JPWO2004056351A1

JPWO2004056351A1 - PKA activity regulator

Info

Publication number: JPWO2004056351A1
Application number: JP2004562064A
Authority: JP
Inventors: 大塚　基之; 基之大塚; 小俣　政男; 政男小俣
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2006-04-20
Also published as: AU2003289467A1; WO2004056351A1

Abstract

本発明に係るＰＫＡ活性調節剤は、メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含むものである。また、本発明に係るＰＫＡ活性化剤は、癌疾患の予防又は治療剤、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤抑制剤、並びにＡＰ−２，ＣＲＥＢ，及びＵＳＦ−１の活性化剤を製造する際に有用である。さらに、本発明は、メナテトレノンまたはその塩を対象物に有効量投与することを特徴とするＰＫＡ活性の調節法を提供するものである。The PKA activity regulator according to the present invention contains menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient. In addition, the PKA activator according to the present invention produces a preventive or therapeutic agent for cancer diseases, a cancer cell growth inhibitor, a cancer cell infiltration suppressor, and AP-2, CREB, and USF-1 activators. Useful in some cases. Furthermore, the present invention provides a method for regulating PKA activity, which comprises administering an effective amount of menatetrenone or a salt thereof to a subject.

Description

本発明は、メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ｃＡＭＰｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ（以下、単に「ＰＫＡ」という。）活性調節剤等に関する。 The present invention relates to a cAMP dependent protein kinase A (hereinafter simply referred to as “PKA”) activity regulator or the like, which contains menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者は、高率に門脈浸潤（ＰＶＩ：ＰｏｒｔａｌＶｅｎｏｕｓＩｎｖａｓｉｏｎ）をきたすことが知られており、一旦ＰＶＩが発生すると予後は極めて不良である。ＨＣＣ患者におけるＤｅｓ−γ−ＣａｒｂｏｘｙＰｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（以下、「ＤＣＰ」と称する。）の高値が、その後のＰＶＩ進展と密接に関連することが知られている（たとえば、非特許文献１参照）。ここで、ＤＣＰとは、正常な凝固活性を持たないプロトロンビンで、ビタミンＫ（以下、「ＶＫ」と称する。）が欠乏した状況で増えることが知られており、ＶＫの欠乏・ＶＫの吸収障害のマーカーとして用いられるタンパク質である。
一方で、ＤＣＰ高値ＨＣＣ患者に対しＶＫを投与すると血清のＤＣＰ値が低下すること（たとえば、非特許文献２参照）、ｉｎｖｉｔｒｏでＤＣＰ産生のＨＣＣｃｅｌｌｌｉｎｅに対しＶＫ−ＩＩを投与することで細胞の増殖が抑制されること（たとえば、非特許文献３参照）が報告されている。
肝癌に関する臨床的な研究としては、非環式ｒｅｔｉｎｏｉｄによる肝癌再発抑止（たとえば、非特許文献４参照）、ＡＣＥｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（たとえば、非特許文献５参照）やＣＯＸ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（たとえば、非特許文献６参照）による肝発癌抑制・肝癌細胞増殖抑制やアポトーシス促進作用が知られている。
他方、ビタミンＫ２が、白血病細胞やＭＤＳ細胞（たとえば、非特許文献７参照）、乳癌細胞（たとえば、非特許文献８参照）、線維芽細胞（たとえば、非特許文献９参照）等における癌細胞の増殖を抑制することが報告されている。
しかしながら、より癌細胞増殖抑制作用ないしは癌細胞浸潤抑制作用に優れた、有用な癌疾患治療剤は未だ提供されていなかった。
［非特許文献１］ＫｏｉｋｅＹ．Ｃａｎｃｅｒ２００１；９１：５６１−９
［非特許文献２］Ｃａｎｃｅｒ１９９２；６９：３１−８
［非特許文献３］ＷａｎｇＺ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１９９５；２２：８７６−８２
［非特許文献４］ＭｕｔｏＹ，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ１９９６；３３４：１５６１−７
［非特許文献５］ＹｏｓｈｉｊｉＨ，ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００１；７：１０７３−８
［非特許文献６］ＫｅｒｎＭＡ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００２；３６：８８５−９４
［非特許文献７］ＭｉｙａｚａｗａＫ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ２００１；１５：１１１１−７
［非特許文献８］ＫａｒＳ，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ２０００；１８５：３８６−９３
［非特許文献９］ＬｉＮ，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ１９９８；１７５：３５９−６９It is known that patients with hepatocellular carcinoma (HCC) have portal vein invasion (PVI) at a high rate, and once PVI occurs, the prognosis is extremely poor. It is known that a high value of Des-γ-Carboxy Prothrombin (hereinafter referred to as “DCP”) in HCC patients is closely related to subsequent PVI progress (for example, see Non-Patent Document 1). Here, DCP is a prothrombin that does not have normal clotting activity, and is known to increase in a situation where vitamin K (hereinafter referred to as “VK”) is deficient. VK deficiency / VK absorption disorder It is a protein used as a marker.
On the other hand, when VK is administered to DCP high-value HCC patients, the serum DCP value decreases (see, for example, Non-Patent Document 2), and VK-II is administered to DCP-producing HCC cell line in vitro. It has been reported that cell proliferation is suppressed (see, for example, Non-Patent Document 3).
Clinical studies on liver cancer include acyclic retinoid-induced inhibition of liver cancer recurrence (see, for example, Non-Patent Document 4), ACE inhibitor (for example, see Non-Patent Document 5), and COX2 inhibitor (for example, see Non-Patent Document 6). Inhibition of hepatocarcinogenesis, hepatoma cell proliferation and pro-apoptosis is known.
On the other hand, vitamin K2 is a cancer cell in leukemia cells, MDS cells (for example, see Non-patent Document 7), breast cancer cells (for example, see Non-Patent Document 8), fibroblasts (for example, see Non-Patent Document 9), and the like. It has been reported to inhibit proliferation.
However, a useful cancer disease therapeutic agent that is more excellent in cancer cell proliferation inhibitory action or cancer cell invasion inhibitory action has not yet been provided.
[Non-Patent Document 1] Koike Y. et al. Cancer 2001; 91: 561-9
[Non-Patent Document 2] Cancer 1992; 69: 31-8
[Non-Patent Document 3] Wang Z, Hepatology 1995; 22: 876-82
[Non-Patent Document 4] Muto Y, N Engl J Med 1996; 334: 1561-7
[Non-Patent Document 5] Yoshiji H, Clin Cancer Res 2001; 7: 1073-8
[Non-patent document 6] Kern MA, Hepatology 2002; 36: 885-94.
[Non-Patent Document 7] Miyazawa K, Leukemia 2001; 15: 1111-7
[Non-Patent Document 8] Kar S, J Cell Physiol 2000; 185: 386-93
[Non-Patent Document 9] Li N, J Cell Physiol 1998; 175: 359-69

