JPWO2004065607A1 - Novel physiologically active substance RS-K3574 and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
ユビキチン活性化酵素の阻害活性と、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性と、抗腫瘍活性とその他の種々な生物学的活性とを示し且つ新しい分子骨格を有する生理活性物質として、次式（Ｉ）〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であるＲＳ−Ｋ３５７４物質がヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）・Ｋ−３５７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５）の培養により製造された。ＲＳ−Ｋ３５７４物質はユビキチン活性化酵素の阻害活性と細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性とを有し、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を有し、さらに抗腫瘍活性、抗癌活性および抗炎症活性ならびに抗ウィルス活性を有する生理活性物質である。As a biologically active substance that exhibits an inhibitory activity of ubiquitin activating enzyme, an inhibitory activity of ubiquitination of intracellular proteins, an antitumor activity and various other biological activities and has a new molecular skeleton, the following formula (I ) [Wherein the steric configurations at the 2-position, 3-position, 4-position and 7-position are S, S, R, and R, respectively, RS-K3574 is a compound of the genus Pleurotus genus Panusrudis ) · K-3574 strain (FERM BP-8265) was produced by culture. RS-K3574 substance has ubiquitin activating enzyme inhibitory activity and intracellular protein ubiquitination inhibitory activity, and also has the activity of inhibiting intracellular protein biosynthesis, and further has antitumor activity and anticancer activity. It is a physiologically active substance having active and anti-inflammatory activity as well as antiviral activity.
Description
本発明は、ユビキチン活性化酵素に対する阻害活性と細胞内タンパク質のユビキチン化に対する阻害活性とを有し、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を有し、さらに抗腫瘍または抗癌活性を示す新規な生理活性物質であるＲＳ−Ｋ３５７４物質に関する。また、本発明は前記の生理活性物質、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の製造法に関する。さらに本発明は、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤、ならびに生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤に関し、また生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分とする抗腫瘍剤組成物、抗炎症剤組成物および抗ウィルス剤組成物に関する。また、本発明は、新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線のアポトーシス誘発作用の増強剤、および癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤、ならびにＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤を包含する。The present invention has an inhibitory activity on ubiquitin activating enzyme and an inhibitory activity on ubiquitination of intracellular proteins, has an activity of inhibiting intracellular protein biosynthesis, and further has antitumor or anticancer activity. It relates to the RS-K3574 substance, which is a novel physiologically active substance. Moreover, this invention relates to the manufacturing method of said bioactive substance and RS-K3574 substance. Furthermore, the present invention relates to an inhibitor of ubiquitin activating enzyme comprising a physiologically active substance RS-K3574, and an inhibitor of ubiquitination of intracellular proteins comprising a physiologically active substance RS-K3574, and the physiologically active substance RS-K3574. The present invention relates to an anti-tumor agent composition, an anti-inflammatory agent composition and an anti-viral agent composition. In addition, the present invention also comprises a novel bioactive substance RS-K3574, an agent for enhancing the apoptosis-inducing action of a cytocidal antitumor agent or anticancer agent or radiation for cancer treatment on cancer cells, and inhibition of protein biosynthesis in cancer cells. agents, including an inhibitor against, and NF-? K activation of B transcription factor.
種々な多数の酵素阻害剤が知られており、また種々な多数の生理活性物質が知られている。これら酵素阻害剤あるいは生理活性物質を、様々な疾病の治療薬として応用するための取り組みがなされている。また細胞の増殖、分化、生育ならびに細胞死などにおける極めて重要かつ必須の制御機構の一つとして、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応があることが知られる。この細胞内タンパク質のユビキチン化反応を抑制できる活性をもつ物質は、疾病の治療と予防に広く応用されることが期待されるので要望されているが、現在まで、その細胞内タンパク質のユビキチン化反応を阻害できる活性をもつ物質は発見されていない。
癌細胞や免疫細胞での細胞増殖や細胞死が起こる際に、急性または慢性の炎症が起こる際に、免疫過敏や免疫不全などの免疫応答が起こる際に、アルツハイマー症を含む神経疾患が起こる際に、ならびにＨＩＶウィルスを含む病原ウィルスの感染や増殖が起こる際に、さらに卵子の受精や発生などでの、正常な分化が起きる際に、極めて重要かつ必須な役割を果たす機構の一つとして、ユビキチンを活性化する酵素が関与するところの細胞内タンパク質のユビキチン化機構があることが知られる。
例えば、ＨＩＶ−１ウィルスまたはＨＩＶ−２ウィルスが感染している細胞内では、これらＨＩＶウイルスの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）、成熟化、感染力獲得にタンパク質のユビキチン化が関与することが知られ、また細胞内に在る酵素であるユビキチン活性化酵素がユビキチンの活性化に関与することが知られる。さらにＨＩＶウィルスが感染している細胞内で、プロテアソームを阻害することによって、ＨＩＶ由来のユビキチン化されたタンパク質の限定的な分解を止めると、ＨＩＶウィルスの出芽、成熟化、感染力獲得、増殖を阻害できることが知られる〔ＰＮＡＳ，９７巻２４号１３０５７〜１３０６２頁（２０００年１１月）〕。
さらに、急性または慢性の炎症が起こる際には、必らず、炎症性サイトカインによるＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化が起こることが知られ、このＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化は、その活性化に伴って、遺伝子ＭＡＤ−３を発現する〔Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．６５，ｐｐ１２８１−１２８９頁（１９９１）〕。
因みに、カワキタケ（Ｐａｎｕｓ）属に属するパヌス・ルジス（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）ＮＲＲＬ３８２１とパヌス・コンシャタス（Ｐａｎｕｓ ｃｏｎｃｈａｔｕｓ）ＮＲＲＬ３２５３により産生される次式（Ａ）
前述したように、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応は、重要な生化学反応であるが、しかし、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応を直接に阻害できる活性をもつ物質は、現在のところ未だ発見されていないので、そのような活性の新しい物質が現在も要望されている。細胞内のタンパク質をユビキチン化する機構を阻害できる活性をもつ新しい物質を提供することができるならば、そのような新しい物質は、従来知られているまたは使用されているところの既知の抗腫瘍性化合物、消炎・鎮痛性化合物、抗リウマチ薬、抗悪疫質剤、免疫抑制物質または免疫活性化物質、抗ウィルス薬、抗痴ほう薬、抗心筋症薬、抗肥満薬、抗糖尿病薬、臓器不全対処薬とは、異なる作用点を有し且つ新規な化学構造を有した化合物として利用できることが期待される。上記のような阻害活性をもつ新しい物質を求めるための研究が行われている。Many different enzyme inhibitors are known, and many different physiologically active substances are known. Efforts have been made to apply these enzyme inhibitors or physiologically active substances as therapeutic agents for various diseases. Moreover, it is known that there is a ubiquitination reaction of intracellular proteins as one of extremely important and essential control mechanisms in cell proliferation, differentiation, growth and cell death. Substances having an activity capable of suppressing the ubiquitination reaction of intracellular proteins are expected to be widely applied in the treatment and prevention of diseases, but until now, the ubiquitination reaction of intracellular proteins is desired. No substance has been discovered that has an activity capable of inhibiting the above.
When neurological diseases such as Alzheimer's disease occur when an immune response such as immune hypersensitivity or immunodeficiency occurs when cell proliferation or cell death occurs in cancer cells or immune cells, when acute or chronic inflammation occurs In addition, as one of the mechanisms that play an extremely important and essential role when normal differentiation occurs, such as fertilization and development of eggs, when infection and propagation of pathogenic viruses including HIV virus occur, It is known that there is a mechanism for ubiquitination of intracellular proteins where enzymes that activate ubiquitin are involved.
