技術分野
本発明は、新規のニューロペプチドＹ様ペプチドに関する。
背景技術
ニューロペプチドＹ（ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ；以下、ＮＰＹと略称する）ファミリーは、ＮＰＹ、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）、及び膵臓ペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＰＰ）の３種類より構成される生理活性ペプチド群である（Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．，６２，１−１１，１９９６）。いずれのペプチドも、アミノ酸３６個からなり、Ｃ末端がアミド化された直鎖ペプチドである。
ＮＰＹは、１９８２年にブタ脳から単離・精製され、その後の研究によって哺乳類の中枢及び末梢神経系で最も含有量が多い神経ペプチドであることが判明した（Ｎａｔｕｒｅ，２９６，６５９−６０，１９８２）。ＮＰＹの発現は、中枢神経系（特に、視床下部、海馬、大脳皮質、及び脳幹部）、副腎髄質、及び副交感神経に見られる。
ＰＹＹも、ＮＰＹと同じ１９８２年にブタ小腸から単離・精製された生理活性ペプチドである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，２５１４−８，１９８２）。ＰＹＹは、ＮＰＹに対してアミノ酸一次配列で７０％の相同性があり、下部小腸、大腸、及び膵臓で発現が確認されている。
ＰＰは、１９７５年にニワトリのインスリン精製過程の副産物として、ＮＰＹファミリー中で最初の分子として同定された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，９３６９−７６，１９７５）。ＮＰＹ及びＰＹＹは全ての脊椎動物で存在が確認されているが、ＰＰは四肢動物への進化の初期に発生したと考えられている。ＰＰは、ＮＰＹに対して５０％のアミノ酸配列相同性を有しており、発現は主に膵臓で観察される。
ＮＰＹ遺伝子は、ヒトで第７染色体ｐ１５．１に存在している。ＰＹＹ遺伝子及びＰＰ遺伝子は、いずれもヒトの第１７染色体ｑ２１．１に、わずか１０ｋｂの距離に連座しており、分子進化学的解析からＰＰ遺伝子はＰＹＹ遺伝子のコピーとして遺伝子複製（ｇｅｎｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）されたものと考えられている。ＮＰＹは、既知の神経ペプチドの内で、分子進化上最も保存されている分子であり、既知オーソログでは３６アミノ酸中、２２アミノ酸が同一である。一方で、ＰＹＹは、それよりも少ない１５アミノ酸が種を超えて保存されているが、ＰＰについては、７アミノ酸が同一であるに過ぎない。こうしたことから、ＰＹＹはＮＰＹに比べ、進化速度の速い分子と考えられており、ＰＰ遺伝子がＰＹＹ遺伝子より遺伝子複製されたことが、ＰＹＹの進化速度を速める一因となったとの考察もある。
ＮＰＹファミリーでは、アミノ酸一次配列中で共通に保有する３つのプロリン残基と２つのチロシン残基とで（ポリプロリンヘリックス）−（βターン）−（αヘリックス）のＵ字構造と、自由度の高いＣ末端の４アミノ酸の立体構造とが形成される。この構造は「ＰＰ−ｆｏｌｄ」と呼ばれ、ＮＰＹファミリーの活性発現に重要な役割を担うと考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１１７０６−１２，１９９０）。
ＮＰＹファミリーの機能発現は、ＮＰＹ特異的受容体との結合を介して行われる（Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，２９４−８，１９９７）。ＮＰＹファミリーの受容体としては、これまで５つの異なるサブタイプが存在することが知られており、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、及びＹ６が遺伝子レベルで同定されている。Ｙ１受容体は、Ｙ４受容体と４２％（アミノ酸配列に関して）と最も高い相同性があり、ヒトでは機能を持たない偽遺伝子のＹ６受容体と５１％の相同性がある。興味深いことに、Ｙ１受容体は、アミノ酸配列に関して、Ｙ５受容体及びＹ２受容体に対する相同性は、それぞれ３５％及び３１％しかない。こうした事実は、ＮＰＹ受容体が、ＧＰＣＲスーパーファミリーの内で最もサブタイプ間相同性の低い群であることを示している。５種類のＮＰＹ受容体は、いずれも百日咳毒素感受性のＧタンパク質の活性化を介して細胞内シグナル伝達系を活性化し、細胞内ｃＡＭＰ量の蓄積を抑制する。また、Ｙ１受容体及びＹ２受容体は、活性化により細胞内Ｃａ濃度上昇を引き起こすこと、そして、Ｙ２受容体は、更にＫチャネルの活性化を引き起こすことも報告されている。
ＮＰＹの生理活性としては、摂食、性行動、日周運動、及び血圧への関与が示唆されている。これらの生理機能のうち、最も良く研究されているのが、中枢投与時における摂食に関するもので、一連の研究よりＮＰＹは最も有効な摂食亢進物質であるとする報告がある（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７８，３７１−９２，２０００）。ＮＰＹをラット脳室内に投与すると、摂食量の増大が観察され、最終的には体重増加及び肥満が起こる。また、日常的な摂食前には、満腹中枢である視床下部室傍核にてＮＰＹの発現が増大する（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７０（４ Ｐｔ １），Ｅ５８９−９５，１９９６）。飢餓状態では、視床下部でのＮＰＹ発現量が亢進するが、摂食によりその発現は減弱する（Ａｍ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６６（５ Ｐｔ ２），Ｒ１６８７−９１，１９９４）。しかしながら、興味深いことに、ＮＰＹのノックアウトマウス（ＫＯマウス）では、摂食パターンに変化は起こらず（Ｎａｔｕｒｅ，３８１，４１５−２１，１９９６）、ｏｂ／ｏｂマウスとＮＰＹのＫＯマウスとを掛け合わせた場合に、摂食量減少及びエネルギー代謝量増加を伴う、強い体重減少が観察される（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７０４−７，１９９６）。
ＰＹＹ及びＰＰも、摂食亢進を惹起することが知られている。ＰＹＹは、ラット脳室内投与により摂食量が著しく上昇し、その効果はＮＰＹよりも顕著であることが報告されている［Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５９（２ Ｐｔ ２），Ｒ３１７−２３，１９９０、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，３４１，２００−３，１９８５、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８０５，２０−８，１９９８、及びＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，５８，７３１−５，１９９５］。ＰＰは、脳室内投与により摂食が刺激されることが知られている［Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９（５ Ｐｔ ２），Ｒ９８３−７，１９９５］。また、ＰＹＹ及びＰＰは、消化管機能、及び膵臓外分泌等の末梢生理機能も調節すると考えられている。ＰＹＹは、多くの動物種において胃酸の分泌を抑制することが知られており、ラット小腸では抗分泌活性を示す。逆に、胃酸はＰＹＹのｍＲＮＡ転写量を増大させる。膵臓では、ＰＹＹはα細胞の分泌顆粒にグルカゴンと共に貯蔵されており、ＰＹＹはグルコース刺激によるインスリン分泌抑制活性を有する（Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１５７，３０５−６，１９９６）。ＰＰは、胃酸分泌の制御に関与することが示唆されている［Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６９（５ Ｐｔ ２），Ｒ９８３−７，１９９５］。
更に、ＮＰＹファミリー阻害剤である、１２２９Ｕ９１、ＢＭＳ−１９２５４８、Ｊ−１０４８７０、及びＢＩＢＰ３２２６等について、抗肥満薬の研究が進められている（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２６１−６，１９９５、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），４８，１０５５−９，１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６，８８−９１，１９９９、及びＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１３６−４２，１９９５）。
上記の通り、ＮＰＹファミリーは新規医薬品ターゲットとして有用であることが知られている。
発明の開示
本発明の課題は、新規なＮＰＹ様ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの製造方法を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得し、本ポリヌクレオチドがコードするペプチドは、ＮＰＹファミリーに属するＰＹＹに最も高い相同性を有することを見出した。そして、本ペプチドは、ＰＹＹと同様に、摂食機能を司る視床下部、胃酸分泌を司る小腸、及びインスリン分泌抑制機能を司る脳下垂体で発現していることを解明し、ＰＹＹと同様の機能を有する新規なＮＰＹ様ペプチドであることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
［３］［１］又は［２］に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［４］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
［５］［３］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体；
［６］［５］に記載の形質転換体を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含むことを特徴とする、［１］又は［２］に記載のペプチドの製造方法；並びに
［７］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換真核生物細胞を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含む方法により製造されうるペプチド
に関する。
なお、本願優先日後に公開されたＷＯ０１／６０８５０号公報には、単に、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列が記載されているのみで、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はこれをコードするポリヌクレオチドの具体的な取得方法、及び前記ペプチド又はポリヌクレオチドを取得したという実施例は存在せず、現実に前記ペプチド等を取得したことを裏付ける記載はない。また、配列番号３で表されるアミノ酸配列は、開示も示唆もされていない。つまり、配列番号３又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及びこれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明者が初めて取得したものである。
発明の実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］本発明のポリペプチド
本発明のペプチドには、
（１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；及び
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
が含まれる。
本発明のペプチドの１つである、「配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、４２個のアミノ酸残基からなるヒト由来のペプチドである。前記「配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、後述の実施例１で示すように、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」として翻訳された前駆体から、Ｎ末端側のシグナルペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番目〜２８番目のアミノ酸からなるペプチド）が切断除去された成熟体であると考えられる。
本発明のペプチドは、ＰＹＹと同様の機能、具体的には、摂食調節機能（好ましくは摂食亢進機能）、胃酸分泌抑制機能、又はインスリン分泌抑制機能を有する。
或るペプチドが「摂食調節機能」を示すか否かの確認方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法により確認することができる。すなわち、被検ペプチドを適当量（例えば、１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇ、及び１０ｍｇずつ）でラット脳室内に投与し、前記投与から所定時間経過後（例えば、３０分経過後、６０分経過後、９０分経過後、１２０分経過後、及び２４０分経過後）の摂食量を、総給餌量の減少分より算出する。この結果、被検ペプチド投与量依存的にラット摂食量の変化が観察されれば、被検ペプチドが摂食調節機能を有すると判定することができる。例えば、被検ペプチド投与量依存的にラット摂食量の亢進が観察されれば、被検ペプチドが摂食亢進機能を有すると判定することができる（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，３４１，２００−３，１９８５、及びＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５９，Ｒ３１７−２３，１９９０）。
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列における１１７番目〜２４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１で表される塩基配列における３６番目〜２４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードし、後者のポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする。
