JPWO2004063748A1 - Screening method of agonist or antagonist for thyroxine receptor - Google Patents

Abstract

Contacting GPCR-T4, a salt thereof, a cell expressing GPCR-T4, or a membrane fraction of the cell with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole, compound I and compound II, and a test substance, By measuring the amount of ligand bound to GPCR-T4 or the degree of activation of GPCR-T4 and comparing it with the case where the test substance was not contacted, an agonist or antagonist of GPCR-T4 was obtained. You can get it. GPCR-T4 agonist or antagonist, or a substance that increases or decreases the expression level of GPCR-T4 gene, controls thyroid function, activates or suppresses neutrophils, prevents or treats inflammatory diseases It can be used for prevention or treatment of asthma, prevention or treatment of chronic obstructive pulmonary disease, prevention or treatment of infectious disease.

Description

  The present invention relates to a method for screening an agonist or antagonist for a G protein-coupled receptor that reacts with thyroxine, a method for screening a substance that increases or decreases the expression of the receptor gene, and a thyroid function containing these substances as active ingredients. Control agent, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases, prophylactic or therapeutic agent for asthma, prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease, or preventive of infectious diseases Or relates to a therapeutic agent.

As thyroid hormones, thyroxine (3,5,3 ', 5'-tetraiodo-1-thyronine: hereinafter abbreviated as T4) and triiodothyronine (3,5,3'-triiodo-1-thyronine: hereinafter abbreviated as T3). )It has been known. T3 and T4 exert various physiological activities by binding to thyroid hormone receptors existing in the nucleus. This activity is more than 10 times stronger in T3 than in T4. Since the expression of physiological activity through the thyroid hormone receptor present in the nucleus involves the regulation of the expression of various genes, it takes several hours or more for the action to be exerted.
On the other hand, there are reports suggesting that another receptor for T3 or T4 exists [Am. J. et al. Physiol. , Cell Physiol. , 276 , C1014 (1999)]. When HeLa cells without functional thyroid hormone receptors are stimulated with T4, phosphorylation of tyrosine residues of mitogen activated protein kinase (hereinafter abbreviated as MAPK) peaked at 30 minutes after stimulation. And the transition into the nucleus occurs. This activity is stronger in T4 than in T3. The T4 degradation product 3,3 ′, 5′-triiodo-1-thyronine, which has no activity on the thyroid hormone receptor, also has this activity. 3,5,3 ′, 5′-tetraiodothyroacetic acid inhibited the activity of T4. T4-agarose also showed the same activity as T4, suggesting that T4 acts on a cell surface receptor. From the above results, it was shown that an unknown receptor for T4 exists on the cell surface of HeLa cells, and T4 activates MAPK via the receptor. When HeLa cells are treated with GTP derivative guanosine 5′-O-3-thiotriphosphate (hereinafter referred to as GTPγS) or pertussis toxin, activation of MAPK is not observed. G protein-coupled receptors coupled with G _i was assumed to be (hereinafter referred to as GPCR). However, the GPCR has not been isolated. When HeLa cells are treated with interferon γ (hereinafter abbreviated as IFN-γ) and T4, the antiviral activity of IFN-γ is enhanced, and this enhancement requires activation of MAPK and phosphorylation of STAT1α by MAPK Met. When HeLa cells were treated with IFN-γ, the amount of HLA-DR mRNA, the amount of class II transactivator mRNA, and the amount of HLA-DR protein increased, but T4 enhanced the action of IFN-γ. From the above results, it is shown that an unknown receptor for T4 exists on the cell surface of HeLa cells, and T4 enhances the action of IFN-γ by activating MAPK via the receptor. It was done.
In addition, it is presumed that the action is caused by the binding of T3 or T4 to the cell membrane. Inactivation of the myocardial Na ⁺ channel, enhancement of erythrocyte and myocardial Ca ²⁺ -ATPase activity, enhancement of thyroid glucose uptake [Thyroid, 6 , 497 (1996)], but the binding molecule on the cell membrane has not been isolated.
GPCRs having an amino acid sequence that is 99% identical to the T4 receptor isolated in the course of the present invention are known [WO 01/42287; WO 02/26825; FEBS Lett. 531 , 407-414 (2002)], these documents do not describe that the GPCR acts as a receptor for T4. Nor is it described whether the GPCR exhibits constitutive activation in the absence of ligand.

（式（ＩＩ）中、ｎは６または７である）
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該リガンドの該ポリペプチドへの結合量を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該リガンドの該ポリペプチドへの結合量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの活性化の程度と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法。
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの活性化の程度と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
（５）ポリペプチドの活性化の程度を以下の（ａ）〜（ｃ）を指標にして測定する（３）または（４）に記載のスクリーニング法。
（ａ）グアノシン５’−Ｏ−３−チオトリフォスフェート（ＧＴＰγＳ）のＧ蛋白質への結合量
（ｂ）Ｇ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性
（ｃ）細胞の応答の程度
（６）以下の（ａ）および（ｂ）を構成成分として含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の細胞膜画分
（ｂ）（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンド
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの構成活性を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの構成活性と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはインバースアゴニストのスクリーニング法。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの構成活性を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの構成活性と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
（９）ポリペプチドの構成活性を以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを指標にして測定することを特徴とする、（７）または（８）に記載のスクリーニング法。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧ蛋白質への結合量
（ｂ）Ｇ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性
（ｃ）細胞の応答の程度
（１０）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドを接触させ、細胞の応答を測定することを特徴とする、該ポリペプチドの機能解析法。
（１１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１２）サイロキシン、サイロキシンの誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１３）イソコナゾール、イソコナゾールの誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
（１４）アゴニストまたはアンタゴニストが（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、該化合物の誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩である、（１１）に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１５）アゴニストまたはアンタゴニストが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体である、（１１）に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１６）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含有する形質転換体と試験物質とを接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定し、試験物質を接触させなかった場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質のスクリーニング方法。
（１７）プロモーター領域が、配列番号３で表される塩基配列の連続する５０〜５０００塩基からなる塩基配列を有するＤＮＡである、（１６）に記載のスクリーニング方法。
（１８）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加または減少させる物質を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１９）遺伝子の発現量を減少させる物質が、配列番号２で表される塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基と相補的な塩基配列もしくは実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または配列番号２で表される塩基配列から選ばれる連続した１９〜２５塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである、（１８）に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（２０）被検者の組織または細胞における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の転写量を測定し、健常者の組織または細胞における該遺伝子の転写量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２１）被検者の組織または細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドの量を測定し、健常者の組織または細胞における該ポリペプチドの量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２２）被検者の組織または細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２４） ２４． 配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウト非ヒト動物を作製し、該動物に試験物質を投与してその症状を観察し、投与しなかった場合の症状と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物Ｉといい、式（ＩＩ）で表される化合物を化合物ＩＩという。化合物ＩＩのうちｎ＝６の化合物を化合物ＩＩａといい、ｎ＝７の化合物を化合物ＩＩｂという。In the present invention, “ligand” means a substance that specifically binds to a receptor. “Agonist” means a substance that specifically binds to a receptor and as a result activates the receptor. “Receptor activation” refers to the promotion of GTP binding to the α subunit of the coupled G protein, the dissociation of the α and βγ subunits, and the dissociated subunits through structural changes in the receptor. It means that it becomes possible to cause signal transmission. “Antagonist” means a substance that specifically binds to a receptor and inhibits the activation of the receptor caused by an agonist. “Antagonists” include “inverse agonists” that inhibit receptor constitutive activity and “neutral antagonists” that do not inhibit receptor constitutive activity. “Constitutive activity GPCR” means a GPCR that can be activated to cause signal information transmission even in the absence of an agonist, and the activity that can cause signal information transmission in the absence of an agonist is referred to as “constitutive activity”. Call.
The object of the present invention is to provide the following (1) to (3). (1) Screening method of agonist or antagonist for GPCR (GPCR-T4) that reacts with T4. (2) A screening method for substances that increase or decrease the expression level of the GPCR-T4 gene. (3) A thyroid function regulator, neutrophil activation promoter or activity containing as an active ingredient an agonist or antagonist for GPCR-T4, or a substance that increases or decreases the expression level of the GPCR-T4 gene Inhibitor, agent for preventing or treating inflammatory diseases, agent for preventing or treating asthma, agent for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease, agent for preventing or treating infectious diseases.
The present invention relates to the following (1) to (24).
(1) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and thyroxine; A polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of isconazole and a compound represented by the following formula (I) or formula (II), a salt of the polypeptide, a cell expressing the polypeptide, or the A membrane fraction of cells, and (i) thyroxine, (ii) isconazole, (iii) a compound represented by the following formula (I) or (II), (iv) (i) to (iii) A derivative selected from the group consisting of a compound that binds to the polypeptide, and a pharmacologically acceptable salt of the compound of (v) (i) to (iv) And the test substance is contacted, the amount of the ligand bound to the polypeptide is measured, and compared with the amount of the ligand bound to the polypeptide when the test substance is not contacted A screening method for agonists or antagonists to the polypeptide.

(In the formula (II), n is 6 or 7)
(2) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and thyroxine, A polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of isconazole and a compound represented by formula (I) or formula (II) of (1), a salt of the polypeptide, a cell expressing the polypeptide, Alternatively, the membrane fraction of the cell and (i) thyroxine, (ii) isconazole, (iii) the compound represented by formula (I) or (II) in (1), (iv) (i) to (iii) And a compound that binds to the polypeptide, and (v) a pharmacologically acceptable salt of the compound of (iv). Contacting a ligand and a test substance, measuring the binding amount of the ligand to the polypeptide, and comparing with the binding amount of the ligand to the polypeptide when the test substance is not contacted , Thyroid function control action, neutrophil activation promotion action or activation suppression action, inflammatory disease prevention or treatment action, asthma prevention or treatment action, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment action, or infection Screening for substances having preventive or therapeutic effects on sexually transmitted diseases.
(3) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a thyroxine, A polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of isconazole and a compound represented by formula (I) or (II) of (1), a salt of the polypeptide, a cell expressing the polypeptide, Alternatively, the membrane fraction of the cell and (i) thyroxine, (ii) isconazole, (iii) the compound represented by formula (I) or (II) in (1), (iv) (i) to (iii) ) A compound that binds to the polypeptide and (v) a pharmacologically acceptable salt of the compound of (iv). The polypeptide and a test substance are contacted, the degree of activation of the polypeptide is measured, and compared with the degree of activation of the polypeptide when the test substance is not contacted, A screening method for agonists or antagonists to peptides.
(4) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and thyroxine, A cell expressing a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of isconazole and a compound represented by formula (I) or (II) of (1), or a membrane fraction of the cell; (I) thyroxine, (ii) isconazole, (iii) a compound represented by formula (I) or (II) in (1), (iv) a derivative of a compound of (i) to (iii), wherein the polypeptide And a compound selected from the group consisting of (v) (i) to (iv) and a pharmacologically acceptable salt thereof, and a test substance. Measuring the degree of activation of the polypeptide and comparing it with the degree of activation of the polypeptide when the test substance is not contacted, thyroid function control action, neutrophil activity Screening for substances that have the action of promoting or suppressing activation, the action of preventing or treating inflammatory diseases, the action of preventing or treating asthma, the action of preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease, or the action of preventing or treating infectious diseases Law.
(5) The screening method according to (3) or (4), wherein the degree of activation of the polypeptide is measured using the following (a) to (c) as indicators.
(A) Binding amount of guanosine 5′-O-3-thiotriphosphate (GTPγS) to G protein (b) GTPase activity of G protein (c) Degree of cellular response (6) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing (b) as a constituent, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 For screening an agonist or antagonist for a polypeptide having and having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isconazole and the compound represented by formula (I) or (II) described in (1) kit.
(A) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and thyroxine; A polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of isconazole and a compound represented by formula (I) or (II) described in (1), a cell expressing the polypeptide, or a cell membrane of the cell Fraction (b) (i) Thyroxine, (ii) Isoconazole, (iii) Compound represented by formula (I) or (II) in (1), (iv) (i) to (iii) Riga selected from the group consisting of a compound which is a derivative and binds to the polypeptide, and a pharmacologically acceptable salt of the compound of (v) (i) to (iv) (7) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and thyroxine A cell expressing a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of isoconazole and a compound represented by formula (I) or formula (II) described in (1), or a membrane fraction of the cell; An agonist or inverse agonist for the polypeptide, comprising contacting with a test substance, measuring the constituent activity of the polypeptide, and comparing with the constituent activity of the polypeptide when the test substance is not contacted Screening method.
(8) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having one or more amino acid sequences deleted, substituted or added, and thyroxine; A cell expressing a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of isconazole and a compound represented by formula (I) or formula (II) described in (1), or a membrane fraction and test of the cell A thyroid function-controlling action, characterized in that the constitutive activity of the neutrophil is characterized by comparing with the constitutive activity of the polypeptide when the substance is contacted, the constituent activity of the polypeptide is measured, and the test substance is not contacted Activation promoting action or activation inhibiting action, prevention or treatment action for inflammatory diseases, prevention or treatment action for asthma, prevention or treatment for chronic obstructive pulmonary disease Or screening method of a substance having a prophylactic or therapeutic effect of infectious diseases.
(9) The screening according to (7) or (8), wherein the constituent activity of the polypeptide is measured using at least one selected from the group consisting of the following (a) to (c) as an index: Law.
(A) GTPγS binding amount to G protein (b) GTPase activity of G protein (c) Degree of cellular response (10) Polypeptide having amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or amino acid sequence of the polypeptide In the group consisting of thyroxine, isoconazole and a compound represented by formula (I) or formula (II) described in (1) having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in A cell expressing a polypeptide having an activity to react with a selected ligand, and (i) thyroxine, (ii) isconazole, (iii) a compound represented by formula (I) or (II) in (1), iv) Derivatives of the compounds of (i) to (iii), which bind to the polypeptide, and (v) pharmacology of the compounds of (i) to (iv) To contacting the acceptable ligand selected from the group consisting of salt, and measuring the response of cells, function analysis of the polypeptide.
(11) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and ( A regulator of thyroid function comprising, as an active ingredient, an agonist or antagonist for a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of compounds represented by formula (I) or formula (II) according to 1) , Neutrophil activation promoter or inhibitor, inflammatory disease prevention or treatment agent, asthma prevention or treatment agent, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment agent, or infectious disease prevention or treatment Agent.
(12) Thyroxine, a thyroxine derivative or any pharmacologically acceptable salt as an active ingredient, an activation promoter or activation inhibitor for neutrophils, a prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases, Agents for preventing or treating asthma, agents for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease, or agents for preventing or treating infectious diseases.
(13) A thyroid function regulator, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, containing isoconazole, a derivative of isoconazole or any pharmacologically acceptable salt as an active ingredient, inflammatory disease Preventive or therapeutic agent for asthma, or preventive or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease.
(14) The agonist or antagonist is the compound represented by the formula (I) or the formula (II) according to (1), a derivative of the compound, or any pharmacologically acceptable salt thereof (11) Thyroid function regulators, neutrophil activation promoters or activation inhibitors, preventive or therapeutic agents for inflammatory diseases, preventive or therapeutic agents for asthma, preventive or therapeutic agents for chronic obstructive pulmonary disease, Alternatively, a preventive or therapeutic agent for infectious diseases.
(15) The agonist or antagonist has a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and An antibody that specifically binds to a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and the compound represented by formula (I) or formula (II) described in (1). 11) The thyroid function regulator, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, inflammatory disease prevention or treatment agent, asthma prevention or treatment agent, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment according to 11) Agent, or preventive or therapeutic agent for infectious diseases.
(16) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and ( A reporter gene is linked downstream of the promoter region of a chromosomal gene encoding a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of compounds represented by formula (I) or formula (II) described in 1) Characterized by contacting a transformant containing the DNA with a test substance, measuring the expression level of the reporter gene, and comparing the expression level of the reporter gene when the test substance is not contacted. Screening for substances that increase or decrease the expression level of genes encoding peptides Law.
(17) The screening method according to (16), wherein the promoter region is DNA having a base sequence consisting of 50 to 5000 bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(18) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and ( A substance that increases or decreases the expression level of a gene encoding a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of compounds represented by formula (I) or formula (II) according to 1) Thyroid function control agent, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, preventive or therapeutic agent for inflammatory disease, preventive or therapeutic agent for asthma, preventive or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease Or preventive or therapeutic agents for infectious diseases.
(19) An oligonucleotide in which the substance that decreases the gene expression level has a base sequence that is complementary or substantially complementary to a continuous 5 to 60 bases selected from the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or a thyroid function regulator according to (18), which is an oligonucleotide comprising a sequence of 19 to 25 consecutive bases selected from the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a sequence complementary thereto Neutrophil activation promoter or activation inhibitor, inflammatory disease prevention or treatment agent, asthma prevention or treatment agent, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment agent, or infectious disease prevention or treatment agent.
(20) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the tissue or cell of a subject or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide And a transcription amount of a gene encoding a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and the compound represented by formula (I) or (II) described in (1) Measuring and comparing the amount of transcription of the gene in tissues or cells of healthy individuals, abnormal thyroid function, abnormal neutrophil activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, Alternatively, a method for determining an abnormality in the defense ability against infection.
(21) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide in the tissue or cell of the subject The amount of a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and a compound represented by formula (I) or (II) described in (1) Abnormal thyroid function, abnormal neutrophil activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or ability to protect against infection, characterized by comparison with the amount of the polypeptide in a person's tissue or cell How to judge abnormalities.
(22) One or more amino acids have been deleted, substituted or added in the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the tissue or cell of the subject A gene encoding a polypeptide having an amino acid sequence and having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and the compound represented by formula (I) or (II) described in (1) A method for determining abnormal thyroid function, abnormal neutrophil activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or abnormal protective ability, characterized by detecting a mutation in
(23) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, a sequence of 5 to 60 bases consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or represented by SEQ ID NO: 2 Oligonucleotide having a base sequence consisting of 5 to 60 consecutive base sequences complementary to the base sequence to be prepared, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 In the group consisting of thyroxine, isoconazole and a compound represented by formula (I) or formula (II) described in (1) having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in An abnormality in thyroid function, comprising an antibody that specifically binds to a polypeptide having activity to react with a selected ligand; Activation of neutrophils anomalies, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma or abnormal infection defenses determination method.
(24) 24. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A knockout non-human animal of a gene encoding a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compound represented by formula (I) or formula (II) according to item 1 is prepared, Control of thyroid function, neutrophil activation or activation suppression, inflammatory disease characterized by administering test substance, observing its symptoms, and comparing with symptoms when not administered Prevention or treatment of asthma, prevention or treatment of asthma, prevention or treatment of chronic obstructive pulmonary disease, or prevention or treatment of infectious diseases Screening method for a substance having an iodine.
Hereinafter, the compound represented by Formula (I) is referred to as Compound I, and the compound represented by Formula (II) is referred to as Compound II. Among compounds II, a compound with n = 6 is referred to as compound IIa, and a compound with n = 7 is referred to as compound IIb.

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は同一または異なって水素原子、ハロゲン、炭素数１〜３のアルキル、炭素数１〜３のアルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表す。Ｒ^３は酸素原子または硫黄原子を表す。）
化合物Ｉの誘導体としては、例えば、式（ＩＶ）で表される化合物があげられる。