For example, in cells infected with HIV-1 virus or HIV-2 virus, it is known that ubiquitination of proteins is involved in the budding, maturation, and infectivity acquisition of these HIV viruses. It is known that a ubiquitin activating enzyme, which is an internal enzyme, is involved in the activation of ubiquitin. Furthermore, by inhibiting the proteasome in cells infected with the HIV virus to stop the limited degradation of the HIV-derived ubiquitinated protein, the HIV virus budding, maturation, infectivity acquisition, and proliferation It is known that it can inhibit [PNAS, 97, 24, 13057-13062 (November 2000)].
Furthermore, it is known that activation of NF- KB transcription factors by inflammatory cytokines occurs whenever acute or chronic inflammation occurs, and this activation of NF- KB transcription factors Upon activation, the gene MAD-3 is expressed [Cell. vol. 65, pp 1281-1289 (1991)].
Incidentally, the following formula (A) produced by Panus rudis NRRL3821 and Panus conchatus NRRL 3253 belonging to the genus Panus
As mentioned above, the ubiquitination reaction of intracellular proteins is an important biochemical reaction. However, a substance having an activity capable of directly inhibiting the ubiquitination reaction of intracellular proteins has yet to be discovered. There is still a need for new substances with such activity. If it is possible to provide new substances with an activity that can inhibit the mechanism of ubiquitination of intracellular proteins, such new substances are known anti-tumor properties as known or used in the past. Compound, anti-inflammatory / analgesic compound, anti-rheumatic drug, anti-pesticide agent, immunosuppressant or immunoactivator, anti-viral agent, anti-dementia agent, anti-cardiomyopathy agent, anti-obesity agent, anti-diabetic agent, organ failure treatment It is expected that the drug can be used as a compound having a different action point and a novel chemical structure. Research is being conducted to find new substances having the above inhibitory activity.
本発明者らは、上記の要望に応えることができる細胞内ユビキチン活性化酵素の阻害活性ならびに細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性をもつと共に、抗腫瘍活性および抗ウィルス活性を持つ新規な物質を提供することを目的に、有用な生理活性物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その研究の結果、ヒラタケ科カワキタケ属に属するアラゲカワキタケの一菌株が新しい構造骨格を有する生理活性物質を生産していることを見い出した。この新規生理活性物質を単離することに成功し、下記の物理化学的性質を有し且つ下記の式（Ｉ）で示した立体的化学構造を有することを確認し、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４と命名した。更に、この新規な生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４がユビキチン活性化酵素に対する阻害活性および細胞内タンパク質のユビキチン化に対する阻害活性、ならびに抗腫瘍活性および抗炎症活性および抗ウィルス活性を有すことを見い出した。
すなわち、第１の本発明においては、このＲＳ−Ｋ３５７４物質が次式（Ｉ）
次に、第１の本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の物理化学的性状を記載する。
Ａ）外観及び性質：無色粘稠な油状物質
Ｂ）比旋光度［α］Ｄ ２６−６２．３°（ｃ１．０、ジクロロメタン）
Ｃ）ＴＬＣのＲｆ値：０．３９
シリカゲル（Ａｒｔ．１０５７１５、メルク社製）の薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合
Ｄ）ＦＡＢマススペクトル（ｍ／ｚ）：２３３（Ｍ＋Ｎａ）＋
なお、Ｍ＋は観察されず、（Ｍ−１８）＋が観察された。
Ｅ）分子式：Ｃ１１Ｈ１４Ｏ４
Ｆ）紫外線吸収スペクトル
（ｉ）メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第１図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０９（８３００）、２４１（５７００）
（ｉｉ）メタノール−ＨＣｌ溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第２図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０５（１４２００）、２４０（ｓｈ５５００）
（ｉｉｉ）メタノール−ＮａＯＨ溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第３図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０６（１６４００）、２４０（ｓｈ５３００）、３０４（２４００）
Ｇ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）を添付図面の第４図に示す。主な吸収帯は次のとおりである。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０
Ｈ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム中／内部標準テトラメチルシラン）を添付図面の第５図に示す。
重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で５００ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）である。
Ｉ）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム中／内部標準テトラメチルシラン）を添付図面の第６図に示す。
重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）である。
なお、本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質の立体的化学構造は、上記の式（Ｉ）に示すとおりであることは、ＲＳ−Ｋ３５７４物質からの或る誘導体の結晶を粉末Ｘ線回析法で分析することによって確認できたのである。
前記の式（Ａ）
さらに、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生物学的性質を次に記載する。
Ａ）ユビキチン活性化酵素に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性の測定
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４のユビキチン活性化酵素に対する阻害活性は、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の１００μｇ／ｍｌ以上の濃度でユビキチン活性化酵素を完全に阻害する強さをもつ。
ユビキチン活性化酵素に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性は、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，６５巻，１４９１−１４９３頁（２００２）に記載の方法に準じて測定した。すなわち、ヒト由来のユビキチン活性化酵素を、組換遺伝子工学法で大腸菌に発現させ、この大腸菌からユビキチン活性化酵素を採取および精製することによってユビキチン活性化酵素試料を調製した。またウシ由来のユビキチンをビオチン化することによって調製されたビオチン化ユビキチンを、基質として用いた。前記のユビキチン活性化酵素と前記の基質をＡＴＰ（アデノシン−５’−３リン酸）とともに、供試のＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下または非存在下で３７℃にて１５分間反応させた。
得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、ゲル内の分画されたところの、ビチオン化ユビキチンと結合した酵素タンパク質を、エレクトロブロットによりポリビニリデンジフロライド膜に吸着させた。この膜上におけるビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量をＥＣＬ法（「Ｃｈｉｎ．Ｃｈｅｍ．」２５巻、１５３１〜１５４６頁（１９７９年）参照）を用いて検定した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下に上記の酵素反応を行った試験区において検出されたビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量と、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下で酵素反応を行った対照試験区において検出されたビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量との比較によって、ビオチン化ユビキチンに結合したユビキチン活性化酵素の結合生成物の生成量がＲＳ−Ｋ３５７４物質によって抑制される程度を判定した。
Ｂ）細胞内タンパク質のユビキチン化に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性の測定
細胞内におけるタンパク質ユビキチン化に対する本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の阻害活性は、２μｇ／ｍｌ以上の濃度のＲＳ−Ｋ３５７４物質で細胞内に惹起されるユビキチン化タンパク質の生成を完全に阻害する強さをもつ。
この細胞内でのユビキチン化タンパク質の生成は次のようにして検出した。すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を含む培地中にあらかじめＲＳ−Ｋ３５７４物質を各種濃度で添加した。その添加から３０分経過後、さらに癌細胞内のプロテアソームに対する阻害物質であるＭＧ−１３２を１μＭの濃度で培地に添加した（ＭＧ−１３２の添加により、プロテアソームを完全に阻害し、このことにより、プロテアソームにより分解されるべきユビキチン化タンパク質が細胞に蓄積できる）。その後、培地で３時間癌細胞を培養した後に、癌細胞を可溶化した。得られた細胞可溶性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル内の分画されたタンパク質をエレクトロブロットによりポリビニリデンジフロライド膜に吸着させ、この膜上の吸着されてあるユビキチン化されたタンパク質を、抗ユビキチン抗体と反応させることにより選択的に検出した。検出にはＥＣＬ法（「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．」２５巻、１５３１〜１５４６頁（１９７９年）参照）を用いた。
