JPWO2004018081A1

JPWO2004018081A1 - Biomaterial purification method using electrocleavable affinity carrier, electrocleavable affinity carrier, biomaterial purification kit, electrocleavable linker

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Publication number: JPWO2004018081A1
Application number: JP2004530574A
Authority: JP
Inventors: 一裕千葉; 信弘高橋
Original assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2002-08-21
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2023-08-20
Also published as: AU2003257602A1; WO2004018081A1; JP4135791B2

Abstract

生体物質を精製する方法であって、前記生体物質を含む水溶液を、電解切断性アフィニティー担体と接触させ、そして、前記水溶液に電圧を印加して前記電解切断性アフィニティー担体を切断することにより前記生体物質を回収することを含む方法が開示される。本発明の電解切断性アフィニティー担体は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成され、電圧を印加することにより切断されることを特徴とする。本発明の方法により目的とする生体物質を簡便かつ高回収率で得ることができる。A method for purifying a biological material, wherein an aqueous solution containing the biological material is brought into contact with an electrocleavable affinity carrier, and a voltage is applied to the aqueous solution to cleave the electrocleavable affinity carrier. A method is disclosed that includes recovering the material. The electrocleavable affinity carrier of the present invention comprises a ligand bound to a solid carrier via an electrocleavable linker, and is characterized by being cleaved by applying a voltage. The target biological material can be obtained simply and with a high recovery rate by the method of the present invention.

Description

本発明は、生体物質を精製する方法、ならびに該方法において用いるための電解切断性アフィニティー担体に関する。本発明はまた、電解切断性アフィニティー担体を利用した生体物質精製用キット、および電解切断性リンカーに関する。 The present invention relates to a method for purifying biological material and an electrocleavable affinity carrier for use in the method. The present invention also relates to a biological material purification kit using an electrocleavable affinity carrier, and an electrocleavable linker.

夾雑蛋白質などの生体物質が含まれる溶液中から目的とする蛋白質のみを分離するために、種々の方法が知られている。例えば、目的とする蛋白質をタグ付きの融合蛋白質として組換え手法により発現させ、そのタグに特異的なリガンドを利用してタグ付きの蛋白質のみを選択的に結合させる方法が広く用いられている。この方法においては、目的とする蛋白質を回収するためには、塩濃度、ｐＨ、あるいは溶媒組成を変えたり、選択的結合の後に特異性の高いプロテアーゼでタグ部分を切断し、目的とする蛋白質のみを溶出させる（例えば、“Ａｇｅｎｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｏｍｅｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ”，ＧｕｉｌｌａｕｍｅＲｉｇａｕｔ，ＡｎｎａＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏ，ＢｅｒｔｈｏｌｄＲｕｔｚ，ＭａｔｔｈｉａｓＷｉｌｍ，ＭａｔｔｈｉａｓＭａｎｎ，ＢｅｒｔｒａｎｄＳｅｒａｐｈｉｎ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７，１０３０−１０３２（０１Ｏｃｔ１９９９））。しかし、この方法では非特異的に吸着した夾雑蛋白質が溶出されることがある。また、プロテアーゼで切断する方法の場合には、目的とする蛋白質の中にそのプロテアーゼ認識部位が存在すると、目的とする蛋白質自体が切断されてしまうという欠点がある。
また、目的とする蛋白質に対する抗体をリガンドとして用いて蛋白質等の生体物質を結合させた後に、その蛋白質の抗原決定部位に対応する合成ペプチドを用いて蛋白質を回収する方法が知られているが、この方法では蛋白質の回収効率が低い。特に、抗原決定部位が不明である場合には、選択的に目的とする蛋白質だけを溶出することができず、蛋白質を含む生体物質の回収率がさらに低くなる。
担体に光感受性のリンカーを介してリガンドを結合させ、このリガンドに蛋白質を結合させた後に、光をあててリンカーを切断する方法も開発されている。この方法では、担体をカラムに充填するとカラム中で試料に十分に光をあてることができない。また、光エネルギーが弱いと十分な切断が得られないが、強すぎると標的蛋白質の構造が変化する可能性があり、光の強度の調節が困難であった。
さらに、目的とする蛋白質のシステイン残基やリン酸化セリン・スレオニン・チロシン残基をビオチンを連結させた修飾試薬で修飾し、担体に結合させたアビジンやストレプトアビジンを用いてシステインやリン酸化セリン・スレオニン・チロシン残基を含むペプチドだけを回収する方法も提唱されているが、回収率が非常に低いという欠点があった。
薬剤をアフィニティーリガンドとして担体に固定化し、目的とする薬剤のターゲット蛋白質を結合させ、薬剤を用いてターゲット蛋白質を回収する方法も知られている。特に疎水性の薬剤の場合、水溶液への溶解度が低く蛋白質の回収率が低い。また、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、あるいは蛋白質以外の生体物質をリガンドとして、蛋白質などの生体物質を結合させ、尿素や界面活性剤などを用いて生体物質の本来の構造を破壊することにより目的とする生体物質を回収する方法も知られているが、夾雑物も同時に回収され、選択的に目的とする生体物質を高い回収率で回収できない。こういった問題は、蛋白質のみならず、他の生体高分子、生理活性物質等の生体低分子でも全く同様である。
したがって、本発明は簡便な手段により、目的とする生体物質を高い回収率で得ることができる生体物質精製方法、ならびにこのような方法において用いるためのアフィニティー担体を提供することを目的とする。Various methods are known for separating only a target protein from a solution containing biological substances such as contaminating proteins. For example, a method in which a target protein is expressed as a tagged fusion protein by a recombinant technique and only a tagged protein is selectively bound using a ligand specific to the tag is widely used. In this method, in order to recover the target protein, the salt concentration, pH, or solvent composition is changed, or after selective binding, the tag portion is cleaved with a highly specific protease and only the target protein is recovered. the eluting (e.g., "a generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration", Guillaume Rigaut, Anna Shevchenko, Berthold Rutz, Matthias Wilm, Matthias Mann, Bertrand Seraphin, Nature Biotechnology17,1030-1032 (01 Oct 1999) ). However, in this method, nonspecifically adsorbed contaminant proteins may be eluted. In addition, the method of cleaving with a protease has a drawback that the target protein itself is cleaved if the protease recognition site is present in the target protein.
In addition, a method of recovering a protein using a synthetic peptide corresponding to the antigen determination site of the protein after binding a biological substance such as a protein using an antibody against the target protein as a ligand, This method has low protein recovery efficiency. In particular, when the antigen determining site is unknown, it is not possible to selectively elute only the target protein, and the recovery rate of the biological material containing the protein is further reduced.
A method has also been developed in which a ligand is bound to a carrier via a light-sensitive linker, a protein is bound to the ligand, and then the linker is cleaved by applying light. In this method, when the carrier is packed in the column, the sample cannot be sufficiently irradiated with light in the column. In addition, when the light energy is weak, sufficient cleavage cannot be obtained, but when the light energy is too strong, the structure of the target protein may change, and it is difficult to adjust the light intensity.
In addition, cysteine residues, phosphorylated serine, threonine, and tyrosine residues of the target protein are modified with a biotin-linked modifying reagent, and cysteine, phosphorylated serine, A method for recovering only a peptide containing a threonine / tyrosine residue has also been proposed, but it has the disadvantage of a very low recovery rate.
A method is also known in which a drug is immobilized on a carrier as an affinity ligand, a target protein of the target drug is bound, and the target protein is recovered using the drug. In particular, hydrophobic drugs have low solubility in aqueous solutions and low protein recovery. In addition, DNA fragments, RNA fragments, or biological substances other than proteins are used as ligands, biological substances such as proteins are bound, and the original structure of biological substances is destroyed using urea or surfactants. Although a method for recovering a biological material is also known, contaminants are also recovered at the same time, and the target biological material cannot be selectively recovered at a high recovery rate. These problems are the same not only for proteins but also for other biological macromolecules and biologically active substances such as physiologically active substances.
Therefore, an object of the present invention is to provide a biological material purification method capable of obtaining a target biological material with a high recovery rate by simple means, and an affinity carrier for use in such a method.