（式中Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって水素原子、ハロゲン、炭素数１〜３のアルキル、炭素数１〜３のアルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表す。）
化合物ＩＩの誘導体としては、例えば、式（ＩＩ）のｎが３〜５、８〜１０のいずれかである化合物があげられる。
（ｉ）〜（ｖ）の化合物はシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ケムブリッジ・コーポレーション（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アシネックス（ＡＳＩＮＥＸ）、プレストウィック・ケミカル（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）等のメーカーから市販されており、入手可能である。また、^１２５Ｉで標識したＴ４は、アマシャム・バイオサイエンシズ社、パーキンエルマー社から市販されている。（ｉ）〜（ｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩は、例えば薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などを包含する。（ｉ）〜（ｖ）の化合物の薬理学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩などがあげられ、薬理学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジンなどの付加塩があげられ、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの付加塩があげられる。（ｉ）〜（ｖ）の化合物の塩を取得したいとき、（ｉ）〜（ｖ）の化合物が塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、（ｉ）〜（ｖ）の化合物を適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えることにより塩を形成させて単離、精製すればよい。
以下、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞の細胞膜画分を用いる場合のリガンドの結合量の測定の具体例を示す。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質と放射性同位元素で標識した一定の放射能量のリガンドを添加したもの、（ｉｉ）放射性同位元素で標識した一定の放射能量のリガンドのみを添加したもの、（ｉｉｉ）放射性同位元素で標識した一定の放射能量のリガンドと大過剰の未標識のリガンドを添加したものを用意し、反応させる。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行なう。
（ｉ）〜（ｉｉｉ）それぞれを反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射能量を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−ウエルカウンター等の放射線測定装置で計測する。（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの放射能量（全結合量：Ｂ）から（ｉｉｉ）の放射能量（非特異的結合量：ＮＳＢ）を差し引いた値を、（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの特異的結合量として計算する。
（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるリガンドの特異的結合量と、（ｉ）の試験物質存在下におけるリガンドの特異的結合量を比較して、リガンドの特異的結合量を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして選択することができる。
試験物質としてはいかなるものも使用できるが、例えば、公知の受容体のリガンド、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物や該抽出物由来の精製物、細胞培養上清や該上清由来の精製物などの生体試料、既知蛋白質、組換え技術を用いて生産された組換え蛋白質、微生物の菌体抽出液や該抽出液由来の精製物、微生物培養上清や該上清由来の精製物、既知化合物、コンビナトリアルケミストリーを用いて合成された化合物などがあげられる。公知の受容体のリガンドとしては、例えば、Ｔ３、Ｔ４、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（ピチュイタリ・アデニレート・シクラーゼ・アクチベイティング・ポリペプチド）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、ガストリン放出ペプチド、副甲状腺ホルモン、ＶＩＰ（バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド）、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αまたはβ−ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、ウロテンシンＩおよびＩＩ、ニューロペプチドＦＦ、オレキシンおよびメラニン・コンセントレーティング・ホルモンなどをあげることができる。特に、アゴニストであるＴ４、イソコナゾールおよび化合物Ｉのそれぞれの誘導体、ならびにアンタゴニストである化合物ＩＩの誘導体はアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が高く、スクリーニングを行うのに適している。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲポリペプチドあるいは他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドあるいはＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いる同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定するスクリーニング法
上記方法（Ｂ）に用いるＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつＴ４、イソコナゾールおよび化合物Ｉまたは化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞があげられる。該細胞は、後述する（３）に記載の方法で取得することができる。細胞膜画分は、該細胞を適当な緩衝液中で破砕し、遠心分離により沈殿した画分として得ることができる。
リガンドとしては、（ｉ）Ｔ４、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）化合物Ｉ、（ｉｖ）Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩのいずれかの誘導体で、ＧＰＣＲ−Ｔ４と結合してＧＰＣＲ−Ｔ４を活性化できるものおよび（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの化合物の薬理学的に許容される塩を使用することができる。これらのリガンドは２．（１）に記載の方法で入手できる。
試験物質としては、２．（１）に記載の物質があげられる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４にリガンドが結合して活性化すると、ＧＰＣＲ−Ｔ４に共役していた三量体Ｇ蛋白質はＧＴＰａｓｅ活性を有するＧαサブユニットとβγサブユニットに解離し、ＧαにはＧＤＰと交換してＧＴＰが結合する。また、解離したＧαサブユニットまたはβγサブユニットを介したシグナル情報伝達により、種々の細胞応答が起こる。スクリーニング方法（Ｂ）におけるＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度は、（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量、（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性、（ｃ）細胞の応答の程度を指標に測定することができる。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量を測定するスクリーニング法
ＧＴＰγＳのＧαへの結合量は、文献〔Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７，８４８−８５４（１９９５）、ＷＯ９８／４６９９５〕に記載の方法に従って、標識したＧＴＰγＳを、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分へ添加し、ＧＴＰγＳの細胞または細胞膜画分への結合量として測定することができる。ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧαと結合するが、Ｇαによる加水分解を受けないため、結合量を正確に測定できる。標識したＧＴＰγＳとしては、例えば^３５Ｓで標識したＧＴＰγＳを用いることができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質、一定量のリガンド、ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉ）一定量のリガンド、ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉｉ）一定量のリガンド、ＧＤＰ、放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳおよび大過剰の未標識のＧＴＰγＳを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応は０〜５０℃、望ましくは４〜３７℃で、２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行なう。（ｉ）〜（ｉｉｉ）それぞれを反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射線測定装置で計測する。（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの放射能量（全結合量：Ｂ）から（ｉｉｉ）の放射能量（非特異的結合量：ＮＳＢ）を差し引いた値を、（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの特異的結合量として計算する。
（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量を比較して、ＧＴＰγＳの特異的結合量を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして選択することができる。一方、ＧＴＰγＳの特異的結合量を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分をＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性を測定するスクリーニング法
ＧＴＰａｓｅ活性は、文献〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ．，２７１，１８５７−１８６０（１９９６）、ＷＯ９８／４６９９５〕に記載の方法に従って、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分へ、γ位リン酸を放射性同位元素で標識したＧＴＰを基質として添加し、測定することができる。γ位リン酸を放射性同位元素で標識したＧＴＰとしては、例えば^３２Ｐで標識した［γ−^３２Ｐ］ＧＴＰを用いることができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質、一定量のリガンドおよびγ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰを添加したもの、（ｉｉ）一定量のリガンドおよびγ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応は０〜５０℃、望ましくは４〜３７℃で、２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行なう。（ｉ）および（ｉｉ）それぞれを反応後、遠心分離により反応液の上清を回収し、上清に放出された無機リン酸（Ｐｉ）の放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射線測定装置で計測し、ＧＴＰａｓｅ活性とする。あるいは、反応液をガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、濾過液を回収し、濾過液中の無機リン酸（Ｐｉ）の放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射線測定装置で計測してもよい。（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性とを比較して、ＧＴＰａｓｅ活性を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして選択することができる。一方、ＧＴＰａｓｅ活性を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分をＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（ｃ）細胞の応答を検出する方法
細胞の応答としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質（例えば、ＣＲＥＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＭＡＰＫ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｉκ−Ｂα、Ｉκ−Ｂβ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８等）のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞の増殖、メラニン色素の凝集または拡散、活性酸素産生、一酸化窒素産生あるいはレポーター遺伝子やマーカー遺伝子の発現量の変動があげられる。これらの細胞の応答は、文献〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８５７（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，９８（１９９５）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２７４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８２２（１９９７）、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１７，５７（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８，１４００（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８，１４７１（１９９７）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，１３３４（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１，４７１（１９９８）、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２５，１３８７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５２，１１５（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ，３５８，３２５（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ，３９３，２７２（１９９８）、Ｃｅｌｌ，９２，５７３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７２，２７４９７（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，４３０（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２０，３７０（１９９９）、ＷＯ９８／４６９９５〕に記載の方法により測定することができる。
レポーター系を用いて細胞の応答をモニターする場合は、例えば、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現させた細胞に、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを導入することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化をレポーター遺伝子の発現で測定することができる。該プロモーターとしては、例えばＩＣＡＭ−１遺伝子のプロモーター、ｃ−ｆｏｓのプロモーター、Ｋｒｏｘ−２４のプロモーター〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２０，１４５（１９９６）〕などが利用できる。また、該プロモーターは、適当な転写因子の結合配列と基本プロモーターからなる人工プロモーターでもよい。転写因子の結合配列としては、Ｇ_ｉに共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）やＧ_ｉに共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写が抑制されるＣＲＥ（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）などが利用できる。また、Ｇα_ｓのＣ末端５アミノ酸をＧα_ｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα_ｓをＧＰＣＲ−Ｔ４の発現細胞に発現させることにより、本来Ｇ_ｓと共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＣＲＥを含む人工プロモーターからも、Ｇ_ｉが共役するＧＰＣＲの活性化に伴いレポーター遺伝子の発現を誘導することができる。
レポーター遺伝子としては、あらゆるレポーター遺伝子を使用可能であるが、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子などが利用できる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドを発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。必要に応じて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、（ｉ）試験物質および一定量のリガンドを添加したもの、（ｉｉ）一定量のリガンドのみ添加したものそれぞれを用意し、一定時間インキュベートする。インキュベート後、細胞の応答（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、活性酸素産生、一酸化窒素産生またはレポーター遺伝子の発現量など）を測定する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加して定量してもよい。
また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞のｃＡＭＰ産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
（ｉｉ）の試験物質非存在下における細胞の応答の程度と、（ｉ）の試験物質存在下における細胞の応答の程度を比較して、細胞の応答を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして選択することができる。一方、細胞の応答を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分をＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞およびＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの調製
（ａ）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞の調製
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を天然に発現する哺乳動物の細胞または組織から調製することができる。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入した形質転換細胞として得ることができる。（１）および（２）に記載したスクリーニングを感度よく行うため、また３．に後述するＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性を利用したスクリーニングを行うためには、ＧＰＣＲ−Ｔ４を大量に発現する形質転換細胞を用いるのが好ましい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を天然に発現する細胞または組織としては、ｍＲＮＡレベルでＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量の見られる、多形核白血球、Ｔ細胞、単球、骨髄、脾臓、甲状腺、胎盤、肺、気管、リンパ節、骨格筋、精巣、脊髄、胎児肝臓、胎児肺等の細胞や組織、ＨＬ−６０やＨｕｔ７８等の細胞株があげられる。特に、多形核白血球、骨髄、脾臓、甲状腺、胎盤が好ましい。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ＤＮＡを造成し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞を取得することができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡは、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡであればいかなるＤＮＡでもよく、具体例として、（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどをあげることができる。
上記（ａ）に相当するＤＮＡとしては、例えばｃＤＮＡクローンｃ−ｈｅｐ１５３７４（ヘリックス研究所）をあげることができる。また、配列番号２で表される塩基配列の５’末端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、３’末端２０〜４０塩基の配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する組織や細胞からｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを鋳型とし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより上記（ａ）に相当するＤＮＡを増幅し単離することができる。組織や細胞からの染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡの調製、およびＰＣＲはモレキュラー・クローニング第３版に記載の方法に従って行うことができる。
上記（ｃ）のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴ４に反応する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記（ａ）に記載のＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体的な例として、フィルター上に固定化したコロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、プローブと４２〜６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液を用いて４２〜６５℃でフィルターを洗浄した結果、同定されるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、２配列間のアラインメント作製ツールＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにおいて、塩基配列間の相同性解析プログラムｂｌａｓｔｎを用いてデフォルトの条件（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ：１、ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａ ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２、ｏｐｅｎ ｇａｐ：５ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０、ｅｘｐｅｃｔ：１０、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１）で解析し、２配列間のアラインメントを作製したときに、上記の配列番号２で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをあげることができる。このようなＤＮＡの具体的な例として、配列番号２で表される塩基配列と９９．８％の相同性を有する配列番号２５で表される塩基配列（配列番号２４で表されるアミノ酸配列をコードするヒトのｃＤＮＡのコード領域の配列）を含むＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列と７４％の相同性を有する配列番号２７で表される塩基配列（配列番号２６で表されるアミノ酸配列をコードするマウスのｃＤＮＡのコード領域の配列）を含むＤＮＡをあげることができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現できるものであればいずれも用いることができるが、該形質転換細胞が発現するＧＰＣＲ−Ｔ４が高次構造を保ち、リガンドとの結合性や機能性を保持するためには、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞などで発現させるのが好ましい。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規受容体遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＥ４２０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７、（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社）、ｐＴｒｓ３０〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製〕、ｐＧＫＡ２〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−６７９８）より調製〕、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９）、ｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＥＴ（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＫＫ２２３−２（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）ｐＭＡＬ−ｃ２（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の原核細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐ_Ｌプロモーター、Ｐ_Ｒプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。またＧＰＣＲの発現に適した変異株や改変Ｇα蛋白質を発現させた酵母〔Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，６１８８（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４７００（１９９６）〕などを宿主として利用することもできる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＣＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３等を例示することができる。特に誘導発現用のベクター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を発現する宿主細胞に導入した場合に、１７β−エストラジオールの添加により発現誘導が可能となるｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄ等が好ましい。また、複製開始点として、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有するｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＧａｌ９−ｄ、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ等のベクターは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞等のエプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現するＢ細胞株を宿主細胞としたときに、染色体外にプラスミド状態で安定に存在するため、高い発現を示す形質転換株を容易に得ることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＧＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株、カエルの卵母細胞およびカエルのメラニン細胞等をあげることができる。
さらにマウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、モレキュラー・バイオロジー第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する昆虫細胞を得ることができる。
すなわち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現する昆虫細胞を得ることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１〔（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）〕等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を、あげることができる。また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する植物細胞を得ることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）、特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
（ｂ）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの調製
ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドは、上記のＧＰＣＲ−Ｔ４を天然に発現する哺乳動物の細胞または組織から公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。例えば哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより単離・精製することができる。
また、（１）で得られるＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入した形質転換細胞を、通常の培養方法に従って培養し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を生成蓄積させ、該培養物よりＧＰＣＲ−Ｔ４を採取することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４を調製することができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変イーグル培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ４００、ＥＸ−ＣＥＬＬ ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、グレースの昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養条件はｐＨ６〜７、培養温度は２５〜３０℃、培養時間は通常１〜５日間が好ましい。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４は、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌蛋白質または融合蛋白質として発現させることもできる。融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（蛋白）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合蛋白質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。これらの蛋白質は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に付加する精製や検出用のタグとしても利用できる。タグは任意の場所に付加することができるが、哺乳動物細胞で発現させる場合、細胞外領域または細胞内領域に付加するのが好ましい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
宿主細胞外へ分泌発現させる場合、あるいは宿主細胞膜上に発現させる場合は、必要に応じて宿主に合ったシグナル配列を、ＧＰＣＲ−Ｔ４のＮ端末側に付加する。ＧＰＣＲ−Ｔ４のＮ末端を一部欠失させた上で、上記分泌シグナルを付加した方がよい場合もある。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
また動物細胞を宿主として用いる場合は、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞の培養物から、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドを単離・精製するには、通常のポリペプチドの単離・精製法を用いることができる。
例えば、ＧＰＣＲ−Ｔ４がＧＰＣＲ−Ｔ４発現形質転換細胞の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャム・バイオシエンシズ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４がＧＰＣＲ−Ｔ４発現形質転換細胞の細胞膜上に蓄積する場合には、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離やろ過により膜画分を得たのち、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いてＧＰＣＲ−Ｔ４を膜から可溶化した後、上記と同様の単離・精製法により精製標品を得ることができる。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法によりＧＰＣＲ−Ｔ４を回収後、ＧＰＣＲ−Ｔ４の不溶体を変性剤で可溶化する。該可溶化液を、変性剤を含まないあるいは変性剤の濃度がＧＰＣＲ−Ｔ４が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離・精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外にＧＰＣＲ−Ｔ４が分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離・精製法と同様の手法により、ＧＰＣＲ−Ｔ４の精製標品を得ることができる。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３２０１に記載の方法に準じて、ＧＰＣＲ−Ｔ４をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、ＩｇＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
さらに、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてＧＰＣＲ−Ｔ４を生産することもできる。
さらに、ＧＰＣＲ−Ｔ４は、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）法、ｔＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）法等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック社、パーキン・エルマー社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
上記の方法で得られるＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
（４）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キットには、（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその塩、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分および（ｉｉ）リガンドとが含まれる。
（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその塩、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞は、上記（３）に記載の方法で調製することができる。該細胞の膜画分は、上記（３）に記載の方法で調製した該細胞を適当な緩衝液中で破砕し、遠心分離により沈殿した画分として得ることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドもしくはその塩は上記（３）に記載の方法で調製することができる。ただし、スクリーニング方法が、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量または（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性で測定する方法の場合は、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその塩ではなく、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分を用い、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を（ｃ）細胞の応答の程度を指標に測定する方法でスクリーニングする場合は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞を用いる。
（ｉｉ）リガンド
（ａ）Ｔ４、（ｂ）イソコナゾール、（ｃ）化合物Ｉ、（ｄ）化合物ＩＩ、（ｅ）（ａ）〜（（ｄ）のいずれかの化合物の誘導体でＧＰＣＲ−Ｔ４と結合するもの、および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの化合物の薬理学的に許容される塩を使用することができる。ただし、スクリーニング方法が、ＧＰＣＲ−Ｔ４へのリガンドの結合量を測定する方法の場合は、^１２５Ｉ等の放射性同位体で標識したリガンドおよび非標識のリガンドの両方を調製する。これらのリガンドは（１）に記載した方法で調製できる。
キットには、これ以外に、（ｉｉｉ）測定の際の試薬の調製や洗浄等に用いる適当な緩衝液、（ｉｖ）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞の培養に用いる培地、（ｖ）測定に用いるマルチウェルプレート、（ｖｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度（ＧＴＰγＳのＧαへの結合量、ＧＴＰａｓｅ活性、細胞の応答）を測定するのに必要な試薬等をさらに含んでもよい。
以下に、ＧＰＣＲ−Ｔ４へのリガンドの結合量を測定する方法によるキットの試薬の具体的な例と、そのキットの測定方法を記載する。
（ａ）キットの試薬
（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現させたＣＨＯ細胞。
（ｉｉ）標識リガンド
^１２５Ｉで標識したＴ４の水溶液。４℃あるいは−２０℃にて保存する。用時に（ｄ）の測定用緩衝液にて１μｍｏｌ／Ｌに希釈する。
（ｉｉｉ）リガンド標準液
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで調製した、１ｍｍｏｌ／Ｌの非標識のＴ４溶液。−２０℃で保存する。
（ｉｖ）測定用緩衝液
０．０５％のＢＳＡを含むハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｅ）測定法
（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４発現ＣＨＯ細胞を、１２ウェル組織培養用プレートに５×１０^５個／ウェルで播種し、５％ＣＯ_２のインキュベーター中、３７℃で２日間培養する。測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各ウェルに加える。
（ｉｉ）１０^−３〜１０^−１０ｍｏｌ／Ｌの試験物質溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。最大結合量の測定のために、試験物質を加えずに、標識リガンドのみ加える。非特異的結合量を知るためには試験物質のかわりに１０ｍｍｏｌ／Ｌのリガンド標準液を５μｌ加えておく。試験物質としては、上記（１）に記載した物質を使用することができる。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞を溶解液（０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターと混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定し、最大結合量に対するパーセント（Ｐｅｒｃｅｎｔ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ：ＰＭＢ）を下記式で求める。
ＰＭＢ＝（Ｂ−ＮＳＢ）÷Ｂ_０×１００
Ｂ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ_０：最大結合量
（１）または（２）記載のスクリーニング方法または（４）記載のスクリーニング用キットを用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを取得することができる。
３．構成活性を利用したスクリーニング法
本発明者らは、本研究においてＧＰＣＲ−Ｔ４が構成活性型ＧＰＣＲであることを初めて見出した。ＧＰＣＲ−Ｔ４は構成活性型ＧＰＣＲであるため、リガンドの非存在下でも、Ｇ蛋白質を介したシグナルを流すことができる。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性を利用すれば、２．（２）に記載したＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定するスクリーニング法において、リガンドを添加しなくとも、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはインバースアゴニストをスクリーニングすることができる。
また、４．に後述するように、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニスト（インバースアゴニストが含まれる）は、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する化合物なので、アゴニストまたはインバースアゴニストをスクリーニングできる方法は、これらの化合物のスクリーニング法ともなる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞は２．（２）に記載の細胞を用いることができる。細胞膜画分は、２．（２）に記載と同様にして調製できる。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量を測定するスクリーニング法
ＧＴＰγＳのＧαへの結合量は、２．（２）に記載と同様して測定することができる。具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質、ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉ）ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉｉ）ＧＤＰ、放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳおよび大過剰の未標識のＧＴＰγＳを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応、測定および特異的結合量の計算は２．（２）の記載と同様にして行う。
（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量を比較して、ＧＴＰγＳの特異的結合量を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。また、ＧＴＰγＳの特異的結合量を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性を測定するスクリーニング法
ＧＴＰａｓｅ活性は、２．（２）に記載と同様にして測定することができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質およびγ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰを添加したもの、（ｉｉ）γ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰのみを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応およびＧＴＰａｓｅ活性を２．（２）に記載と同様にして測定する。（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性とを比較して、ＧＴＰａｓｅ活性を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。また、ＧＴＰａｓｅ活性を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
（ｃ）細胞の応答を検出する方法
細胞の応答は２．（２）に記載と同様にして測定することができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。培養後、必要に応じて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、（ｉ）試験物質を添加したもの、（ｉｉ）試験物質を添加しないものそれぞれを用意し、一定時間インキュベートする。インキュベート後、細胞の応答を２．（２）（ｃ）の記載と同様にして測定する。（ｉｉ）の試験物質非存在下における細胞の応答の程度と、（ｉ）の試験物質存在下における細胞の応答の程度を比較して、細胞の応答を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。また、細胞の応答を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
４．ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストおよびアンタゴニストならびにこれらの物質の利用法
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストおよびアンタゴニスト
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとしては、Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよびこれらの化合物の薬理学的に許容される塩をあげることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとしては、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩの薬理学的に許容される塩をあげることができる。
また、Ｔ４の誘導体、イソコナゾールの誘導体、化合物Ｉの誘導体または化合物ＩＩの誘導体は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が高い。
ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を試験物質として、２．（２）または３．に記載のスクリーニング法に従って評価することにより、アゴニストとして働く抗体、アンタゴニストとして働く抗体を選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体は、下記（５）に記載の方法に従い、取得することができる。
（２）機能解析への利用
上記２および３記載のスクリーニング方法で取得できる、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現している組識や細胞に接触させ、細胞の応答を測定することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４の機能を明らかにすることができる。細胞の応答としては、例えばアラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ^２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質（例えば、ＣＲＥＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＭＡＰＫ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｉκ−Ｂα、Ｉκ−Ｂβ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８等）のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞の増殖、活性酸素産生、一酸化窒素産生あるいはレポーター遺伝子やマーカー遺伝子の発現量があげられる。ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとしては、例えばＴ４、イソコナゾールまたは化合物Ｉを用いることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとしては、例えば化合物ＩＩを用いることができる。
（３）疾患の治療、予防への利用
ＧＰＣＲ−Ｔ４はヒト末梢多形核白血球で高発現している。また、実施例８に示すように、ヒト末梢多形核白血球をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストであるＴ４またはイソコナゾールで刺激すると、定常状態またはＧＭ−ＣＳＦ刺激時のＥＲＫ ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）が抑制される。好中球においては、ＥＲＫ ＭＡＰＫの活性化によりプライミングや活性化が起こることが知られていることから、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストは、好中球の活性化抑制剤として、またアンタゴニストは、好中球の活性化促進剤として有用と考えられる。炎症における好中球の過度の活性化は、組織障害の原因となることが知られている。また、喘息や慢性閉塞性肺疾患においては、炎症や感染に由来する好中球の活性化が肺組識の障害を引き起こし、疾患を悪化させることが知られている。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストは、好中球による組織障害の抑制、炎症性疾患の予防や治療、喘息の予防や治療、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防や治療にも有用と考えられる。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストは、好中球を活性化することにより、感染性疾患の予防や治療にも有用と考えられる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４は甲状腺においても高発現していることから、甲状腺から生産されるＴ４は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を介して甲状腺の機能を制御していると考えられる。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、甲状腺機能の制御に有用と考えられる。
（４）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する医薬
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、（３）に記載した疾患の治療薬または予防薬として単独で用いることも可能ではあるが、通常は各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路としては、予防または治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または例えば静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤等があげられる。
経口投与に適当な例えば錠剤等は、乳糖、マンニット等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤および希釈剤、防腐剤、フレーバー類などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩は、上記の目的で用いる場合、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常経口の場合、成人１人あたり、１回につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの範囲で、１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人当り０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３００ｍｇを一日一回ないし数回投与するか、または１日１〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
（５）ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体の調製
（Ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上記２．（３）に記載の方法により取得したＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチド、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４の部分ペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合するポリクローナル抗体を作製することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の部分ペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の連続する５〜５０残基の配列からなるペプチド等をあげることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の部分ペプチドは、ペプチド合成機によって合成することができる。
該抗原を投与する動物としては、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等をあげることができる。抗原の投与は動物の皮下、静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、抗原性の高いキャリア蛋白質を抗原に結合させて投与する、あるいは適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。キャリア蛋白質としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン、ウシチログロブリン等があげられ、アジュバンドとしては、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することをＥＬＩＳＡ〔酵素免疫測定法 第３版，医学書院（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した上記動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ＩＩ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いたＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの部分ペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示した上記動物を抗体産生細胞の供給源として供することができる。
該抗体価を示した上記動物に抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ １６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ ８−アザグアニンを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０^７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌリン酸一カリウム、７．６５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０^８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００ ２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地に０．１ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。
該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法により、培養上清中にＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法は以下のようにして行うことができる。免疫の際、抗原に用いたＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその部分ペプチドを９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマの培養上清を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に酵素との反応により発色する試薬を用いた反応を行なう。
選択されたハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得したハイブリドーマ株５〜２０×１０^６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
５．ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質、および該物質のスクリーニング法
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写過程、あるいは転写産物から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する物質は、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させることにより、細胞でのＧＰＣＲ−Ｔ４の量を増加または減少させ、ＧＰＣＲ−Ｔ４を介して発揮される細胞機能を制御することが可能である。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写過程、あるいは転写産物から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する物質は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するリガンドが有する生理活性を増強または抑制することができるので、該リガンドの活性を増強または抑制する医薬組成物として有用である。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加させる物質は、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化抑制剤、好中球による組織障害の抑制剤、炎症性疾患の予防や治療剤、喘息の予防や治療剤、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防や治療剤の有効成分として有用である。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を減少させる物質は、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤、あるいは感染性疾患の予防や治療剤の有効成分として有用である。
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質としては、（２）に後述する方法で選択される物質があげられる。また、配列番号２で表される塩基配列の連続する５〜６０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基の配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１３２（１９９２）〕、リボザイム技術〔Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３，２７４（１９９９）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２３，２５７（１９９９）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４，Ｄ４９７（１９９９）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，Ｒ３３（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，５２３７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，４３８（１９９８）〕に基づいてＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術に基づいて該オリゴヌクレオチドがＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制し得る作用を有するためには、翻訳開始点（配列番号２で表される塩基配列の４３８番目の塩基に相当する）を含む領域あるいは翻訳開始点近傍の領域と相補的な配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。実質的に相補的な塩基配列とは、配列番号２で表される塩基配列の連続する５〜６０塩基の配列に相補的な配列と９０％以上の相同性を有し、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするような塩基配列をいう。
また配列番号３で表される塩基配列の連続する５〜６０塩基の配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、デコイＤＮＡ法〔日本臨床，５６，５６３（１９９８）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８２，１０２３（１９９８）、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，５，４２９（１９９７）、日本臨床，５４，２５８３（１９９６）〕により、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの誘導体があげられる。誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる［横山和尚，細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ社等より市販さているＤＮＡ合成機により合成することができる。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含む二本鎖ＲＮＡ〔以下、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）とよぶ〕または該配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ〔以下、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）とよぶ〕を用いて、ＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉとよぶ）〔Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４（２００１）〕により、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現の抑制に用いるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（以下それぞれ、ＧＰＣＲ−Ｔ４ ｓｉＲＮＡ、ＧＰＣＲ−Ｔ４ ｓｈＲＮＡともよぶ）は、以下のようにして作製することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするｃＤＮＡの塩基配列中からＡＡで始まる２１〜２７塩基の配列〔ＡＡ（Ｎ）_{１９−２５}、Ｎは任意の塩基〕、好ましくはＡＡ（Ｎ）_１９ＴＴからなる配列を選択する。選択する配列は、翻訳領域中の開始コドンより５０塩基以上下流の領域中にあり、ＧＣ含量が３０〜７０％、好ましくは５０％前後の配列であって、他の遺伝子の塩基配列と一致せず、ＧＰＣＲ−Ｔ４ ｃＤＮＡに特異的な配列がさらに好ましい。選択した配列の末端のＡＡを除いた１９〜２５塩基の配列またはＡＡおよびＴＴを除いた１９塩基の配列（ただし配列中のＴはＲＮＡではＵとする、以下、配列Ｘとよぶ）、および該配列Ｘと相補的な配列それぞれの３’端に２〜４個のヌクレオチド、好ましくは２個のＴ（ＤＮＡ）またはＵ（ＲＮＡ）を付加した配列を有する２本のＲＮＡ（ただし、Ｔの部分はＤＮＡ）を作製する。作製した２本のＲＮＡをアニーリングすることによりｓｉＲＮＡを作製できる。アニーリングは、２本のＲＮＡを適当なバッファー（例えば、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解した後、ヒートブロックまたはサーマサイクラーで９０〜９５℃で１〜５分間加熱した後、２５℃まで４５〜６０分間かけて冷却することにより行うことができる。
ｓｈＲＮＡとしては、上記配列Ｘと該配列Ｘと相補的な配列とを、３〜１５塩基からなる適当なスペーサー配列でつないで、３’末端に２〜４個のヌクレオチド、好ましくは２個のＴ（ＤＮＡ）またはＵ（ＲＮＡ）を付加した配列を有するＲＮＡ（ただし、Ｔの部分はＤＮＡ）を作製する。スペーサー配列の５’端はＴＴ（ＤＮＡ）またはＵＵ（ＲＮＡ）が好ましい。配列Ｘと配列Ｘと相補的な配列の位置はどちらが先でもよい。
上記のｓｉＲＮＡに用いる２本のＲＮＡおよびｓｈＲＮＡはＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。また、サイレンサー（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ）ｓｉＲＮＡ作製キット等を利用して、Ｔ７プロモーター配列および作製するＲＮＡの配列を有する２本鎖ＤＮＡを作製し、このＤＮＡを鋳型としたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写系によっても、調製することができる。あるいは、以下のようにして作製できるＧＰＣＲ−Ｔ４ ｓｉＲＮＡ発現用ベクターを、培養細胞または生体内の細胞に導入することにより、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させ、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４ ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、Ｕ６プロモーターあるいはＨ１プロモーター等ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを含むｓｉＲＮＡ発現用ベクターに、上記配列Ｘ、ＴＴからはじまる３〜１５塩基からなるスペーサー配列、配列Ｘと相補的な配列およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターとなる４〜６個のＴからなる配列を含むＤＮＡを挿入して作製することができる。細胞内で、Ｕ６プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ反応により、配列Ｘおよび相補的な配列を含むｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてｓｉＲＮＡに変換される。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターとしては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ １．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．０（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳＵＰＥＲ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社製）等をあげることができる。レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクター〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０（２００２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００，１８４４（２００３）；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３，４０１（２００３）〕を用いることもできる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質を有効成分として含有する医薬は、４．（４）に記載の医薬と同様にして調製することができる。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質のスクリーニング法
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質は、以下（ａ）〜（ｃ）に示す方法により取得できる。
（ａ）試験物質の存在下、天然にＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞を、上記２．（３）に記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチド量を、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を用いて測定、比較し、該ポリペプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対する抗体を用いた測定法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等〔酵素免疫測定法 第３版，医学書院（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ．Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、別冊 実験医学，ザ・プロトコールシリーズ，免疫染色・ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション，羊土社（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５０，５，（１９９２）〕を用いた検出法をあげることができる。
（ｂ）試験物質の存在下、天然にＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞を、上記２．（３）に記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物量を、ノーザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）またはＰＣＲ〔ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕等の方法を用いて測定、比較し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
（ｃ）ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記２．（３）に記載の方法に準じて動物細胞に導入し、形質転換体を取得する。試験物質の存在下、該形質転換体を、上記２．（３）に記載の培養法で２時間から１週間培養し、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定、比較し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する方法。
レポーター遺伝子としては、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子等をあげることができる。
（ｃ）の方法で用いるＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域としては、哺乳動物細胞においてＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。具体的には、例えば、ヒトの好中球、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、骨髄、脾、胎盤、甲状腺、肺、リンパ節、胎児肝、胎児肺または気管において、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写に関与するプロモーター領域をあげることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域は、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕により取得することが可能である。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域は、染色体遺伝子でＧＰＣＲ−Ｔ４ ｍＲＮＡに転写される領域よりも上流に存在するので、ＧＰＣＲ−Ｔ４ ｃＤＮＡの塩基配列（例えば配列番号２で表される塩基配列）と、ＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースに登録されているヒト染色体遺伝子の配列とを比較することによりＧＰＣＲ−Ｔ４のプロモーター領域を決定することができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの具体的例としては、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。プロモーター領域は配列番号３で表される塩基配列の連続する５０〜５０００ｂｐの領域と考えられる。
６．疾患の判定方法
好中球や甲状腺におけるＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量またはＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量が健常者のレベルと比較して増加または減少している場合、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の変異により、正常なＧＰＣＲ−Ｔ４と比較してＧＰＣＲ−Ｔ４としての機能が低下または亢進したＧＰＣＲ−Ｔ４変異体が生産されたり、またはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量が健常者のレベルと比較して増加あるいは減少したりする場合、甲状腺機能の異常、好中球機能の異常、感染防御能の異常、喘息の増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪または炎症性疾患の増悪等が起こると考えられる。したがって、以下の方法により上記の疾患や疾患の状態の判定を行うことができる。
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量が変動する疾患の判定方法
ノーザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第３版）、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕、定量的ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）〕、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法〔Ｊｕｎｋｏ Ｓｔｅｖｅｎｓ，実験医学（増刊），１５，４６（１９９７）〕等の方法により、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量を測定することができる。定量的ＰＣＲ法やＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法は定量性に優れている点で好ましい方法である。被検者の組織または細胞におけるＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量を定量し、健常者の同じ組織や細胞のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量と比較することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４の転写量が増加あるいは減少している疾患、例えば甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、感染防御能の異常、喘息の増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪、炎症性疾患の増悪を判定することができる。組織または細胞としては、多形核白血球または甲状腺をあげることができる。
オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基でアプライド・バイオシステムズ社等より市販さているＤＮＡ合成機により合成することができる。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量が変動する疾患の判定方法
ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等〔酵素免疫測定法 第３版，医学書院（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、別冊 実験医学，ザ・プロトコールシリーズ，免疫染色・ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション，羊土社（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５０，５，（１９９２）〕により、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量を測定することができる。被検者の組織または細胞におけるＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量を定量し、健常者の同じ組織や細胞のＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチド量と比較することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量が増加あるいは減少している疾患、例えば甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、感染防御能の異常、喘息の増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪、炎症性疾患の増悪を判定することができる。組織または細胞としては、多形核白血球または甲状腺をあげることができる。
（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の変異を検出する疾患の判定方法
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子または該遺伝子の発現制御領域の変異または多型の検出は、該遺伝子または該制御領域の塩基配列情報を用いて行うことができる。具体的には、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、サザンブロット、ダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子の変異や多型を検出することができる〔臨床検査，４２，１５０７−１５１７（１９９８）、臨床検査，４２，１５６５−１５７０（１９９８）〕。オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基でアプライド・バイオシステムズ社等より市販さているＤＮＡ合成機により合成することができる。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドあるいはＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を含む判定薬は、これらの成分を含む適当な緩衝液として調製される。さらに転写量やポリペプチドまたは変異を検出するのに必要な薬剤を添付してもよい。
７．ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子のノックアウト非ヒト動物を用いたスクリーニング法
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子のノックアウト非ヒト動物とは、染色体上の該遺伝子を全部もしくは一部の欠失またはＤＮＡ断片の挿入等により破壊することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現できなくなり、ＧＰＣＲ−Ｔ４の機能が欠損した非ヒト動物である。該動物は、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの発現異常に起因する種々の疾患、例えば、甲状腺の機能異常、好中球機能の異常、感染防御能の異常、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症疾患等の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。したがって、該動物、または該動物の臓器、組織または細胞は、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または抑制作用、好中球による組織障害の促進作用または抑制作用、炎症性疾患の予防や治療作用、喘息の予防や治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防や治療作用、あるいは感染性疾患の予防や治療作用を有する化合物、機能性食品、健康食品等のスクリーニングや評価に用いることができる。
該動物は、以下のようにして作製できる。まず、ＧＰＣＲ−Ｔ４のゲノム遺伝子の配列に対し、正常なＧＰＣＲ−Ｔ４が発現しないように、欠失またはＤＮＡ断片の挿入をして破壊した配列を有するＤＮＡ（以下、破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子という）を含むベクターを用い、公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により、目的とする動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス等の非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞において、染色体上のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子を、ベクター上の破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子と置換した変異胚性幹細胞クローンを作製する〔Ｎａｔｕｒｅ，３５０，２４３（１９９１）〕。このようにして作製した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作製する。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上片方のアレルのＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の配列が破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の配列に置換したヘテロ個体を得ることができ、さらにそのヘテロ個体の掛け合わせにより相同染色体の双方のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子が破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子に置換したホモ個体を得ることができる。このホモ個体は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現しない、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子のノックアウト非ヒト動物である。
以下、具体的な実施例、参考例をあげて本発明を説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。  The inventors of the present invention are GPCRs (referred to as GPCR-T4) in which a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is activated in response to T4 and transmits signal information via a G protein. As a result, an agonist or antagonist screening system for GPCR-T4 was constructed. Analysis of GPCR-T4 expression distribution and functional analysis of GPCR-T4 using GPCR-T4 agonists T4 and isoconazole. As a result, GPCR-T4 can control priming and activation of leukocytes and thyroid function. I found that I was involved for the first time. That is, an agonist or antagonist for GPCR-T4, or a substance that increases or decreases the expression level of GPCR-T4 gene is a thyroid function regulator, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, inflammatory It has been found for the first time that it is useful as a prophylactic or therapeutic agent for diseases, a prophylactic or therapeutic agent for asthma, a prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease, and a prophylactic or therapeutic agent for infectious diseases. Through the series of studies described above, the present invention has been completed.
  This will be described in detail below.
1. GPCR-T4
  GPCR-T4 includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II. The cDNA encoding GPCR-T4 is referred to as GPCR-T4 cDNA, and the mRNA encoding the polypeptide is referred to as GPCR-T4 mRNA. Examples of the activity that reacts with a ligand include an activity that binds to a ligand, an activity that binds to a ligand and transmits signal information via a G protein, and the like.
  The origin of GPCR-T4 is not particularly limited, and examples thereof include mammals (eg, humans, guinea pigs, rats, mice, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys) and chickens. However, human GPCR-T4 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is particularly preferable.
  A ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II, comprising the amino acid sequence of one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Polypeptides having an activity to react are described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning & Bio-Sol in Biomolecules). 1987-2002) (hereinafter abbreviated as Current Protocols in Molecular Biology), Nuc leic Acids Res. ,10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,796409 (1982), Gene,34, 315 (1985), Nucleic Acids Res. ,13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488 (1985), etc., for example, by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and introducing the mutation It can be obtained by expressing the obtained DNA. The number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-described site-directed mutagenesis, about 1 to several tens, The number is preferably about 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5. Further, amino acid deletion, substitution or addition is not limited to one position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and may occur simultaneously at two or more positions.
  As amino acids capable of amino acid substitution, the 24th serine, 193rd arginine, 457th valine of SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1, which is not conserved between the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 24 When the amino acid sequences of 1 and SEQ ID NO: 26 are compared using known alignment software, amino acids that are not conserved in both can be mentioned. Examples of known alignment software include alignment analysis software included in gene analysis software Genetyx (Software Development Co., Ltd.). Default values can be used as analysis parameters of the analysis software.
  Examples of the amino acid position at which amino acid can be deleted or added include the N-terminus and C-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  The substituted or added amino acid may be a natural type or a non-natural type. Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  Examples of amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids included in the same group can be substituted for each other.
Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
Group C: asparagine, glutamine
Group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
Group E: proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
Group F: serine, threonine, homoserine
Group G: phenylalanine, tyrosine
  Further, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added is selected from the group consisting of T4, isoconazole compound I and compound II In order to have an activity to react with the amino acid sequence, it is 65% or more, preferably 75% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Most preferably, it has a homology of 98% or more. The homology of amino acid sequences is determined by the alignment creation tool BLAST 2 Sequences [FEMS Microbiol Lett.174, 247 (1999)], the algorithm BLAST [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 96, 5873 (1993)], using the homology analysis program blastp between amino acid sequences developed based on the default conditions (matrix: BLOSUM62, open gap: 11 penalties, extension gap: 1 penalty, gap x_dropoff: 50, expect: 10.0, word size: 3) and can be determined by creating an alignment between the two sequences.
  Further, homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 65% or more, preferably 75% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more. GPCR-T4 also includes a polypeptide having an activity and having an activity of reacting with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II. Amino acid sequence homology can be determined by BLAST 2 Sequences using blastp as described above.
  And a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole compound I and compound II, which is encoded by a DNA hybridizing under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. GPCR-T4 also includes a polypeptide having an activity to react with. DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by using a colony hybridization method or plaque hybridization method, etc., using a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a probe. can get. Specific examples of DNA that hybridizes under stringent conditions include colony or plaque-derived DNA immobilized on a filter in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L NaCl, and 42 to After hybridization at 65 ° C., 0.1- to 2-fold concentration of SSC (saline-sodium citrate) solution (composition of 1-fold concentration of SSC solution is 150 mmol / L NaCl, 15 mmol / L sodium citrate) As a result of washing the filter at 42 to 65 ° C using Hybridization is described in Molecular Cloning, 3rd edition, Current Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) and the like. It can be performed according to. In order for the polypeptide encoded by the hybridizable DNA to have an activity of reacting with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II, at least 70 with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. % Or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more. The homology of the base sequences is determined by using the homology analysis program blastn between the base sequences developed based on the algorithm BLAST in the alignment creation tool BLAST 2 Sequences between the two sequences under the default conditions (reward for a match: 1, analysis for penalty for a missmatch: -2, open gap: 5 penalties, extension gap: 2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11) to create an alignment between the two sequences be able to.
  (1) consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II A polypeptide having activity to react with a selected ligand; (2) a group consisting of an amino acid sequence having 65% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II A polypeptide having an activity to react with a ligand selected from: or (3) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and Against a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II Examples of GPCR-T4 is a polypeptide having an activity of, WO 02/26825, WO 01/42287 and FEBS Lett.531, 407-414 (2002), a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, Mol. Cell. Biol. , 20, 4405-4410 (2000), and a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 is a sequence in which the 24th serine, the 193rd arginine, and the 457th valine are substituted with proline, lysine and isoleucine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, respectively. , A sequence having 99% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 is a sequence having 68% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  1. GPCR-T4 has an activity of reacting with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II. (1) and 2. In accordance with the method described in the screening method for agonists or antagonists described later in (2), the specific binding amount of the ligand in the absence of the test substance or the degree of activation of GPCR-T4 in the absence of the test substance is measured. This can be confirmed.
  In addition, if it has an activity to react with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II, the strength of binding to the ligand and the strength of signal information transmission via the G protein are as follows: It may be different from the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
2. Method for screening agonist or antagonist for GPCR-T4 using ligand
  As a method for screening an agonist or antagonist for GPCR-T4 using a ligand,
(A) GPCR-T4 or a salt thereof, a cell expressing GPCR-T4, or a cell membrane fraction of the cell, and (1) a ligand is contacted; and (2) a ligand and a test substance are contacted. In each case, the amount of ligand binding to GPCR-T4 or a salt thereof, the cell, or the cell membrane fraction of the cell is measured and compared, and an agonist or antagonist for GPCR-T4 is selected from the test substance. Method,
(B) GPCR in each case where GPCR-T4 expressing cell or cell membrane fraction of the cell is contacted with (1) a ligand and (2) a ligand and a test substance are contacted -A method of measuring the degree of activation of T4 and performing comparison, and selecting an agonist or antagonist for GPCR-T4 from the test substance,
Can give.
  Agonists and antagonists cannot be distinguished only by the method (A), but can be distinguished by evaluating the selected substance by the method (B). It can be confirmed by the method (A) that the substance selected by the method (B) binds to GPCR-T4.
  4. As described later, the agonist or antagonist for GPCR-T4 is a thyroid function controlling action, a neutrophil activation promoting action or an activation inhibiting action, an inflammatory disease preventing or treating action, an asthma preventing or treating action. Since it is a compound having a preventive or therapeutic action for chronic obstructive pulmonary disease and a preventive or therapeutic action for infectious diseases, the method for screening for agonists or antagonists is also a screening method for these compounds.
(1) Screening method for measuring the amount of ligand binding to GPCR-T4
  The GPCR-T4 used in the above method (A) includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or one or more amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Any polypeptide having an amino acid sequence and having an activity of reacting with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole, compound I and compound II may be used. Salts of these polypeptides can also be used. In the method (A), a cell expressing the polypeptide or a cell membrane fraction of the cell may be used. When the cells are used, the cells may remain alive, or the cells may be fixed with glutaraldehyde, formalin, or the like.
  Said polypeptide, its salt, and the cell which expresses this polypeptide can be acquired by the method as described in (3) mentioned later. The cell membrane fraction can be obtained as a fraction obtained by crushing the cells in an appropriate buffer and centrifuging.
  As a ligand, it binds to GPCR-T4 with a derivative of any one of (i) T4, (ii) isconazole, (iii) compound I, (iv) compound II, and (v) (i) to (iv). And pharmacologically acceptable salts of any of the compounds of (vi) (i)-(v). For measurement of the amount of ligand bound to GPCR-T4, a cell expressing GPCR-T4 or a cell membrane fraction of the cell,³H,¹⁴C,¹²⁵I,³⁵S,³²It is preferable to use a ligand labeled with a radioisotope such as P.
  Examples of the derivative of T4 include 3,3 ′, 5′-triiodo-1-thyronine, 3,5,3′-triiodo-1-thyronine, 3,3′-diiodothyronine, 3,5,3 Examples include ', 5'-tetraiodothyroacetic acid, 3,5,3'-triiodothyroacetic acid, and thyroid hormone derivatives described in US Pat. No. 6,221,911.
  Examples of the isoconazole derivative include econazole, miconazole, sulconazole, thioconazole, orconazole, butconazole, and a compound represented by the formula (III).

