JPWO2003029457A1

JPWO2003029457A1 - Amino acid production method

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Publication number: JPWO2003029457A1
Application number: JP2003532673A
Authority: JP
Inventors: 正人池田; 敏三橋; 淳子大西; 溝口　寛; 寛溝口; 恵子落合; 中川　智; 智中川
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2005-01-13
Anticipated expiration: 2022-09-27
Also published as: JP4152320B2; WO2003029457A1

Abstract

本発明は、マレート：キノンオキシドレダクターゼ活性が低下または欠損した微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造法、該製造法に用いられるＤＮＡ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法に関する。The present invention relates to a method for producing an L-amino acid using a microorganism having reduced or deficient malate: quinone oxidoreductase activity, DNA used in the production method, recombinant DNA, transformant, and ability to produce an L-amino acid The present invention relates to a method for breeding microorganisms that has improved.

Description

技術分野
本発明は、マレート：キノンオキシドレダクターゼ活性が低下または欠損した微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造法、該製造法に用いられるＤＮＡ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法に関する。
背景技術
リンゴ酸からオキザロ酢酸への反応を司るマレート：キノンオキシドレダクターゼ（以下、ＭＱＯと略す）は、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ回路）を構成する酵素の一つとして知られている。
コリネバクテリウム・グルタミカムのＭＱＯに関しては、生化学的性質やＭＱＯ遺伝子の塩基配列が報告されている［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４、３９５（１９９８）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］。
コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、ＭＱＯをコードする遺伝子（以下、ＭＱＯ遺伝子と略すこともある）を欠損させた変異株はニコチンアミドまたはニコチン酸要求性となり、最少培地で生育することができなくなることより、ＭＱＯ遺伝子は生育に重要な遺伝子であることが報告されている［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］。さらに、ＭＱＯをコードするＤＮＡを増幅して過剰発現させることにより、コリネ型細菌において、Ｌ−アミノ酸の生産性を改善できることが知られている（特開平２０００−２７０８８８）。
これまで、Ｌ−アミノ酸の発酵生産において、ＭＱＯ活性を低下または欠損させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産効率を向上させることができることを記載および示唆した報告はない。
発明の開示
本発明の目的は、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を用いることを特徴とする、工業的に有利なＬ−アミノ酸の製造法、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法を提供することにある。
本発明は以下（１）〜（２２）に関する。
（１）Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物が、ＭＱＯをコードするＤＮＡまたはその転写・翻訳調節領域の変異によりＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物である、上記（１）のＬ−アミノ酸の製造法。
（３）変異が、ＭＱＯをコードするＤＮＡまたはその転写・翻訳調節領域中の１以上の塩基の置換、欠失、または付加による変異である、上記（２）のＬ−アミノ酸の製造法。
（４）変異が、ＭＱＯをコードするＤＮＡへのナンセンス変異の導入による変異である、上記（２）または（３）のＬ−アミノ酸の製造法。
（５）ＭＱＯをコードするＤＮＡが、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（２）〜（４）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（６）変異が、配列番号２記載の塩基配列の第６７１番目および／または第６７２番目の塩基をアデニンへ置換することによる変異である、上記（２）〜（５）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（７）微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、およびエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１）〜（６）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（８）微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物である上記（１）〜（７）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（９）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、または微生物の代謝経路上Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸もしくはピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸を経由して合成されるＬ−アミノ酸である上記（１）〜（８）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（１０）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロイシンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、上記（１）〜（９）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（１１）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニンまたはＬ−イソロイシンである上記（１）〜（１０）いずれか１つのＬ−アミノ酸の製造法。
（１２）配列番号２記載の塩基配列のアミノ酸をコードするコドンのいずれかのコドンがナンセンスコドンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
（１３）配列番号２記載の塩基配列の第６７１番目および／または６７２番目の塩基がアデニンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ。
（１４）上記（１２）または（１３）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
（１５）上記（１４）の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（１６）形質転換体が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、およびエシェリヒア属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１５）の形質転換体。
（１７）形質転換体が、コリネバクテリウム属に属する微生物である上記（１６）の形質転換体。
（１８）染色体上に上記（１２）または（１３）のＤＮＡを有する微生物。
（１９）微生物が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、およびエシェリヒア属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である上記（１８）の微生物。
（２０）微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１８）の微生物。
（２１）微生物が、上記（１５）〜（２０）いずれか１つの形質転換体または微生物である、上記（１）の製造法。
（２２）Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物に変異を導入し、得られた微生物のＭＱＯ活性を測定し、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を選択することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の製造法に用いられる微生物（以下、本発明の微生物ともいう）は、Ｌ−アミノ酸を生産することのできる微生物であって、該微生物のＭＱＯ活性が、該微生物の野生株のＭＱＯ活性に比べて低下した微生物、またはＭＱＯ活性が欠損した微生物であればいずれの微生物であってもよいが、ニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を示す微生物であることが好ましい。
該微生物のＭＱＯ活性は、該微生物の野生株のＭＱＯ活性に比べて低下していればよいが、低いほど好ましく、実質的に欠損または完全に欠損していることがさらに好ましい。
本発明において、野生株とは、本発明の微生物と分類学上同じ種に属する微生物であって、かつ自然界で最も高頻度に出現する表現型を有する微生物をいう。
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物（以下、親株と称することもある）のＭＱＯ活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等の、微生物に変異を導入することのできる方法、またはアンチセンス法等のＭＱＯの発現を抑制できる方法等を用いて、低下または欠損させることにより得ることができる。
親株は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有し、かつＭＱＯ活性を有する微生物であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。
親株としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物等をあげることができるが、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属する微生物が好ましく、コリネバクテリウム属に属する微生物がさらに好ましい。
具体的には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｒｃｕｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｌｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ等をあげることができる。
より具体的には、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１３８７０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１５８０６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅＡＴＣＣ１５９９１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０６０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８２６（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０２０（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９（旧属種Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｒｃｕｌｉｓＡＴＣＣ１３８６８、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｌｉｕｍＡＴＣＣ１５９９０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａＡＴＣＣ１７９６５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓＡＴＣＣ９２４４、ＡＴＣＣ９２４５、ＡＴＣＣ９２４６およびＡＴＣＣ９２７７、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１４０６８、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍＡＴＣＣ１３８２５、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓＡＴＣＣ１９２４０、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍＡＴＣＣ１５３５４等をあげることができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、ＭＱＯをコードするＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換え等により該ＤＮＡを親株の染色体に組み込み、さらに相同組換え等により染色体上に元来存在していたＭＱＯをコードするＤＮＡを置換する方法をあげることができる。
ＭＱＯをコードするＤＮＡとしてはリンゴ酸からオキザロ酢酸への反応を司るＭＱＯ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであればいずれでもよく、例えば、配列番号２〔国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／アクセッション・ナンバーＡＪ２２４９４６〕記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
ＭＱＯをコードするＤＮＡに１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法の例としては、以下の方法をあげることができる。
モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に従って、ＭＱＯをコードするＤＮＡに変異を導入する。
ＭＱＯをコードするＤＮＡは、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＭＱＯをコードするＤＮＡの塩基配列情報〔例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）アクセッション・ナンバーＡＪ２２４９４６〕に基づいて、ＰＣＲ法等により取得することができる。
該変異を導入されたＭＱＯをコードするＤＮＡ（以下、変異体ＤＮＡと略す）を適当なプラスミドベクター等に挿入することにより、組換え体プラスミドを作製する。
プラスミドベクターとしては、例えば、親株中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢ［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を有するプラスミドを用いることができる。
変異体ＤＮＡを有する組換え体プラスミドを親株に導入する。
変異体ＤＮＡを有する組換え体プラスミドを親株へ導入する方法としては、微生物へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）］やプロトプラスト法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６（１９８４）］等をあげることができる。
該組換え体プラスミドは親株中で自律複製できないので、該組換え体プラスミドの有する抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
さらに、変異体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９２）］によって、親株の染色体上のＭＱＯをコードするＤＮＡが変異体ＤＮＡに置換された株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
親株の染色体上のＭＱＯをコードするＤＮＡに置換、欠失、または付加を導入する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができ、例えば、相田浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法等をあげることができる。
変異を導入する塩基の数は、置換、欠失、または付加によって、該ＤＮＡがコードするＭＱＯの活性を低下または欠損させることができる数であれば限定されない。
変異を導入する部位は、該変異によってＭＱＯ活性を低下または欠損させることができる部位であれば必ずしもＭＱＯをコードするＤＮＡの有する塩基配列中に限られないが、ＭＱＯをコードするＤＮＡの転写・翻訳調節領域（以下、ＭＱＯ遺伝子という）中であることが好ましく、ＭＱＯをコードするＤＮＡの有する塩基配列中であることがさらに好ましい。
塩基置換を導入してＭＱＯ活性を低下または欠損させる方法としては、例えばナンセンス変異の導入による方法があげられる。
ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマーおよびＭＱＯをコードするＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られたナンセンス変異が導入されたＭＱＯをコードするＤＮＡを用いて親株の染色体上のＭＱＯを置換する方法があげられる。
ナンセンス変異が導入されたＤＮＡとしては、例えば、配列番号２記載の塩基配列において、第６７１番目および／または６７２番目の塩基がアデニンに置換されたＤＮＡ等をあげることができる。
塩基配列の欠失を導入することによってＭＱＯ活性を低下または欠損させる方法としては、例えば、ＭＱＯ遺伝子を制限酵素等で切断し、適当な数の塩基配列を削除した後に再結合させて得られるＭＱＯ遺伝子を染色体に組み込む方法等をあげることができる。
塩基配列を欠失させたＭＱＯ遺伝子の例としては、例えば、ＭＱＯ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる、配列番号２記載の塩基配列の第４２２〜１４３８番目の塩基が欠失したＭＱＯ遺伝子等をあげることができる。
ＭＱＯ遺伝子に変異を導入せずにＭＱＯ活性を低下させることもできる。このような方法として、例えば、ＭＱＯをコードするｍＲＮＡの有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡを該微生物に導入し、ＭＱＯ遺伝子の発現を抑制する、いわゆるアンチセンス法をあげることができる。
上記の操作を行って得られた微生物の中から、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を得ることができる。
例えば、ＭＱＯ活性が欠損した株はニコチンアミド、またはニコチンアミドから生合成されるニコチン酸の要求性になる［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］ことを利用し、変異の導入された微生物の中から、ニコチンアミドまたはニコチン酸を含有しない培地では生育しないか、親株に比べて生育が悪くなった株を、ニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性株として取得し、該ニコチンアミドまたはニコチン酸要求性株のＭＱＯ活性を測定して、該ニコチンアミドまたはニコチン酸要求性株の中から目的とするＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を選択し、取得することができる。
