JPWO2002076377A1 - Mononucleosome and method for producing same, method for measuring antibody specific to nucleosome, method for diagnosing autoimmune disease, method for producing nucleosome DNA, DNA plate, method for producing DNA plate, and method for measuring anti-DNA antibody - Google Patents

Abstract

An object of the present invention is to provide a method for producing mononucleosomes, which can produce mononucleosomes easily and efficiently and with high purity. A nucleosome contained in the sample, a capture collection step of capturing and collecting the nucleosome by an antibody specific to the nucleosome, a dissociation recovery step of dissociating and recovering the captured nucleosome from the antibody, and a mononucleosome from the recovered nucleosome based on the molecular weight. And a step of isolating and purifying the mononucleosome.

Description

これらの手法の中でも、正確な測定法として定評のあるのがＦａｒｒ法であるが、Ｆａｒｒ法においてはＤＮＡ抗原を放射性物質で標識することが必要とされ、高度の医療施設でないと測定できない欠点がある。これに対して、現在特に実験室レベルで頻用されているのがＥＬＩＳＡ法である。Ｆａｒｒ法が液状で抗原抗体反応を行うのに対し、ＥＬＩＳＡ法は抗原をプラスチックプレートなどに付着させて行うものである。ＤＮＡ抗原を固相に効率よく付着させるために、一般的には塩基性タンパク質、例えばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）で予めプラスチックプレートを被覆してからＤＮＡを付着させる手法が用いられている。
しかし、この方法で抗体を測定した場合には、測定された抗体の中に、ＰＬＬとＤＮＡのイオン結合によって形成されるヌクレオソーム様構造や人工的な未知の抗原に対する抗体が含まれる可能性を否定できないという欠点がある。
正確な抗ＤＮＡ抗体の測定にＰＬＬのようなスペーサーを用いずに直接プレートに付着させる方法の開発がなされたが、まだ実用には至っていない。
前述したように、ＳＬＥの病態形成に重要と考えられている抗ＤＮＡを主とする抗クロマチン抗体産生に関連して、アポトーシスに由来するヌクレオソームが抗ＤＮＡ抗体産生のための自己抗原として作用しているという説が注目されるようになった（Ａｍｏｕｒａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ，：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４２：８３３−８４３，１９９９）。
このように、ヒトのヌクレオソームが自己抗原であると指摘されていながら、現在抗ＤＮＡ抗体の測定には、ヒトのヌクレオソームＤＮＡではなく、仔牛胸腺由来ＤＮＡや組換えＤＮＡが抗原として使用されており、必ずしも正確な診断ができない問題点があった。これは、ヒトヌクレオソームＤＮＡを抗原として調製することが容易でないことに起因している。
本発明は、従来における、前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームを、形態安定性を維持し、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるモノヌクレオソームの製造方法、前記モノヌクレオソオームの製造方法により製造されたモノヌクレオソーム、取扱性に優れたモノヌクレオソーム製造用キット、モノヌクレオソーム分析、自己免疫病診断等に好適なヒストン検査方法、前記モノヌクレオソームを含む、ヌクレオソームに特異的で各種診断等に好適な抗体の測定方法、簡便かつ確実な自己免疫病診断方法、高性能で取扱性に優れた自己免疫病診断用キット、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームＤＮＡを、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるヌクレオソームＤＮＡ製造方法、高性能で取扱性に優れたＤＮＡプレート、前記ＤＮＡプレートの効率的な製造方法、及び、自己免疫病診断等に好適な抗ＤＮＡ抗体測定法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。即ち、ヌクレオソームを、前記ヌクレオソームに特異的な抗体を介してプロテインＡカラム等に吸着させた後、高濃度の塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液等を用いて溶出させ、ヌクレオソーム集合体をマイクロコッカル・ヌクレアーゼ等で処理してモノヌクレオソームにした後、ＨＰＬＣ等によってモノヌクレオソームのみを回収することによって、モノヌクレオソームを簡易にかつ効率よく、しかも高純度で製造することができるという知見である。
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は以下の通りである。即ち、
＜１＞ 試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソームの製造方法である。
＜２＞ 抗体が、抗ヌクレオソーム抗体、抗ＤＮＡ抗体、及び抗ヒストン抗体から選択される少なくとも一種である前記＜１＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜３＞ 抗体が、１４０ｍＭの塩濃度において抗原との結合能を有する前記＜１＞又は＜２＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜４＞ 抗体が、２Ｃ１０の可変域のアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列において１以上２０以内のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、２Ｃ１０の抗原特異性を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜５＞ 抗体が、２Ｃ１０である前記＜４＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜６＞ 捕獲収集工程において、抗体を該抗体と親和性を有する固相に結合させることにより、該抗体にヌクレオソームを捕獲させる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜７＞ 固相が、プロテインＡカラムである前記＜６＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜８＞ 捕獲収集工程において、抗体を予め固相に結合させておき、試料を該固相と接触させることにより、該抗体にヌクレオソームを捕獲させる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜９＞ 単離精製工程において、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を回収してモノヌクレオソームを単離・精製する前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１０＞ 捕獲収集工程前にヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理する前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１１＞ 解離回収工程後、単離精製工程前にヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理する前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１２＞ ヌクレアーゼが、マイクロコッカル・ヌクレアーゼである前記＜１０＞又は＜１１＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１３＞ 細胞を低塩濃度の溶液中で破砕させ、溶液中にヌクレオソームを放出させる放出工程と、
前記ヌクレオソームを収集する収集工程と、
収集した前記ヌクレオソームを低塩濃度の溶液に懸濁し、モノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理するヌクレアーゼ処理工程と、
前記ヌクレアーゼ処理後の溶液からモノヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体を用いて、及び／又は分子量に基づいて製造する単離精製工程と、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１４＞ 単離精製工程で用いる抗体が、２Ｃ１０である前記＜１３＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１５＞ 単離精製工程において、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を分離する前記＜１３＞又は＜１４＞に記載のモノヌクレオソームの製造方法である。
＜１６＞ 前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたことを特徴とするモノヌクレオソームである。
＜１７＞ 純度が９８％以上である前記＜１６＞に記載のモノヌクレオソームである。
＜１８＞ 試料中に含まれるヌクレオソームを捕獲収集するための該ヌクレオソームに特異的な抗体と、
捕獲収集したヌクレオソームから分子量に基づきモノヌクレオソームを単離するためのカラムと、
を含むことを特徴とするモノヌクレオソーム製造用キットである。
＜１９＞ 前記抗体が、２Ｃ１０である前記＜１８＞に記載のモノヌクレオソーム製造用キットである。
＜２０＞ 前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により被検試料から得たモノヌクレオソームより被検ヒストンを回収し、該被検ヒストンの電気泳動パターンと対照ヒストンの電気泳動パターンとを比較することを含むことを特徴とするヒストン検査方法である。