(Wherein R¹And R²Are the same or different and each represents a hydrogen atom, halogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms, hydroxy, carboxy, or hydroxymethyl. R³Represents an oxygen atom or a sulfur atom. )
  Examples of the derivative of compound I include a compound represented by formula (IV).

(Wherein R4, R5 and R6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, halogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms, hydroxy, carboxy or hydroxymethyl.)
  Examples of the derivative of compound II include compounds in which n in formula (II) is 3 to 5, or 8 to 10.
  The compounds (i) to (v) are commercially available from manufacturers such as Sigma-Aldrich, ChemBridge Corporation, ASINEX, and Prestwick Chemical. Is available. Also,¹²⁵T4 labeled with I is commercially available from Amersham Biosciences and PerkinElmer. The pharmacologically acceptable salts of the compounds (i) to (v) include, for example, pharmacologically acceptable acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like. . Examples of pharmacologically acceptable acid addition salts of the compounds (i) to (v) include inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates and phosphates, acetates, maleates and fumarates. Examples of the pharmacologically acceptable metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, and the like. Aluminum salts, zinc salts and the like are exemplified, and pharmacologically acceptable ammonium salts include, for example, salts such as ammonium and tetramethylammonium, and pharmacologically acceptable organic amine addition salts include, for example, Examples include addition salts such as morpholine and piperidine. Examples of pharmacologically acceptable amino acid addition salts include lysine, glycine, phenylalanine, and asparagine. , Addition salts, such as glutamic acid, and the like. When it is desired to obtain a salt of the compound of (i) to (v), the compound of (i) to (v) may be purified as it is, and when it is obtained in a free form. The compounds (i) to (v) may be isolated or purified by dissolving or suspending them in a suitable solvent and adding an acid or base to form a salt.
  Hereinafter, specific examples of the measurement of the binding amount of the ligand when using the cell membrane fraction of cells expressing GPCR-T4 will be shown.
  A buffer solution containing a certain amount of a cell that expresses GPCR-T4 or a cell membrane fraction of the cell, (i) a constant radioactivity ligand labeled with a test substance and a radioisotope, (ii) a radioisotope Prepare only one with a certain amount of ligand labeled with an element and (iii) one with a certain amount of radioactivity labeled with a radioisotope and a large excess of unlabeled ligand and react. The reaction is carried out at about 0-50 ° C., desirably about 4-37 ° C., for about 20 minutes-24 hours, desirably about 30 minutes-3 hours.
  (I) to (iii) After each reaction, after filtering with a glass fiber filter paper, washing with an appropriate amount of buffer solution, the amount of radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or a γ-well counter. Measure with the instrument. The value obtained by subtracting the amount of radioactivity of (iii) (nonspecific binding amount: NSB) from the amount of radioactivity (total binding amount: B) of (i) and (ii) Calculated as the amount of static coupling.
  The specific binding amount of the ligand in the absence of the test substance of (ii) is compared with the specific binding amount of the ligand in the presence of the test substance of (i), and a substance that decreases the specific binding amount of the ligand is determined by GPCR -Can be selected as an agonist or antagonist for T4.
  Any substance can be used as the test substance. For example, a known receptor ligand, a human or mammalian (eg, mouse, rat, pig, cow, sheep, monkey, etc.) tissue extract or derived from the extract Purified products, biological samples such as cell culture supernatant and purified products derived from the supernatant, known proteins, recombinant proteins produced using recombinant technology, microorganism cell extracts and purified products derived from the extracts And microorganism culture supernatants, purified products derived from the supernatants, known compounds, compounds synthesized using combinatorial chemistry, and the like. Known ligands of receptors include, for example, T3, T4, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, PACAP (Pituitary adenylate cyclase・ Activating polypeptide), secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatostatin, growth hormone releasing hormone, corticotropin releasing hormone, corticotropin releasing hormone, melanocyte stimulating hormone, gastrin releasing peptide, parathyroid hormone , VIP (vasoactive intestinal polypeptide), dopamine, motilin, amylin, bradykinin, calcitonin gene-related peptide Leukotriene, pancreatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, α or β-chemokine (eg IL-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2) MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, thyroid stimulating hormone releasing hormone, pancreatic polypeptide, galanin Urotensin I and II, neuropeptide FF, orexin and melanin concentrating hormone. In particular, agonists T4, isoconazole and respective derivatives of Compound I and antagonists of Compound II are likely to be agonists or antagonists and are suitable for screening.
  In addition, for a selected substance, another GPCR polypeptide or another GPCR-expressing cell or a cell membrane fraction of the cell, a GPCR-T4 polypeptide or a cell expressing the GPCR-T4, or a cell membrane fraction of the cell By performing a similar assay used in place of, it can be confirmed whether the agonist or antagonist is specific to GPCR-T4.
(2) Screening method for measuring the degree of activation of GPCR-T4
  The cell expressing GPCR-T4 used in the above method (B) includes a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, Examples thereof include cells that express a polypeptide having a substituted or added amino acid sequence and having an activity of reacting with a ligand selected from the group consisting of T4, isoconazole and Compound I or Compound II. The cells can be obtained by the method described in (3) described later. The cell membrane fraction can be obtained as a fraction obtained by crushing the cells in an appropriate buffer and centrifuging.
  As a ligand, (i) T4, (ii) isoconazole, (iii) compound I, (iv) any derivative of T4, isoconazole, compound I and compound II, which binds to GPCR-T4 and binds GPCR-T4 Those that can be activated and pharmacologically acceptable salts of any of compounds (v) (i)-(iv) can be used. These ligands are It can be obtained by the method described in (1).
  As test substances, Examples thereof include the substances described in (1).
  When a ligand binds to GPCR-T4 and activates, the trimeric G protein conjugated to GPCR-T4 dissociates into Gα subunit and βγ subunit having GTPase activity, and Gα is exchanged for GDP. GTP binds. Moreover, various cell responses occur by signal transmission through the dissociated Gα subunit or βγ subunit. The degree of activation of GPCR-T4 in the screening method (B) can be measured using (a) the amount of GTPγS bound to Gα, (b) GTPase activity, and (c) the degree of cell response as an index.
(A) Screening method for measuring the amount of GTPγS binding to Gα
  The amount of GTPγS bound to Gα is described in the literature [Mol. Pharmacol. ,47, 848-854 (1995), WO 98/46995], labeled GTPγS is added to cells expressing GPCR-T4 or to the cell membrane fraction of the cells, and GTPγS is added to the cells or cell membrane fraction. It can be measured as the amount of binding. GTPγS binds to Gα in the same manner as GTP, but does not undergo hydrolysis by Gα, so the amount of binding can be accurately measured. Examples of labeled GTPγS include³⁵GTPγS labeled with S can be used.
  Specifically, a constant amount of radioactivity labeled with (i) a test substance, a certain amount of ligand, GDP and a radioisotope in a buffer solution containing a certain amount of a cell expressing GPCR-T4 or a cell membrane fraction of the cell. (Ii) added with a certain amount of ligand, GDP and a radioactive amount of GTPγS labeled with radioactive isotope, (iii) labeled with a certain amount of ligand, GDP, radioactive isotope Each of them is prepared and reacted with a certain amount of GTPγS and a large excess of unlabeled GTPγS added thereto. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably 4 to 37 ° C., for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. (I)-(iii) After reacting, after filtering with glass fiber filter paper etc. and washing | cleaning with a suitable amount of buffer solutions, the radioactivity amount which remains on glass fiber filter paper is measured with radiation measuring apparatuses, such as a liquid scintillation counter. The value obtained by subtracting the amount of radioactivity of (iii) (nonspecific binding amount: NSB) from the amount of radioactivity (total binding amount: B) of (i) and (ii) Calculated as the amount of static coupling.
  The specific binding amount of GTPγS in the absence of the test substance in (ii) is compared with the specific binding amount of GTPγS in the presence of the test substance in (i), and a substance that decreases the specific binding amount of GTPγS is determined by GPCR. -Can be selected as an antagonist to T4. On the other hand, a substance that increases the specific binding amount of GTPγS can be selected as an agonist for GPCR-T4.
  For the selected substance, by conducting a similar assay using other GPCR-expressing cells or cell membrane fractions of the cells instead of GPCR-T4 expressing cells or cell membrane fractions of the cells, It can be confirmed whether the agonist or antagonist is specific to GPCR-T4.
(B) Screening method for measuring GTPase activity
  GTPase activity has been reported in the literature [J. Biol. Che. ,271, 1857-1860 (1996), WO 98/46995], a GTP labeled with a radioisotope is added to a cell expressing GPCR-T4 or a cell membrane fraction of the cell as a substrate. And can be measured. Examples of GTP in which γ-position phosphate is labeled with a radioisotope include:³²P-labeled [γ-³²P] GTP can be used.
  Specifically, (i) a test substance, a fixed amount of ligand, and a γ-position phosphate labeled with a radioisotope in a buffer solution containing a fixed amount of a cell expressing GPCR-T4 or a cell membrane fraction of the cell And (ii) a mixture of a certain amount of ligand and a GTP with a certain amount of radioactivity labeled with a radioisotope, and a reaction thereof. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably 4 to 37 ° C., for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After reacting (i) and (ii), the supernatant of the reaction solution is collected by centrifugation, and the radioactivity of inorganic phosphoric acid (Pi) released into the supernatant is measured with a radiation measuring device such as a liquid scintillation counter And GTPase activity. Alternatively, the reaction solution is filtered with a glass fiber filter paper, washed with an appropriate amount of the same buffer, the filtrate is recovered, and the radioactivity of inorganic phosphoric acid (Pi) in the filtrate is measured with a radiation measuring device such as a liquid scintillation counter. You may measure with. By comparing the GTPase activity in the absence of the test substance of (ii) and the GTPase activity in the presence of the test substance of (i), a substance that decreases the GTPase activity can be selected as an antagonist for GPCR-T4. On the other hand, a substance that increases GTPase activity can be selected as an agonist for GPCR-T4.
  For the selected substance, by conducting a similar assay using other GPCR-expressing cells or cell membrane fractions of the cells instead of GPCR-T4 expressing cells or cell membrane fractions of the cells, It can be confirmed whether the agonist or antagonist is specific to GPCR-T4.
(C) Method for detecting cellular response
  Examples of cellular responses include arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein (eg, CREB, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, MAPK, ATF-2, c-Jun, c-fos, Iκ-Bα, Iκ-Bβ, Smad1, Smad2, Smad3, Smad5, Smad8, etc.) phosphorylation, c-fos activation, pH change, cell proliferation, melanin Examples include aggregation or diffusion of pigments, active oxygen production, nitric oxide production, or fluctuations in the expression level of reporter genes and marker genes. The response of these cells is described in the literature [J. Biol. Chem. ,271, 1857 (1996), Science,268, 98 (1995), J.A. Pharmacol. Exp. Ther. ,275, 1274 (1995), J.A. Biol. Chem. ,272, 1822 (1997), J. Am. Receive. Signal Transduct. Res. ,17, 57 (1997), Endocrinology138, 1400 (1997), Endocrinology138, 1471 (1997), Nat. Biotechnol. ,16, 1334 (1998), Biochem. Biophys. Res. Commun. ,251, 471 (1998), Br. J. et al. Pharmacol. ,125, 1387 (1998), Trends Biotechnol. ,15487 (1997), Anal. Biochem. ,252, 115 (1997), Nature,358, 325 (1992), Nature,393272 (1998), Cell,92573 (1998); Biol, Chem. ,272, 27497 (1997), Trends Pharmacol. Sci. ,18, 430 (1997), Trends Pharmacol. Sci. ,20, 370 (1999), WO 98/46995].
  When monitoring the response of a cell using a reporter system, for example, an appropriate reporter gene is placed downstream of the promoter sequence of a gene whose expression is induced by activation of GPCR-T4 in cells expressing GPCR-T4. By introducing the linked DNA, the activation of GPCR-T4 can be measured by the expression of the reporter gene. Examples of the promoter include an ICAM-1 gene promoter, a c-fos promoter, and a Krox-24 promoter [Biochem. J. et al. ,320, 145 (1996)]. The promoter may be an artificial promoter composed of a binding sequence of an appropriate transcription factor and a basic promoter. As a transcription factor binding sequence, G_iSRE (serum response element) that activates transcription with activation of GPCR coupled to_iCRE (cAMP reactive element) in which transcription is repressed with activation of GPCR coupled to, etc. can be used. Gα_sOf the C-terminal 5 amino acids of Gα_iChimeric Gα substituted with 5 amino acids of C-terminal_sIs expressed in GPCR-T4 expressing cells,_sFrom an artificial promoter containing a CRE that activates transcription in association with the activation of a GPCR coupled to the GPCR,_iThe expression of the reporter gene can be induced with the activation of the GPCR to which is coupled.
  Any reporter gene can be used as the reporter gene, for example, firefly luciferase gene, Renilla luciferase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase gene, β-lactamase gene The aequorin gene and the green fluorescent protein gene can be used.
  Specifically, cells expressing GPCR-T4 polypeptide are cultured in a multiwell plate or the like. Replace with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells as necessary, and prepare (i) a test substance and a certain amount of ligand, and (ii) a certain amount of ligand only. And incubate for a period of time. After incubation, cellular responses (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH fluctuation, cell proliferation activity, aggregation or diffusion of melanin pigment, activity Oxygen production, nitric oxide production, reporter gene expression level, etc.) are measured. When the production of a substance (for example, arachidonic acid) used as an index of cell stimulating activity is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added and quantified.
  Further, the activity such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells in which the amount of cAMP production in the cells has been increased with forskolin or the like.
  By comparing the degree of cell response in the absence of the test substance in (ii) and the degree of cell response in the presence of the test substance in (i), a substance that decreases the cell response is used as an antagonist to GPCR-T4. You can choose. On the other hand, a substance that increases the cellular response can be selected as an agonist for GPCR-T4.
  For the selected substance, by conducting a similar assay using other GPCR-expressing cells or cell membrane fractions of the cells instead of GPCR-T4 expressing cells or cell membrane fractions of the cells, It can be confirmed whether the agonist or antagonist is specific to GPCR-T4.
(3) Preparation of GPCR-T4 expressing cells and GPCR-T4 polypeptide
(A) Preparation of cells expressing GPCR-T4
  Cells that express GPCR-T4 can be prepared from mammalian cells or tissues that naturally express GPCR-T4. Moreover, it can obtain as a transformed cell which introduce | transduced into the host cell the expression vector containing DNA which codes GPCR-T4. 2. To perform the screening described in (1) and (2) with high sensitivity, In order to perform screening using the constitutive activity of GPCR-T4 described below, it is preferable to use transformed cells that express GPCR-T4 in large quantities.
  Cells or tissues that naturally express GPCR-T4 include polymorphonuclear leukocytes, T cells, monocytes, bone marrow, spleen, thyroid, placenta, lung, trachea, in which the expression level of GPCR-T4 gene is observed at the mRNA level. And cells such as lymph nodes, skeletal muscle, testis, spinal cord, fetal liver, fetal lung, and cell lines such as HL-60 and Hut78. In particular, polymorphonuclear leukocytes, bone marrow, spleen, thyroid and placenta are preferred.
  In addition, a recombinant DNA in which a DNA encoding GPCR-T4 is inserted downstream of the promoter of an appropriate expression vector is constructed, and the recombinant DNA is introduced into a host cell to transform GPCR-T4. Cells can be obtained.
  The DNA encoding GPCR-T4 may be any DNA as long as it encodes GPCR-T4. Specific examples include (a) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, (b) SEQ ID NO: 1 (C) hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and T4, isoconazole, compound I and Examples thereof include DNA encoding a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of Compound II.
  Examples of the DNA corresponding to the above (a) include cDNA clone c-hep15374 (Helix Laboratory). Further, a DNA comprising a 5′-terminal 20-40 base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 at the 3 ′ end, and a DNA comprising a 3′-terminal 20-40 base complementary sequence at the 3 ′ end. Are synthesized with a DNA synthesizer, cDNA is prepared from tissues or cells expressing GPCR-T4, DNA corresponding to the above (a) is obtained by PCR using the cDNA as a template and two types of synthetic DNA as primers. Can be amplified and isolated. Preparation of chromosomal DNA or cDNA from tissues or cells, and PCR can be performed according to the method described in Molecular Cloning 3rd edition.
  DNA that encodes a polypeptide having the activity to react with T4 and that hybridizes under the stringent conditions of (c) above can be obtained by using a colony hybridization method or plaque using the DNA described in (a) as a probe. -Obtained by using a hybridization method or the like. As a specific example of DNA that hybridizes under stringent conditions, DNA derived from colonies or plaques immobilized on a filter is used in the presence of 0.7 to 1.0 mol / L NaCl in the presence of 42 to 65 probes. After hybridization at 0 ° C., the filter can be washed at 42 to 65 ° C. with an SSC solution having a concentration of 0.1 to 2 times. As a result, DNA to be identified can be raised. Hybridization is described in Molecular Cloning, 3rd edition, Current Protocols in Molecular Biology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) and the like. It can be performed according to. As DNA that can be hybridized, in the alignment creation tool BLAST 2 Sequences between two sequences, using a homology analysis program blastn between base sequences, default conditions (reward for a match: 1, penalty for a mismatch: -2 , Open gap: 5 penalties, extension gap: 2 penalties, gap x_dropoff: 50, expect: 10, word size: 11). When an alignment between two sequences is prepared, it is represented by SEQ ID NO: 2 above. DNA containing a nucleotide sequence having at least 70% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more homology with the nucleotide sequence. I can make it. As a specific example of such DNA, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 having the homology of 99.8% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 DNA comprising the coding region sequence of human cDNA encoding), the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 having 74% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (amino acid represented by SEQ ID NO: 26) DNA containing the sequence of the coding region of mouse cDNA encoding the sequence).
  As the host cell, any prokaryotic cell, yeast, animal cell, insect cell, plant cell, etc. can be used as long as it can express GPCR-T4, but the GPCR-T4 expressed by the transformed cell is high. In order to maintain the following structure and retain the binding ability and functionality to the ligand, it is preferably expressed in yeast, insect cells, animal cells, plant cells and the like.
  As an expression vector, a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position suitable for transcription of DNA encoding GPCR-T4 can be used. .
  When a prokaryote such as a bacterium is used as a host cell, an expression vector for DNA encoding GPCR-T4 is capable of autonomous replication in a prokaryote, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, a novel receptor gene, a transcription termination sequence It is preferable that it is comprised more. A gene that controls the promoter may also be included.
  Examples of expression vectors include pSE420 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem,48669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem. ,53, 277, (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,824306 (1985)], pBluescript II SK (-) (Stratagene), pTrs30 [prepared from transformed E. coli strain (FERM BP-5407)], pTrs32 [prepared from transformed E. coli strain (FERM BP-5408)] PGHA2 [prepared from transformed E. coli strain (FERM BP-400)], pGKA2 [prepared from transformed E. coli strain (FERM P-6798)], pTerm2 (JP-A-3-22979), pGEX-2T (Amersham Biosciences) And pET (manufactured by Novagen), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pKK223-2 (manufactured by Amersham Biosciences), pMAL-c2 (manufactured by New England Biolabs), and the like.
  Any promoter can be used as long as it can be expressed in prokaryotic cells such as Escherichia coli. For example,trppromoter,lacPromoter, P_LPromoter, P_RExamples of the promoter include promoters derived from E. coli and phages, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, and the like. AlsotrpA promoter in which two promoters are connected in series,tacAn artificially designed and modified promoter such as a promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
  As the ribosome binding sequence, it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the start codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  Although the transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.Escherichia coli  XL1-Blue,Escherichia coli  XL2-Blue,Escherichia coli  DH1,Escherichia coli  MC1000,Escherichia coli  KY3276,Escherichia coli  W1485,Escherichia coli  JM109,Escherichia coli  HB101,Escherichia coli  No. 49,Escherichia coli  W3110,Escherichia coli  NY49,Escherichia coli  BL21 (DE3),Escherichia coli  BL21 (DE3) pLysS,Escherichia coli  HMS174 (DE3),Escherichia coli  HMS174 (DE3) pLysS,Serratia ficaria,Serratia fonticola,Serratia liquidfaciens,Serratia marcescens,Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefaciens,Corynebacterium amoniagenes,Brevibacterium immariophilum  ATCC 14068,Brevibacterium saccharolyticum  ATCC 14066,Corynebacterium glutamicum  ATCC 13032,Corynebacterium glutamicum  ATCC 14067,Corynebacterium glutamicum  ATCC 13869,Corynebacterium acetoacidophilum  ATCC 13870,Microbacterium amoniaphilum  ATCC 15354,Pseudomonas  sp. D-0110 etc. can be mentioned.
  As a method for introducing the recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, electroporation [Nucleic Acids Res. ,16, 6127 (1988)], a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), Gene,17107 (1982) and Mol. Gen. Genet. ,168111 (1979).
  When yeast strains are used as host cells, examples of expression vectors include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains. For example, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, CUP Promoters such as 1 promoter can be mentioned.
  Examples of host cells include yeast strains belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Sivaniomyces, and the like.Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis,Trichosporon pullulans,Schwanniomyces alluviusEtc. Moreover, mutant strains suitable for GPCR expression and yeast expressing modified Gα protein [Trends Biotechnol. ,15487 (1997), Mol. Cell. Biol. ,156188 (1995), Mol. Cell. Biol. ,164700 (1996)] can also be used as a host.
  As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into yeast can be used. For example, electroporation [Methods. Enzymol. ,194, 182 (1990)], spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)], lithium acetate method [J. Bacteriol. ,153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA,751929 (1978), and the like.
  When animal cells are used as host cells, examples of expression vectors include pcDNA3.1 (+), pCDM8, pAGE107, pREP4, pAGE103, pAMo, pAMoA, pAS3-3, and the like. In particular vectors for inducible expression, for exampleSaccharomyces cerevisiaeChimeric protein (Gal4-ER) [Cell, a DNA binding region of transcription factor Gal4 derived from a ligand binding region of estrogen receptor54, 199 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1657 (1993)], pAGal9-d, pAGal9-nd, and the like that can be induced by addition of 17β-estradiol are preferred. In addition, vectors such as pAMo, pAMoA, pAGal9-d, and pAGal9-nd having Epstein-Barr virus oriP as replication origins are Epstein-Barr virus EBNA- such as Namalwa cells and Namalwa KJM-1 cells. When a B cell strain that expresses one gene is used as a host cell, it stably exists in the form of a plasmid outside the chromosome, so that a transformant exhibiting high expression can be easily obtained.
  Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells. For example, cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene promoter, SV40 early promoter, Moloney murine leukemia virus (Mo ) Long terminal repeat promoter, retrovirus promoter, heat shock promoter, SRα promoter, metallothionein promoter, and the like. Further, an enhancer of human GMV IE gene may be used together with a promoter.
  As host cells, mouse myeloma cells, rat myeloma cells, mouse hybridoma cells, CHO cells, BHK cells, African green monkey kidney cells, Namalwa cells, Namalwa KJM-1 cells, human fetal kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299), human colorectal cancer cell lines, frog oocytes, frog melanocytes, and the like.
  Furthermore, as mouse myeloma cells, SP2 / 0, NSO, etc., rat myeloma cells, YB2 / 0, etc., human fetal kidney cells, HEK293, etc., human leukemia cells, BALL-1, etc., African green monkey kidney cells, etc. Includes COS-1, COS-7, and HCT-15 as a human colon cancer cell line.
  As a method for introducing a recombinant vector, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells. For example, an electroporation method [Cytotechnology,3133 (1990)], calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,847413 (1987)], Virology,52456 (1973). The transformant can be obtained and cultured according to the method described in JP-A-2-227075 or JP-A-2-257891.
  In the case of using insect cells as a host, for example, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. et al. H. Freeman and Company, New York (1992), Molecular Biology 3rd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Bio / Technology,6, 47 (1988), etc., insect cells expressing GPCR-T4 can be obtained.
  In other words, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the insect is further infected with the recombinant virus to express the polypeptide. Cells can be obtained.
  Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  As baculovirus, for example, outgrapha californica nuclea polyhedrosis virus (virus that infects genus insects)Autographa californica  (nuclear polyhedrovirus) or the like can be used.
  As an insect cell,Spodoptera frugiperdaOvary cells,Trichoplusia niOvary cells, cultured cells derived from silkworm ovary, and the like can be used.Spodoptera frugiperdaSf9, Sf21 [(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], etc.,Trichoplusia niAs ovary cells of the above, High5 (manufactured by Invitrogen), etc., as cultured cells derived from silkworm ovaryBombyx mori  N4 etc. can be mentioned.
  Examples of the method for co-introducing the recombinant gene introduction vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,847413 (1987)] and the like. In addition, DNA can be introduced into insect cells using a method similar to the method for introducing DNA into animal cells. For example, electroporation [Cytotechnology,3133 (1990)], calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,847413 (1987)].
  When using plant cells as a host, known methods [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology,15, 45 (1997)], plant cells expressing GPCR-T4 can be obtained.
  Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include cauliflower mosaic virus 35S promoter and rice actin 1 promoter. In addition, the gene expression efficiency can be increased by inserting intron 1 of the corn alcohol dehydrogenase gene between the promoter and the gene to be expressed.
  Examples of host cells include plant cells such as potato, tobacco, corn, rice, rape, soybean, tomato, wheat, barley, rye, alfalfa, and flax.
  As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into plant cells can be used. For example, Agrobacterium (Agrobacterium) (JP 59-140885, JP 60-70080, WO 94/00977), Electroporation [Cytotechnology,3133 (1990), JP-A-60-251887], a method using a particle gun (gene gun) (Japanese Patent No. 2606856, Japanese Patent No. 2517813), and the like.
(B) Preparation of GPCR-T4 polypeptide
  The GPCR-T4 polypeptide can be prepared by a known protein purification method from mammalian cells or tissues that naturally express the GPCR-T4. For example, after homogenizing a mammalian tissue or cell, extraction with an acid or the like is performed, and the extract can be isolated and purified by combining chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography.
  In addition, a transformed cell into which an expression vector containing a DNA encoding GPCR-T4 obtained in (1) is introduced is cultured according to a normal culture method, GPCR-T4 is produced and accumulated, and GPCR-T4 is produced from the culture. GPCR-T4 can be prepared by collecting.
  When the transformed cell expressing GPCR-T4 is a prokaryotic organism such as E. coli or a eukaryotic microorganism such as yeast, the medium for culturing these organisms is a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the organism. Any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as the medium can contain the yeast and can efficiently culture the transformant.
  Any carbon source may be used as long as the transformant can assimilate, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, Alcohols such as ethanol and propanol are used.
  Examples of nitrogen sources include ammonium salts of various inorganic and organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, and casein. A hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
  As the inorganic salt, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 16 to 96 hours. During the culture, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like. Moreover, you may add antibiotics, such as an ampicillin and a tetracycline, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
  When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example,lacWhen culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, isopropyl-β-D-thiogalactoside,trpWhen culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  When the transformed cell expressing GPCR-T4 is an animal cell, the culture medium for culturing the cell is a commonly used RPMI 1640 medium [J. Am. Med. Assoc. ,199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science,122, 501 (1952)], Dulbecco's modified Eagle medium [Virology,8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ,73, 1 (1950)] or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums. Culture is usually pH 6-8, 30-40 ° C., 5% CO₂Perform for 1-7 days under conditions such as presence. Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin and penicillin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
  As a medium for culturing a transformant obtained using insect cells as host cells, commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Invitrogen), EX- CELL 400, EX-CELL 405 (manufactured by JRH Biosciences), Grace's insect medium [Nature,195, 788 (1962)] or the like.
  The culture conditions are preferably pH 6-7, the culture temperature is 25-30 ° C., and the culture time is usually preferably 1-5 days. Moreover, you may add antibiotics, such as a gentamicin, to a culture medium as needed during culture | cultivation.
  GPCR-T4 can also be expressed as a secreted protein or a fusion protein according to the method described in Molecular Cloning 3rd Edition. Proteins to be fused include β-galactosidase, protein A, IgG binding region of protein A, chloramphenicol acetyltransferase, poly (protein), poly (Glu), protein G, maltose binding protein, glutathione S-transferase, Polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA-binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green fluorescent protein, FLAG peptide, and epitope of any antibody, etc. [Akio Yamakawa, Experimental Medicine,13, 469-474 (1995)]. These proteins can also be used as tags for purification and detection added to GPCR-T4. The tag can be added anywhere, but when expressed in mammalian cells, it is preferably added to the extracellular region or intracellular region.
  GPCR-T4 can be produced in a host cell, secreted outside the host cell, or produced on the host cell membrane. The host cell to be used and the structure of the polypeptide to be produced are changed. This method can be selected.
  When secreting and expressing outside the host cell, or when expressing on the host cell membrane, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of GPCR-T4 as necessary. In some cases, it is better to add the secretion signal after partially deleting the N-terminus of GPCR-T4. When the host is Escherichia, alkaline phosphatase signal sequence, OmpA signal sequence, etc., and when the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. are used in yeast. In some cases, the mating factor α signal sequence, invertase signal sequence, etc. When the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used. .
  When animal cells are used as a host, the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like according to the method described in JP-A-2-227075.
  In order to isolate and purify a GPCR-T4 polypeptide from a culture of transformed cells that express GPCR-T4, conventional polypeptide isolation and purification methods can be used.
  For example, when GPCR-T4 accumulates in a dissolved state in cells of GPCR-T4 expressing transformed cells, the culture is centrifuged to collect the cells in the culture, and after washing the cells, A cell-free extract is obtained by crushing cells with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, Dynomill or the like.
  From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) Anion exchange chromatography method using resin, cation exchange chromatography method using resin such as S-Sepharose FF (Amersham Biosciences), butyl sepharose, phenyl sepharose, etc. To obtain purified preparations using methods such as hydrophobic chromatography using resin, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoretic methods such as isoelectric focusing Can do.
  When GPCR-T4 accumulates on the cell membrane of GPCR-T4-expressing transformed cells, the cells are similarly collected and disrupted, and after obtaining a membrane fraction by centrifugation or filtration, the interface such as Triton X-100 is obtained. After solubilizing GPCR-T4 from the membrane using an activator, a purified preparation can be obtained by the same isolation / purification method as described above.
  In addition, when GPCR-T4 is expressed in the form of an insoluble substance in the cell, GPCR-T4 is similarly collected from the precipitate fraction obtained by crushing the cell after collection and centrifugation. After recovery, the insoluble material of GPCR-T4 is solubilized with a denaturing agent. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a dilute solution that does not contain a denaturing agent or the denaturing agent does not denature GPCR-T4. A purified sample can be obtained by the same isolation / purification method as described above.
  When GPCR-T4 is secreted extracellularly, the culture is treated by a technique such as centrifugation to obtain a soluble fraction. From the soluble fraction, a purified GPCR-T4 preparation can be obtained by the same method as the isolation / purification method from the cell-free extract supernatant.
  GPCR-T4 can also be produced as a fusion protein with other proteins and purified using affinity chromatography using a substance having affinity for the fused protein [Akio Yamakawa, Experimental Medicine,13, 469-474 (1995)]. For example, the method of Law et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 8227 (1989), Genes Develop. ,4, 1288 (1990)], JP 05-336963, WO94 / 23201, GPCR-T4 can be produced as a fusion protein with protein A and purified by affinity chromatography using IgG. . In addition, GPCR-T4 can be produced as a fusion protein with a FLAG peptide and purified by affinity chromatography using an anti-FLAG antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 8227 (1989), Genes Develop. ,4, 1288 (1990)].
  Furthermore, it can also be purified by affinity chromatography using an antibody against GPCR-T4.
  Further, a known method [J. Biomolecular NMR,6, 129, Science,2421162 (1988), J. Am. Biochem. ,110, 166 (1991)],in vitroGPCR-T4 can also be produced using a transcription / translation system.
  Furthermore, GPCR-T4 can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc (fluorenylmethyloxycarbonyl) method and the tBoc (t-butyloxycarbonyl) method. Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Shimadzu Corporation.
  When the GPCR-T4 polypeptide obtained by the above method is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, it is known. It can be converted into a free form or other salt by a method or a method analogous thereto.
(4) Kit for screening for agonist or antagonist for GPCR-T4
  The kit for screening for an agonist or antagonist for GPCR-T4 includes (i) GPCR-T4 polypeptide or a salt thereof, or a cell expressing GPCR-T4 or a membrane fraction of the cell, and (ii) a ligand. .
(I) GPCR-T4 polypeptide or a salt thereof, a cell expressing GPCR-T4, or a membrane fraction of the cell
  Cells expressing GPCR-T4 can be prepared by the method described in (3) above. The membrane fraction of the cells can be obtained as a fraction precipitated by crushing the cells prepared by the method described in (3) above in an appropriate buffer and centrifuging. GPCR-T4 polypeptide or a salt thereof can be prepared by the method described in (3) above. However, when the screening method is a method in which the degree of activation of GPCR-T4 is measured by (a) the amount of GTPγS bound to Gα or (b) GTPase activity, it is not a GPCR-T4 polypeptide or a salt thereof, In the case of screening using a cell that expresses GPCR-T4 or a membrane fraction of the cell and measuring the degree of activation of GPCR-T4 using (c) the degree of cell response as an index, Use expressing cells.
(Ii) Ligand
  (A) T4, (b) Isoconazole, (c) Compound I, (d) Compound II, (e) A derivative of any compound of (a) to (d) that binds to GPCR-T4, and (F) A pharmacologically acceptable salt of the compound of any one of (a) to (e) can be used, provided that the screening method measures the amount of ligand binding to GPCR-T4. In the case of,¹²⁵Both radiolabeled and unlabeled ligands such as I are prepared. These ligands can be prepared by the method described in (1).
