JPWO2004022599A1 - Fusion antibody and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
本発明は、従来のようにターゲット物質毎に動物を免疫したり、ハイブリドーマを作成する必要がなく、簡単且つ安価に調製することのできる抗体、及びその作成方法を提供する。目的とするターゲット物質の種類に応じて、該ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを調製し、これを所定の抗原に連結し、該抗原に対する抗体と結合させることにより、目的とするターゲット物質に結合する融合抗体を得る。前記ペプチドは、前記ターゲット物質に対して結合性を有する少なくとも２種類のペプチドからなることが好ましい。また、前記ペプチドは、異なるターゲット物質に対して結合性を有する複数種類のペプチドからなることが好ましい。更に、前記ペプチドは、スペーサーを介して前記抗原に連結されていることが好ましい。The present invention provides an antibody that can be prepared easily and inexpensively without the need for conventional immunization of animals or preparation of hybridomas for each target substance, and a method for producing the same. According to the type of the target substance of interest, a peptide having binding properties to the target substance is prepared, and this is linked to a predetermined antigen and bound to an antibody against the antigen, thereby obtaining the target substance of interest A fusion antibody that binds to is obtained. It is preferable that the peptide consists of at least two types of peptides having binding properties to the target substance. Moreover, it is preferable that the said peptide consists of multiple types of peptides which have binding property with respect to a different target substance. Furthermore, the peptide is preferably linked to the antigen via a spacer.
Description
本発明は、目的とするターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを、所定の抗原と連結し、該抗原に対する抗体と結合させることにより、該ターゲット物質に対する結合能を付与した融合抗体及びその作成方法に関する。 The present invention relates to a fusion antibody imparted with binding ability to a target substance by linking a peptide having binding ability to a target substance of interest to a predetermined antigen and binding to an antibody against the antigen, and preparation thereof Regarding the method.
免疫反応の中心的な役割を担うタンパク質である抗体は、特定の抗原を認識して結合するという性質を有しており、従来より、抗体の特異性を利用した様々な検出・測定試薬が開発されている。また、近年では、抗体を利用した医薬品（抗体医薬）の開発も盛んに行なわれている。
通常、所定の抗原に対する抗体は、その抗原を動物に接種し、その血清から精製する方法やハイブリドーマ法により調製されている。また、近年では、抗体の一部（擬似Ｆａｂフラグメント）のライブラリをファージに呈示させて、抗原と結合する抗体を得る方法（抗体擬似Ｆａｂファージディスプレイ法）も開発されている。
しかし、血清から精製する方法やハイブリドーマ法では、所望の抗体を得るまでに、ポリクローナル抗体で２〜５ヶ月、モノクローナル抗体では５ヶ月以上の期間を要すること、抗体の大量調製が難しいこと、抗体作成のためのコストが高いこと、技術上特定の担当者しか作成できないこと等の問題があった。また、動物を用いる場合は、倫理上の問題も指摘されていた。
一方、抗体擬似Ｆａｂファージディスプレイ法では、可変部のアミノ酸数が多い（軽鎖で約３０〜５５、重鎖で約４０〜４５アミノ酸と言われている。）ため、バリエーションの豊富なライブラリを確保することができず、目的とするターゲット物質との結合力や特異性の高い擬似Ｆａｂフラグメントを効率よく得ることができないという問題があった。なお、現状の抗体擬似Ｆａｂファージディスプレイライブラリのバリエーションは、ヒトの抗体バリエーションとほぼ同数であると言われているが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたファージライブラリがヒト若しくはその他の動物と同じような傾向でアミノ酸の偏りが構成されているわけではなく、やはり不完全であるといえる。
また、抗体擬似Ｆａｂファージディスプレイ法では、あくまでも擬似Ｆａｂフラグメントが得られるのみで完全な抗体（Ｆａｂ）を得ることができないという問題もあった。
更に、上記の方法で得られる抗体や擬似Ｆａｂフラグメントは、交差反応する抗原類似物質を除き、基本的に１種類の抗原にしか結合できないため、抗原の種類に応じてそれと結合する抗体や擬似Ｆａｂフラグメントを作成しなければならず、抗体を広く試薬や医薬品等へ利用する上での制約となっていた。Antibodies, which are proteins that play a central role in the immune response, have the property of recognizing and binding to specific antigens. Various detection and measurement reagents that utilize the specificity of antibodies have been developed in the past. Has been. In recent years, pharmaceuticals using antibodies (antibody drugs) have been actively developed.
Usually, an antibody against a predetermined antigen is prepared by a method in which an animal is inoculated with the antigen and purified from the serum or a hybridoma method. In recent years, a method of obtaining an antibody that binds to an antigen by displaying a library of a part of the antibody (pseudo Fab fragment) on a phage (antibody pseudo Fab phage display method) has also been developed.
However, in the method of purifying from serum or the hybridoma method, it takes 2 to 5 months for the polyclonal antibody and 5 months or more for the monoclonal antibody to obtain the desired antibody, and it is difficult to prepare a large amount of antibody. There are problems such as high costs for the production and technically only specific personnel can be created. In addition, ethical problems were pointed out when animals were used.
On the other hand, the antibody pseudo-Fab phage display method has a large number of amino acids in the variable region (it is said that the light chain is about 30 to 55 amino acids and the heavy chain is about 40 to 45 amino acids). There is a problem that it is impossible to efficiently obtain a pseudo-Fab fragment having high binding power and specificity with the target substance. It is said that the number of variations of the current antibody pseudo-Fab phage display library is almost the same as the number of human antibody variations. However, the phage library constructed in vitro has the same tendency as that of humans or other animals. The bias of amino acids is not composed, and it can be said that it is still incomplete.
In addition, the antibody pseudo-Fab phage display method has a problem in that only a pseudo-Fab fragment can be obtained and a complete antibody (Fab) cannot be obtained.
Furthermore, since the antibodies and pseudo-Fab fragments obtained by the above method can basically bind only to one type of antigen, except for antigen-analogous substances that cross-react, antibodies and pseudo-Fabs that bind to it depending on the type of antigen. Fragments had to be created, which was a limitation in using antibodies widely for reagents and pharmaceuticals.