また、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を含む培地にＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加することなく、上記と同様に試験した。この後者の対照試験のように、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下で試験した場合には、ユビキチン化されたタンパク質が蓄積してくるが、前記の培地にＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加してその存在下に試験を行った場合に、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下でその濃度に依存して、ユビキチン化されたタンパク質の蓄積が抑えられたことが確認された。このことから明らかなように、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は、細胞内でユビキチン化されることによって直接または間接的に制御される性質をもつ機能性の細胞内タンパク質の生成を抑制することに有効である。
Ｃ）癌または腫瘍細胞増殖に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の抑制活性
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は癌または腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する。ＲＳ−Ｋ３５７４物質が各種癌細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０値）を、ＭＴＴ法（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」６５巻、５５〜６０頁（１９８３年）参照）で測定した。その結果を次の第１表に示す。
Ｄ）ＲＳ−Ｋ３５７４物質の制癌活性
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、制癌活性を有する。ＲＳ−Ｋ３５７４物質は例えばエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腹水癌を移植したマウスに対して延命効果を有する。この担癌マウスにＲＳ−Ｋ３５７４物質を１日あたり２５０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で連続９日間投与した場合、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を投与しない場合に比べて延命効果が２００％に達する。この延命効果は以下のようにして判定した。
すなわち、４週齢のＩＣＲマウスにＥｈｒｌｉｃｈ癌細胞の２×１０６個を腹腔に移植し、翌日から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を１日あたり２５０または６２．５μｇ／匹の投与量を腹腔に９日間毎日投与し続けた。無投与群では、腹腔内にＥｈｒｌｉｃｈ癌に誘因された腹水が溜まり全例が約２週間後に死亡した。そこでＲＳ−Ｋ３５７４物質を投与した処理群の平均生存日数を、無投与群の平均生存日数で除した商の値で延命効果を評価した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質による処理群では、腹水の蓄積が顕著に抑制され、その結果、１日あたり２５０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で９日間投与した場合に２００％の延命効果が、また６２．５μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で９日間投与した場合でも１６０％以上の延命効果が認められた。
この結果から明らかなように、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は生体での癌または腫瘍の悪性化に対する抑制効果を有するのであり、このことから、抗腫瘍剤、抗癌剤、または抗悪疫質剤として有用である。
Ｅ）殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線による癌細胞のアポトーシス感受性に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の増強効果
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線が癌細胞に対して有するアポトーシス誘発効果を増強し、抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用に照射される放射線、例えばγ線、Ｘ線、α線の抗腫瘍活性または抗癌活性を増大させる活性を有する。
試験管内でヒト白血病細胞Ｕ９３７を、これに殺細胞性抗癌剤であるＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて４時間処理した場合にはＵ９３７細胞のアポトーシスは観察されない。他方、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の５μｇ／ｍｌであらかじめＵ９３７細胞を処理した上で、ＴＮＦの１０ｎｇ／ｍｌでＵ９３７細胞を処理する場合には、４時間後に顕著なアポトーシスがＵ９３７細胞で観察される。
このアポトーシスは、アポトーシスに特徴的であるＤＮＡの段階的な分解（ｌａｄｄｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）をＢＢＲＣ．ｖｏｌ．２０９，９０７−９１５頁（１９９５）に用いられた方法で測定することにより確認した。ＴＮＦによる癌細胞アポトーシスに対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の増強活性は、ＴＮＦに代えてＴＮＦ様アポトーシス誘導物質（ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）を用いて試験した場合でも、全く同様に認められる。
また、ヒト子宮癌由来ＨｅＬａ細胞を、殺細胞性抗癌剤として用いられるアドリアマイシンで処理して試験管内でアポトーシスに導く際、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を同時に加えることによりＨｅＬａ細胞の生存細胞数を顕著に減少させることができる。すなわち、ＨｅＬａ細胞をアドリアマイシンの１μｇ／ｍｌで２４時間処理した場合の生存細胞数が１００％であるのに対し、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の５μｇ／ｍｌとアドリアマイシンの１μｇ／ｍｌとで同時にＨｅＬａ細胞を処理した場合では、生存細胞数は５０％にまで減少する。
これらの結果から明らかなように、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤のアポトーシス誘発作用を増強する活性を有し、このことで抗腫瘍剤または抗癌剤の抗腫瘍効果を増大させる。また、癌治療用に照射される放射線による癌細胞アポトーシスを同様に増強させる作用をＲＳ−Ｋ３５７４物質が有すると期待できる。従って抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用に照射される放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤として利用でき、癌治療において抗腫瘍剤または抗癌剤の治療効果を増強するための併用剤として、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は有用である。
Ｆ）ＲＳ−Ｋ３５７４物質のタンパク質生合成に対する阻害活性
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２２６巻、２１４−２２１頁（１９９６）で述べられる通り、既知物質パネポキシドンはタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれの生合成も阻害しない。本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質は細胞内のタンパク質生合成を顕著にかつ特異的に阻害する活性を有する。その阻害活性は、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の５０％阻害濃度が４．５μｇ／ｍｌである強さのものである。その阻害活性は次のように測定した。
すなわち、ヒト乳癌由来ＭＣＦ７細胞２×１０５を、血清含有培地を入れた２４穴プレートに撒き、２４時間培養した。血清を含まない培地に交換し、各種の濃度のＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加した。ここに、トリチウム標識したロイシンを１μＣｉ／ｍｌの濃度で加えた。さらに１時間培養すると、この間にロイシンが細胞に取りこまれ、細胞内でタンパク質の生合成が進む。そののち、培地を除去し、培養されたＭＣＦ７細胞に対して氷冷した１０％トリフルオロ酢酸水溶液を加えた。培養プレートを氷上で３０分間放置した後、氷冷した１０％トリフルオロ酢酸水溶液で２回洗浄した。この操作で細胞は破壊された。この洗浄後に、不溶性であったタンパク質を含む画分を集めて、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水で溶解し、得られた溶液の放射活性を測定した。
この得られた溶液の放射活性測定値は、細胞内で生合成されたタンパク質の生成量を指示するものである。添加されたＲＳ−Ｋ３５７４物質の１０μｇ／ｍｌの濃度の存在下にＭＣＦ７細胞を培養する上記の試験を行った場合には、放射活性の測定値は１８０ｃｐｍであった。これに比較して、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下でＭＣＦ７細胞を培養して対照試験を行った場合には、放射活性の測定値は７００ｃｐｍであった。これらの結果から、ＭＣＦ７細胞内のタンパク質生合成を５０％阻害するＲＳ−Ｋ３５７４物質の濃度（ＩＣ５０値）は４．５μｇ／ｍｌであると計算された。
Ｇ）ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害効果
生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を４μｇ／ｍｌの濃度で完全に阻害する活性を有する。この活性は以下のように判定した。
すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７の培養培地中に炎症性サイトカインとして作用するＴＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１（ＩＬ−１）を２ｎｇ／ｍｌの濃度で添加すると、約１時間後にＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化が観察される。このＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化は、その活性化に伴って発現するところの遺伝子であるＭＡＤ−３（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６５，１２８１−１２８９頁、１９９１）のｍＲＮＡが特異的に増加していることをＲＴ−ＰＣＲ法によって測定することで確認できる。この時、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を４μｇ／ｍｌの濃度で培養培地中にあらかじめ添加すると、遺伝子ＭＡＤ−３の発現は全く見られず、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を完全に阻害できた。この結果から、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は急性および慢性の炎症の惹起に必要であるＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を阻害する活性を有することが認められ、抗炎症剤として有用である。
さらに第２の本発明によれば、前記の式（Ｉ）で表される生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）を栄養培地に培養し、培養物から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を採取することを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造法が提供される。
第２の本発明の方法で使用できる生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産菌の一例として、ヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株がある。尚、本菌株は２００１年７月より約１０年以上前に、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）から分譲されたアラゲカワキタケ菌糸を、その分譲から以後約１０年間以上にわたりポテト・デキストロース・アガー培地上でタカラアグリ株式会社の研究所にて、継代培養された菌株である。本Ｋ−３５７４株は、前記継代中に変異しており、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されてあるアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）ＩＦＯ８９９４株に比べると生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産量が多く、また他の代謝物の組成も異なる。このことから、本Ｋ−３５７４株はＰａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ ＩＦＯ ８９９４株とは別異の菌株である。
アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１、中央第６に在る独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年６月２６日に寄託申請し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３９７として寄託を受理された。また、２００２年１２月２５日の移管受託日でブダペスト条約の規約下にアラゲカワキタケＫ−３５７４株はＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５の受託番号で前記の寄託所に寄託された。
なお、アラゲカワキタケは既知のキノコ（担子菌）であり、ほとんど世界中に分布して生えるが、日本ではブナ科の樹木に比較的普通に発生する。アラゲカワキタケのキノコ菌学的性状は次のとおりである。その子実体の傘は径１．５〜５ｃｍ、初めは饅頭形、後に開いてやや漏斗形となり、強じんな肉質〜やや革質、表面は粗い毛を密生し、初め褐紫色、ときにやや紫色を帯びる。縁はほぼ平坦であり、柄は一般に短く（０．５〜２ｃｍ）、偏心性〜中心性、まれに側性、表面はほぼ傘と同様である。胞子紋は白色である。胞子は４．５〜５．５×２〜２．５μｍ、挟楕円形であり、担子器は４胞子性である。厚膜シスチジアは５３〜７０×９．５〜１４μｍ、棍棒形〜円柱形、または紡錘形である。ｈｙｐｈａｌ ｐｅｇはない。肉組織の菌糸構成はｄｉｍｉｔｉｃである（「原色日本新菌類図鑑（１）」）３２頁、今関六也、本郷次雄、保育社、昭和６２年６月３０日発行）。
第２の本発明の方法を実施するに当たっては、ヒラタケ科カワキタケ属に属する生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産株として、前記のアラゲカワキタケＫ−３５７４株を栄養培地に接種し、培養する。ここで用いる栄養培地は、前記の生産株が資化できる炭素源と窒素源を栄養成分として含有するものである。
その培地の栄養源としては、担子菌株の栄養源として通常使用されるもの、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例えば、ぶどう糖、麦芽糖、糖蜜、デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源、ならびにペプトン、肉エキス、綿実粉、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、ＮＺ−アミン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源を使用でき、さらに燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無機塩が配合できる。必要により微量金属例えばコバルト、鉄などを添加することができる。栄養源としては、その他、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するのに、使用されるＲＳ−Ｋ３５７４生産菌株が利用しうるものであれば、いずれの公知の栄養源でも使用できる。
培地における上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、使用するＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株によって、最適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単な小規模実験により容易に決定することができる。また、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後で、培地のｐＨを５〜７の範囲、特にｐＨ５．５〜６．５の範囲に調節するのが有利である。
かかる栄養培地でのＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株の培養は、一般のキノコによる生理活性物質の製造において通常使用されている方法に準じて行なうことができる。通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常、攪拌しながら及び／又は通気しながら培養を行なうことができる。また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪拌をともなう液体培養のいずれも使用可能であるが、液体培養がＲＳ−Ｋ３５７４物質の大量生産に適している。
使用しうる培養温度はＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株の発育が実質的に阻害されず、該生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用する生産菌株に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは２５〜３０℃の範囲内の培養温度を使用することができる。培養は通常はＲＳ−Ｋ３５７４物質が十分に蓄積するまで継続することができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常１４〜３０日間の培養で目的のＲＳ−Ｋ３５７４物質を得ることができる。
培養中の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の蓄積量は、上記したユビキチン活性化酵素の阻害活性の測定方法によって定量することができる。
培養により得た培養物中に蓄積されたＲＳ−Ｋ３５７４物質は、これを培養物から採取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離などのそれ自体公知の分離方法によって菌体細胞を除去した後、その培養濾液を、有機溶媒、特に酢酸ブチルなどを用いた溶媒抽出や、吸着や、イオン交換能を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わせて処理することにより、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を単離し、さらに精製して採取することができる。吸着に用いる担体あるいはイオン交換能を有するクロマトグラフィーに用いる担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂もしくは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。かくして、前記した特性を有する新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４が得られる。
さらに、第３の本発明では、前記の式（Ｉ）で表わされる生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤が提供される。
さらにまた、第４の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤が提供される。
さらに、第５の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗腫瘍剤組成物が提供される。
さらに、第６の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗炎症剤組成物が提供される。
また、第７の本発明においては、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗ウィルス剤組成物が提供される。
第３の本発明によるユビキチン活性化酵素の阻害剤および第４の本発明による細胞内タンパク質のユビキチン化阻害剤は、それぞれＲＳ−Ｋ３５７４物質の単独から成ることができるものである。さらに、第５の本発明による抗腫瘍剤組成物、第６の本発明による抗炎症剤組成物ならびに第７の本発明による抗ウィルス剤組成物は、それぞれ、その有効成分であるＲＳ−Ｋ３５７４物質を、製薬学的に許容できる常用の固体または液体担体と混合してなる組成物の形であることができる。
さらに、第１の本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、抗リウマチ薬、抗悪疫質剤、免疫抑制または免疫活性化物質、抗痴ほう薬、抗心筋症薬、抗肥満薬または抗糖尿病薬としても利用できることが期待される。
さらに、第８の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤が提供される。第８の本発明に言われる殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤とは、ＴＮＦ、ＴＮＦ様アポトーシス誘導物質、アドリアマイシンおよびその他の臨床用抗癌剤を指す。
また、第９の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤が提供される。
さらに、第１０の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤が提供される。
なお、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０（界面活性剤）を含む水にＲＳ−Ｋ３５７４物質を溶解した水溶液を、マウス１匹あたり２ｍｇまたはそれ以上のＲＳ−Ｋ３５７４物質投与量でマウス（４週齢、メス、平均体重２１．６ｇ、１群５匹）に尾静脈から静脈注射したが、投与後の２週間目に全例が生存して異常が認められなかった。１ｍｇ〜５０００ｍｇの投与量でＲＳ−Ｋ３５７４物質をヒト成人（体重６０ｋｇ）に静脈内投与しても、急性毒性の所見はないと予想される。ヒトに対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の投与量は、治療すべき病気の種類、症状、その他の因子に応じて、専門家により予備試験を通じて適当な量に調整することができる。
本発明による抗腫瘍剤組成物、抗炎症剤組成物または抗ウイルス剤組成物のような医薬組成物においては、有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質を、製薬学的に許容できる常用の液状担体、例えばエタノール、含水エタノール、水、生理食塩水、もしくは固体担体、例えば結晶セルロース、でん粉等と混和してＲＳ−Ｋ３５７４物質を含有する組成物の形にすることができる。
本発明により医薬組成物で用いる有効成分であるＲＳ−Ｋ３５７４物質は、経口的に投与できる。あるいは静脈内または筋肉内または皮下内注射、もしくは腹腔内または直腸内投与などにより非経口的にも投与することができる。
経口投与用の場合には、本発明による医薬組成物では、有効成分としてＲＳ−Ｋ３５７４物質を、薬学的に許容できる慣用の固体または液体状の担体と混和して、その得られた混合物を散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤等の形で製剤とすることができる。
本発明による医薬組成物を注射用に製剤する場合には、望ましい注射製剤の形態には、有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む無菌の含水溶液あるいは無菌の凍結乾燥剤がある。注射製剤に用いる液体担体は例えば水、生理食塩水、エタノール、含水エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、植物油などであるのが好ましい。
本発明による前記の如き医薬組成物に配合される有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質の割合は、剤形によっても異なるが、例えば、有効成分の含量割合は、投与単位物の重量の約１〜９５％の範囲にあることができる。 The present inventors have developed a novel substance having an antitumor activity and an antiviral activity as well as an inhibitory activity of intracellular ubiquitin activating enzyme and an inhibitory activity of ubiquitination of intracellular proteins that can meet the above demands. For the purpose of providing, research on the development and practical application of useful bioactive substances has been promoted. As a result of the research, it was found that a strain of Aragekawa kawatake, which belongs to the genus Oyster mushroom, produces a physiologically active substance having a new structural skeleton. The novel physiologically active substance was successfully isolated and confirmed to have the following physicochemical properties and the steric chemical structure represented by the following formula (I), and the physiologically active substance RS-K3574 Named. Furthermore, it has been found that this novel physiologically active substance RS-K3574 has an inhibitory activity on ubiquitin activating enzyme and an inhibitory activity on ubiquitination of intracellular proteins, as well as antitumor activity, antiinflammatory activity and antiviral activity.
