JPWO2003104265A1 - Compound having glycine transporter inhibitory activity - Google Patents

Abstract

In the formula, R1, R2, and R3 each represent a hydrogen atom or a methyl group, R4 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R5 represents a hydrogen atom or a methyl group. ] Is a novel physiologically active substance having inhibitory activity against glial cell glycine transporter, and is useful as a therapeutic agent for schizophrenia.

Description

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３はそれぞれ水素原子またはメチル基、Ｒ_４は水素原子または水酸基、Ｒ_５は水素原子またはメチル基を示す］で示される化合物、及び、式２

で示される化合物である。
以下、式１で示され、Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３が水素原子、Ｒ_４が水酸基、Ｒ_５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２１７、Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３がメチル基、Ｒ_４およびＲ_５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２１８、Ｒ_１，Ｒ_２がメチル基，Ｒ_３が水素原子、Ｒ_４が水酸基、Ｒ_５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２１９、Ｒ_１が水素原子，Ｒ_２がメチル基，Ｒ_３が水素原子、Ｒ_４が水酸基、Ｒ_５が水素原子である化合物をＷＳＳ２２２１、Ｒ_１がメチル基，Ｒ_２，Ｒ_３が水素原子、Ｒ_４が水酸基である化合物をＷＳＳ２２２２、Ｒ_１，Ｒ_２がメチル基，Ｒ_３が水素原子、Ｒ_４が水酸基、Ｒ_５がメチル基である化合物をＷＳＳ８０２７と称する。また、式２で示される化合物をＷＳＳ２２２０と称する。
本発明者らは、前記目的達成のために多数の菌株を土壌および植物より分離し、その菌株の代謝産物について種々検討した結果、ある種の菌株の産生する化合物がラットグリア細胞のグリシン取り込みに対して強い阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
この菌株の菌学的性状を以下に示す。
ＷＳＳ２２１７、ＷＳＳ２２１８、ＷＳＳ２２１９、ＷＳＳ２２２０、ＷＳＳ２２２１、及びＷＳＳ２２２２を産生する菌株は、本発明者らが自然界より分離した放線菌であり、以下に菌学的性状を示す。
Ａ．形態的性質
よく分岐した基生菌糸より気菌糸を形成する。気菌糸上にはフック状、カール状、あるいは緩い螺旋状（１〜３巻き）の４〜１５胞子から成る短い胞子鎖を単生する。胞子は、大きさが１．０〜１．３×１．４〜２．０μｍで、形が卵形で、表面がしわ状である。なお、菌束糸、胞子嚢や疑似胞子嚢の形成、及び胞子の運動性は認められない。
Ｂ．培養的性質
各種培地上で、３０℃、３週間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表１に示した。