本発明の目的は、従来のようにターゲット物質毎に動物を免疫したり、ハイブリドーマを作成する必要がなく、簡単且つ安価に調製することのできる抗体、及びその作成方法を提供することにある。
上記目的を達成するため、本発明の一つは、目的とするターゲット物質に対して結合する抗体であって、所定の抗原と、該抗原に連結され、かつ前記ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと、前記抗原に対する抗体とを備えていることを特徴とする融合抗体である。
本発明の融合抗体は、所定の抗原と、該抗原に連結され、かつ前記ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと、前記抗原に対する抗体とを備えているので、ターゲット物質に応じて前記ペプチドの種類を変更するだけで、目的とするターゲット物質に対する結合能を簡単に付与することができる。また、ペプチドは比較的分子が小さいため、例えば、タンパクのポケットや細菌の外膜等のような立体障害を受けやすい場所に入り込むことが可能であり、従来の抗体では認識できないようなターゲット物質を認識することも可能となる。
上記発明においては、前記ペプチドは、前記ターゲット物質に対して結合性を有する少なくとも２種類のペプチドからなることが好ましい。この態様によれば、目的とするターゲット物質に対する結合力及び結合の特異性を高めることができる。
また、前記ペプチドは、異なるターゲット物質に対して結合性を有する複数種類のペプチドからなることが好ましい。この態様によれば、１分子の抗体で異なるターゲット物質を認識できる融合抗体を提供できる。
更に、前記ペプチドは、スペーサーを介して前記抗原に連結されていることが好ましい。この態様によれば、前記ペプチドとターゲット物質との立体的な結合阻害を回避することが可能となり、ターゲット物質に対する結合力のより高い融合抗体を提供できる。
本発明のもう一つは、目的とするターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを調製し、該ペプチドを所定の抗原に連結し、該抗原に対する抗体と結合させることを特徴とする、目的とするターゲット物質に対して結合する融合抗体の作成方法を提供するものである。
上記発明においては、前記ターゲット物質に対して結合性を有する少なくとも２種類のペプチドを調製し、これらのペプチドを前記抗原に連結することが好ましい。
また、異なるターゲット物質に対して結合性を有する複数種類のペプチドを調製し、これらのペプチドを前記抗原に連結することが好ましい。
更に、前記ペプチドを、スペーサーを介して前記抗原に連結することが好ましい。
本発明の作成方法によれば、目的とするターゲット物質の種類に応じて、該ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを調製し、これを所定の抗原に連結し、該抗原に対する抗体と結合させるだけなので、目的とするターゲット物質に結合する融合抗体を簡単且つ安価に得ることができる。An object of the present invention is to provide an antibody that can be easily and inexpensively prepared and a method for producing the same without immunizing an animal for each target substance or creating a hybridoma as in the conventional art.
In order to achieve the above object, one of the present invention is an antibody that binds to a target substance of interest, which is linked to a predetermined antigen, and binds to the target substance. A fusion antibody, comprising: a peptide having the antibody and an antibody against the antigen.
Since the fusion antibody of the present invention comprises a predetermined antigen, a peptide linked to the antigen and binding to the target substance, and an antibody against the antigen, the peptide depends on the target substance. By simply changing the type, the binding ability to the target substance can be easily provided. In addition, since peptides have relatively small molecules, they can enter steric hindered areas such as protein pockets and bacterial outer membranes, and target substances that cannot be recognized by conventional antibodies can be detected. It can also be recognized.
In the said invention, it is preferable that the said peptide consists of at least 2 types of peptide which has binding property with respect to the said target substance. According to this aspect, it is possible to increase the binding force and the specificity of binding to the target substance of interest.
Moreover, it is preferable that the said peptide consists of multiple types of peptides which have binding property with respect to a different target substance. According to this aspect, a fusion antibody that can recognize different target substances with one molecule of antibody can be provided.
Furthermore, the peptide is preferably linked to the antigen via a spacer. According to this aspect, steric binding inhibition between the peptide and the target substance can be avoided, and a fusion antibody having a higher binding force to the target substance can be provided.
Another aspect of the present invention is to prepare a peptide having a binding property to a target substance of interest, link the peptide to a predetermined antigen, and bind the antibody to the antigen. The present invention provides a method for producing a fusion antibody that binds to a target substance.
In the above invention, it is preferable to prepare at least two types of peptides having binding properties to the target substance and to link these peptides to the antigen.
Moreover, it is preferable to prepare a plurality of types of peptides having binding properties to different target substances and to link these peptides to the antigen.
Furthermore, the peptide is preferably linked to the antigen via a spacer.
According to the production method of the present invention, a peptide having a binding property to a target substance is prepared according to the type of the target substance, and the peptide is linked to a predetermined antigen and bound to an antibody against the antigen. Therefore, a fusion antibody that binds to the target substance of interest can be obtained easily and inexpensively.
図１は、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを１種類用いた場合の融合抗体の作成方法の説明図である。
図２は、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを２種類用いた場合の融合抗体の作成方法の説明図である。
図３は、２種類のターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを用いた場合の融合抗体の作成方法の説明図である。
図４は、ｈＦｃに結合性を有する１種類のペプチドを備えた融合抗体と、固定化したｈＦｃとの結合量を測定した結果を示す図である。
図５は、ｈＦｃに結合性を有する２種類のペプチドを備えた融合抗体と、固定化したｈＦｃとの結合量を測定した結果を示す図である。
図６は、ｈＦｃに結合性を有するペプチドと、ルシフェラーゼに結合性を有するペプチドとを備えた融合抗体と、固定化したｈＦｃ及びルシフェラーゼとの結合量を測定した結果を示す図である。FIG. 1 is an explanatory diagram of a method for producing a fusion antibody in the case of using one type of peptide having binding property to a target substance.
FIG. 2 is an explanatory diagram of a method for producing a fusion antibody when two types of peptides having binding properties to a target substance are used.
FIG. 3 is an explanatory diagram of a method for producing a fusion antibody when peptides having binding properties to two types of target substances are used.
FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the amount of binding between a fusion antibody comprising one type of peptide having binding ability to hFc and immobilized hFc.
FIG. 5 is a diagram showing the results of measuring the amount of binding between a fusion antibody comprising two types of peptides having binding properties to hFc and immobilized hFc.
FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the amount of binding between a fusion antibody comprising a peptide having binding ability to hFc and a peptide having binding ability to luciferase, and immobilized hFc and luciferase.
本発明の融合抗体は、目的とするターゲット物質に対して結合する抗体であって、所定の抗原と、該抗原に連結され、かつ前記ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと、前記抗原に対する抗体とを備えているものである。
ターゲット物質は、特に限定されるものではなく、例えば、抗体、タンパク質受容体、ホルモン、酵素、核酸、複合糖質、低分子化合物、細胞、ウイルス等が挙げられる。
ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドとは、ターゲット物質に特異的に結合する部位（結合部位）を有するペプチドであり、そのアミノ酸配列やアミノ酸数はターゲット物質によって変わるため一概に決定できないが、通常、２〜２００個のアミノ酸からなるペプチドが好ましく、５〜１８個のアミノ酸からなるペプチドがより好ましい。このペプチドは、直鎖状であってもよく、ジスルフィド結合等による環状構造を有していてもよい。また、上記結合部位以外のアミノ酸配列を有していてもよく、ターゲット物質に対する結合性を損わない範囲で修飾されていてもよい。
本発明においては、１つのターゲット物質に対して結合性を有する１種類のペプチドを用いてもよく、２種類以上のペプチドを用いてもよい。１つのターゲット物質に対して結合性を有する２種類以上のペプチドを用いることにより、融合抗体のターゲット物質に対する結合力及び結合の特異性を高めることができる。
また、異なるターゲット物質に対して結合性を有する複数種類のペプチドを用いることもできる。例えば、ターゲット物質が２種類ある場合は、１つのターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと、もう一つのターゲット物質に対して結合性を有するペプチドとを用いることができる。これによれば、１分子で異なるターゲット物質を認識することができる融合抗体を得ることができる。
ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドは、例えば、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，１３１５−１３１７（１９８５））によって得ることができる。ファージディスプレイ法は、ファージの外殼タンパク質に外来タンパク質（例えば、抗体、酵素、ペプチド等）を融合タンパク質として提示させたファージライブラリを用いて、所定のターゲット物質に結合するタンパク質をスクリーニングする方法であり、このようなファージライブラリをターゲット物質に接触させて、選択操作（バイオパニング）を行なうことで、ターゲット物質に結合する外来タンパク質を発現したファージ群のみを選択的に得、このファージのＤＮＡを解析することにより、ファージ表面に提示された外来タンパク質のアミノ酸配列を容易に同定することができる。そして、このアミノ酸配列に基いて、常法（固相法、Ｆｍｏｃ法等）にしたがってペプチドを合成することにより、目的のペプチドを簡単、且つ大量に調製することができる。
ファージライブラリは、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，１３１５−１３１７（１９８５）、Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｇ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０（１９９０）等に記載された方法にしたがって、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより調製することもできるが、商品名「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）等の市販のものを用いることもできる。
本発明においては、少数のアミノ酸数からなるペプチドをスクリーニングすればよいので、抗体擬似Ｆａｂファージディスプレイ法に比べて豊富なバリエーションのファージライブラリを用いることが可能となり、ターゲット物質との結合力や特異性の高いペプチドを効率よく得ることができる。したがって、このようなペプチドを用いて融合抗体を作成することにより、擬似Ｆａｂフラグメントに比べてターゲット物質に対する結合力や特異性の高い抗体を得ることが可能となる。
なお、本発明においては、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを効率よくスクリーニングするために、ファージ表面に提示される外来タンパク質（ペプチド）のバリエーションをできるだけ増やしたファージライブラリを用いることが好ましい。また、上記ファージライブラリを複数個（通常２〜４個）に分割し、各分割したファージライブラリを元のファージライブラリと少なくとも同等数以上のファージを含むように、それぞれ常法にしたがって増幅してから用いることにより、ターゲット物質に対して結合性を有する複数のペプチドを効率よくスクリーニングすることができる。
ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを連結する抗原としては、ペプチドを化学的、物理的に連結することのできる物質であれば特に制限されないが、入手しやすいものが好ましく、具体的には、ペプチド、糖、核酸、脂質及びこれらの複合体等が例示できる。
また、上記抗原に対する抗体は、入手しやすいものが好ましく、目的等に応じてマウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体等を選択して用いることができる。なお、抗体の代わりに、Ｆａｂフラグメント等の抗体の一部断片を用いることもできる。
本発明においては、上記抗原、及び該抗原に対する抗体やＦａｂフラグメント等の抗体の一部断片は、ターゲット物質の種類に関らず、同一のものを使用することが可能であり、使用する抗原に対する抗体やＦａｂフラグメント等が市販されている場合はそれらを用いてもよく、抗原を動物に免疫するなどして、常法にしたがって抗体を調製してもよい。
上記ペプチドと抗原を連結する方法は、例えば、抗原としてペプチドを用いる場合は、以下のような方法が挙げられる。
１）ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと抗原であるペプチドとを連続した一つのペプチドとして合成する。この方法は最も簡便な方法である。
２）抗原であるペプチドに、アミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基を有するアミノ酸を付加したペプチドを合成し、そのアミノ基やチオール基等を活性化して、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを連結する。この方法は、抗原に、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを２種類以上連結する際に特に有効である。
また、抗原としてペプチド以外の物質を用いる場合は、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを合成した後、公知の方法（大野素徳・金岡祐一・崎山文夫・前田浩著、「生物化学実験法１３ 蛋白質の化学修飾（下）」（学会出版センター）、８１〜１１３頁等参照）により抗原に連結すればよい。
本発明においては、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと抗原とを連結する際に、スペーサーを介して連結することが好ましい。スペーサーとしては、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと抗原とを化学的、物理的に連結できる物質であれば特に制限はなく、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよい。
具体的には、ペプチド、炭素数２〜１８の主鎖（主鎖中にエステル結合やエーテル結合を有していてもよい。）を有し、好ましくは水酸基等の親水性の官能基を有するもの（例えば、両末端に活性基を有するポリビニルアルコール、好ましくはビニルアルコール分子が２〜１０程度重合したもの）、２〜１０糖からなる糖鎖等が例示できる。上記ペプチドとしては、グリシンやセリンが数個（通常４〜１０個）ペプチド結合したペプチド等のフレキシブルリンカー等が好ましく挙げられる。また、上記ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドの結合部位以外のアミノ酸配列をスペーサーとして利用することもできる。
このようなスペーサーを介してターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと抗原を連結することにより、前記ペプチドとターゲット物質との立体的な結合阻害を回避することができるので、融合抗体のターゲット物質に対する結合力を高めることができる。また、スペーサーの長さは特に制限されないが、長めのスペーサーを用いることにより、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドが、例えば、タンパクのポケットや細菌の外膜のような立体障害を受けやすい場所により入りやすくなり、従来の抗体では認識できないようなターゲット物質をより認識しやすくなる。
なお、スペーサーは、予めターゲット物質に対して結合性を有するペプチドに連結してから抗原と連結してもよく、予め抗原に連結してからターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと連結してもよい。スペーサーと、ターゲット物質に対して結合性を有するペプチド又は抗原との連結は、上記のターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと抗原を連結する方法と同様の方法で行うことができる。
