphisms in the AHR gene. For example, the following polymorphisms were found in SHR analysis of AHR in France (Association study in lung cancer patients). However, there is no significant association with disease in a case-control study of lung cancer. It was also not correlated with the induction ability of CYP1A1 (Cauchi A et. Al. Polymorphism of human en 19 cit cit cit. .
Amino acid substitution SNPs:
Arg 554 Lys (1721G / A), and Met 786 Val (2417A / G)
SNPs in the 5 ′ UTR: 157 G / A (rare SNPs with a frequency of 0.005)
SHR analysis of AHR in various races has also been performed. As a result, Arg 554 Lys (Lys 35%) and Pro 517 Ser were detected in Africans as the most frequent SNPs. Val 570 Ile was also detected in Africans and Americans. Furthermore, the ligand binding ability of AHR having Lys 554 / Ile570 and Ser 517 / Lys 554 / Ile 570 mutations has been examined in vitro. These mutants were not changed from wild type in their ability to form dimers with ARNT and to bind DNA. On the other hand, in an experiment in which mutant AHR was expressed in Hepa1 cells in vivo and stimulated with TCDD in vivo, the induction of CYP1A1 was suppressed by mutant AHR having Lys 554 / Ile 570 (Wong JM et. Al. Human arylhydrocarbon. receptor polymorphism that result in loss of CYP1A1 induction. Biochem. Biophys. Res. Commun, 2001 288: 990-6).
Regarding the Arg 554 Lys, which is an amino acid substitution SNP frequently detected by AHR, the frequency among races has been investigated. As a result, the following frequency information was reported.
Japan: 0.43
Ivory coast African: 0.57
African: 0.53
Carbbean-african: 0.39
Canadian Chinese: 0.32
Native Indian: 0.14
French Canadian: 0.12
North American (Mixed Ethnicity): 0.11
Canadian Inuit: 0.09
German: 0.07
Furthermore, about the SNPs with an amino acid substitution found in AHR, the influence which it has on the biological activity by the substitution of an amino acid is investigated. There was no change in the ligand binding ability, dimer formation ability with ARNT, and DNA binding ability of AHR having the Arg 554 Lys mutation in vitro. In an experiment in which mutant AHR was expressed in Hepa1 cells in vivo and stimulated with TCDD in vivo, mutant AHR having Arg 554 or Arg 554Lys did not change the ability to induce CYP1A1 (Wong JM et. al. Ethnic. (Variability in the allele distribution of human aryl hydrocarbon receiver codon 554 and assessment of variant receptor in vitro. 94, 11).
There is also a report analyzing SNPs found in Japanese. The major SNPs in Japanese AHR are SNPs with Arg 554 Lys substitution, Arg 554 frequency was 0.57, and Lys 554 frequency was 0.43. These SNPs have not been implicated in the development of lung cancer (Kawajiri K et. Al. Polymorphisms of human Ah receptor gene are involved in lung cancer. 1 Pharmacogenetics. 15: 95).