Ｃ．生理学的性質
１）生育温度範囲
ａ．生育温度 ：１６〜３９℃
ｂ．最適生育温度 ：３２〜３４℃
２）各種性質
ａ．ゼラチンの液化（３０℃、２週間）：陰性
ｂ．脱脂乳の凝固（３７℃、２週間）：陰性
ｃ．脱脂乳のペプトン化（３７℃、２週間）：陰性
ｄ．メラニン様色素の生産（３０℃、２週間）：陰性
ｅ．でんぷんの加水分解（３０℃、２週間）：陰性
３）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上、３０℃、２週間）
Ｌ−アラビノース ： ｗ Ｌ−ラムロース ： ｗ
Ｄ−キシロース ： ＋ ラフィノース ： ＋
Ｄ−グルコース ： ＋ イノシトール ： ＋
Ｄ−フラクトース ： ＋ Ｄ−マンニトール ： ＋
シュクロース ： ＋
（＋：生育する ｗ：弱く生育する）
Ｄ．化学分類学的性質
１）ジアミノピメリン酸の有無と光学異性型：メソ型のジアミノピメリン酸が検出された。
２）メナキノン組成：ＭＫ−９（Ｈ_２）、ＭＫ−９（Ｈ_４）が主成分として検出された。
３）全菌体の還元糖の種類：リボース、マジュロース、マンノース、及びグルコースが検出された。
４）リン脂質：未知のグルコサミン含有リン脂質が検出された。フォスファチジルグリセロールは検出されなかった。
以上の性状をもとに放線菌の分離と同定（日本放線菌学会編、２００１年）に従って検索を行った結果、本菌株はノノムラエア属に属する放線菌に分類することができるので、ノノムラエア・エスピー・ＴＡ−０４２６（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．ＴＡ−０４２６）と命名した。
なお、本菌株は受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−８３７１」として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年１２月４日付けで受託（寄託の移管請求２００３年４月３０日）されている。
ＷＳＳ２２１７〜ＷＳＳ２２２２の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でＴＦ−株を好気的条件下で培養することにより行う。
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質および消泡剤を加えることができ、ｐＨは７前後に調製する。炭素源としては、例えばグルコース、シュウクロース、アキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまたは混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーン・スティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独または混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを、単独または混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物などを用いることができる。
培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、ｐＨ４〜１０、２５〜３５℃で２〜５日間、望ましくはｐＨ６〜７、２５〜２８℃で４日間培養する。
本発明の化合物は、発酵生産物について一般的な方法で精製を行うことにより得られる。すなわち、培養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液および吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび逆層分配用ＯＤＳを充填したカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに伏すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
ＷＳＳ８０２７は以下に示すような方法で合成することができる。すなわち、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第９７巻、第３８０２頁（１９７５年）］に記載の方法に準じて、ＷＳＳ２２１９をヨウ化メチルで処理することによって合成することができる。
以上の方法によって得られたＷＳＳ２２１７〜ＷＳＳ２２２２およびＷＳＳ８０２７は、その分子量、紫外線吸収スペクトル、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル等の解析により、その化学構造が決定された。
ＷＳＳ２２１７の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４７４
（ｃ）．分子式：Ｃ_２５Ｈ_３８Ｎ_４Ｏ_５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：４９７．２７３６
理論値：４９７．２７４０（Ｃ_２５Ｈ_３８Ｎ_４Ｏ_５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−１６９．４（ｃ０．０６２，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：λ_ＭＡＸｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．５（４．２７），２２３．５（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図１に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２１８の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４８６
（ｃ）．分子式：Ｃ_２７Ｈ_４２Ｎ_４Ｏ_４
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５０９．３０９９
理論値：５０９．３１０４（Ｃ_２７Ｈ_４２Ｎ_４Ｏ_４Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−１４６．２（ｃ０．０８１，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ ｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．０（４．２６），２２３．５（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重メタノール中、５００ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重メタノール中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図４に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルム、メタノールに難溶
水、ヘキサン、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２１９の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：５０２
（ｃ）．分子式：Ｃ_２７Ｈ_４２Ｎ_４Ｏ_５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５２５．３０４４
理論値：５２５．３０５３（Ｃ_２７Ｈ_４２Ｎ_４Ｏ_５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−１８２．６（ｃ０．０６８，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ ｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．５（４．２６），２２３．０（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図５に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図６に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２２０の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：５７９
（ｃ）．分子式：Ｃ_２７Ｈ_３９Ｎ_４Ｏ_８Ｓ
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：６２５．２０２３
理論値：６２５．２２８４（Ｃ_２７Ｈ_３９Ｎ_４Ｏ_８Ｓ Ｎａ_２）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−１９０．８（ｃ０．１０４，ｍｅｔｈａｎｏｌ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ ｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０７．５（４．２５），２２３．５（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図７に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図８に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、水、メタノールに可溶
ジオキサン、クロロホルム、アセトンに難溶
ヘキサン、エーテル、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：酸性
ＷＳＳ２２２１の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４８８
（ｃ）．分子式：Ｃ_２６Ｈ_４０Ｎ_４Ｏ_５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５１１．６０３４
理論値：５１１．６１５５（Ｃ_２５Ｈ_３８Ｎ_４Ｏ_５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−２２８．１（ｃ０．０６５，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ ｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０７．０（４．２６），２２３．５（ｓｈ，３．５７）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図９に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図１０に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ２２２２の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：４８８
（ｃ）．分子式：Ｃ_２６Ｈ_４０Ｎ_４Ｏ_５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５１１．６０４８
理論値：５１１．６１５５（Ｃ_２５Ｈ_３８Ｎ_４Ｏ_５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−２２８．１（ｃ０．０６５，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ ｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０７．０（４．２６），２２３．５（ｓｈ，３．５７）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定した結果を図１１に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図１２に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
