JPWO2004060919A1 - Agonist antibodies against heteroreceptors - Google Patents

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Abstract

動物に受容体のＡ鎖、Ｂ鎖それぞれを免疫した後、この動物の脾細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＣＤＲを含む可変領域に対応するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖の可変領域を回収した。ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲにて一本鎖Ｆｖを合成し、ファージライブラリーを構築した。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮・クローン化し、その一本鎖可変領域を動物細胞用のシグナル配列とＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３の間に挿入し、ｓｃＦｖ−ＣＨ１−Ｆｃ発現ベクターを作製した。様々な組み合わせで細胞に導入、抗体を発現させ、リガンド同様の活性を示す抗体クローンを選択した。After immunizing the animal with each of the A chain and B chain of the receptor, mRNA was extracted from the spleen cells of the animal, and RT-PCR was performed to determine the L chain and H chain using primers corresponding to the variable regions containing CDRs. The variable region was recovered. Single-chain Fv was synthesized by assembly PCR and a phage library was constructed. The antigen-binding antibody clone was concentrated and cloned by panning, and the single chain variable region was inserted between the signal sequence for animal cells and CH1-hinge-CH2-CH3 to prepare an scFv-CH1-Fc expression vector. Antibody clones were introduced into cells in various combinations to express antibodies, and antibody clones showing activity similar to ligands were selected.

Description

本発明は、ヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体、および該抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。  The present invention relates to an agonist antibody against a heteroreceptor and a pharmaceutical composition containing the antibody as an active ingredient.

抗体は血中での安定性が高く、抗原性もないことから医薬品として注目されている。その中でも二種類の抗原を同時に認識できる二種特異性抗体が提唱されて久しいが、現状では二種類の抗原を単に繋ぐのみである。しかし抗体は抗原中の特定のエピトープに結合するため、適当な抗体の組み合わせを選べば二種特異性抗体によって２つの抗原を望む距離・角度に配位することが出来ると考えられる。
多くのサイトカイン受容体はリガンドが結合することによって二量体を形成する鎖間の距離・角度が変化して細胞内にシグナルを伝え得るようになると考えられている。つまり適切な抗受容体抗体はリガンドによる受容体の二量体化を模倣でき、アゴニスト抗体となりうる。既にホモ二量体から成るＭＰＬ（米国特許出願公開第９８／１７３６４号明細書、および文献（「Ｂｌｏｏｄ」、１９９８年、Ｖｏｌ．９２、Ｎｏ．６、ｐ．１９８１−１９８８）参照）、ＥＰＯ受容体、ＧＨ受容体に対してアゴニスト作用を示すモノクローナル抗体が報告されている。
しかしながら、ヘテロ二量体を形成する受容体の場合は、二種の受容体鎖の複合体を形成させる必要があるため一般的な抗体ではアゴニスト作用を期待できない。この目的には二種類の抗原を二本の腕でそれぞれ認識出来る上記の二種特異性抗体が適すると考えられるが、報告例は未だなかった。Antibodies are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and lack of antigenicity. Among them, a bispecific antibody that can simultaneously recognize two types of antigens has been proposed, but at present, the two types of antigens are merely linked. However, since an antibody binds to a specific epitope in an antigen, it is considered that two antigens can be coordinated at a desired distance and angle by a bispecific antibody if an appropriate combination of antibodies is selected.
Many cytokine receptors are thought to be able to transmit signals into cells by changing the distance and angle between chains forming a dimer by binding to a ligand. That is, a suitable anti-receptor antibody can mimic receptor dimerization by a ligand and can be an agonist antibody. MPL already composed of homodimers (see US Patent Application Publication No. 98/17364 and literature (“Blood”, 1998, Vol. 92, No. 6, p. 1981-1988)), EPO reception Monoclonal antibodies exhibiting agonistic effects on human and GH receptors have been reported.
However, in the case of a receptor that forms a heterodimer, it is necessary to form a complex of two types of receptor chains, and therefore an agonistic action cannot be expected with a general antibody. For this purpose, the above-mentioned bispecific antibody capable of recognizing two kinds of antigens with two arms is considered suitable, but no report has been made yet.

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヘテロ鎖を含む受容体に対してアゴニスト作用を有する抗体を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った。アゴニスト抗体のスクリーニングでは、受容体を構成する二種の鎖（Ａ，Ｂ）それぞれに対する抗体（α、β）を多数選択し、α、βの組み合わせについてひとつひとつ検定を行う必要がある。また二種特異性抗体の産生には、抗体産生ハイブリドーマ同士の融合、もしくは抗体の発現ベクターを細胞へ導入しなければならない。本発明者らは、例えば、以下のような方法によって、ヘテロ鎖からなる受容体に対してアゴニスト作用を有する二種特異性抗体を作製することに成功した。より具体的には、以下のようにして行った。
動物に受容体のＡ鎖、Ｂ鎖それぞれを免疫した。この動物の脾細胞からｍＲＮＡを抽出し、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含む可変領域に対応するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖の可変領域を回収した。ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲにて一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を合成し、ファージライブラリーを構築した。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮・クローン化し、その一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を動物細胞用のシグナル配列とＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３の間に挿入し、ｓｃＦｖ−ＣＨ１−Ｆｃ発現ベクターを作製した。様々な組み合わせで細胞に導入、抗体を発現させた。この培養上清を目的のリガンドに反応する細胞に添加し、リガンド同様の活性を示す抗体クローンを選択した。
上記方法により、ＡＲ１，ＡＲ２の二種の鎖から成るＩ型インターフェロン受容体に対するアゴニスト抗体の分離に成功した。即ち本発明者らは、ヘテロ鎖からなる受容体に対してアゴニスト作用を有する二種特異性抗体を初めて分離することに成功し、本発明を完成させた。
本発明は、ヘテロ鎖を含む受容体に対してアゴニスト作用を有する抗体に関し、より具体的には、
〔１〕ヘテロ鎖を含む受容体に対してアゴニスト活性を有する抗体、
〔２〕受容体がサイトカイン受容体である〔１〕に記載の抗体、
〔３〕サイトカイン受容体がインターフェロン受容体である〔２〕に記載の抗体、
〔４〕インターフェロン受容体がＩ型インターフェロン受容体である〔３〕に記載の抗体、
〔５〕Ｉ型インターフェロン受容体がＡＲ１鎖及びＡＲ２鎖を含んでいることを特徴とする〔４〕に記載の抗体、
〔６〕受容体が多量体である〔１〕に記載の抗体、
〔７〕多量体が二量体である〔６〕に記載の抗体、
〔８〕二種特異性抗体である〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の抗体、
〔９〕抗ＡＲ１鎖抗体の可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体の可変領域とを含む、〔５〕に記載の抗体、
〔１０〕抗ＡＲ１鎖抗体における下記（ａ）のアミノ酸配列からなる可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ１０）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる可変領域とを含む、〔９〕に記載の抗体、
（ａ） Ｈ鎖可変領域が配列番号：１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２に記載のアミノ酸配列
（ｂ１）Ｈ鎖可変領域が配列番号：７に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：８に記載のアミノ酸配列
（ｂ２）Ｈ鎖可変領域が配列番号：９に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列
（ｂ３）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１９に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２０に記載のアミノ酸配列
（ｂ４）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１３に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１４に記載のアミノ酸配列
（ｂ５）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２３に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２４に記載のアミノ酸配列
（ｂ６）Ｈ鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：６に記載のアミノ酸配列
（ｂ７）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１７に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１８に記載のアミノ酸配列
（ｂ８）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１５に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１６に記載のアミノ酸配列
（ｂ９）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２２に記載のアミノ酸配列
（ｂ１０）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１２に記載のアミノ酸配列
〔１１〕抗ＡＲ１鎖抗体における下記（ａ）のアミノ酸配列からなる可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる可変領域とを含む、〔９〕に記載の抗体、
（ａ） Ｈ鎖可変領域が配列番号：３に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：４に記載のアミノ酸配列
（ｂ１）Ｈ鎖可変領域が配列番号：９に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列
（ｂ２）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２５に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２６に記載のアミノ酸配列
（ｂ３）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２２に記載のアミノ酸配列
〔１２〕〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物、を提供するものである。
本発明は、ヘテロ鎖を含む受容体に対してアゴニスト活性を有する抗体を提供する。
本発明においてヘテロ鎖を含む受容体とは、受容体（多量体）が異なる２つ以上のタンパク質（受容体鎖）で構成されていることをいう。多量体は二量体、三量体、四量体など、そのタンパク質（受容体鎖）数により限定はされないが、好ましくは二量体である。例えば、受容体が二量体の場合には、ヘテロ受容体は２つの構成タンパク質（受容体鎖）が同一でないことを表す。
アゴニスト活性を有する抗体とは、ある受容体に対して、アゴニスト作用を有する抗体を指す。一般的に、アゴニストであるリガンド（因子）が受容体と結合すると、受容体タンパク質の立体構造が変化し、受容体が活性化（受容体が膜タンパク質である場合には、通常、細胞増殖などのシグナルを発する）される。二量体を形成するタイプの受容体である場合には、アゴニスト抗体は適切な距離、角度で受容体を二量体化させることにより、リガンドと同様の働きをすることができる。つまり、適当な抗受容体抗体はリガンドにより受容体の二量体化を模倣でき、アゴニスト抗体となり得る。
アゴニスト作用によって変化が誘導される生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、蛋白質分解活性リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
本発明の好ましい態様においては、本発明の受容体としてサイトカイン受容体を挙げることができる。サイトカインは、通常、各種の血球細胞の増殖と分化を制御する生理活性タンパク質の総称として用いられるが、非免疫系細胞を含む細胞の増殖因子及び増殖抑制因子を指すこともある。従って、サイトカインは細胞から放出され、免疫、炎症反応の制御作用、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化の調節作用など細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子の総称である。
サイトカインの具体的な例としては、インターロイキン１〜１５、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、など）、ケモカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン、エリスロポエチン、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子などを挙げることができるが、好ましくはインターフェロンであり、特に好ましくはＩ型インターフェロンである。
サイトカイン受容体の具体的な例として、インターフェロン受容体ファミリー（ＩＦＮ−α受容体、ＩＦＮ−β受容体、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−１０受容体、など）、インターロイキン受容体ファミリー（ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−６受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、など）、セリン−トレオニンキナーゼ型受容体ファミリー（ＢＭＰ受容体、ＴＧＦ−β受容体、アクチビン受容体、など）、チロシンキナーゼ型受容体（ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ｃ−ｋｉｔ受容体、ｃ−ｆｍｓ受容体、など）、免疫グロブリン受容体ファミリー（ＩＬ−１受容体、など）、細胞死受容体ファミリー（ＴＮＦ受容体、Ｆａｓ受容体、ＮＧＦ受容体、など）、７回膜貫通型受容体ファミリー（ＩＬ−８受容体、ケモカイン受容体、など）などを挙げることができるが、好ましくはインターフェロン受容体ファミリーであり、さらに好ましくはＩ型インターフェロン受容体である。
インターフェロンにはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−τなどが含まれる。ＩＦＮ−αとＩＦＮ−βは相同性が高い為、これら２つのＩＦＮは同一のレセプターを介して反応することができる。又、インターフェロンαとインターフェロンβはＩ型インターフェロンに分類される。
Ｉ型インターフェロン受容体の好ましい例として、ＡＲ１鎖（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ：Ｊ０３１７１、文献：Ｕｚｅ Ｇ，Ｌｕｔｆａｌｌａ Ｇ，Ｇｒｅｓｓｅｒ Ｉ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ［［ａｌｐｈａ］］ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｏ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｃＤＮＡ．Ｃｅｌｌ（１９９０）６０，２２５−２３４．）およびＡＲ２鎖（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ：Ｕ２９５８４、文献：Ｄｏｍａｎｓｋｉ Ｐ，Ｗｉｔｔｅ Ｍ，Ｋｅｌｌｕｍ Ｍ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｈａｃｋｅｔｔ Ｒ，Ｐｉｔｈａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｎｇ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ［［ｂｅｔａ］］ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ［［ａｌｐｈａ］］／［［ｂｅｔａ］］ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９５）２７０，２１６０６−２１６１１．；ＬｕｔｆａＵａ Ｇ，Ｈｏｌｌａｎｄ ＳＪ，Ｃｉｎａｔｏ Ｅ，Ｍｏｎｎｅｒｏｎ−Ｄ．，Ｒｅｂｏｕｌ Ｊ，Ｒｏｇｅｒｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｎｔ Ｕ５Ａ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ．ＥＭＢＯ Ｊ（１９９５）１４，５１００−５１０８．）を有する受容体を挙げることができる。
多種特異性抗体とは、異なる多種の抗原と特異的に結合し得る抗体を言う。つまり、多種特異性抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である（例えば、抗原がヘテロ受容体の場合には、多種特異性抗体はヘテロ受容体を構成する異なるドメインを認識する）。通常、このような分子は２個の抗原と結合するものであるが（二種特異性抗体：ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）、それ以上の（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有していてもよい。
本発明のヘテロ受容体に対する抗体は、特に制限されないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体であることが好ましい。（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
さらに、本発明の抗体は、その抗体断片や抗体修飾物、低分子化抗体などであってよい。たとえば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ等が挙げられる。ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は１つの重鎖および軽鎖の可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変領域の３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常領域および重鎖の定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ′断片は、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点でＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ′−ＳＨとは、定常領域の１またはそれ以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ′を示すものである。Ｆ（ａｂ′）断片は、Ｆ（ａｂ′）２ペプシン消化物のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。
低分子化抗体としては一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、線状抗体、一本鎖抗体分子などが含まれる。
ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ；Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の抗体断片を指す（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号等）。ダイアボディは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）が、互いに結合できない位に短い、例えば、５残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため単鎖Ｖ領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは２つの抗原結合部位を有することとなる。このとき２つの異なる抗原（ａ、ｂ）に対するＶＬとＶＨをＶＬａ−ＶＨｂとＶＬｂ−ＶＨａの組合わせで５残基程度のリンカーで結んだものを同時に発現させると二種特異性Ｄｂとして分泌される。
ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ抗体断片には、抗体のＶＨおよびＶＬ領域が含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはさらにＶＨおよびＶＬ領域の間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりｓｃＦｖは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ｐｐ．２６９−３１５，１９９４）を参照）。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。
これら、抗体断片や低分子化抗体は、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させることによって、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体や、細胞障害性物質、エンドトキシン、放射性物質などと結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
本発明の抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。またキメラ抗体やヒト型化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。
遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体の重鎖、および軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト型化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
本発明のアゴニスト抗体を得る方法は特に制限されず、どのような方法で取得されてもよい。例えば、二種の鎖（Ａ鎖，Ｂ鎖）からなるヘテロ受容体に対するアゴニスト抗体を得る場合、受容体を構成する二種の鎖（Ａ，Ｂ）それぞれで免疫動物を免疫し、複数の抗Ａ鎖抗体及び複数の抗Ｂ鎖抗体を取得する。その後、抗Ａ鎖抗体のＨ鎖とＬ鎖及び抗Ｂ鎖抗体のＨ鎖とＬ鎖を含む二種特異性抗体を作製する。ここで、抗Ａ鎖抗体と抗Ｂ鎖抗体はそれぞれ複数種得られているので、なるべく多くの組み合わせの二種特異性抗体を作製することが好ましい。二種特異性抗体を作製後、アゴニスト活性を有する抗体を選択する。
本発明の一つの態様においては、本発明の抗体は二種特異性抗体である。二種特性抗体の作製は、抗体産生ハイブリドーマ同士の融合、もしくは抗体の発現ベクターの細胞導入などの公知の方法により行うことができる。例えば、動物に受容体のＡ鎖、Ｂ鎖それぞれを免疫する。この動物の脾細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＣＤＲを含む可変領域に対応するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖の可変領域を回収する。ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲにて一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を合成し、ファージライブラリーを構築する。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮・クローン化し、その一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）を動物細胞用のシグナル配列とＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３の間に挿入し、ｓｃＦｖ−ＣＨ１−Ｆｃ発現ベクターを作製する。抗Ａ鎖抗体をコードするベクターと抗Ｂ鎖抗体をコードするベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二種特異性抗体を得ることができる。
アゴニスト活性を有する抗体の選択は、例えば、以下のような方法により行うことができる。
（１）因子依存的に増殖する細胞の培養時に抗体を添加することによって、因子同様に細胞が増殖するか否かを指標とする。細胞が増殖する場合に、被験多種特異性抗体は、アゴニスト作用を有するものと判定する。
（２）因子の本来の活性（増殖とは限らない）を示す細胞株の培養時に加えることによって、因子同様の反応を示すか否かを指標とする。因子同様の反応を示す場合に、抗体は、アゴニスト作用を有するものと判定する。
上記細胞は、通常、本発明の抗体がアゴニストとして作用し得る受容体を、細胞表面において発現しており、該受容体のリガンド（例えば、アゴニスト抗体）と結合することにより、シグナルを発する。従って上記方法において使用する細胞は、受容体のリガンド（因子）依存的に増殖できる細胞（因子依存性増殖細胞）であることが好ましい。また、上記受容体は、通常、リガンドと結合することにより、細胞増殖シグナルを発するものであることが好ましい。しかし、上記受容体が細胞増殖シグナルを出さないタイプのものである場合、該受容体を、細胞増殖シグナルを発するタイプの受容体と融合させ、所謂キメラ受容体とすることにより、上記方法に使用することができる。該キメラ受容体は、リガンドと結合することにより、細胞増殖シグナルを発する。受容体と融合させることによりキメラ受容体を構築するのに適した受容体は、細胞増殖シグナルを発するタイプの受容体であれば特に制限されないが、通常、膜タンパク質であり、より好ましくは細胞外がリガンド受容体鎖であり細胞内が受容体鎖であるような受容体である。具体的には、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ｍｐｌ、ｎｅｕ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ｃ−Ｋｉｔ、ＦＬＴ−３等を挙げることができる。本発明における上記因子依存性増殖細胞の好適な例として、具体的には、細胞外がリガンド受容体鎖であり細胞内がＧ−ＣＳＦ受容体鎖であるキメラ受容体を発現させた因子依存性増殖細胞ＢａＦ３を示すことができる。その他、上記方法において使用できる細胞として、例えば、ＮＦＳ６０、ＦＤＣＰ−１、ＦＤＣＰ−２、ＣＴＬＬ−２、ＤＡ−１、ＫＴ−３等を挙げることができる。
その他、アゴニスト活性を有する抗体の選択方法としては、種々の量的及び／又は質的な変化を指標とした方法が挙げられる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。
無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的及び／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、ＤＮＡ、ＲＮＡの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。
細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋やｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。
組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。
例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
受容体に対する抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、免疫動物に対して抗原を免疫化することにより調製することができる。動物を免疫化する抗原としては、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を有さない不完全抗原（ハプテンを含む）が挙げられる。本発明においては、本発明のアゴニスト抗体がリガンドとして作用すると考えられる受容体を、上記抗原（免疫原）として使用する。本発明における上記受容体は特に制限されないが、好ましくはヘテロ二量体である。免疫化する動物として、例えば、マウス、ハムスター、またはアカゲザル等を用いることができる。これら動物に対して、抗原を免疫化することは、当業者においては、周知の方法によって行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取する。
本発明において好ましくは、免疫化された動物または該動物の細胞から抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域の回収を行う。この操作は、当業者においては一般的に公知の技術を用いて行うことができる。抗原によって免疫化された動物は、とりわけ脾臓細胞において該抗原に対する抗体を発現する。従って、例えば、免疫化された動物の脾臓細胞からｍＲＮＡを調製し、該動物のＣＤＲに対応するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＬ鎖およびＨ鎖の可変領域の回収を行うことができる。ここで、ＣＤＲとは、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を指す。ＣＤＲに対応するプライマーとしては、例えば、ＣＤＲよりも多様性の低いフレームワークに対応するプライマー、あるいはシグナル配列とＣＨ１、ＣＬ部分に対応するプライマーを用いることができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫化することもできる。その後、免疫化された動物の脾臓またはリンパ球中に含まれる抗体をコードするＤＮＡを、慣用の方法、例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるヌクレオチドプローブ等を用いる方法により単離する。
免疫原とする受容体は、該受容体を構成するタンパク質全体、もしくは該タンパク質の部分ペプチドであってもよい。また、動物を免疫するのに用いる免疫原としては、場合により抗原となるものを他の分子に結合させ可溶性抗原とすることも可能であり、また、場合によりそれらの断片を用いてもよい。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外領域）を用いるのが好ましい。また、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原とすることもできる。このような細胞は天然（腫瘍セルライン等）由来、または、組換え技術により膜貫通分子を発現するように構成された細胞であってもよい。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
本発明の抗体は、例えば、ＡＲ１鎖およびＡＲ２鎖を含むＩ型インターフェロン受容体に対してアゴニスト活性を有する抗体である場合には、好ましくは、抗ＡＲ１鎖抗体における可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体における可変領域とを含む構造を有する。該抗体としては、特に制限されるものではないが、例えば、抗ＡＲ１鎖抗体の下記のいずれかの可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体の下記のいずれかの可変領域とを含む抗体を挙げることができる。
・抗ＡＲ１鎖抗体の可変領域：ＡＲ１−４１、ＡＲ１−２４
・抗ＡＲ２鎖抗体の可変領域：ＡＲ２−３７、ＡＲ２−１１、ＡＲ２−１３、ＡＲ２−４５、ＡＲ２−２２、ＡＲ２−４３、ＡＲ２−４０、ＡＲ２−１４、ＡＲ２−４４、ＡＲ２−３３、ＡＲ２−３１
上記のそれぞれの可変領域のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を、配列番号：１〜２６に示す（各可変領域のＶＨおよびＶＬと、配列番号との関係を表１に示す）。

Figure 2004060919
抗ＡＲ１鎖抗体がＡＲ１−２４の場合、パートナーとなる抗ＡＲ２鎖抗体は、ＡＲ２−１３、ＡＲ２−３１、あるいはＡＲ２−４４であることが好ましく、抗ＡＲ１鎖抗体がＡＲ１−４１の場合、パートナーとなる抗ＡＲ２鎖抗体は、ＡＲ２−１１、ＡＲ２−１３、ＡＲ２−１４、ＡＲ２−２２、ＡＲ２−３３、ＡＲ２−３７、ＡＲ２−４０、ＡＲ２−４３、ＡＲ２−４４、あるいはＡＲ２−４５であることが好ましい。ＡＲ２−１３およびＡＲ２−４４は、ＡＲ１−４１およびＡＲ１−２４の両方の抗体に対してパートナーとなることが可能である。上記のような対を形成する抗体もまた、本発明に含まれる。
また、本発明において、上記可変領域を含む抗体は、必ずしも可変領域の全長配列を有している必要はなく、ＣＤＲ配列が保存されていれば、ＦＲ配列は抗体をヒト化等する際に適宜変更してよい。
従って、本発明は、上記可変領域においてＣＤＲに対応するアミノ酸配列を有する抗体を含む。
上記可変領域の配列番号において、ＣＤＲに対応するアミノ酸番号を表２に示す。
Figure 2004060919