本発明は、ステロイド応答性と関連する多型を明らかにし、ステロイド応答性の検査を可能とする多型マーカーを提供することである。
ＣＹＰ１Ａ１などの薬剤代謝に関連する遺伝子は、ＡＨＲの転写制御を受けている。本発明者らは、アレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性に対して、ＡＨＲが関与している可能性があると考えた。そこで本発明者らは、ＡＨＲとアレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性との関連性を見出すために、ＡＨＲ遺伝子の多型解析を試みた。ＡＨＲ遺伝子やその周辺遺伝子のＳＮＰｓと喘息との関連性を検討した結果、小児喘息との有意な相関を示すＳＮＰｓを見出した。本発明者らは、これらのＳＮＰｓとステロイド応答性との関連について更に解析を進め、吸入ステロイド応答性のマーカーとして有用な多型を明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の吸入ステロイド応答性の検査方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、吸入ステロイド応答性の検査方法。
（ａ）被検者が有する、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
（ｂ）（ａ）で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の吸入ステロイド応答性を決定する工程
〔２〕多型が１塩基多型である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕アリル炭化水素受容体遺伝子の多型が、アリル炭化水素受容体遺伝子の９０１０番目の塩基および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方の多型である、〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕アリル炭化水素受容体遺伝子の９０１０番目の塩基の多型が、ＴとＣである、〔３〕に記載の検査方法。
〔５〕アリル炭化水素受容体遺伝子の９２３１番目の塩基の多型が、ＴとＣである、〔３〕に記載の検査方法。
〔６〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者から採取された生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）アリル炭化水素受容体遺伝子における塩基部位であって、該受容体遺伝子の９０１０番目、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方のジェノタイプを決定する工程
（ｃ）９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方がＣである被検者は吸入ステロイド耐性を有すると判定する工程
〔７〕吸入ステロイドがプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、およびプロピオン酸フルチカゾンからなる群から選択されたいずれかのステロイドである〔６〕に記載の方法。
〔８〕吸入ステロイドがプロピオン酸ベクロメタゾンである〔７〕に記載の方法。
〔９〕アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、吸入ステロイド耐性検査用のプライマー。
〔１０〕多型部位が、９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方である〔９〕に記載のプライマー。
〔１１〕アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、吸入ステロイド耐性検査用のプローブ。
〔１２〕多型部位が、９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方である〔１１〕に記載のプローブ。
あるいは本発明は、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーの、吸入ステロイド耐性の生体外における検査における使用に関する。また本発明は、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの、吸入ステロイド耐性の生体外における検査における使用に関する。
本発明は、次の工程を含む、吸入ステロイド応答性の検査方法を提供する。
（ａ）被検者が有する、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
（ｂ）（ａ）で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の吸入ステロイド応答性を決定する工程
多型とは、遺伝学的には、人口中１％以上の頻度で存在している１遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、１％未満の塩基の変化であっても本発明の「多型」に含まれる。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰｓ）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されない。
本発明者らにより、アリル炭化水素受容体（ＡＨＲ）遺伝子座には吸入ステロイド応答性と関連する多型が存在することが明らかにされた。当業者は、本発明の知見に基づいて、吸入ステロイド応答性と関連する多型を明らかにすることができる。たとえば、当該遺伝子座には、先に述べたような様々な多型が見出されている。吸入ステロイド応答性に差のある集団の間で、これらの多型の頻度を比較し、有意な差が見られた多型を、吸入ステロイド応答性の指標として選択することができる。あるいは、実施例に示すように、当該遺伝子の塩基配列解析に基づいて、新規な多型を見出すこともできる。
本発明において、吸入ステロイド応答性と関連する多型は望ましくは１塩基多型（ＳＮＰｓ）である。ＳＮＰｓは、ヒトゲノム上に、１０００塩基に１つの割合で存在すると考えられている。したがって、およそ４７ｋｂからなるＡＨＲの遺伝子座には、理論的には４０以上のＳＮＰｓが存在していると考えられる。これらのＳＮＰｓから、連鎖解析によって吸入ステロイド応答性との関連性を有するＳＮＰｓを見出すことができる。
本発明における好ましい多型として、ＡＨＲ遺伝子の９０１０番目、および９２３１番目における多型を示すことができる。本発明者らは、この部位における塩基が多型（ｔ／ｃ）を有しており、いずれかの部位において塩基Ｃである場合に、プロピオン酸ベクロメタゾン耐性であることを明らかにした。本発明において吸入ステロイド応答性との関連を有する多型として見出されたＡＨＲ遺伝子の９０１０番目、および９２３１番目における多型は、連鎖不平衡の関係にある。したがって、これらの多型はいずれか一方の多型を知ることで、吸入ステロイド応答性を知ることができる。あるいは両方の部位における塩基を確認すれば、より正確に吸入ステロイド応答性を判定することもできる。
本発明において、塩基の部位を示す数字は、ゲノムにおける翻訳開始点を１とする数字である。ＡＨＲ遺伝子は、ヒト７番染色体の７ｐ１５の約４７ｋｂにマッピングされている。この領域の塩基配列はＱＶ４０以上（１００００ｂに１ヶ所以下のエラー頻度）の精度で既に解析され、塩基配列が明らかにされている（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＮＴ＿００７８１９）。ＡｈＲ遺伝子は、ＮＴ＿００７８１９の塩基配列上で塩基番号１６６３１７７１から１６６８１２４１に位置している。この塩基配列において、ＡｈＲのｃｄｓは、塩基番号１６６３４７３８からスタートしている。またＡｈＲのｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列も公知である（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＮＭ＿００１６２１、Ｌ１９８７２など）。両者の情報を照合することによって、ＡＨＲ遺伝子のエクソンを特定することができる。たとえば、ＡＨＲ遺伝子の第一エクソンから最終エクソンまでを含むゲノムの塩基配列は、ＵＣＳＣＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）から取得できる。ゲノムの塩基配列上にｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｌ１９８７２、５２２８ｂｐ）の塩基配列をマッピングした結果を図１に示した。ＡＨＲ遺伝子は７ｐ１５（ＬＯＣＵＳＩＤ１９６）の約４７ｋｂにマッピングされた。
本発明において吸入ステロイド応答性との関連が見出された多型部位は、配列番号：１および配列番号：２に基づいて示すこともできる。配列番号：１および配列番号：２は、それぞれＡＨＲ遺伝子座における９０１０番目、および９２３１番目の多型部位を含む領域の塩基配列である。配列番号：１の塩基配列において、５′末端を１としてカウントしたときに、９０１０番目の塩基は１５０番目に相当する。同様に、配列番号：２の塩基配列において、９２３１番目の塩基は１５０番目に相当する。つまり配列番号：１および配列番号：２は、本発明においてジェノタイピングすべき多型部位を中心として、その５′側と３′側にそれぞれ１５０塩基づつの連続する塩基配列を示している。
すなわち本発明において明らかにされた吸入ステロイド応答性と関連している多型部位は、ヒトゲノムにおける配列番号：１または配列番号：２に示す塩基配列に相当する領域の、各塩基配列中１５０番目の塩基に相当する。当業者は、ゲノムの塩基配列に対して配列番号：１および配列番号：２の塩基配列をマッピングして、それぞれの１５０番目に相当する塩基のゲノムにおける位置を特定することができる。したがって本発明は、ヒト７番染色体における配列番号：１または配列番号：２に記載の塩基配列によって特定される領域の、それぞれ１５０番目の塩基の多型についてジェノタイプを決定する工程を含む。本発明において、ジェノタイプは、好ましくは、被検者から採取された生体試料の解析によって決定することができる。
一般に吸入ステロイドとは、気道から投与されるステロイド製剤を言う。吸入ステロイドは、局所（気道）に直接投与することができ、ステロイドの全身への影響を小さく抑えることができる。そのため、連続的な投与においても副作用が現れにくいとされている。吸入ステロイドには、粉末製剤、エアゾールなどがあり、アプリケーターを利用して気道に直接投与される。吸入ステロイドには、強力な抗炎症作用を有し、循環に達すると急速に代謝されるステロイド剤が好ましい。
このようなステロイド剤として、グルココルチコイド、あるいは副腎皮質ホルモン剤を示すことができる。具体的には、プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、ブデソニド（ＢＵＤ）、およびプロピオン酸フルチカゾン（ＦＰ）などを有効成分として含有する吸入ステロイドが市販されている。本発明においては、これらの吸入ステロイドに対する被検者の応答を予測することができる。本発明において、応答性の予測にもとっとも適する吸入ステロイドは、プロピオン酸ベクロメタゾンである。
本発明において、「吸入ステロイドに対して応答性が低い」とは、被検者において吸入ステロイドの薬理効果が見られない、もしくは抑制された状態をいう。治療開始初期は吸入ステロイドの効果があるが、徐々に耐性を獲得して「吸入ステロイドに対して応答性が低い」状態となる患者も、本発明における「吸入ステロイドに対して応答性が低い」患者に含まれる。本発明において「抑制」とは、完全な抑制に限定されず、対照（通常、健常人）と比較して抑制されていれば、上記「抑制」の意味に解される。
例えば、本発明の検査方法によって、ある被検者について吸入ステロイドに対して耐性であると判定された場合には、該被検者への吸入ステロイドの投与による治療効果は見られない、もしくは低いと予想することができる。あるいは初期には吸入ステロイドの効果が見られたとしても、やがて耐性を獲得するであろうことが予測される。本発明の方法によって得られた被検者についての吸入ステロイドの応答性に関する情報によって、該被検者に対する治療方針等を適宜決定することができる。
本発明の検査方法は、ＡＨＲ遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程を含む。ジェノタイプは、例えば、被検者のＡＨＲ遺伝子座の塩基配列を明らかにすることにより決定すること（ジェノタイピング）ができる。ジェノタイピングのためには、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の生体試料から抽出した染色体ＤＮＡを基に調製することができる。生体試料は、被検者から採取された、染色体ＤＮＡを含む任意の試料と定義される。生体試料としては、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便、および毛髪等を利用することができる。本発明の検査方法は、上記のように直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
ＡＨＲ遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型を有する部位の塩基配列を決定すれば、被検者のジェノタイプを決定することができる。より具体的には、被検者のゲノムにおける当該多型部位がどの塩基で構成されているのかを決定すれば、ジェノタイピングが可能である。たとえば、本発明者らが見出した吸入ステロイド応答性と関連する多型である、Ｔ９０１０Ｃ並びにＴ９２３１Ｃのジェノタイピングは、当該領域の塩基配列を決定し、いずれの塩基であるかを確認すればよい。ゲノムは１対の染色体によって構成されているので、各多型部位のそれぞれについて、ホモかヘテロであるかを決定する。本発明においては、９０１０または９２３１がｃであるアレルをホモまたはヘテロで有するとき、被検者は吸入ステロイド耐性を有すると判定される。したがって、本発明におけるジェノタイピングは、９０１０または９２３１がｃであることを検出することによって、その目的を達することができる。言い換えれば、必ずしもホモかヘテロかを識別する必要は無い。
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、ジェノタイプを決定するための様々な方法が公知である。本発明のジェノタイピングのための方法は、限定されない。たとえば、ＰＣＲ法を応用した解析方法として、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法、ＡｃｙｃｒｏＰｒｉｍｅｒ法、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等が実用化されている。またＰＣＲに依存しないジェノタイピングのための方法としてＩｎｖａｄｅｒ法やＲＣＡ法が知られている。更にＤＮＡアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明におけるジェノタイピングに応用できる。
これらの解析方法においては、実際には、たとえば配列番号：１並びに配列番号：２に記載の塩基配列に対してハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドがプライマーやプローブとして用いられる。当業者は、配列番号：１または配列番号：２に示したような塩基配列をもとに、各解析手法に必要なオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。なおＰＣＲのような増幅反応を伴う解析手法において、増幅すべき領域は配列番号：１あるいは配列番号：２に示した塩基配列に限定されない。各領域における多型部位を含む塩基配列を増幅することができれば、たとえば配列番号：１や配列番号：２を越える領域、あるいはこれらの領域から選択された部分配列を増幅することができる。更にゲノムＤＮＡが２本鎖であることから、配列番号：１あるいは配列番号：２に記載の塩基配列のみならず、その相補鎖における塩基配列を対象としてジェノタイピングが可能であることは言うまでも無い。すなわち本発明におけるジェノタイピングとは、センス鎖またはアンチセンス鎖における多型部位の塩基を決定する工程を含む。
たとえば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰにおいては、対象となる多型部位が制限酵素サイトを形成する場合には、１８０〜２００塩基からなる産物を与えるプライマーが用いられることが多い。あるいは多型部位が制限酵素サイトになるようにプライマーの塩基配列を変更する場合には、一般に１５０−１６０塩基からなる増幅産物を与えるようなプライマーがデザインされる。
［ＴａｑＭａｎＰＣＲ法］
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法の原理は次のとおりである。ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は、アレルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、ＴａｑＭａｎプローブを利用した解析方法である。ＴａｑＭａｎプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域にハイブリダイズするように設計されてる。
ＴａｑＭａｎプローブのＴｍに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってＴａｑＭａｎプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。ＴａｑＭａｎプローブの存在下でＰＣＲ法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブに到達する。このときＤＮＡポリメラーゼの５′−３′エキソヌクレアーゼ活性によって、ＴａｑＭａｎプローブはその５′末端から分解される。ＴａｑＭａｎプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、ＴａｑＭａｎプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、ＴａｑＭａｎプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにＴａｑＭａｎプローブのハイブリダイズが低下すればＴａｑＭａｎプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
多型に対応するＴａｑＭａｎプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時にジェノタイプを判定することもできる。たとえば、レポーター色素として、あるアレルのアレルＡのＴａｑＭａｎプローブに６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）を、アレルＢのプローブにＶＩＣを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアレルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、ＦＡＭまたはＶＩＣのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アレルＡまたはアレルＢのホモであることが明らかになる。他方、アレルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。ＴａｑＭａｎＰＣＲ法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてＰＣＲとジェノタイピングを同時に行うことができる。そのため、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は、大量の被検者のジェノタイピング方法として有用である。
［ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法］
ＰＣＲ法を利用したジェノタイピング方法として、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法も実用化されている。ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、ＳＮＰｓ検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムのＳＮＰｓを含む領域をＰＣＲで増幅する。この工程は、通常のゲノムＰＣＲと同じである。次に、得られたＰＣＲ産物に対して、ゲノム検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。ゲノム検出用のプライマーは、検出対象となっているＳＮＰｓに隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ３′−ＯＨをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、ＳＮＰｓに相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＦＰ）の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のＳＮＰｓが２種額の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアレルがホモかヘテロかを判定することもできる。
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法］
ＰＣＲ産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで解析することによってジェノタイプを解析することもできる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、蛋白質のアミノ酸配列や、ＤＮＡの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによるジェノタイピングのためには、まず解析対象であるアレルを含む領域をＰＣＲで増幅する。次いで増幅産物を単離してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによってその分子量を測定する。アレルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを利用したジェノタイピングには、ＰＣＲ産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確なジェノタイピングが期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。
［ＩＩｓ型制限酵素を利用したＳＮＰｓ特異的な標識方法］
ＰＣＲ法を利用した更に高速でジェノタイピングが可能な方法も報告されている。たとえば、ＩＩｓ型制限酵素を利用してＳＮＰｓのジェノタイピングが行われている。この方法においては、ＰＣＲにあたり、ＩＩｓ型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（ＩＩ型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してＩＩｓ型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。したがって、この塩基数の分だけ離れた位置にＩＩｓ型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、ＩＩｓ型制限酵素によってちょうどＳＮＰｓの部位で増幅産物を切断することができる。
ＩＩｓ型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、ＳＮＰｓの塩基を含む付着末端（ｃｏｎｈｅｓｉｖｅｅｎｄ）が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、ＳＮＰｓに対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物はＳＮＰｓ部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
前記ＩＩｓ型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー（ｃａｐｔｕｒｅｐｒｉｍｅｒ）を組み合せてＰＣＲ法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。たとえばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、ジェノタイプを決定することができる。
［Ｉｎｖａｄｅｒ法］
ＰＣＲ法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。たとえばＩｎｖａｄｅｒ法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、およびＦＲＥＴプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、ｃｌｅａｖａｓｅと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、ジェノタイピングを実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはＦＲＥＴプローブのみである。
アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アレルプローブの５′側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは多型部位の３′側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
一方インベーダープローブは、多型部位の５′側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって３′末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
多型部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダイズすると、アレルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）した構造が形成される。ｃｌｅａｖａｓｅは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってｃｌｅａｖａｓｅによるフラップの切断が起こらない。
ＦＲＥＴプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。ＦＲＥＴプローブは５′末端側に自己相補配列を有し、３′末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。ＦＲＥＴプローブの３′末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがＦＲＥＴプローブにハイブリダイズすると、ＦＲＥＴプローブの自己相補配列の５′末端部分にフラップの３′末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。ｃｌｅａｖａｓｅは侵入構造を認識して切断する。ＦＲＥＴプローブのｃｌｅａｖａｓｅによって切断される部分を挟んで、ＴａｑＭａｎＰＣＲと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、ＦＲＥＴプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもＦＲＥＴプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存在しているフラップとでは、ＦＲＥＴに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、ＦＲＥＴプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
Ｉｎｖａｄｅｒ法に基づいてジェノタイプを決定するためには、アレルＡとアレルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのＦＲＥＴプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、ＴａｃＭａｎＰＣＲ法と同様の考えかたによって、ジェノタイプを解析することができる。
Ｉｎｖａｄｅｒ法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがＦＲＥＴプローブのみであることである。ＦＲＥＴプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。したがって、大量生産が可能である。一方アレルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。
［ＲＣＡ法］
ＰＣＲ法に依存しないジェノタイピングのための方法として、ＲＣＡ法を挙げることができる。鎖置換作用を有するＤＮＡポリメラーゼが、環状の１本鎖ＤＮＡを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくＤＮＡの増幅方法が、ＲｏｌｌｉｎｇＣｉｒｃｌｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法である（ＬｉｚａｒｄｒｉＰＭｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１９，２２５，１９９８）。ＲＣＡ法においては、環状ＤＮＡにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
ＲＣＡ法には、鎖置換作用を有するＤＮＡポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より５′側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。たとえば環状ＤＮＡを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖ＤＮＡが生成される。一方、環状ＤＮＡを鋳型として生成した長い１本鎖ＤＮＡには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。ＲＣＡ法において生成される１本鎖ＤＮＡは、環状のＤＮＡを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。したがって、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、ＤＮＡの増幅が達成される。
ＲＣＡ法に必要な環状１本鎖ＤＮＡがＳＮＰｓの塩基に応じて生成されれば、ＲＣＡ法を利用してＳＮＰｓをタイピングすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、５′末端と３′末端に検出すべきＳＮＰｓの両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。ＳＮＰｓ部分がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をＤＮＡリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、ＲＣＡ法の反応がトリガーされる。ＤＮＡリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。したがって、ライゲーションの有無をＲＣＡ法で確認することによって、ＳＮＰｓのジェノタイピングが可能である。
ＲＣＡ法は、ＤＮＡを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければジェノタイプを決定することができない。これらの点をジェノタイピング用に改良した方法が公知である。たとえばモレキュラービーコンを利用して、ＲＣＡ法に基づいて１チューブでジェノタイピングを行うことができる。モレキュラービーコンは、ＴａｑＭａｎ法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの５′末端と３′末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、ＲＣＡ法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはＲＣＡ法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、１チューブでジェノタイピングが可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを除けば、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らないジェノタイピングも古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
ＲＦＬＰは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、ＲＦＬＰの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
標識プローブを必要としない方法として、ＤＮＡの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。ＰＣＲ−ＳＳＣＰでは、１本鎖ＤＮＡの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している（Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｏｎｙｍｏｕｓＡｌｕｒｅｐｅａｔｓｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２Ｊａｎ１；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐ５３ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｈｕｍａｎｂｒａｉｎｔｕｍｏｒｓｂｙｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１Ａｕｇ１；６（８）：１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄＰＣＲ−ＳＳＣＰａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．１９９５Ａｐｒ１；４（５）：２７５−２８２．）。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、ＰＣＲ産物を１本鎖ＤＮＡに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖ＤＮＡの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
具体的には、まずＰＣＲ法等によってＳＮＰｓ部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブＤＮＡをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブＤＮＡとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたＤＮＡ断片では、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
更にＤＮＡアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる（細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」，秀潤社，２０００．４／２０発行，ｐｐ９７−１０３「オリゴＤＮＡチップによるＳＮＰの解析」，梶江慎一）。ＤＮＡアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、たとえば、多数のＳＮＰｓを同時に解析するには、ＤＮＡアレイは有用である。
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（ＲｏｓｅｔｔａＩｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
オリゴヌクレオチドは、検出すべきＳＮＰｓを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。更に、一般にＤＮＡアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ（ＭＭ）プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（ＰＭ）プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
ＤＮＡアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体ＤＮＡから、ＤＮＡ試料を調製することができる。判定すべきＳＮＰｓを含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体ＤＮＡの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスＰＣＲ法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスＰＣＲ法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるＰＣＲ法である。複数のＳＮＰｓを解析するときには、マルチプレックスＰＣＲ法が有用である。
一般にＤＮＡアレイ法においては、ＰＣＲ法によってＤＮＡ試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。たとえば、まずＳＮＰｓを含む領域に特異的なプライマーセットによるＰＣＲ法でゲノムＤＮＡを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングＰＣＲ法によって、ビオチンラベルされたＤＮＡを合成する。こうして合成されたビオチンラベルＤＮＡを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたＤＮＡを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡｌｌｅｌｅＳｐｅｃｉｆｉｃＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、検出すべきＳＮＰｓが存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ＡＳＯを試料ＤＮＡにハイブリダイズさせるとき、多型によってＳＮＰｓ部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
本発明はまた、本発明の検査方法のためのプローブまたはプライマーを提供する。本発明によって、ＡＨＲ遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位の存在が明らかにされた。したがって、当該多型部位の塩基を明らかにするためのプローブ、あるいはプライマーは、本発明の検査方法に有用である。ある多型部位における塩基を明らかにするための手法には、上記のような様々な方法を応用することができる。これらの手法においては、一般的に、当該多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、あるいは当該多型部位にハイブリダイズするプローブが用いられる。
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーとは、多型部位を含むＤＮＡを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーを言う。本発明のプライマーは、多型部位を含むＤＮＡにおける、多型部位の３′側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は、任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。
たとえば、ＤＮＡチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜３００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。つまり多型部位を中心（１５０番目）に示した配列番号：１または配列番号：２に記載の塩基配列は、ＤＮＡチップによる塩基の解析において、ＰＣＲによって増幅すべき塩基配列の例として示すことができる。たとえば、配列番号：１または配列番号：２に記載の塩基配列において、多型部位を含む連続する塩基配列を増幅することができるプライマーは、本発明におけるジェノタイピングに有用である。当業者は、アリル炭化水素受容体遺伝子の塩基配列をもとに、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。たとえば、ＩＩｓ型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、ＩＩｓ型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。たとえば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。したがって、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
言いかえれば、ゲノムＤＮＡのＡＨＲ遺伝子座を構成する塩基配列から選択された塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有し、吸入ステロイド応答性と関連する多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。たとえばＩｎｖａｄｅｒ法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおけるＡＨＲ遺伝子座の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
本発明のプライマー、またはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。
本発明はまた、吸入ステロイド応答性を検査するための試薬を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む。本発明の試薬には、ジェノタイピング方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合せることができる。酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、あるいはＩＩｓ制限酵素などの、上記のジェノタイピングのための方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、たとえば相補鎖合成用の基質等が用いられる。
更に本発明の試薬には、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予めジェノタイプが明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムＤＮＡの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを対照として用いることもできる。具体的には、ＡＨＲ遺伝子座を含み多型部位における塩基が明らかにされたゲノム由来のＤＮＡを含むＹＡＣベクターやＢＡＣベクターは、対照として有用である。あるいは多型部位に相当する数百ｂのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。The present invention is to clarify a polymorphism associated with steroid responsiveness and to provide a polymorphic marker that enables examination of steroid responsiveness.
Genes related to drug metabolism such as CYP1A1 are subject to transcriptional control of AHR. The present inventors considered that AHR may be involved in drug responsiveness used for the treatment of allergic diseases. Therefore, the present inventors attempted polymorphism analysis of the AHR gene in order to find the relationship between AHR and drug responsiveness used in the treatment of allergic diseases. As a result of examining the relationship between SHRs of the AHR gene and its surrounding genes and asthma, SNPs having a significant correlation with childhood asthma were found. The present inventors have further analyzed the relationship between these SNPs and steroid responsiveness, and have clarified a polymorphism useful as a marker for inhaled steroid responsiveness, thereby completing the present invention. That is, the present invention relates to the following test method for inhaled steroid responsiveness.
[1] A method for examining inhaled steroid responsiveness, comprising the following steps.
(A) determining a polymorphic genotype associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene possessed by a subject; and
(B) determining the inhaled steroid responsiveness of the subject based on the genotype determined in (a)
[2] The inspection method according to [1], wherein the polymorphism is a single nucleotide polymorphism.
[3] The test method according to [1], wherein the polymorphism of the allyl hydrocarbon receptor gene is a polymorphism of either or both of the 9010th base and the 9231st base of the allyl hydrocarbon receptor gene. .
[4] The test method according to [3], wherein the polymorphism of the 9010th base of the allyl hydrocarbon receptor gene is T and C.
[5] The test method according to [3], wherein the polymorphism of the 9231st base of the allyl hydrocarbon receptor gene is T and C.
[6] The inspection method according to [1], including the following steps (a) to (c).