ＷＳＳ８０２７の理化学的性状は以下の通りである。
（ａ）．外観：白色粉末
（ｂ）．分子量：５５８
（ｃ）．分子式：Ｃ_３１Ｈ_５０Ｎ_４Ｏ_５
（ｄ）．ＨＲ−ＴＯＦマススペクトル
実測値：５８１．７４３３
理論値：５８１．７４９６（Ｃ_３１Ｈ_５０Ｎ_４Ｏ_５Ｎａ）として計算
（ｅ）．比旋光度：［α］_Ｄ ^２５：−１６０．４（ｃ０．０４，ｄｉｏｘａｎｅ）
（ｆ）．紫外線吸収スペクトル：
λＭＡＸ ｎｍ（ｌｏｇ ｅ）ｄｉｏｘａｎｅ：２０６．５（４．２６），２２３．０（ｓｈ，３．５８）
（ｇ）．^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
重ピリジン中、５００ＭＨｚで測定した結果を図１３に示す。
（ｈ）．^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：
重ピリジン中、１２５ＭＨｚで測定した結果を図１４に示す。
（ｉ）．溶剤に対する溶解性：
ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶
クロロホルムに難溶
水、ヘキサン、メタノール、エーテル、アセトン、酢酸エチルに不溶
（ｊ）．塩基性、酸性、中性の区別：中性
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例および試験例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１
ＷＳＳ２２１７、ＷＳＳ２２１８、ＷＳＳ２２１９、ＷＳＳ２２２０の製造
（１）可溶性澱粉２．５％、グルコース１％、フィッシュミール０．５％、ファーマメディア０．３％、ＮＺケース０．３％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地６０ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２気圧で２０分滅菌した。次いで、この無菌培地にＮｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．ＴＡ−０４２６株を接種し、２８℃、２００ｒｐｍで３日間回転振とう培養し、種培養とした。
次に、コーンスターチ２％、グリセリン１．０％、グルコース０．５％、ファーマメディア０．５％、麦芽エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．３％からなる無菌液体培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、これに前記種培養液４ｍｌを加えたものを１００本用意し、２８℃、１８０ｒｐｍで１４日間回転振とう培養した。
培養終了後、得られた培養液１０Ｌに５Ｌのｎ−ブタノールを加えて撹拌し、遠心分離により菌体とｎ−ブタノール抽出画分に分けた。ｎ−ブタノール画分を減圧濃縮して、褐色の油状物質６．０３ｇを得た。
（２）前項の油状物質６．０３ｇをクロロホルム約１０ｍｌに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社製）２００ｍｌ：カラム管 ｆ＝４０ｍｍ］に吸着させた。クロロホルム４００ｍｌで洗浄した後、クロロホルム−メタノール（９８：２〜５０：５０）の混合溶媒で順に溶出した。このうち混合溶媒比（９５：５）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固し、２７２．８ｍｇのＦｒ．１を得た。また混合溶媒比（９０：１０）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固し、１７２．５ｍｇのＦｒ．２を得た。さらに混合溶媒比（８０：２０）で溶出した画分を合わせ減圧濃縮乾固し、３９８．０ｍｇのＦｒ．３を得た。
（３）前項のＦｒ．１を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−０．０２％トリフルオロ酢酸水溶液（６５：３５）を移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製 ＯＤＳ−ＡＭ（１０・×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで保持時間１３〜１６分の画分を分取した。この画分を減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した後、半量の酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル抽出画分を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し１５．２ｍｇのＷＳＳ２２１８を得た。
（４）前項のＦｒ．２を少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液（４５：６５）を移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製 ＯＤＳ−ＡＭ（１０ｆ×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収 ２１０ｎｍでモニターしながら流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで保持時間９．５〜１０分、１５〜１６分の画分を分取した。分取した２画分を各々合わせ減圧濃縮し、アセトニトリルを除去した後、半量の酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル抽出画分を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し３．５ｍｇのＷＳＳ２２１７、１３．４ｍｇのＷＳＳ２２１９を得た。
（５）前項のＦｒ．３を少量のメタノールに溶解し、３０％アセトニトリルを移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製 ＯＤＳ−ＡＭ（２０ｆ×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速１０ｍｌ／ｍｉｎで保持時間８．０〜９．０分の画分を分取した。分取した画分を減圧濃縮乾固し、８．８ｍｇのＷＳＳ２２２０を得た。
実施例２
ＷＳＳ２２２１、ＷＳＳ２２２２の製造
（１）可溶性澱粉２．５％、グルコース１％、フィッシュミール０．５％、ファーマメディア０．３％、ＮＺケース０．３％、酵母エキス０．２％、炭酸カルシウム０．２％を含む液体培地６０ｍｌを３００ｍｌの三角フラスコに入れ、１２０℃、２気圧で２０分滅菌した。次いで、この無菌培地にＮｏｎｏｍｕｒａｅａ ｓｐ．ＴＡ−０４２６株を接種し、２８℃、２００ｒｐｍで３日間回転振とう培養し、種培養とした。
次に、コーンスターチ２％、グリセリン１．０％、グルコース０．５％、ファーマメディア０．５％、麦芽エキス０．５％、ポリペプトン０．３％、硫酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．３％からなる無菌液体培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、これに前記種培養液４ｍｌを加えたものを１５０本用意し、２８℃、１８０ｒｐｍで１４日間回転振とう培養した。
培養終了後、得られた培養液１５Ｌに５Ｌのｎ−ブタノールを加えて撹拌し、遠心分離により菌体とｎ−ブタノール抽出画分に分けた。
ｎ−ブタノール画分を減圧濃縮後、酢酸でｐＨ３．０に調製した水５００ｍｌを加えて撹拌し、５００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル抽出画分を合わせて減圧濃縮し、褐色の油状物質２．８３ｇを得た。
（２）前項の油状物質２．８３ｇをクロロホルム約１０ｍｌに溶解し、クロロホルムで調製したシリカゲル［Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ社製）２５０ｍｌ：カラム管 ｆ＝４０ｍｍ］に吸着させた。クロロホルム４００ｍｌで洗浄した後、クロロホルム−メタノール（９９：１〜５０：５０）の混合溶媒で順に溶出した。このうち混合溶媒比（９０：１０）で溶出した画分と混合溶媒比（８０：２０）で溶出した画分を合わせて減圧濃縮乾固し、褐色油状物質８６４ｍｇを得た。
（３）前項の褐色物質８６４ｍｇを少量のメタノールに溶解し、アセトニトリル−０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液（４５：５５）を移動相とした分取高速液体クロマトグラフィー［使用装置：日本分光社製、カラム：ワイエムシー社製ＯＤＳ−ＡＭ（２０・×２５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速１０ｍｌ／ｍｉｎで保持時間１２〜１２．５分、１３〜１４分の画分を分取した。分取した２画分を各々合わせ減圧濃縮乾固し、５．３ｍｇのＷＳＳ２２２１、３．７ｍｇのＷＳＳ２２２２を得た。
実施例３
ＷＳＳ８０２７の製造
窒素気流下、水素化ナトリウム（１００．６ｍｇ）にジメチルホルムアミド１ｍｌを加えて氷冷下、撹拌した。これにＷＳＳ２２１９（１２．９ｍｇ）を溶解したジメチルホルムアミド１ｍｌを加えた後、ヨウ化メチル（３００ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、氷冷下にて水及び酢酸エチルを加え、酢酸エチル抽出画分を減圧留去した。残渣を分取高速液体クロマトグラフィー［移動相：アセトニトリル−０．０２％トリフルオロ酢酸水溶液（８０：２０）、使用装置：ウォーターズ社製、カラム：ワイエムシー社製 ＯＤＳ−ＡＭ（１０ｆ×１５０ｍｍ）］を用い、紫外線吸収２１０ｎｍでモニターしながら流速２．５ｍｌ／ｍｉｎで分取した。分取した画分を減圧濃縮乾固し、４．４ｍｇのＷＳＳ８０２７を得た。
試験例１ ラットグリア細胞に対するグリシン取り込み抑制試験
（検体）
ＷＳＳ２２１７、ＷＳＳ２２１８、ＷＳＳ２２１９、ＷＳＳ２２２０、ＷＳＳ２２２１、ＷＳＳ２２２２及びＷＳＳ８０２７をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解し、滅菌水で目的濃度となるように希釈したものを用いた。
（試験細胞）
ラットグリア細胞Ｃ_６
（試験方法）
液体シンチレーションカクテル含有の平底９６穴プレート（Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ：アマシャムファルマシアバイオテク社製）にＣ_６細胞を５Ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、１０％仔牛血清（ギブコ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、培地を１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭグルコースの組成のバッファーに交換した。さらに目的濃度の薬物溶液０．０１ｍｌ、および３７５ＫＢｑ／ｍｌの［^１４Ｃ］−グリシンを０．０１ｍｌ添加して、３７℃で５０分間培養した。培養後、バッファーを吸引除去し、室温で５時間乾燥させた。その後プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ；パッカード社製）で放射活性を測定した。抑制率はコントロール群の放射活性を０％、過剰量（１０ｍＭ）グリシン添加群を１００％とし、薬物添加群の放射活性との比較から求めた。
抑制率（％）＝［（薬物添加群の値−過剰量グリシン添加群の値）／（薬物未添加群の値−過剰量グリシン添加群の値）］×１００
抑制率５０％を示す化合物濃度をＩＣ_５０（μＭ）として表２に示した。また、ポジティブコントロールとしてＧｌｙｃｉｎｅの抑制率を同時に求めた。