また、本発明で開示されている可変領域を用いて全長抗体を作製する場合、定常領域は特に限定されず、当業者に公知の定常領域を用いることが可能であり、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（１９９１），Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈや、Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ，（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６，６７７−６８１、等に記載されている定常領域を用いることができる。
本発明の抗体はアゴニスト作用を有することから、該抗体が作用する受容体の活性（機能）低下に起因する疾病に対して、有効な薬剤となることが期待される。即ち本発明は、本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。例えば、本発明の抗体がサイトカイン受容体に対してアゴニスト活性を有する抗体である場合には、該抗体はサイトカイン様作用を有するものと考えられる。従って該抗体は抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、細胞増殖・分化調節作用を有する医薬品（医薬組成物）となることが期待される。
治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｏｓｌｏ Ｅｄ．（１９８０）等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３）；ＥＰ第１３３，９８８号）。
本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状、進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、一般に大人では、１日当たり、０．１〜２０００ｍｇを１〜数回に分けて経口投与することができる。より好ましくは１〜１０００ｍｇ／日、更により好ましくは５０〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは１００〜３００ｍｇ／日である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。
また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成するか（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（ＷＯ９３／１７７０６等）して投与することができる。しかしながら、生体内において抗体が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。ｅｘ ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、該細胞を動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。This invention is made | formed in view of such a condition, The objective is to provide the antibody which has an agonist effect with respect to the receptor containing a hetero chain.
The present inventors have intensively studied to solve the above problems. In screening for agonist antibodies, it is necessary to select a large number of antibodies (α, β) for each of the two types of chains (A, B) constituting the receptor, and test each one of the combinations of α, β. In order to produce bispecific antibodies, fusion between antibody-producing hybridomas or an antibody expression vector must be introduced into the cells. The present inventors have succeeded in producing a bispecific antibody having an agonistic action on a receptor consisting of a heterochain, for example, by the following method. More specifically, it was performed as follows.
Animals were immunized with the A and B chains of the receptor, respectively. MRNA is extracted from the spleen cells of this animal, and L- and H-chain variable regions are recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable regions including the complementarity determining region (CDR) of the antibody. did. Single-chain Fv (scFv) was synthesized by assembly PCR to construct a phage library. The antigen-binding antibody clone was concentrated and cloned by panning, and the single-chain variable region (scFv) was inserted between the signal sequence for animal cells and CH1-hinge-CH2-CH3, and the scFv-CH1-Fc expression vector was Produced. Various combinations were introduced into cells to express antibodies. This culture supernatant was added to cells that react with the target ligand, and antibody clones showing the same activity as the ligand were selected.
By the above method, an agonist antibody against type I interferon receptor consisting of two types of chains AR1 and AR2 was successfully separated. That is, the present inventors have succeeded in isolating a bispecific antibody having an agonistic action against a receptor consisting of a hetero chain for the first time, and completed the present invention.
The present invention relates to an antibody having an agonistic effect on a receptor containing a hetero chain, more specifically,
[1] an antibody having agonist activity against a receptor containing a heterochain,
[2] The antibody according to [1], wherein the receptor is a cytokine receptor,
[3] The antibody according to [2], wherein the cytokine receptor is an interferon receptor,
[4] The antibody according to [3], wherein the interferon receptor is a type I interferon receptor,
[5] The antibody according to [4], wherein the type I interferon receptor comprises an AR1 chain and an AR2 chain,
[6] The antibody according to [1], wherein the receptor is a multimer,
[7] The antibody according to [6], wherein the multimer is a dimer,
[8] The antibody according to any one of [1] to [7], which is a bispecific antibody,
[9] The antibody according to [5], comprising a variable region of an anti-AR1 chain antibody and a variable region of an anti-AR2 chain antibody,
[10] A variable region consisting of the following amino acid sequence (a) in an anti-AR1 chain antibody and a variable region consisting of the amino acid sequence described in any of (b1) to (b10) below in an anti-AR2 chain antibody: [9] the antibody according to
(A) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
(B1) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
(B2) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
(B3) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
(B4) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
(B5) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23, and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24
(B6) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
(B7) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
(B8) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16.
(B9) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.
(B10) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
[11] A variable region consisting of the following amino acid sequence (a) in an anti-AR1 chain antibody and a variable region consisting of the amino acid sequence described in any of (b1) to (b3) below in an anti-AR2 chain antibody: [9] the antibody according to
(A) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
(B1) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
(B2) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26
(B3) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22.
[12] A pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of [1] to [11] as an active ingredient.
The present invention provides an antibody having agonist activity against a receptor containing a heterochain.
In the present invention, a receptor containing a hetero chain means that the receptor (multimer) is composed of two or more proteins (receptor chains) different from each other. Multimers are not limited by the number of proteins (receptor chains) such as dimers, trimers, and tetramers, but are preferably dimers. For example, when the receptor is a dimer, the heteroreceptor indicates that the two constituent proteins (receptor chains) are not identical.
An antibody having agonist activity refers to an antibody having an agonistic action against a certain receptor. In general, when a ligand (factor) that is an agonist binds to a receptor, the three-dimensional structure of the receptor protein changes, and the receptor is activated (when the receptor is a membrane protein, usually cell proliferation, etc.) Signal). In the case of a receptor that forms a dimer, an agonist antibody can act like a ligand by dimerizing the receptor at an appropriate distance and angle. That is, a suitable anti-receptor antibody can mimic receptor dimerization with a ligand and can be an agonist antibody.
Physiological activities in which changes are induced by agonistic action include, for example, proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity phosphorylation / dephosphorylation activity, redox activity, Examples include, but are not limited to, metastasis activity, nucleolytic activity, dehydration activity, cell death-inducing activity, and apoptosis-inducing activity.
In a preferred embodiment of the present invention, a cytokine receptor can be mentioned as the receptor of the present invention. Cytokines are generally used as a general term for physiologically active proteins that control the proliferation and differentiation of various blood cells, and may also refer to growth factors and growth inhibitory factors of cells including non-immune cells. Therefore, cytokines are a general term for protein factors that are released from cells and mediate cell-to-cell interactions such as immunity, control of inflammatory response, antiviral action, antitumor action, and regulation of cell proliferation / differentiation.
Specific examples of cytokines include interleukins 1 to 15, colony stimulating factor (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferon (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, etc.), Chemokines, tumor necrosis factor (TNF), lymphotoxin, erythropoietin, epidermal growth factor, fibroblast growth factor and the like can be mentioned. Interferon is preferred, and type I interferon is particularly preferred.