(A) A step of collecting genomic DNA from a biological sample collected from a subject
(B) a step of determining a genotype of a nucleotide site in the allyl hydrocarbon receptor gene, which is either the 9010th and 9231th bases of the receptor gene, or both.
(C) A step of determining that a subject in which either the 9010th base and the 9231st base or both are C has inhaled steroid resistance
[7] The method according to [6], wherein the inhaled steroid is any steroid selected from the group consisting of beclomethasone propionate, budesonide, and fluticasone propionate.
[8] The method according to [7], wherein the inhaled steroid is beclomethasone propionate.
[9] A primer for inhaled steroid resistance test, comprising a primer for synthesizing a region containing a polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene.
[10] The primer according to [9], wherein the polymorphic site is either the 9010th base, the 9231st base, or both.
[11] A probe for testing for inhaled steroid resistance, comprising an oligonucleotide that hybridizes to a region containing a polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene.
[12] The probe according to [11], wherein the polymorphic site is either the 9010th base, the 9231st base, or both.
Alternatively, the present invention relates to the use of an in vitro test for inhaled steroid resistance in order to synthesize a region containing a polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene. The present invention also relates to the use of an oligonucleotide that hybridizes to a region containing a polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene in an in vitro test for inhaled steroid resistance.
The present invention provides a test method for inhaled steroid responsiveness including the following steps.
(A) determining a polymorphic genotype associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene possessed by a subject; and
(B) determining the inhaled steroid responsiveness of the subject based on the genotype determined in (a)
A polymorphism is generally defined genetically as a base change in a gene that is present at a frequency of 1% or more in the population. However, the “polymorphism” of the present invention is not limited to this definition, and even a base change of less than 1% is included in the “polymorphism” of the present invention. Examples of the polymorphism in the present invention include, but are not limited to, polymorphisms in which several tens of bases are deleted, substituted, or inserted from single nucleotide polymorphisms (SNPs).
The present inventors have revealed that there is a polymorphism associated with inhaled steroid responsiveness at the allyl hydrocarbon receptor (AHR) locus. One skilled in the art can identify polymorphisms associated with inhaled steroid responsiveness based on the findings of the present invention. For example, various polymorphisms as described above have been found at the gene locus. The frequency of these polymorphisms can be compared among populations with differences in inhaled steroid responsiveness, and polymorphisms with significant differences can be selected as indicators of inhaled steroid responsiveness. Or as shown in an Example, a novel polymorphism can also be found based on the base-sequence analysis of the said gene.
In the present invention, the polymorphism associated with inhaled steroid responsiveness is desirably single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNPs are considered to exist at a rate of 1 in 1000 bases on the human genome. Therefore, it is considered that there are theoretically more than 40 SNPs at the AHR locus consisting of approximately 47 kb. From these SNPs, SNPs that are related to inhaled steroid responsiveness can be found by linkage analysis.
As preferred polymorphisms in the present invention, polymorphisms at the 9010th and 9231st positions of the AHR gene can be shown. The present inventors have clarified that when the base at this site has a polymorphism (t / c) and is base C at any site, it is resistant to beclomethasone propionate. In the present invention, the polymorphisms in the 9010th and 9231st AHR genes found as polymorphisms associated with inhaled steroid responsiveness are related to linkage disequilibrium. Therefore, by knowing any one of these polymorphisms, it is possible to know inhaled steroid responsiveness. Alternatively, if the bases at both sites are confirmed, inhaled steroid responsiveness can be determined more accurately.
In the present invention, the number indicating the base site is a number with 1 as the translation start point in the genome. The AHR gene is mapped to about 47 kb of 7p15 of human chromosome 7. The base sequence of this region has already been analyzed with an accuracy of QV40 or higher (error frequency of 1 or less in 10000b), and the base sequence has been clarified (GenBank accession # NT_007819). The AhR gene is located at base numbers 16631771 to 16681241 on the base sequence of NT_007819. In this base sequence, the cds of AhR starts from base number 16634738. The base sequence of AhR mRNA (cDNA) is also known (GenBank accession # NM_001621, L19872 etc.). By comparing the information of both, the exon of the AHR gene can be specified. For example, the base sequence of the genome including the first exon to the final exon of the AHR gene can be obtained from UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). The result of mapping the base sequence of cDNA (GenBank accession # L19872, 5228 bp) on the base sequence of the genome is shown in FIG. The AHR gene was mapped to approximately 47 kb of 7p15 (LOCUS ID 196).
Polymorphic sites found to be associated with inhaled steroid responsiveness in the present invention can also be shown based on SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are the nucleotide sequences of the regions containing the 9010th and 9231th polymorphic sites in the AHR locus, respectively. In the base sequence of SEQ ID NO: 1, when the 5 'end is counted as 1, the 9010th base corresponds to the 150th position. Similarly, in the base sequence of SEQ ID NO: 2, the 9231st base corresponds to the 150th position. That is, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 show continuous base sequences of 150 bases each on the 5 ′ side and 3 ′ side, centering on the polymorphic site to be genotyped in the present invention.
That is, the polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness revealed in the present invention is the 150th position in each base sequence in the region corresponding to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the human genome. Corresponds to the base. A person skilled in the art can map the base sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to the base sequence of the genome and specify the position of the base corresponding to the 150th position in the genome. Therefore, the present invention includes a step of determining a genotype for each polymorphism of the 150th base in the region specified by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in human chromosome 7. In the present invention, the genotype can be preferably determined by analysis of a biological sample collected from a subject.
In general, inhaled steroids refer to steroid preparations administered from the respiratory tract. Inhaled steroids can be administered directly to the local area (respiratory tract), and the effects of steroids on the whole body can be minimized. Therefore, side effects are unlikely to appear even in continuous administration. Inhaled steroids include powder formulations, aerosols, etc., which are administered directly to the respiratory tract using an applicator. For inhaled steroids, steroidal agents that have potent anti-inflammatory effects and are rapidly metabolized upon reaching the circulation are preferred.
As such a steroid agent, a glucocorticoid or a corticosteroid agent can be shown. Specifically, inhaled steroids containing beclomethasone propionate (BDP), budesonide (BUD), fluticasone propionate (FP) and the like as active ingredients are commercially available. In the present invention, a subject's response to these inhaled steroids can be predicted. In the present invention, an inhaled steroid that is most suitable for predicting responsiveness is beclomethasone propionate.
In the present invention, “low responsiveness to inhaled steroids” refers to a state in which the pharmacological effect of inhaled steroids is not observed or suppressed in the subject. Although the inhaled steroid has an effect at the beginning of treatment, patients who gradually acquire tolerance and become "low responsiveness to inhaled steroid" are also "low responsiveness to inhaled steroid" in the present invention. Included in patients. In the present invention, “suppression” is not limited to complete suppression, and is understood as the meaning of “suppression” as long as it is suppressed as compared with a control (usually a healthy person).
For example, when the test method of the present invention determines that a subject is resistant to inhaled steroids for a subject, the therapeutic effect of administration of the inhaled steroid to the subject is not seen or is low Can be expected. Alternatively, even if the effects of inhaled steroids are initially seen, it is expected that tolerance will eventually be acquired. Based on the information regarding the responsiveness of the inhaled steroid for the subject obtained by the method of the present invention, the treatment policy for the subject can be appropriately determined.
The test method of the present invention includes a step of determining a genotype of a polymorphism associated with inhaled steroid responsiveness in the AHR gene. The genotype can be determined (genotyping) by elucidating the base sequence of the AHR locus of the subject, for example. For genotyping, a DNA sample is prepared from the subject. A DNA sample can be prepared based on, for example, chromosomal DNA extracted from a biological sample of a subject. A biological sample is defined as any sample containing chromosomal DNA taken from a subject. As biological samples, tissues or cells such as peripheral blood leukocytes, skin, oral mucosa, tears, saliva, urine, feces, hair, and the like can be used. The test method of the present invention can be performed by various methods capable of detecting a polymorphism other than the method for directly determining the base sequence of DNA derived from a subject as described above.
By determining the base sequence of a site having a polymorphism associated with inhaled steroid responsiveness in the AHR gene, the genotype of the subject can be determined. More specifically, genotyping can be performed by determining which base comprises the polymorphic site in the subject's genome. For example, genotyping of T 9010 C and T 9231 C, which are polymorphisms related to inhaled steroid responsiveness found by the present inventors, determine the base sequence of the region and confirm which base it is. do it. Since the genome is composed of a pair of chromosomes, it is determined whether each polymorphic site is homozygous or heterozygous. In the present invention, when the allele in which 9010 or 9231 is c is homo or hetero, the subject is determined to have inhaled steroid resistance. Therefore, genotyping in the present invention can achieve its purpose by detecting that 9010 or 9231 is c. In other words, it is not always necessary to distinguish between homo and hetero.
Various methods for determining the genotype of a polymorphic site whose base variation has been clarified in advance are known. The method for genotyping of the present invention is not limited. For example, TaqMan PCR method, AcycloPromer method, MALDI-TOF / MS method and the like have been put to practical use as analysis methods applying the PCR method. In addition, the Invader method and the RCA method are known as methods for genotyping independent of PCR. Furthermore, the genotype can be determined using a DNA array. These methods are briefly described below. Any of the methods described herein can be applied to genotyping in the present invention.
In these analysis methods, actually, for example, oligonucleotides that can hybridize to the base sequences described in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are used as primers and probes. Those skilled in the art can design oligonucleotides necessary for each analysis technique based on the nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. In an analysis method involving an amplification reaction such as PCR, the region to be amplified is not limited to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. If a base sequence including a polymorphic site in each region can be amplified, for example, a region exceeding SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or a partial sequence selected from these regions can be amplified. Furthermore, since genomic DNA is double-stranded, it goes without saying that genotyping is possible not only for the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but also for the base sequence in its complementary strand. No. That is, genotyping in the present invention includes a step of determining the base of the polymorphic site in the sense strand or antisense strand.
For example, in PCR-RFLP, when the target polymorphic site forms a restriction enzyme site, a primer that gives a product consisting of 180 to 200 bases is often used. Alternatively, when the base sequence of the primer is changed so that the polymorphic site becomes a restriction enzyme site, a primer that gives an amplification product generally consisting of 150 to 160 bases is designed.
[TaqMan PCR method]
The principle of the TaqMan PCR method is as follows. The TaqMan PCR method is an analysis method using a primer set that can amplify a region containing an allele and a TaqMan probe. The TaqMan probe is designed to hybridize to the region containing the allele amplified by this primer set.
If the target base sequence is hybridized under conditions close to the Tm of the TaqMan probe, the hybridization efficiency of the TaqMan probe is significantly reduced due to the difference of one base. When the PCR method is performed in the presence of the TaqMan probe, the extension reaction from the primer eventually reaches the hybridized TaqMan probe. At this time, the TaqMan probe is degraded from its 5 'end by the 5'-3' exonuclease activity of DNA polymerase. If the TaqMan probe is labeled with a reporter dye and a quencher, the degradation of the TaqMan probe can be followed as a change in fluorescence signal. That is, when the TaqMan probe is decomposed, the reporter dye is released and the distance from the quencher is increased, thereby generating a fluorescent signal. If the hybridization of the TaqMan probe decreases due to a difference in one base, the TaqMan probe is not decomposed and a fluorescent signal is not generated.
If a TaqMan probe corresponding to a polymorphism is designed and different signals are generated by the decomposition of each probe, the genotype can be determined at the same time. For example, as a reporter dye, 6-carboxy-fluorescein (FAM) is used for the TaqMan probe of allele A of an allele, and VIC is used for the probe of allele B. In a state where the probe is not decomposed, generation of a fluorescent signal of the reporter dye is suppressed by the quencher. If each probe hybridizes to the corresponding allele, a fluorescence signal corresponding to the hybridization is observed. That is, when either FAM or VIC signal is stronger than the other, it becomes clear that allele A or allele B is homozygous. On the other hand, when the allele is hetero, both signals are detected at substantially the same level. By using the TaqMan PCR method, PCR and genotyping can be performed simultaneously on a genome as an analysis target without a time-consuming step such as separation on a gel. Therefore, the TaqMan PCR method is useful as a method for genotyping a large number of subjects.
[Acyclo Prime method]
As a genotyping method using the PCR method, the Acyclo Prime method has also been put into practical use. In the Acyclo Prime method, one set of primers for genome amplification and one primer for detecting SNPs are used. First, a region containing genomic SNPs is amplified by PCR. This process is the same as normal genomic PCR. Next, the primer for genome detection is annealed with respect to the obtained PCR product, and extension reaction is performed. The genome detection primer is designed to anneal to a region adjacent to the SNPs that are the detection target.
At this time, a nucleotide derivative (terminator) labeled with a fluorescent polarizing dye and blocked with 3'-OH is used as a nucleotide substrate for the extension reaction. As a result, only one base complementary to the base at the position corresponding to the SNPs is incorporated, and the extension reaction stops. Incorporation of nucleotide derivatives into the primer can be detected by an increase in fluorescence polarization (FP) due to an increase in molecular weight. If two types of labels having different wavelengths are used for the fluorescent polarizing dye, it is possible to specify which of the two types of bases the specific SNPs are. Since the level of fluorescence polarization can be quantified, it is also possible to determine whether an allele is homo or hetero in one analysis.
[MALDI-TOF / MS method]
Genotypes can also be analyzed by analyzing PCR products with MALDI-TOF / MS. MALDI-TOF / MS is used in various fields as an analytical method that can clearly identify slight differences in protein amino acid sequences and DNA base sequences because it can know the molecular weight very accurately. Yes. For genotyping by MALDI-TOF / MS, first, a region containing the allele to be analyzed is amplified by PCR. The amplification product is then isolated and its molecular weight is measured by MALDI-TOF / MS. Since the base sequence of the allele is known in advance, the base sequence of the amplification product is uniquely determined based on the molecular weight.
Genotyping using MALDI-TOF / MS requires a PCR product separation step and the like. However, accurate genotyping can be expected without using labeled primers or labeled probes. It can also be applied to simultaneous detection of polymorphisms at multiple locations.
[SNPs-specific labeling method using type IIs restriction enzyme]
A method capable of genotyping at a higher speed using the PCR method has also been reported. For example, SNPs are genotyped using type IIs restriction enzymes. In this method, a primer having a recognition sequence of type IIs restriction enzyme is used for PCR. A general restriction enzyme (type II) used for gene recombination recognizes a specific base sequence and cleaves a specific site in the base sequence. In contrast, type IIs restriction enzymes recognize specific base sequences and cleave sites away from the recognized base sequences. The number of bases between the recognition sequence and the cleavage site is determined by the enzyme. Therefore, if the primer containing the recognition sequence of the type IIs restriction enzyme is annealed at a position separated by the number of bases, the amplified product can be cleaved at the site of the SNPs by the type IIs restriction enzyme.
At the end of the amplification product cleaved with the type IIs restriction enzyme, a cohesive end containing the base of SNPs is formed. Here, an adapter having a base sequence corresponding to the sticky end of the amplification product is ligated. Adapters have different base sequences including bases corresponding to SNPs, and can be labeled with different fluorescent dyes. Finally, the amplification product is labeled with a fluorescent dye corresponding to the base at the SNPs site.
When a PCR method is performed by combining a primer containing the type IIs restriction enzyme recognition sequence with a capture primer, the amplification product is fluorescently labeled and can be solid-phased using the capture primer. For example, if a biotin-labeled primer is used as a capture primer, the amplification product can be captured on avidin-bound beads. The genotype can be determined by tracking the fluorescent dye of the amplification product thus captured.
[Invader method]
A method for genotyping independent of the PCR method has also been put into practical use. For example, in the Invader method, genotyping is realized with only three types of oligonucleotides, an allele probe, an invader probe, and a FRET probe, and a special nuclease called cleavase. Of these probes, only the FRET probe requires labeling.
Allele probes are designed to hybridize to regions adjacent to the allele to be detected. A flap consisting of a base sequence unrelated to hybridization is linked to the 5 'side of the allele probe. The allele probe has a structure that hybridizes to the 3 ′ side of the polymorphic site and is linked to a flap on the polymorphic site.
On the other hand, the invader probe has a base sequence that hybridizes to the 5 'side of the polymorphic site. The base sequence of the invader probe is designed so that the 3 ′ end corresponds to the polymorphic site by hybridization. The base at the position corresponding to the polymorphic site in the invader probe may be arbitrary. That is, both base sequences are designed so that the invader probe and the allele probe hybridize adjacently across the polymorphic site.
When the polymorphic site is a base complementary to the base sequence of the allele probe, when both the invader probe and the allele probe hybridize to the allele, the invader probe enters the base corresponding to the polymorphic site of the allele probe. An (invasion) structure is formed. Cleavease cleaves the strand of the invading side of the oligonucleotide that has formed the invading structure thus formed. Since the cutting occurs on the intrusion structure, the result is that the allele probe flap is cut off. On the other hand, if the base at the polymorphic site is not complementary to the base of the allele probe, there is no competition between the invader probe and the allele probe at the polymorphic site, and no invasion structure is formed. Therefore, the flap is not cut by cleavase.