ＭＱＯ活性の測定は、例えば、実施例３に示すように、モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に準じて、２，６−ジクロロインドフェノールの還元を測定することにより行うことができる。
ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物の作製および取得方法は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力が親株より向上した微生物の育種方法として用いることができる。
本発明におけるＬ−アミノ酸の製造は、ＭＱＯ活性が低下または欠損した微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積したＬ−アミノ酸を採取することにより行う。
微生物の培養は、Ｌ−アミノ酸を生成する能力を有する微生物の通常の培養法によって行うことができる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成培地または天然培地いずれも使用できる。
炭素源としては、本発明の微生物が資化できるものであればよく、例えばグルコース、糖蜜、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４２℃が好適であり、さらに好ましくは３０℃〜４０℃である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。
培養期間は通常１〜６日間であり、培養液中にＬ−アミノ酸が生成蓄積する。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することによりＬ−アミノ酸を回収することができる。
本発明により製造することができるＬ−アミノ酸は特に限定されないが、例えば、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、微生物の代謝経路上Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸またはピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸等をあげることができる。
Ｌ−アスパラギン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン等があげられる。Ｌ−グルタミン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン等があげられる。ピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン等があげられる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ＭＱＯ遺伝子内部を欠失したＬ−リジン生産菌株の造成
（１）ＭＱＯ遺伝子への欠失変異の導入
モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に従って、Ｌ−リジン生産菌のＭＱＯ遺伝子への欠失変異の導入を試みた。
Ｌ−リジン生産菌としては、遺伝形質が明らかなコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＨＰ−３株（ＦＥＲＭＢＰ−７３８２）を用いた。コリネバクテリウム・グルタミクムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウムグルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体上のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｏｍ）にアミノ酸置換変異Ｖａｌ５９Ａｌａ、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）にアミノ酸置換変異Ｔｈｒ３３１Ｉｌｅ、およびピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ）にアミノ酸置換変異Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒを有する菌株である。
まず、ＭＱＯ遺伝子の内部に欠失を有する変異型遺伝子を、ＴＡクローニング法（モレキュラー・クローニング第３版）により、プラスミドｐＥＳＢ３０（宝酒造社製）に挿入した。ｐＥＳＢ３０は、カナマイシン耐性遺伝子を有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）のベクターｐＨＳＧ２９９［Ｇｅｎｅ，６１，６３（１９８７）］のＰｓｔＩ切断部位に、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンシュクラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６ｋｂのＰｓｔＩＤＮＡ断片［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６，１１９５（１９９２）］を連結したプラスミドである。
具体的には、プラスミドｐＥＳＢ３０をＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いてｐＥＳＢ３０断片を抽出し精製した。
得られたｐＥＳＢ３０断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。平滑化したｐＥＳＢ３０断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、Ｔａｑポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｄＴＴＰ存在下で７０℃、２時間反応させ、３’末端にチミンを１塩基を付加して、ｐＥＳＢ３０−Ｔを調製した。
一方、コリネバクテリウムグルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製した。
公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＭＱＯ遺伝子およびその近傍領域の塩基配列情報［例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）アクセッション・ナンバーＡＪ２２４９４６］に基づいて、常法により、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を合成した。
該合成ＤＮＡをプライマー、染色体ＤＮＡを鋳型として用い、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＭＱＯ遺伝子の全長を含む約２．２ｋｂのＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲ増幅産物を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（ともに宝酒造社製）で切断後、アガロースゲル電気泳動し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて約２．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を抽出、精製した。
このようにして得た完全長のＭＱＯ遺伝子を含む約２．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片と、あらかじめＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによって切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて結合させた。
得られた反応産物を用い、常法（モレキュラー・クローニング第３版）に従って大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地］で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）に記載の方法に従って、完全長のＭＱＯ遺伝子を含むプラスミドを調製した。
得られた完全長のＭＱＯ遺伝子を含むプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて結合反応を行い自己環状化させ、上記と同様に大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で形質転換株を選択した後、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。制限酵素切断法で解析したところ、該プラスミドは、ＭＱＯ遺伝子内部の約１．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片が欠失した構造を有していることが確認された。
このプラスミドを鋳型として、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）によりＰＣＲ反応を行い、欠失変異型ＭＱＯ遺伝子（約１．１ｋｂ）を増幅した。
得られた増幅産物を、ライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用い、上記のｐＥＳＢ３０−Ｔ断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地に植菌して終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。
該プラスミドを、制限酵素切断法で解析し、配列番号２記載の塩基配列の第４２２〜１４３８番目が欠失した欠失変異型ＭＱＯ遺伝子を含む約１．１ｋｂのＤＮＡ断片がｐＥＳＢ３０に挿入された構造を有していることを確認した。このプラスミドをｐＣｍｑｏｄ１と命名した。
（２）遺伝子置換法によるＬ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株へのＭＱＯ遺伝子欠失変異の導入
プラスミドｐＣｍｑｏｄ１が、コリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、該プラスミドが相同組換えでコリネバクテリウムグルタミクムＡＨＰ−３株の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた株を選択した。
ｐＣｍｑｏｄ１を用い、レストらの方法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５２，５４１（１９９９）］に従って電気穿孔法にてＡＨＰ−３株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、ｐＣｍｑｏｄ１がＣａｍｐｂｅｌｌタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型と欠失を有する変異型のＭＱＯ遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
該形質転換株（１回組換え体）をＳＵＣ寒天培地〔ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。
ｓａｃＢ遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生育できない［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，５４６２（１９９１）］。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のＭＱＯ遺伝子間での２回目の相同組み換えがおこり、ｓａｃＢ遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、ｓａｃＢとともに欠失する。このとき野生型のＭＱＯ遺伝子がｓａｃＢとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９（１９６３）］により調製し、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体のＭＱＯ遺伝子が野生型か変異型かを調べた。
その結果、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失を有する２回組換え体であるＭＱＤ−４朱を取得した。
実施例２ＭＱＯ遺伝子内にナンセンス変異を有するＬ−リジン生産菌株の造成ＭＱＯをコードする配列番号２記載の塩基配列の第６７０〜６７２番目のＴｒｐ残基（配列番号１記載のアミノ酸配列の２２４番目のアミノ酸残基）をコードする領域を終止コドンに置換したＤＮＡを、部位特異的変異法（モレキュラー・クローニング第３版）に準じて、以下のように作製した。
配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡの第６７０〜６７２番目のＴｒｐ残基をコードする領域（ｔｇｇ）を目的の終止コドン（ｔｇａ）をコードするように塩基を置換した配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ断片（置換前の塩基配列は、配列番号２記載の塩基配列の第６６２〜６８４番目の塩基配列に相当する）、およびその相補配列から成る配列番号６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法により合成した。
また、配列番号７に示した、配列番号２記載の塩基配列の第１６５〜１８５番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および配列番号８に示した、配列番号２記載の塩基配列の第１１４５〜１１６４番目の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法により合成した。これら合成した４種類の一本鎖ＤＮＡ断片をプライマーとして用いた。
具体的には、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片、配列番号６記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、該染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。
ＰＣＲにより得られた２種類の約０．５ｋｂの増幅産物（配列番号２記載の塩基配列の第１６５〜６８４番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片、および第６６２〜１１６４番目の塩基配列を有するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＫｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ増幅により、配列番号２記載の塩基配列の第２２４番目のＴｒｐ残基をコードする領域が終止コドン（ｔｇａ）に置換された約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
該ＰＣＲ産物をＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＡＴＰ存在下で７２℃、１０分間反応させ、３’末端にアデニンを１塩基付加した。得られた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、上記実施例１と同様にしてプラスミドｐＥＳＢ３０−Ｔに挿入した。このようにして得られたプラスミドをｐＣｍｑｏ２２４と命名した。
ｐＣｍｑｏ２２４の塩基配列を調べ、ＭＱＯ遺伝子内部に目的のナンセンス変異が導入されていることを確認した。
次に、ｐＣｍｑｏ２２４を用い、実施例１と同様な遺伝子置換法により、Ｌ−リジン生産菌ＡＨＰ−３株の染色体上のＭＱＯ遺伝子へ該ナンセンス変異を導入した。得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有する２回組換え体であるＡＰＭ−４株を取得した。
実施例３ＭＱＯ活性の測定
上記実施例１および２で得たＭＱＤ−４株、ＡＰＭ−４株、およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株のＭＱＯ活性の測定を、モレナー（Ｄ．Ｍｏｌｅｎａａｒ）らの報告［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，６８８４（２０００）］に準じて以下の方法で測定した。
なお、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＨＰ−３株は、コリネバクテリウムグルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２より誘導された菌株である。コリネバクテリウムグルタミクムＡＨＰ−３株に、ＭＱＯ活性に関与する変異は一切導入されていない。
ＭＱＤ−４株、ＡＰＭ−４株、およびＡＨＰ−３株を、それぞれＭＭＹＥ培地〔グルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１０ｇ、尿素３ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．４ｇ、塩化ナトリウム５０ｍｇ、硫酸鉄７水和物２ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２ｍｇ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ、ビオチン０．０５ｍｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕２００ｍｌに植菌し、３０℃で培養した。
培養中、培養液の濁度を分光光度計等で測定し、培養液のＯＤ．６６０ｎｍが２〜３になった時点（本実験では３６時間）で培養を終了した。培養終了後、培養液を４，０００ｇ、４℃の条件下で５分間遠心分離した。該遠心分離で得られた菌体を氷冷した溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）［１０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸カリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カルシウム、５ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム、５０ｍｍｏｌ／ｌＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５を含む］で２回洗浄した。洗浄後、溶解緩衝液２０ｍｌを添加し、菌体を該溶解緩衝液に懸濁した。この懸濁液をフレンチプレス装置を用いて１６５Ｍｐａで３回処理して菌体を破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を１０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、得られた上清を７５，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。得られた沈澱を溶解緩衝液で１回洗浄し、最終タンパク質濃度が５〜１５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解緩衝液に懸濁し、粗膜懸濁液とした。
１ｍｌのキュベット内に２，６−ジクロロインドフェノール（Ｃｌ_２Ｉｎｄ）を５０μｍｏｌ／ｌの濃度となるように溶解緩衝液に溶かした溶液および上記で得られた粗膜懸濁液を入れ、１ｍｍｏｌ／ｌのＬ−リンゴ酸ナトリウムを添加し、反応を行った。分光光度計で６００ｎｍの吸収を測定し、モル吸光係数を２２ｃｍ^−１（ｍｍｏｌ／ｌ）^−１として２，６−ジクロロインドフェノールの濃度を算出し、１分間で減少する２，６−ジクロロインドフェノール量を算出した。１分間にタンパク質１ｍｇ当たりの２，６−ジクロロインドフェノール量の減少量をＭＱＯ比活性とした。
同様に、野生株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株のＭＱＯ比活性を測定した。
第１表に、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２株、ＡＨＰ−３株、ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株のＭＱＯ比活性を示す。
ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株ではＭＱＯ活性が検出されず、ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。
また、ＡＴＣＣ１３０３２株およびＡＨＰ３株のＭＱＯ比活性はほぼ同一であった。