そこで、本発明は、癌疾患治療に有用な、ＰＫＡ活性調節剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記事情に鑑み、ＰＫＡ活性調節剤を鋭意研究した結果、ビタミンＫ２（メナテトレノンまたはその塩）がＰＫＡを調節すること、ビタミンＫ２がＰＫＡを活性化すること、ビタミンＫ２がＰＫＡを活性化することにより、転写因子ＣＲＥ／ＣＲＥＢ，ＵＳＦ−１，ＡＰ−２の系が活性化されること、ビタミンＫ２がＰＫＡ活性化することにより肝癌細胞の増殖抑制作用及び浸潤抑制作用がもたらされること、を見出した。すなわち、肝癌細胞の増殖抑制作用及び浸潤抑制作用の機序としてＰＫＡ活性化が介在するという知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性調節剤と、
［２］メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性化剤と、
［３］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌疾患の予防又は治療剤と、
［４］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌細胞増殖抑制剤と、
［５］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌細胞浸潤抑制剤と、
［６］癌疾患の予防又は治療に用いられる、上記［２］記載のＰＫＡ活性化剤と、
［７］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，及びＵＳＦ−１の活性化剤と、
［８］メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性の変化に由来する疾患の予防又は治療剤と、
［９］メナテトレノンまたはその塩を対象物に有効量投与することを特徴とする、ＰＫＡ活性の調節法と、
［１０］ＰＫＡ活性化剤の製造のための、メナテトレノンまたはその塩の使用と、
［１１］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を、癌患者に投与するための医薬品キット、を提供する。Then, an object of this invention is to provide a PKA activity regulator useful for cancer disease treatment.
In view of the above circumstances, the present inventors have conducted extensive research on PKA activity regulators. As a result, vitamin K2 (menatetrenone or a salt thereof) regulates PKA, vitamin K2 activates PKA, and vitamin K2 is PKA. Activating the transcription factor CRE / CREB, USF-1 and AP-2 systems, and vitamin K2 activating PKA results in the inhibition of proliferation and invasion of liver cancer cells. I found out. That is, the present inventors have obtained the knowledge that PKA activation is mediated as a mechanism of hepatocarcinoma cell growth inhibitory action and invasion inhibitory action, thereby completing the present invention.
That is, the present invention
[1] a PKA activity modulator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient;
[2] a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient;
[3] a preventive or therapeutic agent for cancer diseases, comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient;
[4] A cancer cell growth inhibitor comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient,
[5] A cancer cell invasion inhibitor comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient,
[6] The PKA activator according to [2] above, which is used for prevention or treatment of cancer diseases,
[7] An activator of AP-2, CREB, and USF-1, comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient;
[8] A preventive or therapeutic agent for a disease caused by a change in PKA activity, comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient;
[9] A method for modulating PKA activity, comprising administering an effective amount of menatetrenone or a salt thereof to a subject;
[10] Use of menatetrenone or a salt thereof for the manufacture of a PKA activator;
[11] A pharmaceutical kit for administering a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient to a cancer patient.

図１は、肝癌細胞の増殖抑制に対するビタミンＫ２添加の効果を示したグラフである。
図２は、細胞周期に対するビタミンＫ２添加の効果を示したチャートである。
図３は、細胞の浸潤能に対するビタミンＫ２の効果を示したゲル写真である。
図４は、ビタミンＫ２添加による遺伝子発現変化を示した（ａ）グラフ，（ｂ）解析チャート写真である。
図５は、ビタミンＫ２添加による遺伝子発現量変化を示したＲＴ−ＰＣＲによる解析チャート写真である。
図６は、ビタミンＫ２添加による遺伝子発現の経時的変化を示した図である。
図７は、遺伝子ネットワークを示す図である。
図８は、ビタミンＫ２添加による蛋白質発現変化を示した（ａ）解析写真、（ｂ）グラフである。
図９は、ビタミンＫ２添加によるシグナル伝達経路の活性化を示した解析写真である。
図１０は、ビタミンＫ２添加によるシグナル伝達経路（ＡＰ−２）の活性化を示した解析写真である。
図１１は、ビタミンＫ２添加によるシグナル伝達経路（ＣＲＥＢ）の活性化を示した解析写真である。
図１２は、ビタミンＫ２添加によるＰＫＡの活性化を示した解析写真である。
図１３は、ＰＫＡｉｎｈｉｂｉｔｏｒによるビタミンＫ２の細胞増殖抑制作用の阻害を示すグラフである。
図１４は、ビタミンＫ２添加によるＲｈｏの活性化の抑制を示す解析写真である。FIG. 1 is a graph showing the effect of vitamin K2 addition on the suppression of proliferation of liver cancer cells.
FIG. 2 is a chart showing the effect of vitamin K2 addition on the cell cycle.
FIG. 3 is a gel photograph showing the effect of vitamin K2 on the invasive ability of cells.
FIG. 4 is (a) graph and (b) analysis chart photographs showing gene expression changes due to vitamin K2 addition.
FIG. 5 is an RT-PCR analysis chart showing changes in gene expression level due to vitamin K2 addition.
FIG. 6 shows changes over time in gene expression due to the addition of vitamin K2.
FIG. 7 is a diagram showing a gene network.
FIG. 8 shows (a) an analysis photograph and (b) a graph showing changes in protein expression due to the addition of vitamin K2.
FIG. 9 is an analysis photograph showing activation of a signal transduction pathway by addition of vitamin K2.
FIG. 10 is an analysis photograph showing activation of a signal transduction pathway (AP-2) by addition of vitamin K2.
FIG. 11 is an analysis photograph showing activation of a signal transduction pathway (CREB) by the addition of vitamin K2.
FIG. 12 is an analysis photograph showing activation of PKA by addition of vitamin K2.
FIG. 13 is a graph showing inhibition of the cell growth inhibitory action of vitamin K2 by PKAinhibitor.
FIG. 14 is an analysis photograph showing suppression of Rho activation by addition of vitamin K2.