＜２１＞ 前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２２＞ モノヌクレオソームが、アポトーシス由来のヌクレオソームである前記＜２１＞に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２３＞ 被検試料が、自己免疫病患者の血清又は血漿である前記＜２１＞又は＜２２＞に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２４＞ 固相化工程において、固相化したモノヌクレオソームを少なくともスキムミルクを含むブロッキング液でブロッキングさせ、反応工程において、試料を少なくともスキムミルクを含む反応液で稀釈してから該試料を、前記固相化されたモノヌクレオソームと反応させる前記＜２１＞から＜２３＞のいずれかに記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２５＞ 反応液が、トリス、ＮａＣｌ、ＮａＮ_３、血清アルブミン、スキムミルク、及びＥＤＴＡを含有する前記＜２４＞に記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２６＞ 測定工程において、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として反応させる前記＜２１＞から＜２５＞のいずれかに記載のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法である。
＜２７＞ 前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
その抗体価を評価する評価工程と、
を含むことを特徴とする自己免疫病診断方法である。
＜２８＞ 前記＜１＞から＜１２＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法により製造したモノヌクレオソームを固相化してなる固相と、緩衝液と、プレート及びカラムのいずれかと、を含むことを特徴とする自己免疫病診断用キットである。
＜２９＞ 試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、
単離・精製されたモノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離・精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
を含むことを特徴とするヌクレオソームＤＮＡ製造方法である。
＜３０＞ 前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法からなるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程とを含むことを特徴とするヌクレオソームＤＮＡ製造方法である。
＜３１＞ プレート上に、前記＜２９＞又は＜３０＞に記載のヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであって、ヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなることを特徴とするＤＮＡプレートである。
＜３２＞ プレート上に、前記＜１６＞又は＜１７＞に記載のモノヌクレオソームであって、ヒト由来のモノヌクレオソームから単離精製されたヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなることを特徴とするＤＮＡプレートである。
＜３３＞ ヌクレオソームＤＮＡが、ヌクレオソーム構成２本鎖ＤＮＡであり、ヌクレオソームＤＮＡの平均鎖長が、１４５ｂｐ以上２００ｂｐ以下である前記＜３１＞又は＜３２＞に記載のＤＮＡプレートである。
＜３４＞ ヌクレオソームＤＮＡが、プレート上に直接固相化されてなる前記＜３１＞から＜３３＞のいずれかに記載のＤＮＡプレートである。
＜３５＞ プレートが、ポリスチレンを含んでなる前記＜３１＞から＜３４＞のいずれかに記載のＤＮＡプレートである。
＜３６＞ 前記＜１＞から＜１５＞のいずれかに記載のモノヌクレオソームの製造方法であって、試料がヒト由来の試料であるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡをプレート上に固相化する固相化工程と、
を含むことを特徴とするＤＮＡプレート製造方法である。
＜３７＞ 固相化工程において、プレート上に、ヌクレオソームＤＮＡを０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加する前記＜３６＞に記載のＤＮＡプレート製造方法である。
＜３８＞ プレート上に、前記＜２９＞又は＜３０＞に記載のヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであってヒト由来のヌクレオソームＤＮＡを、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加することにより固相化することを特徴とするＤＮＡプレート製造方法である。
＜３９＞ 前記＜３１＞から＜３５＞のいずれかに記載のＤＮＡプレートを用いてなり、
被検試料を、該ＤＮＡプレートの固相化されたヌクレオソームＤＮＡと反応させる反応工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むことを特徴とする抗ＤＮＡ抗体測定法である。
発明を実施するための最良の形態
（モノヌクレオソームの製造方法）
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する捕獲収集工程と、
捕獲したヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる解離回収工程と、
回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離・精製する単離精製工程と、を含む。
本発明において、「ヌクレオソーム」とは、ヌクレオソームを単位とする単量体（モノヌクレオソーム）のみならず、二量体、三量体等の多量体、これらの混合物、更には、総てのヌクレオソームを含有する試料（即ち、ヌクレオソーム供給源）をも意味する。
前記ヌクレオソーム含有試料としては、例えば、ヒトや動物の臓器又は組織から直接分離した細胞から細胞核を分離したもの、一般の培養細胞から細胞核を分離したもの、ヌクレオソームを分泌する培養細胞（ＫＭＬ_１−７細胞（Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ Ｂ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｕｐｕｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ，３２：４３−４８，１９９２）あるいはＨＬ−６０細胞（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２７０：３４７−３４９，１９９７））の培養上清、等が挙げられる。
本発明において、「モノヌクレオソーム」とは、約１４６塩基対の二本鎖ＤＮＡとコアヒストン（Ｈ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ及びＨ４）とからなる、ヌクレオソームの単量体をいう。
前記捕獲収集工程は、試料中に含まれるヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体によって捕獲収集する工程である。
本発明において、「ヌクレオソームに特異的な抗体（以下、単に「抗体」ということがある）」とは、ＤＮＡとヒストンとの複合体であるヌクレオソームに特異的な反応を示す抗体を意味し、ヌクレオソームと共に免疫複合体を形成できるものであればよく、ヌクレオソーム自体、ヌクレオソームを構成している二本鎖ＤＮＡ、及びヌクレオソームを構成しているヒストンのいずれに親和性を有するものであってもよいし、ヌクレオソームと特異的な反応を示すと共に二本鎖ＤＮＡの単体やヒストン単体とも反応を示すものであってもよい。前記ヌクレオソームに特異的な抗体の中には、二本鎖ＤＮＡに特異的であると信じられていたが、むしろヌクレオソームにより高い親和性を有することが判明した公知の抗体も含まれる。前記ヌクレオソームに特異的な抗体としては、二本鎖ＤＮＡよりも、ヌクレオソームにより強く反応するものが好ましく、また、その抗体のＦｃを介してプロテインＡカラム等のアフィニティーカラムに吸着できるものが好ましい。
なお、前記アフィニティーカラムとしては、プロテインＡ以外に、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＰＢ）Ｈｉｔｒａｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎなどが挙げられ、具体的には、Ｈｉｔｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄの１ｍｌ又は５ｍｌのカラムが好適に挙げられる。前記ヌクレオソームに特異的な抗体の前記アフィニティーカラムへの吸着（カップリング）の方法としては、特に制限はないが、該抗体として後述の２Ｃ１０を使用する場合には、例えば、カップリングバッファー（０．２ＭＮａＨＣＯ_３／０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．３）で０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌになるように２Ｃ１０を調整して行うことができ、吸着カップリング後の操作はアフィニティーカラム毎に指定されたプロトコールに準じて行うことができる。
前記ヌクレオソームに特異的な抗体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高塩濃度においても抗原との結合能を有するものが、高塩濃度溶液での洗浄によりカラムに非特異的に結合したタンパク質を除去することができる点で好ましく、自己免疫疾患モデルとして知られているＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来Ｂ細胞ハイブリドーマの産生する自己抗体であるモノクローナル抗体２Ｃ１０（ＩｇＧ２ｂに属する）が、高塩濃度においても抗原との結合能を有する点で、特に好ましい。
前記モノクローナル抗体２Ｃ１０は、二本鎖ＤＮＡに特異的であり（Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：５３−５８，１９８６を参照されたい）、本発明者らのグループによって作製されたものであり、その製造方法については、前記Ｉｍｍｕｎｏｌ ｌｅｔｔ．を参照することができ、詳細な性質等については、Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ，ら、２つの抗二本鎖ＤＮＡ抗体の結合部位によるＤＮＡの酸化的開裂の促進（Ｅｎｈａｂｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｔｉ−ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：６５５５−６５６１（１９９６）に記載されている。