実施例４ＭＱＯ変異株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性
第２表に示す成分を３００ｍｌの水に溶解し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。該水溶液に、４００ｍｌとなるように水を加え、濾過滅菌した。これに、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した１０％グルコース水溶液を１００ｍｌ加えた。得られた溶液に、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した３％バクトアガー水溶液（ディフコ社製）５００ｍｌを添加し、プレートに撒いて最少寒天培地を作製した。また、第２表に示す成分とニコチンアミドまたはニコチン酸０．９ｍｇを３００ｍｌの水に溶解する以外は上記と同様な方法により、ニコチンアミドまたはニコチン酸を１ｍｇ／ｌの濃度で含む最少寒天培地を作製した。
なお、バクトアガーは、オートクレーブで滅菌する前に、蒸留水により５回洗浄した。

ＭＱＤ−４株、ＡＰＭ−４株およびＡＨＰ−３を、該最少寒天培地、およびニコチンアミドまたはニコチン酸を１ｍｇ／ｌの濃度で含む最少寒天培地に塗布し、３０℃で４日間培養した。
これらの菌株の成育を観察したところ、ＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株は、最少寒天培地では生育せず、ニコチンアミドまたはニコチン酸を１ｍｇ／ｌの濃度で含む最少寒天培地では生育した。
このことから、ＭＱＯ欠損株であるＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株は、明らかにニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性である。なお、ＡＨＰ−３株は、最少寒天培地でも良好に生育した。
実施例５ＭＱＯ変異株によるＬ−リジン生産試験
実施例１および２で得たＭＱＯ変異株ＭＱＤ−４、ＡＰＭ−４およびこれらの親株であるＡＨＰ−３株をＢＹＧ寒天培地〔グルコース１０ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕で３０℃で１５時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地〔スクロース５０ｇ、コーン・スティープ・リカー４０ｇ、硫酸アンモニウム８．３ｇ、尿素１ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．８３ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸銅５水和物１ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、β−アラニン１０ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２５０ｍｌの入った２リットルバッフル付き三角フラスコに植菌し、３０℃で１２〜１６時間培養した。
得られた種培養液全量を、それぞれ、本培養培地〔グルコース６０ｇ、コーン・スティープ・リカー２０ｇ、塩化アンモニウム２５ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．７５ｇ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１３ｍｇ、塩化カルシウム２水和物５０ｍｇ、硫酸銅５水和物６．３ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１．３ｍｇ、塩化ニッケル６水和物５ｍｇ、塩化コバルト６水和物１．３ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１．３ｍｇ、ニコチン酸１４ｍｇ、β−アラニン２３ｍｇ、チアミン塩酸塩７ｍｇ、ビオチン０．４２ｍｇを水１Ｌに含む培地〕１，４００ｍｌを含む５リットルジャーファーメンターに植菌し、３４℃、１ｖｖｍ、８００ｒｐｍ条件下で、アンモニア水でｐＨ７．０に調整しながら培養した。
培地中のグルコースが消費された時点でグルコース・フィード液（グルコース４００ｇ、塩化アンモニウム４５ｇを水１Ｌに含む培地）を連続的に添加した。
該フィード液の添加は、流加速度が３菌株間で同じになるように調整しながら行い、培養時間が２８時間に達したところで培養を終了した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。
結果を第５表に示す。

ＭＱＯ活性を欠損させたＭＱＤ−４株およびＡＰＭ−４株では、Ｌ−リジンの生産効率が親株ＡＨＰ−３に比べて明らかに向上していた。
実施例６ＭＱＯ活性を欠損したＬ−スレオニン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−スレオニン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−スレオニン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ２１６６０を用いた。ＡＴＣＣ２１６６０は、コリネバクテリウムグルタミクムの野生株ＡＴＣＣ１３０３２から、メチオニン要求性変異、ＡＨＶ耐性変異、およびＡＥＣ耐性変異を誘導することにより取得された変異株である［Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６１１（１９７２）］。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＴＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＴＭＮ−３株も取得した。
ＴＭＤ−１株およびＴＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＴＭＤ−１株およびＴＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例７ＭＱＯ変異株によるＬ−スレオニン生産試験
ＴＭＤ−１株、ＴＭＮ−３株、およびこれらの親株であるＡＴＣＣ２１６６０株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃で２４時間培養し、種培地〔グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地〕１０ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液１ｍｌを本培養培地（グルコース１００ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１０ｍｇ、ビオチン０．１ｍｇ、Ｌ−メチオニン０．１ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整後、炭酸カルシウムを２０ｇ加えた培地）１０ｍｌの入った太型試験管に植菌し、３０℃で７２時間、培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−スレオニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第６表に示す。

ＭＱＯ活性を欠損させたＴＭＤ−１株およびＴＭＮ−３株では、Ｌ−スレオニンの生産効率が親株ＡＴＣＣ２１６６０に比べて明らかに向上していた。
実施例８ＭＱＯ活性を欠損したＬ−グルタミン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−グルタミン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−グルタミン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミクムの野生株であるコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１４７５２を用いた。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＧＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＧＭＮ−３株も取得した。
ＧＭＤ−１株およびＧＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＧＭＤ−１株およびＧＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例９ＭＱＯ変異株によるＬ−グルタミン生産試験
ＧＭＤ−１株、ＧＭＮ−３株、および親株であるＡＴＣＣ１４７５２株を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養した。この培養菌体１白金を、生産培地（グルコース１５０ｇ、塩化アンモニウム５０ｇ、リン酸一水素カリウム０．７ｇ、リン酸二水素カリウム０．７ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２０ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１０ｍｇ、ビオチン６μｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、肉エキス５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを５０ｇ加えた培地）２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、２８℃で９６時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第７表に示す。

ＭＱＯ活性を欠損させたＧＭＤ−１株およびＧＭＮ−３株では、Ｌ−グルタミンの生産効率が親株ＡＴＣＣ１４７５２株に比べて明らかに向上していた。
実施例１０ＭＱＯ活性を欠損したＬ−アルギニン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−アルギニン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−アルギニン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミカムＫＹ１０６７１（ＦＥＲＭＰ−３６１６）株を用いた。ＫＹ１０６７１株は、コリネバクテリウムグルタミカムの野生株であるＫＹ９００４（ＦＥＲＭＰ−３２９５）株から、Ｄ−セリン感受性変異、Ｄ−アルギニン耐性変異、アルギニンハイドロキサメート耐性変異、および６−アザウラシル耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭５３−１２４９１、特開平１−２５７４８６）。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＡＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＡＭＮ−３株も取得した。
ＡＭＤ−１株およびＡＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＡＭＤ−１株およびＡＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例１１ＭＱＯ変異株によるＬ−アルギニン生産試験
ＡＭＤ−１株、ＡＭＮ−３株、およびこれらの親株であるＫＹ１０６７１株を、ＢＹＧ寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、種培地（グルコース２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）６ｍｌの入った太型試験管に植菌して３０℃で２４時間培養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜１５０ｇ（グルコース換算）、コーン・スティープ・リカー５ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、尿素３ｇ、リン酸一水素カリウム０．５ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム２水和物０．２５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕２０ｍｌの入った３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃で７２時間培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−アルギニンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第８表に示す。

ＭＱＯ活性を欠損させたＡＭＤ−１株およびＡＭＮ−３株では、Ｌ−アルギニンの生産効率が親株ＫＹ１０６７１に比べて明らかに向上していた。
実施例１２ＭＱＯ活性を欠損したＬ−イソロイシン生産菌株の造成
実施例１で造成したｐＣｍｑｏｄ１および実施例２で造成したｐＣｍｑｏ２２４を用いて、Ｌ−イソロイシン生産菌のＭＱＯ遺伝子に、以下の方法で欠失変異またはナンセンス変異を導入した。
Ｌ−イソロイシン生産菌としては、コリネバクテリウムグルタミクムＦＥＲＭＢＰ−９８６を用いた。ＦＥＲＭＢＰ−９８６は、コリネバクテリウムグルタミカムの野生株から、アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン耐性、フルオロピルビン酸感受性、リファンピシリン耐性およびスレオニンハイドロキサメート耐性変異を誘導することにより取得された変異株である（特開昭６２−１９５２９３）。
ＭＱＯ遺伝子への欠失変異またはナンセンス変異の導入は、それぞれ上記ｐＣｍｑｏｄ１、ｐＣｍｑｏ２２４を用いて、実施例１と同様な遺伝子置換法によって行った。
得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを用い、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号４記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせ、あるいは配列番号７記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片および配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の組み合わせをプライマーとして、実施例１と同様な方法により２種類のＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、ＭＱＯ遺伝子内部に欠失変異を有する２回組換え体であるＩＭＤ−１株を取得した。
また、ＭＱＯ遺伝子内部にナンセンス変異を有するＩＭＮ−３株も取得した。
ＩＭＤ−１株およびＩＭＮ−３株のＭＱＯ活性を、実施例３と同様な方法で測定したところ、両変異株ともＭＱＯ活性を欠損していることが確認された。さらに、ＩＭＤ−１株およびＩＭＮ−３株のニコチンアミドまたはニコチン酸要求性を、実施例４と同様な方法で調べた結果、両変異株ともニコチンアミドまたはニコチン酸の要求性であることが示された。
実施例１３ＭＱＯ変異株によるＬ−イソロイシン生産試験
ＩＭＤ−１株、ＩＭＮ−３株、およびこれらの親株であるＦＥＲＭＢＰ−９８６を、ＢＹＧ寒天培地上で２８℃で２４時間培養し、種培地（グルコース５％、酵母エキス（ディフコ社製）１％、ペプトン１％、尿素０．３％、ＮａＣｌ０．２５％、コーン・スティープ・リカー０．５％、ビオチン