That is, in the first present invention, this RS-K3574 substance is represented by the following formula (I)
Next, the physicochemical properties of the physiologically active substance RS-K3574 of the first present invention will be described.
A) Appearance and properties: colorless viscous oily substance
B) Specific rotation [α]D 26-62.3 ° (c1.0, dichloromethane)
C) Rf value of TLC: 0.39
When measured by developing with a developing solvent consisting of chloroform-methanol (10: 1) by thin layer chromatography on silica gel (Art. 105715, manufactured by Merck)
D) FAB mass spectrum (m / z): 233 (M + Na)+
M+Is not observed, (M-18)+Was observed.
E) Molecular formula: C11H14O4
F) UV absorption spectrum
(I) The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol solution is shown in FIG. 1 of the accompanying drawings. The main peaks are as follows.
λmaxnm (ε): 209 (8300), 241 (5700)
(Ii) The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol-HCl solution is shown in FIG. 2 of the accompanying drawings. The main peaks are as follows.
λmaxnm (ε): 205 (14200), 240 (sh5500)
(Iii) The ultraviolet absorption spectrum measured in a methanol-NaOH solution is shown in FIG. 3 of the accompanying drawings. The main peaks are as follows.
λmaxnm (ε): 206 (16400), 240 (sh5300), 304 (2400)
G) Infrared absorption spectrum (KBr tablet method) is shown in FIG. 4 of the accompanying drawings. The main absorption bands are as follows.
νmax(Cm-1): 3300-3500, 2979, 2911, 1681, 1446, 1379, 1043, 995, 850, 817, 570
H)1The H-NMR spectrum (in deuterated chloroform / internal standard tetramethylsilane) is shown in FIG. 5 of the accompanying drawings.
Deuterated chloroform CDCl3Proton nuclear magnetic resonance of RS-K3574 material measured at 500 MHz in solution (using tetramethylsilane as internal standard)1(H-NMR) spectrum, δ value (ppm) is 3.47 (dd, J = 3.9 Hz, J = 1.0 Hz), 3.81 (ddd, J = 3.9 Hz, J = 1.2 Hz, J = 2.5 Hz), 4.69 (br s, J = 1.2 Hz, J = 5.0 Hz, J = 1.0 Hz), 6.71 (ddd, J = 5.0 Hz, J = 1.2 Hz) , J = 2.5 Hz), 5.29 (br d, J = 9.0 Hz, J = 1.2 Hz), 5.02 (dt, J = 9.0 Hz, J = 1.2 Hz, J = 1. 2 Hz), 1.72 (d, J = 1.2 Hz), and 1.72 (d, J = 1.2 Hz).
I)13The C-NMR spectrum (in deuterated chloroform / internal standard tetramethylsilane) is shown in FIG. 6 of the accompanying drawings.
Deuterated chloroform CDCl3Carbon-13 nuclear magnetic resonance of RS-K3574 material measured at 125 MHz in solution (using tetramethylsilane as internal standard) (13In the (C-NMR) spectrum, the δ value (ppm) is 194.6 (s), 53.9 (d), 63.2 (d), 137.8 (d), 139.0 (s), 65 .3 (s), 123.6 (d), 138.4 (s), 25.8 (q), and 18.4 (q).
Note that the three-dimensional chemical structure of the RS-K3574 substance of the present invention is as shown in the above formula (I), and that a certain derivative crystal from the RS-K3574 substance is analyzed by a powder X-ray diffraction method. It was confirmed by doing.
Formula (A) above
Furthermore, the biological properties of the physiologically active substance RS-K3574 of the present invention are described below.
A) Measurement of inhibitory activity of RS-K3574 substance on ubiquitin activating enzyme
The inhibitory activity of the physiologically active substance RS-K3574 on the ubiquitin activating enzyme according to the present invention has a strength to completely inhibit the ubiquitin activating enzyme at a concentration of 100 μg / ml or more of the RS-K3574 substance.
The inhibitory activity of RS-K3574 substance on ubiquitin activating enzyme is described in J. Org. Nat. Prod. 65, pp. 1491-1493 (2002). That is, a human-derived ubiquitin activating enzyme was expressed in Escherichia coli by a recombinant genetic engineering method, and a ubiquitin activating enzyme sample was prepared by collecting and purifying the ubiquitin activating enzyme from this E. coli. Biotinylated ubiquitin prepared by biotinylating bovine-derived ubiquitin was used as a substrate. The ubiquitin activating enzyme and the substrate were reacted with ATP (adenosine-5'-3 phosphate) in the presence or absence of the test RS-K3574 substance for 15 minutes at 37 ° C.
The obtained reaction solution was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and the enzyme protein bound to the biotinylated ubiquitin was adsorbed onto the polyvinylidene difluoride membrane by electroblotting. The amount of enzyme protein bound to biotinylated ubiquitin on this membrane was assayed using the ECL method (see “Chin. Chem.” Vol. 25, pages 1531 to 1546 (1979)). The amount of enzyme protein bound to biotinylated ubiquitin detected in the test group in which the enzyme reaction was performed in the presence of the RS-K3574 substance, and the control test group in which the enzyme reaction was performed in the absence of the RS-K3574 substance In comparison with the amount of enzyme protein bound to biotinylated ubiquitin detected in step 1, the degree to which the amount of ubiquitin-activating enzyme bound product bound to biotinylated ubiquitin is suppressed by the RS-K3574 substance was determined.
B) Measurement of inhibitory activity of RS-K3574 substance on ubiquitination of intracellular proteins
The inhibitory activity of the physiologically active substance RS-K3574 according to the present invention on intracellular protein ubiquitination is a strong inhibition that completely inhibits the production of ubiquitinated protein induced in the cell by RS-K3574 substance at a concentration of 2 μg / ml or more. Have
The production of ubiquitinated proteins in the cells was detected as follows. That is, RS-K3574 substance was added in advance at various concentrations in a medium containing human breast cancer cells MCF7. After 30 minutes from the addition, MG-132, which is an inhibitor against the proteasome in cancer cells, was added to the medium at a concentration of 1 μM (addition of MG-132 completely inhibited the proteasome, Ubiquitinated proteins to be degraded by the proteasome can accumulate in the cell). Thereafter, the cancer cells were cultivated in a medium for 3 hours, and then the cancer cells were solubilized. The obtained cell soluble fraction was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. The fractionated protein in the gel was adsorbed on a polyvinylidene difluoride membrane by electroblotting, and the adsorbed ubiquitinated protein on this membrane was selectively detected by reacting with an anti-ubiquitin antibody. . The ECL method (see “Clin. Chem.” Vol. 25, pages 1531 to 1546 (1979)) was used for detection.
Moreover, it tested similarly to the above, without adding RS-K3574 substance to the culture medium containing human breast cancer cell MCF7. When tested in the absence of RS-K3574 substance as in the latter control test, ubiquitinated protein accumulates, but the presence of RS-K3574 substance added to the medium described above When tested below, it was confirmed that the accumulation of ubiquitinated proteins was suppressed in the presence of RS-K3574 substance depending on its concentration. As is clear from this, the RS-K3574 substance is effective in suppressing the production of functional intracellular proteins having the property of being directly or indirectly controlled by being ubiquitinated in the cells. .
C) Inhibitory activity of RS-K3574 substance on cancer or tumor cell proliferation
The physiologically active substance RS-K3574 according to the present invention has an activity of suppressing the growth of cancer or tumor cells. The concentration of RS-K3574 that inhibits the growth of various cancer cells by 50% (IC50Value) was measured by the MTT method (see “Journal of Immunological Methods”, 65, 55-60 (1983)). The results are shown in Table 1 below.