以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明において用いるメナテトレノンは、好ましくはメナキノン−１〜１４であり、より好ましくはメナキノン４〜８であり、さらに好ましくはメナキノン−４である。
本発明において、癌疾患としては、肝癌等が挙げられる。慢性肝炎、肝硬変からは高率に肝癌が発癌し、いったん発癌するとさらに高率に再発する。例えば、Ｃ型肝炎やＢ型肝炎から肝硬変となり、腫瘍切除後、再発するケースがある。本発明に係るＰＫＡ調節剤によれば、このような肝癌治療後の予後を極めて有効に改善（再発の予防又は治療）することができる。また、予後不良な肝癌の再発形態の一つであるＰＶＩの発生を極めて有効に抑制することができる。
また、本発明において、ＰＫＡ活性の変化に由来する疾患としては、白血病、膵癌、卵巣癌などが挙げられる。
ＰＫＡ（ｃＡＭＰｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ）は、ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）などの種々の刺激によって細胞内濃度が高まったｃＡＭＰが、ＰＫＡのｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｕｂｕｎｉｔに結合することでＰＫＡのｃａｔａｌｙｔｉｃｓｕｂｕｎｉｔが遊離しはじめて活性を出す分子として知られている（ＷａｌｓｈＤＡ，ＦＡＳＥＢＪ１９９４；８：１２２７−３６）。活性化されたＰＫＡは下流のシグナル分子を活性化してさまざまな作用を細胞にもたらすが、細胞増殖の観点からＰＫＡを見ると、活性化されたＰＫＡは細胞の増殖に促進的に関わるという報告もあるのに対し、活性化ＰＫＡは癌細胞の増殖を抑えるという報告もある（ｖａｎＯｉｒｓｃｈｏｔＢＡ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００１；２７６：３３８５４−６０他）。
細胞内では様々な転写因子が働いて多くの遺伝子発現に寄与しているが、ＰＫＡは活性化されるとｃＡＭＰＲｅｓｐｏｎｓｅｖｅＥｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）に結合する転写因子であるＣＲＥＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）をリン酸化することで転写を活性化し、下流の遺伝子発現を調節していることが知られている。ＰＫＡが制御している転写因子にはＵＳＦ−１（ＸｉａｏＱ，ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＨｅａｒｔＣｉｒｃＰｈｙｓｉｏｌ２００２；２８３：Ｈ２１３−９）、ＡＰ−２（ＧａｒｃｉａＭＡ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ１９９９；４４４：２７−３１）など他にも多くのものが報告されており、その下流のシグナル伝達系の制御は極めて複雑なものと考えられる。
メナテトレノンは、ビタミンＫ２とも称され、イソプレニル基の数ｎによってメナキノン−ｎ（ＭＫ−ｎ）とも呼ばれる。２−メチル−１，４−ナフトキノン環の３位にイソプレニル基を持つ物質をビタミンＫ２（ＶｉｔａｍｉｎＫ２）と総称する。ビタミンＫ２にはイソプレニル基の数の違いによる同族体がある。メナテトレノンの構造式を以下に示す。

式中、ｎは、好ましくは１〜１４であり、より好ましくは４〜８である。特にｎが４である、２−メチル−３−テトラプレニル−１，４−ナフトキノン（２−ｍｅｔｈｌ−３−ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ；ＭＫ−４）が好ましい。
メナテトレノンは黄色の結晶又は油状の物質で、におい及び味はなく、光により分解しやすい。また、水にはほとんど溶けない。メナテトレノン（ビタミンＫ２）の薬理作用は、血液凝固因子（プロトロンビン、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）のタンパク合成過程で、グルタミン酸残基が生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシル化反応に関与するものであり、正常プロントロビン等の肝合成を促進し、生体の止血機構を賦活して生理的に止血作用を発現するものである。
本発明に係る医薬の有効成分であるメナテトレノンは、塩を形成していてもよく、かかる塩における好ましい例としては、ハロゲン化水素酸塩（例：フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（例：硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）有機カルボン酸塩（例：酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例：メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例：アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例：ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例：マグネシウム塩、カルシウム塩等）等があげられる。
本発明に係る医薬の有効成分であるメナテトレノンまたはその塩は、無水物であってもよいし、水和物を形成していてもよい。また、メナテトレノンまたはその塩には結晶多形が存在することもあるが同様に限定されず、いずれかの結晶形が単一であってもよいし、結晶形混合物であってもよい。さらに、本発明に用いるメナテトレノンまたはその塩が生体内で分解されて生じる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。
本発明において用いるメナテトレノンは、公知の方法で製造することができ、代表的な例として、特開昭４９−５５６５０号公報に開示される方法によれば容易に製造することができる他、合成メーカーから容易に入手することもできるし、公知の方法に準じて塩にすることもできる。また、メナテトレノンはカプセル剤、注射剤等の製剤としても入手できる。
本発明に係る医薬は、メナテトレノンをそのまま用いてもよいし、または、公知の薬学的に許容できる担体等（例：賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、等）、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化してもよい。また、必要に応じて、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤、等の成分を配合してもよい。製剤化の剤形としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、凍結乾燥剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等があげられる。
また、本発明においては、メナテトレノンの投与形態は特に限定されないが、経口的に投与することが好ましい。メナテトレノンのカプセル剤は商品名ケイツーカプセル（エーザイ株式会社製）として、またシロップ剤は商品名ケイツーシロップ（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
本発明に係るメナテトレノン含有医薬は、哺乳類（例：ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル等）の肝疾患治療・予防に有用で、特に、ヒトの肝疾患の治療・予防に有用である。メナテトレノンの好ましい投与量としては通常は１０〜１００ｍｇ／日であり、更に好ましくは３０〜６０ｍｇ／日である。EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these.
Menatetrenone used in the present invention is preferably menaquinone-1 to 14, more preferably menaquinone 4 to 8, and further preferably menaquinone-4.
In the present invention, examples of the cancer disease include liver cancer. From chronic hepatitis and cirrhosis, liver cancer develops at a high rate, and once it begins, it recurs at a higher rate. For example, there are cases where cirrhosis occurs from hepatitis C or hepatitis B and recurs after tumor resection. According to the PKA modulator of the present invention, the prognosis after treatment of such liver cancer can be improved very effectively (prevention or treatment of recurrence). Moreover, generation | occurrence | production of PVI which is one of the recurrence forms of liver cancer with a poor prognosis can be suppressed very effectively.
In the present invention, examples of diseases derived from changes in PKA activity include leukemia, pancreatic cancer, and ovarian cancer.
PKA (cAMP dependent protein kinase A) binds to the regulatory subunit of PKA when cAMP whose intracellular concentration has been increased by various stimuli such as epidermal growth factor (EGF) and binds to PKA regulatory subunit. It is known as a releasing molecule (Walsh DA, FASEB J 1994; 8: 1227-36). Activated PKA activates downstream signaling molecules to bring about various effects on cells. From the viewpoint of cell proliferation, PKA has been reported to be actively involved in cell proliferation. In contrast, there are reports that activated PKA suppresses the growth of cancer cells (van Oirschot BA, J Biol Chem 2001; 276: 33854-60 et al.).
Although various transcription factors work in cells and contribute to the expression of many genes, PKA phosphorylates CRE Binding Protein (CREB), which is a transcription factor that binds to cAMP Response Element (CRE) when activated. Is known to activate transcription and regulate downstream gene expression. Transcription factors regulated by PKA include USF-1 (Xiao Q, Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002; 283: H213-9), AP-2 (Garcia MA, FEBS Lett 1999; 444: 27-31), etc. Many others have been reported, and the control of the signal transduction system downstream thereof is considered to be extremely complicated.
Menatetrenone is also referred to as vitamin K2, and is also referred to as menaquinone-n (MK-n) depending on the number n of isoprenyl groups. Substances having an isoprenyl group at the 3-position of the 2-methyl-1,4-naphthoquinone ring are collectively referred to as vitamin K2 (Vitamin K2). Vitamin K2 has homologues due to the difference in the number of isoprenyl groups. The structural formula of menatetrenone is shown below.