養した。この種培養液２ｍｌを本培養培地〔廃糖蜜（グルコース換算）７０ｇ、コーン・スティープ・リカー５ｇ、塩化アンモニウム２０ｇ、尿素２ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物０．０１ｇ、塩化マンガン４水和物０．０１ｇ、硫酸銅５水和物０．０１ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０１ｇ、硫酸亜鉛７水和物１ｍｇ、塩化ニッケル１ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物１ｍｇ、塩化コバルト６水和物１ｍｇ、

を水１Ｌに含みｐＨ７．４に調整した培地〕２０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種して７２時間、種培養と同様の方法で培養した。
遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−イソロイシンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第９表に示す。

ＭＱＯ活性を欠損させたＩＭＤ−１株およびＩＭＮ−３株では、Ｌ−イソロイシンの生産効率が親株ＦＥＲＭＢＰ−９８６に比べて明らかに向上していた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、マレート：キノンオキシドレダクターゼ活性が低下または欠損した微生物を用いるＬ−アミノ酸の製造法、該製造法に用いられるＤＮＡ、組換え体ＤＮＡ、形質転換体、およびＬ−アミノ酸を生成する能力が向上した微生物の育種方法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】

Technical field
The present invention relates to a method for producing an L-amino acid using a microorganism having reduced or deficient malate: quinone oxidoreductase activity, DNA used in the production method, recombinant DNA, transformant, and ability to produce an L-amino acid The present invention relates to a method for breeding microorganisms that has improved.
Background art
Malate: quinone oxidoreductase (hereinafter abbreviated as MQO) that controls the reaction from malic acid to oxaloacetic acid is known as one of the enzymes constituting the tricarboxylic acid circuit (TCA circuit).
Regarding the MQO of Corynebacterium glutamicum, biochemical properties and the base sequence of the MQO gene have been reported [Eur. J. et al. Biochem. ,254395 (1998), J. MoI. Bacteriol. ,1826884 (2000)].
In Corynebacterium glutamicum, a mutant strain lacking a gene encoding MQO (hereinafter sometimes abbreviated as MQO gene) becomes nicotinamide or nicotinic acid-requiring and cannot grow on a minimal medium. The MQO gene has been reported to be an important gene for growth [J. Bacteriol. ,1826884 (2000)]. Furthermore, it is known that the productivity of L-amino acids can be improved in coryneform bacteria by amplifying and overexpressing DNA encoding MQO (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-270888).
So far, there is no report that describes or suggests that L-amino acid production efficiency can be improved by reducing or deleting MQO activity in the fermentation production of L-amino acid.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide an industrially advantageous method for producing an L-amino acid, and a method for breeding a microorganism having an improved ability to produce an L-amino acid, characterized by using a microorganism having reduced or deficient MQO activity. It is to provide.
The present invention relates to the following (1) to (22).
(1) A microorganism having an ability to produce L-amino acid and having reduced or deficient MQO activity is cultured in a medium, and L-amino acid is produced and accumulated in the culture, and L-amino acid is collected from the culture. A process for producing an L-amino acid, characterized in that
(2) The method for producing an L-amino acid according to (1) above, wherein the microorganism having a decreased or deficient MQO activity is a microorganism having a decreased or deficient MQO activity due to mutation of DNA encoding MQO or a transcription / translation regulatory region thereof. .
(3) The method for producing an L-amino acid according to (2) above, wherein the mutation is a mutation caused by substitution, deletion, or addition of one or more bases in DNA encoding MQO or a transcription / translation regulatory region thereof.
(4) The method for producing an L-amino acid according to (2) or (3) above, wherein the mutation is a mutation caused by introduction of a nonsense mutation into DNA encoding MQO.
(5) The method for producing an L-amino acid according to any one of (2) to (4) above, wherein the DNA encoding MQO is a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 2.
(6) The mutation is a mutation caused by substituting the 671th and / or 672nd base of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 with adenine, and the L- A method for producing amino acids.
(7) The microorganism is corynebacterium (Corynebacterium) Genus, Brevibacterium (Brevibacterium) Genus, Microbacterium (Microbacterium), And Escherichia (Escherichia(1) A method for producing an L-amino acid according to any one of (1) to (6) above, which is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus.
(8) The microorganism is corynebacterium (Corynebacterium(1) A method for producing an L-amino acid according to any one of (1) to (7), which is a microorganism belonging to the genus.
(9) L-amino acid is synthesized via L-amino acid that is biosynthesized via L-aspartic acid, L-glutamic acid, or L-aspartic acid, L-glutamic acid or pyruvic acid in the metabolic pathway of microorganisms A method for producing an L-amino acid according to any one of the above (1) to (8), which is an L-amino acid.
(10) L-amino acid is L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-asparagine, L-glutamine, L-arginine, L-ornithine, L-proline, L -The manufacturing method of L-amino acid any one of said (1)-(9) which is L-amino acid chosen from the group which consists of alanine, L-valine, L-leucine, and L-isoleucine.
(11) The method for producing an L-amino acid according to any one of the above (1) to (10), wherein the L-amino acid is L-lysine, L-threonine, L-glutamine, L-arginine or L-isoleucine.
(12) DNA having a base sequence in which any one of the codons encoding the amino acid of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with a nonsense codon.
(13) A DNA having a base sequence in which the 671th and / or 672th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with adenine.
(14) A recombinant DNA containing the DNA of (12) or (13).
(15) A transformant having the recombinant DNA of (14).
(16) The transformant according to (15) above, wherein the transformant is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, and Escherichia.
(17) The transformant according to (16) above, wherein the transformant is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium.
(18) A microorganism having the DNA of (12) or (13) on a chromosome.
(19) The microorganism according to (18), wherein the microorganism is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, and Escherichia.
(20) The microorganism according to (18) above, wherein the microorganism belongs to the genus Corynebacterium.
(21) The production method of the above (1), wherein the microorganism is the transformant or microorganism of any one of the above (15) to (20).
(22) introducing a mutation into a microorganism having an ability to produce an L-amino acid and having MQO activity, measuring the MQO activity of the obtained microorganism, and selecting a microorganism having a reduced or deficient MQO activity. A method for breeding a microorganism having an improved ability to produce L-amino acids, which is characterized.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The microorganism used in the production method of the present invention (hereinafter also referred to as the microorganism of the present invention) is a microorganism capable of producing an L-amino acid, and the MQO activity of the microorganism is the MQO activity of the wild strain of the microorganism. Any microorganism may be used as long as it is a microorganism that is reduced as compared to the above, or a microorganism that lacks MQO activity, but is preferably a microorganism that exhibits nicotinamide or nicotinic acid requirement.
The MQO activity of the microorganism is only required to be lower than the MQO activity of the wild strain of the microorganism, but it is preferably as low as possible, and more preferably substantially deficient or completely deficient.
In the present invention, a wild strain refers to a microorganism that belongs to the same taxonomic species as the microorganism of the present invention and has a phenotype that appears most frequently in nature.
The microorganism of the present invention has the ability to produce an L-amino acid and has the MQO activity of a microorganism having an MQO activity (hereinafter sometimes referred to as a parent strain) from the usual mutation treatment method, recombinant DNA technology, etc. Reduction or deletion using a method that can introduce mutations into a microorganism, such as a gene replacement method by cell, a cell fusion method, or a transduction method, or a method that can suppress the expression of MQO, such as an antisense method. Can be obtained.
The parent strain may be a wild strain or a breeding strain artificially bred from the wild strain as long as it has the ability to produce L-amino acids and has a MQO activity. .
As a parent strain, for example, Corynebacterium (Corynebacterium) Genus, Brevibacterium (Brevibacterium), Microbacterium (Microbacterium) Genus, Escherichia (EscherichiaAnd microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, and Microbacterium are preferred, and microorganisms belonging to the genus Corynebacterium are more preferred.
In particular,Corynebacterium  acetoacidophilum,Corynebacterium  acetoglutamicum,Corynebacterium  callunae,Corynebacterium  glutamicum,Corynebacterium  lactofermentum,Corynebacterium  herculis,Corynebacterium  lilium,Corynebacterium  melassecola,Corynebacterium  thermoaminogenes,Corynebacterium  efficiens,Brevibacterium  saccharolyticum,Brevibacterium  immariophilum,Brevibacterium  roseum,Brevibacterium  thiogenitalis,Microbacterium  amoniaphilum,Escherichia  coliEtc.
More specifically,Corynebacterium  acetoacidophilum  ATCC 13870,Corynebacterium  acetoglutamicum  ATCC 15806,Corynebacterium  callunae  ATCC 15991,Corynebacterium  glutamicum  ATCC 13032,Corynebacterium  glutamicum  ATCC 13060,Corynebacterium  glutamicum  ATCC 13826 (Old GenusBre vibacterium  flavum),Corynebacterium  glutamicum  ATCC 14020 (Old GenusBrevibacterium  divaricatum),Corynebacterium  glutamicum  ATCC 13869 (Old GenusBrevibacterium  lactofermentum),Corynebacterium  herculis  ATCC 13868,Corynebacterium  lilium  ATCC 15990,Corynebacterium  melassecola  ATCC 17965,Corynebacterium  thermoaminogenes  ATCC 9244, ATCC 9245, ATCC 9246 and ATCC 9277,Brevibacterium  saccharolyticum  ATCC 14066,Brevibacterium  immariophilum  ATCC 14068,Brevibacterium  roseum  ATCC 13825,Brevibacterium  thiogenitalis  ATCC 19240,Microbacterium  amoniaphilum  ATCC 15354 and the like.
Examples of the mutation treatment method include a method using N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) (Microbial Experiment Manual, 1986, p. 131, Kodansha Scientific), ultraviolet irradiation method, and the like. Can give.
As a gene replacement method using recombinant DNA technology, one or more base substitutions, deletions or additions are introduced into the DNA encoding MQO, and the DNA is incorporated into the parent strain chromosome by homologous recombination, etc. A method of replacing the DNA encoding MQO originally present on the chromosome by replacement or the like can be mentioned.
The DNA encoding MQO may be any DNA that encodes a polypeptide having MQO activity that controls the reaction from malic acid to oxaloacetic acid. For example, SEQ ID NO: 2 [National Biotechnology Information Center (NCBI) http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / accession number AJ224946].
As a method for introducing substitution, deletion, or addition of one or more bases into DNA encoding MQO, see, for example, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) [hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 3rd Edition], Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter, Current Protocols). Abbreviated to LOGI), Nucleic Acids Research,10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,796409 (1982), Gene,34, 315 (1985), Nucleic Acids Research,13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488 (1985), etc., can be used.
Examples of gene replacement methods using recombinant DNA techniques include the following methods.