また、前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の軽鎖可変域のアミノ酸配列は、以下の通り同定されている（Ｊａｎｇ ＹＪ，Ｓｔｏｌｌａｒ ＢＤ他、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｄｅｃ；３５（１８）：１２０７−１２１７）。

前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の抗原特異性を有するものは、２Ｃ１０の可変域を有するヒト型抗体等や、前記２Ｃ１０の可変域の１個から２０個程度の、より容易には１又は数個の、アミノ酸を欠失、置換、若しくは付加した変異型を作製することにより、当業者であれば容易に得ることができる。前記モノヌクレオソームを含むヌクレオソームに特異的な抗体には、前記変異型も含まれる。
前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の製造方法を以下に簡単に述べる。
６ケ月齢のＭＲＬ／ｌｐｒマウスの脾臓を培養液（ＤＭＥＭ）の入ったプラスチックデッシュの中で眼科せん刀を用いて細切した後、２枚のスライドグラスのフロスト面で細切を圧挫し、結合組織からリンパ球を遊離させる。数分後に浮遊細胞を遠心分離する。直ちに４４．４質量％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下でマウスミエローマ細胞（ＳＰ２）とリンパ球との細胞融合を二分間かけて行う。融合後、直ちに培養液でＰＥＧを稀釈・除去し、最後に選別培地であるＨＡＴに置き換え、２００μｌずつ９６穴のマイクロタイタープレートに加え、３７℃のＣＯ_２インキュベーター（５質量％ＣＯ_２存在下）で培養する。二週間後、コロニーの増殖した各ウエルの培養上清の抗ＤＮＡ抗体価をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）にて測定し、該抗ＤＮＡ抗体価の高いウエル中の２Ｃ１０ハイブリドーマを選択し、該２Ｃ１０ハイブリドーマを適宜培養することにより前記モノクローナル抗体２Ｃ１０が得られる（Ｔ．Ｋｕｂｏｔａ他、Ｉｍｍｕｎｏ ｌｅｔｔ．，１４：５３−５８，１９８６／１９８７）。
次に、前記モノクローナル抗体２Ｃ１０の性質を以下に簡単に述べる。
前記モノクローナル抗体２Ｃ１０は、一本鎖ＤＮＡ中の二本鎖部分と反応するが、二本鎖ＤＮＡの雛型である、ΦＸ１７４プラスミドＤＮＡに対し強い親和性を示し、かつ塩基配列のＡ・Ｔを好む、優れた抗二本鎖ＤＮＡ抗体である。
なお、前記モノクローナル抗体２Ｃ１０は、これまで二本鎖ＤＮＡに特異的であると考えられていたが、本発明に到達するまでの研究において、プロテインＡカラムによる抗二本鎖ＤＮＡ抗体精製過程で、二本鎖ＤＮＡと並びヌクレオソームに対しても強い親和性を有することが判明した。このことから、本発明のモノヌクレオソームの製造方法において、二本鎖ＤＮＡに特異的な抗体のみならず、ヌクレオソームに特異的な抗体や、二本鎖ＤＮＡ及びヌクレオソームの両者に特異的な抗体を用いることができると考えられる。
前記「プロテインＡカラム」とは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）細菌壁に由来する分子量４２，０００のタンパク質であるプロテインＡを固相化したものをカラムに充填したものである。前記プロテインＡは、ＩｇＧの定常領域（Ｆｃフラグメント）に結合するので抗原抗体反応を妨害せずに、免疫複合体と結合することができる。この性質を利用して、前記プロテインＡによって免疫複合体を捕獲するプロテインＡカラム法は、ＩｇＧの精製法として確立された手法である。本発明で用いることができる市販のプロテインＡカラムとしては、例えば、ヒットラップ（Ｈｉｔｒａｐ）プロテインＡカラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）等が挙げられる。
本発明において、ヌクレオソームをプロテインＡカラム等のカラムに吸着させる媒介物となる抗体は、ヌクレオソームを含む培養液等の液中に遊離の形で存在していてもよいし、プロテインＡカラム等のカラムに予め固定化されていてもよい。なお、前記カラムは、前記プロテインＡカラム以外に、担体カラムでもよい。前記抗体が遊離の形で液中に存在する場合は、液中で免疫複合体を形成した後、形成された免疫複合体をプロテインＡカラム等のカラムに流すことにより、該抗体は、そのＦＣ部分を介してプロテインＡカラムに吸着される。前記抗体がプロテインＡカラム又は適当な担体カラムに固定化されている場合には、ヌクレオソームを含む液をカラムに流すことによって、プロテインＡカラムに固定化されている抗体を介してヌクレオソームを吸着することができる。
前記抗体をプロテインＡカラムに固定化する方法としては、従来公知の方法を用いることができる。具体的には、プロテインＡカラムをｐＨ６．８〜８．３までのレンジでＴｒｉｓを主体とした緩衝液で平衡化し、予め同じ緩衝液で平衡化した抗体又は抗体−ヌクレオソーム複合体をそれに流入し、それを同カラムに数回循環させた後、抗体又は抗体−免疫複合体を含まないＴｒｉｓ緩衝液でカラムを洗浄する。洗浄後のカラム通過液はＡ_２６０＝０．０が好ましい。
ヌクレオソーム及び抗体（免疫複合体）が培養液上清等に含まれている場合には、限外濾過等の手段によって上清をプロテインＡカラムに注ぐ前に濃縮しておくことが好ましい。濃縮を行うことによって、より効率的なモノヌクレオソームの製造が達成できる。限外濾過によって濃縮を行う場合、例えば、分子量３０，０００カットオフのダイアフロー膜（ＰＨ３０）（ミリポア社製）等を用いることができる。
前記解離回収工程は、前記捕獲収集工程において捕獲収集されたヌクレオソームを前記抗体から解離回収させる工程である。前記解離回収は、ヌクレオソームに特異的な抗体とヌクレオソームとの結合を高濃度塩化ナトリウム液等を用いて解離させることにより行うことができ、その結果、ヌクレオソームのみを分離することができる。
ヌクレオソームを解離させるために用いられる溶出液としては、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、塩化ナトリウム濃度が０．８〜１．２Ｍ程度であり、好ましくは０．６〜０．８Ｍであり、特に好ましくは１．２Ｍであり、ｐＨが、ｐＨ４．５〜９．０程度であり、好ましくはｐＨ６〜８であり、特に好ましくはｐＨ７〜７．５である緩衝液などが好適に挙げられ、具体的には、濃度が２５〜１００ｍＭ程度であり、好ましくは２５〜７５ｍＭであり、特に好ましくは２５〜５０ｍＭであるトリス緩衝液が好適に挙げられる。
前記溶出液中の塩の種類や緩衝液の種類としては、特に制限はなく、適宜選択でき、上記以外には、例えば、リン酸緩衝液や、炭酸緩衝液などが挙げられる。
なお、プロテインＡカラムなどの担体からヌクレオソームを解離させる前に、カラムに非特異的に結合しているタンパク質を洗浄によって完全に除去することが不可欠である。その際用いる洗浄液としては、例えば、トリス緩衝液（２５ｍＭトリス、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）等が挙げられるが、種々の条件によって濃度、塩類の種類、ｐＨ等を適宜調整することができる。非特異結合タンパク質が完全に除去されたか否かは、例えば、２６０ｎｍでの吸光度が０．００であることによって確認することができる。
プロテインＡに結合した２Ｃ１０・クロマチン複合体（２Ｃ１０ハイブリドーマ自身がこれに該当する）又は２Ｃ１０を予め結合したプロテインＡカラムあるいは２Ｃ１０を共有結合で固定化したアフィニティーカラムに結合した培養上清中の総てのヌクレオソーム（モノマーからオリゴ又はポリマーまで）は、１．２Ｍの塩化ナトリウムを含むトリス緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．０４質量％ＮａＮ_３，ｐＨ７．４）（以後、これを緩衝液Ｂと呼ぶ）を溶出液として用いて、解離させることができる。この溶出液をウルトラフリー膜（分子量３万カットオフ、ミリポア社）を用いて濃縮、それを０．２５Ｍ塩化ナトリウム添加トリス緩衝液Ａ（以下、これを「緩衝液Ｃ」と呼ぶ）で平衡化したスーパーデックス２００のカラムを用いたＨＰＬＣによりモノヌクレオソームのみを分離することができる。しかし、培養上清中にはそれよりもオリゴマーやポリマーが圧倒的に多く、効率良くモノマーを回収するには緩衝液Ａでの溶出液（濃縮後）をマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で消化し、できるだけモノマーにしてから反応を停止する。このモノマーを前記ＨＰＬＣにより分離するのが好ましい。その際、従来のショ糖濃度勾配超遠心法やゲル切り出し法では、回収することはできなかったヌクレオソームを繋いでいるリンカーＤＮＡも、本クロマトグラフィーで分子量約１０Ｋ位の所に溶出される（図３）。この切断されたリンカーＤＮＡは、遺伝子情報を知るためのクローニングに最適である。
前記単離精製工程は、前記解離回収工程において回収したモノヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて単離精製する工程であり、具体的には、ヌクレオソームを含むプロテインＡカラム溶出液を、所望によりヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼ（例えば、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）など）で消化した後、回収したヌクレオソームからモノヌクレオソームを分子量に基づいて精製する工程である。
前記分子量に基づく精製は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、モノヌクレオソームのみを高収率に回収することにより行うことができ、又は、ゲルろ過カラムを用いて分子量２０万から２５万の分画を回収することにより行うことができる。
前記ＨＰＬＣ用カラムとしては、分子量１０，０００〜１，０００，０００までを分離できるものが好ましく、例えば、スーパーデックス２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）カラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）スーパーデックス１００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１００）カラム（アマシャムファルマシアバイオテックス社製）等が挙げられる。
前記ＨＰＬＣの展開溶媒としては、塩化ナトリウム濃度が１４０〜１２００ｍＭ程度であり、好ましくは２５０ｍＭであり；アジ化ナトリウム等の濃度が０．０２〜０．１質量％程度であり、好ましくは０．０４質量％である、２５〜７５ｍＭ、好ましくは２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ６．８〜８．３、好ましくはｐＨ７，４）が挙げられる。なお、前記濃度、ｐＨ等は、目的に応じて適宜選択することができる。