本発明者らは、生体物質をアフィニティー担体と結合させた後に、電気化学的手法によりアフィニティー担体を切断することにより、目的とする生体物質を容易に回収しうることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、生体物質を精製する方法であって、蛋白質などの生体物質を含む水溶液を、電解切断性アフィニティー担体と接触させ、そして、前記水溶液に電圧を印加して前記電解切断性アフィニティー担体を切断することにより前記蛋白質などの生体物質を回収することを含む方法を提供する。
本発明は、アフィニティ（親和性による親和力）を利用するアフィニティクロマトグラフィ技術で分離精製される生体物質すべてに適用することができる。本明細書においては、生体物質は生体高分子および生体低分子の両方を含む。前者の例には蛋白質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、酵素、糖、糖鎖などが含まれ、後者の例にはペプチド、脂質、ビタミン、金属錯体、ステロイド、テルペノイド（テルペン）、オータコイド、アルカロイド等の生理活性物質が含まれる。
電解切断性アフィニティー担体とは、アフィニティー精製に用いるための担体であって、電圧を印加することによりその一部が切断される特徴を有する担体をいう。好ましくは、該電解切断性アフィニティー担体は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成される。電解切断性リンカーとは、電圧を印加することにより切断されることができるリンカーである。好ましくは、該電解切断性リンカーは、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む。特に好ましくは、担体結合アームは酸化白金−珪素結合により担体に結合されている。
別の観点においては、本発明は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成されることを特徴とする電解切断性アフィニティー担体を提供する。リガンドとは、精製すべき目的物質と選択的もしくは特異的に結合しうる物質をいう。リガンドの例としては、限定されないが、抗原、抗体、ハプテン、ペプチド、レセプター、レセプターに結合する結合パートナー、ビオチン、アビジン、プロテインＡ等が含まれる。本発明の電解切断性アフィニティー担体は、電圧を印加することにより切断されることを特徴とする。好ましくは、該電解切断性リンカーは、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む。特に好ましくは、担体結合アームは酸化白金−珪素結合により担体に結合されている。
さらに別の観点においては、本発明は、上述の電解切断性アフィニティー担体を含む蛋白質などの生体物質精製用キットを提供する。
また別の観点においては、本発明は、電圧を印加することにより切断される電解切断性リンカーであって、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む電解切断性リンカーを提供する。この電解切断性リンカーには、担体結合アームを介して少なくとも１つの担体を結合することができる。
本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いることにより、目的とする生体物質をリガンドに結合させた後に担体と水溶液の間に微弱な電圧を印加することによって、電解切断性アフィニティー担体がその中のリンカーの特定の部位で切断されるため、生体物質を効率よく回収することができる。本発明にしたがう生体物質の精製方法は、生体物質の回収率が高いため、構造未知の複数の生体物質を微量の試料から回収する場合に特に有用である。The present inventors have found that the target biological material can be easily recovered by binding the biological material to the affinity carrier and then cleaving the affinity carrier by an electrochemical method, thereby completing the present invention. It was.
That is, the present invention is a method for purifying a biological material, wherein an aqueous solution containing a biological material such as a protein is brought into contact with an electrocleavable affinity carrier, and a voltage is applied to the aqueous solution to apply the electrocleavable affinity. There is provided a method comprising recovering a biological substance such as the protein by cleaving a carrier.
The present invention can be applied to all biological materials separated and purified by affinity chromatography technology using affinity (affinity by affinity). As used herein, biological material includes both biological macromolecules and biological small molecules. Examples of the former include proteins, nucleic acids (DNA, RNA), enzymes, sugars, sugar chains, etc., and examples of the latter include peptides, lipids, vitamins, metal complexes, steroids, terpenoids (terpenes), otachoids, alkaloids, etc. Of physiologically active substances.
The electrolytically cleavable affinity carrier is a carrier for use in affinity purification and has a characteristic that a part thereof is cleaved by applying a voltage. Preferably, the electrocleavable affinity carrier is composed of a ligand bound to a solid carrier via an electrocleavable linker. An electrolytically cleavable linker is a linker that can be cleaved by applying a voltage. Preferably, the electrocleavable linker comprises an electrocleavable moiety, at least one ligand binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety, and at least one carrier binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety. Particularly preferably, the carrier binding arm is bound to the carrier by a platinum oxide-silicon bond.
In another aspect, the present invention provides an electrocleavable affinity carrier comprising a ligand bound to a solid carrier via an electrocleavable linker. A ligand refers to a substance that can selectively or specifically bind to a target substance to be purified. Examples of ligands include, but are not limited to, antigens, antibodies, haptens, peptides, receptors, binding partners that bind to receptors, biotin, avidin, protein A, and the like. The electrocleavable affinity carrier of the present invention is characterized by being cleaved by applying a voltage. Preferably, the electrocleavable linker comprises an electrocleavable moiety, at least one ligand binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety, and at least one carrier binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety. Particularly preferably, the carrier binding arm is bound to the carrier by a platinum oxide-silicon bond.
In still another aspect, the present invention provides a kit for purifying biological materials such as a protein containing the above-described electrocleavable affinity carrier.
In another aspect, the present invention provides an electrocleavable linker that is cleaved by applying a voltage, the electrolysis cleavage portion, at least one ligand-binding arm bound to the electrolysis cleavage portion, and the electrolysis cleavage. An electrocleavable linker is provided that includes at least one carrier binding arm attached to the moiety. At least one carrier can be bound to the electrocleavable linker via a carrier binding arm.
By using the electrocleavable affinity carrier of the present invention, after binding the target biological substance to the ligand, a weak voltage is applied between the carrier and the aqueous solution, so that the electrocleavable affinity carrier is a linker therein. Since it is cut | disconnected in this specific site | part, a biological material can be collect | recovered efficiently. Since the biological material purification method according to the present invention has a high biological material recovery rate, it is particularly useful when recovering a plurality of biological materials whose structures are unknown from a very small amount of sample.

図１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の構成の１つの態様を示す。
図２は、本発明の電解切断性アフィニティー担体を充填したカラムの模式図を示す。
図３は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図４は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図５は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図６は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。
図７は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ断面図とそれを用いた生体物質とリガンドの相互作用を検知する原理の模式図を示す。
図８は、本発明の電解切断性アフィニティー担体をＢＩＡｃｏｒｅチップに適応した模式図を示す。
図９は、酸化白金−珪素結合により担体に結合した本発明の電解切断性リンカーの好ましい例を示す。
図１０は、本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いる電解切断の例を示す。
図１１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の製造および使用に適した装置の例を示す。
図１２は、リガンドとしてビオチンを用いる本発明の電解切断性アフィニティー担体を示す。
図１３は、リガンドとしてビオチンを用いる本発明の電解切断性アフィニティー担体の製造方法を示す。
図１４は、リガンドとしてビオチンを用いる本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いるアビジンの結合および切断を示す。
発明の詳細な説明
図１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の構成の１つの態様を示す。この態様においては、本発明の電解切断性アフィニティー担体は、固体担体に電解切断性リンカーを介して結合したリガンドから構成される。好ましくは、電解切断性リンカーは、電解切断部分、前記電解切断部分に結合した少なくとも１つのリガンド結合アーム、および前記電解切断部分に結合した少なくとも１つの担体結合アームを含む。
担体としては、水素よりイオン化傾向の小さい金属であればいずれの金属を用いることもできるが、好ましくは金および白金である。その理由は、金および白金と生体物質との親和性が低いので、夾雑物が混入しにくいこと、変化しにくく再利用可能であることである。もちろん、他の金属またはその他の導電性材料の表面に金または白金を蒸着またはメッキしたものを用いてもよい。また、担体として炭素（カーボンブラック等）を用いることもできる。この場合、炭素担体の表面をカルボキシル基で誘導化することにより、目的とする蛋白質がリガンドではなく担体に吸着することを防止することが好ましい。
担体は、当該技術分野において蛋白質あるいは生体物質アフィニティー精製用に一般に用いられる担体と同様の形状、例えば直径０．１μｍ−１ｍｍのビーズ形状とすることができる。好ましくは、精製すべき蛋白質と接触する表面積を大きくするために、直径１−２０μｍのビーズを用いる。あるいは、担体はスポンジ状または多孔性のマトリクスの形状であってもよい。
電解切断部分は、電圧を印加することにより電子移動に伴って開裂する芳香族性の基であり、例えば以下のような基を用いることができる：