試験例２ 脳内マイクロダイアリシス法を用いたグリシン遊離量の測定
グリシンは他の神経伝達物質およびアミノ酸と同様に脳内において特異的トランスポーターによって神経細胞およびグリア細胞に取り込まれ、その作用を消失させる。従って、グリシンの取り込みを阻害することによりシナプス間隙のグリシン濃度が高まり、ポストシナプスのＮＭＤＡ受容体を刺激することが可能となる。
グリシン取り込み機構を阻害し、前頭前野局所におけるグリシン量を増加させることから統合失調症治療薬になる可能性が期待できる。
そこで本発明化合物の前頭前野グリシン量に対する作用を検討した。
（検体）
ＷＳＳ２２２０
（測定方法）
被験動物としてＳＤ系雄性ラットを用いた。あらかじめ測定部位である前頭前野（ＡＰ＋３．２，Ｌ±０．９，Ｖ脳表面下０．８）に透析プローブ挿入用ガイドカニューレを植込み、術後約１週間の回復を待ってから実験を開始した。
測定当日、エーテル麻酔下でガイドカニューレを通して透析プローブ（透析膜３ｍｍ）挿入固定後、無麻酔下で透析液（リンゲル液）を２μｌ／ｍｌで環流しながら２０分間隔でサンプル（４０μｌ）を回収した。ダイアリシスサンプルと２０ｍＭ ＯＰＡ−ＭＥを３：１で混合し、１０℃にて２．５分間反応させた後、ＨＰＬＣにて誘導体化されたアミノ酸を検出した。Ｂａｓａｌ ｌｅｖｅｌは、投与前１時間（３サンプル）の平均遊離量とした。ＷＳＳ２２２０ １０μｍｏｌ／Ｌは１０ｍｍｏｌ／ＬＤＭＳＯ溶液をリンゲル液で希釈し、還流液として透析プローブを介して注入した。薬物還流液は３時間処置した後、通常のリンゲル液に戻した。
（結果及び考察）
結果を第１５図に示した。
ｖｅｈｉｃｌｅ（０．１％ＤＭＳＯ／リンゲル）の前頭前野内局所投与ではグリシン量の変化は認められなかった。
ＷＳＳ２２２０ １０μｍｏｌ／Ｌ含有還流液中を３時間処置したところ、最大１００．７％のグリシン量増加が認められた。本化合物は、グリシン取り込み阻害に起因すると思われるグリシン量増加が確認された。
本化合物は前頭前野局所においてグリシン取り込み機構を阻害し、前頭前野局所におけるグリシン量を増加させることから統合失調症治療薬になる可能性が示唆された。
産業上の利用可能性
本発明の化合物はグリア細胞に発現したグリシントランスポーターに対する取り込み阻害作用を有するので、統合失調症治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１７の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第２図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１７の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第３図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１８の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第４図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１８の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第５図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１９の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第６図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２１９の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第７図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２０の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第８図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２０の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第９図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２１の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１０図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２１の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１１図は重ジメチルスルホキシド中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２２の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１２図は重ジメチルスルホキシド中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ２２２２の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１３図は重ピリジン中、５００ＭＨｚで測定したＷＳＳ８０２７の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。
第１４図は重ピリジン中、１２５ＭＨｚで測定したＷＳＳ８０２７の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した図である。Technical field
The present invention relates to a novel compound having glycine transporter inhibitory activity expressed in mammalian glial cells.
Background art
In recent years, it has been said that the transmission function of glutamate nerves is reduced as a cause of schizophrenia, and that the number of glutamate receptors is increased in the brain of schizophrenia patients. Glycine is known to bind to the glutamate receptor and activate the receptor. Since the amount of glycine present in the synaptic cleft is regulated by uptake by the glycine transporter expressed in glial cells, inhibitors of the glycine transporter increase the amount of glycine in the synaptic cleft and activate the glutamate receptor It is useful as a therapeutic drug for schizophrenia.
There are no known compounds that are structurally similar to the compounds of the present invention and that have uptake inhibitory activity against glycine transporters.
An object of the present invention is to provide a novel physiologically active substance having inhibitory activity against glial cell glycine transporter.
Disclosure of the invention
As a result of various studies, the present inventors have found that certain compounds have excellent inhibitory activity against glycine transporters of glial cells, and have completed the present invention.
That is, the present invention is represented by the formula 1