本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた方法、（ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（ｃ）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法［前記製造方法（ａ）］では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。反応条件（例えば、変性温度又は変性剤添加条件など）を適切に調整して、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
また、本発明のペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織から調製したｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト細胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを実施することによっても、本発明のペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
より詳細には、まず、本発明のペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のペプチドをコードするｍＲＮＡを含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオシアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のペプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティング法、あるいは、本発明のペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。
次に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。また、ゲノムＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法［前記製造方法（ｂ）］では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。また、市販のコンピテント細胞を使用することもできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、又は（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法を用いる方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法［前記選択方法（１）］では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（３２Ｐ又は３３Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング法［前記選択方法（２）］では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、３２Ｐ又は３３Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
化学合成法を用いた方法［前記製造方法（ｃ）］では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
［３］本発明の発現ベクター、形質転換体、及びペプチド製造方法
単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（真核生物及び原核生物の各宿主細胞を含む）を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ，，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、及び前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、サイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
本発明の形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞外に本発明のペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の形質転換体を培養することにより、前記形質転換体の細胞外に生産される本発明のペプチドは、前記ペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、本発明のペプチドを含む培養液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のペプチドを精製することができる。
本発明のペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と本発明のペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
本発明のペプチドは、これまで述べたような、本発明の形質転換体を用いる製造方法以外にも、例えば、ペプチド自動合成機による化学合成法によっても製造が可能である。ペプチド自動合成機には、例えば、アプライドバイオシステムズ社４３０Ａ型、ミリポア社９０５０型、又は島津製作所ＰＳＳＭ−８型等があり、いずれも樹脂に固定したアミノ酸誘導体に１アミノ酸ずつカルボキシル末端から結合させる固相合成を行なうことができる。この方法には、αアミノ基についている保護基（Ｂｏｃ基）のトリフルオロ酢酸による切断を用いるｔＢｏｃ法と、ピペリジンでＮα位のＦｍｏｃ基を外すＦｍｏｃ法とが公知であり、いずれも脱保護により樹脂から外した後、高速液体クロマトグラフィー等で精製することができる［大海・辻村・稲垣編，細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」ｐ２５−４６（１９９４）秀潤社］。
本発明のペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、例えば、各種動物に、本発明のペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のタンパク質単離精製法によりポリクローナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、本発明のペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法により選択することができる。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイブリドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のタンパク質単離精製法により分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。
また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。
以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のタンパク質単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得ることができる。
更には、本発明のペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。
本発明のペプチドを用いると、摂食障害、胃酸分泌障害、及び／又はインスリン分泌障害の治療に有効な物質をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングの手順は、特に限定されるものではないが、例えば、本発明のペプチドを用いて、本発明ペプチドの受容体をスクリーニングした後、その受容体を用いて、本発明ペプチドと前記受容体との結合を阻害する化合物（例えば、受容体アゴニスト又はアンタゴニスト）をスクリーニングすることにより、摂食障害治療に有効な物質を得ることができる。以下、本発明のペプチドを用いる、本発明ペプチドの受容体のスクリーニング（以下、受容体スクリーニングと称する）について説明し、続いて、得られた本発明ペプチドの受容体を用いる、本発明ペプチドと前記受容体との結合を阻害する化合物のスクリーニング（以下、リガンドスクリーニングと称する）について説明する。
本発明のペプチドを用いると、本発明ペプチドの受容体発現細胞の同定、あるいは、本発明ペプチドの受容体の単離が可能である。本発明ペプチドの受容体を単離するためのスクリーニングを行なう場合、被検試料としては、例えば、受容体が発現していることが予想される細胞の細胞抽出物、あるいは、前記細胞から調製したＲＮＡを基に作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いることが可能である。ＮＰＹファミリー分子は、それらの受容体としてＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合することが知られている。本発明のペプチドも、同様に、ＧＰＣＲに結合し、細胞内へシグナル伝達を行なっている可能性が高い。本発明ペプチドの受容体を単離することができれば、本発明ペプチドの受容体に関するアゴニスト又はアンタゴニストの候補化合物を単離することも可能である。
受容体スクリーニングは、例えば、以下の手順で実施することが可能である。まず、本発明のペプチドを遺伝子組換え技術により発現させるか、あるいは、化学合成することにより、その精製品を取得する。次いで、その精製ペプチドを標識し、各種細胞株又は初代培養細胞に対して結合アッセイを行ない、これにより受容体を発現している細胞を選定する［本庶・新井・谷口・村松編，「新生化学実験講座７ 増殖分化因子とその受容体」ｐ２０３−２３６（１９９１）東京化学同人］。標識としては、例えば、ＲＩ標識（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉなど）、又は酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ等）を使用することができる。また、本発明のペプチドを標識する代わりに、本発明のペプチドに対する抗体を標識し、本発明ペプチドと受容体との結合を前記標識抗体を用いて検出することも考えられる。
前記受容体スクリーニングにより、本発明ペプチドの受容体又は受容体発現細胞が得られると、前記受容体又は受容体発現細胞と本発明ペプチドとの結合活性を指標に、前記結合を阻害する化合物（例えば、受容体アゴニストやアンタゴニスト）のスクリーニング（リガンドスクリーニング）が可能となる。このリガンドスクリーニング方法にかける被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販されている種々の化合物、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物、ペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、微生物の培養上清、植物又は海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、ペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はペプチドを用いることができる。
本発明ペプチドの活性に影響を与える物質は、本発明ペプチドの活性の変化を測定することにより、本発明ペプチドのアゴニスト活性を有する物質（すなわち、本発明ペプチドの活性と同等の活性を有するか、あるいは、活性を亢進する物質）と、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（すなわち、本発明ペプチドの活性を阻害する物質）とに大別される。このスクリーニング方法は、本発明ペプチドのアゴニスト活性を有する物質、あるいは、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質のいずれも選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質の選択に、より適している。
また、一次スクリーニングとして、本発明ペプチドに結合する物質をスクリーニングし、二次スクリーニングにおいて、本発明ペプチドの受容体の活性の変化を測定し、アゴニスト又はアンタゴニストを区別してスクリーニングすることもできる。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドをコードする遺伝子の単離
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のペプチドをコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト精巣由来の市販のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型ｃＤＮＡとし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により以下の手順で取得した。
１回目のＰＣＲ用のフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。１回目のＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）存在下で、９４℃（１分間）の変性工程の後、９４℃（３０秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（１分間）とからなるサイクルを３５回繰り返すことにより実施した。
続いて、前記ＰＣＲにより得られた反応液を５０倍に希釈し、この希釈液を鋳型として２回目のＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用したこと、そして、サイクル数を３０回としたこと以外は、１回目のＰＣＲと同じ条件で実施した。
２回目のＰＣＲの結果、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析し、配列番号１で表される塩基配列が得られた。
配列番号１で表される塩基配列には、２１３塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列における３６番目〜２４８番目の塩基からなる配列）が存在した。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（７０アミノ酸）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列であった。得られた予想アミノ酸配列について、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，４６８３−９０，１９８６）によりシグナルペプチド配列を予想すると、Ｎ末端から２８番目のアミノ酸（トレオニン）と２９番目のアミノ酸（システイン）との間にシグナルペプチド分断部位が存在することが判明した。このことから、本遺伝子が分泌ペプチドをコードする遺伝子であることが判明した。