［式中、Ｘは炭素、酸素、窒素、または硫黄原子であり、Ｒは水素、炭化水素基、アシル基または炭素、酸素、窒素、硫黄を介して結合する置換基であり、■はリガンド結合アームまたは担体結合アームである］。
本発明において用いることができる電解切断部分の好ましい例としては、以下の基が含まれるが、これらに限定されない。本発明において用いることができる適当な電解切断部分は、アフィニティによる精製等の技術分野に精通している者であれば、本明細書の開示に基づいて容易に設計し合成することができる。

リガンド結合アームとは、電解切断性部分とリガンドを適当な距離で結合させるためのスペーサー基である。リガンド結合アームは、好ましくは炭素数３−１００の長さのアルキレン鎖であり、ここで、隣接していない１またはそれ以上の−ＣＨ_２−基は、独立して、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−Ｏ−または−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい。リガンド結合アームは、末端にリガンドを結合するための官能基、例えば−ＣＯＯＨ基または−ＮＨ_２基、あるいはサクシニルイミド基またはエポキシ基を有する。また、リガンド結合アームの末端には蛋白質修飾・アミノ酸修飾・核酸修飾およびその他の生体物質修飾に用いるいかなる化合物の反応官能基を付加してもよい。本発明において用いることができるリガンド結合アームの好ましい例としては、以下の基が含まれるが、これらに限定されない。

当業者は、本明細書の開示に基づいて、本発明において用いることができる適当なリガンド結合アームを容易に設計し合成することができる。特に、アフィニティー精製に用いるリガンドおよび精製すべき蛋白質などの生体物質の物理学的性質（例えば、分子のサイズ、電荷）および化学的性質に基づいて、リガンド結合アームの長さおよび疎水性・親水性を適宜選択することができる。
担体結合アームとは、電解切断性部分と担体とを適当な距離で結合させるためのスペーサー基である。担体結合アームは、リガンド結合アーム（炭素数３−１００の長さ）より短いほうが好ましく、より好ましくは炭素数３−１０の長さのアルキレン鎖であり、ここで、隣接していない１またはそれ以上の−ＣＨ_２−基は、独立して、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−、−Ｏ−または−Ｏ−ＣＯ−で置換されていてもよい。電解切断性部分と担体との間の距離が一定の長さ（電圧、電解質溶液の性質、電解切断性部分の性質等により決定される）以下であれば、本発明の電解切断性アフィニティー担体は電圧を印加したときにその電解切断性部分で切断される。担体結合アームの長さがこれより長い場合には、本発明の電解切断性アフィニティー担体が動くことにより担体から一定の距離以下に達したときに切断が生ずる。したがって、担体結合アームの特に好ましい長さは炭素数３−６の長さである。担体結合アームの長さがより長い場合には、種々の官能基をアーム中に組み込むことによりアームの親水性・疎水性等の性質を調節することができるため、このような態様もまた好ましい。担体結合アームは、末端に担体と結合するための官能基を有する。担体が金である場合は適切な官能基は−ＳＨ基であり、担体が白金である場合には、適切な官能基は、−Ｓｉ（ＥｔＯ）_３または−Ｓｉ（ＭｅＯ）_３である。あるいは、担体の表面が−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２基などで誘導化されている場合には、これらの官能基と結合しうる官能基、例えば、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨなどであってもよい。本発明において用いることができる担体結合アームの好ましい例としては、以下の基が含まれるが、これらに限定されない。