The FRET probe is a probe for detecting the flap thus separated. The FRET probe constitutes a hairpin loop having a self-complementary sequence on the 5 ′ end side and a single-stranded portion arranged on the 3 ′ end side. The single-stranded portion arranged on the 3 ′ end side of the FRET probe has a base sequence complementary to the flap, and the flap can hybridize there. When the flap is hybridized to the FRET probe, both base sequences are designed so that a structure in which the 3 'end of the flap enters the 5' end portion of the self-complementary sequence of the FRET probe is formed. The cleavase recognizes the invasion structure and cuts it. If the portion of the FRET probe that is cleaved by cleavase is sandwiched and labeled with a reporter dye and quencher similar to TaqMan PCR, the cleavage of the FRET probe can be detected as a change in the fluorescence signal.
Theoretically, the flap should hybridize to the FRET probe even if it is not cut. However, in reality, there is a large difference in the binding efficiency to FRET between the cut flap and the flap present in the state of the allele probe. Therefore, it is possible to specifically detect the cut flap by using the FRET probe.
In order to determine the genotype based on the Invader method, two types of allele probes including base sequences complementary to allele A and allele B may be prepared. At this time, the base sequences of the flaps are different base sequences. If two types of FRET probes for detecting the flaps are prepared and each reporter dye can be identified, the genotype can be analyzed in the same way as the TacMan PCR method.
The advantage of the Invader method is that the FRET probe is the only oligonucleotide that needs to be labeled. The FRET probe can use the same oligonucleotide regardless of the base sequence to be detected. Therefore, mass production is possible. On the other hand, since the allele probe and the invader probe do not need to be labeled, a reagent for genotyping can be manufactured at low cost.
[RCA method]
An example of a method for genotyping that does not depend on the PCR method is the RCA method. A DNA amplification method based on a reaction in which a DNA polymerase having a strand displacement action synthesizes a long complementary strand using a circular single-stranded DNA as a template is the Rolling Circle Amplification (RCA) method (Lizardri PM et al.,). Nature Genetics 19, 225, 1998). In the RCA method, an amplification reaction is configured using a primer that anneals to a circular DNA to initiate complementary strand synthesis and a second primer that anneals to a long complementary strand generated by this primer.
In the RCA method, a DNA polymerase having a strand displacement action is used. Therefore, the portion that has become double-stranded by complementary strand synthesis is replaced by a complementary strand synthesis reaction started from another primer annealed to the 5 ′ side. For example, the complementary strand synthesis reaction using circular DNA as a template does not end in one round. Complementary strand synthesis continues while replacing the previously synthesized complementary strand, and a long single-stranded DNA is produced. On the other hand, the second primer anneals to the long single-stranded DNA generated using the circular DNA as a template, and complementary strand synthesis starts. Since single-stranded DNA generated by the RCA method uses circular DNA as a template, the base sequence is a repetition of the same base sequence. Thus, continuous production of long single strands results in continuous annealing of the second primer. As a result, single-stranded portions that can be annealed by the primer are continuously generated without going through a denaturing step. Thus, DNA amplification is achieved.
If circular single-stranded DNA necessary for the RCA method is generated according to the bases of the SNPs, SNPs can be typed using the RCA method. For this purpose, a linear single-stranded padlock probe is used. The padlock probe has complementary base sequences on both sides of the SNPs to be detected at the 5 'end and 3' end. These base sequences are linked at a portion consisting of a special base sequence called a backbone. If the SNPs part is a base sequence complementary to the end of the padlock probe, the end of the padlock probe hybridized to the allele can be ligated by DNA ligase. As a result, the linear padlock probe is circularized and the reaction of the RCA method is triggered. The reaction of the DNA ligase significantly decreases the reaction efficiency when the terminal portion to be ligated is not completely complementary. Therefore, SNPs can be genotyped by confirming the presence or absence of ligation by the RCA method.
The RCA method can amplify DNA but does not generate a signal as it is. If only the presence or absence of amplification is used as an index, the genotype cannot be determined unless a reaction is performed for each allele. Methods are known in which these points are improved for genotyping. For example, genotyping can be performed with one tube based on the RCA method using a molecular beacon. The molecular beacon is a signal generation probe using a fluorescent dye and a quencher, as in the TaqMan method. The 5 'end and 3' end of the molecular beacon are composed of complementary base sequences, and by themselves form a hairpin structure. If both ends are labeled with a fluorescent dye and a quencher, a fluorescent signal cannot be detected in a state where a hairpin structure is formed. If a part of the molecular beacon is set as a base sequence complementary to the amplification product of the RCA method, the molecular beacon hybridizes to the amplification product of the RCA method. Since the hairpin structure is eliminated by hybridization, a fluorescent signal is generated.
The advantage of the molecular beacon is that the base sequence of the molecular beacon can be made common regardless of the detection target by using the base sequence of the backbone portion of the padlock probe. Genotyping is possible in one tube by changing the backbone base sequence for each allele and combining two types of molecular beacons with different fluorescence wavelengths. Since the cost of synthesis of fluorescently labeled probes is high, the ability to use a common probe regardless of the measurement target is an economic advantage.
All of these methods have been developed for genotyping a large amount of samples at high speed. Except for MALDI-TOF / MS, it is necessary to prepare a labeled probe or the like in any way for any method. On the other hand, genotyping that does not rely on labeled probes has also been performed for a long time. As one of such methods, for example, a method using restriction fragment length polymorphism (RFLP), a PCR-RFLP method, and the like can be mentioned.
RFLP utilizes the fact that a restriction enzyme recognition site mutation or insertion or deletion of a base in a DNA fragment caused by restriction enzyme treatment can be detected as a change in the size of the fragment produced after the restriction enzyme treatment. If there is a restriction enzyme that recognizes a base sequence containing a polymorphism to be detected, the base of the polymorphic site can be known by the principle of RFLP.
As a method that does not require a labeled probe, a method of detecting a difference in base using a change in secondary structure of DNA as an index is also known. PCR-SSCP utilizes the fact that the secondary structure of single-stranded DNA reflects the difference in its base sequence (Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism anomalous ensemble genes 11). 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146, Detection of p53 gene mutations in human brain tumours by single-strand conformation polymorphism analysis of oligomeric polymorphism. ncogene.1991 Aug 1; 6 (8): 1313-1318., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling., PCR Methods Appl. 1995 Apr. 1; 4 (5). The PCR-SSCP method is performed by dissociating the PCR product into single-stranded DNA and separating it on a non-denaturing gel. Since the mobility on the gel varies depending on the secondary structure of the single-stranded DNA, if there is a difference in base at the polymorphic site, it can be detected as a difference in mobility.
In addition, examples of methods that do not require a labeled probe include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE method). The DGGE method is a method in which a mixture of DNA fragments is run in a polyacrylamide gel having a concentration gradient of a denaturing agent, and the DNA fragments are separated according to differences in instability. When a mismatched unstable DNA fragment migrates to a certain denaturant concentration in the gel, the DNA sequence around the mismatch is partially dissociated into single strands due to its instability. The mobility of a partially dissociated DNA fragment becomes very slow and is different from the mobility of a complete double-stranded DNA without a dissociated part, so that both can be separated.
Specifically, first, a region including the SNPs site is amplified by a PCR method or the like. The amplification product is hybridized with a probe DNA whose base sequence is known to make a double strand. This is electrophoresed in a polyacrylamide gel that gradually increases as the concentration of denaturing agents such as urea moves, and is compared with a control. In a DNA fragment in which a mismatch has occurred due to hybridization with the probe DNA, the DNA fragment becomes single-stranded at a lower denaturant concentration position, and the moving speed becomes extremely slow. The presence or absence of mismatch can be detected by detecting the difference in mobility generated in this way.
Furthermore, genotypes can also be determined using DNA arrays (cell engineering separate volume "DNA microarray and the latest PCR method", Shujunsha, 2000.4 / 20, pp97-103 "Analysis of SNPs using oligo DNA chips" , Shinichi Kanie). In the DNA array, sample DNA (or RNA) is hybridized to a large number of probes arranged on the same plane, and the hybridization to each probe is detected by scanning the plane. Since responses to many probes can be observed simultaneously, for example, a DNA array is useful for analyzing a large number of SNPs simultaneously.
In general, a DNA array is composed of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually, these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate. The surface layer of the substrate is generally glass, but a porous film such as a nitrocellulose membrane can also be used.
In the present invention, an oligonucleotide-based array developed by Affymetrix can be exemplified as a nucleotide immobilization (array) method. In an array of oligonucleotides, the oligonucleotides are usually synthesized in situ. For example, in situ synthesis methods of oligonucleotides using photolithographic technology (Affymetrix) and ink-jet (Rosetta Informatics) technology for immobilizing chemical substances are already known. Can be used.
The oligonucleotide is composed of a base sequence complementary to a region containing SNPs to be detected. The length of the nucleotide probe to be bound to the substrate is usually 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 25 bases when the oligonucleotide is immobilized. Furthermore, in general, mismatch (MM) probes are used in the DNA array method in order to avoid errors due to cross hybridization (non-specific hybridization). The mismatch probe constitutes a pair with an oligonucleotide having a base sequence completely complementary to the target base sequence. An oligonucleotide consisting of a base sequence that is completely complementary to a mismatch probe is called a perfect match (PM) probe. In the process of data analysis, the influence of cross-hybridization can be reduced by eliminating the signal observed with the mismatch probe.
A sample for genotyping by the DNA array method can be prepared by a method well known to those skilled in the art based on a biological sample collected from a subject. The biological sample is not particularly limited. For example, a DNA sample can be prepared from chromosomal DNA extracted from tissues or cells of peripheral blood leukocytes, skin, oral mucosa, etc., tears, saliva, urine, feces or hair of the subject. A specific region of chromosomal DNA is amplified using a primer for amplifying a region containing SNPs to be determined. At this time, a plurality of regions can be simultaneously amplified by the multiplex PCR method. The multiplex PCR method is a PCR method using a plurality of primer sets in the same reaction solution. When analyzing a plurality of SNPs, the multiplex PCR method is useful.
In general, in the DNA array method, a DNA sample is amplified by the PCR method and the amplification product is labeled. A labeled primer is used for labeling the amplification product. For example, genomic DNA is first amplified by a PCR method using a primer set specific to a region containing SNPs. Next, DNA labeled with biotin is synthesized by a labeling PCR method using a primer labeled with biotin. The biotin-labeled DNA synthesized in this way is hybridized to the oligonucleotide probe on the chip. The hybridization reaction solution and reaction conditions can be appropriately adjusted according to conditions such as the length of the nucleotide probe immobilized on the substrate and the reaction temperature. One skilled in the art can design appropriate hybridization conditions. In order to detect the hybridized DNA, avidin labeled with a fluorescent dye is added. The array is analyzed with a scanner, and the presence or absence of hybridization is confirmed using fluorescence as an index.
In addition to the method described above, an allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization method can be used to detect a base at a specific site. An allele-specific oligonucleotide (ASO) is composed of a base sequence that hybridizes to a region where SNPs to be detected are present. When ASO is hybridized to sample DNA, the hybridization efficiency decreases if a mismatch occurs in the SNPs site due to polymorphism. Mismatches can be detected by Southern blotting or a method that uses the property of quenching by intercalating a special fluorescent reagent into the hybrid gap. Mismatches can also be detected by the ribonuclease A mismatch cleavage method.
The present invention also provides a probe or primer for the test method of the present invention. The present invention revealed the presence of polymorphic sites associated with inhaled steroid responsiveness in the AHR gene. Therefore, the probe or primer for clarifying the base of the polymorphic site is useful for the inspection method of the present invention. Various methods as described above can be applied to a technique for clarifying a base at a polymorphic site. In these techniques, a primer for amplifying a region containing the polymorphic site or a probe that hybridizes to the polymorphic site is generally used.
In the present invention, a primer for amplifying a region containing a polymorphic site refers to a primer capable of starting complementary strand synthesis toward the polymorphic site using DNA containing the polymorphic site as a template. The primer of the present invention can also be expressed as a primer for providing a replication origin on the 3 ′ side of the polymorphic site in DNA containing the polymorphic site. The interval between the region where the primer hybridizes and the polymorphic site is arbitrary. For the interval between the two, a suitable number of bases can be selected according to the analysis method of the base at the polymorphic site.
For example, in the case of a primer for analysis using a DNA chip, the primer can be designed so that an amplification product having a length of 20 to 500, usually 50 to 300 bases, can be obtained as a region containing a polymorphic site. That is, the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 centered on the polymorphic site (150th position) may be shown as an example of the base sequence to be amplified by PCR in the base analysis using a DNA chip. it can. For example, a primer that can amplify a continuous base sequence including a polymorphic site in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is useful for genotyping in the present invention. A person skilled in the art can design a primer according to the analysis method based on the base sequence of the allyl hydrocarbon receptor gene. The base sequence constituting the primer of the present invention can be appropriately modified as well as a base sequence completely complementary to the genomic base sequence.
In addition to the base sequence complementary to the genomic base sequence, an arbitrary base sequence can be added to the primer of the present invention. For example, in a primer for a polymorphism analysis method using a type IIs restriction enzyme, a primer to which a recognition sequence for a type IIs restriction enzyme is added is used. Such a primer with a modified base sequence is included in the primer of the present invention. Furthermore, the primer of the present invention can be modified. For example, a fluorescent material or a primer labeled with a binding affinity material such as biotin or digoxin is used in various genotyping methods. Primers having these modifications are also included in the present invention.
On the other hand, in the present invention, a probe that hybridizes to a region containing a polymorphic site refers to a probe that can hybridize to a polynucleotide having a base sequence of a region containing a polymorphic site. More specifically, a probe containing a polymorphic site in the base sequence of the probe is preferable as the probe of the present invention. Alternatively, depending on the base analysis method at the polymorphic site, the probe may be designed so that the end of the probe corresponds to a base adjacent to the polymorphic site. Therefore, although the polymorphic site is not included in the base sequence of the probe itself, a probe including a base sequence complementary to the region adjacent to the polymorphic site can also be shown as a desirable probe in the present invention.
In other words, it has a base sequence selected from the base sequence constituting the AHR locus of genomic DNA or a base sequence complementary thereto, and is adjacent to the polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness or the polymorphic site A probe that can hybridize to a site is preferred as the probe of the present invention. In the probe of the present invention, modification of the base sequence, addition of the base sequence, or modification is allowed in the same manner as the primer. For example, a probe used for the Invader method is added with a base sequence unrelated to the genome constituting the flap. Such a probe is also included in the probe of the present invention as long as it hybridizes to a region containing a polymorphic site. The base sequence constituting the probe of the present invention can be designed according to the analysis method based on the base sequence of the AHR locus in the genome.
The primer or probe of the present invention can be synthesized by any method based on the base sequence constituting it. The length of the base sequence complementary to the genomic DNA of the primer or probe of the present invention is usually 15 to 100, generally 15 to 50, usually 15 to 30. A technique for synthesizing an oligonucleotide having the base sequence based on the given base sequence is known. Furthermore, in the synthesis of the oligonucleotide, any modification can be introduced into the oligonucleotide using a nucleotide derivative modified with a fluorescent dye or biotin. Alternatively, a method of binding a fluorescent dye or the like to a synthesized oligonucleotide is also known.
The present invention also provides a reagent for testing inhaled steroid responsiveness. The reagent of the present invention includes the primer and / or probe of the present invention. Various reagents, enzyme substrates, buffers and the like can be combined with the reagent of the present invention according to the genotyping method. Examples of the enzyme include enzymes necessary for various analysis methods exemplified as the above-described method for genotyping, such as DNA polymerase, DNA ligase, or IIs restriction enzyme. As the buffer solution, a buffer solution suitable for maintaining the activity of the enzyme used for these analyzes is appropriately selected. Furthermore, as the enzyme substrate, for example, a substrate for complementary strand synthesis is used.
Furthermore, the reagent of the present invention can be accompanied by a control in which the base at the polymorphic site is clear. As a control, a genome or a genomic fragment whose genotype is known in advance can be used. The genome may be extracted from cells, or cells or cell fractions may be used. If cells are used as a control, the result of the control can prove that the genomic DNA extraction operation was performed correctly. Alternatively, DNA consisting of a base sequence containing a polymorphic site can be used as a control. Specifically, a YAC vector or a BAC vector containing a DNA derived from a genome that includes the AHR locus and whose base at the polymorphic site has been clarified is useful as a control. Alternatively, a vector in which only several hundred b corresponding to the polymorphic site is cut out and inserted can be used as a control.