D) Anticancer activity of RS-K3574 substance
The physiologically active substance RS-K3574 according to the present invention has anticancer activity. RS-K3574 substance has a life-prolonging effect on mice transplanted with, for example, Ehrlich ascites cancer. When RS-K3574 substance is administered to these cancer-bearing mice at a dose of 250 μg / mouse per day for 9 consecutive days, the life-prolonging effect reaches 200% compared to the case where RS-K3574 substance is not administered. This life-prolonging effect was determined as follows.
That is, 2 × 10 2 of Ehrlich cancer cells in 4 weeks old ICR mice.6Individuals were transplanted into the peritoneal cavity, and the next day, the physiologically active substance RS-K3574 was administered daily at a dose of 250 or 62.5 μg / animal per day for 9 days. In the non-administration group, ascites caused by Ehrlich cancer accumulated in the abdominal cavity and all cases died after about 2 weeks. Therefore, the survival effect was evaluated by the value of the quotient obtained by dividing the average survival days of the treatment group administered with the RS-K3574 substance by the average survival days of the non-administration group. In the group treated with the RS-K3574 substance, the accumulation of ascites was remarkably suppressed, and as a result, when administered for 9 days at a dose of 250 μg / mouse per day, a 200% life-prolonging effect was obtained, and 62.5 μg / mouse Even when administered at a dose of 9 days, a life-prolonging effect of 160% or more was observed.
As is clear from this result, the physiologically active substance RS-K3574 has an inhibitory effect on malignant transformation of cancer or tumor in the living body, and from this, it is useful as an antitumor agent, anticancer agent, or anti-ectotoxic agent. is there.
E) Enhancement effect of RS-K3574 substance on apoptosis sensitivity of cancer cells by cell killing antitumor agent or anticancer agent or cancer therapeutic radiation
The physiologically active substance RS-K3574 according to the present invention enhances the apoptosis-inducing effect that an antitumor agent, an anticancer agent, or cancer therapeutic radiation has on cancer cells, and is irradiated for antitumor agent, anticancer agent, or cancer treatment, For example, it has an activity to increase the antitumor activity or anticancer activity of γ-rays, X-rays and α-rays.
When human leukemia cells U937 and TNF (tumor necrosis factor), which is a cytocidal anticancer agent, are added at a concentration of 10 ng / ml and treated for 4 hours in vitro, no apoptosis of U937 cells is observed. On the other hand, when U937 cells are treated with 5 μg / ml of bioactive substance RS-K3574 in advance and then treated with 10 ng / ml of TNF, significant apoptosis is observed in U937 cells after 4 hours. .
This apoptosis is caused by the stepwise degradation of DNA, which is characteristic of apoptosis, by BBRC. vol. 209, pages 907-915 (1995). The enhancement activity of RS-K3574 substance against cancer cell apoptosis by TNF is observed in the same manner even when tested using a TNF-like apoptosis-inducing substance (TRAIL) instead of TNF.
In addition, when human uterine cancer-derived HeLa cells are treated with adriamycin used as a cytocidal anticancer agent to induce apoptosis in vitro, the RS-K3574 substance is simultaneously added to significantly reduce the number of viable HeLa cells. be able to. That is, when the HeLa cells were treated with 1 μg / ml of adriamycin for 24 hours, the number of viable cells was 100%, whereas the HeLa cells were treated simultaneously with 5 μg / ml of the RS-K3574 substance and 1 μg / ml of adriamycin. In that case, the number of viable cells is reduced to 50%.
As is clear from these results, the physiologically active substance RS-K3574 has an activity of enhancing the apoptosis-inducing action of a cell-killing antitumor agent or anticancer agent on cancer cells, and thus the antitumor agent or anticancer agent has an anti-tumor effect. Increase tumor effect. Moreover, it can be expected that the RS-K3574 substance has an effect of enhancing the apoptosis of cancer cells due to radiation irradiated for cancer treatment. Therefore, it can be used as an antitumor agent or an anticancer agent or an enhancer of cancer cell apoptosis-inducing action of radiation irradiated for cancer treatment, and as a combined agent for enhancing the therapeutic effect of the antitumor agent or anticancer agent in cancer treatment, RS- The K3574 material is useful.
F) Inhibitory activity of RS-K3574 substance on protein biosynthesis
As described in Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 226, pages 214-221 (1996), the known substance panepoxidone does not inhibit any biosynthesis of protein, RNA, or DNA. The RS-K3574 substance of the present invention has an activity to remarkably and specifically inhibit intracellular protein biosynthesis. The inhibitory activity is such that the 50% inhibitory concentration of RS-K3574 substance is 4.5 μg / ml. The inhibitory activity was measured as follows.
That is, human breast cancer-derived
The radioactivity measurement of the resulting solution indicates the amount of protein biosynthesized within the cell. When the above test for culturing MCF7 cells in the presence of 10 μg / ml concentration of added RS-K3574 substance was performed, the measured radioactivity was 180 cpm. In comparison, when MCF7 cells were cultured in the absence of RS-K3574 substance and a control test was conducted, the measured radioactivity was 700 cpm. From these results, the concentration of the RS-K3574 substance that inhibits protein biosynthesis in MCF7 cells by 50% (IC50Value) was calculated to be 4.5 μg / ml.
G) NF-KInhibitory effect of RS-K3574 substance on activation of B transcription factor
The physiologically active substance RS-K3574 is NF-KIt has the activity of completely inhibiting the activation of B transcription factor at a concentration of 4 μg / ml. This activity was determined as follows.
That is, when TNF acting as an inflammatory cytokine is added at a concentration of 10 ng / ml or Interleukin-1 (IL-1) at a concentration of 2 ng / ml in the culture medium of human breast cancer cell MCF7, NF is observed after about 1 hour.-KActivation of the B transcription factor is observed. This NF-KActivation of the B transcription factor indicates that the mRNA of MAD-3 (Cell, vol. 65, pages 1281-1289, 1991), which is a gene expressed along with the activation, is specifically increased. It can confirm by measuring by RT-PCR method. At this time, if the RS-K3574 substance was previously added to the culture medium at a concentration of 4 μg / ml, no expression of the gene MAD-3 was observed, and NF-KThe activation of the B transcription factor could be completely inhibited. From this result, the RS-K3574 substance is required for the induction of acute and chronic inflammation.-KIt is recognized as having an activity to inhibit the activation of B transcription factor, and is useful as an anti-inflammatory agent.
Furthermore, according to the second aspect of the present invention, there is an Arakawakawatake which produces the physiologically active substance RS-K3574 represented by the above formula (I) (Panus rudis) Is cultured in a nutrient medium, and the bioactive substance RS-K3574 is collected from the culture.
As an example of a bacterium that produces the physiologically active substance RS-K3574 that can be used in the method of the second present invention, the oyster mushroom genus Arakawakawatake (Panus rudis) There is K-3574 strain. In addition, about 10 years or more before July 2001, the present strain was obtained from the larva Kawatake mushroom mycelia, which was distributed from the Foundation for Fermentation Research (IFO), on the potato-dextrose agar medium for more than 10 years after the distribution. This strain has been subcultured at the laboratory of Takara Agri Corporation. This K-3574 strain has been mutated during the passage, and has been cultivated by Aragekawa Kitatake, which has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO).Panus rudis) Compared to the IFO 8994 strain, the production amount of the physiologically active substance RS-K3574 is large, and the composition of other metabolites is also different. Therefore, this K-3574 strainPanus rudis It is a strain different from the IFO 8994 strain.
Aragekawa Kitatake (Panus rudis) K-3574 shares were filed on June 26, 2001 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan. The deposit was accepted under the number FERM P-18397. Also, on the date of transfer consignment dated December 25, 2002, Aragekawa Kitatake K-3574 strain was deposited at the depository under the deposit number of FERM BP-8265 under the terms of the Budapest Treaty.