  In addition to this, the kit includes (iii) an appropriate buffer used for the preparation and washing of reagents for measurement, (iv) a medium used for culturing cells expressing GPCR-T4, and (v) used for measurement. It may further contain a multiwell plate, (vi) reagents necessary for measuring the degree of activation of GPCR-T4 (the amount of GTPγS bound to Gα, GTPase activity, cell response), and the like.
  Below, the specific example of the reagent of the kit by the method of measuring the binding amount of the ligand to GPCR-T4 and the measuring method of the kit are described.
(A) Kit reagents
(I) Cells expressing GPCR-T4
  A CHO cell expressing GPCR-T4.
(Ii) Labeled ligand
¹²⁵An aqueous solution of T4 labeled with I. Store at 4 ° C or -20 ° C. At the time of use, it is diluted to 1 μmol / L with the measurement buffer solution (d).
(Iii) Ligand standard solution
  1 mmol / L unlabeled T4 solution prepared in PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Store at -20 ° C.
(Iv) Buffer for measurement
  Hanks' Balanced Salt Solution containing 0.05% BSA. The solution may be sterilized by filtration with a 0.45 μm filter and stored at 4 ° C. or may be prepared at the time of use.
(E) Measurement method
  (I) GPCR-T4 expressing CHO cells were placed in a 12-well tissue culture plate at 5 × 10⁵Seeded per piece / well, 5% CO₂Incubate for 2 days at 37 ° C. After washing twice with 1 ml of measurement buffer, 490 μl of measurement buffer is added to each well.
  (Ii) 10^-3-10^-10After 5 μl of a mol / L test substance solution is added, 5 μl of a labeled ligand is added and reacted at room temperature for 1 hour. For the determination of the maximum binding amount, only the labeled ligand is added without adding the test substance. In order to know the amount of non-specific binding, 5 μl of 10 mmol / L ligand standard solution is added instead of the test substance. As a test substance, the substance described in the above (1) can be used.
  (Iii) Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. Cells are lysed with lysis solution (0.2 mol / L NaOH, 1% SDS) and mixed with 4 ml of liquid scintillator.
  (Iv) The radioactivity is measured using a liquid scintillation counter, and the percent (Maximum Binding: PMB) with respect to the maximum binding amount is determined by the following formula.
PMB = (B−NSB) ÷ B₀× 100
  B: Value when the sample is added
  NSB: Non-specific binding (non-specific binding amount)
  B₀: Maximum binding amount
  An agonist or antagonist for GPCR-T4 can be obtained using the screening method described in (1) or (2) or the screening kit described in (4).
3. Screening method using constitutive activity
  The present inventors found for the first time in this study that GPCR-T4 is a constitutively active GPCR. Since GPCR-T4 is a constitutively active GPCR, a signal through the G protein can flow even in the absence of a ligand. Therefore, if the constitutive activity of GPCR-T4 is utilized, In the screening method for measuring the degree of activation of GPCR-T4 described in (2), an agonist or inverse agonist for GPCR-T4 can be screened without adding a ligand.
  4. As described later, an agonist or an antagonist (including an inverse agonist) for GPCR-T4 is a thyroid function controlling action, a neutrophil activation promoting action or an activation inhibiting action, and an inflammatory disease preventing or treating action. Since it is a compound having an action to prevent or treat asthma, an action to prevent or treat chronic obstructive pulmonary disease, or an action to prevent or treat infectious diseases, a method capable of screening for agonists or inverse agonists is also a screening method for these compounds. Become.
  Cells expressing GPCR-T4 are 2. The cell described in (2) can be used. The cell membrane fraction is 2. It can be prepared in the same manner as described in (2).
(A) Screening method for measuring the amount of GTPγS binding to Gα
  The amount of GTPγS bound to Gα is 2. It can be measured in the same manner as described in (2). Specifically, (i) a certain amount of GTPγS labeled with a test substance, GDP and a radioisotope was added to a buffer solution containing a certain amount of a cell expressing GPCR-T4 or a cell membrane fraction of the cell. (Ii) a certain amount of GTPγS labeled with GDP and radioactive isotopes, (iii) a certain amount of GTPγS labeled with GDP, radioactive isotopes and a large excess of unlabeled GTPγS. Prepare each added one and react. Reaction, measurement and calculation of specific binding amount are as follows. Performed in the same manner as described in (2).
  The specific binding amount of GTPγS in the absence of the test substance in (ii) is compared with the specific binding amount of GTPγS in the presence of the test substance in (i), and a substance that decreases the specific binding amount of GTPγS is determined by GPCR. -It can be selected as an inverse agonist for T4. In addition, a substance that increases the specific binding amount of GTPγS can be selected as an agonist for GPCR-T4.
(B) Screening method for measuring GTPase activity
  GTPase activity is It can be measured in the same manner as described in (2).
  Specifically, GTP-T4 expressing cells or a buffer solution containing a certain amount of cell membrane fraction of the cells, (i) a test substance and a GTP with a certain radioactivity obtained by labeling the γ-phosphate with a radioisotope And (ii) those having only a certain amount of GTP labeled with a radioactive isotope labeled with γ-position phosphate are prepared and reacted. 1. Reaction and GTPase activity Measure in the same manner as described in (2). By comparing the GTPase activity in the absence of the test substance in (ii) and the GTPase activity in the presence of the test substance in (i), a substance that decreases the GTPase activity can be selected as an inverse agonist for GPCR-T4. . In addition, a substance that increases GTPase activity can be selected as an agonist for GPCR-T4.
(C) Method for detecting cellular response
  The cell response is 2. It can be measured in the same manner as described in (2).
  Specifically, cells expressing GPCR-T4 are cultured in a multiwell plate or the like. After culturing, replace with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells as necessary. Prepare (i) the test substance added and (ii) the test substance not added for a certain period of time. Incubate. 1. Incubate cell response after incubation. (2) Measured as described in (c). By comparing the degree of cell response in the absence of the test substance of (ii) and the degree of cell response in the presence of the test substance of (i), a substance that decreases the cell response is determined as an inverse agonist for GPCR-T4. Can be selected. Moreover, the substance which increases the response of a cell can be selected as an agonist with respect to GPCR-T4.
4). Agonists and antagonists for GPCR-T4 and methods of using these substances
(1) Agonists and antagonists for GPCR-T4
  Examples of agonists for GPCR-T4 include T4, isoconazole, compound I, and pharmacologically acceptable salts of these compounds.
  Examples of antagonists for GPCR-T4 include Compound II and pharmacologically acceptable salts of Compound II.
  In addition, a derivative of T4, a derivative of isconazole, a derivative of compound I or a derivative of compound II is likely to be an agonist or antagonist for GPCR-T4.
  1. An antibody that specifically binds to GPCR-T4 is used as a test substance. (2) or 3. The antibody that acts as an agonist and the antibody that acts as an antagonist can be selected by evaluating according to the screening method described in 1. above. An antibody that specifically binds to GPCR-T4 can be obtained according to the method described in (5) below.
(2) Use for functional analysis
  An agonist or antagonist for GPCR-T4, which can be obtained by the screening method described in 2 and 3 above, is contacted with a tissue or cell expressing GPCR-T4, and the response of GPCR-T4 is measured. The function can be revealed. Examples of cellular responses include arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca²⁺Release, intracellular cAMP production, intracellular cAMP reduction, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein (eg, CREB, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, MAPK, ATF-2, c-Jun, c-fos, Iκ-Bα, Iκ-Bβ, Smad1, Smad2, Smad3, Smad5, Smad8, etc.) phosphorylation, c-fos activation, pH change, cell proliferation, activity Examples include oxygen production, nitric oxide production, and expression levels of reporter genes and marker genes. As an agonist for GPCR-T4, for example, T4, isoconazole or Compound I can be used. As an antagonist for GPCR-T4, for example, Compound II can be used.
(3) Use for treatment and prevention of diseases
  GPCR-T4 is highly expressed in human peripheral polymorphonuclear leukocytes. Further, as shown in Example 8, when human peripheral polymorphonuclear leukocytes are stimulated with T4 or isonconazole, which is an agonist for GPCR-T4, phosphorylation (activation) of ERK MAPK during steady state or GM-CSF stimulation is observed. It is suppressed. In neutrophils, it is known that priming and activation occur due to activation of ERK MAPK. Therefore, agonists for GPCR-T4 are neutrophil activation inhibitors and antagonists are neutrophils. It is considered useful as a sphere activation promoter. Excessive activation of neutrophils in inflammation is known to cause tissue damage. In addition, in asthma and chronic obstructive pulmonary disease, it is known that activation of neutrophils derived from inflammation and infection causes disorder of lung tissue and worsens the disease. Therefore, agonists for GPCR-T4 are considered useful for suppressing tissue damage by neutrophils, preventing and treating inflammatory diseases, preventing and treating asthma, or preventing and treating chronic obstructive pulmonary disease. Moreover, the antagonist with respect to GPCR-T4 is thought to be useful for the prevention and treatment of infectious diseases by activating neutrophils.
  Since GPCR-T4 is highly expressed also in the thyroid gland, it is considered that T4 produced from the thyroid gland controls the function of the thyroid gland via GPCR-T4. Therefore, agonists or antagonists for GPCR-T4 are considered useful for the control of thyroid function.
(4) A medicine containing an agonist or antagonist for GPCR-T4 as an active ingredient
  Although the agonist or antagonist for GPCR-T4 can be used alone as a therapeutic or prophylactic agent for the disease described in (3), it is usually desirable to provide it as various pharmaceutical preparations. These pharmaceutical preparations are used for animals or humans.
  The pharmaceutical preparation according to the present invention may contain the above-mentioned active ingredient or a pharmacologically acceptable salt thereof alone or as a mixture with any other active ingredient for treatment. These pharmaceutical preparations are produced by any method well known in the technical field of pharmaceutics by mixing the active ingredient together with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  As the administration route, it is desirable to use the most effective one for prevention or treatment, and examples thereof include oral or parenteral such as intravenous administration.
  Examples of the dosage form include tablets and injections.
  For example, tablets suitable for oral administration include excipients such as lactose and mannitol, disintegrants such as starch, lubricants such as magnesium stearate, binders such as hydroxypropylcellulose, surfactants such as fatty acid esters It can be produced using a plasticizer such as glycerin as an additive.
  Formulations suitable for parenteral administration preferably comprise a sterile aqueous solution containing the active compound that is isotonic with the blood of the recipient. For example, in the case of an injection, a solution for injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution. In these parenterals, one kind selected from excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and diluents, preservatives, flavors and the like exemplified in the oral preparations. Or more auxiliary components can be added.
  The active ingredient or a pharmacologically acceptable salt thereof is usually administered systemically or locally in an oral or parenteral form when used for the above purpose. The dose and frequency of administration vary depending on the dosage form, patient age, body weight, nature or severity of symptoms to be treated, etc., but usually oral, 0.01 to 1000 mg per adult, The dose is preferably in the range of 0.05 to 500 mg once to several times a day. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, usually 0.001-1000 mg, preferably 0.01-300 mg per adult is administered once to several times a day, or in the range of 1-24 hours per day. Administer intravenously. However, the dose and the number of doses vary depending on the various conditions described above.
(5) Preparation of an antibody that specifically binds to GPCR-T4
(I) Preparation of polyclonal antibody
  2. The GPCR-T4 polypeptide obtained by the method according to (3), a cell expressing GPCR-T4 or a membrane fraction of the cell, or a partial peptide of GPCR-T4 is used as an antigen, and GPCR is administered to an animal. -Polyclonal antibodies that specifically bind to T4 can be made. Examples of the partial peptide of GPCR-T4 include a peptide consisting of a sequence of 5 to 50 residues of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the like. A partial peptide of GPCR-T4 can be synthesized by a peptide synthesizer.
  Examples of animals to which the antigen is administered include rabbits, goats, rats, mice, hamsters and the like. The antigen may be administered as it is subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in an animal, but it may be administered with a highly antigenic carrier protein bound to the antigen or administered with an appropriate adjuvant. preferable. The dose of the antigen is preferably 50 to 100 μg per animal. Examples of carrier proteins include keyhole limpet hemocyanin, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin and the like, and adjuvants include Freund's complete adjuvant (Complete Freund's Adjuvant), aluminum hydroxide Examples include gels and pertussis vaccines.
  The antigen is administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood was collected from the fundus venous plexus, and the serum reacted with the antigen used for immunization. ELISA [Enzyme immunoassay 3rd edition, Medical School (1987), Antibodies-A Laboratory] Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  Polyclonal antibodies can be obtained by obtaining serum from the above animals whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
  Separation and purification methods include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, precipitation of caprylic acid (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)), or DEAE-Sepharose column, anion exchange. Examples of the method include a chromatography using a column, a protein A or G column, a gel filtration column, or the like, alone or in combination.
(II) Production of monoclonal antibodies
(A) Preparation of antibody-producing cells
  The animal whose serum showed a sufficient antibody titer against the partial peptide of GPCR-T4 polypeptide used for immunization can be used as a source of antibody-producing cells.
  The spleen is removed 3 to 7 days after the final administration of the antigenic substance to the animal showing the antibody titer. The spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. The spleen cells of the obtained precipitate fraction were treated with Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove erythrocytes and then washed 3 times with MEM medium. Used as a cell.
(B) Preparation of myeloma cells
  As myeloma cells, cell lines obtained from mice or rats are used.
  For example, 8-azaguanine resistant mice (BALB / c-derived) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 [Curr. Topics. Microbiol. Immunol. ,81, 1 (1978), Europ. J. et al. Immunol. ,6, 511 (1976)], SP2 / 0-Ag14 [Nature,276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 [J. Immunol. ,123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 [Nature,256, 495 (1975)].
  These cell lines consist of 8-azaguanine medium [RPMI 1640 medium supplemented with 1.5 mmol / L glutamine, 50 μmol / L 2-mercaptoethanol, 10 μg / mL gentamicin and 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as normal medium). ) And further supplemented with 15 μg / mL 8-azaguanine], but cultured in a normal medium 3 to 4 days before cell fusion.⁷Use more than one.
(C) Production of hybridoma
  The antibody-producing cells obtained in (a) and the myeloma cells obtained in (b) are mixed with MEM medium or PBS (1.83 g / L disodium phosphate, 0.21 g / L monopotassium phosphate, 7.65 g / L). Wash well with NaCl, pH 7.2), mix so that the number of cells is antibody-producing cells: myeloma cells = 5-10: 1, centrifuge at 1,200 rpm for 5 minutes, and discard the supernatant.
  Thoroughly loosen the cell group of the obtained precipitate fraction and stir the cell group at 37 ° C. with stirring.⁸0.2-1 mL of a solution prepared by mixing 2 g of polyethylene glycol-1000, 2 mL of MEM medium and 0.7 mL of dimethyl sulfoxide is added per antibody-producing cell, and 1-2 mL of MEM medium is added several times every 1-2 minutes. . After the addition, MEM medium is added to prepare a total volume of 50 mL.
  The preparation is centrifuged at 900 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. The cells of the obtained precipitate fraction are loosened gently, and then sucked with a pipette and blown out gently to give a HAT medium [0.1 mmol / L hypoxanthine, 15 μmol / L thymidine and 0.4 μmol / L amino in normal medium. Medium supplemented with pterin] Suspend in 100 mL.
  The suspension was dispensed into a 96-well culture plate at 100 μL / well, and 5% CO 2 was added.₂Incubate in an incubator at 37 ° C for 7-14 days. After culturing, a portion of the culture supernatant is taken, and a hybridoma that produces an antibody that specifically binds to GPCR-T4 is selected in the culture supernatant by enzyme immunoassay.
  The enzyme immunoassay can be performed as follows. At the time of immunization, the GPCR-T4 polypeptide used as an antigen or a partial peptide thereof is coated on a 96-well plate, the culture supernatant of the hybridoma is reacted as a first antibody, and an enzyme such as peroxidase, alkaline phosphatase, etc. After reacting with an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with, a reaction is performed using a reagent that develops color by reaction with the enzyme.
  Using the selected hybridoma, cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used), and stable. Those having a strong antibody titer are selected as hybridoma strains producing an antibody that specifically binds to GPCR-T4.
(D) Preparation of monoclonal antibody
  Hybridoma strain 5 obtained in (c) was applied to 8-10 week old mice or nude mice that were intraperitoneally administered with pristane (Pristane, 2,6,10,14-tetramethylpentadecane) 0.5 mL. ~ 20x10⁶Cells / animals are injected intraperitoneally. The hybridoma becomes ascites tumor in 10 to 21 days. Ascites is collected from the mouse with ascites tumor, and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids. From the obtained supernatant, a monoclonal antibody can be purified and obtained by the same method as that used for polyclonal.
5). Substance that increases or decreases the expression level of GPCR-T4 gene, and method for screening the substance
(1) Substance that increases or decreases the expression level of GPCR-T4 gene
  Substances that promote or suppress the transcription process of GPCR-T4 gene or the translation process from transcript to protein increase the amount of GPCR-T4 in cells by increasing or decreasing the expression level of GPCR-T4 gene Alternatively, it is possible to reduce and control the cellular function exerted through GPCR-T4. Therefore, a substance that promotes or suppresses the transcription process of the GPCR-T4 gene or the translation process from the transcript to the protein can enhance or suppress the physiological activity of the ligand for GPCR-T4. It is useful as a pharmaceutical composition that enhances or suppresses. Therefore, substances that increase the expression level of the GPCR-T4 gene include thyroid function regulators, neutrophil activation inhibitors, neutrophil tissue damage inhibitors, prophylactic and therapeutic agents for inflammatory diseases, asthma It is useful as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for or a preventive or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease. In addition, a substance that decreases the expression level of the GPCR-T4 gene is useful as a thyroid function regulator, a neutrophil activation promoter, or an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for infectious diseases.
  Examples of the substance that increases or decreases the expression level of the GPCR-T4 gene include substances selected by the method described later in (2). Further, a base sequence complementary to or substantially complementary to a sequence of 5 to 60 bases, preferably 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used. Antisense RNA / DNA technology [Bioscience and Industry,50322 (1992), chemistry,46, 681 (1991), Biotechnology,9, 358 (1992), Trends in Biotechnology,10, 87 (1992), Trends Biotechnol. ,10, 152 (1992), Cell engineering,16, 1463 (1997)], triple helix technology [Trends Biotechnol. ,10, 132 (1992)], ribozyme technology [Curr. Opin. Chem. Biol. ,3, 274 (1999), FEMS Microbiol. Rev. ,23, 257 (1999), Front. Biosci. ,4, D497 (1999), Chem. Biol. ,6, R33 (1999), Nucleic Acids Res. ,26, 5237 (1998), Trends Biotechnol. ,16, 438 (1998)], the expression of the GPCR-T4 gene can be suppressed. In order for the oligonucleotide to have an action capable of suppressing the expression of the GPCR-T4 gene based on the antisense RNA / DNA technology, it corresponds to the translation start point (corresponding to the 438th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2). And an oligonucleotide consisting of a base sequence containing a sequence complementary to the region near the translation start point. The substantially complementary base sequence has 90% or more homology with a sequence complementary to a sequence of 5 to 60 bases consecutive in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and is represented by SEQ ID NO: 2. A base sequence that hybridizes with a DNA comprising a base sequence under stringent conditions.
  Also, using a double-stranded oligonucleotide having a sequence of 5 to 60 bases that is continuous with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, the decoy DNA method [Japanese clinical,56563 (1998), Circ. Res. ,82, 1023 (1998), Exp. Nephrol. ,5429 (1997), Japanese clinical practice,54, 2583 (1996)] can suppress the expression of the GPCR-T4 gene.
  Examples of the oligonucleotide include DNA, RNA, and derivatives thereof. Examples of the derivative include an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, an oligonucleotide derivative in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to an N3′-P5 ′ phosphoramidate bond, Oligonucleotide derivatives in which ribose and phosphodiester bonds in nucleotides are converted to peptide nucleic acid bonds, oligonucleotide derivatives in which uracil in oligonucleotides is substituted with C-5 propynyluracil, uracil in oligonucleotides is C-5 thiazole Oligonucleotide derivatives substituted with uracil, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine, cytosine in the oligonucleotide is phenoxy Oligonucleotide derivative substituted with gin-modified cytosine, oligonucleotide derivative in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2'-o-propyl ribose, or oligo in which ribose in the oligonucleotide is substituted with 2'-methoxyethoxyribose Nucleotide derivatives, etc. [Kazutaka Yokoyama, Cell engineering,161463 (1997)]. Oligonucleotides can be synthesized with a DNA synthesizer commercially available from Applied Biosystems.
  In addition, a double-stranded RNA comprising a sequence corresponding to 19 to 25 consecutive nucleotides in the DNA sequence encoding GPCR-T4 and a sequence complementary to the sequence (hereinafter referred to as siRNA (short interfering RNA)) Alternatively, RNA that includes the sequence and a sequence that is complementary to the sequence and forms a hairpin structure (hereinafter referred to as shRNA (hereinafter referred to as short hairpin RNA)), RNA interference (hereinafter referred to as RNAi) [Nature,411494 (2001)] can suppress the expression of the GPCR-T4 gene. SiRNA and shRNA (hereinafter also referred to as GPCR-T4 siRNA and GPCR-T4 shRNA, respectively) used for suppression of GPCR-T4 gene expression can be prepared as follows. A sequence of 21 to 27 bases beginning with AA from the base sequence of cDNA encoding GPCR-T4 [AA (N)_19-25, N is any base], preferably AA (N)₁₉A sequence consisting of TT is selected. The sequence to be selected is in a region that is 50 bases or more downstream from the start codon in the translation region, has a GC content of 30 to 70%, preferably around 50%, and matches the base sequence of other genes. First, a sequence specific to GPCR-T4 cDNA is more preferable. 19-25 base sequence excluding AA at the end of the selected sequence or 19 base sequence excluding AA and TT (wherein T in the sequence is U in RNA, hereinafter referred to as sequence X), and Two RNAs having a sequence to which 2 to 4 nucleotides, preferably 2 T (DNA) or U (RNA) are added to the 3 ′ end of each sequence complementary to the sequence X (provided that the T portion Make DNA). An siRNA can be prepared by annealing the two prepared RNAs. For annealing, two RNAs were dissolved in an appropriate buffer (for example, 10 mmol / L Tris-HCl, 50 mmol / L NaCl, 1 mmol / L EDTA, pH 7.5), and then heated at 90 to 95 ° C. with a heat block or a thermocycler. Can be performed by heating to 25 ° C. over 45 to 60 minutes.
  As the shRNA, the sequence X and a sequence complementary to the sequence X are connected with an appropriate spacer sequence consisting of 3 to 15 bases, and 2 to 4 nucleotides, preferably 2 T RNA having a sequence to which (DNA) or U (RNA) is added (where T is DNA) is prepared. The 5 'end of the spacer sequence is preferably TT (DNA) or UU (RNA). Either the sequence X or the sequence complementary to the sequence X may be first.
  The two RNAs and shRNA used for the above siRNA can be chemically synthesized using a DNA synthesizer. In addition, a double-stranded DNA having a T7 promoter sequence and the RNA sequence to be prepared is prepared using a silencer siRNA preparation kit or the like, and an in vitro transcription system using T7 RNA polymerase using this DNA as a template. Can also be prepared. Alternatively, by introducing a GPCR-T4 siRNA expression vector, which can be produced as follows, into cultured cells or in vivo cells, the siRNA is expressed in the cells and the expression of the GPCR-T4 gene is suppressed. it can. The GPCR-T4 siRNA expression vector is a spacer sequence consisting of 3 to 15 bases starting from the sequence X and TT, a sequence complementary to the sequence X, to the siRNA expression vector containing the RNA polymerase III promoter such as U6 promoter or H1 promoter. And a DNA containing a sequence consisting of 4 to 6 T serving as an RNA polymerase III terminator. In the cell, shRNA containing the sequence X and a complementary sequence is synthesized by RNA polymerase III reaction from the U6 promoter, and this shRNA is cleaved in the cell and converted into siRNA. Examples of siRNA expression vectors include pSilencer 1.0-U6 (Ambion), pSilencer 3.0 (Ambion), pSUPER (OligoEngine) and the like. SiRNA expression vector using a retrovirus vector or a lentivirus vector [Science,296, 550 (2002); Proc. Natl. Acad. Sci USA,100, 1844 (2003); Nat. Genet. ,33, 401 (2003)] can also be used.
  3. A medicament containing, as an active ingredient, a substance that increases or decreases the expression level of the GPCR-T4 gene. It can be prepared in the same manner as the medicine described in (4).
(2) Screening method for substances that increase or decrease the expression level of GPCR-T4 gene
  A substance that increases or decreases the expression level of the GPCR-T4 gene can be obtained by the methods shown in the following (a) to (c).
(A) Cells that naturally express GPCR-T4 in the presence of a test substance are After culturing for 2 hours to 1 week by the culture method described in (3), the amount of the polypeptide in the cells is measured and compared using an antibody that specifically binds to GPCR-T4, and the amount of the polypeptide is increased. Alternatively, a method for selecting and obtaining a compound having a decreasing activity.
  Examples of the measurement method using an antibody against GPCR-T4 include ELISA, radioimmunoassay, fluorescent antibody method, Western blot method, immunohistochemical staining, etc. [Enzyme immunoassay method, 3rd edition, Medical School (1987), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring. Harbor Laboratory (1988), separate volume Experimental Medicine, The Protocol Series, Immunostainingin situHybridization, Yodosha (1997), J. Am. Immunol. Methods,150, 5, (1992)].
(B) Cells that naturally express GPCR-T4 in the presence of the test substance are After culturing for 2 hours to 1 week according to the culture method described in (3), the amount of the transcription product of the GPCR-T4 gene in the cells is determined by Northern hybridization (Molecular Cloning 3rd edition) or PCR [PCR Protocols, Academic Press ( 1990)] and the like, and a compound having an activity to increase or decrease the amount of the transcript is selected and obtained.
(C) A plasmid incorporating a reporter gene-linked DNA downstream of the promoter region of the GPCR-T4 chromosomal gene is prepared by a known method. Introduce into an animal cell according to the method of (3), and obtain a transformant. In the presence of the test substance, the transformant is treated with the above-mentioned 2. Cultivation by the culture method described in (3) for 2 hours to 1 week, and the expression level of the reporter gene in the cell is a known method [Department of Cancer Research, University of Tokyo, New Cell Engineering Experimental Protocol, Hidejun (1993), Biotechniques,20, 914 (1996), J. Am. Antibiotics,49, 453 (1996), Trends Biochem. Sci. ,20448 (1995), cell engineering,16, 581 (1997)], and a method for selecting and obtaining a compound having an activity of increasing or decreasing the expression level.
  Reporter genes include, for example, firefly luciferase gene, Renilla luciferase gene, chloramphenicol acetyltransferase gene, β-glucuronidase gene, β-galactosidase gene, β-lactamase gene, aequorin gene or green fluorescein gene A protein gene etc. can be mentioned.
  Examples of the promoter region of the GPCR-T4 chromosomal gene used in the method (c) include all promoter regions involved in transcription of the GPCR-T4 gene in mammalian cells. Specifically, for example, human neutrophil, eosinophil, basophil, T cell, B cell, macrophage, monocyte, bone marrow, spleen, placenta, thyroid, lung, lymph node, fetal liver, fetal lung Alternatively, in the trachea, a promoter region involved in transcription of the GPCR-T4 gene can be mentioned.
  The promoter region of the GPCR-T4 chromosomal gene is a known method using a DNA encoding GPCR-T4 or an oligonucleotide specific for the sense strand or antisense strand of the DNA as a probe [Cancer Research, Institute of Medical Science, University of Tokyo. Part, New Cell Engineering Experimental Protocol, Shujunsha (1993)].
  Further, since the promoter region of the GPCR-T4 chromosomal gene is present upstream from the region transcribed into GPCR-T4 mRNA in the chromosomal gene, the base sequence of GPCR-T4 cDNA (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2) ) And a human chromosomal gene sequence registered in a base sequence database such as GenBank or the like, the promoter region of GPCR-T4 can be determined.
  A specific example of DNA containing the promoter region of the GPCR-T4 chromosomal gene is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. The promoter region is considered to be a 50-5000 bp region in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is continuous.
6). Disease determination method
  When the amount of GPCR-T4 gene transcription or the amount of GPCR-T4 polypeptide in neutrophils or thyroid is increased or decreased compared to the level of healthy subjects, or due to mutation of GPCR-T4 gene, normal GPCR -A GPCR-T4 variant with reduced or enhanced function as GPCR-T4 compared to T4 is produced, or the transcription amount of GPCR-T4 gene is increased or decreased compared with the level of healthy subjects In this case, abnormal thyroid function, abnormal neutrophil function, abnormal infection defense ability, exacerbation of asthma, exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, exacerbation of inflammatory disease, etc. may occur. Therefore, the above-described disease and disease state can be determined by the following method.
(1) Method for determining a disease in which the transcription amount of the GPCR-T4 gene varies
  Northern hybridization method (Molecular Cloning 3rd edition), PCR method [PCR Protocols, Academic Press (1990)], quantitative PCR method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,872725 (1990)], Real Time PCR method [Junko Stevens, Experimental Medicine (extra number),15, 46 (1997)] or the like, a polynucleotide that hybridizes with the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions; The amount of transcription of the GPCR-T4 gene can be measured using an oligonucleotide having a base sequence consisting of 5 to 60 bases that are continuous with 60 bases or a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. . Quantitative PCR method and Real Time PCR method are preferable methods because of their excellent quantitativeness. By quantifying the amount of GPCR-T4 gene transcription in a tissue or cell of a subject and comparing it with the amount of GPCR-T4 gene transcription in the same tissue or cell of a healthy subject, the amount of GPCR-T4 transcription increases or decreases. For example, abnormalities in thyroid function, neutrophil activation, infectious defense ability, asthma exacerbation, chronic obstructive pulmonary disease exacerbation, and inflammatory disease exacerbation can be determined. The tissue or cell can include polymorphonuclear leukocytes or thyroid.
  Oligonucleotides can be synthesized with a DNA synthesizer commercially available from Applied Biosystems, etc., preferably with 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases.
(2) Method for determining a disease in which the amount of GPCR-T4 polypeptide varies
  ELISA using an antibody that specifically binds to GPCR-T4, radioimmunoassay, fluorescent antibody method, Western blotting, immunohistochemical staining, etc. [Enzyme immunoassay, 3rd edition, Medical School (1987), Antibodies-A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory (1988), separate volume Experimental Medicine, The Protocol Series, Immunostainingin situHybridization, Yodosha (1997), J. Am. Immunol. Methods,150, 5, (1992)], the amount of GPCR-T4 polypeptide can be measured. The amount of GPCR-T4 polypeptide is increased or decreased by quantifying the amount of GPCR-T4 polypeptide in a tissue or cell of a subject and comparing it with the amount of GPCR-T4 polypeptide in the same tissue or cell of a healthy subject For example, abnormalities in thyroid function, neutrophil activation, infectious defense ability, asthma exacerbation, chronic obstructive pulmonary disease exacerbation, and inflammatory disease exacerbation can be determined. The tissue or cell can include polymorphonuclear leukocytes or thyroid.
(3) Disease determination method for detecting a mutation in GPCR-T4 gene
  Detection of mutation or polymorphism in the GPCR-T4 gene or the expression control region of the gene can be performed using the nucleotide sequence information of the gene or the control region. Specifically, a polynucleotide that hybridizes with a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions, a continuous 5 to 60 bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 2 Gene mutation using Southern blot, direct sequencing method, PCR, DNA chip method, etc. using oligonucleotide having a base sequence consisting of 5 to 60 bases in a sequence complementary to the base sequence represented by And polymorphisms [clinical tests,42, 1507-1517 (1998), clinical examination,42, 1565-1570 (1998)]. Oligonucleotides can be synthesized with a DNA synthesizer commercially available from Applied Biosystems, etc., preferably with 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases.
  A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 A determination drug containing an oligonucleotide having a base sequence consisting of 5 to 60 bases of a continuous base sequence complementary to the sequence or an antibody that specifically binds to GPCR-T4 is prepared as an appropriate buffer containing these components. Is done. Furthermore, an agent necessary for detecting the transcription amount, polypeptide or mutation may be attached.
7). Screening method using knockout non-human animal for GPCR-T4 gene
  GPCR-T4 gene knockout A non-human animal refers to a GPCR-T4 that cannot be expressed by destroying the gene on the chromosome by deletion of all or part of it or insertion of a DNA fragment. Is a non-human animal deficient in The animal has various diseases caused by abnormal expression of GPCR-T4 polypeptide, such as thyroid dysfunction, neutrophil function abnormality, infection defense ability abnormality, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, inflammatory disease, etc. It is an extremely useful animal model for the treatment and prevention. Therefore, the animal, or the organ, tissue or cell of the animal has a thyroid function control action, a neutrophil activation promotion action or an inhibition action, a neutrophil tissue damage promotion action or a suppression action, an inflammatory disease Used for screening and evaluation of compounds, functional foods, health foods, etc. that prevent or treat asthma, prevent or treat asthma, prevent or treat chronic obstructive pulmonary disease, or prevent or treat infectious diseases be able to.
  The animal can be produced as follows. First, DNA having a sequence that has been destroyed by deletion or insertion of a DNA fragment so that normal GPCR-T4 is not expressed relative to the sequence of the genomic gene of GPCR-T4 (hereinafter referred to as a disrupted GPCR-T4 gene). A known homologous recombination technique [e.g., Nature,326, 295 (1987), Cell,51, 3, 503 (1987) etc.] in the embryonic stem cells of the target animal, for example, non-human mammals such as cows, sheep, goats, pigs, horses, chickens, mice, etc., the GPCR-T4 gene on the chromosome To produce a mutant embryonic stem cell clone replacing the disrupted GPCR-T4 gene on the vector [Nature,350243 (1991)]. Using the embryonic stem cell clone thus prepared, a chimeric individual consisting of an embryonic stem cell clone and a normal cell is prepared by a method such as an injection chimera method or an assembly chimera method of an animal fertilized egg into a blastcyst To do. By crossing this chimeric individual with a normal individual, it is possible to obtain a heterozygous individual in which the sequence of the GPCR-T4 gene of the allele on the chromosome of the whole body cell is replaced with the sequence of the disrupted GPCR-T4 gene. Thus, a homozygous individual in which both GPCR-T4 genes of the homologous chromosome are replaced by the disrupted GPCR-T4 gene can be obtained. This homo individual is a GPCR-T4 gene knockout non-human animal that does not express GPCR-T4.
  Hereinafter, the present invention will be described with reference to specific examples and reference examples, but the scope of the present invention is not limited thereby.