A report by D. Molenaar et al. [J. Bacteriol. ,182, 6884 (2000)], the mutation is introduced into the DNA encoding MQO.
The DNA encoding MQO is obtained by PCR or the like based on the nucleotide sequence information of the DNA encoding MQO derived from known Corynebacterium glutamicum [eg, National Biotechnology Information Center (NCBI) Accession Number AJ224946]. Can be acquired.
A recombinant plasmid is prepared by inserting a DNA encoding MQO into which the mutation has been introduced (hereinafter abbreviated as mutant DNA) into an appropriate plasmid vector or the like.
Examples of plasmid vectors include those that cannot replicate autonomously in the parent strain, and that are resistant to antibiotics and a Bacillus subtilis levanshuclease gene.sacB[Mol. Microbiol. ,61195 (1992)] can be used.
A recombinant plasmid carrying the mutant DNA is introduced into the parent strain.
As a method for introducing a recombinant plasmid having a mutant DNA into a parent strain, any method that can introduce DNA into a microorganism can be used. For example, electroporation [Appl. Microbiol. Biotech. ,52, 541 (1999)] and the protoplast method [J. Bacteriol. ,159, 306 (1984)].
Since the recombinant plasmid cannot autonomously replicate in the parent strain, the recombinant plasmid is integrated into the chromosome by obtaining a strain that is resistant to the antibiotic according to the antibiotic resistance marker of the recombinant plasmid. Transformed strains can be obtained.
Furthermore, a selection method utilizing the fact that Bacillus subtilis levansuclease incorporated into the chromosome together with the mutant DNA produces a suicide substrate [J. Bacteriol. ,174, 5462 (1992)], a strain in which the DNA encoding MQO on the chromosome of the parent strain is replaced with the mutant DNA can be obtained.
Although the gene replacement on the chromosome of the parent strain can be performed by the above method, the present invention is not limited to the above method, and any other gene replacement method can be used as long as it can replace the gene on the chromosome of the microorganism.
Other methods for introducing substitution, deletion, or addition into the DNA encoding MQO on the chromosome of the parent strain include cell fusion method and transduction method. For example, edited by Hiroshi Aida et al., Amino acid fermentation In 1986, the method described in the Society Publishing Center can be mentioned.
The number of bases into which mutation is introduced is not limited as long as the activity of MQO encoded by the DNA can be reduced or eliminated by substitution, deletion, or addition.
The site where the mutation is introduced is not necessarily limited to the base sequence of the DNA encoding MQO as long as the mutation can reduce or eliminate MQO activity, but transcription and translation of the DNA encoding MQO It is preferably in the regulatory region (hereinafter referred to as MQO gene), and more preferably in the base sequence of the DNA encoding MQO.
Examples of a method for reducing or eliminating MQO activity by introducing a base substitution include a method by introducing a nonsense mutation.
As a method for introducing a nonsense mutation, for example, PCR is performed using a primer containing a stop codon and DNA encoding MQO, and the obtained DNA encoding MQO into which the nonsense mutation has been introduced is used on the chromosome of the parent strain. The method of substituting MQO of this is mentioned.
Examples of the DNA into which the nonsense mutation has been introduced include DNA in which the 671th and / or 672th base is substituted with adenine in the base sequence described in SEQ ID NO: 2.
Examples of a method for reducing or deleting MQO activity by introducing a deletion of a base sequence include, for example, MQO obtained by cleaving the MQO gene with a restriction enzyme or the like, deleting an appropriate number of base sequences, and then recombining them. A method for incorporating a gene into a chromosome can be mentioned.
Examples of MQO genes with deleted base sequences include, for example, MQO genesHinExamples thereof include an MQO gene obtained by cleaving with dIII and having the nucleotides 422 to 1438 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 deleted.
MQO activity can also be reduced without introducing mutations into the MQO gene. As such a method, for example, there is a so-called antisense method in which an oligonucleotide or RNA having a base sequence complementary to the base sequence of mRNA encoding MQO is introduced into the microorganism to suppress the expression of the MQO gene. be able to.
Among the microorganisms obtained by performing the above operation, a microorganism having a reduced or deficient MQO activity can be obtained.
For example, strains deficient in MQO activity become a requirement for nicotinamide or nicotinic acid biosynthesized from nicotinamide [J. Bacteriol. ,182, 6884 (2000)], among strain-introduced microorganisms, a strain that does not grow on a medium not containing nicotinamide or nicotinic acid or that has grown worse than the parent strain is nicotinamide or Microorganism obtained as a nicotinic acid-requiring strain and measuring the MQO activity of the nicotinamide or nicotinic acid-requiring strain to reduce or eliminate the target MQO activity from the nicotinamide or nicotinic acid-requiring strain You can select and get.
For example, as shown in Example 3, the measurement of MQO activity is reported by D. Molenaar et al. [J. Bacteriol. ,182, 6884 (2000)], by measuring the reduction of 2,6-dichloroindophenol.
A method for producing and obtaining a microorganism having a reduced or deficient MQO activity can be used as a method for breeding a microorganism having an ability to produce an L-amino acid improved from that of a parent strain.
The production of L-amino acid in the present invention is carried out by culturing a microorganism having a reduced or deficient MQO activity in a medium and collecting the L-amino acid produced and accumulated in the culture.
Microorganism can be cultured by a normal culture method for microorganisms capable of producing L-amino acids.
As the medium, any of a synthetic medium or a natural medium can be used as long as it contains a suitable amount of carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like.
Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by the microorganism of the present invention. For example, sugars such as glucose, molasses, fructose, sucrose, maltose and starch hydrolysate, alcohols such as ethanol, acetic acid, lactic acid and Organic acids such as acids can be used.
Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium acetate and other inorganic and organic ammonium salts, urea, other nitrogen-containing compounds, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean hydrolysate Nitrogen-containing organic substances such as can be used.
As the inorganic salt, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, ammonium sulfate, sodium chloride, magnesium sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
In addition, trace nutrient sources such as biotin, thiamine, nicotinamide, and nicotinic acid can be added as necessary. These micronutrient sources can be substituted with medium additives such as meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid and the like.
The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture and deep aeration stirring culture. The culture temperature is generally preferably 20 to 42 ° C, more preferably 30 to 40 ° C. The pH of the medium is preferably maintained in the vicinity of neutrality in the range of 5-9. The pH of the medium is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, a pH buffer solution, or the like.
The culture period is usually 1 to 6 days, and L-amino acids are produced and accumulated in the culture solution.
After completion of the culture, L-amino acid can be recovered from a culture solution obtained by removing precipitates such as bacterial cells by using a known method such as activated carbon treatment or ion exchange resin treatment.
The L-amino acid that can be produced according to the present invention is not particularly limited. For example, L-aspartic acid, L-glutamic acid, biosynthesis via L-aspartic acid, L-glutamic acid, or pyruvic acid on the metabolic pathway of microorganisms. And L-amino acids to be used.
Examples of the L-amino acid biosynthesized via L-aspartic acid include L-methionine, L-lysine, L-threonine, and L-asparagine. Examples of the L-amino acid biosynthesized via L-glutamic acid include L-glutamine, L-arginine, L-ornithine, L-proline and the like. Examples of the L-amino acid biosynthesized via pyruvic acid include L-alanine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine and the like.
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these Examples.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Example 1 Construction of L-lysine producing strain lacking the MQO gene
(1) Introduction of deletion mutation into MQO gene
A report by D. Molenaar et al. [J. Bacteriol. ,182, 6884 (2000)], an attempt was made to introduce a deletion mutation into the MQO gene of an L-lysine-producing bacterium.
As an L-lysine-producing bacterium, Corynebacterium glutamicum (genetic trait is obvious)Corynebacterium  glutamicum) AHP-3 strain (FERM BP-7382) was used. Corynebacterium glutamicum AHP-3 strain is a homoserine dehydrogenase gene on the chromosome of the wild strain ATCC 13032 of Corynebacterium glutamicum (hom) Amino acid substitution mutation Val59Ala, aspartokinase gene (lysC) Amino acid substitution mutation Thr331Ile, and pyruvate carboxylase gene (pyc) Has an amino acid substitution mutation Pro458Ser.
First, a mutant gene having a deletion inside the MQO gene was inserted into a plasmid pESB30 (Takara Shuzo) by TA cloning method (Molecular Cloning 3rd edition). pESB30 is Escherichia coli having a kanamycin resistance gene (Escherichia  coli) Vector pHSG299 [Gene,61, 63 (1987)]PstAt the I cleavage site, Bacillus subtilis (Bacillus  subtilisLevanschlase genesacB2.6 kb includingPstI DNA fragment [Mol. Microbiol. ,6, 1195 (1992)].
Specifically, plasmid pESB30 isBamAfter digestion with HI, agarose gel electrophoresis was performed, and the pESB30 fragment was extracted and purified using GENECLEAN Kit (manufactured by BIO 101).
Both ends of the obtained pESB30 fragment were blunted using a DNA branding kit (DNA Blunting Kit, manufactured by Takara Shuzo) according to the attached protocol. The blunted pESB30 fragment was concentrated by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, then reacted at 70 ° C. for 2 hours in the presence of Taq polymerase (Boehringer Mannheim) and dTTP, and 1 base of thymine was added to the 3 ′ end. PESB30-T was prepared.
On the other hand, the chromosomal DNA of the wild strain ATCC 13032 of Corynebacterium glutamicum was obtained by the method of Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta,72619 (1963)].
Based on the known MQO gene derived from Corynebacterium glutamicum and the base sequence information of its neighboring region [for example, National Biotechnology Information Center (NCBI) Accession Number AJ224946], the base described in SEQ ID NO: 3 by a conventional method A DNA fragment having the sequence and a DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 4 were synthesized.
Using this synthetic DNA as a primer and chromosomal DNA as a template, a DNA fragment of about 2.2 kb including the full length of the MQO gene was amplified by PCR using Pfu turbo DNA polymerase (Stratagene) and the attached buffer.
PCR amplification productsBamHI andSalAfter cutting with I (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), it was subjected to agarose gel electrophoresis and about 2.2 kb using GENECLEAN Kit (manufactured by BIO 101).BamHI-SalThe I fragment was extracted and purified.
About 2.2 kb containing the full-length MQO gene thus obtainedBamHI-SalI fragment in advanceBamHI andSalPBluescript II (SK +) (Stratagene) cleaved by I was mixed, and ligation kit ver. 1 (Takara Shuzo) was used.