図１は、発明を実施するための最良の形態において見出されたＡＨＲ遺伝子のＳＮＰｓをゲノム上にマッピングした結果を示す図である。図中の位置を示す数値は、転写開始点を＋１としてカウントした塩基数である。連鎖不平衡が見出されたＳＮＰｓには、＃および＄を付けた。図右下のスケールが約１ｋｂに相当する。 FIG. 1 is a diagram showing the results of mapping SHRs of AHR gene found on the genome in the best mode for carrying out the invention onto the genome. The numerical value indicating the position in the figure is the number of bases counted from the transfer start point as +1. SNPs in which linkage disequilibrium was found were marked with # and $. The scale on the lower right of the figure corresponds to about 1 kb.

ＣＹＰ１Ａ１などの薬剤代謝に関連する遺伝子は、ＡＨＲの転写制御を受けている。本発明者らは、アレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性に対して、ＡＨＲが関与している可能性があると考えた。そこで本発明者らは、ＡＨＲとアレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性との関連性を見出すために、ＡＨＲ遺伝子の多型解析を試みた。
試料として、成人喘息患者、小児喘息患者それぞれ１２名の末梢血由来ゲノムＤＮＡを使用した。ＡＨＲ遺伝子のＳＮＰｓスクリーニングに使用したプライマー及びＰＣＲ法の反応条件を以下に示す。各プライマーの塩基配列の後に、そのアニーリング温度と、ＤＭＳＯの添加の有無を有り／＋、または無し／−で示した。
ＡＨＲ用プライマー