本発明の融合抗体は、上記のようにしてターゲット物質に対して結合性を有するペプチドと抗原とを連結したもの（以下、融合抗原という）と、前記抗原に対する抗体とを抗原抗体反応により結合させることにより得ることができる。
以下、本発明の融合抗体の作成方法について、図１〜３を参照して更に詳細に説明する。
図１は、１つのターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを１種類用いた場合の融合抗体の作成方法について説明したものである。すなわち、ターゲット物質１に対して結合性を有するペプチド１１を抗原２１に直接連結することにより融合抗原２３を作成し、この融合抗原２３と抗原２１に対する抗体２０とを抗原抗体反応により結合させることにより、融合抗体３１を作成することができる。また、ペプチド１１と抗原２１とを、スペーサー２２を介して連結した融合抗原２４を用いることにより、融合抗体３２を作成することができ、融合抗原２３と２４の両方を用いることにより、融合抗体３３を作成することができる。
このようにして得られた融合抗体３１〜３３は、図に示すように、ターゲット物質１に対して結合性を有するペプチド１１を介して該ターゲット物質１１と結合することができる。
図２は、１つのターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを２種類用いた場合の融合抗体の作成方法について説明したものである。なお、以下の説明において、上記の説明と実質的に同じものには同一の符号を附し、その説明を省略する。
すなわち、ターゲット物質１に対して結合性を有するペプチド１１及び１２を、抗原２１に直接連結することにより融合抗原２５を作成し、この融合抗原２５と抗原２１に対する抗体とを抗原抗体反応により結合させることにより、融合抗体３４を作成することができる。また、ペプチド１１及び１２と抗原２１とを、スペーサー２２を介して連結した融合抗原２６を用いることにより、融合抗体３５を作成することができ、融合抗原２５と２６の両方を用いることにより、融合抗体３６を作成することができる。
このようにして得られた融合抗体３４〜３６は、図に示すように、ターゲット物質１に対して結合性を有するペプチド１１及び１２を介して該ターゲット物質１と結合することができる。
図３は２種類のターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを用いた場合の融合抗体の作成方法の説明図である。すなわち、ターゲット物質１に対して結合性を有するペプチド１１と、ターゲット物質２に対して結合性を有するペプチド１３とを、抗原２１にスペーサー２２を介して連結することにより融合抗原２７を作成し、この融合抗原２７と抗原２１に対する抗体とを抗原抗体反応により結合させることにより、融合抗体３７を作成することができる。また、ペプチド１１及び１３と抗原２１とを直接連結した融合抗原２８を用いることにより、融合抗体３８を作成することができ、融合抗原２７と２８の両方を用いることにより、融合抗体３９を作成することができる。
このようにして得られた融合抗体３７〜３９は、図に示すように、ターゲット物質１に対して結合性を有するペプチド１１を介して該ターゲット物質１１と結合でき、ターゲット物質２に対して結合性を有するペプチド１３を介して該ターゲット物質２と結合できるようになっており、１分子で２種類のターゲット物質を認識できるようになっている。
本発明の融合抗体は、例えば、各種の検出・測定試薬、医薬品等へ利用することができる。The fusion antibody of the present invention is an antibody that binds to a target substance of interest, and comprises a predetermined antigen, a peptide linked to the antigen and having a binding property to the target substance, and the antigen. And an antibody.
The target substance is not particularly limited, and examples thereof include antibodies, protein receptors, hormones, enzymes, nucleic acids, complex carbohydrates, low molecular compounds, cells, viruses and the like.
A peptide having a binding property to a target substance is a peptide having a site (binding site) that specifically binds to the target substance, and the amino acid sequence and the number of amino acids vary depending on the target substance. Usually, a peptide consisting of 2 to 200 amino acids is preferred, and a peptide consisting of 5 to 18 amino acids is more preferred. This peptide may be linear or may have a cyclic structure such as a disulfide bond. Further, it may have an amino acid sequence other than the above binding site, and may be modified within a range that does not impair the binding property to the target substance.
In the present invention, one type of peptide having binding property to one target substance may be used, or two or more types of peptides may be used. By using two or more kinds of peptides having binding properties to one target substance, the binding force and the binding specificity of the fusion antibody to the target substance can be increased.
In addition, a plurality of types of peptides having binding properties to different target substances can be used. For example, when there are two types of target substances, a peptide having binding ability to one target substance and a peptide having binding ability to another target substance can be used. According to this, a fusion antibody capable of recognizing different target substances with one molecule can be obtained.
A peptide having a binding property to a target substance can be obtained by, for example, a phage display method (Smith, GP, Science, 288, 1315-1317 (1985)). The phage display method is a method of screening a protein that binds to a predetermined target substance using a phage library in which a foreign protein (eg, antibody, enzyme, peptide, etc.) is displayed as a fusion protein on the phage outer protein. By bringing such a phage library into contact with the target substance and performing a selection operation (biopanning), only the phage group expressing a foreign protein that binds to the target substance is selectively obtained, and the DNA of this phage is analyzed. Thus, the amino acid sequence of the foreign protein displayed on the phage surface can be easily identified. And based on this amino acid sequence, by synthesizing a peptide according to a conventional method (solid phase method, Fmoc method, etc.), the target peptide can be prepared easily and in large quantities.