In addition, Aragekawa Kitatake is a known mushroom (basidiomycota) and grows almost all over the world, but in Japan it occurs relatively commonly in beech family trees. The mushroom mycological properties of Aragekawa Kitatake are as follows. The fruit body umbrella is 1.5 to 5 cm in diameter, initially in the shape of a bun, and later opened in a slightly funnel shape, with a strong flesh to a slight leather texture, the surface is dense with rough hair, initially brown purple, sometimes slightly purple Tinged. The edges are generally flat, the handle is generally short (0.5-2 cm), eccentric to central, rarely lateral, and the surface is similar to an umbrella. The spore pattern is white. The spore is 4.5 to 5.5 × 2 to 2.5 μm and has a sandwiched ellipse shape, and the basidiomy is tetraspore. The thick film cystidia is 53 to 70 × 9.5 to 14 μm, rod-shaped to cylindrical, or spindle-shaped. There is no hypha peg. The mycelial composition of the meat tissue is dimitic (“Primary Color Japanese New Fungi Encyclopedia (1)”), p. 32, Rokuya Imanoseki, Tsuguo Hongo, Yoikusha, published June 30, 1987).
In carrying out the second method of the present invention, the above-mentioned Aragekawa Kitatake K-3574 strain is inoculated into a nutrient medium as a production strain of the physiologically active substance RS-K3574 belonging to the genus Kawataketake genus. The nutrient medium used here contains a carbon source and a nitrogen source that can be assimilated by the production strain as nutrient components.
As a nutrient source of the culture medium, those commonly used as a nutrient source for basidiomycetes strains, for example, a assimilable nutrient source such as a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic salt can be used. For example, carbohydrates such as glucose, maltose, molasses, dextrin, glycerin and starch, and carbon sources such as oils and fats such as soybean oil and peanut oil, as well as peptone, meat extract, cottonseed powder, soybean powder, yeast extract, casein, corn -Nitrogen sources such as sweep liquor, NZ-amine, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium chloride can be used, and inorganic salts such as dipotassium phosphate, sodium phosphate, sodium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, and manganese chloride can be blended. If necessary, trace metals such as cobalt and iron can be added. As the nutrient source, any known nutrient source can be used as long as it can be used by the RS-K3574 producing strain used to produce the physiologically active substance RS-K3574.
The mixing ratio of the nutrient sources as described above in the medium is not particularly limited and can be varied over a wide range. The optimum nutrient composition and mixing ratio depends on the RS-K3574 substance-producing strain used. If so, it can be easily determined by a simple small-scale experiment. Further, the nutrient medium comprising the above nutrient sources can be sterilized prior to culturing, and before or after this sterilization, the pH of the medium is in the range of 5 to 7, particularly in the range of pH 5.5 to 6.5. It is advantageous to adjust.
The cultivation of the RS-K3574 substance-producing strain in such a nutrient medium can be performed according to a method usually used in the production of a physiologically active substance by a general mushroom. Usually, it is preferable to culture under aerobic conditions, and the culture can usually be performed with stirring and / or aeration. As the culture method, any of stationary culture, shaking culture, and liquid culture with aeration and stirring can be used, but liquid culture is suitable for mass production of the RS-K3574 substance.
The culture temperature that can be used is not particularly limited as long as the growth of the RS-K3574 substance-producing strain is not substantially inhibited and the physiologically active substance RS-K3574 can be produced. The culture temperature in the range of 25-30 ° C. can be used particularly preferably. Incubation can usually be continued until the RS-K3574 substance has accumulated sufficiently. The culture time varies depending on the composition of the medium, the culture temperature, the use temperature, the production strain used, etc., but the desired RS-K3574 substance can usually be obtained by culturing for 14 to 30 days.
The accumulated amount of the physiologically active substance RS-K3574 in culture can be quantified by the method for measuring the inhibitory activity of the ubiquitin activating enzyme described above.
The RS-K3574 substance accumulated in the culture obtained by culturing is collected from the culture. After culturing, if necessary, cells are removed by a known separation method such as filtration or centrifugation, and then the culture filtrate is extracted with an organic solvent, particularly butyl acetate, adsorbed, or ionized. The RS-K3574 substance can be isolated, further purified and collected by treating the chromatography using exchange capacity, gel filtration, or chromatography using countercurrent distribution alone or in combination. As the carrier used for adsorption or the carrier used for chromatography having ion exchange ability, activated carbon, silica gel, porous polystyrene-divinylbenzene resin, or various ion exchange resins can be used. Thus, a novel physiologically active substance RS-K3574 having the above-described characteristics is obtained.
Furthermore, in 3rd this invention, the inhibitor of the ubiquitin activating enzyme which consists of bioactive substance RS-K3574 represented by said Formula (I) is provided.
Furthermore, in the fourth aspect of the present invention, there is provided an inhibitor of intracellular protein ubiquitination, which comprises the above-mentioned physiologically active substance RS-K3574.
Furthermore, in the fifth aspect of the present invention, there is provided an antitumor agent composition comprising the physiologically active substance RS-K3574 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier mixed therewith.
Furthermore, in the sixth aspect of the present invention, there is provided an anti-inflammatory agent composition comprising the physiologically active substance RS-K3574 as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier mixed therewith.
The seventh aspect of the present invention provides an antiviral composition containing the physiologically active substance RS-K3574 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier mixed therewith.
The inhibitor of ubiquitin activating enzyme according to the third aspect of the present invention and the inhibitor of intracellular protein ubiquitination according to the fourth aspect of the present invention can each consist of RS-K3574 substance alone. Furthermore, the antitumor agent composition according to the fifth invention, the anti-inflammatory agent composition according to the sixth invention and the antiviral agent composition according to the seventh invention are each an RS-K3574 substance which is an active ingredient thereof. Can be in the form of a composition mixed with a conventional pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier.
Furthermore, the physiologically active substance RS-K3574 of the first present invention is used as an anti-rheumatic drug, an anti-pesticide, an immunosuppressive or immune activator, an anti-dementia drug, an anti-cardiomyopathy drug, an anti-obesity drug or an anti-diabetic drug. Is also expected to be available.
Furthermore, in the eighth aspect of the present invention, there is provided an agent for enhancing cancer cell apoptosis-inducing action of a cell-killing antitumor agent or anticancer agent or cancer therapeutic radiation for cancer cells, comprising a physiologically active substance RS-K3574. The cell-killing antitumor agent or anticancer agent referred to in the eighth invention refers to TNF, TNF-like apoptosis inducer, adriamycin and other clinical anticancer agents.
In the ninth aspect of the present invention, there is provided an inhibitor of protein biosynthesis in cancer cells, comprising the physiologically active substance RS-K3574.
Furthermore, in the tenth aspect of the present invention, NF- consisting of a physiologically active substance RS-K3574KInhibitors for activation of the B transcription factor are provided.
An aqueous solution in which RS-K3574 substance is dissolved in water containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 0.5% Tween 80 (surfactant) is used at a dose of 2 mg or more of RS-K3574 substance per mouse. Mice (4 weeks old, female, average body weight 21.6 g, 5 mice per group) were intravenously injected from the tail vein, but all cases survived and no abnormality was observed 2 weeks after administration. Even if the RS-K3574 substance is intravenously administered to a human adult (body weight 60 kg) at a dose of 1 mg to 5000 mg, no evidence of acute toxicity is expected. The dose of RS-K3574 substance for humans can be adjusted to an appropriate amount by a specialist through preliminary tests depending on the type of disease to be treated, symptoms and other factors.
In a pharmaceutical composition such as an antitumor agent composition, anti-inflammatory agent composition or antiviral agent composition according to the present invention, RS-K3574 substance as an active ingredient is used as a pharmaceutically acceptable conventional liquid carrier, For example, it can be in the form of a composition containing RS-K3574 substance mixed with ethanol, hydrous ethanol, water, physiological saline, or a solid carrier such as crystalline cellulose, starch and the like.