実施例２：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドのアミノ酸配列でのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索
実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列について、データベースＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）検索を実施した。既知ペプチドの中には、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一の配列は存在せず、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）前駆体（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ１００８２、アミノ酸残基数＝９７個）に対して、５６％で最も高い相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を示した。このことから、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のペプチドが、ＮＰＹファミリーに属するＰＹＹに相同性の高い新規ペプチドであることが判明した。
実施例３：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドのアミノ酸配列での、既知ＮＰＹファミリーに属するＮＰＹ、ＰＹＹ、及びＰＰに対するアラインメント解析
実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」のアミノ酸配列について、ＮＰＹファミリーに属する既知ペプチド３種、すなわち、ヒトＮＰＹ（ＧｅｎＢａｎＫ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＸＰ００４９４１）、ヒトＰＹＹ（ＧｅｎＢａｎＫ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ１３８９９）、及びヒトＰＰ（ＧｅｎＢａｎＫ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＸＭ００８３５７）の各アミノ酸配列に対する相同性を解析するために、市販のソフトウェア（ＤＮＡＳＩＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｖｅｒ ２．１；日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、アライメント解析を行なった。
結果を図１に示す。図１において、「ＸＰ」は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを表わす。また、「−」は、ギャップ部分（すなわち、相当するアミノ酸が存在しないこと）を表わす。アライメント解析の結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のペプチドは、ＮＰＹファミリーに属する既知ペプチドと高い相同性を有する新規ＮＰＹファミリーに属する新規ペプチドであり、特に、ＰＹＹに対して相同性が最も高いことが判明した。
実施例４：本発明の新規ＮＰＹ様ペプチドのｃＤＮＡでのヒトゲノムドラフト配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索
実施例１で得られたｃＤＮＡ配列について、ヒトゲノムドラフト配列データベースに対するＢＬＡＳＴ検索を実施した。その結果、配列番号１で表される塩基配列全部を、塩基配列の一部として含む公知の塩基配列として、ＧｅｎＢａｎＫ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＬ５９０３６６（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｘ ｃｌｏｎｅ ＲＰ１３−３７７Ｇ１，ＤＢ：２００１／０５／１９ Ｐｈａｓｅ１ Ｌｅｎｇｔｈ＝１９４７９９）及びＧｅｎＢａｎＫ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＪ２３９３２３（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｘ ｃｌｏｎｅ ＰＡＣ ＲＰＣＩ−３ ５１９Ｎ１８ ｍａｐ Ｘｐ１１．２，ＤＢ：２００１／０５／１９ Ｐｈａｓｅ２ Ｌｅｎｇｔｈ＝１０２８５３）が存在した。この結果から、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、Ｘ染色体に遺伝子がコードされるペプチドであり、第７染色体に存在するＮＰＹや、第１７染色体に存在するＰＹＹ及びＰＰとは、ゲノム上で遺伝子的に独立していることが判明した。
実施例５：ヒト組織における本発明遺伝子の発現分布の確認
実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」をコードする遺伝子の組織発現分布を解析するために、ヒト各組織由来ｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを以下の手順で実施した。
１回目のＰＣＲ用のフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。１回目のＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、５％ＤＭＳＯ存在下で、９４℃（１分間）の変性工程の後、９４℃（３０秒間）と６０℃（３０秒間）と７２℃（４５秒間）とからなるサイクルを４０回繰り返すことにより実施した。
続いて、前記ＰＣＲにより得られた各反応液を５０倍に希釈し、この各希釈液を鋳型として２回目のＰＣＲを実施した。２回目のＰＣＲは、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用したこと、そして、サイクル数を３５回としたこと以外は、１回目のＰＣＲと同じ条件で実施した。
その結果、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が、摂食機能を司る視床下部に由来するｃＤＮＡで増幅されることが確認された。この結果は、実施例１で得られた遺伝子でコードされるペプチドの摂食機能を裏付ける結果となった。また、視床下部以外にも、ＰＹＹやＰＰと同じように、脳下垂体及び小腸に由来する各ｃＤＮＡでも増幅されることが確認された。従って、ＰＹＹやＰＰと同じように、胃酸の分泌抑制及びインスリン分泌抑制機能を併せ持つ可能性もある。
実施例６：動物細胞でのＦＬＡＧエピトープ付加ＸＰ発現系の構築
本実施例では、実施例１で得られた「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」をコードする遺伝子（以下、ＸＰ遺伝子と称する）を、マーカー配列ＦＬＡＧエピトープとの融合ペプチド（以下、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドと称する）として動物細胞で発現させるための発現ベクターを構築し、更に、動物細胞において前記ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの発現を確認した。
具体的には、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現されるＸＰ遺伝子（ＸＰ−ＦＬＡＧ）の増幅は、フォワードプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号９で表される塩基配列には、ＦＬＡＧ配列が含まれる。これにより、ＸＰペプチドの発現の検出を簡便化することができる。また、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＫｐｎＩ認識配列又はＮｏｔＩ認識配列が付加してある。
ＰＣＲは、実施例１で得られたＸＰペプチドをコードするｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用い、９４℃（２分間）の変性工程の後、９４℃（３０秒間）と５５℃（３０秒間）と７２℃（３０秒間）とからなるサイクルを２０回繰り返すことにより実施した。その結果、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列は、ジデオキシターミネーター法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析し、ＸＰ−ＦＬＡＧ遺伝子と合致したクローンを選択した。前記クローンを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで消化し、動物細胞発現用ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。
６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）にＨＥＫ２９３細胞（１×１０５細胞／ウェル；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を播種して２４時間培養した後、先に構築したＸＰ−ＦＬＡＧ発現プラスミド（１μｇ／ウェル）を、市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて遺伝子導入した。前記遺伝子導入から７２時間経過後から、ハイグロマイシンＢ含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行ない、得られた薬剤耐性細胞をＸＰ−ＦＬＡＧ発現細胞として用いた。ＸＰ−ＦＬＡＧ発現細胞を１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）でコンフルエントになるまで培養した後、培地を廃棄し、０．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ培地にて４日間培養した後、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチド含有培地を回収した。
ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの発現確認は、ウエスタンブロット解析により行なった。具体的には、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；ドデシル硫酸ナトリウム）レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液（第一化学薬品）を用いてサンプル調製した回収培地を、ＳＤＳ／１５％〜２５％アクリルアミドゲル（第一化学薬品）を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行なった後、ニトロセルロース膜に転写した。得られた転写膜を、市販のブロッキング試薬（ブロックエース；大日本製薬）でブロッキングした後、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ社）と、西洋わさびパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社）とを順次反応させた。反応後、市販の検出試薬（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシア社）を用いて、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの発現を確認した。抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２と反応するペプチドは、空ベクターｐＣＥＰ４を導入した細胞には存在しないが、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドを発現した培地では、約６ｋＤａのバンドとして検出された。ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドの推定分子量は、６１９１．４１Ｄａであり、ほぼ予測される分子量にバンドが存在した。
実施例７：ＸＰペプチドに対する内在性受容体のスクリーニング系の構築
本実施例では、ＸＰペプチドに対する内在性受容体のスクリーニング系を構築した。
具体的には、４８ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ４８ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＡＳＡＨＩ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ社）にＨＥＫ２９３細胞（３×１０４細胞／ウェル）を播種して２４時間培養した後、オーファン受容体発現プラスミド（５０ｎｇ／ウェル）とルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ又はｐＣＲＥ−ｌｕｃ（１０ｎｇ／ウェル；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とを市販のトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６）により遺伝子導入した。次の日に、ＸＰ−ＦＬＡＧペプチドを含む培地に交換し、５時間反応させた後、細胞内ルシフェラーゼ活性をルミノメーター（ＭＬ３０００ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にて測定した。
この系において、前記オーファン受容体発現プラスミドとして、公知の各種オーファン受容体遺伝子を含む各種発現プラスミドを遺伝子導入することで、ＸＰペプチドに対する内在性受容体のスクリーニングが可能となる。
産業上の利用可能性
本発明のペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体は、摂食障害、胃酸分泌障害、及び／又はインスリン分泌障害の治療剤の製造に有用であり、また、摂食障害、胃酸分泌障害、及び／又はインスリン分泌障害の治療剤として有効な物質のスクリーニングにも有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号８及び９の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明ペプチドのアミノ酸配列と、ＮＰＹファミリーに属する公知ペプチド３種のアミノ酸配列とのアライメント解析の結果を示す説明図である。Technical field
The present invention relates to a novel neuropeptide Y-like peptide.