ＰＣＲ法の反応条件は次のとおりである。
ＰＣＲ反応液組成（単位μｌ）
Ｖ−ｂｕｆｆｅｒ＊１．１
ＤＭＳＯ１ｏｒ０
７８ｍＭＭｇＣｌ_２０．５５
２５ｍＭｄＮＴＰ０．５５
ｐｒｉｍｅｒＦ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）０．１４
ｐｒｉｍｅｒＲ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）０．１４
ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μｌ）０．１１
ＤＷｕｐｔｏ１０μｌ
ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ１（５ｎｇ／μｌ）
Ｖ−ｂｕｆｆｅｒ：１６．６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，６７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８），１０ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．０７ｍＭＥＤＴＡ
ＰＣＲ法の反応温度は、次のとおりである。まず９５℃／２分の変性後、（９４℃／３０秒＝各アニーリング温度／３０秒＝７２℃／３分）を１サイクルとして３７サイクル繰り返した。３７サイクル終了後に７２℃で７分間インキュベートした。
ＰＣＲ反応産物を精製後、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いてシーケンス反応を実施した。シーケンス反応の条件は、次のとおりである。
シーケンス反応溶液（単位μｌ）
精製ＰＣＲ産物１
ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ試薬１．５
Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）０．０５
ＤＷ３．４５
トータル６
シーケンス反応に用いたプライマーは、増幅に用いたプライマーと同じものを使用した。ただし、ＡＨＲｇＦ３Ｒ３、ＡＨＲｇＦ１３Ｒ１３は増幅プライマー以外に下記のシーケンス用プライマーを使用した。