The RS-K3574 substance, which is an active ingredient used in the pharmaceutical composition according to the present invention, can be administered orally. Alternatively, it can be administered parenterally by intravenous, intramuscular or subcutaneous injection, or intraperitoneal or rectal administration.
In the case of oral administration, in the pharmaceutical composition according to the present invention, the RS-K3574 substance is mixed as an active ingredient with a conventional pharmaceutically acceptable solid or liquid carrier, and the resulting mixture is powdered. , Tablets, capsules, suspensions, syrups and the like.
When the pharmaceutical composition according to the present invention is formulated for injection, a desirable injectable form includes a sterile aqueous solution or a sterile lyophilizing agent containing RS-K3574 substance as an active ingredient. The liquid carrier used for the injection preparation is preferably water, physiological saline, ethanol, hydrous ethanol, glycerol, propylene glycol, vegetable oil or the like.
The ratio of the RS-K3574 substance as an active ingredient to be blended in the pharmaceutical composition as described above according to the present invention varies depending on the dosage form. For example, the content ratio of the active ingredient is about 1 to about the weight of the dosage unit It can be in the range of 95%.
第１図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
第２図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール−ＨＣｌ溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
第３図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中−ＮａＯＨの紫外線吸収スペクトルである。
第４図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
第５図はＲＳ−Ｋ３５７４物質の重クロロホルム溶液（内部標準：テトラメチルシラン）にて５００ＭＨｚで測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
第６図はＲＳ−Ｋ３５７４物質の重クロロホルム溶液（内部標準：テトラメチルシラン）にて１２５ＭＨｚで測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルである。FIG. 1 is an ultraviolet absorption spectrum in a methanol solution of RS-K3574 substance.
FIG. 2 is an ultraviolet absorption spectrum of RS-K3574 substance in methanol-HCl solution.
FIG. 3 is an ultraviolet absorption spectrum of —NaOH in a methanol solution of RS-K3574 substance.
FIG. 4 is an infrared absorption spectrum of RS-K3574 substance measured by the KBr tablet method.
FIG. 5 is a proton nuclear magnetic resonance spectrum measured at 500 MHz with a deuterated chloroform solution of RS-K3574 substance (internal standard: tetramethylsilane).
FIG. 6 is a carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum measured at 125 MHz with a deuterated chloroform solution of RS-K3574 substance (internal standard: tetramethylsilane).
次に実施例により、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造例を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１ 生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造
グルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％、を含む液体培地（ｐＨ無調整）を振盪フラスコ（５００ｍｌ容）に２００ｍｌずつ分注し、常法により１２０℃で２０分滅菌した。滅菌された該液体培地に対して、寒天斜面培地に培養したヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５）の菌糸を接種した。その後に、液体培地中で、２７℃で３日間静置培養した。その後に、２７℃で２日間にわたり回転攪拌下に培養した。ここで得た培養液を種母培養液として次に用いた。
グルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％、を含む液体培地（ｐＨ無調整）を振盤フラスコ（５００ｍｌ容）に２００ｍｌずつ分注し、常法により１２０℃で２０分間滅菌した。その後、滅菌された液体培地に、上記で得た種母培養液をそれぞれ７ｍｌずつ接種し、２７℃で１５日間静置培養した。
このようにして得られた培養液１０Ｌ（リットル）をろ過し、培養ろ液を分離した。培養ろ液を酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチル層を減圧下に濃縮乾固した。得られた残渣をクロロホルムに溶かした溶液を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（８０ｇ）に付し、クロロホルム−メタノール（１００：０〜５０：１、容量比）、により段階的に溶出した。クロロホルム−メタノール（２００：１〜１００：１）で溶出された画分にＲＳ−Ｋ３５７４物質が含まれた。ＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む画分を集めて濃縮乾固して粗精製物１．１７ｇを得た。この粗精製物を、さらにクロロホルム−メタノール−水（５：６：４）からなる液相を用いた上昇法による液々遠心分配クロマトグラフィー（２５０ｍＬ容）に付し、溶出液を１０ｍｌ−画分で集めて、それによって不要な成分と所要な成分とを分離した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む画分は１０ｍｌづつ分画した時に、２４〜２７番目の画分として得られた。これら活性画分を、減圧下で濃縮乾固して、本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質の精製品の７１６ｍｇを得た。Next, production examples of the physiologically active substance RS-K3574 of the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to the following examples.
Including production of glucose 1% Example 1 bioactive substance RS-K3574, 0.5% of polypeptone, 0.3% yeast extract, KH 2 PO 4 0.3%, MgSO 4 · 7H 2 O 0.1%, the The liquid medium (pH unadjusted) was dispensed in 200 ml portions into a shake flask (500 ml volume), and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes by a conventional method. The sterilized liquid medium was inoculated with hyphae of Panus rudis K-3574 strain (FERM BP-8265) cultured on an agar slant medium. Thereafter, the cells were statically cultured at 27 ° C. for 3 days in a liquid medium. Thereafter, the cells were cultured at 27 ° C. for 2 days under rotary stirring. The culture solution obtained here was then used as a seed culture solution.
A shaker flask containing a liquid medium (pH unadjusted) containing 1% glucose, 0.5% polypeptone, 0.3% yeast extract, 0.3% KH 2 PO 4 , 0.1% MgSO 4 .7H 2 O 200 ml each was dispensed (500 ml volume) and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes by a conventional method. Thereafter, 7 ml each of the seed mother culture solution obtained above was inoculated into a sterilized liquid medium, followed by stationary culture at 27 ° C. for 15 days.
10 L (liter) of the culture solution thus obtained was filtered to separate the culture filtrate. The culture filtrate was extracted with ethyl acetate, and the ethyl acetate layer was concentrated to dryness under reduced pressure. A solution obtained by dissolving the obtained residue in chloroform was subjected to silica gel column chromatography (80 g) and eluted stepwise with chloroform-methanol (100: 0 to 50: 1, volume ratio). The fraction eluted with chloroform-methanol (200: 1 to 100: 1) contained RS-K3574 material. Fractions containing the RS-K3574 substance were collected and concentrated to dryness to give 1.17 g of crude product. This crude product was further subjected to liquid-liquid centrifugal partition chromatography (250 mL volume) by an ascending method using a liquid phase consisting of chloroform-methanol-water (5: 6: 4). To separate unwanted and required components. The fraction containing RS-K3574 substance was obtained as the 24th to 27th fractions when fractionated in increments of 10 ml. These active fractions were concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 716 mg of a purified product of the RS-K3574 substance of the present invention.
前記に説明したとおり、本発明によって新規な生理活性物質、ＲＳ−Ｋ３５７４物質が提供された。このＲＳ−Ｋ３５７４物質は、癌細胞または免疫細胞の細胞増殖またはアポトーシス、あるいは炎症の生起に関与するところの、細胞内酵素であるユビキチン活性化酵素を阻害する活性をもつのみならず、抗腫瘍活性、抗癌活性および抗炎症活性をもち、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を示す。本発明によるＲＳ−Ｋ３５７４物質は、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗炎症剤あるいは抗ウイルス剤として有用である。 As described above, the present invention provides a novel physiologically active substance, RS-K3574 substance. This RS-K3574 substance not only has an activity of inhibiting ubiquitin activating enzyme, which is an intracellular enzyme involved in cell proliferation or apoptosis of cancer cells or immune cells, or the occurrence of inflammation, but also has antitumor activity. It has an anti-cancer activity and an anti-inflammatory activity, and also exhibits an activity of inhibiting intracellular protein biosynthesis. The RS-K3574 substance according to the present invention is useful as an antitumor agent, anticancer agent, anti-inflammatory agent or antiviral agent.
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