In formula, n becomes like this. Preferably it is 1-14, More preferably, it is 4-8. In particular, n is 4 and 2-methyl-3-tetraprenyl-1,4-naphthoquinone (2-methl-3-tetraprenyl-1,4-naphthoquinone; MK-4) is preferable.
Menatetrenone is a yellow crystalline or oily substance, has no smell and taste, and is easily decomposed by light. Moreover, it hardly dissolves in water. The pharmacological action of menatetrenone (vitamin K2) is involved in the carboxylation reaction when glutamic acid residues are converted to γ-carboxyglutamic acid having physiological activity during protein synthesis of blood coagulation factors (prothrombin, VII, IX, X). It promotes liver synthesis such as normal prothrobin and activates the hemostasis mechanism of the living body to physiologically express the hemostasis action.
Menatetrenone, which is an active ingredient of the medicament according to the present invention, may form a salt. Preferred examples of such a salt include hydrohalides (eg, hydrofluoride, hydrochloride, hydrogen bromide). Acid salt, hydroiodide salt, etc.), inorganic acid salt (eg sulfate, nitrate, perchlorate, phosphate, carbonate, bicarbonate etc.) organic carboxylate (eg acetate, tri Fluoroacetate, oxalate, maleate, tartrate, fumarate, citrate, etc.), organic sulfonates (eg methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfone) Acid salt, toluene sulfonate, camphor sulfonate, etc.), amino acid salt (eg, aspartate, glutamate, etc.), quaternary amine salt, alkali metal salt (eg, sodium salt, potassium salt, etc.), al Li earth metal salt (e.g. magnesium salt, calcium salt, etc.) and the like.
Menatetrenone or a salt thereof, which is an active ingredient of the medicament according to the present invention, may be an anhydride or may form a hydrate. Further, although menatetrenone or a salt thereof may have a crystal polymorph, it is not limited in the same manner, and any crystal form may be single or a crystal form mixture. Furthermore, the metabolite produced by degrading menatetrenone or a salt thereof used in the present invention in vivo is also included in the scope of the claims of the present invention.
Menatetrenone used in the present invention can be produced by a known method. As a representative example, menatetrenone can be easily produced by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 49-55650. Can be easily obtained, or can be converted into a salt according to a known method. Menatetrenone can also be obtained as preparations such as capsules and injections.
Menatetrenone may be used as it is for the medicament according to the present invention, or a known pharmaceutically acceptable carrier or the like (eg, excipient, binder, disintegrant, lubricant, coloring agent, flavoring agent). , Stabilizers, emulsifiers, absorption accelerators, surfactants, pH adjusters, preservatives, antioxidants, etc.), and ingredients that are generally used as raw materials for pharmaceutical preparations, and are formulated by conventional methods. Also good. Moreover, you may mix | blend components, such as a blood-flow promoter, a disinfectant, an anti-inflammatory agent, a cell activator, vitamins, an amino acid, a moisturizer, and a keratolytic agent, as needed. As the dosage form for preparation, tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, capsules, syrups, troches, inhalants, suppositories, injections, freeze-dried agents, ointments, ophthalmic ointments Eye drops, nasal drops, ear drops, poultices, lotions and the like.
In the present invention, the administration form of menatetrenone is not particularly limited, but is preferably administered orally. Menatetrenone capsules can be obtained under the trade name K2 capsule (manufactured by Eisai Co., Ltd.), and syrups can be obtained under the trade name K2 syrup (manufactured by Eisai Co., Ltd.).
The menatetrenone-containing medicament according to the present invention is useful for the treatment and prevention of liver diseases in mammals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, horses, monkeys, etc.), and in particular, treatment and prevention of human liver diseases. Useful for. A preferred dose of menatetrenone is usually 10 to 100 mg / day, more preferably 30 to 60 mg / day.