Phage libraries are described in, for example, Smith, G. et al. P. , Science, 288, 1315-1317 (1985), J. Am. K. Scott and G.M. P. In accordance with the method described in Smith, Science, 249, 386-390 (1990), etc., the randomized DNA is chemically synthesized, and this is inserted into a gene encoding the outer protein of the phage DNA. However, it is also possible to use commercially available products such as trade name “Page Display Peptide Library Kit” (manufactured by New England Biolab).
In the present invention, since a peptide consisting of a small number of amino acids only needs to be screened, it is possible to use a phage library with abundant variations compared to the antibody pseudo-Fab phage display method, and the binding ability and specificity to the target substance. Can be obtained efficiently. Therefore, by producing a fusion antibody using such a peptide, it is possible to obtain an antibody having a higher binding force and specificity for the target substance than the pseudo Fab fragment.
In the present invention, it is preferable to use a phage library in which variations of foreign proteins (peptides) displayed on the phage surface are increased as much as possible in order to efficiently screen for peptides having binding properties to the target substance. In addition, the phage library is divided into a plurality (usually 2 to 4), and each divided phage library is amplified according to a conventional method so as to contain at least the same number of phages as the original phage library. By using it, a plurality of peptides having binding properties to the target substance can be efficiently screened.
The antigen for linking a peptide having a binding property to a target substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of chemically and physically linking a peptide, but an easily available one is preferable, specifically , Peptides, sugars, nucleic acids, lipids, and complexes thereof.
In addition, an antibody against the antigen is preferably easily available, and a mouse antibody, a rabbit antibody, a human antibody or the like can be selected and used depending on the purpose. Instead of antibodies, partial fragments of antibodies such as Fab fragments can also be used.
In the present invention, it is possible to use the same antigen as the antigen and a partial fragment of an antibody such as an antibody against the antigen or a Fab fragment regardless of the type of the target substance. When antibodies, Fab fragments and the like are commercially available, they may be used, and antibodies may be prepared according to a conventional method by immunizing an animal with an antigen.
Examples of the method for linking the peptide and the antigen include the following methods when a peptide is used as the antigen.
1) A peptide having a binding property to a target substance and an antigen peptide are synthesized as a continuous peptide. This method is the simplest method.
2) Synthesize a peptide in which amino acid having amino group, thiol group, carboxyl group or other functional group is added to peptide as antigen, and activate the amino group or thiol group to bind to the target substance. A peptide having This method is particularly effective when two or more types of peptides having binding properties to the target substance are linked to the antigen.
In addition, when a substance other than a peptide is used as an antigen, a peptide having a binding property to a target substance is synthesized, and then a known method (Motonori Ohno, Yuichi Kanaoka, Fumio Sakiyama, Hiroshi Maeda, “Biochemical Experimental Method” 13 “Chemical modification of protein (bottom)” (refer to Academic Publishing Center), pages 81 to 113).
In the present invention, it is preferable to link via a spacer when linking a peptide having a binding property to a target substance and an antigen. The spacer is not particularly limited as long as it is a substance capable of chemically and physically linking a peptide having a binding property to a target substance and an antigen, and may be linear or branched. Good.
Specifically, the peptide has a main chain of 2 to 18 carbon atoms (may have an ester bond or an ether bond in the main chain), and preferably has a hydrophilic functional group such as a hydroxyl group. Examples thereof include, for example, polyvinyl alcohols having active groups at both ends, preferably those obtained by polymerizing about 2 to 10 vinyl alcohol molecules, and sugar chains composed of 2 to 10 sugars. Preferred examples of the peptide include flexible linkers such as peptides having several (usually 4 to 10) glycine and serine peptide bonds. In addition, an amino acid sequence other than the binding site of the peptide having binding property to the target substance can be used as a spacer.
Since steric binding inhibition between the peptide and the target substance can be avoided by connecting the antigen having a binding property to the target substance via such a spacer, the target substance of the fusion antibody. The binding force to can be increased. In addition, the length of the spacer is not particularly limited, but by using a longer spacer, a peptide having a binding property to the target substance is easily subjected to steric hindrance such as a protein pocket or a bacterial outer membrane. It becomes easier to enter depending on the place, and it becomes easier to recognize target substances that cannot be recognized by conventional antibodies.
The spacer may be linked to the antigen after previously linking to a peptide having a binding property to the target substance, or may be linked to a peptide having a binding property to the target substance after previously linking to the antigen. Also good. The spacer and the peptide or antigen having a binding property to the target substance can be linked by the same method as the method for linking the peptide having a binding property to the target substance and the antigen.
The fusion antibody of the present invention binds a peptide having a binding property to a target substance and an antigen (hereinafter referred to as fusion antigen) and an antibody against the antigen by an antigen-antibody reaction as described above. Can be obtained.
Hereinafter, the method for producing the fusion antibody of the present invention will be described in more detail with reference to FIGS.
FIG. 1 illustrates a method for producing a fusion antibody in the case of using one kind of peptide having binding property to one target substance. That is, a
The
FIG. 2 illustrates a method for producing a fusion antibody when two types of peptides having binding properties to one target substance are used. In the following description, components substantially the same as those described above are denoted by the same reference numerals, and description thereof is omitted.