FIG. 1 shows agonistic activity of T4 on GPCR-T4. In the figure, GPCR-T4 represents the activity fold when the assay cell 1 is used, the vector is the control cell 1, the vertical axis represents the Renilla luciferase activity when the T4 stimulation is not performed and the activity is 1 respectively.
FIG. 2 shows the agonist activity of isconazole on GPCR-T4. In the figure, GPCR-T4 represents the activity fold when the assay cell 1 is used, the control cell 1 is used as the vector, and the Renilla luciferase activity is 1 when the isoconazole stimulation is not performed.
FIG. 3 shows the expression levels of GPCR-T4 transcripts in 35 human organs. The arrow indicates the position of the amplified fragment (405 bp) derived from the GPCR-T4 transcript. Samples for each lane are as follows.
1: adrenal gland, 2: whole brain, 3: caudate nucleus, 4: hippocampus, 5: substantia nigra, 6: thalamus, 7: kidney, 8: pancreas, 9: pituitary gland, 10: small intestine, 11: bone marrow, 12: amygdala, 13: cerebellum, 14: corpus callosum, 15: fetal brain, 16: fetal kidney, 17: fetal liver, 18: fetal lung, 19: heart, 20: liver, 21: lung, 22: lymph node, 23: mammary gland, 24: placenta, 25: prostate, 26: salivary gland, 27: skeletal muscle, 28: spinal cord, 29: spleen, 30: stomach, 31: testis, 32: thymus, 33: thyroid, 34: trachea, 35 : Uterus, M: Molecular weight marker FIG. 4 shows the expression levels of GPCR-T4 transcripts in various human peripheral blood fractions and HeLa cells. The arrow indicates the position of the amplified fragment (405 bp) derived from the GPCR-T4 transcript. Samples for each lane in the figure are as follows.
1: HeLa, 2: mononuclear cell, 3: polymorphonuclear leukocyte, 4: CD4 ⁺ T cell, 5: CD8 ⁺ T cell, 6: B cell, 7: monocyte, 8: water, M: molecular weight marker FIG. 5 shows the expression level of GPCR-T4 transcript in various human cell lines. The arrow indicates the position of the amplified fragment (405 bp) derived from the GPCR-T4 transcript. Samples for each lane in the figure are as follows.
1: Jurkat, 2: Molt-3, 3: Molt-4, 4: Hut78, 5: Namalwa KJM-1, 6: Daudi, 7: Raji, 8: HL-60, 9: U-937, 10: THP −1, M: molecular weight marker FIG. 6 shows the intensity of phosphorylation of ERK1 / 2 MAPK when polymorphonuclear leukocytes were stimulated with T4 or isoconazole for 2, 9 or 29 minutes. The upper row (P-MAPK) shows the result of staining using anti-phosphorylated ERK1 / 2 MAPK antibody, and the lower row (MAPK) shows the result of staining using anti-ERK1 / 2 MAPK antibody.
FIG. 7 ERK1 / 2 MAPK phosphorylation when polymorphonuclear leukocytes were stimulated with various concentrations (10 nmol / L, 100 nmol / L, 1 μmol / L) of T4 or T3 in the presence or absence of GM-CSF Indicates the strength of oxidation. The upper row (P-MAPK) shows the result of staining using anti-phosphorylated ERK1 / 2 MAPK antibody, and the lower row (MAPK) shows the result of staining using anti-ERK1 / 2 MAPK antibody.

アンタゴニストとして取得された化合物ＩＩａおよびＩＩｂについて、濃度０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０μｍｏｌ／Ｌでの阻害率を測定し、Ｌｏｇｉｔ−Ｌｏｇ変換法の線形近似解析法によって、ＩＣ_５０値を算出した。その結果、化合物ＩＩａのＩＣ_５０は９１ｎｍｏｌ／Ｌ、化合物ＩＩｂのＩＣ_５０は１２７ｎｍｏｌ／Ｌであった。
化合物Ｉのアゴニスト活性を、リガンドとしてＴ４の代わりに化合物Ｉを用いるアッセイ法で測定した。上記と同様に、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を９６ウェル白色プレートに１ウェルあたり１×１０^５個ずつに播種し、終濃度１０ｎｍｏｌ／ＬになるようにＥ２を添加し、２４時間培養した。ただしバックグラウンド測定用にＥ２を添加しないものも設けた。ウェルに各種濃度の化合物Ｉを添加した。コントロール用のウェルおよびＥ２を添加しないバックグラウンド測定用のウェルには、化合物Ｉは添加しなかった。それぞれをさらに７時間培養して反応させた後、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍの基質溶液を添加して反応を停止し、トップカウント（パッカード社製）を用いて１秒あたりのカウント数すなわち発光量を測定した。
化合物Ｉの活性（アゴニスト作用）は、下の式に示す化合物Ｉ添加時と非添加時の１秒あたりのカウント数をもとに算出した活性化率で表した。
活性化率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは各々以下の意味を表す。
Ａ：Ｅ２および化合物Ｉ添加時の１秒あたりのカウント数
Ｂ：Ｅ２および化合物Ｉともに非添加時（バックグラウンド測定用）の１秒あたりのカウント数
Ｃ：Ｅ２のみ添加、化合物Ｉ非添加時（コントロール用）の１秒あたりのカウント数
結果を第２表に示す。