以下に本発明の実施例を挙げるが、これらは例示的なものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は、以下に示す実施例のみならず本特許請求の範囲に様々な変更を加えて実施することが可能であり、かかる変更も本特許請求の範囲に包含される。
〔ビタミンＫ２による肝癌細胞増殖抑制〕
代表的な肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２を用いた系に、ＭＫ−４（ビタミンＫ２）を２×１０^−５，６×１０^−５，８×１０^−５，１０×１０^−５Ｍの各濃度になるように添加し、経時的に細胞増殖の程度をＭＴＴａｓｓａｙ（ＭＴＴアッセイ）で測定した。
図１は、肝癌細胞の増殖抑制に対するビタミンＫ２添加の効果を示したグラフである。図１に示すように、ビタミンＫ２添加後１日目，２日目では細胞増殖の程度にそれほど変化は認められなかったが、３日目，５日目になると、ビタミンＫ２濃度に依存して生細胞の数が抑制された。また、図１に示す結果から、ビタミンＫ２のＨｅｐＧ２細胞増殖５０％抑制濃度は、約５×１０^−５Ｍであると考えられる。
次に、この肝癌細胞増殖抑制作用が、細胞周期のどのステージで効果を発揮しているのかを調べるため、ＭＫ−４を５×１０^−５Ｍの濃度になるように添加した後５日間経過したＨｅｐＧ２細胞を、核染色して、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ；蛍光標示式細胞分取器）で細胞周期を測定した。図２にチャートを示すように、Ｇ１期及びＧ２／Ｍ期の細胞分画が増え、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）の細胞分画が相対的に減少していることが分かった。これより、主に細胞周期の停止が細胞増殖抑制につながっていることが分かった。
〔ビタミンＫ２による肝癌細胞浸潤能の抑制〕
次に、ビタミンＫ２が細胞の浸潤能に与える影響を、ＨｅｐＧ２細胞とマトリゲルチャンバーを用いたｉｎｖａｓｉｏｎａｓｓａｙで検討した。すなわち、小さな孔のあいたゲルの上層に細胞をまき、下層に走化性因子を含んだ培養液を入れ、細胞が上層から下層に浸潤する数を数えることで、浸潤能を判定した。その際に、上層の培養液中にＭＫ−４（ビタミンＫ２）をＯＭ，４×１０^−５Ｍ，８×１０^−５Ｍの濃度になるように添加し、まだ細胞増殖に影響のない２４時間経過後に下層に出てきた細胞を染色し、その数を数えることで浸潤能に与える影響を検討した。図３に各濃度におけるゲル写真を示すように、ビタミンＫ２は濃度依存的に癌細胞の浸潤を抑制した。
以上の結果より、ビタミンＫ２は肝癌細胞の増殖に関わるだけでなく細胞の浸潤能を抑制する作用も有することが分かった。
〔ビタミンＫ２による細胞の遺伝子発現への影響〕
ビタミンＫ２添加による細胞の遺伝子発現への影響をｃＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ｃＤＮＡマイクロアレイ）を用いて検討した。
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４（ビタミンＫ２）を５×１０^−５Ｍの濃度になるように添加した後、ＨｅｐＧ２細胞を４日後に回収しＲＮＡを抽出し、次いでこれをラベルした。次に、これを、肝臓や胃組織から抽出したｃＤＮＡを約４３００種類搭載したｉｎ−ｈｏｕｓｅのｃＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて遺伝子発現プロファイルを解析した（図４（ｂ））。
図４（ａ）は、横軸にビタミンＫ２非添加細胞（コントロール）を、縦軸にＭＫ−４添加細胞をＳｃａｔｔｅｒｐｌｏｔした遺伝子発現プロファイルである。図４（ａ）において、縦軸及び横軸はいずれもシグナル強度（ｌｏｇｓｃａｌｅ）を示し、赤い点（図４（ａ）中におけるＲ部分）は２倍以上あるいは０．５倍以下の発現変化を示した遺伝子を示す。図４（ａ）に示すように、２倍以上あるいは０．５倍以下の遺伝子発現量変化を示した遺伝子は約１０％弱に認められた。特に、細胞接着因子（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｂｅｔａ１，Ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＣＤ４４），ＩｎｔｅｇｒｉｎａｌｐｈａＸ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｂｅｔａ２，ＩｎｔｅｇｒｉｎａｌｐｈａＭ，Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）、アポトーシス関連遺伝子（ＧＡＤＤ３４）、細胞周期関連遺伝子（ＣｙｃｌｉｎＥ，ＣｙｃｌｉｎＧ）などの遺伝子発現量に変化が認められた。このようなＭＫ−４添加による遺伝子発現変化が、細胞増殖抑制や浸潤転移抑制につながるものと考えられる。
また、ＨｅｐＧ２細胞の一部（Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ，ＧＡＤＤ３４，Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＰｒｏｔｅｉｎ，ＣｙｃｌｉｎＧ，ＣＤ４４，ＣｙｃｌｉｎＥ）について、ＲＴ−ＰＣＲにより発現量変化を確認した（図５）。
さらに、図６に示すように、ＭＫ−４を添加後１日目，２日目，３日目と経時的に遺伝子変化を解析した。図６は縦方向に今回検討した約４３００遺伝子をならべて、非添加細胞に比べてｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ダウンレギュレーション）している遺伝子を緑（図６中におけるＧ部分）、ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（アップレギュレーション）している遺伝子を赤（図６中におけるＲ部分）で描画したものである。図６に示すように、時間が経過するにつれて遺伝子の発現が変化することが明らかとなった。
図７に、上記の遺伝子発現の経時的な変化に基づいて遺伝子ネットワークを描出した図を示す。図７に示すこれらの遣伝子は発現変化を共にしているものであり、遺伝子発現の制御が近似しているものと考えられる。
次に、ＭＫ−４が遺伝子発現に変化を及ぼすことを蛋白レベルで確認した。ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０^−５Ｍになるように添加し、細胞を４日後に回収し蛋白を抽出、二次元電気泳動後、銀染色を行った。図８にその結果を示すように、ＭＫ−４の添加細胞と非添加細胞との間では、蛋白レベルでも遺伝子発現に違いが見られることが確認された。
以上の結果から、ＭＫ−４が細胞の遺伝子発現に影響を及ぼすことが明らかとなった。すなわち、ＭＫ−４による癌細胞増殖抑制作用や浸潤抑制作用の機序として、これらの遺伝子発現の変化が関係していることが分かった。
〔ビタミンＫ２により活性化されるシグナル伝達経路〕
ビタミンＫ２が、どのような経路を介して遺伝子発現を制御しているのかを調べるために、５４種（ＡＰ１ＡＰ２ＡＲＥＢｒｍ３Ｃ／ＥＢＰＣＢＦＣＤＰｃ−ＭｙｂＡＰ１ＣＲＥＢＥ２ＦｌＥＧＲＥＲＥＥｔｓＰＥＡ３ＦＡＳＴ１ＩＳＲＥＡＰ２ＧＡＴＡＧＲＥＨＮＦ４ＩＲＦ１ＭＥＦ１ＭＥＦ２Ｍｙｃ−ＭａｘＮＦ１ＣＲＥＢＮＦＡＴＮＦＥ１ＮＦＥ２ＮＦｋＢＯｃｔ１ｐ５３Ｐａｘ５Ｐｂｘ１ＥＧＲＰｉｔ１ＰＰＡＲＰＲＥＲＡＲＲＸＲＳＩＥＳＢＥＳｍａｄ３／４Ｓｐ１ＳＲＥＳｔａｔ１Ｓｔａｔ３Ｓｔａｔ４Ｓｔａｔ５Ｓｔａｔ６ＴＦＩＩＤＴＲＤＲ４ＵＳＦ１ＶＤＲＨＳＥＭＲＥ）の転写因子の活性化の有無について検討した。
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０^−５Ｍとなるように添加し、最初の変化を同定するために、２時間，１２時間という比較的短時間で細胞を回収し、その核抽出物を抽出した。核抽出物と上記の転写因子の結合配列ＤＮＡｐｒｏｂｅｍｉｘとを混合した後、転写因子が結合したｐｒｏｂｅのみを回収し、それらｐｒｏｂｅと相補的な配列を搭載したアレイとハイブリダイズさせ転写因子が結合したＤＮＡｐｒｏｂｅ（すなわち活性化された転写因子経路）の量を判定し、その転写因子経路の活性化の程度とした。その結果を図９に示すように、ビタミンＫ２の添加により、上記５４種の経路のうち、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，ＵＳＦ１の系が活性化されていることが明らかとなった。
さらに、ＭＫ−４添加前（０時間）と添加後２，６，１２，２４，４８時間経過後の核抽出物と、ＡＰ−２ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｐｒｏｂｅを用いたゲルシフトアッセイを行った。その結果を図１０に示すように、添加後にはＭＫ−４添加前に比べてＤＮＡとの蛋白結合が増えていることが分かった。
また、ＣＲＥＢ，ＵＳＦ−１についても同様にゲルシフトアッセイを行ったところ、ＭＫ−４添加前に比べて添加後２，６時間経過後でＤＮＡと蛋白の結合が増えていることが分かった（データは図示せず）。
ＣＲＥＢについて、ｐＥＧＦＰ−ＣＲＥＢ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨｅｐＧ２にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、蛍光観察した結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＭＫ−４添加によって、この蛍光のシグナル（光量）が添加前に比べて経時的に増したことから、ＣＲＥＢが活性化したことが分かった。
以上の結果より、ビタミンＫ２の添加により、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，ＵＳＦ−１の各転写因子が活性化されることが明らかとなった。
〔ビタミンＫ２によるＰＫＡの活性化〕
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０^−５Ｍとなるように添加した後、これを蛍光標識した。この細胞の溶解液に、ＰＫＡの基質ペプチドを混合し、これを電気泳動させた。この結果を図１２に示す。ＰＫＡの基質ペプチドはもともとプラス（＋）に荷電しており、蛍光標識したＰＫＡの基質ペプチドと細胞の溶解液を混合することにより、細胞内のＰＫＡが活性化されている場合には基質ペプチドをリン酸化する結果、基質をマイナス（−）に荷電させることにより、＋極へ移動する。すなわち、リン酸化を受けた場合（すなわち、ＰＫＡが活性化されている場合）は＋極へ、リン酸化を受けない場合（すなわち、ＰＫＡが活性化されていない場合）は−極側へ移動することになる。
図１２に示すように、ＭＫ−４を添加してから２時間経過した時点において、＋極へ移動したことから、ＭＫ−４によりＰＫＡが活性化されたことが分かった。
〔肝癌細胞増殖におけるＰＫＡ活性の役割〕