Specific examples of cytokine receptors include interferon receptor family (IFN-α receptor, IFN-β receptor, IFN-γ receptor, IL-10 receptor, etc.), interleukin receptor family (IL- 2 receptor, IL-3 receptor, IL-6 receptor, GM-CSF receptor, etc.), serine-threonine kinase type receptor family (BMP receptor, TGF-β receptor, activin receptor, etc.) Tyrosine kinase type receptors (EGF receptor, PDGF receptor, VEGF receptor, c-kit receptor, c-fms receptor, etc.), immunoglobulin receptor family (IL-1 receptor, etc.), cells Death receptor family (TNF receptor, Fas receptor, NGF receptor, etc.), 7-transmembrane receptor family (IL-8 receptor, chemokine) Receptor, etc.) and the like, preferably interferon receptor family, more preferably a type I interferon receptor.
Interferons include IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-τ, and the like. Since IFN-α and IFN-β are highly homologous, these two IFNs can react via the same receptor. Interferon α and interferon β are classified as type I interferons.
As a preferred example of the type I interferon receptor, the AR1 chain (GenBank ACCESSION No: J03171, literature: Uze G, Lutfalla G, Gresser I. Genetic transfer of a functional human interferon [alpha]. of it cDNA.Cell (1990) 60, 225-234.) and AR2 chain (GenBank ACCESSION No: U29584, literature: Domanski P, Witte M, Kellum M, Rubinstein M, Hackett R, Pitha P, et al. expression of a long form of the [[beta]] subunit of the interferon [[alpha]] / [[beta]] receptor what is required for signaling, J Biol Chem16. SJ, Cinato E, Monneron-D., Reboul J, Rogers NC, et al. ne cluster.EMBO J (1995) 14,5100-5108.).
A multispecific antibody refers to an antibody that can specifically bind to different types of antigens. That is, a multispecific antibody is an antibody having specificity for at least two different antigens (for example, when the antigen is a heteroreceptor, the multispecific antibody has different domains constituting the heteroreceptor). recognize). Usually, such a molecule binds to two antigens (bispecific antibody: bispecific antibody), but has specificity for more (eg, three types) antigens. Also good.
The antibody against the heteroreceptor of the present invention is not particularly limited, but is preferably a monoclonal antibody. In addition, a recombinant antibody produced using a gene recombination technique is preferable. (See, for example, Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 19). A recombinant antibody is obtained by cloning DNA encoding the antibody from a hybridoma or antibody-producing cells such as sensitized lymphocytes that produce the antibody, incorporating the DNA into an appropriate vector, and introducing the vector into a host for production. be able to.
Furthermore, the antibody of the present invention may be an antibody fragment, an antibody modification product, a low molecular weight antibody or the like. For example, antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fv and the like. Here, the “Fv” fragment is the smallest antibody fragment and contains a complete antigen recognition site and a binding site. This region is a dimer in which the variable regions of one heavy chain and light chain are strongly linked by non-covalent bonds (VH-VL dimer). Three CDRs in each variable region interact to form an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Six CDRs confer antigen binding sites on the antibody. However, even one variable region (or half of an Fv containing only three CDRs specific for the antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind to the antigen. .
The Fab fragment (also referred to as F (ab)) further comprises a light chain constant region and a heavy chain constant region (CH1). Fab ′ fragments differ from Fab fragments in that they additionally have several residues from the carboxy terminus of the heavy chain CH1 region including one or more cysteines from the antibody hinge region. Fab′-SH refers to Fab ′ in which one or more cysteine residues in the constant region have a free thiol group. The F (ab ′) fragment is F (ab ′) 2 Produced by cleavage of the disulfide bond at the cysteine at the hinge of the pepsin digest. Other chemically conjugated antibody fragments are known to those skilled in the art.
Low molecular weight antibodies include single chain Fv (scFv), diabody, linear antibodies, single chain antibody molecules, and the like.
Diabody (Db) refers to a bivalent antibody fragment constructed by gene fusion (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)). EP 404,097, WO 93/11161, etc.). A diabody is a dimer composed of two polypeptide chains, each of which is in a position where the light chain variable region (VL) and the heavy chain variable region (VH) cannot bind to each other in the same chain. They are linked by a short linker, for example, about 5 residues. Since VL and VH encoded on the same polypeptide chain cannot form a single-chain V region fragment due to a short linker between them, a diabody forms two antigen-binding sites. Will have. At this time, if VL and VH for two different antigens (a, b) are combined with a linker of about 5 residues in the combination of VLa-VHb and VLb-VHa, they are secreted as bispecific Db. The
An scFv or scFv antibody fragment includes the VH and VL regions of an antibody, and these regions are present in a single polypeptide chain (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). In general, the scFv polypeptide further comprises V H And V L It contains a polypeptide linker between the regions, which allows the scFv to form the structure required for antigen binding (for a review of scFv, see Puckthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113 (Rosenburg). and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp. 269-315, 1994). The linker in the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the expression of the antibody variable region linked to both ends thereof.
These antibody fragments and low molecular weight antibodies can be produced by treating antibodies with enzymes such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or constructing genes encoding these antibody fragments and introducing them into expression vectors And then expressed in a suitable host cell (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol). (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; , J.e al, Methods Enzymol (1986) 121,663-669;.. Bird, R.E.and Walker, B.W., see Trends Biotechnol (1991) 9,132-137)..
Examples of the modified antibody include an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), and an antibody bound to a cytotoxic substance, endotoxin, radioactive substance and the like. In the modified antibody of the present invention, the substance to be bound is not limited. Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
The origin of the antibody of the present invention is not limited to human antibodies, mouse antibodies, rat antibodies and the like. Further, it may be a genetically modified antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody.
Methods for obtaining human antibodies are already known. For example, a target human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a target antigen (International Patent Application Publication) Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
Genetically modified antibodies can be produced using known methods. Specifically, for example, a chimeric antibody is an antibody comprising the heavy and light chain variable regions of an immunized animal antibody and the heavy and light chain constant regions of a human antibody. A chimeric antibody can be obtained by ligating DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal with DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. .
A humanized antibody is a modified antibody also referred to as a reshaped human antibody. Humanized antibodies are constructed by grafting CDRs of antibodies derived from immunized animals into the complementarity determining regions of human antibodies. The general gene recombination technique is also known.
Specifically, several oligonucleotides were prepared so that a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was linked to the terminal portion. It is synthesized from nucleotides by PCR. The obtained DNA is obtained by ligating with DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication Number EP 239400, International Patent Application Publication Number). WO 96/02576). As the FR of a human antibody linked through CDR, a complementarity determining region that forms a favorable antigen binding site is selected. If necessary, amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer). Res. (1993) 53, 851-856).
The method for obtaining the agonist antibody of the present invention is not particularly limited, and may be obtained by any method. For example, when obtaining an agonist antibody against a heteroreceptor composed of two types of chains (A chain and B chain), an immunized animal is immunized with each of the two types of chains (A, B) constituting the receptor, and a plurality of anti-antibodies Obtain an A chain antibody and a plurality of anti-B chain antibodies. Thereafter, a bispecific antibody comprising the H chain and L chain of the anti-A chain antibody and the H chain and L chain of the anti-B chain antibody is prepared. Here, since a plurality of types of anti-A chain antibodies and anti-B chain antibodies are obtained, it is preferable to prepare bispecific antibodies in as many combinations as possible. After producing the bispecific antibody, an antibody having agonist activity is selected.
In one embodiment of the invention, the antibody of the invention is a bispecific antibody. The preparation of the two-characteristic antibody can be performed by a known method such as fusion between antibody-producing hybridomas or introduction of an antibody expression vector into a cell. For example, an animal is immunized with each of the A chain and B chain of the receptor. MRNA is extracted from the spleen cells of this animal, and the variable regions of the L chain and H chain are recovered by RT-PCR using primers corresponding to the variable regions containing CDRs. A single-chain Fv (scFv) is synthesized by assembly PCR to construct a phage library. The antigen-binding antibody clone was concentrated and cloned by panning, and the single chain variable region (scFv) was inserted between the signal sequence for animal cells and CH1-hinge-CH2-CH3, and the scFv-CH1-Fc expression vector was inserted. Make it. A bispecific antibody can be obtained by introducing a vector encoding an anti-A chain antibody and a vector encoding an anti-B chain antibody into the same cell and expressing the antibody.
The selection of an antibody having agonist activity can be performed, for example, by the following method.
(1) By adding an antibody at the time of culturing a cell that proliferates in a factor-dependent manner, it is used as an index whether or not the cell proliferates like the factor. When the cell grows, the test multispecific antibody is determined to have an agonistic action.
(2) Whether or not a reaction similar to the factor is exhibited by adding at the time of culturing a cell line showing the original activity (not necessarily proliferation) of the factor is used as an index. An antibody is determined to have an agonistic action when it exhibits a reaction similar to a factor.
The cell normally expresses on the cell surface a receptor to which the antibody of the present invention can act as an agonist, and emits a signal by binding to a ligand (for example, an agonist antibody) of the receptor. Therefore, the cells used in the above method are preferably cells (factor-dependent proliferating cells) that can proliferate depending on the ligand (factor) of the receptor. Moreover, it is preferable that the said receptor is what normally emits a cell proliferation signal by couple | bonding with a ligand. However, when the receptor is of a type that does not emit a cell proliferation signal, it is used in the above method by fusing the receptor with a receptor of a type that emits a cell proliferation signal to form a so-called chimeric receptor. can do. The chimeric receptor emits a cell proliferation signal by binding to a ligand. The receptor suitable for constructing a chimeric receptor by fusing with the receptor is not particularly limited as long as it is a receptor that emits a cell proliferation signal, but is usually a membrane protein, more preferably extracellular. Is a receptor with a ligand receptor chain and a intracellular receptor chain. Specific examples include G-CSF receptor, mpl, neu, GM-CSF receptor, EPO receptor, c-Kit, and FLT-3. As a preferable example of the above-described factor-dependent proliferating cells in the present invention, specifically, factor dependency in which a chimeric receptor in which extracellular is a ligand receptor chain and intracellular is a G-CSF receptor chain is expressed. Proliferating cells BaF3 can be shown. In addition, examples of cells that can be used in the above method include NFS60, FDCP-1, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, and KT-3.