当業者は、本明細書の開示に基づいて、本発明において用いることができる適当な担体結合アームを容易に設計し合成することができる。特に、精製すべき蛋白質などの生体物質の性質および担体の材料に基づいて、担体結合アームの長さおよび疎水性あるいは親水性を適切に選択することができる。
本発明の特に好ましい態様においては、担体と担体結合アームとは酸化白金−珪素結合により結合している。担体を陽極として電解酸化によりリンカーを切断する場合、担体と担体結合アームが例えばＡｕ−Ｓ結合により結合していると、この結合部分も酸化的に開裂する可能性がある。担体と電解切断性リンカーとの間で切断が起こると、非特異的に結合した夾雑成分も同時に溶出する割合が多くなるため、電解切断の条件を注意深く設定する必要がある。これに対し、酸化白金−珪素結合は水溶液中の酸化処理では結合は殆ど開裂しないため、電解切断性部分で選択的に電解酸化開裂反応を起こさせることが可能である。このことにより、反応の制御が容易となり、生体成分の混合物中に含まれる還元反応系の影響を受けず、外部スイッチにより選択的に切断できるという利点を有する。
図３−６は、本発明の電解切断性リンカーの構造の好ましい例を示す。本発明の範囲はこれらに限定されない。
本発明の電解切断性リンカーに、リガンド結合アームを介して少なくとも１つのリガンドを結合させ、さらに担体結合アームを介して少なくとも１つの担体を結合させることにより、電解切断性アフィニティー担体を得ることができる。本発明の電解切断性アフィニティー担体は、蛋白質などの生体物質を高い回収率で精製するのに有用である。
本発明の電解切断性アフィニティー担体の構成は図１に示される。本発明の電解切断性アフィニティー担体を、目的とする蛋白質などの生体物質を含む水溶液と接触させ、洗浄して夾雑蛋白質などの生体物質を除去する。このとき、夾雑物質の一部が担体と非特異的に吸着したまま残ってもよい。次に担体と水溶液の間に電圧を印加することにより、電解切断性アフィニティー担体の電解切断性部分が開裂する。印加する電圧は、０．５Ｖ−１．５Ｖ、より好ましくは０．５Ｖ−１．２Ｖであり、最も好ましくは１Ｖである。電圧が低いほど切断効率が低下し、電圧が１．５Ｖより高いと水が電気分解してしまう。
電圧の印加方法は、定電圧の印加の他、パルス電圧印加および正弦波、鋸状波、三角波などで往復掃引（スイープ）して印加する方法など、任意の方法を採用できる。電解切断性部分が単一の特定電圧で切断される場合には、その電圧以上の定電圧の印加を持続して印加すればよい。しかしながら、切断電圧にばらつきがある場合も多いので、より確実には切断電圧の最大最小をカバーする電圧範囲を掃引（スイープ）させて印加するのが好ましい。
図２は、本発明の電解切断性アフィニティー担体を充填したカラムによる蛋白質精製の態様を示す。本発明の電解切断性アフィニティー担体を電解質溶液とともにカラムに充填し、担体と電気的に連絡するよう電極を装着する。対電極は、電解質溶液と電気的に連絡するように装着する。精製すべき蛋白質を含む溶液をカラムに負荷し、蛋白質をリガンドに結合させる。カラムを洗浄して夾雑蛋白質を除去した後、電極に電圧を印加すると、電解切断性リンカーはその電解切断部分で切断されて、リガンドに結合した蛋白質が担体から解離する。解離した蛋白質をカラムから溶出することにより、目的とする蛋白質を回収することができる。
図１１は、本発明の電解切断性アフィニティー担体の製造および使用に適した装置の例を示す。図１１Ａは、本発明の電解切断性リンカーを白金担体に結合させるために用いることができる反応カラムの例である。電解反応を実施する場合には、図１１Ｂに示すように電極を装着する。このようなカラムを、図１１Ｃに示す吸引瓶に装着し、上部から反応液、洗浄溶液または溶出液を加える。溶液と白金粒子とを所望の時間接触させた後に系を吸引することにより、瓶の内部に溶液を回収することができる。
本発明の電解切断性アフィニティー担体を用いると、蛋白質を溶出する条件を適切に選択することにより、担体または電解切断性リンカーの担体結合アームに非特異的に吸着した夾雑蛋白質の溶出を防止することができるため、回収された蛋白質中への夾雑蛋白質の混入が非常に少ないという利点を有する。
本発明はまた、本発明の電解切断性アフィニティー担体を含む生体物質精製用キットを提供する。電解切断性アフィニティー担体はカラムに充填した形状で提供してもよい。キットはさらに、試料を溶解するための溶液、洗浄液、および溶出液を含んでいてもよい。あるいは、キットは担体に結合した電解切断性リンカーを含むものであってもよく、この場合、ユーザが目的に応じてリンカーにリガンドを結合させることができる。
本発明の電解切断性アフィニティー担体は、特に、リアルタイムＢＩＡ（ＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ）用のバイオチップに容易に適用可能である。ＢＩＡ用バイオチップは、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標；以下、「ＢＩＡｃｏｒｅチップ」と呼ぶ）の商品名であり、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されている。かかるチップ技術は、ＵＳＰ５，６４１，６４０、ＵＳＰ５，９５５，７２９、特許第３２９４６０５号、特表平０７−５０７８６５に開示されており、下記にその概略を説明する。
ＢＩＡｃｏｒｅチップは、センサチップの表面にある分子間の相互作用を検知するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）現象を利用する。リガンドと蛋白質などの生体物質が相互作用できるように、これら物質を流す微細なフローチャネルをＢＩＡｃｏｒｅチップ表面上に形成する。その表面にリガンドを固定する。図７に、ＢＩＡｃｏｒｅチップ断面図とそれを用いた生体物質とリガンドの相互作用を検知する原理の模式図を示す。
図７中、Ｆは生体物質のフローチャネル、Ｇは金の蒸着膜、Ｐは偏光、Ｒは全反射光である。Ｌはリガンド、Ｄはデキストラン、ＤＬはデキストランの結合リンカーである。ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面には、１００ｎｍ程度の長さのデキストランが結合しており、そのデキストランに目的とするリガンドが結合している。リガンドは、図に示すように単独のリガンドが一本のデキストランについていてもよく、複数のリガンドが枝別れしたデキストランに果実のようについていてもよい。ＳＰＲでは、およそ１００ｎｍ以内の距離のリガンドに物質が結合した場合、検出可能といわれている。物質と表面に固定されたリガンドが相互作用するとき、ＳＰＲによる屈折率の変化が生じるので、このセンサチップの裏面にてこれを光学的に測定する。このことで、リガンドと蛋白質を含む生体物質との相互作用が検知でき、かつ、反射光の反射角等から相互作用が定量化できる。図７に示すように、ＢＩＡｃｏｒｅチップの表面には、ＳＰＲを用いるために光学的特性のよい（全反射率の高い）金の蒸着膜が用いられている。
金の薄膜が用いられていることから、本発明の電解切断性アフィニティー担体をＢＩＡｃｏｒｅチップに容易に適用することが可能である。すなわち、ＢＩＡｃｏｒｅチップの金の薄膜面に本発明の電解切断性アフィニティ担体を結合することができる。あるいは、従来用いられているデキストランの一部に本発明の電解切断性アフィニティ担体を結合させてもよい。そして、電圧を印加するための電極の一方をＢＩＡｃｏｒｅチップの金の薄膜に電気的に接続する。このような電気的な回路の追加は容易である。このようにすれば、リアルタイムＢＩＡ技術により物質と固定リガンドの相互作用を定量的にリアルタイムでモニターし、所望のタイミングで固定リガンドを切り離すことができる。たとえば、リガンドと蛋白質の結合が検知されたあとで、チップ表面のフローで洗浄試薬を流し、洗浄が完了した後に結合蛋白質を切り離せば、固定リガンドに特異的に結合する蛋白質のみを高純度で回収することができる。
図８は、本発明の電解切断性アフィニティー担体をＢＩＡｃｏｒｅチップに適応した例の模式図である。ＬＡがリガンド結合アーム、ＣＰが切断部位、ＣＡが担体結合アームである。担体結合アームの長さは、金の蒸着膜を電極として電圧を印加したときに電解切断性アフィニティー担体が切断部位で切断されるように選択される。あるいは、より長い担体結合アームの長さを選択して、本発明の電解切断性アフィニティー担体がＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に固定されるリガンドと共にフローチャネルの流れの中で非定常的に動くことにより、切断部が担体から所定の距離に移動した際に切断されるようにしてもよい。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００２−２４１０７２号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。FIG. 1 shows one embodiment of the constitution of the electrocleavable affinity carrier of the present invention.
FIG. 2 shows a schematic diagram of a column packed with the electrocleavable affinity carrier of the present invention.
FIG. 3 shows a preferred example of the structure of the electrocleavable linker of the present invention.
FIG. 4 shows a preferred example of the structure of the electrocleavable linker of the present invention.
FIG. 5 shows a preferred example of the structure of the electrocleavable linker of the present invention.
FIG. 6 shows a preferred example of the structure of the electrocleavable linker of the present invention.
FIG. 7 shows a cross-sectional view of a BIAcore chip and a schematic diagram of the principle for detecting the interaction between a biological substance and a ligand using the BIAcore chip.
FIG. 8 is a schematic diagram in which the electrocleavable affinity carrier of the present invention is applied to a BIAcore chip.
FIG. 9 shows a preferred example of the electrocleavable linker of the present invention bonded to a carrier by a platinum oxide-silicon bond.
FIG. 10 shows an example of electrolytic cleavage using the electrolytically cleavable affinity carrier of the present invention.
FIG. 11 shows an example of an apparatus suitable for the production and use of the electrocleavable affinity carrier of the present invention.
FIG. 12 shows the electrocleavable affinity carrier of the present invention using biotin as a ligand.
FIG. 13 shows a method for producing an electrocleavable affinity carrier of the present invention using biotin as a ligand.
FIG. 14 shows the binding and cleavage of avidin using the electrocleavable affinity carrier of the present invention using biotin as the ligand.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION FIG. 1 shows one embodiment of the construction of the electrocleavable affinity carrier of the present invention. In this embodiment, the electrocleavable affinity carrier of the present invention is composed of a ligand bound to a solid carrier via an electrocleavable linker. Preferably, the electrocleavable linker comprises an electrocleavable moiety, at least one ligand binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety, and at least one carrier binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety.
As the carrier, any metal can be used as long as it has a lower ionization tendency than hydrogen, but gold and platinum are preferred. The reason is that, since the affinity between gold and platinum and the biological material is low, impurities are not easily mixed in, and it is difficult to change and can be reused. Of course, another metal or other conductive material with gold or platinum deposited or plated may be used. Carbon (carbon black or the like) can also be used as the carrier. In this case, it is preferable to prevent the target protein from being adsorbed on the carrier instead of the ligand by derivatizing the surface of the carbon carrier with a carboxyl group.
The carrier can be in the same shape as a carrier generally used for protein or biological substance affinity purification in the technical field, for example, a bead shape having a diameter of 0.1 μm-1 mm. Preferably, beads with a diameter of 1-20 μm are used to increase the surface area in contact with the protein to be purified. Alternatively, the carrier may be in the form of a sponge or porous matrix.
The electrolytic cleavage portion is an aromatic group that is cleaved along with electron transfer when a voltage is applied. For example, the following groups can be used:

[Wherein X is a carbon, oxygen, nitrogen or sulfur atom, R is a hydrogen, hydrocarbon group, acyl group or a substituent bonded via carbon, oxygen, nitrogen or sulfur, and ■ is a ligand bond Arm or carrier binding arm].
Preferred examples of the electrolytic cleavage moiety that can be used in the present invention include, but are not limited to, the following groups. A suitable electrolytic cleavage moiety that can be used in the present invention can be easily designed and synthesized based on the disclosure of the present specification, as long as the person is familiar with technical fields such as affinity purification.