That is, the
The fusion antibodies 34 to 36 thus obtained can be bound to the
FIG. 3 is an explanatory diagram of a method for producing a fusion antibody when peptides having binding properties to two types of target substances are used. That is, a
The
The fusion antibody of the present invention can be used, for example, for various detection / measurement reagents, pharmaceuticals and the like.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
（１）ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドの調製
ターゲット物質として、ヒトの抗体の一部であるＩｇＧのＦｃフラグメント（以下、ｈＦｃと略記する。）を用い、ファージディスプレイ法により、ｈＦｃに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下のようにして行なった。
ターゲットｈＦｃは、商品名「ｓｕｌｆｏＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ」（ピアース社製）を用いてビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」、Ｄｙａｎａｌ社製）に、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した。この磁気ビーズは非特異的な結合を最低限にするため、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４）に懸濁してブロッキングを行なった。
この磁気ビーズを用いて、常法にしたがってファージディスプレイ法を行ない、配列番号１、２に示すｈＦｃに対して結合性を有する２種類のペプチドを得た。なお、ファージディスプレイ法では、１２アミノ酸のペプチドライブラリ（商品名「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた。
（２）ｈＦｃに対して結合性を有するペプチドと抗原（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）との連結
配列番号１に示すペプチドのＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇ（ヒスチジンが４個ペプチド結合したペプチド）を連結したペプチド（融合抗原１）、配列番号１に示すペプチドのＣ末端側にスペーサーとして２つのセリンを挿入し、その後にＨｉｓ−Ｔａｇを連結したペプチド（融合抗原２）を常法にしたがって合成した。また、対照として、配列番号３に示すペプチド（ｈＦｃに結合しないペプチド）のＣ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇを連結したペプチド（融合抗原３）、配列番号３に示すペプチドのＣ末端側にスペーサーとして２つのセリンを挿入し、その後にＨｉｓ−Ｔａｇを連結したペプチド（融合抗原４）を合成した。
（３）融合抗体の作成
Ｈｉｓ−Ｔａｇに結合するマウス抗体（商品名「Ａｎｔｉ−Ｈｉｓｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」、ＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ製、以下同じ。）を購入し、この抗体と上記の融合抗原１とを抗原抗体反応により結合させて、融合抗体１を作成した。同様にして上記抗体に融合抗原２〜４をそれぞれ結合させて、融合抗体２〜４を作成した。
（４）ターゲット物質（ｈＦｃ）に対する融合抗体の結合性の確認
ＥＬＩＳＡ法により、得られた各融合抗体のｈＦｃに対する結合性を調べた。具体的には、ｈＦｃを１０μｇ／ｍＬとなるように１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、コーニング社製９６穴プレート（高結合タイプ）に、１ウエル当たり１００μＬずつ加え、２５℃で１時間放置し、物理吸着による固定化を行なった。プレートを洗浄後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０）を１ウエル当たり２５０μＬずつ加えてブロッキングした。
一方、対照として、ｈＦｃを固定化せず、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０）を２５０μＬ加えてブロッキングしたウエルを作成した。
上記融合抗体１〜４を、それぞれ１μｇ／ｍＬとなるように２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０）に溶解し、２００μＬずつ、ｈＦｃを固定化したウエル３つ、ブロッキングのみのウエル２つに加え、２５℃で１時間放置した。
プレートを洗浄後、各ウエルにＨＲＰで修飾した抗マウス抗体（抗ウサギ抗体で吸収済み）を加え、２５℃で１時間放置した。プレートを洗浄後、ＡＢＴＳ反応液を加え、４０５ｎｍの吸光度で融合抗体の結合量を測定し、吸光度比（ｈＦｃ固定化ウエル３つの吸光度の平均値／ブロッキングのみのウエル２つの吸光度の平均値）を求めた。その結果を図４に示す。
図４から、配列番号１に示すペプチドを備えた融合抗体１、２はｈＦｃとの結合が見られ、これらの融合抗体は抗ｈＦｃ抗体として利用できることが分かる。特に、スペーサーを挿入した融合抗体２は、ｈＦｃにより結合しやすくなっていることが分かる。(1) Preparation of peptide having binding property to target substance IgG Fc fragment (hereinafter abbreviated as hFc), which is a part of human antibody, is used as a target substance. On the other hand, peptides having binding properties were screened as follows.
The target hFc is biotinylated using a trade name “sulfoNHS-LC-Biotin” (Pierce) and coated with streptavidin (trade name “Dynabeads M280 streptavidin”, manufactured by Dynal). Immobilization was performed using streptavidin binding activity. The magnetic beads were blocked by suspending them in a 2% (w / v) skim milk solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.4) to minimize non-specific binding.
Using this magnetic bead, the phage display method was performed according to a conventional method, and two types of peptides having binding properties to hFc shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 were obtained. In the phage display method, a peptide library of 12 amino acids (trade name “Page Display Peptide Library Kit”, manufactured by New England Biolab) was used.
(2) Ligation of peptide having binding ability to hFc and antigen (His-Tag) Peptide having His-Tag (peptide in which four histidines are bonded) on the C-terminal side of the peptide shown in SEQ ID NO: 1 (Fusion antigen 1) A peptide (fusion antigen 2) in which two serines were inserted as spacers on the C-terminal side of the peptide shown in SEQ ID NO: 1 and then His-Tag was linked was synthesized according to a conventional method. Further, as a control, a peptide (fusion antigen 3) in which His-Tag is linked to the C-terminal side of the peptide shown in SEQ ID NO: 3 (a peptide that does not bind to hFc), 2 as a spacer on the C-terminal side of the peptide shown in SEQ ID NO: 3 A peptide (fusion antigen 4) in which one serine was inserted and then His-Tag was linked was synthesized.
(3) Preparation of fusion antibody A mouse antibody that binds to His-Tag (trade name “Anti-Histag Antibody”, manufactured by CN Bioscience Inc., hereinafter the same) is purchased, and this antibody and the above-mentioned
(4) Confirmation of binding ability of fusion antibody to target substance (hFc) The binding ability of each obtained fusion antibody to hFc was examined by ELISA. Specifically, hFc was dissolved in 100 mM sodium carbonate buffer (pH 8.0) to 10 μg / mL, and 100 μL per well was added to a Corning 96-well plate (high binding type) at 25 ° C. It was left for 1 hour and fixed by physical adsorption. After washing the plate, 2% (w / v) skim milk solution (100 mM sodium carbonate buffer, pH 8.0) was added at 250 μL per well for blocking.
On the other hand, as a control, hFc was not immobilized and 250 μL of 2% (w / v) skim milk solution (100 mM sodium carbonate buffer, pH 8.0) was added to create a blocked well.
The
After washing the plate, anti-mouse antibody modified with HRP (absorbed with anti-rabbit antibody) was added to each well and left at 25 ° C. for 1 hour. After washing the plate, the ABTS reaction solution is added, and the amount of fusion antibody bound is measured at an absorbance of 405 nm. The absorbance ratio (average value of the absorbance of three hFc-immobilized wells / average value of the absorbance of two wells with blocking only) Asked. The result is shown in FIG.