In addition, examples of a method for selecting an antibody having agonist activity include methods using various quantitative and / or qualitative changes as indicators. For example, a cell-free assay, a cell-based assay, a tissue index, or a biological index can be used.
As an index of a cell-free system, enzymatic reaction and quantitative and / or qualitative changes of protein, DNA, and RNA can be used. As the enzyme reaction, for example, amino acid transfer reaction, sugar transfer reaction, dehydration reaction, dehydrogenation reaction, substrate cleavage reaction and the like can be used. In addition, protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, and the like, DNA, RNA amplification, cleavage, and extension can be used. For example, phosphorylation of a protein existing downstream in the signal transduction pathway can be used as a detection index.
As a cell system indicator, changes in cell phenotype, for example, quantitative and / or qualitative changes of the produced substance, changes in proliferation activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in characteristics, etc. it can. As the production substance, secreted proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA and the like can be used. Changes in morphology include protrusion formation and / or change in number of protrusions, change in flatness, change in elongation / aspect ratio, change in cell size, change in internal structure, and deformity / uniformity as a cell population Changes in sex and cell density can be used. These morphological changes can be confirmed by observation under a microscope. As changes in properties, anchorage dependence, cytokine dependence responsiveness, hormone dependence, drug resistance, cell motility, cell migration activity, pulsatility, changes in intracellular substances, and the like can be used. Cell motility includes cell invasion activity and cell migration activity. Examples of changes in intracellular substances include enzyme activity, mRNA amount, Ca 2+ The amount of intracellular signaling substances such as cAMP and the amount of intracellular proteins can be used. In the case of a cell membrane receptor, a change in cell proliferation activity induced by receptor stimulation can be used as an index.
As an index of the tissue system, a change in function according to the tissue used can be used as a detection index. Biological indicators include tissue weight changes, blood system changes such as blood cell number changes, protein content, enzyme activity, electrolysis mass changes, and circulatory system changes such as blood pressure and heart rate changes. Etc. can be used.
The method for measuring these detection indexes is not particularly limited, and is as follows: absorption, emission, color development, fluorescence, radioactivity, fluorescence polarization, surface plasmon resonance signal, time-resolved fluorescence, mass, absorption spectrum, light scattering, fluorescence Resonant energy transfer, etc. can be used. These measurement methods are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected according to the purpose.
For example, the absorption spectrum can be measured with a commonly used photometer, plate reader, etc., emission can be measured with a luminometer, and fluorescence can be measured with a fluorometer. Mass can be measured using a mass spectrometer. Radioactivity is measured by measuring equipment such as a gamma counter according to the type of radiation, the degree of fluorescence polarization is measured by BEACON (Takara Shuzo), the surface plasmon resonance signal is measured by BIACORE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer is measured by ARVO, etc. it can. Furthermore, a flow cytometer or the like can also be used for measurement. These measurement methods may measure two or more types of detection indices with one measurement method. If simple, more detections can be made by measuring two or more types simultaneously and / or successively. It is also possible to measure an indicator. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorometer.
Antibodies against the receptor can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be prepared by immunizing an immunized animal with an antigen. Antigens for immunizing animals include complete antigens having immunogenicity and incomplete antigens (including haptens) having no immunogenicity. In the present invention, a receptor that is considered that the agonist antibody of the present invention acts as a ligand is used as the antigen (immunogen). The receptor in the present invention is not particularly limited, but is preferably a heterodimer. As an animal to be immunized, for example, mouse, hamster, rhesus monkey, or the like can be used. Those skilled in the art can immunize these animals with antigens by well-known methods. For example, as a general method, a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously. Specifically, the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline or the like, mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary, and emulsified. The mammal is dosed several times every 4-21 days. Thus, after immunizing a mammal and confirming that a desired antibody level rises in serum, immune cells are collected from the mammal.
In the present invention, preferably, the variable regions of the L and H chains of the antibody are recovered from the immunized animal or cells of the animal. This operation can be performed by those skilled in the art using generally known techniques. Animals immunized with an antigen express antibodies against the antigen, especially in spleen cells. Therefore, for example, mRNA can be prepared from spleen cells of an immunized animal, and the variable regions of the L chain and H chain can be recovered by RT-PCR using primers corresponding to the CDRs of the animal. Here, the CDR refers to three regions (CDR1, CDR2, CDR3) that are present in the hypervariable region in the variable region of an antibody and directly bind to each other in a complementary manner. As a primer corresponding to CDR, for example, a primer corresponding to a framework having lower diversity than CDR, or a primer corresponding to a signal sequence and CH1, CL portions can be used. It is also possible to immunize lymphocytes in vitro. Thereafter, a DNA probe encoding an antibody contained in the spleen or lymphocyte of the immunized animal can be specifically bound to a conventional method, for example, a gene encoding an antibody heavy chain and light chain. It isolates by the method using etc.
The receptor used as an immunogen may be the whole protein constituting the receptor or a partial peptide of the protein. In addition, as an immunogen used for immunizing an animal, an antigen that is an antigen may be bound to another molecule to form a soluble antigen, or a fragment thereof may be used in some cases. When a transmembrane molecule such as a receptor is used as an antigen, it is preferable to use these fragments (for example, the extracellular region of the receptor). Alternatively, a cell that expresses a transmembrane molecule on the cell surface can be used as an immunogen. Such cells may be cells derived from nature (such as tumor cell lines) or configured to express transmembrane molecules by recombinant techniques.
The obtained antibody can be purified to homogeneity. For separation and purification of antibodies, separation and purification methods used for ordinary proteins may be used. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratories, 1988), but is not limited thereto. Examples of columns used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column. For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) and the like.
When the antibody of the present invention is an antibody having agonistic activity against, for example, a type I interferon receptor containing an AR1 chain and an AR2 chain, preferably the variable region in the anti-AR1 chain antibody and the anti-AR2 chain antibody And a variable region. Examples of the antibody include, but are not limited to, an antibody comprising any of the following variable regions of an anti-AR1 chain antibody and any of the following variable regions of an anti-AR2 chain antibody. it can.
-Variable region of anti-AR1 chain antibody: AR1-41, AR1-24
-Variable region of anti-AR2 chain antibody: AR2-37, AR2-11, AR2-13, AR2-45, AR2-22, AR2-43, AR2-40, AR2-14, AR2-44, AR2-33, AR2 -31
The amino acid sequences of VH and VL of each of the above variable regions are shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 (the relationship between VH and VL of each variable region and SEQ ID NO: is shown in Table 1).
Figure 2004060919
When the anti-AR1 chain antibody is AR1-24, the partner anti-AR2 chain antibody is preferably AR2-13, AR2-31, or AR2-44, and when the anti-AR1 chain antibody is AR1-41, the partner The anti-AR2 chain antibody is AR2-11, AR2-13, AR2-14, AR2-22, AR2-33, AR2-37, AR2-40, AR2-43, AR2-44, or AR2-45. It is preferable. AR2-13 and AR2-44 can be partners to both AR1-41 and AR1-24 antibodies. Antibodies that form pairs as described above are also included in the present invention.
In the present invention, the antibody containing the variable region does not necessarily have the full length sequence of the variable region. If the CDR sequence is conserved, the FR sequence is appropriately used when the antibody is humanized. You may change it.
Therefore, the present invention includes an antibody having an amino acid sequence corresponding to CDR in the variable region.
Table 2 shows amino acid numbers corresponding to CDRs in the variable region SEQ ID NOs.
Figure 2004060919
In the case of producing a full-length antibody using the variable region disclosed in the present invention, the constant region is not particularly limited, and a constant region known to those skilled in the art can be used. For example, Sequences of proteins of immunological interest, (1991), U.S. Pat. S. Department of Health and Human Services. Public Health Service National Institutes of Health and An efficient route to human bispecific IgG, (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681, etc. can be used.
Since the antibody of the present invention has an agonistic action, it is expected to be an effective drug against a disease caused by a decrease in activity (function) of a receptor on which the antibody acts. That is, the present invention provides a pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention as an active ingredient. For example, when the antibody of the present invention is an antibody having agonist activity against a cytokine receptor, the antibody is considered to have a cytokine-like action. Accordingly, the antibody is expected to be a pharmaceutical product (pharmaceutical composition) having an antiviral action, an antitumor action, and a cell growth / differentiation regulating action.
A pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention used as an active ingredient for therapeutic or prophylactic purposes is mixed with an appropriate pharmaceutically acceptable carrier, vehicle, etc. inert to them as necessary. It can be formulated. For example, sterile water, physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like. Other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, sugars and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides, and sugars such as mannitol and sorbitol Alcohol may be included. In the case of an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and appropriate dissolution You may use together with adjuvants, such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc.
If necessary, the antibody of the present invention can be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]) or colloid drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles). And nanocapsules etc.) (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed. (1980), etc.). Furthermore, a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the antibody of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981); Langer, Chem.Tech.12: 98-105 (1982); U.S. Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983). EP 133,988).
The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is finally determined as appropriate based on the judgment of a doctor in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptom, degree of progression, etc. However, in general, for adults, 0.1 to 2000 mg per day can be orally administered in 1 to several divided doses. More preferred is 1-1000 mg / day, even more preferred is 50-500 mg / day, and most preferred is 100-300 mg / day. These doses vary depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. The administration period is also preferably determined appropriately according to the patient's healing progress and the like.