ＨＰＬＣカラムを上記展開溶媒で平衡化した後、プロテインＡカラム溶出液を流し、モノヌクレオソームのピーク画分を集めると、単離・精製されたモノヌクレオソームが得られる。保存用としてのモノヌクレオソームのタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンをスタンダードとして、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ピース（ＰＩＥＲＣＥ）社製）で測定した場合、１００〜１０００μｇ／ｍｌ程度が好ましく、５００μｇ／ｍｌであることがより好ましい。
モノヌクレオソームの検出は、１５％ＳＤＳ・ＰＡＧＥ電気泳動でＨ１を除くコアヒストンＨ３、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ４及びその修飾産物の同定並びにヌクレオソームから抽出したＤＮＡの大きさが１５０〜２００ｂｐの点にのみ集簇していることを１〜２％アガロースゲル電気泳動にて確かめることによって行うことができる。
なお、プロテインＡカラム溶出液をそのままＨＰＬＣにかけてもある程度のモノヌクレオソームを回収できるが、その前に、溶出液をマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で処理（消化）することが好ましい。これによって、重合しているヌクレオソームをモノヌクレオソームに分解することによって、モノヌクレオソームの回収率を顕著に高めることができる。溶出液の消化に用いることができるマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）としては、例えば、マイクロコッカル・ヌクレアーゼＥＣ３．１３１．１（シグマ社製）、等が挙げられる。消化されるヌクレオソームを含む溶液の濃度としては、１〜１００ユニット／ｍｌ、程度が好ましく、５〜５０ユニット／ｍｌがより好ましい。
マイクロコッカル・ヌクレアーゼによる消化は、溶出液にＣａ^２＋を１〜１０ｍＭ程度、好ましくは２．５ｍＭ、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）を０．２５〜１Ｕ、好ましくは０．５Ｕ添加し、３０〜４０℃、好ましくは３７℃で、４５〜１２０分間、好ましくは６０分間保温することによって行うことができる。反応容量は適宜設定することができ、例えば２００μｌとすることができる。保温終了後、直ちに５ｍＭ（ＥＧＴＡ）を添加してマイクロコッカル・ヌクレアーゼを失活させ反応を停止させる。不溶物をマイクロヒュージ（１３Ｋｒｐｍ、５分）で除去し、上清をＨＰＬＣにかけ単離精製工程を行う。
なお、抗体がプロテインＡカラムに固定化されている場合、前記捕獲収集工程の前に、ヌクレオソームを含むサンプルをマイクロコッカル・ヌクレアーゼによって処理（消化）してもよい。これによって、前記単離精製工程の前に処理（消化）するのと同様にモノヌクレオソームの回収率を高めることができる。
本発明によって得られたモノヌクレオソームの純度は、通常９５質量％以上、好ましくは９９質量％以上である。なお、得られたモノヌクレオソームのピーク画分に含まれるものがモノヌクレオソームであることは、Ｉｓｈｉｚａｋａらの方法（Ｉｓｈｉｚａｋａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５７９２，１９９１）によって該画分から抽出されたＤＮＡが、２質量％アガロースゲル電気泳動で１５０〜２００塩基対のサイズに集中して検出されること、及び１５質量％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでコアヒストン（ヒストンＨ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ａ、及びＨ４）のみが検出され、ヒストンＨ１は検出されないことによって証明される。
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、モノヌクレオソームの分離が極めて厳格であるため、得られたヌクレオソームから分離されるＤＮＡの純度が高く、その遺伝子情報入手のためのクローニングの能率化に寄与することができる。
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、自己免疫疾患等で注目されている修飾ヌクレオソームを製造することができるため、それらの疾患のメカニズム、アポトーシスの生理的意義等の解明に貢献でき、学術的にも大きな意義を有する。
また、ゲノムプロジェクトの一環として、疾患感受性、薬剤抵抗性の解明が、単一ヌクレオチド多形態（ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の点から大規模に進められている。しかし、それは全ゲノムが対象で、膨大な人力と資金を要する。これに対し、ヌクレオソーム単位でのＳＮＰの解析は、より低コストで且つ効率が良いと考えられる。したがって、ヌクレオソーム単位でのＳＮＰ解析を行うに当たって、本発明のモノヌクレオソームの製造方法は大きく貢献できる。
本発明のモノヌクレオソームの製造方法の他の態様としては、細胞を低塩濃度の溶液中で破砕させ、溶液中にヌクレオソームを放出させる放出工程と、
前記ヌクレオソームを収集する収集工程と、
収集した前記ヌクレオソームを低塩濃度の溶液に懸濁し、モノヌクレオソーム単位に切断し得るヌクレアーゼで処理するヌクレアーゼ処理工程と、
前記ヌクレアーゼ処理後の溶液からモノヌクレオソームを、該ヌクレオソームに特異的な抗体を用いて、及び／又は分子量に基づいて製造する単離精製工程と、を含む。
通常の状態ではヌクレオソームを培養液中に放出しない細胞からモノヌクレオソームを製造する場合には、前記放出工程により、溶液中にヌクレオソームを放出させてから、モノヌクレオソームを単離すればよい。前記ヌクレアーゼ処理工程は、前記ヌクレアーゼを用いた処理（消化）と同様に行うことができ、前記単離精製工程は、上述したとおり行うことができる。
（モノヌクレオソーム）
本発明のモノヌクレオソームは、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造される。
本発明のモノヌクレオソームは、厳格な条件により製造されるため、純度が通常９５質量％以上、好ましくは９９質量％以上と高く、保存安定性に優れ、モノヌクレオソーム本来の形態をよく維持している（形態維持性に優れる）。したがって、各種測定乃至診断に好適に用いることができる。
また、本発明のモノヌクレオソームは長期間安定に保存することができる。具体的には、トリス、ＮａＣｌ及びＮａＮ_３からなるＮａＣｌ添加トリス緩衝液（ＴＢＳ）中で、又は、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４質量％スキムミルク、１０質量％ブロックエース、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ中で、４℃で２ヶ月間保存しても前記モノヌクレオソームは、なおかつ抗原性を維持した。ヌクレオソームは、一般的に安定性が低く、また、凍結すると破壊されるため、前記安定性は大きな利点である。
また、アポトーシス由来のモノヌクレオソームは、アポトーシスによる修飾を保持しており、自己抗原性を獲得し易いため、自己免疫病患者の抗体測定（自己免疫病診断）に、特に好適に利用できる。
（モノヌクレオソーム製造用キット）
本発明のモノヌクレオソーム製造用キットは、試料中に含まれるヌクレオソームを捕獲収集するための該ヌクレオソームに特異的な抗体と、
捕獲収集したヌクレオソームから分子量に基づきモノヌクレオソームを単離するためのカラムと、を含む。
本発明のモノヌクレオソーム製造用キットを本発明のモノヌクレオソームの製造方法に使用することにより、モノヌクレオソーム分析、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適で、保存安定性に優れたモノヌクレオソームを、形態安定性よく、簡易にかつ効率よく、しかも高純度で製造することができる。
（ヒストン検査方法）
本発明のヒストン検査方法は、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により得たモノヌクレオソームより被検ヒストンを回収し、該被検ヒストンの電気泳動パターンと対照ヒストンの電気泳動パターンとを比較することを含む。
自己免疫疾患における、自己免疫現象は、アポトーシスにより修飾されたヌクレオソームが抗原となっていると考えられ、この修飾ヌクレオソームの本体はコアヒストンの修飾であると考えられる。したがって、モノヌクレオソームのコアヒストンの修飾を検査することで、ヌクレオソームの修飾状態を把握し、自己免疫疾患の診断、解明に利用することができる。
前記ヒストン検査方法は、具体的には、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により被検試料から得られるモノヌクレオソームを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析する。この解析結果を、正常細胞から得られるヒストンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果と比較することにより行うことができる。
（ヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法）
本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、を含む。
前記固相化工程においては、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを用いる。このモノヌクレオソームは、純度が通常９５質量％以上、好ましくは９９質量％以上と高く、モノヌクレオソームの形態をよく保持している（形状安定性に優れる）。したがって、ヌクレオソームに特異的な抗体に対する抗原として好適である。
また、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により得られる、アポトーシス由来のモノヌクレオソームは、アポトーシスによる修飾を保持しており、自己抗原性を獲得し易いため、自己免疫病患者の抗体測定に、特に好適である。
前記モノヌクレオソームの固定化緩衝液としては、モノヌクレオソームの形態を変化させないものであれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えば、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を使用することができる。