Using the obtained reaction product, Escherichia coli DH5α (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed according to a conventional method (Molecular Cloning 3rd Edition). LB agar medium containing 20 μg / ml kanamycin [Bactotryptone (Difco) 10 g, Yeast extract (Difco) 5 g, Sodium chloride 10 g, Bactogar (Difco) 16 g in 1 L of water And a medium adjusted to pH 7.0], and a transformant was selected. The transformed strain is inoculated into an LB medium containing 20 μg / ml kanamycin and cultured overnight, and the full length MQO gene is contained in the culture solution according to the method described in the alkaline SDS method (Molecular Cloning 3rd edition). A plasmid was prepared.
The resulting plasmid containing the full-length MQO geneHinAfter cleaving with dIII, the ligation kit ver. 1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to perform a binding reaction to cause autocyclization, and E. coli DH5α was transformed in the same manner as described above. After selecting a transformant in LB medium containing 20 μg / ml kanamycin, a plasmid was prepared by alkaline SDS method. When analyzed by restriction enzyme cleavage, the plasmid was found to be approximately 1.1 kb within the MQO gene.HinIt was confirmed that the dIII fragment had a deleted structure.
Using this plasmid as a template, PCR was carried out by Taq polymerase (manufactured by Boehringer Mannheim) using a DNA fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a DNA fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 as primers, and deletion A mutant MQO gene (about 1.1 kb) was amplified.
The obtained amplification product was ligated with ligation kit ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used to bind to the above-described pESB30-T fragment.
Escherichia coli DH5α was transformed using the resulting ligation product according to a conventional method. The strain was cultured on an LB agar medium containing 20 μg / ml kanamycin, and a transformant was selected. The transformed strain was inoculated into an LB medium containing 20 μg / ml kanamycin and cultured overnight, and a plasmid was prepared from the obtained culture solution by the alkaline SDS method.
The plasmid was analyzed by a restriction enzyme cleaving method, and a DNA fragment of about 1.1 kb containing a deletion mutant type MQO gene in which the 422 to 1438th positions of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 were deleted was inserted into pESB30. It was confirmed to have a structure. This plasmid was named pCmqod1.
(2) Introduction of MQO gene deletion mutation into L-lysine-producing AHP-3 strain by gene replacement method
Utilizing the fact that the plasmid pCmqod1 cannot autonomously replicate in coryneform bacteria, a strain in which the plasmid was integrated into the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum AHP-3 by homologous recombination was selected by the following method. .
Using pCmqod1, the method of Rest et al. [Appl. Microbiol. Biotech. ,52, 541 (1999)], the AHP-3 strain was transformed by electroporation to select a kanamycin resistant strain. As a result of examining the structure of the chromosome obtained from one of the selected kanamycin resistant strains by Southern hybridization (Molecular Cloning, 3rd edition), it was found that pCmqod1 was integrated into the chromosome by Campbell type homologous recombination. It was confirmed. In such a strain, a mutant MQO gene having a wild type and a deletion is present close to the chromosome, and the second homologous recombination is likely to occur between them.
The transformed strain (recombinant once) was prepared by using SUC agar medium (100 g of sucrose, 7 g of meat extract, 10 g of peptone, 3 g of sodium chloride, 5 g of yeast extract (Difco), 18 g of bacto agar (Difco) The culture was adjusted to pH 7.2, and colonies were grown by culturing at 30 ° C. for 1 day.
sacBThe strain in which the gene is present cannot grow on this medium because it converts sucrose to a suicide substrate [J. Bacteriol. ,1745462 (1991)]. In contrast, the second homologous recombination between the wild-type and mutant MQO genes existing close together on the chromosome occurs,sacBA strain lacking a gene cannot be a suicide substrate and can grow on this medium. During this second homologous recombination, either the wild type gene or the mutant genesacBWith deletion. At this time, the wild-type MQO genesacBIn the strain deleted together, gene substitution to the mutant type occurred.
The chromosomal DNA of the twice recombinant obtained in this manner was ligated to the method of Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta,72619 (1963)], Pfu turbo DNA polymerase (manufactured by Stratagene) and the attached DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the DNA fragment having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 as primers. PCR was performed using a buffer. The base sequence of the PCR product was determined by a conventional method, and it was examined whether the MQO gene of the recombinant twice was a wild type or a mutant type.
As a result, MQD-4 vermilion, which is a double recombinant having a deletion in the MQO gene, was obtained.
Example 2 Construction of an L-lysine-producing strain having a nonsense mutation in the MQO gene The 670th to 672nd Trp residues of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 encoding MQO (the 224th amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1) DNA in which the region encoding (amino acid residue) was substituted with a stop codon was prepared as follows according to the site-directed mutagenesis method (Molecular Cloning 3rd Edition).
The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in which the region (tgg) encoding the 670th to 672nd Trp residues of DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced with a base so as to encode the target stop codon (tga) A DNA fragment having a base sequence described in SEQ ID NO: 6 comprising a DNA fragment having a base sequence (the base sequence before substitution corresponds to the 662 to 684th base sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 2) and its complementary sequence Fragments were synthesized by conventional methods.
Further, a DNA fragment having the 165th to 185th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 shown in SEQ ID NO: 7, and the 1145th to 1164th base sequences of SEQ ID NO: 2 shown in SEQ ID NO: 8. A DNA fragment having a base sequence complementary to the second base sequence was synthesized by a conventional method. These four kinds of synthesized single-stranded DNA fragments were used as primers.
Specifically, the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 5, the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 8, the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 6, and the base sequence described in SEQ ID NO: 7 Two types of PCR were performed using the DNA fragment as a primer, the chromosomal DNA as a template, and Pfu turbo DNA polymerase and the attached buffer.
Two kinds of amplification products of about 0.5 kb obtained by PCR (DNA fragments having the 165th to 684th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and DNA fragments having the 662 to 1164th base sequences ) After agarose gel electrophoresis, and extracted and purified using GENECLEAN Kit (manufactured by BIO 101).
Furthermore, PCR was performed using both purified products as templates and a DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 8 as primers. By this PCR amplification, a DNA fragment of about 1.0 kb was obtained in which the region encoding the 224th Trp residue of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was replaced with a stop codon (tga).
The PCR product was reacted in the presence of Taq polymerase and dATP at 72 ° C. for 10 minutes to add 1 base of adenine to the 3 ′ end. The obtained DNA fragment of about 1.0 kb was inserted into the plasmid pESB30-T in the same manner as in Example 1. The plasmid thus obtained was named pCmqo224.
The base sequence of pCmqo224 was examined, and it was confirmed that the desired nonsense mutation was introduced into the MQO gene.
Next, using pCmqo224, the nonsense mutation was introduced into the MQO gene on the chromosome of the L-lysine-producing bacterium AHP-3 strain by the same gene replacement method as in Example 1. PCR was carried out in the same manner as in Example 1 using the obtained chromosomal DNA of the twice-recombinant, using as a primer a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. Went.
As a result of determining the base sequence of the obtained PCR product by a conventional method, APM-4 strain, which is a twice-recombinant having a nonsense mutation in the MQO gene, was obtained.
Example 3 Measurement of MQO activity
The measurement of MQO activity of the MQD-4 strain, APM-4 strain obtained in Examples 1 and 2 and their parent AHP-3 strain was reported by D. Molenaar et al. [J. Bacteriol. ,182, 6884 (2000)] and was measured by the following method.
The Corynebacterium glutamicum AHP-3 strain is a strain derived from the wild strain ATCC 13032 of Corynebacterium glutamicum. No mutation involved in MQO activity has been introduced into Corynebacterium glutamicum AHP-3.
MQD-4 strain, APM-4 strain, and AHP-3 strain were added to MMYE medium [glucose 20 g, ammonium sulfate 10 g, urea 3 g, potassium dihydrogen phosphate 1 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.4 g, sodium chloride 50 mg, respectively. Medium containing 2 mg of iron sulfate heptahydrate, 2 mg of manganese sulfate pentahydrate, 0.2 mg of thiamine hydrochloride, 0.05 mg of biotin and 1 g of yeast extract (manufactured by Difco) adjusted to pH 7.2] Inoculated into 200 ml and cultured at 30 ° C.
During the culture, the turbidity of the culture solution is measured with a spectrophotometer or the like, and the OD of the culture solution is measured. The culture was terminated when 660 nm became 2 to 3 (36 hours in this experiment). After completion of the culture, the culture solution was centrifuged at 4,000 g and 4 ° C. for 5 minutes. Lysis buffer (10 mmol / l potassium acetate, 10 mmol / l calcium chloride, 5 mmol / l magnesium chloride, 50 mmol / l Hepes-NaOH, pH 7.5) was prepared by cooling the cells obtained by the centrifugation with ice. Including] was washed twice. After washing, 20 ml of lysis buffer was added, and the cells were suspended in the lysis buffer. This suspension was treated 3 times with 165 Mpa using a French press apparatus to disrupt the cells. The suspension containing the disrupted cells was centrifuged at 10,000 g, 4 ° C. for 15 minutes, and the resulting supernatant was centrifuged at 75,000 g, 4 ° C. for 30 minutes. The resulting precipitate was washed once with the lysis buffer and suspended in the lysis buffer to a final protein concentration of 5-15 mg / ml to give a crude membrane suspension.
2,6-dichloroindophenol (Cl₂Ind) was dissolved in a lysis buffer to a concentration of 50 μmol / l, and the crude membrane suspension obtained above was added, and 1 mmol / l sodium L-malate was added to carry out the reaction. . The absorption at 600 nm is measured with a spectrophotometer, and the molar extinction coefficient is 22 cm.^-1(Mmol / l)^-1As a result, the concentration of 2,6-dichloroindophenol was calculated, and the amount of 2,6-dichloroindophenol that decreases in one minute was calculated. The decrease amount of 2,6-dichloroindophenol per mg of protein per minute was defined as MQO specific activity.
Similarly, the MQO specific activity of the wild strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 was measured.
Table 1 shows the MQO specific activities of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain, AHP-3 strain, MQD-4 strain and APM-4 strain.
In MQD-4 strain and APM-4 strain, MQO activity was not detected, and it was confirmed that both MQD-4 strain and APM-4 strain lack MQO activity.
Further, the MQO specific activities of the ATCC 13032 strain and the AHP3 strain were almost the same.