[Wherein R₁, R₂, R₃Are each a hydrogen atom or a methyl group, R₄Is a hydrogen atom or a hydroxyl group, R₅Represents a hydrogen atom or a methyl group], and a compound represented by formula 2

It is a compound shown by these.
Hereinafter, it is represented by Formula 1 and R₁, R₂, R₃Is a hydrogen atom, R₄Is a hydroxyl group, R₅Wherein W is a hydrogen atom, WSS2217, R₁, R₂, R₃Is a methyl group, R₄And R₅Wherein W is a hydrogen atom, WSS2218, R₁, R₂Is a methyl group, R₃Is a hydrogen atom, R₄Is a hydroxyl group, R₅Wherein W is a hydrogen atom, WSS2219, R₁Is a hydrogen atom, R₂Is a methyl group, R₃Is a hydrogen atom, R₄Is a hydroxyl group, R₅Wherein W is a hydrogen atom, WSS2221, R₁Is a methyl group, R₂, R₃Is a hydrogen atom, R₄Wherein W is a hydroxyl group.₁, R₂Is a methyl group, R₃Is a hydrogen atom, R₄Is a hydroxyl group, R₅A compound in which is a methyl group is referred to as WSS8027. In addition, the compound represented by Formula 2 is referred to as WSS2220.
In order to achieve the above object, the present inventors have isolated a large number of strains from soil and plants, and as a result of various studies on the metabolites of the strains, the compounds produced by certain strains have been found to be able to prevent glycine uptake by rat glial cells. The present invention has been completed.
The bacteriological properties of this strain are shown below.
The strains that produce WSS2217, WSS2218, WSS2219, WSS2220, WSS2221, and WSS2222 are actinomycetes that the present inventors have isolated from the natural world, and show mycological properties below.
A. Morphological properties
Forms aerial hyphae from well-branched basic hyphae. On the aerial hyphae, short spore chains composed of 4 to 15 spores in a hook shape, a curl shape, or a loose spiral shape (1 to 3 turns) are singly grown. The spore has a size of 1.0 to 1.3 × 1.4 to 2.0 μm, an oval shape, and a wrinkled surface. In addition, mycelial bundle thread, spore sac and pseudospore sac formation, and spore motility are not observed.
B. Culture properties
The following table 1 shows the results of macroscopic observation when cultured on various media at 30 ° C. for 3 weeks.