前記固相化工程に用いられる固相としては、モノヌクレオソームを固定化できるものであれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えばポリスチレン製のマイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製 Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）等が、好適に使用することができる。前記モノヌクレオソームの前記固相化の条件としては、固相の種類等に応じて適宜選択することができ、前記固相化の具体例としては、前記ポリスチレン製マイクロタイタープレートを固相として使用する場合には、従来からｄｓＤＮＡ抗原のプレートへの吸着に用いられているポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（１μｇ／ｍｌ蒸留水）を介して、１μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩吸着させ、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液洗浄する方法等が、好適に挙げられる。
前記固相化工程においては、モノヌクレオソームの固定化されていない固相を遮蔽し、非特異性反応を防止するため、モノヌクレオソームの固相への固定化後に固相をブロッキング液でブロッキングすることが好ましい。ヌクレオソームは複雑な高次構造を有するため、特に非特異性反応の影響が大きく、ブロッキングの役割は大きい。前記ブロッキングは、前記固相とブロッキング液とを反応させた後、洗浄することにより行うことができる。前記ブロッキング液としては、少なくともスキムミルクを含む溶液が好ましく、トリス、ＮａＣｌ及びＮａＮ_３からなるＮａＣｌ添加トリス緩衝液（ＴＢＳ）に、０．１〜０．３質量％のスキムミルクを含む溶液が特に好ましい。
固相化工程の終了後、直ちに反応工程を開始しない場合には、各ウエルにＴＢＳ又は後述の反応液を加え、プレートシールで密閉し、４℃で保存することができる。
前記反応工程は、被検試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる工程であるが、該被検試料としては、健常者又は患者の血清又は血漿が好ましく、自己免疫病等の病気の診断に利用できる点で、自己免疫病の疑いのある患者の血清又は血漿が特に好ましい。
前記試料を前記モノヌクレオソームと反応させる方法については、前記試料中のヌクレオソームに特異的な抗体が前記モノヌクレオソームに結合できる方法であれば特に制限はなく、適宜選択することができる。例えば、前記マイクロタイタープレートを用いた場合には、試料を反応液で稀釈し、振盪しながら反応させ、前記反応後吸引除去し、洗浄する等の方法により行うことができる。
なお、試料を稀釈する反応液としては、前記非特異性反応を防止する観点から、スキムミルクを含むことが好ましく、１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４質量％スキムミルク、１０質量％ブロックエース、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳであることが特に好ましい。前記ＢＳＡは、アルブミン フラクション Ｖ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｆｒａｋｔｉｏｎ Ｖ，ベーリンガーマンハイム社製 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が好ましく、前記ブロックエースは、大日本製薬株式会社製が好ましく、前記ＥＤＴＡはＥＤＴＡ二ナトリウム塩（同仁化学製）が好ましい。
前記測定工程は、前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する工程であるが、前記モノヌクレオソームに結合する抗体を測定することができれば特に制限はなく、目的に合わせて適宜選択することができる。なお、前記測定工程においては、前記抗体の代りに、前記モノヌクレオソームに結合する抗体を認識する二次抗体を測定してもよい。例えば、前記マイクロタイタープレートを用いた場合には、前記洗浄後、直ちに、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）稀釈液を、各ウエルに加え、振盪反応させ、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル ホスフェイト（ＰＮＰ）（シグマ社製 Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試薬を各ウエルに添加し、再び振盪反応させ、発色させる等の方法により行うことができる。なお、前記発色は、反応直後に発色の度合（吸光度）を、オートリーダーを用いて、吸光波長４０５ｎｍで測定する。対照又は盲検は、前記一連の反応系で、血清又は血漿を加えなかった時に得られる吸光度とし、各資料における吸光度からこれを差し引いた値が実測値となる。抗体価は、前記吸光度の実測値として表すことも可能であるが、高力価の血清で予め標準曲線を作成し、それとの対比により試料における抗体価をユニット単位で表示することが好ましい。
前記測定工程は、また、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として反応させる工程を含んでもよく、この場合にはサブクラス別の抗体の測定が可能となる点で、特に好ましい。
即ち、ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の四種類のサブクラスがあり、患者の有する、ヌクレオソームに特異的な抗体の、サブクラスの片寄りが、疾患病態を特徴付けることがある。したがって、サブクラス別抗体の測定が可能であれば、疾患病態をよりよく把握することができる。
前記サブクラス別抗体の測定には、例えばビオチン標識した抗ヒトサブクラス抗体（マウス）（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を前記アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）の代りに使用して反応及び洗浄後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を反応させ、前記と同様に基質のＰＮＰを加えて、発色させ、オートリーダーで吸光度を測定することができる。
本発明のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法は、純度が高く、本来の形態をよく保持したモノヌクレオソームを用いることにより、自己抗原が陽性の場合にはヌクレオソームに対する極めて高い抗体価を示し、自己抗原が陰性の場合には常に低い抗体価しか示さない、極めて精度の良い測定方法である。また、必要に応じて、ブロッキング剤、及び反応液の組成を調整することによっても、非特異性反応を防ぎバックグラウンドの閾値を低くすることができる。更に必要に応じて、サブクラス別に抗体を測定することにより、ＳＬＥ等の自己免疫病患者病態をより詳しく分析することができる。
本発明のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法は、ヌクレオソームに特異的な抗体を極めて精度良く測定することができ、自己免疫病、特にＳＬＥの診断、ループス腎炎、血管炎、ＣＮＳループス、小児ＳＬＥの診断に極めて有効である。
（自己免疫病診断方法）
本発明の自己免疫病診断方法は、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造されたモノヌクレオソームを固相化する固相化工程と、
試料を、固相化された該モノヌクレオソームと反応させる反応工程と、
前記モノヌクレオソームに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
その抗体価を評価する評価工程と、を含む。
前記自己免疫病診断方法は、前記ヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法において記載した方法により、ヌクレオソームに特異的な抗体を測定し、その測定された抗体価を評価する。前記抗体価の評価は、例えば、平均値＋標準偏差の３倍などにより、予め設定した所定閾を超えるか否かにより陽性か陰性かを評価することができる。
また、ＩｇＧサブクラスを認識する抗ヒト抗体を二次抗体として使用して、ヌクレオソームに特異的な抗体をＩｇＧのサブクラスごとに測定し、それぞれの抗体価がＩｇＧのサブクラスごとに予め設定した各々の所定閾を超えるか否かを評価することもできる。また、サブクラス別の抗体価のパターンを分析して評価することもできる。サブクラスごとの評価は、病態をより詳しく表すものである。
（自己免疫病診断用キット）
本発明の自己免疫病診断用キットは、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造したモノヌクレオソームを固相化してなる固相と、緩衝液と、プレート及びカラムのいずれかを含む。
前記自己免疫病診断用キットは、本発明のモノヌクレオソームの製造方法により製造され、形態安定性に優れたモノヌクレオソームを高純度で含むため、ヌクレオソームに特異的な抗体を極めて精度良く測定することができ、自己免疫病、特にＳＬＥの診断に極めて有効である。また、前記自己免疫検査キットは、緩衝液を満たして密封シールすることができ、前記ヌクレオソームの保存安定性が高いことからその保存安定性に優れている。前記自己免疫病診断用キットは、必要に応じて、反応液、稀釈液、洗浄液、二次抗体等を更に含んでいてもよい。また、前記二次抗体が抗ヒトサブクラス抗体であってもよい。
前記自己免疫病診断用キットは、例えば、前記ヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法の固相化工程で説明した方法等により作製することができる。
（ヌクレオソームＤＮＡ製造方法）
本発明のヌクレオソームＤＮＡ製造方法は、前記本発明のモノヌクレオソームの製造方法からなるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程とを含むこと以外は特に制限はない。
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程は、公知の方法から適宜選択して行うことができる（Ｋａｎａｉ，Ｙ ｅｔ ａｌ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ：ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４６：２０７−２１４，１９９５）。例えば、一定量の精製ヌクレオソームを、１％ＳＤＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含むトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁し、室温で６０分間処理する。次に、６ＭのＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）を含む変性剤を３倍量加え、６０℃で１５分間加熱する。この操作で可溶化したＤＮＡを５０％イソプロピルアルコールで沈殿させ、沈殿したＤＮＡを上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、少量のＲＮａｓｅを添加し、混在する可能性のあるＲＮＡを分解する方法を用いることができる。