The ligand binding arm is a spacer group for binding the electrocleavable moiety and the ligand at an appropriate distance. The ligand binding arm is preferably an alkylene chain having a length of 3 to 100 carbon atoms, wherein one or more non-adjacent —CH ₂ — groups are independently —NH—, —NHCO. It may be substituted with-, -CO-, -O- or -O-CO-. The ligand binding arm has a functional group for binding a ligand at the terminal end, such as a —COOH group or —NH ₂ group, or a succinimide group or an epoxy group. In addition, a reactive functional group of any compound used for protein modification, amino acid modification, nucleic acid modification, and other biological substance modification may be added to the end of the ligand binding arm. Preferred examples of ligand binding arms that can be used in the present invention include, but are not limited to, the following groups:

One skilled in the art can readily design and synthesize appropriate ligand binding arms that can be used in the present invention based on the disclosure herein. In particular, the length of the ligand-binding arm and the hydrophobicity / hydrophilicity based on the physical properties (eg, molecular size, charge) and chemical properties of the biological material such as the ligand used for affinity purification and the protein to be purified. Can be appropriately selected.
The carrier binding arm is a spacer group for binding the electrocleavable moiety and the carrier at an appropriate distance. The carrier binding arm is preferably shorter than the ligand binding arm (3-100 carbons in length), more preferably an alkylene chain with 3-10 carbons in length, where 1 or The above —CH ₂ — groups may be independently substituted with —NH—, —NHCO—, —CO—, —O— or —O—CO—. If the distance between the electrolytically cleavable part and the carrier is a certain length (determined by the voltage, the properties of the electrolyte solution, the properties of the electrolytically cleavable part, etc.), the electrolytically cleavable affinity carrier of the present invention is When a voltage is applied, it is cut at the electrolytic cutting portion. When the length of the carrier binding arm is longer than this, the electrocleavable affinity carrier of the present invention is moved, so that the cleavage occurs when a certain distance or less is reached from the carrier. Therefore, a particularly preferable length of the carrier binding arm is 3 to 6 carbon atoms. In the case where the length of the carrier-binding arm is longer, such a mode is also preferable since various properties such as hydrophilicity and hydrophobicity can be adjusted by incorporating various functional groups into the arm. The carrier binding arm has a functional group for binding to the carrier at the end. When the support is gold, a suitable functional group is a —SH group, and when the support is platinum, a suitable functional group is —Si (EtO) ₃ or —Si (MeO) ₃ . Alternatively, when the surface of the support is derivatized with —COOH, —NH ₂ groups, etc., it is a functional group capable of binding to these functional groups, for example, —OH, —NH ₂ , —COOH, etc. Also good. Preferred examples of the carrier binding arm that can be used in the present invention include, but are not limited to, the following groups.

One skilled in the art can readily design and synthesize suitable carrier binding arms that can be used in the present invention based on the disclosure herein. In particular, the length of the carrier binding arm and the hydrophobicity or hydrophilicity can be appropriately selected based on the properties of the biological substance such as the protein to be purified and the material of the carrier.
In a particularly preferred embodiment of the present invention, the carrier and the carrier binding arm are bound by a platinum oxide-silicon bond. When the linker is cleaved by electrolytic oxidation using the carrier as an anode, if the carrier and the carrier binding arm are bonded by, for example, an Au-S bond, this bonded portion may also be oxidatively cleaved. When cleavage occurs between the carrier and the electrolytically cleavable linker, the proportion of nonspecifically bound contaminant components increases at the same time, so it is necessary to carefully set the conditions for electrolytic cleavage. On the other hand, since the platinum oxide-silicon bond is hardly cleaved by the oxidation treatment in an aqueous solution, it is possible to cause an electrolytic oxidative cleavage reaction selectively at the electrolytically cleavable portion. This makes it easy to control the reaction and has the advantage that it can be selectively disconnected by an external switch without being affected by the reduction reaction system contained in the mixture of biological components.
FIGS. 3-6 show preferred examples of the structure of the electrocleavable linker of the present invention. The scope of the present invention is not limited to these.
By binding at least one ligand to the electrocleavable linker of the present invention via a ligand binding arm and further binding at least one carrier via a carrier binding arm, an electrocleavable affinity carrier can be obtained. . The electrocleavable affinity carrier of the present invention is useful for purifying biological substances such as proteins with a high recovery rate.
The structure of the electrocleavable affinity carrier of the present invention is shown in FIG. The electrolytically cleavable affinity carrier of the present invention is brought into contact with an aqueous solution containing a biological substance such as a target protein and washed to remove biological substances such as contaminating proteins. At this time, some of the contaminants may remain adsorbed nonspecifically with the carrier. Next, by applying a voltage between the carrier and the aqueous solution, the electrocleavable portion of the electrocleavable affinity carrier is cleaved. The voltage to be applied is 0.5V-1.5V, more preferably 0.5V-1.2V, and most preferably 1V. The lower the voltage, the lower the cutting efficiency. When the voltage is higher than 1.5V, water is electrolyzed.
As a method for applying the voltage, in addition to the application of a constant voltage, any method such as a pulse voltage application and a method of applying a reciprocal sweep (sweep) with a sine wave, a sawtooth wave, a triangular wave or the like can be adopted. When the electrolytic cutting portion is cut at a single specific voltage, a constant voltage higher than that voltage may be applied continuously. However, since there are many variations in the cutting voltage, it is preferable that the voltage range that covers the maximum and minimum cutting voltages be swept and applied more reliably.
FIG. 2 shows an embodiment of protein purification using a column packed with the electrocleavable affinity carrier of the present invention. The electrolytically cleavable affinity carrier of the present invention is packed in a column together with an electrolyte solution, and an electrode is mounted so as to be in electrical communication with the carrier. The counter electrode is mounted in electrical communication with the electrolyte solution. The solution containing the protein to be purified is loaded onto the column and the protein is bound to the ligand. When the column is washed to remove contaminating proteins and then a voltage is applied to the electrode, the electrocleavable linker is cleaved at the electrocleavable portion, and the protein bound to the ligand is dissociated from the carrier. By eluting the dissociated protein from the column, the target protein can be recovered.
FIG. 11 shows an example of an apparatus suitable for the production and use of the electrocleavable affinity carrier of the present invention. FIG. 11A is an example of a reaction column that can be used to attach the electrocleavable linker of the present invention to a platinum support. When carrying out the electrolytic reaction, electrodes are mounted as shown in FIG. 11B. Such a column is attached to the suction bottle shown in FIG. 11C, and a reaction solution, a washing solution or an eluate is added from above. The solution can be recovered inside the bottle by aspirating the system after contacting the solution and platinum particles for a desired time.
By using the electrocleavable affinity carrier of the present invention, by appropriately selecting the conditions for eluting the protein, it is possible to prevent elution of contaminating proteins adsorbed non-specifically on the carrier binding arm of the carrier or the electrocleavable linker. Therefore, there is an advantage that contamination protein is very little mixed in the recovered protein.
The present invention also provides a biological material purification kit comprising the electrocleavable affinity carrier of the present invention. The electrocleavable affinity carrier may be provided in a form packed in a column. The kit may further include a solution for dissolving the sample, a washing solution, and an eluent. Alternatively, the kit may include an electrocleavable linker bound to a carrier, in which case the user can bind a ligand to the linker depending on the purpose.
The electrocleavable affinity carrier of the present invention is particularly easily applicable to a biochip for real-time BIA (Biomolecular Interaction Analysis). The biochip for BIA is a trade name of BIAcore (registered trademark; hereinafter referred to as “BIAcore chip”), and is commercially available from Biacore AB (Uppsala, Sweden). Such chip technology is disclosed in USP 5,641,640, USP 5,955,729, Japanese Patent No. 3294605, and Japanese Translation of PCT National Publication No. 07-507865, and the outline thereof will be described below.
The BIAcore chip uses a surface plasmon resonance (SPR) phenomenon to detect an interaction between molecules on the surface of the sensor chip. In order to allow biological substances such as ligands and proteins to interact, a fine flow channel through which these substances flow is formed on the surface of the BIAcore chip. Immobilize the ligand on its surface. FIG. 7 shows a cross-sectional view of a BIAcore chip and a schematic diagram of the principle for detecting the interaction between a biological substance and a ligand using the BIAcore chip.
In FIG. 7, F is a biological material flow channel, G is a gold deposition film, P is polarized light, and R is totally reflected light. L is a ligand, D is dextran, and DL is a dextran binding linker. On the surface of the BIAcore chip, dextran having a length of about 100 nm is bound, and the target ligand is bound to the dextran. As shown in the figure, a single ligand may be attached to a single dextran, or a plurality of ligands may be attached to a dextran in which a plurality of ligands are branched. In SPR, it is said that detection is possible when a substance binds to a ligand within a distance of about 100 nm or less. When the substance and the ligand fixed on the surface interact with each other, a refractive index change due to SPR occurs, and this is optically measured on the back surface of the sensor chip. Thus, the interaction between the ligand and the biological substance containing the protein can be detected, and the interaction can be quantified from the reflection angle of the reflected light. As shown in FIG. 7, on the surface of the BIAcore chip, a gold vapor deposition film with good optical characteristics (high total reflectance) is used for using SPR.
Since the gold thin film is used, the electrocleavable affinity carrier of the present invention can be easily applied to the BIAcore chip. That is, the electrocleavable affinity carrier of the present invention can be bound to the gold thin film surface of the BIAcore chip. Alternatively, the electrocleavable affinity carrier of the present invention may be bound to a part of conventionally used dextran. Then, one of the electrodes for applying the voltage is electrically connected to the gold thin film of the BIAcore chip. It is easy to add such an electric circuit. In this way, the interaction between the substance and the fixed ligand can be monitored quantitatively in real time by the real-time BIA technology, and the fixed ligand can be separated at a desired timing. For example, if the binding between the ligand and the protein is detected, then the washing reagent is run in the flow of the chip surface, and after the washing is completed, the binding protein is separated, and only the protein that specifically binds to the immobilized ligand is recovered with high purity. can do.
FIG. 8 is a schematic view of an example in which the electrocleavable affinity carrier of the present invention is applied to a BIAcore chip. LA is a ligand binding arm, CP is a cleavage site, and CA is a carrier binding arm. The length of the carrier binding arm is selected so that the electrocleavable affinity carrier is cut at the cutting site when a voltage is applied using a gold vapor deposition film as an electrode. Alternatively, the length of the longer carrier binding arm can be selected so that the electrocleavable affinity carrier of the present invention moves non-stationarily in the flow channel flow with the ligand immobilized on the surface of the BIAcore chip. It may be cut when the part moves a predetermined distance from the carrier.
The contents of all patents and references explicitly cited herein are hereby incorporated by reference as part of the present specification. In addition, the contents described in the specification and drawings of Japanese Patent Application No. 2002-241072, which is an application on which the priority of the present application is based, are cited herein as part of the present specification.