以上の結果より、本発明のアッセイ系を用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストおよびアンタゴニストを取得できることが示された。
また、他のＧＰＣＲ（例えば、ＧＰＲ４またはＯＧＲ−１）を誘導発現する細胞（ＷＯ０３／０８７３６６）をアッセイ細胞として用いて、同様のアッセイを行った際には、化合物Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂは活性を示さなかった。このことから、化合物Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂはＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に作用することが示された。
なお、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２の代わりに、実施例１で構築したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を用いることによっても同様のスクリーニングを行うことができる。
実施例３ ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストを用いた、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
実施例１または２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１または２と、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストであるＴ４またはイソコナゾールを用いて、以下のようにしてＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングを行うことができる。
実施例１で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を約１×１０^４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。試験物質とＴ４またはイソコナゾールを添加して６時間培養後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。
または、実施例２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を約１×１０^４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。試験物質とＴ４またはイソコナゾールを添加して６時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。
アッセイ細胞を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して増加する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストとして選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の代わりに別のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該選択物質の受容体特異性を調べることができる。
アッセイ細胞を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して減少する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４のアンタゴニストとして選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の代わりに別のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該選択物質の受容体特異性を調べることができる。
上記試験物質としては、任意の物質を使用することができるが、Ｔ４またはイソコナゾールの誘導体や類似化合物を用いることにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストを効率的に探索することができる。
実施例４ ＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性の測定
実施例１（１）で調製したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１およびコントロール細胞１を９６ウェルプレートにそれぞれ約１×１０^４個／ウェルずつ分注し、３７℃で１日間培養した。各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してさらに１日間培養後、セレンテラジンｈを添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。
また、１７β―エストラジオールを添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。１７β−エストラジオールを添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とした。コントロール細胞１における誘導倍率は約１であった。一方、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１の誘導倍率は約１２倍であった。ＧＰＣＲ−Ｔ４は、誘導発現するだけでシグナルを流すことから、構成活性型ＧＰＣＲであることがわかった。
実施例５ ＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性を利用した、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストのスクリーニング
実施例１または２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１または２を用いて、以下のようにしてＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストのスクリーニングを行うことができる。
実施例１で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を約１×１０^４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）と試験物質を添加し、さらに１日間培養する。その後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。
または、実施例２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を約１×１０^４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）と試験物質を添加し、さらに１日間培養する。その後、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。
実施例３で示されたように、ＧＰＣＲ−Ｔ４は、アゴニストが存在しない状態でも構成活性を示すので、アッセイ細胞を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して減少する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の代わりに別のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該選択物質の受容体特異性を調べることができる。
実施例６ ＧＰＣＲ−Ｔ４が共役するＧ蛋白質の解析
ＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４（２μｇ）、ならびに参考例５（４）で構築したＧα_ｓのＣ末端５アミノ酸をＧα_ｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧα_ｓ（以下、Ｇα_ｓ−ｉと呼ぶ）の発現用プラスミドでもある、ホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉ（２μｇ）を、エレクトロポレーション法により、参考例２（２）で取得した１．６×１０^６細胞のＫＪＭＧＥＲ８に導入した。
該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株（以下、Ｇα_ｓ−ｉ発現アッセイ細胞と呼ぶ）を取得した。
同様にして、ＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４（２μｇ）および参考例３（１）で構築したホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃ（２μｇ）をＫＪＭＧＥＲ８に導入し、安定形質転換株（コントロールアッセイ細胞と呼ぶ）を取得した。Ｇα_ｓ−ｉ発現アッセイ細胞およびコントロールアッセイ細胞は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
Ｇα_ｓ−ｉ発現アッセイ細胞およびコントロールアッセイ細胞をそれぞれ約１×１０^４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養した。１００ｎｍｌ／ＬのＴ４を添加して６時間培養後、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）の試薬を添加し、トップカウント（パッカード社製）を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。また、１００ｎｍｏｌ／ＬのＴ４を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。
Ｇα_ｓ−ｉ発現アッセイ細胞を用いたアッセイにおいては、Ｔ４を添加した際の活性は、Ｔ４を添加しない場合の活性に対して５．３倍増加した。一方、コントロールアッセイ細胞を用いたアッセイにおいては、ほとんど差がなかった（１．１倍）。すなわち、Ｔ４で活性化されるＧＰＣＲ−Ｔ４からのシグナルを検出するためにはＧα_ｓ−ｉの発現が必須であることが明らかになった。
コントロールアッセイ細胞には、ＣＲＥ制御下にホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が発現するレポータープラスミドが導入されているので、Ｇ_Ｓに共役するＧＰＣＲがリガンド刺激により活性化を受けた場合、Ｇ_Ｓを介してＣＲＥ制御下のレポーター遺伝子の発現が上昇する。Ｇα_ｓ−ｉを共発現させたＧα_ｓ−ｉ発現アッセイ細胞においては、Ｇ_ｉに共役するＧＰＣＲがリガンド刺激により活性化を受けた場合でも、Ｇα_ｓ−ｉを介してＣＲＥ制御下のレポーター遺伝子の発現が上昇する。したがって、上記の結果は、ＧＰＣＲ−Ｔ４はＧ_ｓには共役しないが、Ｇ_ｉには共役することを示している。ＧＰＣＲ−Ｔ４は、リガンド刺激により、Ｇ_ｉを介してシグナルを流すことが判明した。
実施例７ ヒトの各種細胞や組識におけるＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物の発現解析
ＧＰＣＲ−Ｔ４転写産物の定量は、半定量的ＰＣＲ法〔ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により行った。
また、どの細胞でも同程度発現していると考えられるβ−アクチン遺伝子の転写産物の定量も同時に行い、細胞間でのｍＲＮＡ量の違いや、サンプル間での逆転写酵素によるｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡへの変換効率に大差ないことを確認した。β−アクチン転写産物の定量は、定量的ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕により行った。
（１）各種細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
ヒト細胞株としては、Ｔ細胞株〔ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５５２）、ＭＯＬＴ−４（ＪＣＲＢ９０３１）、ＨＵＴ７８〕、Ｂ細胞株〔Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１、Ｄａｕｄｉ（ＪＣＲＢ９０７１）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８６）〕、顆粒球／単球系細胞株〔ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４０）、Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５９３．２）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−２０２）〕、血管内皮細胞株〔ＩＶＥＣ、ＨＵＶＥＣ〕、メラノーマ細胞株（ＷＭ２６６−４、ＷＭ１１５）、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１０）、肺癌細胞株〔ＰＣ−９、ＨＬＣ−１、ＱＧ９０〕、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４３５）、胃癌細胞株ＫＡＴＯＩＩＩ、膵臓癌細胞株〔Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７９）、Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−８０）〕、大腸癌細胞株〔Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０〕、上皮様細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２）を用いた。ＱＧ９０およびＳＷ１１１６は愛知癌センターより入手した。ＨＬＣ−１は大阪大学癌研究所より入手した。ＫＡＴＯ ＩＩＩおよびＰＣ−９は免疫生物研究所株式会社より入手した。ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は倉敷紡績株式会社より入手した。ＩＶＥＣ〔Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５７，４１（１９９３）〕はＮ．Ｔ．Ｌ．ＦＲＡＮＣＥ社より入手した。ＭＯＬＴ−４、ＤａｕｄｉはＪＣＲＢより入手した。それ以外の細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した。
各細胞の全ＲＮＡは常法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７７）〕にしたがって調製した。全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、インビトロジェン社製）を用いて行った。細胞株については５μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（２）末梢白血球細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
健康な成人の末梢血よりＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ^ＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて多形核白血球と単核球を分離取得した。次いで、常法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０，７０６（１９８３）〕にしたがって、取得した単核球より単球およびリンパ球を分離取得した。
次いで、ＣＤ４^＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、ＣＤ８^＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、およびＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を知いて、取得したリンパ球より、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＢ細胞を分離取得した。
上記で取得した多形核白血球、単核球、単球、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞およびＢ細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡを調製した。一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、インビトロジェン社製）を用いて行った。５μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（３）ヒト各種組識由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
ヒトの３５種類の組識（副腎、全脳、尾状核、海馬、黒質、視床、腎臓、膵臓、脳下垂体、小腸、骨髄、扁桃体、小脳、脳梁、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、子宮）由来のｍＲＮＡ（クロンテック社製）から同様にして一本鎖ｃＤＮＡを合成した。１μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、水で２４０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（４）β−アクチン遺伝子の転写産物定量用スタンダードの調製
ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄのそれぞれのｃＤＮＡ部分を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれβ−アクチンの転写産物定量用のスタンダードおよび内部コントロールとして用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕。各プラスミドが完全に切断された事を確認後、１μｇ／ｍＬの酵母のｔＲＮＡを含む水で段階的に希釈して使用した。
（５）ＰＣＲ法を用いたＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物の定量
上記（１）〜（３）記載の一本鎖ｃＤＮＡ ５μＬに、フォワード・プライマーとして配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを１０ｐｍｏｌ、リバース・プライマーとして配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡを１０ｐｍｏｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ混合液を１．６μＬ、ジメチルスルホキシドを１μＬ、５単位／μＬのＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．１μＬ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を２μＬ添加し、滅菌水を加えて全量を２０μＬに調製した。サーマルサイクラーＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪリサーチ社製）を用い、９４℃で３分間の熱処理によりＤＮＡを変性させ後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を２５〜３３サイクル行った。該反応液の一部（８μＬ）をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｉｎ（モレキュラー・プローブス社製）で染色した。増幅されたＤＮＡ断片のパターンをフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ、モレキュラー・ダイナミクス社製）で解析することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。より正確な転写産物の定量を行なうため、ＰＣＲのサイクル数を変えて同様のＰＣＲを行った。スタンダードの量はＰＣＲのサイクル数に応じて変化させた。
β−アクチン遺伝子の転写産物の定量については既報〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平６−１８１７５９〕と同様に行った。
第３図にＰＣＲのサイクル数が３０のときのヒトの各種組織についての結果を示した。ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物は、ヒト正常組織では骨髄、脾臓、甲状腺、胎盤で多く発現しており、次いで肺、気管、リンパ節で多く発現していた。骨格筋、精巣、脊髄、胎児肝臓、胎児肺でも発現がみられた。第４図にＰＣＲのサイクル数が２８のときのヒトの各種末梢白血球細胞およびＨｅＬａ細胞についての結果を示した。ヒト末梢血においては多形核白血球において、非常に強い発現がみられた。ＨｅＬａ細胞でもわずかに発現がみられた。Ｔ細胞や単球でも発現がみられた。第５図にＰＣＲのサイクル数が３０のときのヒトの各種培養細胞株での結果を示した。ヒト培養細胞株では、前骨髄系細胞株（ＨＬ−６０）、Ｔ細胞株（Ｈｕｔ７８）で発現がみられた。
Ｔ４（甲状腺ホルモン）の新規受容体であるＧＰＣＲ−Ｔ４は甲状腺で高発現していることから、甲状腺で生産されたＴ４はオートクラインに作用し、甲状腺ホルモン分泌の制御等、甲状腺機能の制御に関与していると考えられる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４は多形核白血球（好中球を多く含む）で高発現していることから、好中球機能の制御に関与していると考えられる。また、Ｔ細胞、単球、リンパ節でも発現していることから、ＧＰＣＲ−Ｔ４は炎症や免疫機能を調節する活性を有していると考えられる。
実施例８ ヒト末梢多形核白血球のＭＡＰＫの活性化に対するＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストの作用
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストによるヒト末梢多形核白血球のＭＡＰＫの活性化の抑制
実施例６に記載したように、ＧＰＣＲ−Ｔ４は好中球が多く含まれるヒト末梢多形核白血球画分で高発現している。そこで、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対してアゴニスト活性を示したＴ４またはイソコナゾールでヒト末梢多形核白血球を刺激して、ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫの活性化状態の変動を調べた。
健康な成人の末梢血よりＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ^ＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて多形核白血球を分離取得した。取得した多形核白血球を氷冷したＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｔｉｏｎ：インビトロジェン社製）に懸濁後、１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ社製）に２×１０^６細胞ずつ分注した。該細胞を３７℃で５分間プレインキュベーションした後、１μｍｏｌ／ＬのＴ４またはイソコナゾールを添加し、３７℃で２分間、９分間、または２９分間インキュベーションした。その後、９０×ｇで１分間遠心して細胞を取得した。
上記細胞に３０μＬの細胞溶解バッファー〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）（和光純薬社製）、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（和光純薬社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（シグマ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ １，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール（シグマ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルフォニルフルオライド（シグマ社製）、１０μｍｏｌ／Ｌロイペプチン（シグマ社製）、２ｍｍｏｌ／Ｌバナジン酸ナトリウム（シグマ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化ナトリウム（シグマ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸（和光純薬社製）〕を添加し、氷上で１０分間静置した。該溶解液を１３０×ｇ、７分間遠心して上清を取得した。該上清中の蛋白質濃度を、プロテインアッセイ染色液（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて測定し、２０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気永動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルとしては１０％均一ゲルＮＰＵ−Ｒ１０Ｌ（アトー社製）を、分子量マーカーとしてはプレシジョン・プロテイン・スタンダーズ・アンステインド・ブロード・レンジ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、バイオラッド社製）を用いた。電気泳動は２０ｍＡで７０分間行った。
電気泳動後、蛋白質をイモビロン・トランスファー・メンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ミリポア社製）にブロッティングし、一次抗体として抗リン酸化ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ抗体（２００倍希釈したＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製のＰｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または抗ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ抗体（２００倍希釈したＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製のｐ４４／４２ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製：１０００倍希釈）を用いて抗体染色を行った。発色および検出にはＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）およびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いた。
上記の溶解液の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングは常法〔タンパク質実験ノート下巻，羊土社（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１７，１１３（２００１），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１６，７０（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３３８４７（２００１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４８９（２０００），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７，７０４（１９９６）〕に従って行った。
上記解析の結果、１μｍｏｌ／ＬのＴ４刺激または１μｍｏｌ／Ｌのイソコナゾール刺激により、ヒト末梢多形核白血球中のＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）が抑制されることが明らかになった（第６図）。この結果は、Ｔ４またはイソコナゾール、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストを用いて、好中球におけるＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫの活性化を抑制できることを示している。
（２）ＧＭ−ＣＳＦ刺激によるヒト末梢多形核白血球のＭＡＰＫの活性化に対するＧＰＣＲ−Ｔ４アゴニストによる抑制
好中球をＧＭ−ＣＳＦで刺激すると、ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫがリン酸化（活性化）されることが知られている。そこで、ＧＭ−ＣＳＦ刺激によるヒト末梢多形核白血球におけるＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫの活性化に及ぼすＴ４の影響を調べた。
健康な成人の末梢血よりＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ^ＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて多形核白血球を分離取得した。取得した多形核白血球を氷冷したＨＢＳＳ（インビトロジェン社製）に懸濁後、１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ社製）に２×１０^６細胞ずつ分注した。該細胞を３７℃で５分間プレインキュベーションした後、５ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦの存在下または非存在下、各種濃度（１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ）のＴ４を添加し、３７℃で４分間インキュベーションした。その後、９０×ｇで１分間遠心して細胞を取得した。また、コントロールとして、Ｔ４の代わりにＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニスト活性がＴ４に比較して１／１００程度弱いＴ３を用いて同様の操作を行い、細胞を取得した。
上記細胞を用いて、（１）と同様にして、抗リン酸化ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ抗体または抗ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。その結果、１μｍｏｌ／ＬのＴ４刺激により、ＧＭ−ＣＳＦによるＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）が抑制されることが明らかになった（第７図）。一方、Ｔ３刺激では、ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）の抑制はみられなかった。
以上の結果は、Ｔ４あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ刺激またはＧＭ−ＣＳＦと同様のシグナルを流すサイトカイン刺激による好中球におけるＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫの活性化を抑制できることを示している。
好中球においては、ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫの活性化により、好中球のプライミングや活性化が起こることが知られていることから、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニスト（例えばＴ４、イソコナゾールまたは化合物Ｉ）またはアンタゴニスト（例えば化合物ＩＩａまたはＩＩｂ）を用いて、好中球のプライミングや活性化を制御することが可能と考えられる。
参考例１ ＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドの造成
（１）ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃおよびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃの造成
ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。
ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＫｐｎＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＫｐｎＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。
ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＢｇｌＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）をＸｈｏＩとＮｓｉＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰ配列を含む２．２ｋｂのＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を取得した。ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３由来のＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰを造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＳＥＯｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、アンピシリン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片およびｐＳＥＯｌｕｃ２のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１を造成した。
ｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．１１ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。上記のｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１を造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を取得した。配列番号６、７、８、および９で表される塩基配列を有する４種のＤＮＡを合成した。該合成ＤＮＡをそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化後、混合してアニールさせることにより、ポリアデニル化シグナルを有する二本鎖ＤＮＡとした。該二本鎖ＤＮＡとｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１由来のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡを造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＦＲ−ｌｕｃ（ストラタジーン社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、０．１４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）断片、およびｐＦＲ−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を結合し、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１を作製した。ｐＡＧａｌＳｄ１は、Ｇａｌ４ｐ応答配列を５回繰り返した配列を有するプロモーターを含有している。
ｐＡＧａｌＳｄ１をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。またｐＳＥＯｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理することにより、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片およびｐＳＥＯｌｕｃ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を結合することにより、ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃ内に存在する二つのＨｉｎｄＩＩＩサイトのうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からより離れたＨｉｎｄＩＩＩサイトのみをＫｌｅｎｏｗ処理により消失させることにより、ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃをＡｓｐ７１８で切断後、ＳｔｕＩで部分消化しｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃ由来の９．５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＳｔｕＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ処理し、自己結合させることによりホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃおよびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃは転写因子Ｇａｌ４ｐに対する応答配列を有するプロモーターを含むため、Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（以下、Ｇａｌ４−ＥＲとよぶ）を発現する宿主細胞に導入した形質転換体において、１７β−エストラジオールの添加により、ホタル・ルシフェラーゼの発現が誘導される。
（２）誘導発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄの造成
（１）で造成した発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、ｏｒｉＰを含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｄのスタッファー配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｎｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｎｄのスタッファー配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄは転写因子Ｇａｌ４ｐに対する応答配列を有するプロモーターを含むため、スタッファー配列の代わりに任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入することにより、該ポリペプチドを誘導発現するためのプラスミドを造成することができる。
（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４の造成
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするｃＤＮＡクローンであるｃ−ｈｅｐ１５３７４を用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４を造成した。ｃ−ｈｅｐ１５３７４ ｃＤＮＡは、特許（ＥＰ１１９５４３４ Ａ１）に記載の方法にしたがって発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース登録番号ＡＢ００９８６４）を用いて作製された肝臓癌細胞株ＨＥＰＧ２由来の完全長ｃＤＮＡライブラリーから取得された。ｃ−ｈｅｐ１５３７４ ｃＤＮＡの配列を配列番号２８に示した。
ｃ−ｈｅｐ１５３７４ ｃＤＮＡを含むプラスミドをＳｔｕＩとＮｏｔＩで切断することにより、ｃ−ｈｅｐ１５３７４ ｃＤＮＡを含む約２．７ｋｂのＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｄをＰｍａＣＩとＮｏｔＩで切断し、ｏｒｉＰ配列を含むＰｍａＣＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｃ−ｈｅｐ１５３７４ ｃＤＮＡを含む約２．７ｋｂのＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片とｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＰｍａＣＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりプラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４を造成した。
ｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４は転写因子Ｇａｌ４ｐに対する応答配列を有するプロモーターを含むため、Ｇａｌ４−ＥＲを発現する宿主細胞に導入した形質転換体において、１７β−エストラジオールの添加により、ＧＰＣＲ−Ｔ４の発現が誘導される。
参考例２ Ｇａｌ４−ＥＲを発現する宿主細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
（１）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２の造成
ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ）耐性遺伝子を有するベクターｐＳＶ２ｂｓｒ（科研製薬社製）をＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して２．６ｋｂのＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（以下、Ｇａｌ４−ＥＲとよぶ）をコードするＤＮＡ〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を含有するＥＲαＡＦ２ ｉｎ ｐＭ（東京大学の加藤茂明先生より分与）をＡａｔＩＩとＮｄｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＳＶ２ｂｓｒ由来のＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片、およびＥＲαＡＦ２ ｉｎ ｐＭ由来のＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を結合することにより、Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を造成した。
（２）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２をＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞の染色体ＤＮＡに組み込んた細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン４酢酸〕に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、該プラスミドをＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕に、１．６×１０^６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞は、ＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である。
該形質転換体を、８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地〔ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）に、１／４０量の７．５％ ＮａＨＣＯ_３、３％ ２００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社製）、０．５％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、５０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３μｇ／ｍＬインシュリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１２５ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、１ｍｄ／ｍｌガラクトースを添加した培地〕に懸濁し、ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（ＫＫ−４００、科研製薬社製）を２．０μｇ／ｍｌになるように添加し、９６ウェルプレートに５００〜２０００細胞／ウェルずつ分注して培養を行い、ｐＧＥＲｂｓｒＲ２が染色体ＤＮＡに組み込まれた安定形質転換株（シングルクローン）を多数取得した。各形質転換株は、２．０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
以下に示す方法により上記安定形質転換株から、誘導倍率が高く、かつ非誘導時のバックグラウンドが低い優れた安定形質転換株ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
各形質転換株に参考例１（１）で造成したホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃをエレクトロポレーション法により導入し、２日間培養した。培養後、１７β−エストラジオール（Ｅ８８７５：シグマ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに２４時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性の測定を行った。
活性の測定は、ルミノメーターＬＢ９５３（ベルトールド社製）を用い、細胞溶解用緩衝液〔１％トリトンＸ−１００、１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール〕１００μｌを、上記培養液に自動注入後、基質溶液〔２５ｍｍｏｌ／Ｌグリシルグリシン（ｐＨ７．８）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ_４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌルシフェリン〕３００μｌを自動注入し、１０秒間の発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性とした。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
１７β−エストラジオール添加条件下のルシフェラーゼ活性と１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出し、該誘導倍率が高く、かつ１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性が低いクローンとして、ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
参考例３ Ｇａｌ４−ＥＲを発現し、かつＣＲＥ制御下でホタル・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＧＢＣ７の造成
（１）ホタル・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃの造成
ハイグロマイシン耐性遺伝子およびエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有し、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にホタル・ルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを以下の方法で造成した。
ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕をＣｌａＩで部分消化し、１カ所切断されたＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＭｌｕＩで部分消化し、９．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）〕をＣｌａＩおよびＭｌｕＩで切断し、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含む１．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片、およびｐＡＧＥ２４８由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏｈを造成した。
ｐＡＭｏｈをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｏｒｉＰ、Ｇａｌ４ＵＡＳを含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌ９ｈを造成した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋（ストラタジーン社製）をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断した後、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ７５由来、宝酒造社製）を用いて脱リン酸化処理し、アンピシリン耐性遺伝子を含むＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。配列番号１０および１１で表される塩基配列を有す合成ＤＮＡをアニールさせることにより、ＣＲＥ配列を２つ含む二本鎖ＤＮＡを調製した。該二本鎖ＤＮＡとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ＋由来の上記ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を２つ含むプラスミドｐＢＳ−ＣＲＥＩを造成した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩは、該二本鎖ＤＮＡが、ＳａｌＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位が再生する方向に組み込まれたプラスミドであり、上記切断部位をそれぞれ１つずつ有している。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断し、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩ由来ＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を４つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断し、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を８つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＶを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断し、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を１６個含むｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、１６個のＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。参考例１（１）で造成したｐＡＧａｌＳｄ１をＭｌｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１．４ｋｂのＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９ｈをＸｂａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＭｌｕＩで切断することによりＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片、ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＧａｌ９ｈ由来のＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｈを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｈをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＲＥ配列を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＣＲＥｈ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＸｈｏＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片、およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片をそれぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来の上記２種のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片を結合することにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃ中のＣＲＥ配列上流のＨｉｎｄＩＩＩサイトが消失したプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＨを作製した。
ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒベクター（プロメガ社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断し、ｌｕｃ＋遺伝子（改変型のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりｌｕｃ＋遺伝子を含むレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを作製した。
（２）レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
ｐＡＣＲＥｐｌｕｃ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＨｐａＩ、ＳｐｅＩまたはＢａｌＩで切断したｐＡＣＲＥｐｌｕｃを１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、参考例２（２）で造成した細胞株ＫＪＭＧＥＲ８に、１．６×１０^６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに７日間培養した。生細胞数を確認後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびＫＪＭＧＥＲ８を１×１０^５細胞／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、１５０細胞／ｍＬになるように希釈し、９６ウェルプレートに分注（平均３０細胞／ウェル）して培養を行い、実際に１ウェル当たり１コロニーを形成したウェルを選択し、４２０個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（３）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣ７の選択
上記（２）で取得した各クローンを９６ウェルプレートにまき（１〜２×１０^４細胞／ウェル）、２ａ型アデノシン受容体（Ａ２ａ）に対するアゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ、シグマ−アルドリッチ社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ_２インキュベーター中で６時間培養した。Ａ２ａはＫＪＭＧＥＲ８のようなＢ細胞で内因性に発現しているＧＰＣＲであり、Ａ２ａのアゴニスト刺激によりアデニレートシクラーゼが活性化され、細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇するため、ＣＲＥを有するプロモーターからの転写が誘導される。
培養後、参考例２（２）に記載の方法に従って各ウェルのホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。ただし、測定器としてはルミノメーターＬＢ９５３に代わってＭｉｃｒｏ Ｌｕｍａｔ ＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）を使用した。活性の高かった１７クローンを選択した。
該１７クローンを４８ウェルプレート１ウェルあたり１×１０^５細胞ずつ分注し、ＮＥＣＡを終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌになるように添加し、ＣＯ_２インキュベーター中で５時間培養した。培養後、参考例２（２）に記載の方法に従ってホタル・ルシフェラーゼ活性測定をおこなった。ＮＥＣＡ刺激しない場合と比較し、ＮＥＣＡ刺激した場合にルシフェラーゼ活性が６０倍以上上昇した８クローンを選択した。
該８クローンに、Ｇα_ｓと共役する構成活性型ＧＰＣＲであるＧＰＲ１２の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２（下記参考例５参照）を、上記エレクトロポレーション法により、１．６×１０^６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換株を取得した。
該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株に１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、参考例２（２）と同様の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。１７β−エストラジオールを添加した際のルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった３クローン（ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７）を選択した。ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７における該上昇率は、それぞれ５６、１９３、および３６４倍であった。
該３クローンに、上記ｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２と同様の方法でＧα_ｓと共役する２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２（下記参考例６参照）を導入して安定形質転換株を取得し、１７β−エストラジオール刺激によりＶ２を誘導発現させた後に、バソプレッシン刺激した際のルシフェラーゼ活性を調べた。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合のルシフェラーゼ活性、およびバソプレッシン刺激しない場合のルシフェラーゼ活性を調べた。その結果、１７β−エストラジオールで刺激した時にのみバソプレッシンに反応して高いルシフェラーゼ活性（５９９倍）を示したＧＢＣ７を優良株として選択した。
参考例４ Ｇａｌ４−ＥＲを発現し、かつＣＲＥ制御下でウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＧＢＣＲ２の造成
（１）ウミシイタケ・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃの造成
ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（プロメガ社製）をＸｂａＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ処理後、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片を取得した。参考例３（１）で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃを造成した。
（２）レポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
参考例３（２）で記載した方法に準じて、ｐＡＣＲＥＲｌｕｃを細胞株ＫＪＭＧＥＲ８に導入し、９６個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（３）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣＲ２の選択
ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、参考例３（３）に記載した方法に準じ、上記（２）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。
上記（２）で取得した各クローンを９６ウェルプレートにまき（１〜２×１０^４細胞／ウェル）、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ_２インキュベーター中で６時間培養した。その後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社製）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）を用いた。活性の高かった９クローンを選択した。
該９クローンについて、ＮＥＣＡ刺激し、ＮＥＣＡ刺激しない時と比較し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が１８倍以上上昇した２クローンを選択した。該２クローンをそれぞれＧＢＣＲ１およびＧＢＣＲ２と命名した。
該２クローンにｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２を導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオールで２４時間刺激後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性も測定した。１７β−エストラジオールを添加した際のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった１クローンＧＢＣＲ２を優良株として選択した。該上昇率は３６４倍であった。
参考例５ Ｇａｌ４−ＥＲおよびキメラＧα_ｓを発現し、かつＣＲＥ制御下でホタル・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＧＢＣＣ１３の造成
（１）Ｇα_ｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４の造成
Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて全ＲＮＡを取得した。鋳型として該全ＲＮＡを５μｇ用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該一本鎖ｃＤＮＡを水で５０倍希釈し、ＰＣＲの鋳型として使用した。
上記一本鎖ｃＤＮＡ（１０μｌ）に、Ｇα_ｓ４遺伝子特異的プライマー（各２０ｐｍｏｌ）、２．５ｎｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、ジメチルスルホキシドを２．５μｌ、５単位／μｌ Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．２５μｌ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を５μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を５０μｌに調製した。Ｇα_ｓ４遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１２および１３で表される配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これらプライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトまたはＡｓｐ７１８サイトが導入されている。サーマルサイクラーＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。参考例３（１）で造成したプラスミドｐＡＭｏｈをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＭｏｈ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｇα_ｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４を造成した。
（２）Ｇα_ｓ−ｑ発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑの造成
上記（１）で構築したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩとＡｓｐ７１８で切断することによりｏｒｉＰを含むＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。また、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩで切断後、ＳｐｈＩで部分消化することにより、Ｃ末端を欠失したＧα_ｓ４をコードするＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を取得した。配列番号１４および１５で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、Ｇα_ｑのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、Ｇα_ｓのＣ末端の５アミノ酸をＧα_ｑのＣ末端の５アミノ酸に置換したキメラＧα_ｓ（以下、Ｇα_ｓ−ｑとよぶ）発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑを造成した。
（３）Ｇα_ｓ−ｉ発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉの造成
配列番号１６および１７で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、Ｇα_ｉのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、ならびに上記（２）で取得したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、Ｇα_ｓのＣ末端の５アミノ酸をＧα_ｉのＣ末端の５アミノ酸に置換したキメラＧα_ｓ（以下、Ｇα_ｓ−ｉとよぶ）発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを造成した。
（４）Ｇα_ｓ−ｑおよびＧα_ｓ−ｉを共発現するためのプラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉの造成
参考例３（１）で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃをＣｌａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＣｐｏＩで切断することにより、ｏｒｉＰおよびＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分を含むＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇα_ｓ−ｉをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０（１９９４）〕をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏ処理し、さらにＢｓｓＨＩＩで切断し、モロニー・マウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター（以下、Ｍｏプロモーターと略す）配列の一部を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇα_ｓ−ｑをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ならびに上記で取得したｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片およびｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを、ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＭｏプロモーターを含むＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、ＣｐｏＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＧα_ｓ−ｉをコードするＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、それぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを、ＮｈｅＩおよびＣｐｏＩで切断しＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片を、ＮｈｅＩおよびＮａｅＩで切断しＧα_ｓ−ｑをコードするＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片を、それぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉ由来のＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片およびＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片、ならびにｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑ由来のＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片およびＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片の４断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉプラスミドをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＳａｌＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片をセルフライゲーションすることにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉからＣＲＥレポーターユニットを除去したプラスミドｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＣｐｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｓｅＩで切断することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含まないＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ（クロンテック社製）をＢａｍＨＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｓｅＩで切断することにより、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ由来のＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ由来のＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を結合し、ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のハイグロマイシン耐性遺伝子を、ピューロマイシン耐性遺伝子で置き換えたｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを導入した細胞では、Ｇα_ｉまたはＧα_ｑに共役するＧＰＣＲのシグナル情報伝達についても、Ｇα_ｓを介したＧＰＣＲのシグナル情報伝達と同じく、ＣＲＥ制御下の遺伝子の転写の活性化を指標に検出することができる。
（５）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣ７の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＳｐｅＩで切断したｐＡＭｏＰＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、参考例３（３）で造成したＧＢＣ７に、１．６×１０^６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換株を、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（シグマ−アルドリッチ社製、２．０μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに７日間培養した。
培養後、該形質転換株の生細胞数を確認し、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびＫＪＭＧＥＲ８（１×１０^６細胞／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、該形質転換株が１５０細胞／ｍＬになるように希釈し、９６ウェルプレートに３０細胞／ウェルずつ分注して培養を行い、９３個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（６）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣＣ１３の選択
上記（５）で取得した９３クローンを１〜２×１０^４細胞／ウェルずつ９６ウェルプレートにまき、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００（インビトロジェン社製）を用いて、Ｇα_ｉまたはＧα_ｑと共役する１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＡＴ１（下記参考例９参照）を各クローンに導入し、形質転換株を取得した。遺伝子導入の具体的方法はリポフェクトアミン２０００の説明書に従って行い、１ウェル当たりプラスミドを０．３μｇ、リポフェクトアミン２０００を０．８μｌ使用した。
該形質転換株を１日培養した後に、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で７日間培養した。各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養した。各ウェルへアンジオテンシンＩＩ（ペプチド研究所社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、６時間培養後、参考例２（２）の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を調べた。以上の結果、アンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性を示した１０クローンを選択した。
該１０クローンに、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を上記エレクトロポレーション法により、１．６×１０^６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換株を取得した。
該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。
該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株に１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、アンジオテンシンＩＩ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに６時間培養後、上記の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。１７β−エストラジオールで刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性（８５倍）を示したＧＢＣＣ１３を優良株として選択した。
参考例６ Ｇａｌ４−ＥＲおよびキメラＧα_ｓを発現し、かつＣＲＥ制御下でウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＣＢＣＲＣ６の造成
（１）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを細胞株ＧＢＣＲ２の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
参考例５（５）で記載した方法に準じて、ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを参考例４（３）で造成した細胞株ＧＢＣＲ２に導入することにより、９４個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（２）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣＲＣ６の選択
上記（１）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、参考例５（５）に記載した方法に準じた。ウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性は、参考例４（３）に記載した方法に準じて測定した。
上記（１）で取得した各クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞を１７β−エストラジオールで処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。アンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示した１３クローンを選択した。
該１３クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１をエレクトロポレーション法により導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞を１７β−エストラジオールで処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。１７β−エストラジオールで刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性（１３２倍）を示したＧＢＣＲＣ６を優良株として選択した。
参考例７ ＧＰＲ１２の誘導発現プラスミドの造成
鋳型として、ヒト脳梁由来のｍＲＮＡ（１μｇ、クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、ＧＰＲ１２遺伝子特異的プライマーとして配列番号１８および１９で表される配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＧＰＲ１２遺伝子を取得した。酵素としては、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。ＰＣＲを行う際の緩衝液としては、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに付加された１０倍濃度の緩衝液を使用した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で５分間の処理後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を３５サイクル行った。
ＧＰＣＲ１２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断後、ＧＰＣＲ１２遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該切断断片を、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄの対応する制限酵素サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ）間へ組み込むことにより、誘導発現プラスミドを構築した。
プラスミドに組み込んだＤＮＡ断片の配列を以下のようにして決定し、ＧＰＣＲ１２をコードしていることを確認した。ｐＡＧａｌ９−ｎｄ中の配列に特異的なプライマー（配列番号２０および２１で表される配列を有する合成ＤＮＡ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、パーキン・エルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：アプライド・バイオシステムズ社）を使用した。
参考例８ ２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２の造成
鋳型として、ヒト腎臓由来のｍＲＮＡ（１μｇ、クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、Ｖ２遺伝子特異的プライマーとして、配列番号１６および１７で表される配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＶ２遺伝子を取得した。Ｖ２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。
得られたＶ２遺伝子増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。参考例１（２）で造成したプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。上記Ｖ２遺伝子増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｖ２の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２を造成した。
参考例９ １型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＡＴ１の造成
プラスミドｐＡＲ１．８〔Ｎａｔｕｒｅ，３５１，２３０（１９９１）〕をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ウシＡＴ１遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。参考例１（１）で造成したｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＲ１．８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合し、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を造成した。Example 1 Screening of agonists for GPCR-T4
(1) Preparation of assay cells
  The GPCR-T4-induced expression plasmid pAGal9-GPCR-T4 (4 μg) constructed in Reference Example 1 (3) was electroporated [Cytotechnology,3, 133 (1990)], 1.6 × 10 6 selected in Reference Example 6 (2)⁶The cells were introduced into GBCRC6. The transformed strain was suspended in 8 ml of RPMI1640 • ITPSG medium, and CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. After culturing, blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), puromycin (2.0 μg / mL) and geneticin (500 μg / mL) were added, and further cultured for 14 days. A stable transformant (referred to as GPCR-T4 assay cell 1) was obtained.
  Similarly, the control plasmid pAGal9-nd (4 μg) constructed in Reference Example 1 (2) was introduced into GBCRC6 to obtain a stable transformant (referred to as control cell 1). GPCR-T4 assay cell 1 and control cell 1 were treated with blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), puromycin (2.0 μg / mL) and geneticin (500 μg / mL). It was subcultured with RPMI1640 / ITPSG medium containing.
(2) Screening of agonists for GPCR-T4
  GPCR-T4 assay cell 1 and control cell 1 were respectively dispensed into 96-well plates (Sumitomo Bakelite) (approximately 1 × 10⁴After culturing at 37 ° C. for 1 day, 17β-estradiol (final concentration: 10 nmol / L, manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter abbreviated as E2) was added to each well and further cultured for 1 day. After adding the test substance and culturing for 6 hours, coelenterazine h (final concentration 250 nmol / L, manufactured by Molecular Probes) was added to measure Renilla luciferase activity. For the activity measurement, a Wallac 1420 ARVOsx multi-label counter (manufactured by Wallac Bertoled Japan) or FDSS6000 (manufactured by Hamamatsu Photonics) was used. In addition, the same experiment was performed without adding the test substance, and Renilla luciferase activity was measured.
  GPCR-T4 assay In the assay using cell 1, when the activity when a test substance is added increases relative to the activity when no test substance is added, the test substance is selected as a candidate agonist for GPCR-T4 did. In the assay using control cell 1, when the activity when the candidate substance was added and the activity when the candidate substance was not added were approximately equal, the substance was selected as an agonist for GPCR-T4.
  As a result of assaying various in-vivo substances as test substances, it was revealed that T4 (manufactured by Prestwick Chemical) is an agonist for GPCR-T4. FIG. 1 shows the Renilla luciferase activity fold when the various concentrations of T4 were added to the assay cell 1 or the control cell 1 (the fold of Renilla luciferase activity when the T4 was not added was 1). On the other hand, T3 showing strong agonist activity at the known thyroid hormone receptor showed only very weak agonist activity (activity about 1/100 of T4) against GPCR-T4.
  According to the method of Reference Example 7, various GPCRs [A-2, AGR9, CKRX, ETBR-LP-2, G2A, g10d, GPR1, GPR3, GPR4, GPR6, GPR7, GPR8, GPR12, GPR15, GPR17, GPR18, GPR19 GPR20, GPR21, GPR22, GPR23, GPR25, GPR26, GPR28, GPR30, GPR32, GPR35, GPR37, GPR39, GPR40, GPR41, GPR43, GPR45, GPR52, GPR55, GPR58, GPR65, P2Y10, PNR, RE2: Curr. Opin. Pharmacol.1, 31 (2001)] was prepared, and assay cells for each GPCR were constructed according to the method of Example 1. Since T4 did not show agonistic activity in these assay cells, T4 was considered a specific ligand for GPCR-T4. From the above results, it was considered that T4 is a ligand in vivo of GPCR-T4, and GPCR-T4 is a T4 receptor different from the thyroid hormone receptor.
  Further, as a result of assaying various substances as test substances, it was found that isconazole (manufactured by Prestwick Chemical Co.) is an agonist for GPCR-T4. FIG. 2 shows the Renilla luciferase activity fold when various concentrations of isoconazole were added to assay cell 1 or control cell 1 (the fold of activity when Renilla luciferase activity was 1 when no isoconazole was added). Since isoconazole did not act on assay cells into which other GPCRs were introduced, it was considered that the receptor specificity for GPCR-T4 was high.
Example 2 Screening for agonists or antagonists to GPCR-T4 using T4
(1) Construction of assay cells
  The GPCR-T4 inducible expression plasmid pAGal9-GPCR-T4 (4 μg) constructed in Reference Example 1 (3) was selected in Reference Example 5 (6) according to the method described in Example 1 (1). 6x10⁶The cells were introduced into GBCC13 to obtain a stable transformant (hereinafter referred to as GPCR-T4 assay cell 2).
(2) Screening for agonists or antagonists for GPCR-T4
  The GPCR-T4 assay cell 2 constructed in (1) is added to a 96-well white plate (Corning) at 1 × 10 6 per well.⁵Inoculated one by one, and E2 diluted with a medium to a final concentration of 10 nmol / L was added to induce and express GPCR-T4. However, a sample to which E2 was not added was provided for background measurement. 5% CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. 500 nmol / L T4 (Sigma-Aldrich) and a test compound were added to each well, and only 500 nmol / L T4 was added to a control well without adding a test compound. Nothing was added to wells for background measurement to which E2 was not added. Each was further incubated for 7 hours and allowed to react. Then, the substrate solution of Steady-Glo Luciferase Assay System (manufactured by Promega) was added to stop the reaction, and the top count (manufactured by Packard) was used per second. The number of counts, that is, the amount of luminescence, was measured and used as firefly luciferase activity.
  The activity (antagonism) of the test compound was expressed as an inhibition rate calculated based on the counts per second when the test compound was added and when it was not added, as shown in the following formula.
Inhibition rate (%) = [1-{(AB) / (CB)}] × 100
  In the formula, A, B, and C each represent the following meanings.
A: Counts per second upon addition of E2, T4 and test compound
B: Counts per second when E2, T4 and test compound are not added (for background measurement)
C: Counts per second when only E2 and T4 are added and when no test compound is added (for control)
  When the inhibition rate is positive, that is, when the light emission amount (A-B) when the test compound is added decreases compared to the light emission amount (C-B) when the test compound is not added, the test compound is selected as an antagonist. did. In addition, when the inhibition rate is negative, that is, when the light emission amount (A-B) when the test compound is added is increased compared to the light emission amount (C-B) when the test compound is not added, the test compound is agonistic. Selected as.
  As a result of the screening, Compound I (Chembridge Corporation) was obtained as an agonist for GPCR-T4, and Compound IIa (Acinex) and Compound IIb (Acinex) were used as antagonists for GPCR-T4. Was acquired. Table 1 shows the inhibition rates (%) of Compound I, Compound IIa and Compound IIb when the concentration of the test compound was 3 μmol / L.

  For compounds IIa and IIb obtained as antagonists, the inhibition rate at concentrations of 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 μmol / L was measured, and Logit-Log By the linear approximation analysis method of conversion method, IC₅₀The value was calculated. As a result, IC of compound IIa₅₀Is 91 nmol / L, IC of Compound IIb₅₀Was 127 nmol / L.
  Agonist activity of Compound I was measured by an assay using Compound I instead of T4 as a ligand. As above, GPCR-T4 assay cells 2 were placed in a 96-well white plate at 1 × 10 6 per well.⁵Each seed | inoculated, E2 was added so that it might become final concentration of 10 nmol / L, and it culture | cultivated for 24 hours. However, a sample to which E2 was not added was provided for background measurement. Various concentrations of Compound I were added to the wells. Compound I was not added to control wells and wells for background measurement to which E2 was not added. Each was further incubated for 7 hours and allowed to react, then the Steady-Glo Luciferase Assay System substrate solution was added to stop the reaction, and the number of counts per second, that is, the amount of luminescence using TopCount (manufactured by Packard) Was measured.
  The activity (agonist action) of Compound I was expressed as the activation rate calculated based on the counts per second when Compound I was added and when it was not added as shown in the following formula.
Activation rate (%) = {(A−B) / (C−B)} × 100
  In the formula, A, B, and C each represent the following meanings.
A: Counts per second when E2 and Compound I were added
B: Counts per second when E2 and Compound I are not added (for background measurement)
C: Count per second when only E2 is added and compound I is not added (for control)
  The results are shown in Table 2.