It is also conceivable to perform gene therapy by incorporating a gene encoding the antibody of the present invention into a gene therapy vector. As the administration method, in addition to direct administration with naked plasmid, it can be packaged in liposomes or as various virus vectors such as retrovirus vector, adenovirus vector, vaccinia virus vector, poxvirus vector, adenovirus related vector, HVJ vector, etc. (See Adolph “Virus Genome Method”, CRC Press, Florida (1996)), or coated on a bead carrier such as colloidal gold particles (WO93 / 17706, etc.). However, the antibody may be administered by any method as long as the antibody is expressed in vivo and can exert its action. Preferably, by suitable parenteral routes (intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, adipose tissue, intramammary tissue, inhalation or intramuscular route, injection, infusion, or gas-induced particle bombardment (electronic A sufficient amount is administered by a method such as a gun), a method via a mucosal route such as an nasal drug, etc. Ex vivo administration to liposomes, blood cells, bone marrow-derived cells, etc. using liposome transfection, particle bombardment (US Pat. No. 4,945,050), or viral infection, and reintroducing the cells into animals The gene encoding the antibody of the present invention may be administered by

図１は、抗体のＤａｕｄｉ細胞に対する増殖抑制活性を示したものである。用量依存的なアゴニスト活性を確認できた。
図２は、ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ導入Ｋ５６２細胞に対する抗体のＩＳＲＥ活性化能を示したものである。ＡＲ１−４１／ＡＲ２−１３のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。□はＩＦＮ−α２ａ、●はＡＲ１−４１／ＡＲ２−１３二種特異性抗体を示す。
図３は、ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ導入Ｋ５６２細胞に対する抗体のＩＳＲＥ活性化能を示したものである。ＡＲ１−４１／ＡＲ２−１３のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。□はＩＦＮ−α２ａ、●はＡＲ１−４１／ＡＲ２−１４二種特異性抗体を示す。
図４は、ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ導入Ｋ５６２細胞に対する抗体のＩＳＲＥ活性化能を示したものである。ＡＲ１−４１／ＡＲ２−１３のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。□はＩＦＮ−α２ａ、●はＡＲ１−２４／ＡＲ２−１３二種特異性抗体を示す。
図５は、ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃ導入Ｋ５６２細胞に対する抗体のＩＳＲＥ活性化能を示したものである。ＡＲ１−４１／ＡＲ２−１３のルシフェラーゼ活性測定の結果を示す。□はＩＦＮ−α２ａ、●はＡＲ１−２４／ＡＲ２−３１二種特異性抗体を示す。FIG. 1 shows the growth inhibitory activity of antibodies against Daudi cells. A dose-dependent agonist activity could be confirmed.
FIG. 2 shows the ability of the antibody to activate ISRE against pISRE-Luc-introduced K562 cells. The result of the luciferase activity measurement of AR1-41 / AR2-13 is shown. □ indicates IFN-α2a, and ● indicates an AR1-41 / AR2-13 bispecific antibody.
FIG. 3 shows the ability of the antibody to activate ISRE against pISRE-Luc-introduced K562 cells. The result of the luciferase activity measurement of AR1-41 / AR2-13 is shown. □ indicates IFN-α2a, and ● indicates an AR1-41 / AR2-14 bispecific antibody.
FIG. 4 shows the ISRE activation ability of antibodies against pISRE-Luc-introduced K562 cells. The result of the luciferase activity measurement of AR1-41 / AR2-13 is shown. □ indicates IFN-α2a, and ● indicates an AR1-24 / AR2-13 bispecific antibody.
FIG. 5 shows the ability of the antibody to activate ISRE against pISRE-Luc-introduced K562 cells. The result of the luciferase activity measurement of AR1-41 / AR2-13 is shown. □ indicates IFN-α2a, and ● indicates an AR1-24 / AR2-31 bispecific antibody.

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 抗原および免疫
ヒトＡＲ１及びＡＲ２それぞれの細胞外領域のＣ末端にＦＬＡＧもしくはＨｉｓ６のタグを付加した可溶型受容体の発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し、その培養上清からアフィニティーカラムを用いて精製した。マウスプロＢ細胞株ＢａＦ３にヒトＡＲ１の細胞外領域とＧ−ＣＳＦ受容体とのキメラ分子の発現ベクターを導入し、高発現細胞を樹立した。同様にヒトＡＲ２の細胞外領域とＧ−ＣＳＦ受容体とのキメラ分子の高発現細胞を樹立した。それぞれの細胞をＢＡＬＢ／ｃの腹腔に免疫した。脾臓を摘出する３日前にＡＲ１ＨｉｓもしくはＡＲ２Ｈｉｓを静注した。
〔実施例２〕 ｓｃＦｖ提示ライブラリーからの抗体分離
（ａ）ファージライブラリーのパンニング
免疫マウスの脾臓よりｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにてｓｃＦｖを合成し、ｓｃＦｖがｆ１ファージのｇｅｎｅ３との融合蛋白として発現するプラスミドライブラリーを構築した（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１，（１９９７），３５−５５）。ライブラリーの大腸菌（２ｘ１０９ｃｆｕ）を５０ｍＬ ２ｘＹＴＡＧ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２％グルコースを含む２ｘＴＹ）に植菌し、ＯＤ ６００ ０．４〜０．５まで３７℃にて培養した。４ｘ１０１１のヘルパーファージＶＣＳＭ１３を加え３７℃、１５分間静置して感染させた。ここに４５０ｍＬ ２ｘＹＴＡＧ、２５μＬ １ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧを添加し、２６℃ １０時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、１００ｍＬ ＰＥＧ−ＮａＣｌ（１０％ポリエチレングリコール８０００，２．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を混合後、４℃、６０分間静置した。１０，８００ ｘ ｇ、３０分間遠心にてファージを沈殿させ、沈殿物を４０ｍＬの水に懸濁し、８ｍＬ ＰＥＧ−ＮａＣｌを混合後、４℃、２０分間静置した。１０，８００ ｘ ｇ、３０分間遠心にてファージを沈殿させ５ｍＬ ＰＢＳに懸濁した。ＡＲ１ＦＬＡＧとＡＲ２ＦＬＡＧはＮｏ−Ｗｅｉｇｈ Ｐｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン標識した。ファージライブラリーに１００ｐｍｏｌのビオチン標識ＡＲ１ＦＬＡＧもしくはＡＲ２ＦＬＡＧを加え、６０分間抗原と接触させた。５％ Ｍ−ＰＢＳ（５％スキムミルクを含むＰＢＳ）で洗浄したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）６００μＬを加え、１５分間結合させた。ビーズを１ｍＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）とＰＢＳにて３回ずつ洗浄した。０．８ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中にビーズを５分間懸濁し、ファージを溶出した。回収したファージ溶液に４５μＬ ２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓを添加して中和し、対数増殖期（ＯＤ ６００ ０．４〜０．５）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ １０ｍＬに添加、３７℃、３０分間静置することで感染させた。これを２ｘＹＴＡＧプレートに広げ、３０℃で培養した。コロニーを回収し、２ｘＹＴＡＧに植菌、ＯＤ ６００ ０．４〜０．５まで３７℃にて培養した。培養液１０ｍＬに５μＬ １ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、１０１１ｐｆｕヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加し３７℃ ３０分間静置した。遠心集菌後、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｘＹＴＡＧ １００ｍＬに再懸濁し、３０℃、１０時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、２０ｍＬ ＰＥＧ−ＮａＣｌを混合後、４℃、２０分間静置した。１０，８００ ｘ ｇ、３０分間遠心にてファージを沈殿させ、２ｍＬ ＰＢＳに懸濁したものを次のパンニングに供した。２回目のパンニングではビーズをＰＢＳＴとＰＢＳにて５回ずつ洗浄した。溶出したファージを感染させ得られた大腸菌からＡＲ結合ファージを産生するクローンをＥＬＩＳＡにて選択した。
（ｂ）ファージＥＬＩＳＡ
上記のシングルコロニーを１５０μＬ ２ｘＹＴＡＧに植菌し、３０℃で一晩培養した。この５μＬを５００μＬ ２ｘＹＴＡＧに植菌、３７℃、２時間培養後、ヘルパーファージ２．５ｘ１０９ｐｆｕと０．３μＬ １ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧを含む２ｘＹＴＡＧを１００μＬ添加し３７℃にて３０分間静置した。続いて３０℃にて一晩培養し、遠心上清をＥＬＩＳＡに供した。ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ９６マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を１．０μｇ／ｍＬビオチン標識ＡＲ１ＦＬＡＧもしくはＡＲ２ＦＬＡＧを含むＰＢＳ１００μＬにて一晩コートした。ＰＢＳＴにて洗浄し抗原を除いた後、２％ Ｍ−ＰＢＳ ２００μＬで一晩ブロッキングした。２％ Ｍ−ＰＢＳを除き、ここに培養上清を加え４０分間静置し抗体を結合させた。洗浄後、結合ファージは２％ Ｍ−ＰＢＳにて希釈したＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とＢＭ ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）で検出し、硫酸の添加により反応を停止した後、Ａ４５０の値を測定した。
（ｃ）配列決定とクローン選択
ＥＬＩＳＡにて陽性であったクローンのファージ液からプライマーＰＢＧ３−Ｆ１（５′−ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣ−３′／配列番号：２７）とＰＢＧ３−Ｒ１（５′−ＣＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧ−３′／配列番号：２８）を用いてＰＣＲにてｓｃＦｖ領域を増幅し、その塩基配列決定した。ファージ液１μＬ、１０ ｘ ＫＯＤ Ｄａｓｈ緩衝液２μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌプライマーを０．５μＬづつ、ＫＯＤ Ｄａｓｈポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ、２．５Ｕ／μＬ）０．３μＬを含むＰＣＲ反応液２０μＬを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ９７００で９６℃、１０秒、５５℃、１０秒、７２℃、３０秒、３０サイクルの増幅を行なった。ＰＣＲ後、５μＬの反応液にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（アマシャム）を３μＬ添加し、３７℃、２０分間、引き続き８０℃、１５分間保温した。このサンプルについてＰＢＧ３−Ｆ２（５′−ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴ−３′／配列番号：２９）あるいはＰＢＧ３−Ｒ２（５′−ＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣ−３′／配列番号：３０）をプライマーとしてＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて反応を行ない、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで泳動した。塩基配列から推定されるアミノ酸配列のＣＤＲ３の異なるクローンを抗ＡＲ１及び抗ＡＲ２についてそれぞれ４５クローンずつ選択した。