Example 4 Nicotinamide or nicotinic acid requirement of MQO mutants
The components shown in Table 2 were dissolved in 300 ml of water and adjusted to pH 7.0 with 1N aqueous sodium hydroxide solution. Water was added to the aqueous solution so as to be 400 ml, and the solution was sterilized by filtration. To this, 100 ml of a 10% glucose aqueous solution autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes was added. To the resulting solution, 500 ml of a 3% Bactagar aqueous solution (manufactured by Difco) autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes was added, and the mixture was spread on a plate to prepare a minimal agar medium. In addition, a minimal agar medium containing nicotinamide or nicotinic acid at a concentration of 1 mg / l was prepared in the same manner as above except that 0.9 mg of nicotinamide or nicotinic acid and 300 mg of water were dissolved in 300 ml of water. Produced.
Bactagar was washed 5 times with distilled water before sterilization in an autoclave.

The MQD-4 strain, APM-4 strain and AHP-3 were applied to the minimal agar medium and the minimal agar medium containing nicotinamide or nicotinic acid at a concentration of 1 mg / l and cultured at 30 ° C. for 4 days.
When the growth of these strains was observed, the MQD-4 strain and the APM-4 strain did not grow on the minimal agar medium, but grew on the minimal agar medium containing nicotinamide or nicotinic acid at a concentration of 1 mg / l.
From this, MQD-4 strain and APM-4 strain, which are MQO-deficient strains, are clearly nicotinamide or nicotinic acid requirement. The AHP-3 strain grew well even on a minimal agar medium.
Example 5 L-lysine production test using MQO mutant
The MQO mutants MQD-4 and APM-4 obtained in Examples 1 and 2 and their parent strain AHP-3 were added to BYG agar medium [glucose 10 g, meat extract 7 g, peptone 10 g, sodium chloride 3 g, yeast extract ( 5 g of Difco) and 18 g of Bactoagar (Difco) in 1 L of water and adjusted to pH 7.2] were cultured at 30 ° C. for 15 hours, and each strain was seeded with seed media (sucrose 50 g, corn steep liquor). 40 g, ammonium sulfate 8.3 g, urea 1 g, potassium dihydrogen phosphate 2 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.83 g, iron sulfate heptahydrate 10 mg, copper sulfate pentahydrate 1 mg, zinc sulfate heptahydrate 10 mg , Β-alanine 10 mg, nicotinic acid 5 mg, thiamine hydrochloride 1.5 mg, biotin 0.5 mg in 1 L of water to pH 7.2 Retighten was inoculated calcium carbonate in a 2 L baffled Erlenmeyer flask containing a culture medium] 250ml plus 30g, and 12-16 hours at 30 ° C..
The total amount of the seed culture solution obtained was adjusted to the main culture medium [glucose 60 g, corn steep liquor 20 g, ammonium chloride 25 g, potassium dihydrogen phosphate 2.5 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.75 g, iron sulfate, respectively. Heptahydrate 50 mg, manganese sulfate pentahydrate 13 mg, calcium chloride dihydrate 50 mg, copper sulfate pentahydrate 6.3 mg, zinc sulfate heptahydrate 1.3 mg, nickel chloride hexahydrate 5 mg, 1,400 ml of cobalt chloride hexahydrate 1.3 mg, ammonium molybdate tetrahydrate 1.3 mg, nicotinic acid 14 mg, β-alanine 23 mg, thiamine hydrochloride 7 mg, biotin 0.42 mg in 1 L of water] Inoculate 5 liter jar fermenter containing and adjust to pH 7.0 with aqueous ammonia under conditions of 34 ° C, 1 vvm, 800 rpm While the culture.
When glucose in the medium was consumed, a glucose feed solution (medium containing 400 g of glucose and 45 g of ammonium chloride in 1 L of water) was continuously added.
The feed solution was added while adjusting the flow acceleration to be the same among the three strains, and the culture was terminated when the culture time reached 28 hours.
The cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-lysine hydrochloride accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC).
The results are shown in Table 5.

In the MQD-4 and APM-4 strains deficient in MQO activity, the production efficiency of L-lysine was clearly improved compared to the parent strain AHP-3.
Example 6 Construction of L-threonine producing strain deficient in MQO activity
Using pCmqod1 constructed in Example 1 and pCmqo224 constructed in Example 2, deletion mutations or nonsense mutations were introduced into the MQO gene of L-threonine-producing bacteria by the following method.
Corynebacterium glutamicum ATCC 21660 was used as the L-threonine producing bacterium. ATCC 21660 is a mutant obtained by inducing a methionine auxotrophic mutation, an AHV resistance mutation, and an AEC resistance mutation from the wild strain ATCC 13032 of Corynebacterium glutamicum [Agr. Biol. Chem. ,36, 1611 (1972)].
The deletion mutation or nonsense mutation was introduced into the MQO gene by the same gene replacement method as in Example 1 using the above-mentioned pCmqod1 and pCmqo224, respectively.
Using the obtained chromosomal DNA of the twice-recombinant, it has a combination of a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Two types of PCR were carried out in the same manner as in Example 1 using as a primer a combination of the DNA fragment and the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 8.
As a result of determining the base sequence of the obtained PCR product by a conventional method, a TMD-1 strain which is a twice-recombinant having a deletion mutation in the MQO gene was obtained.
In addition, TMN-3 strain having a nonsense mutation within the MQO gene was also obtained.
When the MQO activity of the TMD-1 strain and TMN-3 strain was measured by the same method as in Example 3, it was confirmed that both mutant strains lacked the MQO activity. Furthermore, as a result of examining the nicotinamide or nicotinic acid requirement of the TMD-1 strain and TMN-3 strain by the same method as in Example 4, it was shown that both mutant strains are nicotinamide or nicotinic acid requirement. It was done.
Example 7 L-threonine production test by MQO mutant
TMD-1 strain, TMN-3 strain, and their parent strain ATCC 21660 strain were cultured on BYG agar medium at 30 ° C. for 24 hours, and seed medium [glucose 20 g, peptone 10 g, yeast extract (Difco)] 10 g, medium containing 2.5 g of sodium chloride in 1 L of water and adjusted to pH 7.4] A large test tube containing 10 ml was inoculated and cultured at 30 ° C. for 24 hours. 1 ml of this seed culture solution was added to the main culture medium (glucose 100 g, ammonium sulfate 20 g, potassium monohydrogen phosphate 0.5 g, potassium dihydrogen phosphate 0.5 g, magnesium sulfate heptahydrate 1 g, iron sulfate heptahydrate 10 mg, Inoculate 10 ml of a large test tube containing 10 mg of manganese sulfate pentahydrate, 0.1 mg of biotin and 0.1 mg of L-methionine in 1 L of water and adjusting to pH 7.4 and then adding 20 g of calcium carbonate. And cultured at 30 ° C. for 72 hours.
The cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-threonine accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 6.

In the TMD-1 and TMN-3 strains lacking MQO activity, the production efficiency of L-threonine was clearly improved compared to the parent strain ATCC 21660.
Example 8 Construction of L-glutamine producing strain deficient in MQO activity
Using pCmqod1 constructed in Example 1 and pCmqo224 constructed in Example 2, deletion mutations or nonsense mutations were introduced into the MQO gene of L-glutamine producing bacteria by the following method.
As an L-glutamine producing bacterium, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, which is a wild strain of Corynebacterium glutamicum, was used.
The deletion mutation or nonsense mutation was introduced into the MQO gene by the same gene replacement method as in Example 1 using the above-mentioned pCmqod1 and pCmqo224, respectively.
Using the obtained chromosomal DNA of the twice-recombinant, it has a combination of a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Two types of PCR were carried out in the same manner as in Example 1 using as a primer a combination of the DNA fragment and the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 8.
The base sequence of the obtained PCR product was determined by a conventional method to obtain a GMD-1 strain which is a twice-recombinant having a deletion mutation within the MQO gene.
A GMN-3 strain having a nonsense mutation within the MQO gene was also obtained.
When the MQO activity of GMD-1 strain and GMN-3 strain was measured by the same method as in Example 3, it was confirmed that both mutant strains lacked MQO activity. Furthermore, as a result of examining the nicotinamide or nicotinic acid requirement of the GMD-1 strain and the GMN-3 strain by the same method as in Example 4, it was shown that both mutant strains are required for nicotinamide or nicotinic acid. It was done.
Example 9 L-glutamine production test by MQO mutant
The GMD-1 strain, the GMN-3 strain, and the parent strain, ATCC 14752 strain, were cultured on a BYG agar medium at 28 ° C. for 24 hours. 1 platinum of this cultured cell was produced in a production medium (glucose 150 g, ammonium chloride 50 g, potassium monohydrogen phosphate 0.7 g, potassium dihydrogen phosphate 0.7 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.5 g, iron sulfate 7 water. Japanese medium 20 mg, Manganese sulfate pentahydrate 20 mg, Zinc sulfate heptahydrate 10 mg, Biotin 6 μg, Thiamine hydrochloride 1 mg, Meat extract 5 g in 1 L of water and adjusted to pH 7.2, then added with 50 g of calcium carbonate ) Inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml and cultured at 28 ° C. for 96 hours.
The cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-glutamine accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 7.