  From the above results, it was shown that agonists and antagonists for GPCR-T4 can be obtained using the assay system of the present invention.
  In addition, when a similar assay was performed using cells (WO03 / 087366) inducing and expressing other GPCRs (for example, GPR4 or OGR-1) as assay cells, compounds I, IIa, and IIb exhibited activity. Not shown. From this, it was shown that compounds I, IIa and IIb act specifically on GPCR-T4.
  The same screening can be performed by using the GPCR-T4 assay cell 1 constructed in Example 1 instead of the GPCR-T4 assay cell 2.
Example 3 Screening for GPCR-T4 Agonists or Antagonists Using GPCR-T4 Agonists
  Using the GPCR-T4 assay cell 1 or 2 obtained in Example 1 or 2 and T4 or isoconazole which is an agonist of GPCR-T4, screening of an agonist or antagonist of GPCR-T4 can be performed as follows. it can.
  About 1 × 10 6 of the GPCR-T4 assay cell 1 obtained in Example 1⁴After aliquoting into individual 96 well plates and culturing at 37 ° C. for 1 day, E2 (final concentration: 10 nmol / L) is added to each well and further culturing for 1 day. The test substance and T4 or isoconazole are added and cultured for 6 hours, and then Renilla luciferase activity is measured. In addition, the same experiment is performed without adding a test substance, and Renilla luciferase activity is measured.
  Alternatively, the GPCR-T4 assay cell 2 obtained in Example 2 is about 1 × 10⁴After aliquoting into individual 96 well plates and culturing at 37 ° C. for 1 day, E2 (final concentration: 10 nmol / L) is added to each well and further culturing for 1 day. A test substance and T4 or isoconazole are added and cultured for 6 hours, and then firefly luciferase activity is measured. In addition, the same experiment is performed without adding the test substance, and the firefly luciferase activity is measured.
  In an assay using assay cells, when the activity when a test substance is added increases relative to the activity when no test substance is added, the test substance can be selected as an agonist of GPCR-T4. By performing the same experiment using an assay cell in which another GPCR is expressed instead of GPCR-T4, the receptor specificity of the selected substance can be examined.
  In an assay using assay cells, when the activity when a test substance is added decreases with respect to the activity when no test substance is added, the test substance can be selected as an antagonist of GPCR-T4. By performing the same experiment using an assay cell in which another GPCR is expressed instead of GPCR-T4, the receptor specificity of the selected substance can be examined.
  Any substance can be used as the test substance, but an agonist or antagonist of GPCR-T4 can be efficiently searched for by using a derivative or similar compound of T4 or isoconazole.
Example 4 Measurement of constituent activity of GPCR-T4
  The GPCR-T4 assay cell 1 and the control cell 1 prepared in Example 1 (1) were each about 1 × 10 6 in a 96-well plate.⁴Individual / well was dispensed and cultured at 37 ° C. for 1 day. After adding 17β-estradiol (final concentration 10 nmol / L) to each well and further culturing for 1 day, coelenterazine h was added to measure Renilla luciferase activity.
  In addition, the same experiment was conducted without adding 17β-estradiol, and Renilla luciferase activity was measured. The induction ratio was obtained by dividing the activity when 17β-estradiol was added by the activity when no activity was added. The induction factor in control cell 1 was about 1. On the other hand, the induction factor of GPCR-T4 assay cell 1 was about 12 times. GPCR-T4 was found to be a constitutively active GPCR because a signal was passed only by inducible expression.
Example 5 Screening of inverse agonists for GPCR-T4 using the constitutive activity of GPCR-T4
  Using the GPCR-T4 assay cells 1 or 2 obtained in Example 1 or 2, inverse agonists for GPCR-T4 can be screened as follows.
  About 1 × 10 6 of the GPCR-T4 assay cell 1 obtained in Example 1⁴After aliquoting each well / well into a 96-well plate and culturing at 37 ° C. for 1 day, 17β-estradiol (final concentration: 10 nmol / L) and a test substance are added to each well, followed by further culturing for 1 day. Thereafter, Renilla luciferase activity is measured. In addition, the same experiment is performed without adding a test substance, and Renilla luciferase activity is measured.
  Alternatively, the GPCR-T4 assay cell 2 obtained in Example 2 is about 1 × 10⁴After aliquoting each well / well into a 96-well plate and culturing at 37 ° C. for 1 day, 17β-estradiol (final concentration: 10 nmol / L) and a test substance are added to each well, followed by further culturing for 1 day. Thereafter, firefly luciferase activity is measured. In addition, the same experiment is performed without adding the test substance, and the firefly luciferase activity is measured.
  As shown in Example 3, GPCR-T4 shows constitutive activity even in the absence of an agonist. Therefore, in the assay using assay cells, the activity when a test substance is added does not add the test substance. If there is a decrease relative to the activity of the case, the test substance can be selected as an inverse agonist for GPCR-T4. By performing the same experiment using an assay cell in which another GPCR is expressed instead of GPCR-T4, the receptor specificity of the selected substance can be examined.
Example 6 Analysis of G protein conjugated with GPCR-T4
  GPCR-T4 induced expression plasmid pAGal9-GPCR-T4 (2 μg) and Gα constructed in Reference Example 5 (4)_sOf the C-terminal 5 amino acids of Gα_iChimeric Gα substituted with 5 amino acids of C-terminal_s(Hereafter, Gα_siFirefly luciferase reporter plasmid pACRElucMoGs-i (2 μg), which is also a plasmid for expression), was obtained by electroporation in 1.6 × 10 6 obtained in Reference Example 2 (2).⁶The cells were introduced into KJMGER8.
The transformed strain was suspended in 8 ml of RPMI1640 • ITPSG medium, and CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. After culturing, blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL) and geneticin (500 μg / mL) were added, and further cultured for 14 days to obtain a stable transformant (hereinafter referred to as Gα)._siCalled expression assay cells).
  Similarly, the GPCR-T4 inducible expression plasmid pAGal9-GPCR-T4 (2 μg) and the firefly luciferase reporter plasmid pACREluc (2 μg) constructed in Reference Example 3 (1) were introduced into KJMGER8, and a stable transformant (control) Called assay cells). Gα_siExpression assay cells and control assay cells were passaged in RPMI 1640 • ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL) and geneticin (500 μg / mL).
  Gα_siApproximately 1 × 10 each for expression assay cells and control assay cells⁴The cells were dispensed into 96-well plates one by one, and cultured at 37 ° C. for 1 day. Then, 17β-estradiol (final concentration: 10 nmol / L) was added to each well and further cultured for 1 day. After adding 100 nml / L T4 and culturing for 6 hours, a reagent of Steady Glo Luciferase Assay System (manufactured by Promega) was added, and firefly luciferase activity was measured using a top count (manufactured by Packard). Moreover, the same experiment was conducted without adding 100 nmol / L T4, and the firefly luciferase activity was measured.
  Gα_siIn the assay using expression assay cells, the activity when T4 was added increased 5.3-fold over the activity when T4 was not added. On the other hand, there was almost no difference (1.1 times) in the assay using control assay cells. That is, to detect a signal from GPCR-T4 activated by T4, Gα_siIt became clear that the expression of is essential.
  Since the control assay cell is introduced with a reporter plasmid expressing the firefly luciferase gene under the control of CRE,_SWhen a GPCR conjugated to is activated by ligand stimulation,_SThe expression of the reporter gene under CRE control is increased. Gα_siGα co-expressed_siIn expression assay cells, G_iEven when the GPCR conjugated to is activated by ligand stimulation, Gα_siThe expression of the reporter gene under CRE control is increased. Therefore, the above results show that GPCR-T4 is G_sIs not conjugated to G_iIndicates conjugation. GPCR-T4 is activated by ligand stimulation._iIt was found that a signal flows through
Example 7 Expression analysis of transcription product of GPCR-T4 gene in various human cells and tissues
  GPCR-T4 transcript was quantified by a semi-quantitative PCR method [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  In addition, the transcripts of the β-actin gene, which is considered to be expressed at the same level in any cell, are also quantified at the same time, so that the amount of mRNA between cells and the single-strand from the mRNA by reverse transcriptase between samples are also measured. It was confirmed that there was not much difference in the conversion efficiency to cDNA. Quantification of the β-actin transcript was performed by quantitative PCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,872725 (1990), J.A. Biol. Chem. ,26914730 (1994), Japanese Patent Laid-Open No. 06-181759].
(1) Synthesis of single-stranded cDNA derived from various cell lines
  Examples of human cell lines include T cell lines [MOLT-3 (ATCC number: CRL-1552), MOLT-4 (JCRB9031), HUT78], B cell lines [Namalwa KJM-1, Daudi (JCRB9071), Raji (ATCC number). : CCL-86)], granulocyte / monocyte cell line [HL-60 (ATCC number: CCL-240), U-937 (ATCC number: CRL-1593.2), THP-1 (ATCC number: TIB) -202)], vascular endothelial cell lines [IVEC, HUVEC], melanoma cell lines (WM266-4, WM115), neuroblastoma cell lines SK-N-MC (ATCC number: HTB-10), lung cancer cell lines [ PC-9, HLC-1, QG90], prostate cancer cell line PC-3 (ATCC number: CRL-1435), gastric cancer cell line ATOIII, pancreatic cancer cell lines [Capan-1 (ATCC number: HTB-79), Capan-2 (ATCC number: HTB-80)], colon cancer cell lines [Colo205, SW1116, LS180], epithelial cell line HeLa ( ATCC number: CCL-2) was used. QG90 and SW1116 were obtained from Aichi Cancer Center. HLC-1 was obtained from Osaka University Cancer Research Institute. KATO III and PC-9 were obtained from the Institute for Immunobiology. HUVEC (Human Umbilical Endoceral Cell) was obtained from Kurashiki Boseki Co., Ltd. IVEC [J. Cell. Physiol. ,157, 41 (1993)] is N. T. T. et al. L. Obtained from FRANCE. MOLT-4 and Daudi were obtained from JCRB. Other cells were obtained from the American Type Culture Collection.
  The total RNA of each cell can be obtained by a conventional method [Biochemistry,18, 5294 (1977)]. Synthesis of single-stranded cDNA from total RNA is performed using a kit (SUPERSCRIPT^TM  Preamplification System (manufactured by Invitrogen) was used. For cell lines, single-stranded cDNA was synthesized from 5 μg of total RNA, and each was diluted 50-fold with water and used as a template for PCR. As a primer, an oligo (dT) primer was used.
(2) Synthesis of single-stranded cDNA derived from peripheral white blood cells
  Polymorphprep from peripheral blood of healthy adults^TMPolymorphonuclear leukocytes and mononuclear cells were separated and obtained using (Nycomed Pharma). Subsequently, the conventional method [J. Immunol. ,130, 706 (1983)], monocytes and lymphocytes were separately obtained from the obtained mononuclear cells.
CD4⁺  T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec), CD8⁺Knowing T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) and CD19 MicroBeads (Miltenyi Biotec), CD4⁺  T cells, CD8⁺  T cells and B cells were obtained separately.
  Polymorphonuclear leukocytes, mononuclear cells, monocytes, CD4 obtained above⁺  T cells, CD8⁺  Total RNA was prepared from T cells and B cells using RNeasy Midi Kit (QIAGEN). The synthesis of single-stranded cDNA is a kit (SUPERSCRIPT^TM  Preamplification System (manufactured by Invitrogen) was used. Single-stranded cDNA was synthesized from 5 μg of total RNA, diluted 50 times with water and used as a template for PCR. As a primer, an oligo (dT) primer was used.
(3) Synthesis of single-stranded cDNA derived from various human tissues
  35 human tissues (adrenal gland, whole brain, caudate nucleus, hippocampus, substantia nigra, thalamus, kidney, pancreas, pituitary gland, small intestine, bone marrow, amygdala, cerebellum, corpus callosum, fetal brain, fetal kidney, fetus From mRNA derived from liver, fetal lung, heart, liver, lung, lymph node, mammary gland, placenta, prostate, salivary gland, skeletal muscle, spinal cord, spleen, stomach, testis, thymus, thyroid, trachea, uterus (Clontech) Similarly, single-stranded cDNA was synthesized. Single-stranded cDNA was synthesized from 1 μg of mRNA, diluted 240-fold with water, and used as a PCR template. As a primer, an oligo (dT) primer was used.
(4) Preparation of standard for quantification of β-actin gene transcript
  pUC119-ACT and pUC119-ACTd, each of which is a restriction enzymeHindIII andAspAfter being cleaved at 718 and converted into linear DNA, each was used as a standard for quantifying β-actin transcripts and as an internal control [J. Biol. Chem. ,26914730 (1994), JP 06-181759]. After confirming that each plasmid was completely cleaved, it was used after diluting stepwise with water containing 1 μg / mL yeast tRNA.
(5) Quantification of transcription product of GPCR-T4 gene using PCR method
  10 μmol of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 as a forward primer and 5 μL of the single-stranded cDNA described in the above (1) to (3), and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 as a reverse primer 10 μmol of DNA, 1.6 μL of 2.5 mmol / L dNTP mixed solution, 1 μL of dimethyl sulfoxide, 5 μl / μL of Ex Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.1 μL, 10 × reaction buffer (Takara Shuzo) 2 μL) was added, and sterilized water was added to adjust the total volume to 20 μL. Using a thermal cycler DNA Engine (manufactured by MJ Research), the DNA was denatured by heat treatment at 94 ° C. for 3 minutes, and then a reaction consisting of 25 minutes at 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. 33 cycles were performed. A part (8 μL) of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and then the gel was stained with SYBR Green I nucleic acid stain (manufactured by Molecular Probes). The amount of the amplified DNA fragment was measured by analyzing the pattern of the amplified DNA fragment using a fluoroimager (FluorImager SI, manufactured by Molecular Dynamics). In order to more accurately quantify transcripts, similar PCR was performed by changing the number of PCR cycles. The amount of standard was varied according to the number of PCR cycles.
  The quantification of the transcript of the β-actin gene has already been reported [J. Biol. Chem. ,26914730 (1994), JP-A-6-181759].
  FIG. 3 shows the results for various human tissues when the number of PCR cycles is 30. The transcript of the GPCR-T4 gene was highly expressed in bone marrow, spleen, thyroid gland, and placenta in normal human tissues, and then in the lung, trachea, and lymph nodes. Expression was also observed in skeletal muscle, testis, spinal cord, fetal liver, and fetal lung. FIG. 4 shows the results for various human peripheral white blood cells and HeLa cells when the number of PCR cycles is 28. In human peripheral blood, very strong expression was observed in polymorphonuclear leukocytes. Slight expression was also observed in HeLa cells. Expression was also seen in T cells and monocytes. FIG. 5 shows the results for various cultured cell lines of humans when the number of PCR cycles is 30. In cultured human cell lines, expression was observed in promyelocytic cell lines (HL-60) and T cell lines (Hut78).
  Since GPCR-T4, a novel receptor for T4 (thyroid hormone), is highly expressed in the thyroid gland, T4 produced in the thyroid gland acts on autocrine and controls thyroid function such as regulation of thyroid hormone secretion. It seems that they are involved.
  Since GPCR-T4 is highly expressed in polymorphonuclear leukocytes (including many neutrophils), it is considered to be involved in the control of neutrophil function. Moreover, since it is also expressed in T cells, monocytes, and lymph nodes, GPCR-T4 is considered to have activity to regulate inflammation and immune function.
Example 8 Effect of agonist on GPCR-T4 on MAPK activation of human peripheral polymorphonuclear leukocytes
(1) Inhibition of MAPK activation of human peripheral polymorphonuclear leukocytes by agonists for GPCR-T4
  As described in Example 6, GPCR-T4 is highly expressed in the human peripheral polymorphonuclear leukocyte fraction rich in neutrophils. Therefore, human peripheral polymorphonuclear leukocytes were stimulated with T4 or isoconazole that showed agonist activity against GPCR-T4, and the change in the activation state of ERK1 / 2 MAPK was examined.
  Polymorphprep from peripheral blood of healthy adults^TMPolymorphonuclear leukocytes were separated and obtained using (Nycomed Pharma). The obtained polymorphonuclear leukocytes are suspended in ice-cooled HBSS (Hank's balanced salt solution: manufactured by Invitrogen) and then 2 × 10 2 in a 1.5 mL tube (Eppendorf).⁶Cells were dispensed. The cells were preincubated for 5 minutes at 37 ° C., then 1 μmol / L T4 or isoconazole was added and incubated at 37 ° C. for 2, 9 or 29 minutes. Thereafter, the cells were obtained by centrifugation at 90 × g for 1 minute.
  30 μL of cell lysis buffer [50 mmol / L HEPES / NaOH (pH 7.4) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 250 mmol / L NaCl (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 1 mmol / L EDTA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) 1% Nonidet P-40 (manufactured by Sigma), 1 mmol / L 1,4-dithio-DL-threitol (manufactured by Sigma), 1 mmol / L phenylmethylsulfonyl fluoride (manufactured by Sigma), 10 μmol / L leupeptin (Manufactured by Sigma), 2 mmol / L sodium vanadate (manufactured by Sigma), 1 mmol / L sodium fluoride (manufactured by Sigma), 10 mmol / L β-glycerophosphoric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] And left for 10 minutes. The lysate was centrifuged at 130 × g for 7 minutes to obtain a supernatant. The protein concentration in the supernatant was measured using a protein assay staining solution (manufactured by BioRad), and 20 μg was subjected to SDS polyacrylamide gel electrical permanence (SDS-PAGE). SDS polyacrylamide gel is 10% uniform gel NPU-R10L (manufactured by Atto), and Precision Protein Standards Unstained Broad Range (manufactured by Bio-Rad) is the molecular weight marker. Using. Electrophoresis was performed at 20 mA for 70 minutes.
  After electrophoresis, the protein was blotted onto an immobilon transfer membrane (Immobilon transfer membrane, manufactured by Millipore), and an anti-phosphorylated ERK1 / 2 MAPK antibody (Phospho-p44 / 42 MAP manufactured by CellSignaling, diluted 200-fold) as a primary antibody. Kinase antibody) or anti-ERK1 / 2 MAPK antibody (p44 / 42 MAP Kinase antibody manufactured by CellSignaling, diluted 200-fold), horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by DAKO: 1000-fold diluted) as a secondary antibody Antibody staining was performed. ECL western blotting analysis (Amersham Biosciences) and Hyperfilm ECL (Amersham Biosciences) were used for color development and detection.
  Preparation of the above-mentioned lysate, SDS-PAGE, and Western blotting were performed by a conventional method [Protein Experiment Note, Volume 2, Yodosha (1999), Mol. Cell, Biochem. ,217113 (2001), Mol. Endocrinol. ,16, 70 (2002), J. et al. Biol. Chem. ,276, 33847 (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,97, 1489 (2000), Eur. J. et al. Biochem. ,237, 704 (1996)].
  As a result of the above analysis, it was revealed that phosphorylation (activation) of ERK1 / 2 MAPK in human peripheral polymorphonuclear leukocytes was suppressed by 1 μmol / L T4 stimulation or 1 μmol / L isoconazole stimulation ( FIG. 6). This result shows that the activation of ERK1 / 2 MAPK in neutrophils can be suppressed using an agonist for T4 or isconazole or GPCR-T4.
(2) Suppression of MAPK activation of human peripheral polymorphonuclear leukocytes by GM-CSF stimulation by GPCR-T4 agonist
  It is known that when neutrophils are stimulated with GM-CSF, ERK1 / 2 MAPK is phosphorylated (activated). Therefore, the effect of T4 on the activation of ERK1 / 2 MAPK in human peripheral polymorphonuclear leukocytes by GM-CSF stimulation was examined.
  Polymorphprep from peripheral blood of healthy adults^TMPolymorphonuclear leukocytes were separated and obtained using (Nycomed Pharma). The obtained polymorphonuclear leukocytes are suspended in ice-cooled HBSS (manufactured by Invitrogen) and then 2 × 10 2 in a 1.5 mL tube (manufactured by Eppendorf).⁶Cells were dispensed. The cells were preincubated for 5 minutes at 37 ° C., and various concentrations (10 nmol / L, 100 nmol / L, 1 μmol / L) of T4 were added in the presence or absence of 5 ng / mL GM-CSF. Incubated for 4 minutes at ° C. Thereafter, the cells were obtained by centrifugation at 90 × g for 1 minute. In addition, as a control, cells were obtained by performing the same operation using T3 having an agonist activity for GPCR-T4 weaker by about 1/100 compared to T4 instead of T4.
  Using the above cells, Western blotting using anti-phosphorylated ERK1 / 2 MAPK antibody or anti-ERK1 / 2 MAPK antibody was performed in the same manner as (1). As a result, it was revealed that phosphorylation (activation) of ERK1 / 2 MAPK by GM-CSF was suppressed by 1 μmol / L T4 stimulation (FIG. 7). On the other hand, phosphorylation (activation) of ERK1 / 2 MAPK was not suppressed by T3 stimulation.
  The above results show that activation of ERK1 / 2 MAPK in neutrophils by GM-CSF stimulation or cytokine stimulation that sends the same signal as GM-CSF can be suppressed using an agonist for T4 or GPCR-T4. Yes.
  In neutrophils, activation of ERK1 / 2 MAPK is known to cause neutrophil priming and activation. Therefore, agonists (eg T4, isoconazole or compound I) or antagonists for GPCR-T4 It is thought that priming and activation of neutrophils can be controlled using (eg compound IIa or IIb).
Reference Example 1 Construction of GPCR-T4 induced expression plasmid
(1) Construction of inducible expression plasmids pAGalSd1-luc and pAGal9-luc of firefly luciferase
  pcDNA3 (Invitrogen)XhoAfter cutting with I, Klenow processing,XhoI (blunt end) fragment was obtained. By joining the fragments,XhoPcDNA3 in which the I cleavage site was eliminated was constructed.
XhoPcDNA3 from which the I-cleavage site has been eliminatedKpnAfter cutting with I, Klenow processing,KpnI (blunt end) fragment was obtained. By joining the fragments,XhoI andKpnPcDNA3 in which the I cleavage site was eliminated was constructed.
XhoI andKpnPcDNA3 from which the I-cleavage site has been eliminatedBglAfter cutting with II, Klenow processing,BglII (blunt end) fragment was obtained. pAMoERC3Sc (Japanese Patent Laid-Open No. 05-336963)XhoI andNsiAfter cutting with I, Klenow treatment, 2.2 kb containing Epstein-Barr virus oriP sequenceXhoI (blunt end)-NsiI (blunt end) fragment was obtained.XhoI andKpnDerived from pcDNA3 in which the I cleavage site has been deletedBglII (blunt end) fragment, and from pAMoERC3ScXhoI (blunt end)-NsiPlasmid pcDNA3-oriP was constructed by ligating I (blunt end) fragments.
  pcDNA3-oriPXhoI andHincut with dIII,XhoI-HinA dIII fragment was obtained. pSEOluc2 (WO98 / 14474)XhoI andNcoAfter cutting with I, Klenow treatment and ampicillin resistance gene is includedXhoI (blunt end)-NcoI (blunt end) fragment was obtained. pcDNA3-oriPXhoI-Hinof the dIII fragment and pSEOluc2XhoI (blunt end)-NcoPlasmid pASd1-luc1 was constructed by ligating the I (blunt end) fragment.
  pASd1-luc1XhoI andHinAfter cutting with dIII, 0.11 kbXhoI−HinA dIII fragment was obtained. Derived from pcDNA3-oriPXhoI-HindIII fragment, and from pASd1-luc1XhoI-HinThe dIII fragment was ligated to construct plasmid pcDNA3-oriP-Sd1.
  pcDNA3-oriP-Sd1XhoI andKpnCut with I,XhoI-KpnI fragment was obtained. Four types of DNA having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 8, and 9 were synthesized. Each of the synthetic DNAs was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase, mixed and annealed to obtain double-stranded DNA having a polyadenylation signal. Derived from the double-stranded DNA and pcDNA3-oriP-Sd1XhoI-KpnThe plasmid pcDNA3-oriP-Sd1-pA was constructed by ligating the I fragments.
  pcDNA3-oriP-Sd1-pAXhoAfter cutting with I, Klenow processing,XhoI (blunt end) fragment was obtained. pFR-luc (manufactured by Stratagene)HindIII andBamCut with HI, Klenow processing, 0.14 kbHindIII (blunt end)-BamHI (blunt end) fragments were obtained. derived from pcDNA3-oriP-Sd1-pAXhoI (blunt end) fragment and from pFR-lucHindIII (blunt end)-BamThe HI (blunt end) fragment was ligated to produce plasmid pAGalSd1. pAGalSd1 contains a promoter having a sequence in which a Gal4p response element is repeated 5 times.
  pAGalSd1EcoAfter cutting with RI, Klenow processing,EcoRI (blunt end) fragments were obtained. In addition, pSEOluc2 (WO98 / 14474)HindIII andSacAfter cutting with I, it is 1.7 kb containing the firefly luciferase gene by Klenow treatment.HindIII (blunt end)-SacI (blunt end) fragment was obtained. derived from pAGalSd1EcoFrom RI (blunt end) fragment and pSEOluc2HindIII (blunt end)-SacA firefly luciferase inducible expression plasmid pAGalSd1-luc was constructed by ligating I (blunt end) fragments.
  two existing in pAGalSd1-lucHinWithin the dIII site, more distant from the firefly luciferase geneHinpAGalSd4-luc was constructed by eliminating only the dIII site by Klenow treatment.
  pAGalSd4-lucAspAfter cutting at 718,Stu9.5 kb derived from pAGalSd4-lucAsp718-StuI fragment was obtained. The DNA fragment was treated with Klenow and self-ligated to construct a firefly luciferase inducible expression plasmid pAGal9-luc.
  Since pAGalSd1-luc and pAGal9-luc contain a promoter having a response element to the transcription factor Gal4p, a host that expresses a chimeric protein (hereinafter referred to as Gal4-ER) of the DNA binding region of Gal4p and the ligand binding region of estrogen receptor In the transformant introduced into the cells, the expression of firefly luciferase is induced by the addition of 17β-estradiol.
(2) Construction of inducible expression vectors pAGal9-d and pAGal9-nd
  The expression plasmid pAGal9-luc constructed in (1) isHindIII andSacCut with I and 6.9 kb including oriPHindIII-SacI fragment was obtained. pAMo-d (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-211885)HindIII andSacCleaved with I and contains a tetracycline resistance geneHindIII-SacI fragment was obtained. Derived from the above pAGal9-lucHindIII-SacI fragment and from pAMo-dHindIII-SacBy ligating the I fragment, a plasmid pAGal9-d was constructed in which the firefly luciferase gene portion in pAGal9-luc was replaced with the stuffer sequence of pAMo-d.
  pAGal9-lucHindIII andSacCut with I, 6.9kbHindIII-SacI fragment was obtained. pAMo-nd (JP 2001-211885)HindIII andSacCleaved with I and contains a tetracycline resistance geneHindIII-SacI fragment was obtained. Derived from the above pAGal9-lucHindIII-SacI fragment, and from pAMo-ndHindIII-SacBy ligating the I fragment, a plasmid pAGal9-nd was constructed in which the firefly luciferase gene portion in pAGal9-luc was replaced with the stuffer sequence of pAMo-nd.
  Since pAGal9-d and pAGal9-nd contain a promoter having a response element to the transcription factor Gal4p, a plasmid for inducing and expressing the polypeptide by inserting a DNA encoding an arbitrary polypeptide instead of the stuffer sequence Can be created.
(3) Construction of inducible expression plasmid pAGal9-GPCR-T4 of GPCR-T4
  An inducible expression plasmid pAGal9-GPCR-T4 of GPCR-T4 was constructed using c-hep15374, which is a cDNA clone encoding human GPCR-T4 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. c-hep15374 cDNA was obtained from a full-length cDNA library derived from the liver cancer cell line HEPG2 prepared using the expression vector pME18S-FL3 (NCBI nucleotide database accession number AB009864) according to the method described in the patent (EP1195434 A1). It was done. The sequence of c-hep15374 cDNA is shown in SEQ ID NO: 28.
  a plasmid containing c-hep15374 cDNAStuI andNotBy cutting with I, about 2.7 kb containing c-hep15374 cDNAStuI-NotI fragment was obtained. pAGal9-dPmaCI andNotCleaved with I and contains oriP sequencePmaCI-NotI fragment was obtained. about 2.7 kb containing c-hep15374 cDNAStuI-NotFrom the I fragment and pAGal9-dPmaCI-NotPlasmid pAGal9-GPCR-T4 was constructed by ligating the I fragments.
  Since pAGal9-GPCR-T4 contains a promoter having a response element to the transcription factor Gal4p, expression of GPCR-T4 is induced by the addition of 17β-estradiol in a transformant introduced into a host cell that expresses Gal4-ER. The
Reference Example 2 Construction of host cell line KJMGER8 expressing Gal4-ER
(1) Construction of Gal4-ER expression plasmid pGERbsrR2
  A vector pSV2bsr having a blastcidin resistance gene (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.)PvuII andEcoAfter cutting with RI, Klenow processing and 2.6 kbPvuII (blunt end)-EcoRI (blunt end) fragments were obtained. yeast(Saccharomyces cerevisiae) -Derived transcription factor Gal4p-derived DNA binding region and estrogen receptor ligand-binding region chimeric protein (hereinafter referred to as Gal4-ER) [Cell,54, 199 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 1657 (1993)] containing ERαAF2 in pM (distributed by Prof. Shigeaki Kato of the University of Tokyo)AatII andNdeAfter cutting with I, Klenow processing,AatII (blunt end)-NdeI (blunt end) fragment was obtained. derived from pSV2bsrPvuII (blunt end)-EcoFrom RI (blunt end) fragment and ERαAF2 in pMAatII (blunt end)-NdeA Gal4-ER expression plasmid pGERbsrR2 was constructed by ligating the I (blunt end) fragment.
(2) Construction of a cell line KJMGER8 in which the Gal4-ER expression plasmid pGERbsrR2 is incorporated into the chromosomal DNA of Namalwa KJM-1 cells
  Gal4-ER expression plasmid pGERbsrR2 was dissolved in TE buffer [10 mmol / L Tris-HCl (PH8.0), 1 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid] so as to be 1 μg / μl, and then electroporation method [Cytotechnology,3133 (1990)], the plasmid was transformed into Namalwa KJM-1 cells [Cytotechnology,1, 151 (1988)], 1.6 × 10⁶4 μg per cell was introduced to obtain transformed cells. Namalwa KJM-1 cells are a serum-free conditioned B cell line that expresses the EBNA-1 gene.
  The transformant was added to 8 mL of RPMI1640 · ITPSG medium [RPMI1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at a 1/40 amount of 7.5% NaHCO 3.₃3% 200 mmol / L L-glutamine solution (Invitrogen), 0.5% penicillin / streptomycin solution (Invitrogen, 5000 units / mL penicillin, 5000 μg / mL streptomycin), 10 mmol / L N-2-hydroxyethylpiperazine -N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), 3 μg / mL insulin, 5 μg / mL transferrin, 5 mmol / L sodium pyruvate, 125 nmol / L sodium selenite, medium supplemented with 1 md / ml galactose] , CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator.
  After culturing, blasticidin S (KK-400, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to a concentration of 2.0 μg / ml, and 500-2000 cells / well were dispensed into a 96-well plate, followed by culturing. A large number of stable transformants (single clones) in which was incorporated into chromosomal DNA were obtained. Each transformant was subcultured in RPMI1640 • ITPSG medium containing 2.0 μg / ml of blasticidin S.
  An excellent stable transformant KJMGER8 cell having a high induction ratio and a low background during non-induction was selected from the above stable transformants by the method described below.
  The firefly luciferase inducible expression plasmid pAGalSd1-luc constructed in Reference Example 1 (1) was introduced into each transformant by electroporation and cultured for 2 days. After the culture, 17β-estradiol (E8875: manufactured by Sigma) (final concentration: 10 nmol / L) was added, and after further incubation for 24 hours, the firefly luciferase activity was measured.
  The activity was measured using a luminometer LB953 (manufactured by Berthold) and a cell lysis buffer [1% Triton X-100, 100 mmol / L KH.₂PO₄(PH 7.8) 100 μl of 1 mmol / L dithiothreitol] was automatically injected into the culture solution, and then the substrate solution [25 mmol / L glycylglycine (pH 7.8), 15 mmol / L MgSO 4₄5 mmol / L ATP, 0.33 mmol / L luciferin] was automatically injected, and the amount of luminescence for 10 seconds was measured to obtain luciferase activity. For comparison, luciferase activity was also measured under conditions where 17β-estradiol was not added.
  By comparing the luciferase activity under the condition of addition of 17β-estradiol and the luciferase activity under the condition of no addition of 17β-estradiol, the induction ratio of gene expression was calculated, and the induction ratio was high, and under the condition of no addition of 17β-estradiol. KJMGER8 cells were selected as clones with low luciferase activity.
Reference Example 3 Construction of host cell line GBC7 expressing Gal4-ER and expressing firefly luciferase under CRE control
(1) Construction of reporter plasmid pACREplus using firefly luciferase as a reporter
  A reporter plasmid pACREplus having a hygromycin resistance gene and Epstein-Barr virus oriP and expressing firefly luciferase under the control of cAMP response element (CRE) was constructed by the following method.
  pAMo [J. Biol. Chem. ,268, 22782 (1993), also known as pAMoPRC3Sc (Japanese Patent Laid-Open No. 05-336963)]ClaPartially digested with I, a DNA fragment cut at one place was obtained. The DNA fragmentMluPartial digestion with I, 9.5 kbClaI-MluI fragment was obtained. pAGE248 [J. Biol. Chem. ,269, 14730 (1994)]ClaI andMlu1.5 kb containing the hygromycin resistance gene cut with IClaI-MluI fragment was obtained. derived from pAMoClaI-MluI fragment, and from pAGE248ClaI-MluThe I fragment was ligated to construct plasmid pAMoh.
  pAMohXhoI andHinContains hygromycin resistance gene after digestion with dIIIXhoI-HinA dIII fragment was obtained. pAGal9-lucSalI andHincleaved with dIII, containing oriP and Gal4UASSalI-HinA dIII fragment was obtained. derived from pAGal9-lucSalI-HindIII fragment, and from pAMoh aboveXhoI-HinPlasmid pAGal9h was constructed by ligating the dIII fragment.
  pBluescript II KS + (Stratagene)SalI andXhoAfter cleavage with I, alkaline phosphatase (E.coli  C75-derived, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), containing ampicillin resistance geneSalI-XhoI fragment was obtained. Double-stranded DNAs containing two CRE sequences were prepared by annealing synthetic DNAs having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 10 and 11. The double-stranded DNA and the above derived from pBluescript II KS +SalI-XhoThe I fragment was ligated to construct a plasmid pBS-CREI containing two CRE sequences. pBS-CREI has the double-stranded DNASalI cleavage site andXhoIt is a plasmid in which I cleavage sites are incorporated in the direction of regeneration, and each has one of the cleavage sites.
  pBS-CREIScaI andXhoCleaved with I and contains ori of phage f1ScaI-XhoI fragment was obtained. pBS-CREIScaI andSalCut with I, including ColE1 oriScaI-SalI fragment was obtained. From pBS-CREIScaI-XhoI fragment andScaI-SalThe I fragment was ligated to create pBS-CREII containing 4 CRE sequences.
  pBS-CREIIScaI andXhoCleaved with I and contains ori of phage f1ScaI-XhoI fragment was obtained. pBS-CREIIScaI andSalCut with I, including ColE1 oriScaI-SalI fragment was obtained. derived from pBS-CREIIScaI-XhoI fragment andScaI-SalThe I fragment was ligated to create pBS-CREIV containing 8 CRE sequences.
  pBS-CREIVScaI andXhoCleaved with I and contains ori of phage f1ScaI-XhoI fragment was obtained. pBS-CREIVScaI andSalCut with I, including ColE1 oriScaI-SalI fragment was obtained. derived from pBS-CREIVScaI-XhoI fragment andScaI-SalThe I fragment was ligated to construct pBS-CREVIII containing 16 CRE sequences.
  pBS-CREVIIIXhoAfter cutting with I, Klenow processing,HinContains 16 CREs by cutting with dIIIHindIII-XhoI (blunt end) fragment was obtained. PAGalSd1 prepared in Reference Example 1 (1)MluI andHincut with dIII, 1.4 kbMluI-HinA dIII fragment was obtained. pAGal9hXbaAfter cutting with I, Klenow processing,MluBy cutting with IXbaI (blunt end)-MluI fragment was obtained. derived from pBS-CREVIIIHindIII-XhoI (blunt end) fragment, derived from pAGalSd1MluI-HindIII fragment, and from pAGal9hXbaI (blunt end)-MluThe I fragment was ligated to construct plasmid pACREh.
  pAGal9-lucXhoI andNotCut with I and contains the firefly luciferase geneXhoI-NotI fragment was obtained. pACREhXhoI andNotCleaved with I and contains CRE sequenceXhoI-NotI fragment was obtained.
derived from pAGal9-lucXhoI-NotI fragment, and from pACREhXhoI-NotA reporter plasmid pACREluc containing the firefly luciferase gene was constructed by ligating the I fragment.
  pACRElucHinAfter cutting with dIII, Klenow treatment,XhoIncluding CRE by cutting with IHindIII (blunt end)-XhoIncludes I fragment and firefly luciferase geneHindIII (blunt end)-XhoEach I fragment was obtained. The above two types derived from pACRElucHindIII (blunt end)-XhoBy linking the I fragment upstream of the CRE sequence in pACREluc.HinPlasmid pACRElucH in which the dIII site disappeared was prepared.
  pGL3-Enhancer vector (Promega)HindIII andHpaCleaved with I and contains luc + gene (modified firefly luciferase gene)HindIII-HpaI fragment was obtained. pACRElucHNotAfter cutting with I, Klenow processing,HinIncluding CRE by cutting with dIIIHinA dIII-NotI (blunt end) fragment was obtained. derived from pGL3-Enhancer vectorHindIII-HpaI fragment, and from pACRElucHHindIII-NotA reporter plasmid pACREplus containing the luc + gene was prepared by ligating the I (blunt end) fragment.
(2) Construction of a stable transformant in which the reporter plasmid pACREplus is incorporated into the chromosomal DNA of KJMGER8
  It is a restriction enzyme that exists in one place in oriP in pACREplus.HpaI,SpeI orBalPACREplus cleaved with I was dissolved in TE buffer so as to be 1 μg / μl, and then electroporation [Cytotechnology,3, 133 (1990)] to the cell line KJMGER8 constructed in Reference Example 2 (2), 1.6 × 10⁶4 μg per cell was introduced to obtain transformed cells.
  The transformed cells are suspended in 8 ml of RPMI1640 • ITPSG medium,₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. After the culture, blasticidin S (2.0 μg / mL) and hygromycin B (300 μg / mL) were added, and further cultured for 7 days. After confirming the number of viable cells, blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL) and KJMGER8 were added at 1 × 10⁵In RPMI1640 / ITPSG medium containing cells / ml, dilute to 150 cells / mL, dispense into 96-well plates (average 30 cells / well), and culture, actually form 1 colony per well The wells were selected and 420 stable transformants (single clones) were obtained. Each transformant was passaged in RPMI 1640 • ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL) and hygromycin B (300 μg / mL).
(3) Selection of stable transformant (single clone) GBC7 having excellent properties
  Each clone obtained in (2) above is seeded in a 96-well plate (1-2 × 10⁴Cells / well), 5'-N-ethylcarboxamide adenosine (NECA, manufactured by Sigma-Aldrich), which is an agonist for type 2a adenosine receptor (A2a) (final concentration 100 nmol / L) was added, and CO was added.₂The cells were cultured for 6 hours in an incubator. A2a is a GPCR that is endogenously expressed in B cells such as KJMGER8, and adenylate cyclase is activated by agonist stimulation of A2a and the intracellular cAMP concentration increases. Transcription is induced.
  After the culture, firefly luciferase activity in each well was measured according to the method described in Reference Example 2 (2). However, instead of the luminometer LB953, Micro Lumat LB96P (manufactured by Bertrand) was used as a measuring instrument. 17 clones with high activity were selected.
  The 17 clones were 1 x 10 per well of 48 well plate⁵Dispense cells one by one and add NECA to a final concentration of 100 nmol / L.₂The cells were cultured for 5 hours in an incubator. After the culture, firefly luciferase activity was measured according to the method described in Reference Example 2 (2). Eight clones in which the luciferase activity increased by 60 times or more when NECA was stimulated were selected as compared with the case where NECA was not stimulated.
  To the 8 clones,_sAn inducible expression plasmid pAGal9-GPR12 (see Reference Example 5 below) of GPR12, which is a constitutively active GPCR conjugated with A, was obtained by the electroporation method using 1.6 × 10 6.⁶4 μg was introduced per cell to obtain a transformed strain.
  The transformed strain was suspended in 8 ml of RPMI1640 • ITPSG medium, and CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. After the culture, blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / ml) and geneticin (500 μg / mL) were added, and further cultured for 14 days to obtain a stable transformant. The transformed strain was subcultured in RPMI1640 · ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL) and geneticin (500 μg / mL).
  17β-estradiol (final concentration 10 nmol / L) was added to each transformed strain and cultured for 24 hours, and then luciferase activity was measured by the same method as in Reference Example 2 (2). For comparison, luciferase activity was also measured under conditions where 17β-estradiol was not added. Three clones (GBC5, GBC6, and GBC7) that had a high rate of increase in luciferase activity when 17β-estradiol was added were selected. The rates of increase in GBC5, GBC6, and GBC7 were 56, 193, and 364 times, respectively.
  The three clones were subjected to Gα in the same manner as in the above pAGal9-GPR12._sSerotype 2 vasopressin receptor (V2) inducible expression plasmid pAGal9-V2 (see Reference Example 6 below) is introduced to obtain a stable transformant, and V2 is induced and expressed by stimulation with 17β-estradiol, and then vasopressin The luciferase activity upon stimulation was examined. At the same time, luciferase activity when not stimulated with 17β-estradiol and luciferase activity when not stimulated with vasopressin were examined. As a result, GBC7, which showed high luciferase activity (599 times) in response to vasopressin only when stimulated with 17β-estradiol, was selected as a superior strain.
Reference Example 4 Construction of host cell line GBCR2 expressing Gal4-ER and expressing Renilla luciferase under CRE control
(1) Construction of a reporter plasmid pACLERluc using Renilla luciferase as a reporter
  pRL-SV40 vector (manufactured by Promega)XbaAfter cutting with I and Klenow processing,HinCleaved with dIII and contains the Renilla luciferase geneHindIII-XbaI (blunt end) fragment was obtained. PACRElucH prepared in Reference Example 3 (1)NotAfter cutting with I, Klenow processing,HinIncluding CRE by cutting with dIIIHindIII-NotI (blunt end) fragment was obtained. derived from pRL-SV40 vectorHindIII-XbaI (blunt end) fragment, and from pACRElucHHindIII-NotPlasmid pACLERluc was constructed by ligating the I (blunt end) fragment.
(2) Construction of a stable transformant in which the reporter plasmid pACLERluc is incorporated into the chromosomal DNA of KJMGER8
  In accordance with the method described in Reference Example 3 (2), pACLERluc was introduced into the cell line KJMGER8 to obtain 96 stable transformants (single clones). Each transformant was passaged in RPMI 1640 • ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL) and hygromycin B (300 μg / mL).
(3) Selection of stable transformant (single clone) GBCR2 having excellent properties
  Except for measuring the activity of Renilla luciferase instead of measuring the activity of firefly luciferase, it has excellent properties from the clones obtained in (2) above according to the method described in Reference Example 3 (3) Clone selection was performed.
  Each clone obtained in (2) above is seeded in a 96-well plate (1-2 × 10⁴Cells / well), NECA (final concentration 100 nmol / L) and CO₂The cells were cultured for 6 hours in an incubator. Thereafter, coelenterazine h (manufactured by Molecular Probes) (final concentration 250 nmol / L) was added to measure Renilla luciferase activity. For the activity measurement, a Wallac 1420 ARVOsx multi-label counter (manufactured by Wallac Bertoled Japan) was used. Nine clones with high activity were selected.
  Of these 9 clones, 2 clones in which Renilla luciferase activity was increased 18-fold or more were selected as compared with the case of NECA stimulation and no NECA stimulation. The two clones were named GBCR1 and GBCR2, respectively.
  PAGal9-GPR12 was introduced into the two clones to obtain stable transformants. The transformed strain was stimulated with 17β-estradiol for 24 hours, and then Renilla luciferase activity was measured. For comparison, Renilla luciferase activity was also measured under the condition where 17β-estradiol was not added. One clone GBCR2 having a high rate of increase in Renilla luciferase activity when 17β-estradiol was added was selected as a superior strain. The rate of increase was 364 times.
Reference Example 5 Gal4-ER and Chimera Gα_sOf a host cell line GBCC13 that expresses firefly luciferase under CRE control
(1) Gα_s4Of an expression plasmid pAMoh-Gs4
  Total RNA was obtained from Namalwa KJM-1 cells using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Single-stranded cDNA was synthesized by SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Invitrogen) using 5 μg of the total RNA as a template. The single-stranded cDNA was diluted 50-fold with water and used as a PCR template.
  To the above single-stranded cDNA (10 μl), Gα_s4Gene-specific primer (20 pmol each), 2.5 μmol / l dNTP mixed solution 4 μl, dimethyl sulfoxide 2.5 μl, 5 unit / μl Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) 0.25 μl, 10 × reaction buffer ( 5 μl of Takara Shuzo) was added, and sterilized water was added to make a total volume of 50 μl. Gα_s4As gene-specific primers, synthetic DNAs having the sequences represented by SEQ ID NOs: 12 and 13 were used. Each of these primersHindIII site orAsp718 sites have been introduced. Using thermal cycler DNA Engine (manufactured by MJ Research) for 5 minutes at 95 ° C, PCR was performed under the conditions of 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes. went. The DNA fragment amplified by PCR was recovered by agarose gel electrophoresis. The amplified fragmentHindIII andAspCut at 718,HindIII-Asp718 fragments were obtained. Plasmid pAMoh constructed in Reference Example 3 (1)HindIII andAspAfter cutting at 718,HindIII-Asp718 fragments were obtained. Derived from PCR fragmentHindIII-Asp718 fragment, and from pAMohHindIII-AspBy binding the 718 fragment, Gα_s4The expression plasmid pAMoh-Gs4 was constructed.
(2) Gα_sqConstruction of expression plasmid pAMoh-Gs-q
  PAMoh-Gs4 constructed in the above (1)XbaI andAspInclude oriP by cutting at 718XbaI-Asp718 fragments were obtained. In addition, pAMoh-Gs4XbaAfter cutting with I,SphGα lacking the C-terminus by partial digestion with I_s4CodeXbaI-SphI fragment was obtained. By synthesizing a synthetic DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 14 and 15 with T4 polynucleotide kinase and annealing, Gα_qA double-stranded DNA containing a region encoding the C-terminal 5 amino acids was obtained. This double-stranded DNA, derived from pAMoh-Gs4XbaI-Asp718 fragments andXbaI-SphBy binding the I fragment, Gα_sThe 5 amino acids at the C-terminal of Gα_qChimeric Gα substituted with 5 amino acids at the C-terminal of_s(Hereafter, Gα_sqThe expression plasmid pAMoh-Gs-q was constructed.
(3) Gα_siConstruction of expression plasmid pAMoh-Gs-i
  By synthesizing a synthetic DNA having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 17 with T4 polynucleotide kinase and annealing, Gα_iA double-stranded DNA containing a region encoding the C-terminal 5 amino acids was obtained. The double-stranded DNA and the pAMoh-Gs4 derived from (2) aboveXbaI-Asp718 fragments andXbaI-SphBy binding the I fragment, Gα_sThe 5 amino acids at the C-terminal of Gα_iChimeric Gα substituted with 5 amino acids at the C-terminal of_s(Hereafter, Gα_siThe expression plasmid pAMoh-Gs-i was constructed.
(4) Gα_sqAnd Gα_siOf plasmid pAMopGs-qMoGs-i for co-expression of
  PACREluc produced in Reference Example 3 (1)ClaAfter cutting with I, Klenow processing,CpoCleave with I to include the oriP and CRE-firefly luciferase gene partsCpoI-ClaI (blunt end) fragment was obtained. pAMoh-Gs-iBssHII andCpoCut with I and Gα_siCodeBssHII-CpoI fragment was obtained. pAGE248 [J. Biol. Chem.269, 14730 (1994)]XhoAfter cutting with I, Kleno processing,BssCleaved with HII and contains part of the Moloney murine leukemia virus LTR promoter (hereinafter abbreviated as Mo promoter) sequenceXhoI (blunt end)-BssThe HII fragment was obtained. derived from pACRElucCpoI-ClaI (blunt end) fragment, derived from pAMoh-Gs-iBssHII-CpoI fragment, derived from pAGE248XhoI (blunt end)-BssThe HII fragment was ligated to construct plasmid pACRElucMoGs-i.
  pAMoh-Gs-qBssHII andCpoCut with I and Gα_sqCodeBssHII-CpoI fragment was obtained. derived from pAMoh-Gs-iBssHII-CpoI fragment, as well as from pACREluc obtained aboveCpoI-ClaFrom the I (blunt end) fragment and pAGE248XhoI (blunt end)-BssThe HII fragment was ligated to construct plasmid pACRElucMoGs-q.
  pACRElucMoGs-i,NaeI andBssCleaved with HII and contains Mo promoterNaeI-BssHII fragmentCpoI andBssGα cut with HII_siCodeCpoI-BssEach HII fragment was obtained. pACRElucMoGs-q,NheI andCpoCleaved with I and contains CRE-firefly luciferase geneNheI-CpoI fragmentNheI andNaeCut with I and Gα_sqCodeNheI-NaeEach I fragment was obtained. derived from pACRElucMoGs-iNaeI-BssHII fragment andCpoI-BssHII fragment, as well as from pACRElucMoGs-qNheI-CpoI fragment andNheI-NaeFour fragments of the I fragment were ligated to construct plasmid pACRElucMoGs-qMoGs-i.
  pACRElucMoGs-qMoGs-i plasmidSalI andNotDigested with I, treated with Klenow,SalI (blunt end)-NotI (blunt end) fragment was obtained. The fragment was self-ligated to construct a plasmid pAMohGs-qMoGs-i in which the CRE reporter unit was removed from pACRElucMoGs-qMoGs-i.
  pAMohGs-qMoGs-iCpoAfter cutting with I, Klenow processing,AseNo hygromycin resistance gene by cutting with ICpoI (blunted) -AseI fragment was obtained. pPUR (Clontech)BamAfter cutting with HI, Klenow processing,AseContains puromycin resistance gene by cutting with IBamHI (blunt end)-AseI fragment was obtained. derived from pPURBamHI (blunt end)-AseI fragment, and from the above pAMohGs-qMoGs-iCpoPAMopGs-qMoGs-i was constructed by ligating the I (blunted) -AseI fragment and replacing the hygromycin resistance gene in pAMohGs-qMoGs-i with a puromycin resistance gene.
  In cells transfected with pAMopGs-qMoGs-i, Gα_iOr Gα_qAs for signal transmission of GPCR coupled to Gα,_sAs in the case of GPCR signal transduction via, activation of transcription of a gene under the control of CRE can be detected as an index.
(5) Construction of a stable transformant in which the plasmid pAMopGs-qMoGs-i is incorporated into the chromosomal DNA of GBC7
  pAMopGs-q is a restriction enzyme existing in one place in oriP in MoGs-iSpePAMoPGs-qMoGs-i cleaved with I was dissolved in TE buffer so as to be 1 μg / μl, and then electroporation method [Cytotechnology,3133 (1990)], the GBC7 produced in Reference Example 3 (3) was added to 1.6 × 10 6.⁶4 μg per cell was introduced to obtain transformed cells.
  The transformed strain is suspended in 8 ml of RPMI1640 • ITPSG medium, and CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. After culturing, blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), and puromycin (Sigma-Aldrich, 2.0 μg / mL) were added, followed by further culturing for 7 days.
  After culturing, the number of viable cells of the transformant was confirmed, and blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), puromycin (2.0 μg / mL), and KJMGER8 (1 × 10⁶In a RPMI1640 / ITPSG medium containing 150 cells / mL, the transformed strain is diluted to 150 cells / mL, dispensed into a 96-well plate at 30 cells / well, and cultured. A converted strain (single clone) was obtained. Each transformant was passaged in RPMI 1640 • ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), and puromycin (2.0 μg / mL).
(6) Selection of stable transformant (single clone) GBCC13 having excellent properties
  93 clones obtained in (5) above are 1 to 2 × 10⁴Cells / well are seeded in a 96-well plate, and using Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Gα_iOr Gα_qA type 1 angiotensin II receptor (AT1) expression plasmid pAGal9-AT1 (see Reference Example 9 below) conjugated to the clone was introduced into each clone to obtain a transformant. The specific method of gene transfer was performed according to the instructions for Lipofectamine 2000, and 0.3 μg of plasmid and 0.8 μl of Lipofectamine 2000 were used per well.
  After the transformant was cultured for 1 day, hygromycin B (300 μg / mL), blasticidin S (2.0 μg / mL), puromycin (2.0 μg / mL), and geneticin (0.5 mg / mL) ) Was added and cultured at 37 ° C. for 7 days. 17β-estradiol (final concentration 10 nmol / L) was added to each well and further cultured for 1 day. Angiotensin II (manufactured by Peptide Institute, Inc.) (final concentration 100 nmol / L) was added to each well, and after culturing for 6 hours, the firefly luciferase activity was measured using the method of Reference Example 2 (2). At the same time, the activity without stimulation with angiotensin II was examined. As a result, 10 clones that showed high firefly luciferase activity in response to angiotensin II were selected.
  PAGal9-AT1 was added to the 10 clones by the above electroporation method at 1.6 × 10 6.⁶4 μg was introduced per cell to obtain a transformed strain.
  The transformed strain was suspended in 8 ml of RPMI1640 • ITPSG medium, and CO₂The cells were cultured for 24 hours at 37 ° C. in an incubator. After the culture, blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), puromycin (2.0 μg / mL), and geneticin (500 μg / mL) were added, and further cultured for 14 days. A stable transformant was obtained.
  The transformant is RPMI1640 • ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), puromycin (2.0 μg / mL), and geneticin (500 μg / mL). Passed on.
  After adding 17β-estradiol (final concentration 10 nmol / L) to each transformed strain and culturing for 24 hours, angiotensin II (final concentration 100 nmol / L) was added, and further culturing for 6 hours, using the above method, firefly -Luciferase activity was measured. At the same time, the activity without stimulation with 17β-estradiol and the activity without stimulation with angiotensin II were measured. GBCC13, which showed high firefly luciferase activity (85 times) in response to angiotensin II only when stimulated with 17β-estradiol, was selected as a superior strain.
Reference Example 6 Gal4-ER and Chimera Gα_sOf a host cell line CBCRC6 that expresses Renilla and expresses Renilla luciferase under CRE control
(1) Construction of a stable transformant in which the plasmid pAMopGs-qMoGs-i is incorporated into the chromosomal DNA of the cell line GBCR2.
  According to the method described in Reference Example 5 (5), pAMopGs-qMoGs-i was introduced into the cell line GBCR2 constructed in Reference Example 4 (3), whereby 94 stable transformants (single clones) were obtained. I got it. Each transformant was passaged in RPMI 1640 • ITPSG medium containing blasticidin S (2.0 μg / mL), hygromycin B (300 μg / mL), and puromycin (2.0 μg / mL).
(2) Selection of stable transformant (single clone) GBCRC6 having excellent properties
  A clone having excellent properties was selected from the clones obtained in (1) above. The method described in Reference Example 5 (5) was followed except that the activity of Renilla luciferase was measured instead of the measurement of firefly luciferase activity. The activity of Renilla luciferase was measured according to the method described in Reference Example 4 (3).
  PAGal9-AT1 was introduced into each clone obtained in (1) above to obtain transformed cells. Each transformed cell was treated with 17β-estradiol and then stimulated with angiotensin II to measure Renilla luciferase activity. At the same time, the activity without stimulation with angiotensin II was measured. Thirteen clones that showed high Renilla luciferase activity in response to angiotensin II were selected.
  PAGal9-AT1 was introduced into the 13 clones by electroporation to obtain transformed cells. Each transformed cell was treated with 17β-estradiol and then stimulated with angiotensin II to measure Renilla luciferase activity. At the same time, the activity without stimulation with 17β-estradiol and the activity without stimulation with angiotensin II were measured. GBCRC6, which showed high Renilla luciferase activity (132 times) in response to angiotensin II only when stimulated with 17β-estradiol, was selected as a superior strain.
Reference Example 7 Construction of GPR12 inducible expression plasmid
  PCR using a single-stranded cDNA prepared from mRNA derived from human corpus callosum (1 μg, manufactured by Clontech) as a template, and using synthetic DNAs having the sequences represented by SEQ ID NOs: 18 and 19 as GPR12 gene-specific primers The GPR12 gene was obtained. As the enzyme, KOD DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.) was used. As a buffer for PCR, a 10-fold concentration buffer added to KOD DNA polymerase was used. PCR was performed using thermal cycler DNA Engine (manufactured by MJ Research) at 95 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of reactions consisting of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. .
  Each GPCR12 gene-specific primer containsHindIII site andNotI site has been introduced. Amplified fragmentHindIII andNotAfter cutting with I, a fragment containing the GPCR12 gene was recovered by agarose gel electrophoresis. The cleaved fragment was ligated to the corresponding restriction enzyme site of plasmid pAGal9-nd (HindIII-NotInducible expression plasmids were constructed by integrating between I).
  The sequence of the DNA fragment incorporated into the plasmid was determined as follows, and it was confirmed that GPCR12 was encoded. Using a primer specific to the sequence in pAGal9-nd (synthetic DNA having the sequences represented by SEQ ID NOs: 20 and 21), the sequences on the 5 'side and 3' side of the cDNA were determined. Synthetic DNA specific to the determined sequence was prepared and used as a primer, and further the base sequence was determined. By repeating this operation, the entire nucleotide sequence of the cDNA was determined. For determination of the base sequence, a DNA sequencer 377 manufactured by Perkin Elmer and a reaction kit (ABI Prism ™ BigDye ™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit: Applied Biosystems) were used.
Reference Example 8 Construction of type 2 vasopressin receptor (V2) expression plasmid pAGal9-V2
  PCR using a single-stranded cDNA prepared from human kidney-derived mRNA (1 μg, Clontech) as a template and synthetic DNAs having sequences represented by SEQ ID NOs: 16 and 17 as V2 gene-specific primers The V2 gene was obtained. Each V2 gene specific primer containsHindIII site andAsp718 sites have been introduced.
  Obtained V2 gene amplified fragmentHindIII andAspCut at 718,HindIII-Asp718 fragments were obtained. Plasmid pAGal9-d constructed in Reference Example 1 (2) wasHindIII andAspCut at 718,HindIII-Asp718 fragments were obtained. Derived from the above V2 gene amplified fragmentHindIII-Asp718 fragment, and from pAGal9-dHindIII-AspBy joining the 718 fragment, an inducible expression plasmid pAGal9-V2 of V2 was constructed.
Reference Example 9 Construction of Type 1 Angiotensin II Receptor (AT1) Expression Plasmid pAGal9-AT1
  Plasmid pAR1.8 [Nature,351, 230 (1991)]HindIII andNotCleaved with I and contains the bovine AT1 geneHindIII-NotI fragment was obtained. PAGal9-luc prepared in Reference Example 1 (1)HindIII andNotCleaved with I and does not contain firefly luciferase geneHindIII-NotI fragment was obtained. derived from pAR1.8HindIII-NotI fragment and from pAGal9-lucHindIII-NotThe I fragment was ligated to construct pAGal9-AT1.