Background art
The neuropeptide Y (hereinafter abbreviated as NPY) family is a group of physiologically active peptides composed of three types of NPY, peptide YY (PYY), and pancreatic polypeptide (PP) (Regul. Pept., 62, 1-11, 1996). Each peptide is a linear peptide composed of 36 amino acids and amidated at the C-terminus.
NPY was isolated and purified from porcine brain in 1982, and subsequent studies have revealed that it is the most abundant neuropeptide in the central and peripheral nervous systems of mammals (Nature, 296, 659-60, 1982). ). NPY expression is found in the central nervous system (especially the hypothalamus, hippocampus, cerebral cortex, and brainstem), adrenal medulla, and parasympathetic nerve.
PYY is a bioactive peptide isolated and purified from porcine small intestine in 1982, the same as NPY (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2514-8, 1982). PYY has 70% homology with NPY in the amino acid primary sequence, and its expression has been confirmed in the lower small intestine, large intestine, and pancreas.
PP was identified in 1975 as the first molecule in the NPY family as a by-product of the chicken insulin purification process (J. Biol. Chem., 250, 9369-76, 1975). Although NPY and PYY have been identified in all vertebrates, PP is thought to have occurred early in the evolution to tetrapods. PP has 50% amino acid sequence homology to NPY, and expression is mainly observed in the pancreas.
The NPY gene is present on human chromosome 7 at p15.1. Both the PYY gene and the PP gene are linked to human chromosome 17 at q21.1 at a distance of only 10 kb. From molecular evolutionary analysis, the PP gene is subjected to gene duplication as a copy of the PYY gene. It is believed that NPY is the most conserved molecule in molecular evolution among known neuropeptides. In the known ortholog, 22 out of 36 amino acids are identical. On the other hand, PYY has less than 15 amino acids conserved across species, while PP is only 7 amino acids identical. From these facts, PYY is considered to be a molecule with a higher evolution rate than NPY, and it has been considered that the gene replication of the PP gene from the PYY gene contributed to the increase in the evolution rate of PYY.
In the NPY family, three proline residues and two tyrosine residues commonly held in the primary amino acid sequence form a (polyproline helix)-(β turn)-(α helix) U-shaped structure and a degree of freedom. A high C-terminal 4 amino acid conformation is formed. This structure is called “PP-fold” and is thought to play an important role in expressing the activity of the NPY family (J. Biol. Chem., 265, 11706-12, 1990).
Functional expression of the NPY family occurs through binding to NPY-specific receptors (Trends Neurosci., 20, 294-8, 1997). It is known that there are five different subtypes of the NPY family receptors so far, and G protein-coupled receptors (GPCRs) Y1, Y2, Y4, Y5, and Y6 have been identified at the gene level. ing. The Y1 receptor has the highest homology of 42% (in terms of amino acid sequence) with the Y4 receptor and 51% homology with the pseudogene Y6 receptor, which has no function in humans. Interestingly, the Y1 receptor has only 35% and 31% homology to the Y5 and Y2 receptors, respectively, with respect to amino acid sequence. These facts indicate that the NPY receptor is the group with the lowest intersubtype homology in the GPCR superfamily. All five NPY receptors activate the intracellular signal transduction system through the activation of pertussis toxin-sensitive G protein, and suppress the accumulation of intracellular cAMP. It has also been reported that the Y1 receptor and the Y2 receptor cause an increase in intracellular Ca concentration upon activation, and that the Y2 receptor further causes activation of the K channel.
As the physiological activity of NPY, involvement in eating, sexual behavior, diurnal exercise, and blood pressure has been suggested. Of these physiological functions, the best studied is related to feeding during central administration, and a series of studies have reported that NPY is the most effective food-stimulating substance (Biochem. Cell). Biol., 78, 371-92, 2000). When NPY is administered intracerebroventricularly in rats, an increase in food intake is observed, which eventually leads to weight gain and obesity. Before daily eating, NPY expression increases in the paraventricular nucleus of the hypothalamus, which is the center of satiety (Am. J. Physiol., 270 (4 Pt 1), E589-95, 1996). Under starvation, the amount of NPY expression in the hypothalamus increases, but its expression is attenuated by eating (Am, J. Physiol., 266 (5 Pt 2), R1687-91, 1994). Interestingly, however, in NPY knockout mice (KO mice), the feeding pattern did not change (Nature, 381, 415-21, 1996), and ob / ob mice were crossed with NPY KO mice. In some cases, strong weight loss is observed, with reduced food intake and increased energy metabolism (Science, 274, 1704-7, 1996).
PYY and PP are also known to cause hyperphagia. It has been reported that PYY significantly increases food intake by intracerebroventricular administration in rats, and the effect is more remarkable than NPY [Am. J. Physiol. , 259 (2 Pt 2), R317-23, 1990, Brain Res. , 341, 200-3, 1985, Brain Res. , 805, 20-8, 1998, and Physiol. Behav. , 58, 731-5, 1995]. PP is known to stimulate food intake by intraventricular administration [Am. J. Physiol. , 269 (5 Pt 2), R983-3, 1995]. PYY and PP are also thought to regulate gastrointestinal tract functions and peripheral physiological functions such as pancreatic exocrine secretion. PYY is known to suppress gastric acid secretion in many animal species, and exhibits antisecretory activity in rat small intestine. Conversely, gastric acid increases PYY mRNA transcripts. In the pancreas, PYY is stored together with glucagon in secretory granules of α cells, and PYY has a glucose-stimulated insulin secretion inhibitory activity (Acta Physiol. Scand., 157, 305-6, 1996). PP has been suggested to be involved in the regulation of gastric acid secretion [Am. J. Physiol. , 269 (5 Pt 2), R983-3, 1995].
Furthermore, studies on anti-obesity drugs are underway for NPY family inhibitors such as 1229U91, BMS-192548, J-104870, BIBP3226, and the like (J. Pharmacol. Exp. Ther., 275, 1261-6. 1995, J. Antibiot. (Tokyo), 48, 1055-9, 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun., 266, 88-91, 1999, and J. Pharmacol. Exp. Ther., 275, 136-42. , 1995).