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０^−５Ｍとなるように添加した後にＰＫＡのｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｈ８９）４０μＭを添加したグループ、Ｈ８９だけを加えたグループ、ＭＫ−４のみを加えたグループ、何も添加しないもの（コントロール）について、添加後４日目にＭＴＴａｓｓａｙを試行し、ＭＫ−４添加による細胞の増殖を検討した。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、ＭＫ−４及びＨ８９を添加したグループは、コントロールほどには細胞増殖はしなかったものの、ＭＫ−４単独添加グループよりも細胞の数は明らかに増えた。これより、ＭＫ−４添加による細胞増殖抑制作用を、Ｈ８９が一部ではあるもののキャンセル（解除）することが分かった。
この結果から、ビタミンＫ２添加による肝癌細胞増殖抑制作用は、少なくとも一部はＰＫＡの活性化を介しているものと考えられる。
〔ビタミンＫ２によるＲｈｏの活性抑制作用〕
Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤと細胞溶解液を混ぜた後、Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤをｐｕｌｌｄｏｗｎして結合したＲｈｏ蛋白の量をプロットすることで、Ｒｈｏ蛋白の活性化にビタミンＫ２が何らかの関与を持つか検討した。
Ｒｈｏ蛋白は活性化されるとＧＴＰが結合したＧＴＰ−Ｒｈｏとなるが、この活性化Ｒｈｏとは、Ｒｈｏｔｅｋｉｎという蛋白のＲｈｏＢｉｎｄｉｎｇＤｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）が高いａｆｆｉｎｉｔｙで結合することが知られている（ＲｅｎＸＤ，ＥＭＢＯＪ１９９９；１８：５７８−８５）。Ｒｈｏは、癌の浸潤転移に重要な役割をしていると考えられている低分子量Ｇ蛋白である（ＣｌａｒｋＥＡ，Ｎａｔｕｒｅ２０００；４０６：５３２−５）。
ＨｅｐＧ２細胞を用いてコントロールと、ＭＫ−４を５×１０^−５Ｍおよび１０×１０^−５Ｍで添加したもの、５×１０^−５Ｍ添加の上にＨ８９を４０μＭ加えたもので、６時間経過後に細胞を回収しＲｈｏの活性化を検討した結果を図１４に示す。
図１４に示すように、ＭＫ−４濃度に依存してＲｈｏの活性化は抑制され、この効果はＨ８９でキャンセルされた。Ｒｈｏの活性化をＰＫＡが制御するという報告がなされており（ＦａｕｃｈｅｕｘＮ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２００２；２３：２２９５−３０１；ＭａｎｇａｎｅｌｌｏＪＭ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２００２）、今回の結果から、ビタミンＫ２はＲｈｏの活性化を抑制しその作用はＰＫＡを介していることが分かった。
以上の結果から、ビタミンＫ２は、ビタミンＫ依存性γグルタミルカルボキシラーゼの補酵素として機能するよりも数倍高い濃度域においてＰＫＡを活性化し、これにより肝癌細胞の増殖抑制作用、及び浸潤能抑制作用を有し、様々な遺伝子発現を制御することが判明した。Examples of the present invention will be given below, but these are illustrative and the present invention is not limited to these examples. Those skilled in the art can implement various modifications to the claims as well as the embodiments shown below, and such modifications are also included in the claims.
[Inhibition of liver cancer cell growth by vitamin K2]
In a system using HepG2, which is a typical liver cancer cell line, MK-4 (vitamin K2) at concentrations of 2 × 10 ⁻⁵ , 6 × 10 ⁻⁵ , 8 × 10 ⁻⁵ and 10 × 10 ⁻⁵ M And the degree of cell proliferation over time was measured by MTT assay (MTT assay).
FIG. 1 is a graph showing the effect of vitamin K2 addition on the suppression of proliferation of liver cancer cells. As shown in FIG. 1, there was no significant change in the degree of cell growth on the first and second days after the addition of vitamin K2, but on the third and fifth days, depending on the vitamin K2 concentration The number of viable cells was suppressed. Moreover, from the result shown in FIG. 1, it is considered that the 50% inhibitory concentration of vitamin K2 on HepG2 cell proliferation is about 5 × 10 ⁻⁵ M.
Next, in order to investigate in which stage of the cell cycle this hepatocarcinoma cell growth inhibitory effect is exerting an effect, 5 days have passed since MK-4 was added to a concentration of 5 × 10 ⁻⁵ M. The HepG2 cells thus obtained were subjected to nuclear staining, and the cell cycle was measured by FACS (fluorescence-activated cell sorter). As shown in the chart of FIG. 2, it was found that the cell fractions in the G1 phase and the G2 / M phase increased and the cell fraction in the S phase (DNA synthesis phase) relatively decreased. From this, it was found that cell cycle arrest mainly led to cell growth suppression.
[Inhibition of liver cancer cell invasion by vitamin K2]
Next, the influence of vitamin K2 on the invasion ability of cells was examined by inversion assay using HepG2 cells and a Matrigel chamber. That is, cells were spread on the upper layer of a gel with small pores, a culture solution containing a chemotactic factor was added to the lower layer, and the number of cells infiltrating from the upper layer to the lower layer was counted to determine the invasion ability. At that time, MK-4 (vitamin K2) was added to the culture medium of the upper layer so as to have a concentration of OM, 4 × 10 ⁻⁵ M, 8 × 10 ⁻⁵ M, and the cell growth was not yet affected. The effect on the invasion ability was examined by staining cells counted in the lower layer after the passage of time. As shown in the gel photograph at each concentration in FIG. 3, vitamin K2 suppressed infiltration of cancer cells in a concentration-dependent manner.
From the above results, it was found that vitamin K2 has an action of suppressing the invasion ability of cells as well as being involved in the proliferation of hepatoma cells.
[Effect of vitamin K2 on cellular gene expression]
The effect of vitamin K2 addition on cell gene expression was examined using cDNA microarray (cDNA microarray).
After MK-4 (vitamin K2) was added to HepG2 cells to a concentration of 5 × 10 ⁻⁵ M, HepG2 cells were collected after 4 days to extract RNA, and then labeled. Next, the gene expression profile was analyzed using an in-house cDNA microarray in which about 4300 kinds of cDNA extracted from liver and stomach tissues were mounted (FIG. 4 (b)).