前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡは、前述したような純度が高くかつ形態をよく保持したモノヌクレオソームから抽出されるため、モノヌクレオソームに由来する純度の高いＤＮＡである。前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法の一例により製造されたヌクレオソームＤＮＡのアガロースゲル電気泳動によると、１５０ｂｐ付近に強いバンドがあり、これはモノヌクレオソームの２本鎖ＤＮＡであると考えられる。これらのヌクレオソームＤＮＡの平均鎖長は、１４５ｂｐ〜２００ｂｐであることが好ましく、３２０〜４００ｂｐのＤＮＡをわずかに含んでいることもある。
前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡは、ヒト由来の試料から製造すればヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが得られるため、ＳＬＥ等の病態判断のための抗原として、異種のＤＮＡを用いることに起因する非特異的反応を排除できる点、近年注目されているように抗ＤＮＡ抗体産生の自己抗原となる可能性が強いヌクレオソームのＤＮＡである点で優れている。本発明のヌクレオソームＤＮＡ製造方法は、今まで必ずしも製造が容易ではなかったこのようなヌクレオソームＤＮＡの製造を容易に、かつ、精度よく行う方法を提供したものであり、これによりＳＬＥ等の診断に好適なヌクレオソームＤＮＡを提供することができる。
（ＤＮＡプレート）
本発明のＤＮＡプレートは、プレート上に、前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであって、ヒト由来のヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなること以外は特に制限はない。また、本発明のＤＮＡプレートは、プレート上に前記ヒト由来のモノヌクレオソームから単離精製されたヌクレオソームＤＮＡが固相化されてなることを特徴とするＤＮＡプレートであってもよい。これらのＤＮＡプレートは、ＳＬＥ等の病態判断のための抗原として、ヒトのＤＮＡを用いることにより、異種のＤＮＡを用いることに起因する非特異的反応を排除できる点、近年注目されているように抗ＤＮＡ抗体産生の自己抗原となる可能性が強いヌクレオソームのＤＮＡを用いる点で優れている。
前記ＤＮＡプレートは、ヌクレオソームＤＮＡがプレート上に直接固相化されてなることが、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）等の塩基性タンパク質を介してＤＮＡを付着させた従来プレートが有する、ＰＬＬに対する抗体及びＰＬＬ−ＤＮＡ複合体が形成する未知の抗原構造に対する抗体反応による問題点を排除できる点で好ましい。プレートの材質は、ポリスチレンを含むことがＤＮＡを直接付着させやすい点で好ましく、マイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ、Ｉｍｍｕｌｏｎ４ＨＢ及びＩｍｍｕｌｏｎＨＢ（ダイネックステクノロジー社製 Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）が特に好ましい。
このように、本発明のＤＮＡプレートは正常血清のバックグランドが減少するため、目的とする疾患血清の抗体価の信頼性が高くなり、ＳＬＥ等の病態判断のための抗ＤＮＡ抗体反応の測定に極めて好適に用いることができる。
（ＤＮＡプレート製造方法）
本発明のＤＮＡプレート製造方法は、前記モノヌクレオソームの製造方法であって、試料がヒト由来の試料であるモノヌクレオソーム製造工程と、
モノヌクレオソームからヌクレオソームＤＮＡを単離精製するヌクレオソームＤＮＡ単離精製工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡをプレート上に固相化する固相化工程とを含むこと以外は特に制限はない。
前記固相化工程は、ＰＬＬ等の前処理なしに、プレート上に、直接ヌクレオソームＤＮＡを付着させることが好ましい。
前記モノヌクレオソームの固定化緩衝液としては、ヌクレオソームＤＮＡの形態を変化させないものであれば、特に制限はなく、適宜選択することができるが、ＰＬＬ等の前処理なしに、ヌクレオソームＤＮＡを付着させる観点から、固定化緩衝液は、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液又はホウ酸−カセイソーダ緩衝液であることが好ましく、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含むトリス緩衝液がより好ましい。ＮａＣｌの濃度は０．２５Ｍ以上であることがコーティング効率、及び製造されたＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応性の面から特に好ましい。
前記固相化工程に用いられる固相としては、ヌクレオソームＤＮＡを固定化できるものであれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、前記、ヌクレオソームＤＮＡを直接プレートに付着させる観点から、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートであることが好ましく、Ｉｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製 Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）が、特に好ましい。前記ヌクレオソームＤＮＡの前記固相化の条件としては、固相の種類等に応じて適宜選択することができ、前記固相化の具体例としては、前記ポリスチレン製マイクロタイタープレートを固相として使用する場合には、ヌクレオソームＤＮＡを０．５μｇ／ｍｌの濃度で０．２５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝液に溶解した溶液で、４℃で一晩吸着させ、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液洗浄する方法等が、好適に挙げられる。
ブロッキングは、前記ヌクレオソームの固定化の場合に準じて行うことができる。
本発明のＤＮＡプレート製造方法は、プレート上に、前記ヌクレオソームＤＮＡ製造方法により製造されたヌクレオソームＤＮＡであってヒト由来のヌクレオソームＤＮＡを、０．１Ｍ以上１．０Ｍ以下のＮａＣｌを含む、トリス緩衝液及びホウ酸−カセイソーダ緩衝液のいずれかに溶解させて添加することにより固相化するものであってもよい。
（抗ＤＮＡ抗体測定法）
本発明の抗ＤＮＡ抗体測定法は、前記ＤＮＡプレートを用いてなり、
被検試料を、該ＤＮＡプレートの固相化されたヌクレオソームＤＮＡと反応させる反応工程と、
前記ヌクレオソームＤＮＡに結合する特異的な抗体を測定する測定工程と、
を含むものであれば、特に制限はなく、前記測定工程は、前記ヌクレオソームに特異的な抗体の測定法に準じて適宜選択することができる。
実施例
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の効果を害しない限り適宜変更することができる。
（実施例１）
抗二本鎖ＤＮＡ抗体産生ハイブリドーマ培養細胞上清からのモノヌクレオソームの製造
自己免疫疾患モデルとして知られているＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来Ｂ細胞ハイブリドーマの産生する、二本鎖ＤＮＡに特異的な自己抗体２Ｃ１０（ＩｇＧ２ｂに属する）を、ＩｇＧ抗体の分離・精製法として既に確立されているプロテインＡカラム法を用いて上記ハイブリドーマの培養上清から分離し、分離した抗体をＳＤＳ−ボリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動で、その成分を調べると、ヒストンをはじめとするＤＮＡ結合タンパク質（核タンパク質複合体）を含んでいることが知られている（金井ほか：ハイブリドーマモノクローナル抗体からの自己抗原の分離とその応用、厚生省特定疾患 混合性結合組織病調査研究班 平成５年度研究報告書 ｐｐ５６−５９、１９９４）。
前記２Ｃ１０−核タンパク質複合体が捕獲されているプロテインＡカラムを、１．２Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（以下、この１．２Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭトリス緩衝液を「緩衝液Ａ」という）を溶出液として用いて解離溶出させ、その溶出液を濃縮し、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ抽出物を、２％アガロースゲル電気泳動で調べたところ、モノヌクレオソームＤＮＡ（約１５０塩基対）及びその重合体が検出された（図１）。
一方、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＨ（１５％）で調べたところ、コアヒストン、即ち、ヒストンＨ３、Ｈ２ｂ、Ｈ２ａ及びＨ４のみが検出された。これらの結果から、この溶出液中には、モノヌクレオソーム及びその種々の重合度の多量体が存在することが明らかになった。
上記事実に基づき、スケールを上げてモノヌクレオソームの回収を試みた。２Ｃ１０ハイブリドーマを無血清培地（培地は、５質量％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ通常培地でもよい）で大量培養（約１リットル）し、培養上清を分子量３０，０００カットオフのダイアフロー膜ＰＭ３０（ミリポア社製）を用いた限外濾過法により２０倍に濃縮した。この濃縮液を上記ヒットラップ（Ｈｉｔｒａｐ）プロテインＡカラム（５ｍｌ）（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に注いで核タンパク質複合体を捕獲し、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２５ｍＭトリス緩衝液（以下、この１４０ｍＭ塩化ナトリウム含有２５ｍＭトリス緩衝液を「緩衝液Ｃ」という）（ｐＨ７．４）で洗浄し、非特異的結合タンパク質を完全に除去した。非特異的結合タンパク質の除去は、２６０ｎｍでの吸光度が０．００となったときに完了とした。次に、緩衝液Ａでヌクレオソームを溶出させた。この溶出液には、モノヌクレオソーム、及びモノヌクレオソームが２個以上連なったオリゴ乃至ポリヌクレオソームが含まれていた。
次に、モノヌクレオソームのみを単離するため、分子量１０，０００〜１，０００，０００までの分子を分離できるスーパーデックス２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）カラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を導入した。展開溶媒としては、２５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０４質量％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（以下、この２５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０４質量％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液を「緩衝液Ｂ」という）（ｐＨ７．４）を使用した。