As described above, the NPY family is known to be useful as a new drug target.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide a novel NPY-like peptide, a polynucleotide encoding the same, and a method for producing them.
As a result of intensive studies, the present inventor has obtained a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the peptide encoded by the polynucleotide has the highest homology to PYY belonging to the NPY family I found that. And, as in PYY, this peptide was elucidated to be expressed in the hypothalamus, which controls the feeding function, the small intestine, which controls gastric acid secretion, and the pituitary gland, which controls the insulin secretion function. The present invention has been clarified to be a novel NPY-like peptide having
That is, the present invention
[1] a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
[2] a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
[3] a polynucleotide encoding the peptide of [1] or [2];
[4] an expression vector comprising the polynucleotide of [3];
[5] a transformant comprising the polynucleotide of [3];
[6] The method for producing a peptide according to [1] or [2], comprising a step of culturing the transformant according to [5] and a step of collecting the peptide;
[7] A peptide that can be produced by a method including a step of culturing a transformed eukaryotic cell containing a polynucleotide encoding a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a step of recovering the peptide
About.
In addition, WO01 / 60850 published after the priority date of the present application merely describes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence encoding it, and is represented by SEQ ID NO: 2. There is no specific method for obtaining a peptide consisting of an amino acid sequence or a polynucleotide encoding the same, and there is no example in which the peptide or polynucleotide was obtained, and the description confirms that the peptide or the like was actually obtained. There is no. Further, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is neither disclosed nor suggested. That is, the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 2, and the polynucleotide encoding them were obtained by the present inventors for the first time.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[1] The polypeptide of the present invention
In the peptide of the present invention,
(1) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3;
(2) a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
Is included.
“Peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3”, which is one of the peptides of the present invention, is a human-derived peptide consisting of 42 amino acid residues. As described in Example 1 below, the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3” is derived from a precursor translated as “the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” by N The terminal signal peptide (that is, the peptide consisting of the 1st to 28th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2) is considered to be a mature form in which the peptide is cleaved off.
The peptide of the present invention has a function similar to that of PYY, specifically, a food intake regulating function (preferably a food intake enhancing function), a gastric acid secretion suppressing function, or an insulin secretion suppressing function.
The method for confirming whether or not a certain peptide exhibits the “feeding regulation function” is not particularly limited, but for example, it can be confirmed by the following method. That is, a test peptide is administered in an appropriate amount (eg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, and 10 mg) into the rat ventricle, and after a predetermined time (eg, 30 minutes, 60 minutes, 90 minutes) after the administration. The amount of food consumed after the passage of minutes, 120 minutes, and 240 minutes) is calculated from the decrease in the total feed amount. As a result, if a change in the amount of food consumed in the rat is observed depending on the dose of the test peptide, it can be determined that the test peptide has a food intake regulating function. For example, if an increase in rat food intake is observed in a test peptide dose-dependent manner, it can be determined that the test peptide has a food intake enhancing function (Brain Res., 341, 200-3, 1985; And Am. J. Physiol., 259, R317-23, 1990).
[2] The polynucleotide of the present invention
The polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the peptide of the present invention.
As the polynucleotide of the present invention, a polynucleotide consisting of a sequence consisting of the 117th to 248th bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a 36th to 248th base in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide consisting of a sequence consisting of the following bases is preferred. The former polynucleotide encodes a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the latter polynucleotide encodes a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
As used herein, the term "polynucleotide" includes both DNA and RNA.
The method for producing the polynucleotide of the present invention is not particularly limited. Examples thereof include (a) a method using the polymerase chain reaction (PCR), and (b) a conventional genetic engineering technique (that is, (A method of selecting a transformant containing a desired cDNA from the transformant transformed with the rally), or (c) a chemical synthesis method. Hereinafter, each manufacturing method will be sequentially described.
In the method using PCR [the above-mentioned production method (a)], the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the following procedure.
That is, mRNA is extracted from human cells or tissues capable of producing the peptide of the present invention. Then, based on the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the peptide of the present invention, a pair of two primer sets capable of sandwiching the full length of the mRNA corresponding to the peptide of the present invention, or a partial mRNA region thereof, Create a pair of primer sets that can be sandwiched. By appropriately adjusting the reaction conditions (eg, denaturation temperature or denaturant addition conditions) and performing reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), the full-length cDNA encoding the peptide of the present invention or one thereof is obtained. You can get a part.
Further, PCR was performed using mRNA prepared from mRNA prepared from human cells or tissues having the ability to produce the peptide of the present invention using reverse transcriptase, or commercially available cDNA derived from human cells or tissues as a template. By doing so, a full-length cDNA encoding the peptide of the present invention or a part thereof can be obtained.
More specifically, first, total RNA including mRNA encoding the peptide of the present invention is extracted from cells or tissues capable of producing the peptide of the present invention by a known method. Examples of the extraction method include a guanidine thiocyanate hot phenol method, a guanidine thiocyanate-guanidine hydrochloride method, and a guanidine thiocyanate cesium chloride method.The guanidine thiocyanate cesium chloride method may be used. preferable. Cells or tissues capable of producing the peptide of the present invention are, for example, a Northern blotting method using a polynucleotide encoding the peptide of the present invention or a part thereof, or using an antibody specific to the peptide of the present invention. It can be specified by Western blotting or the like.
Subsequently, the extracted mRNA is purified. mRNA may be purified according to a conventional method. For example, mRNA can be purified by adsorbing it onto an oligo (dT) cellulose column and then eluting it. If desired, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. In addition, even without extracting mRNA, commercially available extracted and purified mRNA can be used.
Next, the purified mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of, for example, a random primer, an oligo dT primer, and / or a custom-synthesized primer to synthesize a first-strand cDNA. This synthesis can be performed by a conventional method. Using the obtained first-strand cDNA, PCR is carried out using two types of primers sandwiching the full length or a partial region of the target polynucleotide to amplify the target cDNA. The obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the target DNA fragment can be obtained by cutting the DNA with a restriction enzyme or the like and connecting it. Also, a target DNA fragment can be obtained from genomic DNA.
In the method using the conventional genetic engineering technique [the above-mentioned production method (b)], for example, the polynucleotide of the present invention can be produced by the following procedure.
First, a single-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase with the mRNA prepared by the method using PCR as a template, and then a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA. Examples of the method include the S1 nuclease method (Extratidis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976) and the Land method (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981). , O. The Joon Yoo method (Yoo, OJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983) or the Okayama-Berg method (Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982).
Next, after preparing a recombinant plasmid containing the double-stranded cDNA, Escherichia coli (for example, DH5α strain, HB101 strain, or JM109 strain) is introduced and transformed, and for example, a drug for tetracycline, ampicillin, or kanamycin. A recombinant is selected using the resistance as an index. For example, when the host cell is Escherichia coli, the transformation of the host cell is performed by the method of Hanahan (Hanahan, DJ, Mol. Biol., 166, 557-580, 1983), that is, CaCl 22, MgCl2Alternatively, the method can be carried out by adding the recombinant DNA to competent cells prepared in the presence of RbCl. Also, commercially available competent cells can be used. In addition, as a vector, a phage vector such as a lambda system can be used in addition to the plasmid.
As a method for selecting a transformant having the cDNA of interest from the transformants thus obtained, for example, the following (1) screening method using a synthetic oligonucleotide probe or (2) PCR A method using a screening method using a probe thus obtained can be employed.
In the screening method using the synthetic oligonucleotide probe [the selection method (1)], for example, a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure.
That is, an oligonucleotide corresponding to all or a part of the peptide of the present invention is synthesized, and this is probed (32P or33(Labeled with P)), the DNA of the transformant is hybridized with a denaturated and fixed nitrocellulose filter, and the obtained positive strain is searched for and selected. In the case of synthesizing an oligonucleotide for a probe, a nucleotide sequence derived using codon usage can be used, or a plurality of nucleotide sequences obtained by combining possible nucleotide sequences can be used. . In the latter case, the type can be reduced by including inosine.