FIG. 4 shows that the
実施例１で調製したｈＦｃに対して結合性を有する２種類のペプチド、すなわち、配列番号１、２に示すペプチドと、抗原としてＨｉｓ−ＴａｇのＮ末端側に３つのリジンを有するペプチドを用いて融合抗体を作成した。
具体的には、配列番号１、２に示すペプチドを各５０μｇ／ｍＬとなるように滅菌済み超純水に溶解し、Ｃ末端カルボキシル基をＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）とＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）で活性化し、上記抗原のリジン残基のアミノ基と反応させて、配列番号１、２に示すペプチドと上記抗原を連結した。反応後、ＱＩＡＧＥＮ社製Ｎｉ−ＮＴＡアガロースで、配列番号１、２に示すペプチドと上記抗原が連結したペプチド（融合抗原５）を精製した。
また、配列番号１に示すペプチドのみを抗原に連結したペプチド（融合抗原６）、配列番号２に示すペプチドのみを抗原に連結したペプチド（融合抗原７）、対照として、配列番号３に示すペプチドのみを抗原に結合したペプチド（融合抗原８）を同様にして調製した。
そして、Ｈｉｓ−Ｔａｇに結合するマウス抗体と上記融合抗原５を結合させて、融合抗体５を作成した。同様にして抗体に融合抗原６〜８をそれぞれ結合させて、融合抗体６〜８を作成した。
そして、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡ法により、得られた各融合抗体のｈＦｃに対する結合性を調べた。その結果を図５に示す。
図５から、配列番号１に示すペプチド及び／又は配列番号２に示すペプチドを備えた融合抗体５〜７はｈＦｃとの結合が見られ、これらの融合抗体は抗ｈＦｃ抗体として利用できることが分かる。特に、配列番号１に示すペプチド及び配列番号２に示すペプチドを備えた融合抗体５は、ｈＦｃにより結合しやすくなっており、ｈＦｃに結合性を有する２種類のペプチドを用いることにより、結合力を高めることができることが分かる。Using two types of peptides having binding properties to hFc prepared in Example 1, that is, peptides shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and peptides having three lysines on the N-terminal side of His-Tag as an antigen A fusion antibody was made.
Specifically, the peptides shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 are dissolved in sterilized ultrapure water so as to be 50 μg / mL, and the C-terminal carboxyl group is converted into EDC (N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl). ) -Carbohydrate (NH) (N-hydroxysuccinimide) and activated with the amino group of the lysine residue of the antigen, and the peptide shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 were linked. After the reaction, a peptide (fusion antigen 5) in which the peptide shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 and the above antigen were linked was purified with Ni-NTA agarose manufactured by QIAGEN.
Further, a peptide in which only the peptide shown in SEQ ID NO: 1 is linked to the antigen (fusion antigen 6), a peptide in which only the peptide shown in SEQ ID NO: 2 is linked to the antigen (fusion antigen 7), and as a control, only the peptide shown in SEQ ID NO: 3 A peptide (fusion antigen 8) in which was bound to an antigen was prepared in the same manner.
Then, the
Then, in the same manner as in Example 1, the binding ability of each obtained fusion antibody to hFc was examined by ELISA. The result is shown in FIG.
FIG. 5 shows that the
ｈＦｃとルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ Ｐｙｒａｌｉｓ）の２種類のターゲット物質に結合する融合抗体を作成した。
ターゲット物質としてルシフェラーゼを用い、ファージディスプレイ法により、ルシフェラーゼに対して結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下のようにして行なった。
ターゲットルシフェラーゼは、実施例１と同様にしてビオチン標識し、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズに、ビオチン−ストレプトアビジン結合活性を利用して固定化した。この磁気ビーズは非特異的な結合を最低限にするため、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４）に懸濁してブロッキングを行なった。
この磁気ビーズを用いて、常法にしたがってファージディスプレイ法を行ない、配列番号５に示すルシフェラーゼに対して結合性を有するペプチドを得た。なお、ファージディスプレイ法では、７アミノ酸のペプチドライブラリ（商品名「Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ」、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）を用いた。
一方、ｈＦｃに対して結合性を有するペプチドとして、実施例１で得られた配列番号１に示すペプチドを用いた。
配列番号５と配列番号１に示すペプチドを、実施例２と同様にしてＨｉｓ−ＴａｇのＮ末端側に３つのアルギニンを有するペプチド（抗原）に連結し、ｈＦｃを固定化したカラム（商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」、アマシャムファルマシア製）と、ルシフェラーゼを固定化したカラム（商品名「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」、アマシャムファルマシア製）に順次通して、両方に結合するペプチド（融合抗原９）のみを回収した。
また、対照として、配列番号１に示すペプチドのみを抗原に連結したペプチド（融合抗原１０）、配列番号５に示すペプチドのみを抗原に連結したペプチド（融合抗原１１）、配列番号３に示すペプチド（融合抗原１２）を実施例２と同様にして調製した。なお、配列番号３に示すペプチドは、ｈＦｃ及びルシフェフーゼに対して結合性を有さないペプチドである。
Ｈｉｓ−Ｔａｇに結合するマウス抗体と上記融合抗原９を結合させて、融合抗体９を作成した。同様にして上記抗体に上記の融合抗原１０〜１２をそれぞれ結合させて、融合抗体１０〜１２を作成した。
そして、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡ法により、得られた各融合抗体のｈＦｃ及びルシフェラーゼに対する結合性を調べた。具体的には、ｈＦｃを１０μｇ／ｍＬとなるように１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、コーニング社製９６穴プレート（高結合タイプ）に、１ウエル当たり１００μＬずつ加え、２５℃で１時間放置し、物理吸着による固定化を行なった。また、ルシフェラーゼを１０μｇ／ｍＬとなるように１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解したもの、ｈＦｃ及びルシフェラーゼをそれぞれ５μｇ／ｍＬとなるように溶解したものをそれぞれ用いて、同様にして固定化を行なった。
プレートを洗浄後、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０）を１ウエル当たり２５０μＬずつ加えてブロッキングした。
一方、対照として、ｈＦｃを固定化せず、２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０）を２５０μＬ加えてブロッキングしたウエルを作成した。
上記融合抗体９〜１２を、それぞれ１μｇ／ｍＬとなるように２％（ｗ／ｖ）スキムミルク溶液（１００ｍＭ 炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０）に溶解し、２００μＬずつ、ｈＦｃを固定化したウエル３つ、ルシフェラーゼを固定化したウエル３つ、ｈＦｃ及びルシフェラーゼを固定化したウエル３つ、ブロッキングのみのウエル２つに加え、２５℃で１時間放置した後、実施例１と同様にして融合抗体の結合量を測定し、吸光度比を求めた。その結果を図６に示す。
図６から、配列番号５に示すペプチド及び配列番号１に示すペプチドを備えた融合抗体９は、全てのウエルで結合が見られ、特にｈＦｃ及びルシフェラーゼを固定化したウエルで最も強い結合が見られることが分かる。したがって、この融合抗体９はｈＦｃ及びルシフェラーゼの両方を認識する抗体として利用できることが分かる。Fusion antibodies that bind to two types of target substances, hFc and luciferase (Phototinus Pyralis), were prepared.