〔実施例３〕 二種特異性抗体の発現
ｓｃＦｖ−ＣＨ１−Ｆｃとして発現させるためにＣＡＧＧプロモーターで駆動されるヒトシグナル配列とイントロン−ＣＨ１−Ｆｃ（ヒトＩｇＧ４ ｃＤＮＡ）の間にＳｆｉＩサイトを介してｓｃＦｖを挿入できる発現ベクターｐＣＡＧＧｓｓ−ｇ４ＣＨヘテロＩｇＧ４を構築した。ヘテロ分子として発現させるためにＩｇＧ１のｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌ．９，６１７−６２１，１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６，６７７−６８１，１９９８）を参考にＩｇＧ４のＣＨ３部分へのアミノ酸置換体を作成した。ＡタイプはＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗの置換体である。ＢタイプはＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの置換体である。両者のヒンジ部分にも置換（−ｐｐｃｐＳｃｐ−→−ｐｐｃｐＰｃｐ−）を導入した。またＡタイプにはヒトＩＬ−３のシグナル配列を、ＢタイプにはヒトＩＬ−６のシグナル配列を用いて構築した（ｐＣＡＧＧ−ＩＬ３ｓｓ−ｇ４ＣＨＰａ，ｐＣＡＧＧ−ＩＬ６ｓｓ−ｇ４ＣＨＰｂ）。塩基配列より選択したクローンのｓｃＦｖ領域のＰＣＲ産物をＳｆｉＩ処理し、抗ＡＲ１クローンはｐＣＡＧＧ−ＩＬ３ｓｓ−ｇ４ＣＨＰａに、抗ＡＲ２クローンはｐＣＡＧＧ−ＩＬ３ｓｓ−ｇ４ＣＨＰｂにサブクローニングした。抗ＡＲ１及び抗ＡＲ２クローン４５ｘ４５の合計２０２５種類の全組み合わせについて発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にリポフェクトアミン２０００を用いてトランスフェクションし、３日後の培養上清を回収した。
〔実施例４〕 アゴニスト二種特異性抗体の分離
（ａ）ＢａＦ３増殖アッセイ
ＢａＦ３−ＡＲＧはマウスＩＬ−３依存性増殖細胞ＢａＦ３にＡＲ１及びＡＲ２の細胞外領域とＧ−ＣＳＦ受容体の細胞内領域とのキメラ分子の発現ベクターを導入して樹立した。ＢａＦ３−ＡＲＧはＩＦＮαに依存して増殖した。３度洗浄したウエル当り１ｘ１０３個の細胞およびサンプルを含む０．１ｍＬの培地で９６ウエルプレートに播種した。４日間培養後１０μＬの生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を添加し、２時間３７℃保温した後Ａ４５０を測定した。
（ｂ）Ｄａｕｄｉ細胞増殖抑制アッセイ
Ｄａｕｄｉ細胞はＩＦＮに対して高感受性を示すヒトＢ細胞株である。サンプルを含む０．１ｍＬの培地でウエル当り６．２５ｘ１０３個の細胞を９６ウエルプレートに播種した。４日間培養後１０μＬの生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を添加し、２時間３７℃保温した後、Ａ４５０を測定した。
（ｃ）アゴニスト二種特異性抗体の配列
上記スクリーニングにて選択された抗体の可変領域のアミノ酸配列を、配列番号：１〜２６に示す。各抗体の名称および配列番号との関係は、上記表１に示す。
（ｄ）ＩＳＲＥを用いたレポータージーンアッセイ
３ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉに１００μＬのＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し攪拌したものに、ｐＩＳＲＥ−Ｌｕｃを４０μｇ添加し、攪拌の後室温にて２０分間静置した。これを８ｘ１０６／２ｍＬ ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩに調整したヒト細胞Ｋ５６２に加え、３７℃にて４時間培養した後、１０ｍＬの１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０を添加し更に一晩培養した。翌日、遠心操作にて回収したＫ５６２を１０．５ｍＬの１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０で再度懸濁し９６ｗｅｌｌ平底プレートに７０μＬ／ｗｅｌｌで播種した。
抗体遺伝子導入ＨＥＫ２９３培養上清中のｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｃＦｖ−ＣＨをＩｇＧ換算で１２．５ｎｇ／ｍＬに濃度調整し、更に５倍希釈系列を作製した。これを、レポータープラスミドを導入した細胞に３０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。陽性対照のｗｅｌｌにはＩＦＮ−α２ａの５倍希釈列を３０μＬ／ｗｅｌｌ分注した。３７℃にて２４時間培養後、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を５０μＬ／ｍＬ添加し室温１０分静置した後、Ａｎａｌｙｓｔ ＨＴ（ＬＪＬ）にてルシフェラーゼ活性を測定した（図１、図２、図３、図４）。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Antigen and immunity A soluble receptor expression vector having a FLAG or His6 tag added to the C-terminus of the extracellular region of each of human AR1 and AR2 was introduced into CHO cells, and affinity was obtained from the culture supernatant. Purified using a column. A high expression cell was established by introducing an expression vector of a chimeric molecule of the extracellular region of human AR1 and the G-CSF receptor into the mouse pro B cell line BaF3. Similarly, a high-expression cell of a chimeric molecule between the extracellular region of human AR2 and the G-CSF receptor was established. Each cell was immunized into the peritoneal cavity of BALB / c. AR1His or AR2His was intravenously injected 3 days before the removal of the spleen.
[Example 2] Separation of antibody from scFv display library (a) Panning of phage library PolyA (+) RNA was extracted from the spleen of an immunized mouse, and scFv was synthesized by RT-PCR. A plasmid library that was expressed as a fusion protein with gene3 was constructed (J. Immun. Methods, 201, (1997), 35-55). Library E. coli (2 × 10 9 cfu) was inoculated into 50 mL 2 × YTAG (100 μg / mL ampicillin, 2 × TY containing 2% glucose) and cultured at 37 ° C. to an OD 600 of 0.4 to 0.5. 4 × 10 11 helper phage VCSM13 was added and left at 37 ° C. for 15 minutes for infection. 450 mL 2 × YTAG, 25 μL 1 mol / L IPTG was added thereto, and cultured at 26 ° C. for 10 hours. The culture supernatant was collected by centrifugation, mixed with 100 mL PEG-NaCl (10% polyethylene glycol 8000, 2.5 mol / L NaCl), and allowed to stand at 4 ° C. for 60 minutes. Phage was precipitated by centrifugation at 10,800 × g for 30 minutes, the precipitate was suspended in 40 mL of water, mixed with 8 mL PEG-NaCl, and allowed to stand at 4 ° C. for 20 minutes. Phage was precipitated by centrifugation at 10,800 × g for 30 minutes and suspended in 5 mL PBS. AR1FLAG and AR2FLAG were labeled with biotin using No-Weighed Premeasured NHS-PEO4-Biotin Microtubes (Pierce). 100 pmol of biotin-labeled AR1FLAG or AR2FLAG was added to the phage library and contacted with the antigen for 60 minutes. 600 μL of Streptavidin MagneSphere (Promega) washed with 5% M-PBS (PBS containing 5% skim milk) was added and allowed to bind for 15 minutes. The beads were washed 3 times each with 1 mL PBST (PBS containing 0.1% Tween-20) and PBS. The beads were suspended in 0.8 mL of 0.1 mol / L glycine / HCl (pH 2.2) for 5 minutes to elute the phages. 45 μL 2 mol / L Tris was added to the collected phage solution for neutralization, added to 10 mL of logarithmic growth phase (OD 600 0.4 to 0.5) XL1-Blue, and left to stand at 37 ° C. for 30 minutes for infection. I let you. This was spread on 2 × YTAG plates and cultured at 30 ° C. Colonies were collected, inoculated into 2xYTAG, and cultured at 37 ° C until OD 600 0.4-0.5. 5 μL of 1 mol / L IPTG and 10 11 pfu helper phage (VCSM13) were added to 10 mL of the culture solution and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. After centrifugation, the cells were resuspended in 100 mL of 2 × YTAG containing 25 μg / mL kanamycin and cultured at 30 ° C. for 10 hours. The culture supernatant was collected by centrifugation, mixed with 20 mL PEG-NaCl, and allowed to stand at 4 ° C. for 20 minutes. Phage was precipitated by centrifugation at 10,800 × g for 30 minutes, and suspended in 2 mL PBS for the next panning. In the second panning, the beads were washed 5 times with PBST and PBS. A clone producing an AR-binding phage was selected by ELISA from E. coli obtained by infecting the eluted phage.
(B) Phage ELISA
The single colony was inoculated into 150 μL 2 × YTAG and cultured at 30 ° C. overnight. After inoculating 5 μL of this in 500 μL 2 × YTAG and culturing at 37 ° C. for 2 hours, 100 μL of 2 × YTAG containing 2.5 × 10 9 pfu of helper phage and 0.3 μL 1 mol / L IPTG was added and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the cells were cultured overnight at 30 ° C., and the centrifuged supernatant was subjected to ELISA. A StreptaWell 96 microtiter plate (Roche) was coated overnight with 100 μL of PBS containing 1.0 μg / mL biotin-labeled AR1FLAG or AR2FLAG. After washing with PBST to remove the antigen, blocking was performed overnight with 200 μL of 2% M-PBS. 2% M-PBS was removed, the culture supernatant was added here, and the mixture was allowed to stand for 40 minutes to bind the antibody. After washing, the bound phage was detected with HRP-conjugated anti-M13 antibody (Amersham Pharmacia Biotech) diluted with 2% M-PBS and BM blue POD substrate (Roche), and the reaction was stopped by addition of sulfuric acid. Was measured.