In the screening method using the probe prepared by PCR [the selection method (2)], for example, a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure.
That is, oligonucleotides of a sense primer and an antisense primer corresponding to a part of the peptide of the present invention are synthesized, and PCR is performed by combining them to amplify a DNA fragment encoding all or a part of the target peptide. As the template DNA used here, cDNA synthesized by reverse transcription reaction from mRNA of cells producing the peptide of the present invention, or genomic DNA can be used. The DNA fragment thus prepared is, for example,32P or33A transformant having the target cDNA is selected by labeling with P and performing colony hybridization or plaque hybridization using this as a probe.
A method for collecting the polynucleotide of the present invention from the obtained target transformant is a known method (for example, Sambrook, J. et al., “Molecular Cloning-A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). Can be implemented according to For example, it can be carried out by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out a cDNA region from the obtained plasmid DNA.
In the method using the chemical synthesis method [the above-mentioned production method (c)], for example, the polynucleotide of the present invention can be produced by binding a DNA fragment produced by the chemical synthesis method. Each DNA can be synthesized using a DNA synthesizer [for example, Oligo 1000M DNA Synthesizer (manufactured by Beckman), or 394 DNA / RNA Synthesizer (manufactured by Applied Biosystems)].
In addition, the polynucleotide of the present invention can be prepared on the basis of the information of the peptide of the present invention by a conventional method such as the phosphite triester method (Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 1984). It can also be produced by chemical synthesis of nucleic acids. The codon for the desired amino acid is known per se and may be arbitrarily selected. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the frequency of codon usage of the host to be used (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Further, partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be performed by a site-specific mutagenesis method (Mark, DF) using a primer comprising a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification according to a conventional method. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984) and the like.
The sequencing of DNA obtained by the various methods described so far can be performed, for example, by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (Maxam, AM and Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) and the dideoxynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).
[3] Expression vector, transformant and peptide production method of the present invention
Host cells (including eukaryotic and prokaryotic host cells) can be transformed by reintegrating the isolated polynucleotides of the present invention into appropriate vector DNA. In addition, by introducing an appropriate promoter and a sequence related to expression into these vectors, the polynucleotide can be expressed in each host cell.
For example, eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast, and vertebrate cells include, for example, monkey COS cells (Gluzman, Y, Cell, 23, 175-182, 1981), a dihydrofolate reductase-deficient strain of Chinese hamster ovary cells (CHO) (Urlaub, G. and Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), human embryonic kidney-derived HEK293 cells, and 293-EBNA cells (Invitrogen) obtained by introducing the EBNA-1 gene of Epstein-Barr virus into the HEK293 cells.
As a vertebrate cell expression vector, those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence, which are usually located upstream of a polynucleotide to be expressed, can be used. , A replication origin. Examples of the expression vector include pSV2dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981) and pEF-BOS having a human elongation factor promoter. (Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), pCEP4 (Invitrogen) having a cytomegalovirus promoter, and the like.
When a COS cell is used as a host cell, an expression vector having an SV40 origin of replication, capable of autonomous growth in COS cells, and further comprising a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site is used. For example, pME18S (Maruyama, K. and Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res. , 18, 5322, 1990) or pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987).
The expression vector is prepared, for example, by a DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL. van der Ed, AJ, Virology, 52, 456-457, 1973), commercially available transfection reagents (eg, FuGENE)TM6 Transfection Reagent; a method using Roche Diagnostics, or an electric pulse perforation method (Neumann, E., et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982) or the like can be taken into COS cells. .
When CHO cells are used as host cells, a vector capable of expressing a neo gene functioning as a G418 resistance marker together with an expression vector containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention, for example, pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) or pSV2-neo (Southern, P.J. and Berg, P., J. Mol. Appl. 327-341, 1982) and selecting a G418-resistant colony, a transformed cell stably producing the peptide of the present invention can be obtained.
When 293-EBNA cells are used as host cells, pCEP4 (Invitrogen) having an Epstein-Barr virus origin of replication and capable of self-propagation in 293-EBNA cells may be used as an expression vector. it can.
The transformant of the present invention can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the peptide of the present invention extracellularly. As a medium that can be used for the culture, various types of commonly used media can be appropriately selected depending on the host cell used. For example, in the case of COS cells, for example, a medium in which a serum component such as fetal bovine serum (FBS) is added to a medium such as RPMI-1640 medium or Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) as necessary is used. can do. In the case of 293-EBNA cells, a medium obtained by adding G418 to a medium such as Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM) to which serum components such as fetal bovine serum (FBS) are added can be used.
By culturing the transformant of the present invention, the peptide of the present invention produced outside the cells of the transformant can be obtained by various known separation procedures utilizing the physical properties, biochemical properties, and the like of the peptide. It can be separated and purified by the method. Specifically, a culture solution containing the peptide of the present invention is treated with, for example, a usual protein precipitant, ultrafiltration, various liquid chromatography [eg, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion chromatography, and the like. Exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), etc.], or dialysis, or a combination thereof, and the like, to purify the peptide of the present invention.
The expression of the peptide of the present invention can be easily confirmed or purified by fusing the peptide of the present invention with the marker sequence in frame. Examples of the marker sequence include a FLAG epitope, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, and a myc epitope. Further, by inserting a specific amino acid sequence recognized by a protease (for example, enterokinase, factor Xa, or thrombin) between the marker sequence and the peptide of the present invention, the marker sequence portion is changed by these proteases. It can be cut and removed.
The peptide of the present invention can be produced by, for example, a chemical synthesis method using an automatic peptide synthesizer in addition to the production method using the transformant of the present invention as described above. Examples of the automatic peptide synthesizer include Applied Biosystems, Inc. Model 430A, Millipore, Model 9050, and Shimadzu PSSM-8, all of which are attached to an amino acid derivative immobilized on a resin from the carboxyl terminus by one amino acid. Phase synthesis can be performed. As this method, a tBoc method using cleavage of a protecting group (Boc group) on an α-amino group with trifluoroacetic acid, and an Fmoc method for removing an Nα-position Fmoc group with piperidine are known. After removal from the resin, it can be purified by high performance liquid chromatography and the like [Okai, Tsujimura, Inagaki, edited by Cell Engineering, “Anti-Peptide Antibody Experiment Protocol”, pp. 25-46 (1994) Shujunsha].
An antibody that reacts with the peptide of the present invention (for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) can be obtained, for example, by directly administering the peptide of the present invention or a fragment thereof to various animals. Further, using a plasmid into which a polynucleotide encoding the peptide of the present invention has been introduced, a DNA vaccine method (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; or Donnelly, JJ et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996).
Polyclonal antibodies include, for example, animals immunized with an emulsion obtained by emulsifying the peptide of the present invention or a fragment thereof in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) intraperitoneally, subcutaneously, or veinly ( For example, it can be produced from serum or eggs of rabbits, rats, goats or chickens. A polyclonal antibody can be separated and purified from the serum or eggs thus produced by a conventional protein isolation and purification method. Examples of such separation and purification methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatography using DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein A agarose, or the like.
Monoclonal antibodies can be easily produced by those skilled in the art by, for example, the cell fusion method of Koehler and Milstein (Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975).
That is, the peptide of the present invention or a fragment thereof is emulsified in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) repeatedly intraperitoneally, subcutaneously, or intravenously several times in a mouse every several weeks. Immunize. After the final immunization, the spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
As a myeloma cell for obtaining a hybridoma, a myeloma cell having a marker such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency or thymidine kinase deficiency (for example, mouse myeloma cell line P3X63Ag8.U1) can be used. . Further, as the fusogenic agent, for example, polyethylene glycol can be used. Further, as a medium for producing a hybridoma, for example, 10 to 30% of fetal bovine serum is appropriately added to a commonly used medium such as Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's modified minimum essential medium, or RPMI-1640. In addition, it can be used. Fusion strains can be selected by the HAT selection method. Hybridoma screening is performed by using well-known methods such as ELISA method or immunohistochemical staining method using the culture supernatant, and a hybridoma clone secreting the desired antibody can be selected. Further, by repeating subcloning by the limiting dilution method, it is possible to guarantee the monoclonality of the hybridoma. The hybridoma thus obtained produces a purifiable amount of antibody by culturing it in the medium for 2 to 4 days or in the abdominal cavity of BALB / c mouse pretreated with pristane for 10 to 20 days. can do.
The monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional protein isolation and purification method. Examples of such separation and purification methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatography using DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein A agarose, or the like.
In addition, an antibody fragment containing a monoclonal antibody or a part thereof can be obtained by incorporating all or a part of the polynucleotide encoding the monoclonal antibody into an expression vector and introducing it into an appropriate host cell (eg, Escherichia coli, yeast, or animal cell). Can also be produced.
Antibodies (including polyclonal antibodies and monoclonal antibodies) separated and purified as described above are digested by a peptide degrading enzyme (for example, pepsin or papain) by a conventional method, followed by a conventional protein isolation and purification method. An antibody fragment containing a part of an active antibody, for example, F (ab ')2, Fab, Fab ', or Fv.
Furthermore, an antibody that reacts with the peptide of the present invention can be obtained by the method of Clackson et al. Or the method of Zebede et al. (Clackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; or Zebedee, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992) can be obtained as a single chain Fv or Fab. It is also possible to obtain a human antibody by immunizing a transgenic mouse (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1994) in which the mouse antibody gene is replaced with a human antibody gene.
When the peptide of the present invention is used, it is possible to screen for a substance that is effective for treating eating disorders, gastric acid secretion disorders, and / or insulin secretion disorders. The screening procedure is not particularly limited. For example, after screening the receptor of the peptide of the present invention using the peptide of the present invention, the peptide of the present invention and the receptor are screened using the receptor. By screening for a compound that inhibits the binding to (for example, a receptor agonist or antagonist), a substance effective for treating an eating disorder can be obtained. Hereinafter, screening of a receptor for the peptide of the present invention using the peptide of the present invention (hereinafter referred to as receptor screening) will be described. Subsequently, the peptide of the present invention using the obtained receptor for the peptide of the present invention will be described. Screening for a compound that inhibits binding to a receptor (hereinafter, referred to as ligand screening) will be described.
Use of the peptide of the present invention enables identification of cells expressing the receptor of the peptide of the present invention or isolation of the receptor of the peptide of the present invention. When performing screening for isolating the receptor of the peptide of the present invention, the test sample may be, for example, a cell extract of a cell in which the receptor is expected to be expressed, or prepared from the cell. It is possible to use a cDNA expression library prepared based on RNA. NPY family molecules are known to bind as their receptors to G protein-coupled receptors (GPCRs). Similarly, it is highly likely that the peptide of the present invention also binds to GPCR and performs signal transduction into cells. If the receptor for the peptide of the present invention can be isolated, it is also possible to isolate candidate compounds for agonists or antagonists relating to the receptor for the peptide of the present invention.
Receptor screening can be performed, for example, by the following procedure. First, a purified product is obtained by expressing the peptide of the present invention by genetic recombination technology or by chemically synthesizing it. Next, the purified peptide is labeled, and a binding assay is performed on various cell lines or primary culture cells, whereby cells expressing the receptor are selected [Honjo, Arai, Taniguchi, Muramatsu eds. Chemistry Experiment Lecture 7 Growth Differentiation Factor and Its Receptor ", p. As the label, for example, an RI label (for example,3H or125I) or an enzyme label (eg, alkaline phosphatase, etc.). Instead of labeling the peptide of the present invention, it is also conceivable to label an antibody against the peptide of the present invention and detect the binding between the peptide of the present invention and the receptor using the labeled antibody.
When a receptor of the peptide of the present invention or a cell that expresses the receptor is obtained by the receptor screening, a compound that inhibits the binding using the binding activity between the receptor or the receptor-expressing cell and the peptide of the present invention as an index (for example, , Receptor agonists and antagonists) (ligand screening). The test substance to be subjected to this ligand screening method is not particularly limited. For example, various commercially available compounds, various known compounds registered in a chemical file, peptides, combinatorial chemistry techniques ( A group of compounds obtained by Terrett, NK, et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995), phage display method (Felici, F., et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991). ), Random supernatants, culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants or marine organisms, animal tissue extracts, or compounds or peptides obtained by chemically or biologically modifying peptides Can be used.
The substance that affects the activity of the peptide of the present invention is a substance having an agonistic activity of the peptide of the present invention (that is, a substance having an activity equivalent to the activity of the peptide of the present invention, Alternatively, the substance is broadly classified into a substance that enhances the activity) and a substance that has the antagonist activity of the peptide of the present invention (that is, a substance that inhibits the activity of the peptide of the present invention). In this screening method, either a substance having an agonistic activity of the peptide of the present invention or a substance having an antagonistic activity of the peptide of the present invention can be selected. The screening method of the present invention is more suitable for selecting a substance having an antagonist activity of the peptide of the present invention.
In addition, as a primary screening, a substance that binds to the peptide of the present invention can be screened, and in a secondary screening, a change in the activity of the receptor of the peptide of the present invention can be measured, and screening can be performed by distinguishing an agonist or antagonist.
Example
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
Example 1: Isolation of a gene encoding a novel NPY-like peptide of the present invention
The full-length cDNA encoding the peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was prepared by using a commercially available cDNA derived from human testis (Marathon Ready cDNA; Clontech) as a template cDNA and performing the following polymerase chain reaction (PCR). Obtained in the procedure of.
As the forward primer and the reverse primer for the first PCR, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 were used, respectively. The first PCR was performed using a DNA polymerase (Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo) in the presence of 5% dimethyl sulfoxide (DMSO), followed by a denaturation step at 94 ° C (1 minute), followed by 94 ° C (30 seconds) and 60 ° C. The cycle consisting of 30 ° C. (30 seconds) and 72 ° C. (1 minute) was repeated 35 times.
Subsequently, the reaction solution obtained by the PCR was diluted 50-fold, and a second PCR was performed using the diluted solution as a template. In the second PCR, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 were used as the forward primer and the reverse primer, respectively. The PCR was performed under the same conditions as the first PCR, except that the number was set to 30 times.
As a result of the second PCR, a DNA fragment of about 0.2 kbp was amplified. This fragment was cloned using the pCR2.1 plasmid (Invitrogen). The nucleotide sequence of the obtained clone was analyzed using a DNA sequencer (ABI 3700 DNA Sequencer; Applied Biosystems) by the dideoxy terminator method, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained.
The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 had an open reading frame of 213 bases (a sequence consisting of the 36th to 248th bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1). The amino acid sequence (70 amino acids) predicted from this open reading frame was the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. When the signal peptide sequence of the obtained predicted amino acid sequence is predicted by the method of von Heijne G (Nucleic Acids Res., 14, 4683-90, 1986), the 28th amino acid (threonine) and the 29th amino acid from the N-terminus are obtained. (Cysteine) and a signal peptide cleavage site. From this, it was found that this gene was a gene encoding a secretory peptide.
Example 2: BLAST search for SWISS-PROT on the amino acid sequence of the novel NPY-like peptide of the present invention
With respect to the amino acid sequence of the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” obtained in Example 1, a BLAST (Basic local alignment search tool) search for the database SWISS-PROT was performed. No sequence identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 exists in the known peptides, and the peptide YY (PYY) precursor (SWISS-PROT Acc. No. P10082, the number of amino acid residues = 97) Showed the highest homology (identities) at 56%. This proved that the peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was a novel peptide having high homology to PYY belonging to the NPY family.
Example 3: Alignment analysis of NPY, PYY and PP belonging to the known NPY family with the amino acid sequence of the novel NPY-like peptide of the present invention
Regarding the amino acid sequence of the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” obtained in Example 1, three kinds of known peptides belonging to the NPY family, namely, human NPY (GenBank Acc. No. XP004941) and human PYY (GenBank Acc. No. D13899) and human PP (GenBank Acc. No. XM008357) to analyze the homology to each amino acid sequence, using commercially available software (DNASIS for Windows Ver 2.1; Hitachi Software Engineering). Was used to perform an alignment analysis.