FIG. 4A shows a gene expression profile obtained by scatter plotting cells without vitamin K2 (control) on the horizontal axis and MK-4 added cells on the vertical axis. In FIG. 4 (a), both the vertical axis and the horizontal axis indicate the signal intensity (logscale), and the red dot (the R portion in FIG. 4 (a)) indicates an expression change of 2 times or more or 0.5 times or less. The indicated genes are indicated. As shown in FIG. 4 (a), genes showing a change in gene expression level of 2 times or more or 0.5 times or less were found to be about 10% or less. In particular, cell adhesion factor (Fibrectin, Desmoplatin, Integrin beta 1, Cell adhesion molecule (CD44), Integrin alpha X, Integrin beta 2, Integrin alpha M, Fibromodulin gene, Apoptosis C gene , Cyclin G) and other gene expression levels were changed. It is considered that such gene expression change due to the addition of MK-4 leads to suppression of cell proliferation and suppression of invasion and metastasis.
Moreover, the expression level change was confirmed by RT-PCR about a part of HepG2 cell (Fibromodulin, GADD34, Fibronectin, Progression Associated Protein, CyclinG, CD44, CyclinE) (FIG. 5).
Furthermore, as shown in FIG. 6, gene changes were analyzed over time on the first day, the second day, and the third day after the addition of MK-4. FIG. 6 shows about 4300 genes examined this time in the vertical direction, and the down-regulated genes in green (G part in FIG. 6) and up-regulation (up-regulation) compared to non-added cells. The drawn genes are drawn in red (R portion in FIG. 6). As shown in FIG. 6, it was revealed that the gene expression changes with time.
FIG. 7 shows a diagram depicting a gene network based on the above-described changes in gene expression over time. These genes shown in FIG. 7 are accompanied by changes in expression, and it is considered that the control of gene expression is approximate.
Next, it was confirmed at the protein level that MK-4 had a change in gene expression. MK-4 was added to HepG2 cells so as to have a concentration of 5 × 10 ⁻⁵ M, and the cells were collected after 4 days to extract proteins, followed by two-dimensional electrophoresis and silver staining. As shown in FIG. 8, it was confirmed that there was a difference in gene expression at the protein level between cells with and without MK-4 added.
From the above results, it was revealed that MK-4 affects cell gene expression. That is, it was found that these gene expression changes are related as a mechanism of cancer cell proliferation inhibitory action and invasion inhibitory action by MK-4.
[Signal transduction pathway activated by vitamin K2]
54 types (AP1 AP2 ARE Brm3 C / EBP CBF CDP c-Myb AP1 CREB E2Fl EGR ERE Ets PEA3 FAST1 ISRE AP2 GATA were examined in order to investigate the pathway through which vitamin K2 regulates gene expression. of GRE HNF4 IRF1 MEF1 MEF2 Myc-Max NF1 CREB NFAT NFE1 NFE2 NFkB Oct1 p53 Pax5 Pbx1 EGR Pit1 PPAR PRE RAR RXR SIE SBE Smad3 / 4 Sp1 SRE Stat1 Stat3 Stat4 Stat5 Stat6 TFIID TRDR4 USF1 VDR activation of the transcription factor of the HSE MRE) The presence or absence was examined.
MK-4 was added to HepG2 cells to 5 × 10 ⁻⁵ M, and in order to identify the first change, the cells were collected in a relatively short time of 2 hours and 12 hours, and the nuclear extract was recovered. Extracted. After mixing the nuclear extract and the above-mentioned transcription factor binding sequence DNA probe mix, only the probe to which the transcription factor is bound is recovered and hybridized with an array loaded with a sequence complementary to the probe to bind the transcription factor. The amount of DNA probe (ie, activated transcription factor pathway) was determined, and the degree of activation of the transcription factor pathway was determined. As a result, as shown in FIG. 9, it was clarified that the addition of vitamin K2 activated the AP-2, CREB, USF1 system among the 54 pathways.
Further, a gel shift assay was performed using the nuclear extract before addition of MK-4 (0 hour) and after 2, 6, 12, 24, and 48 hours after addition, and AP-2 consensus probe. As shown in FIG. 10, it was found that the protein binding to DNA increased after the addition compared to before MK-4 addition.
In addition, when CREB and USF-1 were similarly subjected to gel shift assay, it was found that the binding between DNA and protein increased after a lapse of 2 to 6 hours after addition of MK-4 (data). Is not shown).
With respect to CREB, pEGFP-CREB (Clontech) was transfected into HepG2 and the result of fluorescence observation is shown in FIG. As shown in FIG. 11, the addition of MK-4 increased the fluorescence signal (light quantity) over time compared to before addition, indicating that CREB was activated.
From the above results, it has been clarified that addition of vitamin K2 activates AP-2, CREB, and USF-1 transcription factors.