ＰＣＲ法の反応温度は、次のとおりである。まず９５℃で１分変性後、（９６℃／３０秒＝５０℃／３０秒＝６０℃／３分）を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。イソプロパノール沈殿後、ＡＢＩ３７００を使用して塩基配列を解析した。
塩基配列の解析の結果、図１および表１に示すようなＳＮＰｓの存在が確認された。図および表中において、＃および＄をつけたＳＮＰｓは、連鎖不平衡の関係にあった。
これらのＳＮＰｓのそれぞれについて、関連解析（ケースコントロールスタディ）を行った。解析の結果を表５にまとめた。表５中、人数を記載していないものは、小児２８８人、成人２８８人、およびコントロール１９２人の結果である。各ＳＮＰｓには、表２に示すような表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）との関連性が見出された。

表２に示す関連性の中から統計学的により正しい関連性を見出すために、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を行った。その結果、Ｔ９０１０Ｃ、およびＴ９２３１Ｃの２つのＳＮＰｓが、プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）の投与量と遺伝統計学的な関連性を有することが確認された。すなわち９０１０および９２３１における塩基がＣである患者に、ベクラメタゾンの１日当たりの投与量が多い患者が有意に多かった。９０１０Ｃおよび９２３１Ｃの解析対象集団におけるアレル頻度は、いずれも３５％であった。補正後のχ^２値、およびｐ値を表３〜表５に示す。