C. Physiological properties
1) Growth temperature range
a. Growth temperature: 16-39 ° C
b. Optimum growth temperature: 32-34 ° C
2) Various properties
a. Gelatin liquefaction (30 ° C, 2 weeks): negative
b. Coagulation of skim milk (37 ° C, 2 weeks): negative
c. Peptonization of skim milk (37 ° C, 2 weeks): Negative
d. Melanin-like pigment production (30 ° C, 2 weeks): negative
e. Starch hydrolysis (30 ° C, 2 weeks): Negative
3) Availability of carbon source (on Prideham Goat Leve agar, 30 ° C, 2 weeks)
L-arabinose: w L-ramulose: w
D-xylose: + raffinose: +
D-glucose: + inositol: +
D-fructose: + D-mannitol: +
Sucrose: +
(+: Grows w: grows weakly)
D. Chemical taxonomic properties
1) Presence / absence of diaminopimelic acid and optical isomerism: Meso-type diaminopimelic acid was detected.
2) Menaquinone composition: MK-9 (H₂), MK-9 (H₄) Was detected as the main component.
3) Types of reducing sugars in all cells: ribose, majurose, mannose, and glucose were detected.
4) Phospholipid: An unknown glucosamine-containing phospholipid was detected. No phosphatidylglycerol was detected.
As a result of searching according to the isolation and identification of actinomycetes based on the above properties (Edited by the Japanese Actinomycetes Society, 2001), this strain can be classified into actinomycetes belonging to the genus Nonomuraea.・ TA-0426 (Nonomuraea  sp. TA-0426).
This strain has been deposited with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number “FERM BP-8371” on December 4, 2001 (request for transfer of deposit, April 30, 2003). Yes.
Production of WSS2217 to WSS2222 is carried out by culturing the TF-strain under aerobic conditions in a medium containing various nutrients in accordance with the production of general fermentation products.
The medium is mainly a liquid medium, and is composed of a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic salt. Vitamins, precursors and antifoaming agents can be added as necessary, and the pH is adjusted to around 7. As the carbon source, for example, glucose, sucrose, axtrin, glycerin, starch and the like are used alone or in combination. As the nitrogen source, for example, meat extract, oatmeal, yeast extract, soybean flour, polypeptone, corn steep liquor, urea, ammonium salt and the like are used alone or in combination. As the inorganic salt, for example, monopotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate and the like are used alone or in combination. As an antifoaming agent, adecanol, a silicon compound, or the like can be used.
As the culture method, aerobic culture such as shaking culture and aeration-agitation culture is suitable. The culture is performed at pH 4 to 10, 25 to 35 ° C. for 2 to 5 days, preferably at pH 6 to 7 and 25 to 28 ° C. for 4 days. .
The compound of this invention is obtained by refine | purifying a fermentation product by a general method. That is, after culturing, a culture filtrate is obtained by centrifugation or filtration, adsorbed on a polystyrene resin such as Diaion HP-20 (trade name, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and then eluted with an organic solvent such as lower alcohol or acetone. Let The cells are extracted with an organic solvent such as lower alcohol or acetone. Next, the bacterial cell extract and the eluate from the adsorption resin were combined and concentrated under reduced pressure to remove the organic solvent, and then transferred to a water-insoluble organic solvent such as ethyl acetate, chloroform, or n-butanol, and concentrated. Into a syrup. This syrup is again dissolved in an organic solvent such as benzene, ethyl acetate, acetone, methanol, chloroform, etc., and subjected to silica gel column chromatography, gel filtration column chromatography, and column chromatography and high performance liquid chromatography packed with ODS for reverse layer distribution. The compound of the present invention can be purified and isolated by lying down.
WSS8027 can be synthesized by the following method. That is, Journal of the American Chemical Society [J. Am. Chem. Soc. 97, page 3802 (1975)], and can be synthesized by treating WSS2219 with methyl iodide.
WSS2217 to WSS2222 and WSS8027 obtained by the above method have their molecular weight, ultraviolet absorption spectrum,¹H-NMR spectrum,¹³The chemical structure was determined by analysis such as C-NMR spectrum.
The physicochemical properties of WSS2217 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 474
(C). Molecular formula: C₂₅H₃₈N₄O₅
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 497.2736
Theoretical value: 497.2740 (C₂₅H₃₈N₄O₅Calculated as Na)
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -169.4 (c0.062, dioxane)
(F). UV absorption spectrum: λ_MAXnm (log e) dioxane: 206.5 (4.27), 223.5 (sh, 3.58)
(G).¹H-NMR spectrum: FIG. 1 shows the result of measurement at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.
(H).¹³C-NMR spectrum: FIG. 2 shows the results of measurement in deuterated dimethyl sulfoxide at 125 MHz.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
Insoluble in chloroform
Insoluble in water, hexane, methanol, ether, acetone, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: neutral
The physicochemical properties of WSS2218 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 486
(C). Molecular formula: C₂₇H₄₂N₄O₄
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 509.3099
Theoretical value: 509.3104 (C₂₇H₄₂N₄O₄Calculated as Na)
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -146.2 (c0.081, dioxane)
(F). UV absorption spectrum:
λMAX nm (log e) dioxane: 206.0 (4.26), 223.5 (sh, 3.58)
(G).¹H-NMR spectrum:
The result of measurement at 500 MHz in deuterated methanol is shown in FIG.
(H).¹³C-NMR spectrum:
The results of measurement at 125 MHz in deuterated methanol are shown in FIG.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
Slightly soluble in chloroform and methanol
Insoluble in water, hexane, ether, acetone, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: neutral
The physicochemical properties of WSS2219 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 502
(C). Molecular formula: C₂₇H₄₂N₄O₅
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 525.3044
Theoretical value: 525.3530 (C₂₇H₄₂N₄O₅Calculated as Na)
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -182.6 (c0.068, dioxane)
(F). UV absorption spectrum:
λMAX nm (log e) dioxane: 206.5 (4.26), 223.0 (sh, 3.58)
(G).¹H-NMR spectrum:
The result of measurement at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(H).¹³C-NMR spectrum:
The result of measurement at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
Insoluble in chloroform
Insoluble in water, hexane, methanol, ether, acetone, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: neutral
The physicochemical properties of WSS2220 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 579
(C). Molecular formula: C₂₇H₃₉N₄O₈S
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 625.2023
Theoretical value: 625.2284 (C₂₇H₃₉N₄O₈S Na₂) Calculated as
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -190.8 (c0.104, methanol)
(F). UV absorption spectrum:
λMAX nm (log e) dioxane: 207.5 (4.25), 223.5 (sh, 3.58)
(G).¹H-NMR spectrum:
The result of measurement at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(H).¹³C-NMR spectrum:
The result of measurement at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, water, methanol
Slightly soluble in dioxane, chloroform and acetone
Insoluble in hexane, ether, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: acidic
The physicochemical properties of WSS2221 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 488
(C). Molecular formula: C₂₆H₄₀N₄O₅
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 511.6034
Theoretical value: 511.6155 (C₂₅H₃₈N₄O₅Calculated as Na)
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -228.1 (c0.065, dioxane)
(F). UV absorption spectrum:
λMAX nm (log e) dioxane: 207.0 (4.26), 223.5 (sh, 3.57)
(G).¹H-NMR spectrum:
The result of measurement at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(H).¹³C-NMR spectrum:
The result of measurement at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
Insoluble in chloroform
Insoluble in water, hexane, methanol, ether, acetone, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: neutral
The physicochemical properties of WSS 2222 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 488
(C). Molecular formula: C₂₆H₄₀N₄O₅
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 511.6048
Theoretical value: 511.6155 (C₂₅H₃₈N₄O₅Calculated as Na)
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -228.1 (c0.065, dioxane)
(F). UV absorption spectrum:
λMAX nm (log e) dioxane: 207.0 (4.26), 223.5 (sh, 3.57)
(G).¹H-NMR spectrum:
The results measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide are shown in FIG.
(H).¹³C-NMR spectrum:
The result of measurement at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide is shown in FIG.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
Insoluble in chloroform
Insoluble in water, hexane, methanol, ether, acetone, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: neutral
The physicochemical properties of WSS8027 are as follows.
(A). Appearance: White powder
(B). Molecular weight: 558
(C). Molecular formula: C₃₁H₅₀N₄O₅
(D). HR-TOF mass spectrum
Actual value: 581.7433
Theoretical value: 581.7497 (C₃₁H₅₀N₄O₅Calculated as Na)
(E). Specific rotation: [α]_D ²⁵: -160.4 (c0.04, dioxane)
(F). UV absorption spectrum:
λMAX nm (log e) dioxane: 206.5 (4.26), 223.0 (sh, 3.58)
(G).¹H-NMR spectrum:
The result of measurement at 500 MHz in heavy pyridine is shown in FIG.
(H).¹³C-NMR spectrum:
The result of measurement at 125 MHz in deuteripyridine is shown in FIG.
(I). Solubility in solvents:
Soluble in dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylformamide
Insoluble in chloroform
Insoluble in water, hexane, methanol, ether, acetone, ethyl acetate
(J). Distinguishing between basic, acidic and neutral: neutral
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples and Test Examples.
Example 1
Manufacture of WSS2217, WSS2218, WSS2219, WSS2220
(1) Contains 2.5% soluble starch, 1% glucose, 0.5% fishmeal, 0.3% pharmame media, 0.3% NZ case, 0.2% yeast extract, 0.2% calcium carbonate 60 ml of the liquid medium was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C. and 2 atm for 20 minutes. Then in this sterile mediumNonomuraea  sp. TA-0426 strain was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. and 200 rpm for 3 days to prepare a seed culture.
Next, corn starch 2%, glycerin 1.0%, glucose 0.5%, Pharmamedia 0.5%, malt extract 0.5%, polypeptone 0.3%, magnesium sulfate 0.05%, calcium carbonate 0. 100 ml of 3% sterile liquid medium (100 ml) was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask and 4 ml of the seed culture solution was added thereto, and cultured with shaking at 28 ° C. and 180 rpm for 14 days.
After completion of the culture, 5 L of n-butanol was added to 10 L of the obtained culture broth and stirred, and the cells were separated into cells and an n-butanol extract fraction by centrifugation. The n-butanol fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 6.03 g of a brown oily substance.
(2) The oily substance (6.03 g) was dissolved in about 10 ml of chloroform and adsorbed on silica gel (Silica Gel 60 (manufactured by Merck) 200 ml: column tube f = 40 mm) prepared with chloroform. After washing with 400 ml of chloroform, elution was sequentially performed with a mixed solvent of chloroform-methanol (98: 2 to 50:50). Of these, fractions eluted with a mixed solvent ratio (95: 5) were combined and concentrated to dryness under reduced pressure, and 272.8 mg of Fr. 1 was obtained. The fractions eluted with a mixed solvent ratio (90:10) were combined and concentrated to dryness under reduced pressure, and 172.5 mg of Fr. 2 was obtained. Further, the fractions eluted with a mixed solvent ratio (80:20) were combined and concentrated to dryness under reduced pressure, and 398.0 mg of Fr. 3 was obtained.
(3) Fr. 1 is dissolved in a small amount of methanol and preparative high performance liquid chromatography using acetonitrile-0.02% trifluoroacetic acid aqueous solution (65:35) as a mobile phase [apparatus used: Waters, column: YMC ODS -AM (10.times.250 mm)], and fractions with a retention time of 13 to 16 minutes were collected at a flow rate of 2.5 ml / min while monitoring at an ultraviolet absorption of 210 nm. This fraction was concentrated under reduced pressure to remove acetonitrile, and then extracted twice with half of ethyl acetate. The ethyl acetate extract fractions were combined, dehydrated over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure to dryness to obtain 15.2 mg of WSS2218.
(4) Fr. 2 was dissolved in a small amount of methanol, and preparative high performance liquid chromatography using acetonitrile-0.01% trifluoroacetic acid aqueous solution (45:65) as a mobile phase [apparatus used: Waters, column: YMC ODS -AM (10 f × 250 mm)], fractions with a retention time of 9.5 to 10 minutes and 15 to 16 minutes were collected at a flow rate of 2.5 ml / min while monitoring at an ultraviolet absorption of 210 nm. The two fractions collected were combined and concentrated under reduced pressure to remove acetonitrile, and then extracted twice with half of ethyl acetate. The ethyl acetate extract fractions were combined, dehydrated over anhydrous sodium sulfate, and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 3.5 mg of WSS2217 and 13.4 mg of WSS2219.
(5) Fr. 3 was dissolved in a small amount of methanol, and preparative high performance liquid chromatography using 30% acetonitrile as a mobile phase [apparatus used: manufactured by Waters Co., Ltd., column: ODS-AM (20 f × 250 mm) manufactured by YMC Co., Ltd.] While monitoring at an absorption of 210 nm, a fraction having a retention time of 8.0 to 9.0 minutes was collected at a flow rate of 10 ml / min. The fraction collected was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 8.8 mg of WSS2220.
Example 2
Manufacture of WSS 2221 and WSS 2222
(1) Contains 2.5% soluble starch, 1% glucose, 0.5% fishmeal, 0.3% pharmame media, 0.3% NZ case, 0.2% yeast extract, 0.2% calcium carbonate 60 ml of the liquid medium was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C. and 2 atm for 20 minutes. Then in this sterile mediumNonomuraea  sp. TA-0426 strain was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. and 200 rpm for 3 days to prepare a seed culture.
Next, corn starch 2%, glycerin 1.0%, glucose 0.5%, Pharmamedia 0.5%, malt extract 0.5%, polypeptone 0.3%, magnesium sulfate 0.05%, calcium carbonate 0. 150 ml of 3% sterile liquid medium (100 ml) was put into a 500 ml Erlenmeyer flask and 4 ml of the seed culture solution was added thereto, and cultured with shaking at 28 ° C. and 180 rpm for 14 days.
After completion of the culture, 5 L of n-butanol was added to 15 L of the obtained culture broth and stirred, and the cells were separated into cells and n-butanol extracted fractions by centrifugation.
The n-butanol fraction was concentrated under reduced pressure, 500 ml of water adjusted to pH 3.0 with acetic acid was added and stirred, and the mixture was extracted twice with 500 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate extract fractions were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 2.83 g of a brown oily substance.
(2) The oily substance (2.83 g) described above was dissolved in about 10 ml of chloroform and adsorbed on silica gel (Silica Gel 60 (Merck) 250 ml: column tube f = 40 mm) prepared with chloroform. After washing with 400 ml of chloroform, elution was sequentially performed with a mixed solvent of chloroform-methanol (99: 1 to 50:50). Among these, the fraction eluted with the mixed solvent ratio (90:10) and the fraction eluted with the mixed solvent ratio (80:20) were combined and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 864 mg of a brown oily substance.
(3) Preparative high-performance liquid chromatography in which 864 mg of the brown substance described above is dissolved in a small amount of methanol and an acetonitrile-0.01% trifluoroacetic acid aqueous solution (45:55) is used as a mobile phase [apparatus used: manufactured by JASCO Corporation , Column: ODS-AM (20 · 250 mm) manufactured by YMC Co., Ltd.], and fractions with a retention time of 12 to 12.5 minutes and 13 to 14 minutes at a flow rate of 10 ml / min while monitoring at an ultraviolet absorption of 210 nm. I took it. The two fractions collected were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 5.3 mg of WSS 2221 and 3.7 mg of WSS 2222.
Example 3
Manufacture of WSS8027
Under a nitrogen stream, 1 ml of dimethylformamide was added to sodium hydride (100.6 mg) and stirred under ice cooling. To this was added 1 ml of dimethylformamide in which WSS2219 (12.9 mg) was dissolved, methyl iodide (300 ml) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, water and ethyl acetate were added under ice cooling, and the ethyl acetate extract fraction was distilled off under reduced pressure. The residue was subjected to preparative high performance liquid chromatography [mobile phase: acetonitrile-0.02% trifluoroacetic acid aqueous solution (80:20), apparatus used: manufactured by Waters Co., Ltd., column: ODS-AM manufactured by YMC Co. (10 f × 150 mm)] The sample was collected at a flow rate of 2.5 ml / min while monitoring with UV absorption at 210 nm. The collected fraction was concentrated to dryness under reduced pressure to obtain 4.4 mg of WSS8027.
Test Example 1 Glycine uptake inhibition test on rat glial cells
(Sample)
WSS2217, WSS2218, WSS2219, WSS2220, WSS2221, WSS2222 and WSS8027 were each dissolved in DMSO to a concentration of 10 mg / ml, and diluted with sterilized water to a target concentration.
(Test cell)
Rat glial cell C₆
(Test method)
A flat bottom 96-well plate (Cytostar-T: manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) containing liquid scintillation cocktail₆5X10 cells⁴The cells were seeded so as to be cells / well and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (Gibco) containing 10% calf serum (Gibco) for 24 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Thereafter, the medium was replaced with a buffer having a composition of 10 mM hepes (pH 7.4), 150 mM sodium chloride, 1 mM potassium chloride, 1 mM calcium chloride, 1 mM magnesium chloride, and 10 mM glucose. Furthermore, 0.01 ml of drug solution of the target concentration and 375 KBq / ml [¹⁴C] -Glycine was added in 0.01 ml and incubated at 37 ° C. for 50 minutes. After incubation, the buffer was removed by suction and dried at room temperature for 5 hours. Thereafter, the radioactivity was measured with a plate reader (TopCount; manufactured by Packard). The inhibition rate was determined by comparing the radioactivity of the drug addition group with the radioactivity of the control group being 0% and the excess (10 mM) glycine addition group being 100%.
Inhibition rate (%) = [(value of drug addition group−value of excess glycine addition group) / (value of non-drug addition group−value of excess glycine addition group)] × 100
The concentration of the compound exhibiting a 50% inhibition rate was determined as IC.₅₀It is shown in Table 2 as (μM). Moreover, the inhibition rate of Glycine was calculated | required simultaneously as positive control.