(C) Sequencing and clone selection Primers PBG3-F1 (5′-CAGCTATGAAATACCTATTGCC-3 ′ / SEQ ID NO: 27) and PBG3-R1 (5′-CTTTTCATATAATCAAAATCACCGG-3 ′) from the phage solution of clones that were positive by ELISA / SEQ ID NO: 28) was used to amplify the scFv region by PCR, and its nucleotide sequence was determined. 1 μL of phage solution, 2 μL of 10 × KOD Dash buffer solution, 0.5 μL of 10 μmol / L primer, and 20 μL of PCR reaction solution containing 0.3 μL of KOD Dash polymerase (TOYOBO, 2.5 U / μL) at 96 ° C. with Perkin Elmer 9700 Amplification was carried out for 10 seconds, 55 ° C., 10 seconds, 72 ° C., 30 seconds and 30 cycles. After PCR, 3 μL of ExoSAP-IT (Amersham) was added to 5 μL of the reaction solution, and incubated at 37 ° C. for 20 minutes, then at 80 ° C. for 15 minutes. For this sample, BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (PIG3-Terminator Cycle sequencing kit) using PBG3-F2 (5'-ATTGCCTACGGCAGCCGCT-3 '/ SEQ ID NO: 29) or PBG3-R2 (5'-AAATACCCGGAACCAGAGCC-3' / SEQ ID NO: 30) as a primer. The reaction was carried out using an Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencer. Forty-five clones for anti-AR1 and anti-AR2 were selected for clones having different CDR3 of the amino acid sequence deduced from the base sequence.
[Example 3] Bispecific antibody expression Via a SfiI site between a human signal sequence driven by the CAGG promoter and intron-CH1-Fc (human IgG4 cDNA) for expression as scFv-CH1-Fc An expression vector pCAGGss-g4CH hetero IgG4 into which scFv can be inserted was constructed. In order to express it as a hetero molecule, amino acid substitution to IgG3 CH3 part with reference to IgG1 knobs-into-holes (Protein Engineering vol.9, 617-621, 1996, Nature Biotechnology vol. 16, 677-681, 1998) Created the body. Type A is a substitute for Y349C, T366W. Type B is a substitution product of E356C, T366S, L368A, Y407V. A substitution (-ppcpScp- → -ppcpPcp-) was also introduced into both hinge portions. In addition, a human IL-3 signal sequence was constructed for the A type, and a human IL-6 signal sequence was constructed for the B type (pCAGG-IL3ss-g4CHPa, pCAGG-IL6ss-g4CHPb). The scFv region PCR product of the clone selected from the nucleotide sequence was treated with SfiI, and the anti-AR1 clone was subcloned into pCAGG-IL3ss-g4CHPa and the anti-AR2 clone was subcloned into pCAGG-IL3ss-g4CHPb. Expression vectors were transfected into HEK293 cells using Lipofectamine 2000 for a total of 2025 combinations of anti-AR1 and anti-AR2 clones 45 × 45, and the culture supernatant after 3 days was collected.
Example 4 Isolation of Agonist Bispecific Antibodies (a) BaF3 Proliferation Assay BaF3-ARG is an extracellular region of AR1 and AR2 and an intracellular region of G-CSF receptor in mouse IL-3-dependent proliferating cells BaF3. And introduced an expression vector for the chimeric molecule. BaF3-ARG proliferated depending on IFNα. A 96-well plate was seeded with 0.1 mL of medium containing 1 × 10 3 cells and samples washed three times. After culturing for 4 days, 10 μL of viable cell count measuring reagent SF (nacalai test) was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours, and then A450 was measured.
(B) Daudi Cell Growth Inhibition Assay Daudi cells are a human B cell line that is highly sensitive to IFN. 6.25 × 10 3 cells per well were seeded in a 96-well plate with 0.1 mL of medium containing the sample. After culturing for 4 days, 10 μL of viable cell count measuring reagent SF (nacalai test) was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours, and then A450 was measured.
(C) Sequence of agonist bispecific antibody The amino acid sequences of the variable regions of the antibodies selected by the above screening are shown in SEQ ID NOs: 1 to 26. The relationship between the name of each antibody and the sequence number is shown in Table 1 above.
(D) Reporter gene assay using ISRE To 100 mL of DMRIE-C (Invitrogen) added to 3 mL of OPTI-MEM I and stirred, 40 μg of pISRE-Luc was added and allowed to stand at room temperature for 20 minutes after stirring. did. This 8x10 6 / 2mL OPTI-MEMI addition to human cell K562 adjusted to, after 4 hours incubation at 37 ° C., the cells were further cultured overnight by adding 15% FCS-RPMI1640 of 10 mL. The next day, K562 recovered by centrifugation was resuspended in 10.5 mL of 10% FCS-RPMI 1640 and seeded on a 96-well flat bottom plate at 70 μL / well.
The concentration of bispecific scFv-CH in the antibody gene-introduced HEK293 culture supernatant was adjusted to 12.5 ng / mL in terms of IgG, and a 5-fold dilution series was prepared. This was added at 30 μL / well to the cells into which the reporter plasmid was introduced. As a positive control well, 30 μL / well of a 5-fold dilution series of IFN-α2a was dispensed. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, 50 μL / mL of Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega) was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then luciferase activity was measured with Analyst HT (LJL) (FIGS. 1 and 2). 3 and 4).

産業上の利用の可能性Industrial applicability

本発明によりヘテロ鎖を含む受容体に対してアゴニスト作用を有する抗体が提供された。本発明の抗体は、血中での安定性が高く、抗原性もないものと考えられることから、医薬品となるものと大いに期待される。  The present invention provides an antibody having an agonistic effect on a receptor containing a hetero chain. The antibody of the present invention is highly expected to be a pharmaceutical because it is considered to have high stability in blood and no antigenicity.

【配列表】

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Claims (12)

ヘテロ鎖を含む受容体に対してアゴニスト活性を有する抗体。An antibody having agonistic activity against a receptor containing a heterochain. 受容体がサイトカイン受容体である請求項１に記載の抗体。The antibody according to claim 1, wherein the receptor is a cytokine receptor. サイトカイン受容体がインターフェロン受容体である請求項２に記載の抗体。The antibody according to claim 2, wherein the cytokine receptor is an interferon receptor. インターフェロン受容体がＩ型インターフェロン受容体である請求項３に記載の抗体。The antibody according to claim 3, wherein the interferon receptor is a type I interferon receptor. Ｉ型インターフェロン受容体がＡＲ１鎖及びＡＲ２鎖を含んでいることを特徴とする請求項４に記載の抗体。The antibody according to claim 4, wherein the type I interferon receptor comprises an AR1 chain and an AR2 chain. 受容体が多量体である請求項１に記載の抗体。The antibody according to claim 1, wherein the receptor is a multimer. 多量体が二量体である請求項６に記載の抗体。The antibody according to claim 6, wherein the multimer is a dimer. 二種特異性抗体である請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。The antibody according to any one of claims 1 to 7, which is a bispecific antibody. 抗ＡＲ１鎖抗体の可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体の可変領域とを含む、請求項５に記載の抗体。6. The antibody of claim 5, comprising a variable region of an anti-AR1 chain antibody and a variable region of an anti-AR2 chain antibody. 抗ＡＲ１鎖抗体における下記（ａ）のアミノ酸配列からなる可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ１０）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる可変領域とを含む、請求項９に記載の抗体。
（ａ） Ｈ鎖可変領域が配列番号：１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２に記載のアミノ酸配列
（ｂ１）Ｈ鎖可変領域が配列番号：７に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：８に記載のアミノ酸配列
（ｂ２）Ｈ鎖可変領域が配列番号：９に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列
（ｂ３）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１９に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２０に記載のアミノ酸配列
（ｂ４）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１３に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１４に記載のアミノ酸配列
（ｂ５）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２３に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２４に記載のアミノ酸配列
（ｂ６）Ｈ鎖可変領域が配列番号：５に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：６に記載のアミノ酸配列
（ｂ７）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１７に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１８に記載のアミノ酸配列
（ｂ８）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１５に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１６に記載のアミノ酸配列
（ｂ９）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２２に記載のアミノ酸配列
（ｂ１０）Ｈ鎖可変領域が配列番号：１１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１２に記載のアミノ酸配列The variable region which consists of the amino acid sequence of the following (a) in an anti-AR1 chain antibody, and the variable region which consists of the amino acid sequence in any one of the following (b1)-(b10) in an anti-AR2 chain antibody. The antibody according to 1.
(A) The heavy chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the light chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and (b1) the heavy chain variable region is the amino acid described in SEQ ID NO: 7. The L chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 (b2) the H chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9, and the L chain variable region is described in SEQ ID NO: 10. The amino acid sequence (b3) heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and the light chain variable region is the amino acid sequence (b4) heavy chain variable region described in SEQ ID NO: 20. The L chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 (b5) The H chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 23, and the L chain variable region is SEQ ID NO: 24. The amino acid sequence described (b6 ) The H chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the L chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (b7) The H chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 The L chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 (b8) the H chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 15, and the L chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16. (B9) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21, the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22, and (b10) the heavy chain variable region is the amino acid set forth in SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence of which the L chain variable region is represented by SEQ ID NO: 12 抗ＡＲ１鎖抗体における下記（ａ）のアミノ酸配列からなる可変領域と、抗ＡＲ２鎖抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ３）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる可変領域とを含む、請求項９に記載の抗体。
（ａ） Ｈ鎖可変領域が配列番号：３に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：４に記載のアミノ酸配列
（ｂ１）Ｈ鎖可変領域が配列番号：９に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：１０に記載のアミノ酸配列
（ｂ２）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２５に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２６に記載のアミノ酸配列
（ｂ３）Ｈ鎖可変領域が配列番号：２１に記載のアミノ酸配列であり、Ｌ鎖可変領域が配列番号：２２に記載のアミノ酸配列The variable region which consists of an amino acid sequence of the following (a) in an anti-AR1 chain antibody, and the variable region which consists of the amino acid sequence in any one of the following (b1)-(b3) in an anti-AR2 chain antibody. The antibody according to 1.
(A) The heavy chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3, the light chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, and (b1) the heavy chain variable region is the amino acid described in SEQ ID NO: 9. The L chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 (b2), the H chain variable region is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 25, and the L chain variable region is described in SEQ ID NO: 26. Amino acid sequence (b3) The heavy chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21 and the light chain variable region is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22. 請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。The pharmaceutical composition which contains the antibody in any one of Claims 1-11 as an active ingredient.
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