In the GMD-1 and GMN-3 strains lacking MQO activity, the production efficiency of L-glutamine was clearly improved compared to the parent strain ATCC14752.
Example 10 Construction of L-arginine producing strain deficient in MQO activity
Using pCmqod1 constructed in Example 1 and pCmqo224 constructed in Example 2, deletion mutations or nonsense mutations were introduced into the MQO gene of L-arginine-producing bacteria by the following method.
As an L-arginine-producing bacterium, Corynebacterium glutamicum KY10671 (FERM P-3616) strain was used. The KY10671 strain induces a D-serine sensitive mutation, a D-arginine resistant mutation, an arginine hydroxamate resistant mutation, and a 6-azauracil resistant mutation from the wild strain of Corynebacterium glutamicum, KY9004 (FERM P-3295). (See JP-A-53-12491, JP-A-1-257486).
The deletion mutation or nonsense mutation was introduced into the MQO gene by the same gene replacement method as in Example 1 using the above-mentioned pCmqod1 and pCmqo224, respectively.
Using the obtained chromosomal DNA of the twice-recombinant, it has a combination of a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Two types of PCR were carried out in the same manner as in Example 1 using as a primer a combination of the DNA fragment and the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 8.
The base sequence of the obtained PCR product was determined by a conventional method, and the AMD-1 strain, which is a twice-recombinant having a deletion mutation in the MQO gene, was obtained.
In addition, an AMN-3 strain having a nonsense mutation within the MQO gene was also obtained.
When the MQO activity of the AMD-1 strain and the AMN-3 strain was measured by the same method as in Example 3, it was confirmed that both mutant strains lacked the MQO activity. Furthermore, as a result of examining the nicotinamide or nicotinic acid requirement of the AMD-1 strain and the AMN-3 strain by the same method as in Example 4, it was shown that both mutant strains are nicotinamide or nicotinic acid requirement. It was done.
Example 11 L-Arginine Production Test Using MQO Mutant
The AMD-1 strain, AMN-3 strain, and their parent strain KY10671 strain are cultured on a BYG agar medium at 30 ° C. for 24 hours, and seed medium (glucose 20 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, sodium chloride 2. 5 g of medium containing 1 L of water and adjusted to pH 7.2) A large test tube containing 6 ml was inoculated and cultured at 30 ° C. for 24 hours. 2 ml of this seed culture solution was added to the main culture medium [waste molasses 150 g (converted to glucose), corn steep liquor 5 g, ammonium sulfate 30 g, urea 3 g, potassium monohydrogen phosphate 0.5 g, potassium dihydrogen phosphate 0.5 g, sulfuric acid A medium containing 0.25 g of magnesium dihydrate in 1 L of water, adjusted to pH 7.2, and supplemented with 30 g of calcium carbonate] was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml and cultured at 30 ° C. for 72 hours.
The cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-arginine accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 8.

In the AMD-1 and AMN-3 strains lacking MQO activity, the production efficiency of L-arginine was clearly improved compared to the parent strain KY10671.
Example 12 Construction of L-isoleucine producing strain deficient in MQO activity
Using pCmqod1 constructed in Example 1 and pCmqo224 constructed in Example 2, deletion mutations or nonsense mutations were introduced into the MQO gene of L-isoleucine-producing bacteria by the following method.
Corynebacterium glutamicum FERM BP-986 was used as the L-isoleucine-producing bacterium. FERM BP-986 is obtained from a wild strain of Corynebacterium glutamicum by inducing arginine requirement, S- (2-aminoethyl) cysteine resistance, fluoropyruvic acid sensitivity, rifampicillin resistance and threonine hydroxamate resistance mutations. Mutant (Japanese Patent Laid-Open No. 62-195293).
The deletion mutation or nonsense mutation was introduced into the MQO gene by the same gene replacement method as in Example 1 using the above-mentioned pCmqod1 and pCmqo224, respectively.
Using the obtained chromosomal DNA of the twice-recombinant, it has a combination of a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a DNA fragment having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Two types of PCR were carried out in the same manner as in Example 1 using as a primer a combination of the DNA fragment and the DNA fragment having the base sequence described in SEQ ID NO: 8.
The base sequence of the obtained PCR product was determined by a conventional method, and an IMD-1 strain, which is a twice-recombinant having a deletion mutation in the MQO gene, was obtained.
In addition, an IMN-3 strain having a nonsense mutation within the MQO gene was also obtained.
When the MQO activity of IMD-1 strain and IMN-3 strain was measured by the same method as in Example 3, it was confirmed that both mutant strains lack MQO activity. Furthermore, as a result of examining the nicotinamide or nicotinic acid requirement of the IMD-1 strain and the IMN-3 strain by the same method as in Example 4, it was shown that both mutant strains are nicotinamide or nicotinic acid requirement. It was done.
Example 13 L-isoleucine production test by MQO mutant
IMD-1 strain, IMN-3 strain, and their parent strain FERM BP-986 are cultured on BYG agar medium at 28 ° C. for 24 hours, and seed medium (glucose 5%, yeast extract (Difco) manufactured) 1 %, Peptone 1%, urea 0.3%, NaCl 0.25%, corn steep liquor 0.5%, biotin

Nourished. 2 ml of this seed culture solution was added to the main culture medium [70 g of molasses (glucose equivalent), 5 g of corn steep liquor, 20 g of ammonium chloride, 2 g of urea, 2 g of potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g of magnesium sulfate heptahydrate, sulfuric acid Iron heptahydrate 0.01 g, manganese chloride tetrahydrate 0.01 g, copper sulfate pentahydrate 0.01 g, calcium chloride dihydrate 0.01 g, zinc sulfate heptahydrate 1 mg, nickel chloride 1 mg , 1 mg of ammonium molybdate tetrahydrate, 1 mg of cobalt chloride hexahydrate,

A medium adjusted to pH 7.4 in 1 L of water] A 300 ml Erlenmeyer flask containing 20 ml was inoculated and cultured for 72 hours in the same manner as the seed culture.
The cells were removed from the culture by centrifugation, and the amount of L-isoleucine accumulated in the supernatant was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 9.

In the IMD-1 and IMN-3 strains lacking MQO activity, the production efficiency of L-isoleucine was clearly improved compared to the parent strain FERM BP-986.
Industrial applicability
According to the present invention, a method for producing an L-amino acid using a microorganism having reduced or deficient malate: quinone oxidoreductase activity, DNA used in the production method, recombinant DNA, transformant, and production of an L-amino acid It is possible to provide a method for breeding a microorganism with improved ability to perform the above-described process.
Sequence listing free text
SEQ ID NO: 3 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 4-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 5-description of artificial sequence: synthetic DNA
SEQ ID NO: 6 Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 7--Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
SEQ ID NO: 8-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
[Sequence Listing]

Claims

A microorganism having an ability to produce an L-amino acid and having reduced or deficient malate: quinone oxidoreductase (hereinafter abbreviated as MQO) activity is cultured in a medium, and the L-amino acid is produced and accumulated in the culture, A method for producing an L-amino acid, which comprises collecting the L-amino acid from a culture.

The method for producing an L-amino acid according to claim 1, wherein the microorganism having a decreased or deficient MQO activity is a microorganism having a decreased or deficient MQO activity due to a mutation in DNA encoding MQO or a transcriptional / translational regulatory region thereof. .

The method for producing an L-amino acid according to claim 2, wherein the mutation is a mutation by substitution, deletion or addition of one or more bases in DNA encoding MQO or a transcription / translation regulatory region thereof.

The method for producing an L-amino acid according to claim 2 or 3, wherein the mutation is a mutation caused by introduction of a nonsense mutation into DNA encoding MQO.

The method for producing an L-amino acid according to any one of claims 2 to 4, wherein the DNA encoding MQO is a DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2.

The L- of any one of claims 2 to 5, wherein the mutation is a mutation caused by substituting the 671th and / or 672nd base of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 with adenine. A method for producing amino acids.

Microorganism, Corynebacterium (Corynebacterium) genus Brevibacterium (Brevibacterium) genus-mycobacterial (Microbacterium) genus and a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to Escherichia (Escherichia) genus, the scope of the claims The method for producing an L-amino acid according to any one of 1 to 6.

The method for producing an L-amino acid according to any one of claims 1 to 7, wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium.

The L-amino acid is L-amino acid that is biosynthesized via L-aspartic acid, L-glutamic acid, or L-aspartic acid, L-glutamic acid or pyruvic acid in the metabolic pathway of the microorganism. The manufacturing method of L-amino acid of any one of -8.

L-amino acid is L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-lysine, L-methionine, L-threonine, L-asparagine, L-glutamine, L-arginine, L-ornithine, L-proline, L-alanine, The method for producing an L-amino acid according to any one of claims 1 to 9, which is an L-amino acid selected from the group consisting of L-valine, L-leucine and L-isoleucine.

The method for producing an L-amino acid according to any one of claims 1 to 10, wherein the L-amino acid is L-lysine, L-threonine, L-glutamine, L-arginine or L-isoleucine.

A DNA having a base sequence in which any one of codons encoding an amino acid of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with a nonsense codon.

A DNA having a base sequence in which the 671th and / or 672th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with adenine.

A recombinant DNA containing the DNA according to claim 12 or 13.

A transformant having the recombinant DNA according to claim 14.

16. The transformant according to claim 15, wherein the transformant is a microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, and Escherichia.

The transformant according to claim 15, wherein the transformant is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium.

A microorganism having the DNA of claim 12 or 13 on a chromosome.

The microorganism according to claim 18, wherein the microorganism is selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, and Escherichia.

The microorganism according to claim 18, wherein the microorganism belongs to the genus Corynebacterium.

The production method according to claim 1, wherein the microorganism is the transformant or microorganism according to any one of claims 15 to 20.

It is characterized by introducing a mutation into a microorganism having an ability to produce an L-amino acid and having MQO activity, measuring the MQO activity of the obtained microorganism, and selecting a microorganism having a reduced or deficient MQO activity A method of breeding microorganisms with improved ability to produce L-amino acids.