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。以下の実施例は、電子移動に伴って開裂する本発明の電解切断性リンカーの化学合成および切断、ならびにこれを用いる蛋白質の精製の例を示す。
実施例１．金粒子上に硫黄原子を介して結合した電解開裂ユニットを有するリンカーの合成

ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド（１０ｍｍｏｌ）

および３−メルカプト−プロピオン酸（２２ｍｍｏｌ）

をジクロロメタンに室温にて溶解した。次に、三フッ化ホウ素・ジエチルエーテル錯体（０．１ｍｍｏｌ）を添加し、５分間攪拌した。直ちに反応溶液に食塩水を添加し、酢酸エチルによって抽出した。酢酸エチル層は食塩水により洗浄した。無水硫酸ナトリウムで酢酸エチル溶液を乾燥、ろ過、濃縮乾固した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒ヘキサン−酢酸エチル）により精製して、３−［（２−カルボキシ−エチルスルファニル）−（４−ヒドロキシ−フェニル）−メチルスルファニル］−プロピオン酸を得た。

新たに３−メルカプト−プロピオン酸（５ｍｍｏｌ）に、２０ｍｍｏｌの塩化チオニルを加え、１時間室温で攪拌した。この溶液を、減圧濃縮後、ジクロロメタンを加え、さらに先に調製した３−［（２−カルボキシ−エチルスルファニル）−（４−ヒドロキシ−フェニル）−メチルスルファニル］−プロピオン酸（５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２０ｍｍｏｌ）を加えアルゴン気流下、室温でさらに１６時間攪拌した。反応終了後、５％クエン酸水溶液および酢酸エチルを加え、生成物を酢酸エチルによって抽出した。酢酸エチル層はさらに５％クエン酸水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、濃縮した。残渣にアセトニトリルを加えて溶解し、さらに金粒子を添加し、アルゴン気流下、室温で１８時間放置した。続いて、金粒子をろ別、アセトニトリルで５回洗浄後、ジメチルホルムアミドに浸漬した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｍｏｌ）および２，２′−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（２０ｍｍｏｌ）

を添加し、室温にて４時間攪拌した。次に、金粒子をろ別し、アセトニトリルで５回洗浄した。このようにして得られた金粒子は末端にアミノ基を有し、任意のリガンドを当該アミンと結合させることができる。
実施例２．水溶液中における電気化学的な切断
末端アミンにリガンドのモデルとして、塩化ベンゾイルを反応させることによりベンゾイル化した。化学修飾済みの金粒子をジメチルホルムアミド中に分散させたのち、過剰量の塩化ベンゾイルを添加し、室温にて３時間攪拌した。反応容器を氷冷した後、メタノールを滴下した。その後、金粒子を分別し、アセトニトリルで５回洗浄、さらに純水で３回洗浄した。得られた金粒子を図２のようにカラム管に詰め、白金導線をセットした後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を満たした。次に、金粒子側を陽極として、端子電圧０ｖから１．６Ｖの間で繰り返し電位を掃引した（往復掃引、１００ｍＶ／ｓｅｃ）。４０回掃引後、導線を外し、カラムから緩衝液を溶出させた。本緩衝液から、電解によってジチオアセタール部分で切断されたリガンドユニットが回収された。
実施例３．白金−酸化白金粒子上に珪素原子を介して結合した電解開裂ユニットを有するリンカーの合成

２，５−ジヒドロキシベンズアルデヒド（１０ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフランに溶解し、アルゴン気流下、トリフェニルホスホラニリデン酢酸メチルエステル（１２ｍｍｏｌ）を添加し、１８時間室温にて攪拌した。反応液に飽和食塩水および酢酸エチルを添加し、酢酸エチル層を飽和食塩水で２回洗浄後、濃縮乾固した。この残渣に酢酸エチルおよび５％パラジウム／炭素存在下、水素ガス気流下にて接触水素添加を行った。水素添加完了後、パラジウム／炭素をろ過して除き、濃縮乾固した。残渣を希塩酸にて加水分解し、３−（２，５−ジヒドロキシ−フェニル）−プロピオン酸を得た。

一方、表面を酸化白金とした白金粒子１．０グラムをアセトニトリル中に分散後、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（１０ｍｍｏｌ）を添加し、室温、アルゴン気流下２４時間攪拌した。白金粒子をろ別し、アセトニトリルで５回洗浄後、再び白金粒子をアセトニトリルに浸漬した。次に、無水コハク酸（１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０ｍｍｏｌ）を添加し、４時間室温にて攪拌を続けた。反応終了後白金粒子をろ別、アセトニトリルでさらに５回洗浄した。続いて、得られた白金粒子をさらに新たなアセトニトリルに分散し、塩化チオニル（１０ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン気流下で室温にて３時間攪拌した。反応終了後、白金粒子をろ過、洗浄し、直ちに、３−（２，５−ジヒドロキシ−フェニル）−プロピオン酸（１０ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル溶液中に白金粒子を浸漬、攪拌し、１６時間放置した。最後に、白金粒子をろ別、洗浄した。次に、この白金粒子をアセトニトリルに浸漬した後、１，６−ジアミノヘキサン（１０ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２０ｍｍｏｌ）を添加し、室温にて１０時間攪拌した。反応終了後、白金粒子をろ別、洗浄し、目的とする金−酸化白金粒子上に珪素原子を介して結合した電解開裂ユニットを有するリンカーを得た。このようにして得られた白金粒子は末端にアミノ基を有し、任意のリガンドを当該アミンと結合させることができる。
実施例４．水溶液中における電気化学的切断
末端アミンにリガンドのモデルとして、塩化ベンゾイルを反応させることによりベンゾイル化した。化学修飾済みの金粒子をジメチルホルムアミド中に分散させたのち、過剰量の塩化ベンゾイルを添加した。室温にて３時間攪拌した。反応容器を氷冷した後、メタノールを滴下した。その後、白金粒子を分別し、アセトニトリルで５回洗浄、さらに純水で３回洗浄した。得られた白金粒子を図２のようにカラム管に詰め、白金導線をセットした後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を満たした。次に、白金粒子側を陽極として、端子電圧０Ｖから１．６Ｖの間で繰り返し電位を掃引した（往復掃引、１００ｍＶ／ｓｅｃ）。４０回掃引後、導線を外し、カラムから緩衝液を溶出させた。本緩衝液から、電解によってフェニルエステル部分で切断されたリガンドユニットが回収された。
実施例５．生体物質のアフィニティー吸着−電解切断法による精製
金表面に結合させることにより調製した次式：