The results are shown in FIG. In FIG. 1, “XP” represents a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. "-" Indicates a gap portion (that is, no corresponding amino acid is present). As a result of the alignment analysis, the peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a novel peptide belonging to a novel NPY family having high homology to a known peptide belonging to the NPY family, and The homology was found to be the highest.
Example 4: BLAST search against human genome draft sequence database with cDNA of novel NPY-like peptide of the present invention
A BLAST search was performed on the human genome draft sequence database for the cDNA sequence obtained in Example 1. As a result, as a known base sequence containing the entire base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a part of the base sequence, GenBank Acc. No. AL590366 (chromosome X clone RP13-377G1, DB: 2001/05/19 Phase 1 Length = 194799) and GenBank Acc. No. AJ239323 (chromosome X clone PAC RPCI-3 519N18 map Xp 11.2, DB: 2001/05/19 Phase 2 Length = 102853) was present. From these results, the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” is a peptide whose gene is encoded on the X chromosome, NPY present on chromosome 7, and PYY and PP present on chromosome 17 Was found to be genetically independent on the genome.
Example 5: Confirmation of expression distribution of the gene of the present invention in human tissues
In order to analyze the tissue expression distribution of the gene encoding the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” obtained in Example 1, using each human-derived cDNA as a template, PCR was performed by the following procedure. Carried out.
As the forward primer and the reverse primer for the first PCR, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 were used, respectively. The first PCR was performed using a DNA polymerase (Ex Taq DNA polymerase; Takara Shuzo) in the presence of 5% DMSO, followed by a denaturation step at 94 ° C (1 minute), followed by 94 ° C (30 seconds) and 60 ° C (30 seconds). For 45 seconds) and 72 ° C. (45 seconds).
Subsequently, each reaction solution obtained by the PCR was diluted 50-fold, and a second PCR was performed using each of the diluted solutions as a template. In the second PCR, an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 were used as the forward primer and the reverse primer, respectively. The PCR was performed under the same conditions as in the first PCR, except that the number was 35.
As a result, it was confirmed that a DNA fragment of about 0.2 kbp was amplified by cDNA derived from the hypothalamus which controls the feeding function. This result supported the feeding function of the peptide encoded by the gene obtained in Example 1. In addition to the hypothalamus, it was confirmed that each cDNA derived from the pituitary gland and the small intestine was amplified similarly to PYY and PP. Therefore, like PYY and PP, they may have both functions of suppressing gastric acid secretion and inhibiting insulin secretion.
Example 6: Construction of FLAG epitope-added XP expression system in animal cells
In this example, a gene encoding the “peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” (hereinafter referred to as XP gene) obtained in Example 1 was used as a fusion peptide (hereinafter referred to as a marker peptide FLAG epitope). , Referred to as XP-FLAG peptide) in animal cells, and the expression of the XP-FLAG peptide in animal cells was confirmed.
Specifically, the amplification of the XP gene (XP-FLAG) expressed by in-frame fusion of the marker sequence FLAG epitope on the C-terminal side is performed using an oligo consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 as a forward primer. A nucleotide was used, and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 9 was used as a reverse primer. The base sequence represented by SEQ ID NO: 9 includes the FLAG sequence. Thereby, detection of the expression of the XP peptide can be simplified. In addition, a KpnI recognition sequence or a NotI recognition sequence is added to the 5 'end of each of the above primers.
In the PCR, using a cDNA encoding the XP peptide obtained in Example 1 as a template, a DNA polymerase (Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo) was used, and after a denaturation step at 94 ° C. (2 minutes), 94 ° C. (30 seconds) And a cycle of 55 ° C. (30 seconds) and 72 ° C. (30 seconds) was repeated 20 times. As a result, a DNA fragment of about 250 bp was amplified. This fragment was cloned using the pCR2.1 plasmid (Invitrogen). The nucleotide sequence of the obtained clone was analyzed by a DNA sequencer (ABI 3700 DNA Sequencer; Applied Biosystems) by the dideoxy terminator method, and a clone matching the XP-FLAG gene was selected. The clone was digested with restriction enzymes KpnI and NotI, and inserted into a pCEP4 plasmid for animal cell expression (Invitrogen).
HEK293 cells (1 × 10 6) were placed in a 6-well plate (Collagen-Type I-Coated 6 well plate; ASAHI TECHNO GLASS).5Cells / well; Invitrogen) were seeded and cultured for 24 hours, and the previously constructed XP-FLAG expression plasmid (1 μg / well) was transfected with a commercially available transfection reagent (FuGENE6; Boeringer Mannheim). did. After a lapse of 72 hours from the gene transfer, the transfected cells were selected using a hygromycin B-containing medium, and the obtained drug-resistant cells were used as XP-FLAG-expressing cells. The XP-FLAG-expressing cells were cultured in a 10-cm Petri dish (Collagen-Type I-Coated; ASAHI TECHNO GLASS) until confluence, and the medium was discarded. After culturing for one day, the XP-FLAG peptide-containing medium was recovered.
The expression of the XP-FLAG peptide was confirmed by Western blot analysis. Specifically, a recovery medium prepared as a sample using SDS (sodium dodecyl sulfate; sodium dodecyl sulfate) Laemmli buffer (Daiichi Pure Chemicals) was subjected to SDS / 15% to 25% acrylamide gel (Daiichi Pure Chemicals). After performing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using a (drug), the resultant was transferred to a nitrocellulose membrane. After blocking the obtained transfer membrane with a commercially available blocking reagent (Block Ace; Dainippon Pharmaceutical), mouse anti-FLAG monoclonal antibody M2 (Sigma) and horseradish peroxidase-labeled rabbit anti-mouse IgG polyclonal antibody (Zymed) ) Were sequentially reacted. After the reaction, the expression of XP-FLAG peptide was confirmed using a commercially available detection reagent (ECL western blotting detection system; Amersham Pharmacia). The peptide which reacts with the anti-FLAG monoclonal antibody M2 was not present in the cells into which the empty vector pCEP4 was introduced, but was detected as a band of about 6 kDa in the medium in which the XP-FLAG peptide was expressed. The estimated molecular weight of the XP-FLAG peptide was 6191.41 Da, with a band at the expected molecular weight.
Example 7: Construction of screening system for endogenous receptor for XP peptide
In this example, a screening system for an endogenous receptor for the XP peptide was constructed.
Specifically, HEK293 cells (3 × 10 5) were placed in a 48-well plate (Collagen-Type I-Coated 48 well plate; ASAHI TECHNO GLASS).4Cells / well) and cultured for 24 hours. Then, an orphan receptor expression plasmid (50 ng / well) and a luciferase reporter plasmid pSRE-luc or pCRE-luc (10 ng / well; manufactured by Stratagene) are commercially available. The gene was transfected with a transfection reagent (FuGENE6). On the next day, the medium was replaced with a medium containing the XP-FLAG peptide, and after reacting for 5 hours, intracellular luciferase activity was measured with a luminometer (ML3000 luminometer; Dynatech laboratories).
In this system, the endogenous receptor for the XP peptide can be screened by introducing a gene for various expression plasmids containing various known orphan receptor genes as the orphan receptor expression plasmid.
Industrial applicability
The peptide of the present invention, a polynucleotide encoding the same, an expression vector containing the polynucleotide, and a transformant containing the polynucleotide are used to produce a therapeutic agent for eating disorders, gastric acid secretion disorders, and / or insulin secretion disorders. It is also useful for screening for a substance that is effective as a therapeutic agent for eating disorders, gastric acid secretion disorders, and / or insulin secretion disorders.
Sequence listing free text
The description of “Artificial Sequence” is described in the numerical heading <223> in the following sequence listing. Specifically, each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 8 and 9 in the sequence listing is a primer sequence artificially synthesized.
As described above, the present invention has been described in connection with the specific embodiments. However, modifications and improvements obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram showing the results of alignment analysis between the amino acid sequence of the peptide of the present invention and the amino acid sequences of three types of known peptides belonging to the NPY family.