Test Example 2 Measurement of glycine release using brain microdialysis
Glycine, like other neurotransmitters and amino acids, is taken up by neurons and glial cells in the brain by specific transporters and abolishes its action. Therefore, inhibition of glycine uptake increases the concentration of glycine in the synaptic cleft, thereby stimulating post-synaptic NMDA receptors.
Since it inhibits the glycine uptake mechanism and increases the amount of glycine in the prefrontal area, it can be expected to be a therapeutic drug for schizophrenia.
Thus, the effect of the compound of the present invention on the prefrontal glycine amount was examined.
(Sample)
WSS2220
(Measuring method)
SD male rats were used as test animals. A guide cannula for dialysis probe insertion was implanted in the prefrontal cortex (AP + 3.2, L ± 0.9, V below the surface of the brain), which was the measurement site, and the experiment was started after about one week after recovery. did.
On the day of the measurement, after inserting and fixing a dialysis probe (dialysis membrane 3 mm) through a guide cannula under ether anesthesia, samples (40 μl) were collected at intervals of 20 minutes while circulating the dialysate (Ringer solution) at 2 μl / ml without anesthesia. A dialysis sample and 20 mM OPA-ME were mixed at a ratio of 3: 1 and reacted at 10 ° C. for 2.5 minutes, and then the derivatized amino acid was detected by HPLC. Basal level was defined as the average released amount for 1 hour (3 samples) before administration. For WSS2220 10 μmol / L, a 10 mmol / LDMSO solution was diluted with Ringer's solution and injected as a reflux solution through a dialysis probe. The drug reflux solution was treated for 3 hours and then returned to a normal Ringer solution.
(Results and discussion)
The results are shown in FIG.
No change in the amount of glycine was observed after local administration of vehicle (0.1% DMSO / Ringer) in the prefrontal cortex.
When treated in a reflux solution containing 10 μmol / L of WSS2220 for 3 hours, an increase in the amount of glycine of 100.7% at maximum was observed. This compound was confirmed to have an increase in the amount of glycine that is thought to be due to inhibition of glycine uptake.
This compound inhibits the mechanism of glycine uptake in the prefrontal cortex and increases the amount of glycine in the prefrontal cortex, suggesting that it may be a therapeutic drug for schizophrenia.
Industrial applicability
Since the compound of the present invention has an inhibitory action on uptake of glycine transporter expressed in glial cells, it is useful as a therapeutic agent for schizophrenia.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows WSS2217 measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 2 shows WSS2217 measured at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.
FIG. 3 shows the WSS2218 measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 4 shows WSS2218 measured at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.
FIG. 5 shows WSS2219 measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 6 shows WSS2219 measured at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.
FIG. 7 shows WSS2220 measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 8 shows WSS2220 measured at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.
FIG. 9 shows WSS2221 measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 10 shows the WSS2221 measured at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.
FIG. 11 shows the WSS2222 measured at 500 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 12 shows WSS 2222 measured at 125 MHz in deuterated dimethyl sulfoxide.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.
Figure 13 shows WSS8027 measured at 500 MHz in heavy pyridine.¹It is the figure which showed the H-NMR spectrum.
FIG. 14 shows WSS8027 measured at 125 MHz in heavy pyridine.¹³It is the figure which showed the C-NMR spectrum.

Claims (4)

formula

[Wherein, R ₁ , R ₂ and R ₃ each represent a hydrogen atom or a methyl group, R ₄ represents a hydrogen atom or a hydroxyl group, and R ₅ represents a hydrogen atom or a methyl group. ] The compound represented by this. formula

A compound represented by A pharmaceutical comprising the compound shown in claim 1 or 2. A glycine transporter inhibitor comprising the compound according to claim 1 or 2 as an active ingredient.

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