A luciferase was used as a target substance, and a peptide having a binding property to luciferase was screened by the phage display method as follows.
Target luciferase was labeled with biotin in the same manner as in Example 1, and immobilized on magnetic beads coated with streptavidin using biotin-streptavidin binding activity. The magnetic beads were blocked by suspending them in a 2% (w / v) skim milk solution (10 mM phosphate buffer, pH 7.4) to minimize non-specific binding.
Using this magnetic bead, a phage display method was performed according to a conventional method, and a peptide having binding property to luciferase shown in SEQ ID NO: 5 was obtained. In the phage display method, a peptide library of 7 amino acids (trade name “Page Display Peptide Library Kit”, manufactured by New England Biolab) was used.
On the other hand, the peptide shown in SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 was used as a peptide having binding ability to hFc.
The peptide shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 1 was linked to a peptide (antigen) having three arginines on the N-terminal side of His-Tag in the same manner as in Example 2, and a column (trade name “ HiTrap NHS-activated HP "(manufactured by Amersham Pharmacia) and a luciferase-immobilized column (trade name" HiTrap NHS-activated HP ", Amersham Pharmacia) are sequentially passed through only the peptide (fusion antigen 9) that binds to both. Was recovered.
As a control, a peptide in which only the peptide shown in SEQ ID NO: 1 was linked to the antigen (fusion antigen 10), a peptide in which only the peptide shown in SEQ ID NO: 5 was linked to the antigen (fusion antigen 11), and a peptide shown in SEQ ID NO: 3 ( Fusion antigen 12) was prepared as in Example 2. In addition, the peptide shown to sequence
A fusion antibody 9 was prepared by binding the mouse antibody that binds to His-Tag and the fusion antigen 9 described above. In the same manner, the above fusion antigens 10-12 were respectively bound to the above antibodies to prepare fusion antibodies 10-12.
Then, the binding properties of the obtained fusion antibodies to hFc and luciferase were examined by ELISA in the same manner as in Example 1. Specifically, hFc was dissolved in 100 mM sodium carbonate buffer (pH 8.0) to 10 μg / mL, and 100 μL per well was added to a Corning 96-well plate (high binding type) at 25 ° C. It was left for 1 hour and fixed by physical adsorption. Immobilization was similarly performed using luciferase dissolved in 100 mM sodium carbonate buffer (pH 8.0) to 10 μg / mL and hFc and luciferase dissolved to 5 μg / mL, respectively. Was done.
After washing the plate, 2% (w / v) skim milk solution (100 mM sodium carbonate buffer, pH 8.0) was added at 250 μL per well for blocking.
On the other hand, as a control, hFc was not immobilized and 250 μL of 2% (w / v) skim milk solution (100 mM sodium carbonate buffer, pH 8.0) was added to create a blocked well.
The above fusion antibodies 9-12 were dissolved in 2% (w / v) skim milk solution (100 mM sodium carbonate buffer, pH 8.0) so as to be 1 μg / mL, and 200 μL each of three wells to which hFc had been immobilized. In addition to 3 wells with luciferase immobilized, 3 wells with hFc and luciferase immobilized, 2 wells with blocking only, and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour, binding of fusion antibody in the same manner as in Example 1. The amount was measured and the absorbance ratio was determined. The result is shown in FIG.
From FIG. 6, the fusion antibody 9 comprising the peptide shown in SEQ ID NO: 5 and the peptide shown in SEQ ID NO: 1 shows binding in all wells, and in particular, the strongest binding is seen in wells in which hFc and luciferase are immobilized. I understand that. Therefore, it can be seen that this fusion antibody 9 can be used as an antibody that recognizes both hFc and luciferase.
配列番号１：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド。
配列番号２：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントに結合性を有するペプチド。
配列番号３：ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント及びルシフェラーゼに結合性を有さないペプチド。
配列番号４：ルシフェラーゼに結合性を有するペプチド。SEQ ID NO: 1: Peptide having binding ability to Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 2: Peptide having binding property to Fc fragment of human IgG.
SEQ ID NO: 3: Peptide not binding to Fc fragment of human IgG and luciferase.
SEQ ID NO: 4: Peptide having binding property to luciferase.
以上説明したように本発明によれば、目的とするターゲット物質の種類に応じて、該ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドを調製し、これを所定の抗原に連結し、該抗原に対する抗体と結合させることにより、目的とするターゲット物質に結合する融合抗体を得ることができる。ターゲット物質に対して結合性を有するペプチドは、ファージディスプレイ法によって容易、且つ短時間でスクリーニングして調製できるので、様々な結合能を有する抗体を簡単且つ安価に提供することができる。
こうして得られる融合抗体は、抗体の特異性を利用した様々な検出、測定試薬、あるいは医薬品の構成材料として利用できる。As described above, according to the present invention, a peptide having a binding property to the target substance is prepared according to the type of target target substance, and this is linked to a predetermined antigen, and an antibody against the antigen. As a result, a fusion antibody that binds to the target substance of interest can be obtained. Peptides having binding ability to the target substance can be prepared by screening easily and in a short time by the phage display method, so that antibodies having various binding capacities can be provided simply and inexpensively.
The fusion antibody thus obtained can be used as various detection and measurement reagents utilizing the specificity of the antibody, or as a constituent material of a pharmaceutical product.
【配列表】
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