Genes related to drug metabolism such as CYP1A1 are subject to transcriptional control of AHR. The present inventors considered that AHR may be involved in drug responsiveness used for the treatment of allergic diseases. Therefore, the present inventors attempted polymorphism analysis of the AHR gene in order to find the relationship between AHR and drug responsiveness used in the treatment of allergic diseases.
As samples, genomic DNA derived from peripheral blood of 12 adult asthma patients and pediatric asthma patients was used. The primers used for the AHR gene SNP screening and the reaction conditions of the PCR method are shown below. After the base sequence of each primer, the annealing temperature and the presence / absence of DMSO addition are indicated by “Yes / +” or “No / −”.
Primer for AHR

The reaction conditions for the PCR method are as follows.
PCR reaction solution composition (unit: μl)
V-buffer * 1.1
DMSO 1 or 0
78 mM MgCl ₂ 0.55
25 mM dNTP 0.55
primer F (100 pmol / μl) 0.14
primer R (100 pmol / μl) 0.14
Ex Taq (5 U / μl) 0.11
DW up to 10 μl
Genomic DNA 1 (5 ng / μl)
V-buffer: 16.6 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 67 mM Tris-HCL (pH 8.8), 10 mM β-mercaptoethanol, 0.07 mM EDTA
The reaction temperature of the PCR method is as follows. First, after denaturation at 95 ° C./2 minutes, (94 ° C./30 seconds = each annealing temperature / 30 seconds = 72 ° C./3 minutes) was repeated 37 cycles. After 37 cycles, the cells were incubated at 72 ° C. for 7 minutes.
After the PCR reaction product was purified, a sequencing reaction was performed using BigDye Terminator. The conditions for the sequence reaction are as follows.
Sequence reaction solution (unit: μl)
Purified PCR product 1
BigDye Terminator Reagent 1.5
Primer (100 pmol / μl) 0.05
DW 3.45
Total 6
The same primers as those used for amplification were used for the sequencing reaction. However, AHR g F3R3 and AHR g F13R13 used the following sequencing primers in addition to the amplification primers.

The reaction temperature of the PCR method is as follows. First, after denaturation at 95 ° C. for 1 minute, (96 ° C./30 seconds = 50 ° C./30 seconds = 60 ° C./3 minutes) was set as 1 cycle and repeated 30 cycles. After isopropanol precipitation, the base sequence was analyzed using ABI3700.
As a result of the base sequence analysis, the presence of SNPs as shown in FIG. 1 and Table 1 was confirmed. In the figures and tables, SNPs with # and $ were in a linkage disequilibrium relationship.
A related analysis (case control study) was performed for each of these SNPs. The results of the analysis are summarized in Table 5. In Table 5, those without the number of persons are the results of 288 children, 288 adults, and 192 controls. Each SNP was found to be associated with a phenotype as shown in Table 2.

Bonferroni correction was performed in order to find statistically more correct associations from those shown in Table 2. As a result, it was confirmed that the two SNPs of T9010C and T9231C have a genetic statistical relationship with the dose of beclomethasone propionate (BDP). That is, there were significantly more patients with high daily doses of beclamethasone in patients whose bases at 9010 and 9231 were C. Allele frequencies in the 9010C and 9231C analysis target populations were both 35%. Tables 3 to 5 show the χ ² value and the p value after correction.

Industrial applicability

本発明者らによって、ＡＨＲ遺伝子における多型と吸入ステロイド応答性の関連が見出された。その結果、本発明により、被検者における吸入ステロイド応答性の検査が可能となった。より具体的には、たとえば喘息に対して処方される代表的な吸入ステロイドであるプロピオン酸ベクロメタゾンに対する応答性を、本発明によって予測することができる。プロピオン酸ベクロメタゾンは、初期の段階で選択されることの多い吸入ステロイドである。
従来はプロピオン酸ベクロメタゾンの治療効果を予測できないため、投与後の経過を見た後に、第２の選択肢が検討されていた。本発明によって、喘息患者が予めプロピオン酸ベクロメタゾンに耐性であることを予測できれば、早期により有効な薬剤を選択できる可能性が高まる。したがって、本発明は喘息患者のＱＯＬの向上に貢献する。また、本発明によって予め効果の低い薬剤を予測できるため、無駄な投薬を避けることができる。つまり本発明には、医療経済上のメリットも期待できる。The present inventors have found an association between polymorphisms in the AHR gene and inhaled steroid responsiveness. As a result, the present invention has made it possible to examine inhaled steroid responsiveness in subjects. More specifically, responsiveness to beclomethasone propionate, a typical inhaled steroid prescribed for asthma, for example, can be predicted by the present invention. Beclomethasone propionate is an inhaled steroid often selected at an early stage.
Conventionally, since the therapeutic effect of beclomethasone propionate cannot be predicted, the second option has been studied after observing the course after administration. According to the present invention, if it can be predicted that an asthmatic patient is resistant to beclomethasone propionate in advance, the possibility of selecting a more effective drug at an early stage is increased. Therefore, the present invention contributes to improving the QOL of asthmatic patients. Moreover, since a drug with a low effect can be predicted in advance according to the present invention, useless medication can be avoided. That is, the present invention can also be expected to have medical economic advantages.

【配列表】

[Sequence Listing]

Claims

A test method for inhaled steroid responsiveness, comprising the following steps.
(A) determining the polymorphic genotype associated with inhaled steroid responsiveness in the allyl hydrocarbon receptor gene of the subject, and (b) based on the genotype determined in (a), Process for determining inhaled steroid responsiveness of a subject

The test method according to claim 1, wherein the polymorphism is a single nucleotide polymorphism.

The test method according to claim 1, wherein the polymorphism of the allyl hydrocarbon receptor gene is a polymorphism of either or both of the 9010th base and the 9231st base of the allyl hydrocarbon receptor gene.

The test method according to claim 3, wherein the polymorphism of the 9010th base of the allyl hydrocarbon receptor gene is T and C.

The test | inspection method of Claim 3 whose polymorphism of the 9231st base of an allyl hydrocarbon receptor gene is T and C.

The inspection method according to claim 1, comprising the following steps (a) to (c).
(A) A step of collecting genomic DNA from a biological sample collected from a subject (b) a base site in an allyl hydrocarbon receptor gene, the 9010th base and the 9231th base of the receptor gene (C) determining that a subject whose C is at either the 9010th position and the 9231th position, or both bases is C, has inhaled steroid resistance.

7. The method of claim 6, wherein the inhaled steroid is any steroid selected from the group consisting of beclomethasone propionate, budesonide, and fluticasone propionate.

8. The method of claim 7, wherein the inhaled steroid is beclomethasone propionate.

A primer for inhaled steroid resistance testing, comprising a primer for synthesizing a region containing a polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene.

The primer according to claim 9, wherein the polymorphic site is any one or both of the 9010th base and the 9231st base.

A probe for testing for inhaled steroid resistance, comprising an oligonucleotide that hybridizes to a region containing a polymorphic site associated with inhaled steroid responsiveness in an allyl hydrocarbon receptor gene.

The probe according to claim 11, wherein the polymorphic site is one of or both of the 9010th base and the 9231st base.