溶出画分の吸光度のプロファイルを図２に示す。ポリヌクレオソーム画分の大きなピークに遅れてモノヌクレオソーム画分のピークが分子量２０万から２５万の位置に検出された。
モノヌクレオソームの収率を上げるために、ポリヌクレオソームをモノヌクレオソーム単位に消化することを行った。具体的には、得られた溶出液にＣａ^２＋を２．５ｍＭ、マイクロコッカル・ヌクレアーゼを０．５ユニット／ｍｌになるように添加して２００μｌとし、３７℃で４５分間保温した。保温終了後、直ちにＨＧＴＡを５ｍＭになるように添加して反応を停止した。不溶物をマイクロヒュージ（１５ｋ ｒｐｍ）で除去した。
得られた上清を、緩衝液Ｂで平衡化したスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣ（３２１ポンプ、ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）社製を使用）にかけた。溶出画分の吸光度のプロファイルを図３に示す。ゲルろ過カラムにかける前にヌクレアーゼ処理することにより、モノヌクレオソームの画分を増加させることができた。この画分を再度クロマトグラフィーにかけた結果を図４に示す。ほぼ単一なピークとして精製することができた。一方、この方法を用いることにより同時にモノヌクレオソームの間をつなぐリンカーＤＮＡも回収することができた（図３）。
モノヌクレオソームのピーク画分をウルトラフリー（ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ）（５０ｋカットオフ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）で濃縮した。濃縮液のタンパク質濃度を、ＢＣＡプロテインアッセイキット（ピース（ＰＩＥＲＣＥ）社製）で測定したところ、３００〜５００μｇ／ｍｌであった。
なお、濃縮前の細胞培養液以外は総て、タンパク質分解を防止するためにプロデアーゼ阻害剤カクテル、コンプリート（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ＴＭ，ＥＤＴＡフリー（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）を処方通り添加し、更にセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライド）（シグマ社製）を１００μＭになるように添加した。以下の実施例でも同様である。
（実施例２）
一般培養細胞上清からのモノヌクレオソームの製造
本発明のモノヌクレオソームの製造方法は、二本鎖ＤＮＡ及び／又はヌクレオソームに特異的な抗体を生産しない一般の樹立細胞又はヒトを含む動物組織から直接分離した細胞（一次培養細胞）にも適用できる。
自己免疫疾患モデルであるＭＲＬ／ｌｐｒマウス由来株価細胞ＫＭＬ_１−７（Ｋａｎａｉら、Ｉｎｔｌ．Ａｒｃｈｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：９２−９４，１９８６）は、血清添加培地及び無血清培地の如何に係わらず、無刺激でその培養上清中にヌクレオソームを分泌することが知られている。したがって、この培養上清がそのままヌクレオソームの供給源として使用することができる。
また、樹立されている市販の各種癌細胞株又は一次培養細胞でもアポトーシス誘導剤の添加培養によって培養上清中にヌクレオソームを放出させることができ、上記と同様に、培養上清をヌクレオソームの供給源として使用することができる。
この培養上清を適切な濃度（１０〜２０倍）まで濃縮した後、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で処理（消化）し、モノクローナル抗体２Ｃ１０が固定化されたプロテインＡカラムに流す。
前記プロテインＡカラムを、緩衝液Ｃで洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、緩衝液Ａで溶出する。溶出液を直ちに緩衝液Ｂに対して透析した後、濃縮を行う。この濃縮は、大容量であれば前記ダイアフロー膜ＰＭ３０を用いた限外濾過で行うことができ、少量であれば前記ウルトラフリーを用いて行うことができる。
以下、実施例１と同様にして、上記濃縮液をスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣにかけ、モノヌクレオソームを回収した。ＨＰＬＣによる分画パターンは図３及び図４と同様であった。
なお、モノクローナル抗体２Ｃ１０の固定化は、次のようにして行った。
段落番号００６０に記したトリス緩衝液でプロテインＡカラムを平衡化しておき、それにトリス緩衝液で調製した２Ｃ１０（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）をチャージした。カラム中の流速は５ｍｌ／分で、サイクルは２回である（２回目で吸着は完璧となる）。吸着・固定化の後、再度カラムは、トリス緩衝液で平衡化した。
（実施例３）
培養細胞又は末梢血単核球からのヌクレオソームの製造
低張緩衝液（５０ｍＭトリス、５０ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ２−ＭＥ、０．２５Ｍショ糖、０．２ｍＭ ＡＥＢＳＦ、０．０４質量％アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）、ｐＨ７．４）１０ｍｌ当たり２×１０^８個の細胞を懸濁し、ポッター・テフロン^（Ｒ）製ホモジナイザー（２０ストローク）で手動でホモジナイズする。これを５００ｇで７分間遠心分離し、細胞核を沈降させた。細胞核を上記緩衝液にて一度洗浄して不純物を除去した。
次いで、洗浄した核を、ショ糖を含まない以外は上記緩衝液と同じ組成の緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、マイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）１．２５Ｕ／ｍｌ及び５ｍＭＣａ^２＋を添加し、実施例１と同様に酵素消化し、ＥＧＴＡが５ｍＭになるように添加して反応を停止させた。１３ｋで５分間還心分離し、得られた沈渣に緩衝液Ｂを添加し、可溶性画分を１３ｋの遠心分離で回収した。前記可溶性画分を直ちにモノクローナル抗体２Ｃ１０結合プロテインＡカラムにかけ、結合したヌクレオソームのみを上記溶出液（緩衝液Ａ）にて選択的に溶出させた。得られた溶出液を濃縮後、実施例２と同様のスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣにかけ、モノヌクレオソームを単離した。ＨＰＬＣによるモノヌクレオソームの単離の結果を図５に示す。
更に、ここで得られたモノヌクレオソーム画分を再度、スーパーデックス２００カラムにかけると図６に示すほぼ単一なピークとして精製された。
一方、モノヌクレオソームは、抗体２Ｃ１０結合カラムを用いずに、直接スーパーデックス２００カラムにかけ、分子量２０万から２５万の画分を分画することによっても精製することができた。２Ｃ１０結合カラムを用いずに精製した場合は、２Ｃ１０結合カラムを用いて精製した場合に比して若干純度が劣るが、再度ＨＰＬＣにかけると２Ｃ１０カラムの場合とほぼ同様の効果が得られた。
（実施例４）
本実施例４では、上記実施例２で得られたアポトーシスを起こした培養細胞由来のモノヌクレオソームと、実施例３で得られた正常な培養細胞由来のモノヌクレオソームとの比較解析を行った。
両ヌクレオソームを０．５％アガロース電気泳動により分画した。図７に示すように、正常な細胞由来のモノヌクレオソームに比較してアポトーシスを起こした細胞由来のヌクレオソームは、ブロードなバンドとして泳動された。
更に、これらモノヌクレオソームを詳細に分析するために、モノヌクレオソームを構成するコアヒストン、ＤＮＡをそれぞれ解析した。
ＤＮＡについては、アガロースゲル電気泳動によりその泳動パターン、位置などを比較したところ、大きな差異は観られなかった（図８）。
一方、コアヒストンについては１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画ヒストン成分を分画して解析した。結果を図９に示す。正常な細胞由来のヒストンは、図１０に示すＨ３、Ｈ２ｂ、Ｈ２ａ及びＨ４の通常のパターンと同様の分画パターンが示された。しかし、一方のアポトーシスを起こした細胞由来のコアヒストンは、分画パターンに異常が観られた。即ち、Ｈ２ｂに相当するバンドが減少し、Ｈ４のバンドを挟むように２本の新たなバンドが現れた。
このようにモノヌクレオソーム単位の製造が簡便になったことから、従来のその単離が困難であったヒストンの分離も簡便となった。更には上記のようなヒストンに基づいた生物現象の解析や疾患の診断や解明をも簡便に行うことが可能となる。
（実施例５）
ヌクレオソームのＥＬＩＳＡプレートへの固相化
自己抗原に対する免疫応答を調べる場合のＥＬＩＳＡプレートへの抗原の固相化条件を検討した。まず、抗原付着用溶媒の検討を行った。経験上、抗原のプレートへの固相化には、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）が使用される場合が多いことから、該炭酸緩衝液が、本プレートの抗原付着用溶媒として適するかを、該緩衝液によるヌクレオソームの形態的変化の有無により調べた。具体的には、ヌクレオソームの溶媒である０．５ＭＮａＣｌを該５０ｍＭ炭酸緩衝液に置換し、当該緩衝液で平衡化したスーパーデックス２００カラムを用いたＨＰＬＣにより調べた。その結果、溶液の置換に伴う溶出位置及びパターンに変化は観られなかった。これにより、当該緩衝液を、抗原付着用溶媒として用いることができることが判った。
次に、抗原の支持体としてポリスチレン製のマイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製 Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用い、ヌクレオソームを、該支持体に、従来からｄｓＤＮＡ抗原のプレートへの吸着に用いられているポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）（シグマ社製 Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１ｇ／ｍｌ蒸留水）を介して、２μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩吸着させた。吸着後、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液（２５ｍＭ トリス、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０４質量％ ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）で、４回洗浄した。１プレート当たり約１０ｍｌのＴＢＳを使用した。洗浄後、各ウエル当たり１００μｌのブロッキング溶液（２質量％スキムミルク（ディフコ社製 Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）含有ＴＢＳ）を加えて、一時間反応させ、抗原の付着していない部位を遮蔽した。最後に先の抗原吸着後の洗浄と同様にＴＢＳで４回洗浄することにより、抗原付着プレートを作製した。使用に供するまで、各ウエルにＴＢＳを１００μｌずつ加え、プレートシールで密閉し、４℃で保存した。