のリンカーを有する金粒子２．０ｇを、乾燥ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中に分散させた。この分散溶液にビオチン２０ｍｇ、ジシクロヘキシルカルボジイミド１００ｍｇを添加し、アルゴン気流下、室温にて２４時間攪拌することにより、次式：

に示すリガンド結合体を作成した。この分散溶液をろ過、アセトニトリルで５回洗浄後、燐酸緩衝液中に分散した。このようにして得られた、ビオチンが結合した金粒子をカラムに詰めた。このとき、導線および対極をセットした。次に、分離目的とする糖タンパク質アビジン２ｍｇを含む燐酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌを、通過させた（流速約０．２ｍｌ／ｍｉｎ）。続いて、生体分子を含まない燐酸緩衝液４０ｍｌを用い、同じ流速にて洗浄操作を行い、洗浄液中に蛋白質が溶出しないことを、紫外線吸収スペクトルおよび高速液体クロマトグラフィーによって確認した。次に、電解によるアビジン−ビオチン複合体の溶出を行った。このとき、溶出液として同じ燐酸緩衝液を用い、カラムに溶出液を供給しながら、０ボルトから１．５ボルトの範囲で電位掃引を繰り返した。このとき溶出液を捕集し、複合体の溶出を紫外線吸収および高速液体クロマトグラフィーによって確認した。
実施例６．白金粒子アフィニティー担体の製造
パラメトキシベンズアルデヒドおよび３−メルカプトプロピルトリメトキシシランから、図９に記載のスキームにしたがって、電解切断性リンカーを合成した。このリンカーをｎ−ブタノールに溶解し、表面を酸化白金とした粒径１−１０μｍの白金粒子１ｇを加えて、酸化白金表面にトリアルコキシシリル基を解してリンカーを結合させた。シリル基一つあたり１から３個の酸素原子を介して白金表面に結合していた。電解溶液中で白金担体を陽極として通電することにより、選択的にベンジルジチオアセタール部位が酸化的に開裂し、切断されたアルデヒドが溶出した。
実施例７．白金粒子アフィニティー担体を用いる電解切断
実施例６において製造した電解切断性リンカーに４−ブロモブタン酸を反応させて、末端にカルボキシル基を導入し、これにリガンドのモデルとして色素（ＡｚｕｒｅＡ）を結合させた。実験は図１１に示す装置を用いて行った。色素を結合させた酸化白金粒子をカラムに充填し、電解溶液（１Ｍ過塩素酸リチウム水溶液）を満たし１０分間放置した後に、電解溶液を吸引除去した。カラムを３回、電解溶液（１Ｍ過塩素酸リチウム水溶液）で洗浄した。洗浄溶液は透明であり、色素成分が溶出しないことを確認した。次に、電解溶液を充填し、白金担体を陽極として通電（１．５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ，５分間）した。吸引ろ過すると青色色素が溶出した。すなわち、選択的にベンジルジチオアセタール部位が酸化的に開裂し、切断されたアルデヒド（青色色素）が溶出した。電解時間が３０秒の段階では、溶出色素の吸光度により判定して、白金１グラムあたりの色素の量は０．１ｘ１０^−５モルであった。５分間の通電後に溶出した色素は白金１グラムあたり０．８ｘ１０^−５モルであった。このことから、明らかに通電、すなわち電解酸化によって色素成分が切断され、溶出されたことが示された。
実施例８．リガンドとしてビオチンを有する白金粒子アフィニティー担体の製造
図１２に示すビオチン結合白金粒子アフィニティー担体を合成した。合成方法は図１３に記載されるスキームにしたがった。得られたビオチン結合電解切断アフィニティー担体をカラムに充填し、カラムにアビジン水溶液を流し、続いて純水および電解質溶液で洗浄した。次に、このアフィニティー担体に１．５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ，５分間電位を印加した後、カラム中の電解液を溶出させた。溶出液を電気泳動法により分析して、アビジンが溶出されたことを確認した（図１４）。EXAMPLES The present invention will be described below in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. The following examples show chemical synthesis and cleavage of the electrocleavable linker of the present invention that cleaves upon electron transfer, and examples of protein purification using the same.
Example 1. Synthesis of linker having an electrolytic cleavage unit attached through a sulfur atom onto gold particles

p-Hydroxybenzaldehyde (10 mmol)

And 3-mercapto-propionic acid (22 mmol)

Was dissolved in dichloromethane at room temperature. Next, boron trifluoride-diethyl ether complex (0.1 mmol) was added and stirred for 5 minutes. Immediately, brine was added to the reaction solution, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with brine. The ethyl acetate solution was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, concentrated to dryness, and purified by silica gel column chromatography (elution solvent hexane-ethyl acetate) to give 3-[(2-carboxy-ethylsulfanyl)-(4- Hydroxy-phenyl) -methylsulfanyl] -propionic acid was obtained.

To 3-mercapto-propionic acid (5 mmol), 20 mmol of thionyl chloride was newly added and stirred at room temperature for 1 hour. The solution was concentrated under reduced pressure, dichloromethane was added, and 3-[(2-carboxy-ethylsulfanyl)-(4-hydroxy-phenyl) -methylsulfanyl] -propionic acid (5 mmol) and triethylamine (20 mmol) prepared earlier were further added. ) And stirred at room temperature for 16 hours under a stream of argon. After completion of the reaction, 5% aqueous citric acid solution and ethyl acetate were added, and the product was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was further washed with a 5% aqueous citric acid solution, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated. Acetonitrile was added to the residue for dissolution, gold particles were further added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 18 hours under a stream of argon. Subsequently, the gold particles were separated by filtration, washed 5 times with acetonitrile, and then immersed in dimethylformamide. Dicyclohexylcarbodiimide (10 mmol) and 2,2 '-(ethylenedioxy) bis (ethylamine) (20 mmol)

And stirred at room temperature for 4 hours. Next, the gold particles were filtered off and washed 5 times with acetonitrile. The gold particles thus obtained have an amino group at the terminal, and any ligand can be bound to the amine.
Example 2 Benzoylation was performed by reacting benzoyl chloride as a ligand model with an electrochemically cleaved terminal amine in aqueous solution . After the chemically modified gold particles were dispersed in dimethylformamide, an excess amount of benzoyl chloride was added and stirred at room temperature for 3 hours. After cooling the reaction vessel with ice, methanol was added dropwise. Thereafter, the gold particles were separated, washed 5 times with acetonitrile, and further washed 3 times with pure water. The obtained gold particles were packed in a column tube as shown in FIG. 2, and after setting a platinum lead, 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.2) was filled. Next, with the gold particle side as the anode, the potential was repeatedly swept between the terminal voltage of 0 v and 1.6 V (reciprocating sweep, 100 mV / sec). After 40 sweeps, the lead was disconnected and the buffer was eluted from the column. From this buffer solution, the ligand unit cleaved at the dithioacetal moiety by electrolysis was recovered.
Example 3 Synthesis of linkers with electrolytic cleavage units bonded to platinum-platinum oxide particles via silicon atoms

2,5-Dihydroxybenzaldehyde (10 mmol) was dissolved in dry tetrahydrofuran, triphenylphosphoranylideneacetic acid methyl ester (12 mmol) was added under an argon stream, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours. Saturated brine and ethyl acetate were added to the reaction solution, and the ethyl acetate layer was washed twice with saturated brine and then concentrated to dryness. This residue was subjected to catalytic hydrogenation in the presence of ethyl acetate and 5% palladium / carbon in a hydrogen gas stream. After completion of hydrogenation, palladium / carbon was filtered off and concentrated to dryness. The residue was hydrolyzed with dilute hydrochloric acid to obtain 3- (2,5-dihydroxy-phenyl) -propionic acid.