  According to the present invention, a method for screening an agonist or antagonist for GPCR-T4, a method for screening a substance that increases or decreases the expression level of GPCR-T4 gene, and an expression level of an agonist or antagonist for GPCR-T4 or GPCR-T4 gene Thyroid function regulator, neutrophil activator or activator, prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases, prophylactic or therapeutic agent for asthma, chronic obstructive, containing substance or reducing substance as active ingredient A prophylactic or therapeutic agent for lung diseases and a prophylactic or therapeutic agent for infectious diseases are provided.

SEQ ID NO: 1-Inventor: Satoshi Saeki; Hiroki Kawai; Ayumu Natsume
Inventor: Nagahide Obata; Katsutoshi Sasaki SEQ ID NO: 4-GPCR-T4 gene for forward primer SEQ ID NO: 5-GPCR-T4 gene transcript for reverse primer SEQ ID NO: 6-Polyadenylation signal Synthetic DNA for construction of double-stranded DNA
SEQ ID NO: 7--Synthetic DNA for construction of double stranded DNA containing polyadenylation signal
SEQ ID NO: 8-Synthetic DNA for construction of double stranded DNA containing polyadenylation signal
SEQ ID NO: 9--Synthetic DNA for construction of double stranded DNA containing polyadenylation signal
SEQ ID NO: 10-2 Synthetic DNA for construction of double-stranded DNA containing two CRE sequences
SEQ ID NO: 11-2 Synthetic DNA for construction of double-stranded DNA containing two CRE sequences
SEQ ID NO: 12-Gα _S4 gene-specific primer SEQ ID NO: 13-Gα _S4 gene-specific primer SEQ ID NO: 14-Synthetic DNA for constructing double-stranded DNA containing a region encoding the C-terminal 5 amino acids of Gα _q SEQ ID NO: 15- Synthetic DNA SEQ ID NO: 16 for constructing double-stranded DNA containing a region encoding C-terminal 5 amino acids of Gα _q- Synthetic DNA SEQ ID NO: 16 for constructing double-stranded DNA containing a region encoding C-terminal 5 amino acids of Gα _i 17-G.alpha _i double-stranded DNA for constructing synthetic DNA SEQ ID NO: 18-GPR12 gene-specific primer SEQ ID NO: 19-GPR12 gene-specific primer SEQ ID NO: 20-pAGal9-nd, including a region encoding the C-terminal 5 amino acids Sequence-specific primer SEQ ID NO: 21-pAGal9-nd-specific primer SEQ ID NO: 22-V2 Gene-specific primer SEQ ID NO: 23-V2 gene-specific primers

[Sequence Listing]

Claims (24)

A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole and A polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of compounds represented by formula (I) or formula (II), a salt of the polypeptide, a cell expressing the polypeptide, or a membrane of the cell A fraction, (i) thyroxine, (ii) isoconazole, (iii) a compound represented by the following formula (I) or (II), or (iv) a derivative of a compound of (i) to (iii): And a ligand selected from the group consisting of a compound that binds to the polypeptide, and a pharmacologically acceptable salt of the compound of (v) (i) to (iv) And the test substance is contacted, the amount of binding of the ligand to the polypeptide is measured, and compared with the amount of binding of the ligand to the polypeptide when no test substance is contacted, A screening method for agonists or antagonists to the polypeptide.

(In formula II, n is an integer of 6 or 7) A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compounds represented by formula (I) or formula (II) of item 1, a salt of the polypeptide, a cell expressing the polypeptide, or the cell (I) Thyroxine, (ii) Isoconazole, (iii) A compound of formula (I) or (II) of claim 1, (iv) (i) to (iii) Selected from the group consisting of a compound that binds to the polypeptide and a pharmacologically acceptable salt of the compound of (v) (i) to (iv) Gand and test substance are contacted, the amount of binding of the ligand to the polypeptide is measured, and compared with the amount of binding of the ligand to the polypeptide when no test substance is contacted , Thyroid function control, neutrophil activation or deactivation, inflammatory disease prevention or treatment, asthma prevention or treatment, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment, or infectivity A screening method for substances having preventive or therapeutic effects on diseases. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compounds represented by formula (I) or formula (II) of item 1, a salt of the polypeptide, a cell expressing the polypeptide, or the cell (I) Thyroxine, (ii) Isoconazole, (iii) Compound represented by formula (I) or (II) of claim 1, (iv) (i) to (iii) A compound that binds to the polypeptide and a pharmacologically acceptable salt of the compound of (v) (i) to (iv) The polypeptide and a test substance are contacted, the degree of activation of the polypeptide is measured, and compared with the degree of activation of the polypeptide when the test substance is not contacted, A screening method for agonists or antagonists to peptides. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A cell expressing a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compound represented by formula (I) or formula (II) of item 1 or a membrane fraction of the cell; and (i) thyroxine, (Ii) isconazole, (iii) a compound represented by formula (I) or formula (II) of claim 1, and (iv) a derivative of a compound of (i) to (iii), which binds to the polypeptide Contacting a compound and a ligand selected from the group consisting of pharmacologically acceptable salts of the compounds of (v) (i) to (iv) and a test substance Thyroid function control action, neutrophil activation, characterized by measuring the degree of activation of the polypeptide and comparing with the degree of activation of the polypeptide when the test substance is not contacted A screening method for a substance having an action or activation inhibitory action, a preventive or therapeutic action for inflammatory diseases, a preventive or therapeutic action for asthma, a preventive or therapeutic action for chronic obstructive pulmonary disease, or a preventive or therapeutic action for infectious diseases. The screening method according to claim 3 or 4, wherein the degree of activation of the polypeptide is measured using the following (a) to (c) as indicators.
(A) Amount of guanosine 5′-O-3-thiotriphosphate (GTPγS) bound to the G protein (b) GTPase activity of the G protein (c) Degree of cellular response One or more amino acids in the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 containing the following (a) and (b) as constituents: A polypeptide having an added amino acid sequence and having an activity of reacting with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and the compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1 A screening kit for agonists or antagonists.
(A) a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and thyroxine; A polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of isoconazole and the compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1, a cell expressing the polypeptide, or a cell membrane of the cell Fraction (b) (i) Thyroxine, (ii) Isoconazole, (iii) Compound of formula (I) or (II) of claim 1, (iv) (i) to (iii) A compound that is a derivative and binds to the polypeptide, and is selected from the group consisting of (v) (i) to (iv) pharmacologically acceptable salts Gund A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A cell expressing a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compound represented by formula (I) or formula (II) according to item 1 or a membrane fraction of the cell and a test substance A method for screening an agonist or inverse agonist for the polypeptide, comprising measuring the constituent activity of the polypeptide, contacting the test substance, and comparing with the constituent activity of the polypeptide when the test substance is not contacted. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A cell expressing a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compound represented by formula (I) or formula (II) according to item 1 or a membrane fraction of the cell and a test substance Contacting, measuring the constitutive activity of the polypeptide, comparing with the constitutive activity of the polypeptide when the test substance is not contacted, control action of thyroid function, neutrophil activation action Or activation suppressive action, preventive or therapeutic action for inflammatory diseases, preventive or therapeutic action for asthma, preventive or therapeutic action for chronic obstructive pulmonary disease, Screening method of a substance having a prophylactic or therapeutic effect of infectious diseases. The screening method according to claim 7 or 8, wherein the constituent activity of the polypeptide is measured using at least one selected from the group consisting of the following (a) to (c) as an index.
(A) Amount of GTPγS bound to G protein (b) GTPase activity of G protein (c) Degree of cellular response A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and claim 1 A cell expressing a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compounds represented by the formula (I) or (II), (i) thyroxine, (ii) isoconazole, (iii) A compound of formula (I) or formula (II) of claim 1, a derivative of a compound of (iv) (i)-(iii), which binds to said polypeptide, and (v) (i ) To (iv) are contacted with a ligand selected from the group consisting of pharmacologically acceptable salts of the compounds, and the cellular response is measured. , Functional analysis of the polypeptide. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and claim 1 A thyroid function regulator comprising, as an active ingredient, an agonist or antagonist for a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compounds represented by the formula (I) or (II): Sphere activation promoter or activation inhibitor, inflammatory disease prevention or treatment agent, asthma prevention or treatment agent, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment agent, or infectious disease prevention or treatment agent. Thyroxine, thyroxine derivative or any pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases, prophylactic asthma Or therapeutic agents, preventive or therapeutic agents for chronic obstructive pulmonary disease, or preventive or therapeutic agents for infectious diseases. A control agent for thyroid function, a neutrophil activation promoter or an activation inhibitor, containing isoconazole, a derivative of isoconazole or a pharmacologically acceptable salt of any of them as an active ingredient, prevention of inflammatory disease or A therapeutic agent, a prophylactic or therapeutic agent for asthma, or a prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease. The agonist or antagonist according to claim 11, which is the compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1, a derivative of the compound or any pharmaceutically acceptable salt thereof. Thyroid function control agent, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, inflammatory disease prevention or treatment agent, asthma prevention or treatment agent, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment agent, or infectivity Preventive or therapeutic agent for diseases. The agonist or antagonist has a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole And an antibody that specifically binds to a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of compounds represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1 Agents for controlling thyroid function, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases, prophylactic or therapeutic agent for asthma, prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease, or A preventive or therapeutic agent for infectious diseases. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and claim 1 A DNA having a reporter gene linked downstream of a promoter region of a chromosomal gene encoding a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compounds represented by the formula (I) or formula (II) Coding the polypeptide, wherein the transformant containing the test substance is contacted, the expression level of the reporter gene is measured, and compared with the expression level of the reporter gene when the test substance is not contacted A screening method for a substance that increases or decreases the expression level of a gene. The screening method according to claim 16, wherein the promoter region is DNA having a base sequence consisting of 50 to 5000 bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and thyroxine, isoconazole and claim 1 A substance that increases or decreases the expression level of a gene encoding a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compounds represented by the formula (I) or formula (II) described above is contained as an active ingredient , Thyroid function control agent, neutrophil activation promoter or activation inhibitor, inflammatory disease prevention or treatment agent, asthma prevention or treatment agent, chronic obstructive pulmonary disease prevention or treatment agent, or infection Preventive or therapeutic agent for sexually transmitted diseases. An oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a continuous 5 to 60 bases selected from the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a substance that reduces the gene expression level, or a sequence The agent for controlling thyroid function according to claim 18, which is an oligonucleotide comprising a sequence of 19 to 25 bases consecutively selected from the base sequence represented by No. 2 and a sequence complementary thereto. An activation promoter or activation inhibitor, a prophylactic or therapeutic agent for inflammatory diseases, a prophylactic or therapeutic agent for asthma, a prophylactic or therapeutic agent for chronic obstructive pulmonary disease, or a prophylactic or therapeutic agent for infectious diseases. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the tissue or cell of a subject, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide, and Measuring the transcription amount of a gene encoding a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isconazole and the compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1; Abnormal thyroid function, neutrophil activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or protection against infection, characterized by comparison with the amount of transcription of the gene in tissues or cells of healthy individuals How to judge abnormalities in performance. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the tissue or cell of the subject, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide; And measuring the amount of a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and the compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1, Or abnormal thyroid function, neutrophil activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or abnormal protective ability, characterized by comparison with the amount of the polypeptide in the cell Judgment method. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the tissue or cell of the subject A mutation of a gene encoding a polypeptide having an activity to react with a ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and the compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1 A method for determining abnormal thyroid function, abnormal neutrophil activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, or abnormal protective ability of infection, characterized by detecting. A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 One in an oligonucleotide having a base sequence consisting of 5 to 60 bases of a continuous base sequence complementary to the sequence, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A ligand selected from the group consisting of thyroxine, isoconazole and a compound represented by formula (I) or formula (II) according to claim 1 having an amino acid sequence in which the above amino acids are deleted, substituted or added Abnormal thyroid function, neutrophil, which contains an antibody that specifically binds to a polypeptide having activity to react with Abnormal activation, inflammatory disease, chronic obstructive pulmonary disease, asthma or abnormal infection defenses determination method. A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and thyroxine, isoconazole, and claim A knockout non-human animal of a gene encoding a polypeptide having activity to react with a ligand selected from the group consisting of the compound represented by formula (I) or formula (II) according to item 1 is prepared, Control of thyroid function, neutrophil activation or activation suppression, inflammatory disease characterized by administering test substance, observing its symptoms, and comparing with symptoms when not administered Preventive or therapeutic action of asthma, preventive or therapeutic action of asthma, preventive or therapeutic action of chronic obstructive pulmonary disease, or preventive or therapeutic action of infectious disease Screening method for a substance having an iodine.

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