[Activation of PKA by vitamin K2]
MK-4 was added to HepG2 cells to 5 × 10 ⁻⁵ M, and this was fluorescently labeled. The cell lysate was mixed with a PKA substrate peptide and electrophoresed. The result is shown in FIG. The PKA substrate peptide is originally charged positively (+). When the intracellular PKA is activated by mixing the fluorescently labeled PKA substrate peptide and the cell lysate, the substrate peptide is As a result of phosphorylation, the substrate is charged to minus (−), and moves to the + pole. That is, when phosphorylation is performed (that is, when PKA is activated), it moves to the positive pole, and when phosphorylation is not performed (that is, when PKA is not activated), it moves to the negative pole side. It will be.
As shown in FIG. 12, when 2 hours had passed since the addition of MK-4, it moved to the positive pole, indicating that PKA was activated by MK-4.
[Role of PKA activity in hepatoma cell proliferation]
A group in which 40 μM of PKA specific inhibitor (H89) was added after adding MK-4 to HepG2 cells to 5 × 10 ⁻⁵ M, a group in which only H89 was added, a group in which only MK-4 was added, what For those not added (control), MTT assay was tried on the 4th day after the addition, and the proliferation of cells by addition of MK-4 was examined. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 13, the group to which MK-4 and H89 were added did not proliferate as much as the control, but the number of cells was clearly increased compared to the group to which MK-4 was added alone. From this, it was found that the cell growth inhibitory action by the addition of MK-4 was canceled (released) although H89 was a part.
From this result, it is considered that at least a part of the liver cancer cell growth inhibitory action by the addition of vitamin K2 is mediated by PKA activation.
[Inhibition of Rho activity by vitamin K2]
After mixing Rhotekin-RBD and cell lysate, whether Rhovitain-RBD was pulled down and the amount of Rho protein bound was plotted, and it was examined whether vitamin K2 had any involvement in Rho protein activation.
When the Rho protein is activated, it becomes GTP-Rho in which GTP is bound, and this activated Rho is known to bind with high affinity to Rho Binding Domain (RBD), a protein called Rhotekin (Ren). XD, EMBO J 1999; 18: 578-85). Rho is a low molecular weight G protein that is thought to play an important role in cancer invasive metastasis (Clark EA, Nature 2000; 406: 532-5).
Control using HepG2 cells, MK-4 added at 5 × 10 ⁻⁵ M and 10 × 10 ⁻⁵ M, 5 × 10 ⁻⁵ M added and H89 added at 40 μM, 6 hours FIG. 14 shows the result of examining the activation of Rho after recovering cells after the passage.
As shown in FIG. 14, Rho activation was suppressed depending on the MK-4 concentration, and this effect was canceled by H89. It has been reported that PKA regulates Rho activation (Faucheux N, Biomaterials 2002; 23: 2295-301; Manganello JM, J Biol Chem 2002). From this result, vitamin K2 is responsible for Rho activation. It was found that its action was mediated through PKA.
From the above results, vitamin K2 activates PKA in a concentration range several times higher than that functioning as a coenzyme of vitamin K-dependent γ-glutamylcarboxylase, thereby inhibiting the proliferation of liver cancer cells and the invasion ability. Have been found to control various gene expression.

本発明に係るＰＫＡ活性調節剤は、癌疾患治療の予防又は治療に有用である。本発明に係るＰＫＡ活性化剤によれば、癌細胞増殖抑制及び／又は癌細胞浸潤抑制に有用である。 The PKA activity modulator according to the present invention is useful for the prevention or treatment of cancer disease treatment. The PKA activator according to the present invention is useful for suppressing cancer cell proliferation and / or suppressing cancer cell invasion.

Claims

A PKA activity regulator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

A PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

A preventive or therapeutic agent for cancer diseases, comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

A cancer cell growth inhibitor comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

A cancer cell invasion inhibitor comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

The PKA activator according to claim 2, which is used for prevention or treatment of cancer diseases.

An activator of AP-2, CREB, and USF-1, comprising a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

A preventive or therapeutic agent for a disease derived from a change in PKA activity, comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient.

A method for modulating PKA activity, comprising administering an effective amount of menatetrenone or a salt thereof to a subject.

Use of menatetrenone or a salt thereof for the manufacture of a PKA activator.

A pharmaceutical kit for administering a PKA activator comprising menatetrenone or a salt thereof as an active ingredient to a cancer patient.