On the other hand, after dispersing 1.0 g of platinum particles whose surface was platinum oxide in acetonitrile, 3-aminopropyltrimethoxysilane (10 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours under an argon stream. The platinum particles were filtered off, washed 5 times with acetonitrile, and then again immersed in acetonitrile. Next, succinic anhydride (10 mmol) and triethylamine (10 mmol) were added and stirring was continued for 4 hours at room temperature. After completion of the reaction, the platinum particles were filtered off and further washed 5 times with acetonitrile. Subsequently, the obtained platinum particles were further dispersed in fresh acetonitrile, thionyl chloride (10 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours under an argon stream. After completion of the reaction, the platinum particles were filtered and washed, and immediately, the platinum particles were immersed in an acetonitrile solution containing 3- (2,5-dihydroxy-phenyl) -propionic acid (10 mmol), stirred, and left for 16 hours. Finally, the platinum particles were filtered and washed. Next, after immersing the platinum particles in acetonitrile, 1,6-diaminohexane (10 mmol) and dicyclohexylcarbodiimide (20 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 hours. After completion of the reaction, the platinum particles were filtered and washed to obtain a linker having an electrolytic cleavage unit bonded to the target gold-platinum oxide particles via silicon atoms. The platinum particles thus obtained have an amino group at the terminal, and any ligand can be bound to the amine.
Example 4 Benzoylation was performed by reacting an electrochemically cleaved terminal amine in aqueous solution with benzoyl chloride as a model of the ligand. After the chemically modified gold particles were dispersed in dimethylformamide, an excess amount of benzoyl chloride was added. Stir at room temperature for 3 hours. After cooling the reaction vessel with ice, methanol was added dropwise. Thereafter, the platinum particles were separated, washed 5 times with acetonitrile, and further washed 3 times with pure water. The obtained platinum particles were packed in a column tube as shown in FIG. 2, and after setting a platinum conductor, 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) was filled. Next, with the platinum particle side as the anode, the potential was repeatedly swept between the terminal voltage of 0 V and 1.6 V (reciprocating sweep, 100 mV / sec). After 40 sweeps, the lead was disconnected and the buffer was eluted from the column. From this buffer solution, the ligand unit cleaved at the phenyl ester moiety by electrolysis was recovered.
Embodiment 5 FIG. The following formula was prepared by binding to a purified gold surface by affinity adsorption-electrolytic cleavage of biological material :

2.0 g of gold particles having a linker of 2 were dispersed in 10 ml of dry dimethylformamide. By adding 20 mg of biotin and 100 mg of dicyclohexylcarbodiimide to this dispersion, and stirring for 24 hours at room temperature under an argon stream, the following formula:

The ligand conjugate shown in FIG. This dispersion was filtered, washed 5 times with acetonitrile, and then dispersed in a phosphate buffer. The gold particles bound with biotin thus obtained were packed in a column. At this time, a conducting wire and a counter electrode were set. Next, 10 ml of a phosphate buffer (pH 7.2) containing 2 mg of the glycoprotein avidin to be separated was passed (flow rate: about 0.2 ml / min). Subsequently, a washing operation was performed at the same flow rate using 40 ml of a phosphate buffer containing no biomolecule, and it was confirmed by ultraviolet absorption spectrum and high performance liquid chromatography that the protein was not eluted in the washing solution. Next, the avidin-biotin complex was eluted by electrolysis. At this time, the same phosphate buffer was used as the eluent, and the potential sweep was repeated in the range of 0 to 1.5 volts while supplying the eluate to the column. At this time, the eluate was collected, and elution of the complex was confirmed by ultraviolet absorption and high performance liquid chromatography.
Example 6 Production of Platinum Particle Affinity Carrier An electrocleavable linker was synthesized from paramethoxybenzaldehyde and 3-mercaptopropyltrimethoxysilane according to the scheme shown in FIG. This linker was dissolved in n-butanol, 1 g of platinum particles having a particle size of 1-10 μm whose surface was platinum oxide was added, and the linker was bonded to the surface of the platinum oxide by breaking the trialkoxysilyl group. Each silyl group was bonded to the platinum surface via 1 to 3 oxygen atoms. By energizing the platinum carrier as an anode in the electrolytic solution, the benzyldithioacetal site was selectively cleaved oxidatively, and the cleaved aldehyde was eluted.
Example 7 Electrolytic cleavage using platinum particle affinity carrier The electrocleavable linker produced in Example 6 was reacted with 4-bromobutanoic acid to introduce a carboxyl group at the terminal, and a dye (Azure A) was bound thereto as a ligand model. It was. The experiment was performed using the apparatus shown in FIG. The column was filled with platinum oxide particles bound with a dye, filled with an electrolytic solution (1M aqueous solution of lithium perchlorate) and allowed to stand for 10 minutes, and then the electrolytic solution was removed by suction. The column was washed three times with an electrolytic solution (1M aqueous lithium perchlorate). The washing solution was transparent and it was confirmed that the dye component did not elute. Next, the electrolytic solution was filled and energized (1.5 V vs Ag / AgCl, 5 minutes) using the platinum carrier as an anode. The blue pigment was eluted by suction filtration. That is, the benzyldithioacetal site was selectively cleaved oxidatively, and the cleaved aldehyde (blue dye) was eluted. When the electrolysis time was 30 seconds, the amount of the dye per gram of platinum was 0.1 × 10 ⁻⁵ mol as judged by the absorbance of the eluted dye. The dye eluted after 5 minutes of energization was 0.8 × 10 ⁻⁵ mol per gram of platinum. This clearly showed that the pigment component was cut and eluted by energization, that is, electrolytic oxidation.
Example 8 FIG. Production of platinum particle affinity carrier having biotin as a ligand The biotin-bound platinum particle affinity carrier shown in FIG. 12 was synthesized. The synthesis method followed the scheme described in FIG. The obtained biotin-coupled electrolytic cleavage affinity carrier was packed into a column, and an avidin aqueous solution was allowed to flow through the column, followed by washing with pure water and an electrolyte solution. Next, 1.5 V vs Ag / AgCl, a potential was applied to the affinity carrier for 5 minutes, and then the electrolyte in the column was eluted. The eluate was analyzed by electrophoresis to confirm that avidin was eluted (FIG. 14).

Claims

A method for purifying biological material comprising:
A method comprising recovering the biological material by contacting an aqueous solution containing the biological material with an electrocleavable affinity carrier, and applying a voltage to the aqueous solution to cleave the electrolytically cleavable affinity carrier.

The method of claim 1, wherein the electrocleavable affinity carrier is comprised of a ligand bound to a solid support via an electrocleavable linker.

The method of claim 2, wherein the electrocleavable linker is bound to the solid support by a platinum oxide-silicon bond.

The electrolytic cleavable linker is
Electrolytic cutting part,
The method of claim 2, comprising at least one ligand binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety and at least one carrier binding arm coupled to the electrolytic cleavage moiety.

An electrocleavable affinity carrier which is an electrocleavable affinity carrier which is cleaved by applying a voltage, the electrocleavable affinity carrier comprising a ligand bound to a solid carrier via an electrocleavable linker.

The electrolytically cleavable affinity carrier according to claim 5, wherein the electrolytically cleavable linker is bound to a solid carrier by a platinum oxide-silicon bond.

The electrolytic cleavable linker is
Electrolytic cutting part,
6. The electrocleavable affinity carrier according to claim 5, comprising at least one ligand binding arm bound to the electrolytic cleavage moiety and at least one carrier binding arm bound to the electrolytic cleavage moiety.

A biological material purification kit comprising the electrocleavable affinity carrier according to claim 5, 6 or 7.

An electrocleavable linker that is cleaved by applying a voltage,
Electrolytic cutting part,
Electrolytic cleavable linker comprising at least one ligand binding arm bound to the electrolytic cleavage moiety and at least one carrier binding arm bound to the electrolytic cleavage moiety.

10. The electrocleavable linker of claim 9, further comprising at least one carrier bound via the carrier binding arm.

The electrocleavable linker according to claim 10, wherein the carrier binding arm is bonded to a solid support by a platinum oxide-silicon bond.