（実施例６）
患者血清中の抗ヌクレオソーム抗体測定
加療中の１２例のＳＬＥ患者及び２６例の健常者の血清を対象として抗ヌクレオソーム抗体の測定を行った。
血清は、１２人のＳＬＥ患者及び２６人の健常者からそれぞれ血清を採取した。
反応液［１質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４質量％スキムミルク、１０質量％ブロックエース、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ］にて血清を１００倍に稀釈し、マイクロタイタープレートの各ウエルに５０μｌずつ加えた。前記ＢＳＡは、アルブミン フラクション Ｖ（Ａｌｂｕｍｉｎ，Ｆｒａｋｔｉｏｎ Ｖ，ベーリンガーマンハイム社製 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、前記ブロックエースは、大日本製薬株式会社製、前記ＥＤＴＡはＥＤＴＡ二ナトリウム塩（同仁化学製）を使用した。
前記マイクロタイタープレートを、水平振盪器上で軽く振盪しながら、室温で３０分反応させた。反応後、直ちに反応液を吸引除去し、今度は０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０を含有したＴＢＳで、抗原付着後のプレートの洗浄と同様の手技で、プレートを４回洗浄した。
前記洗浄後、直ちに、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）（ジムド社製 Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を前記反応液にて２０００倍稀釈し、各ウエルに加え、前記血清の場合と同様に室温で３０分振盪反応させた。前記血清の場合と同様に洗浄した後、２．５ｍＭ Ｍｇ^２＋添加炭酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌになるように調整したＡＰの基質である、ｐ−ニトロフェニル ホスフェイト（ＰＮＰ）（シグマ社製 Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）試薬を１００μｌずつ各ウエルに添加し、前記血清の場合と同様に、室温で３０分振盪反応させた。
反応直後に発色の度合（吸光度）を、オートリーダーを用いて、吸光波長４０５ｎｍで測定した。なお、対照又は盲検は、前記一連の反応系で、血清を加えなかった時に得られる吸光度とし、これを差し引いた価を実測地とした。抗体価は吸光度で表した。
測定結果を、図１１に表した。加療中のＳＬＥ患者から採取した１２例の血清うち、２例の血清が、ヌクレオソームに対する極めて高い抗体価を示し、陽性と判定された。健常者から採取した２６例の血清は、いずれも低い抗体価しか示さず、これらの平均値＋３倍の標準偏差（ｍ＋３ＳＤ）で定義したバックグラウンドの閾値は二例の陽性血清の抗体価よりも極めて低かった。なお、２例の陽性と判定された患者以外のＳＬＥ患者からの血清が、高い力価を示さないのは、加療中処方されている薬剤の影響により既に治癒に近い状態である等の理由により、既に血清中にヌクレオソームに特異的な抗体が多く存在しないことを示すものである。
以上の結果から、本発明の測定方法により、ヌクレオソームに特異的な抗体を極めて精度良く測定することができ、本発明のヌクレオソームに特異的な抗体の測定方法がＳＬＥの診断に極めて有効であることが実証された。
（実施例７）
抗体サブクラス別の測定法
ＩｇＧ抗体には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の四種類のサブクラスがある。患者の有する、ヌクレオソームに特異的な抗体のサブクラスの片寄りが、疾患病態を特徴付けることがある。したがって、サブクラス別抗体の測定が疾患病態を把握する上で重要である。
実施例６の図１１でヌクレオソーム抗体の最高値を呈した症例について、サブクラス別抗体の測定を行った。
前記サブクラス別抗体の測定には、ビオチン標識した抗ヒトサブクラス抗体（マウス）（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を実施例６のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ）の代りに使用した。反応様式・反応時間は上記と同様に行った。次に、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を反応させ、最後に実施例６と同様に基質のＰＮＰを加えて、発色させ、オートリーダーで吸光度を測定した。
測定結果を図１２に表した。
（実施例８）
ヌクレオソームＤＮＡの製造
ヒト前骨髄性白血病細胞培養株ＨＬ−６０クロマチンから、実施例１と同様にモノヌクレオソームを製造し、さらに、ヌクレオソームＤＮＡを抽出した。ヌクレオソームＤＮＡの抽出は、公知の方法により行った（Ｋａｎａｉ，Ｙ ｅｔ ａｌ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒ ｍｉｃｅ：ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４６：２０７−２１４，１９９５）。具体的には、一定量の精製ヌクレオソームを、１％ＳＤＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを含むトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁し、室温で６０分間処理した。次に、６ＭのＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）を含む変性剤を３倍量加え、６０℃で１５分間加熱した。この操作で可溶化したＤＮＡを５０％イソプロピルアルコールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、少量のＲＮａｓｅを添加し、混在する可能性のあるＲＮＡを分解した。
このヌクレオソームＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを図１３に示した。１５０ｂｐ付近に単一のバンドが見られ、モノヌクレオソームのＤＮＡが抽出されたことがわかる。
（実施例９）
ヌクレオソームＤＮＡのＥＬＩＳＡプレートへの固相化
実施例８で得られたヌクレオソームＤＮＡ、その母体であるＨＬ−６０細胞のゲノムＤＮＡ、及び、従来使用されてきた仔牛胸腺ＤＮＡをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。ＨＬ−６０細胞のゲノムＤＮＡは、前記細胞のクロマチンから、前記ヌクレオソームからのＤＮＡの抽出法に準じて抽出した。ゲノムＤＮＡの大きさは、ヌクレオソームＤＮＡがおよそ１５０ｂｐであるのに対して、およそ２０ｋｂｐであった。
次に、抗原の支持体としてポリスチレン製のマイクロタイタープレートＩｍｍｕｌｏｎ２ＨＢ（ダイネックステクノロジー社製 Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を用い、前記ＤＮＡを、該支持体に、０．５μｇ／ｍｌの濃度で０．２５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、それを２５ｎｇ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で一晩吸着させた。吸着後、過剰な抗原を一度吸引除去した後、ＮａＣｌ添加トリス緩衝液（２５ｍＭ トリス、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０４質量％ ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）（ＴＢＳ）で、４回洗浄した。１プレート当たり約１０ｍｌのＴＢＳを使用した。洗浄後、各ウエル当たり１００μｌのブロッキング溶液（２質量％スキムミルク（ディフコ社製 Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）含有ＴＢＳ）を加えて、一時間反応させ、抗原の付着していない部位を遮蔽した。最後に先の抗原吸着後の洗浄と同様にＴＢＳで４回洗浄することにより、抗原付着プレートを作製した。使用に供するまで、各ウエルにＴＢＳを１００μｌずつ加え、プレートシールで密閉し、４℃で保存した。
（実施例１０）
ＤＮＡプレートによる抗ＤＮＡ抗体の測定
ＳＬＥ患者１症例の血清について、実施例９の各マイクロタイタープレートにより、実施例６の抗ヌクレオソーム抗体測定と同様に、抗ＤＮＡ抗体の測定を行った。測定結果を図１４に表す。前記患者のヒトヌクレオソームＤＮＡに対する免疫応答は、仔牛胸腺ＤＮＡに対するより遥かに強いことが分かった。さらに、ヒトゲノムＤＮＡと比較してもヌクレオソームＤＮＡの方が免疫応答が強いことが分かった。この傾向は抗ＤＮＡ抗体価の高い他の３例のＳＬＥ患者症例でも認められた。
（実施例１１）
抗体の抑制実験
実施例１０で用いた血清につき、予め血清中の抗体を、抗原を用いて溶液中で吸収した後、抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体活性の測定を行う抑制実験を行った。抗原には、それぞれ、ヌクレオソームＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。抑制実験の結果を図１５に表す。抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体活性を４０％阻害するのに要する仔牛胸腺ＤＮＡの量はヌクレオソームＤＮＡの３倍であったことから、異種ＤＮＡの抗原性の弱さが明確になった。
同様の抑制実験を、マイクロタイタープレートをＰＬＬで前処理してからヌクレオソームＤＮＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）をマイクロタイタープレートに添加して作製したプレートについて行った。抑制実験の結果を図１６に表す。この場合は、抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体活性を４０％阻害するのに要する仔牛胸腺ＤＮＡの量はヌクレオソームＤＮＡの１．３倍とＰＬＬで前処理しないプレートの場合に比べて低く、異種ＤＮＡとの差が目立たなくなる。このことは、ＰＬＬによるＤＮＡ抗原構造の修飾によるものと考えられる。即ち、ＰＬＬで前処理したＤＮＡプレートにより測定された抗体活性が、ＤＮＡとＰＬＬとで新たに形成された未知の抗原に対する反応を含むため、本来のＤＮＡ抗原による抑制効果が目立たなくなったものと考えられる。
（実施例１２）
ＰＬＬで前処理せずにＤＮＡを付着させたプレートとＰＬＬで前処理してＤＮＡを付着させたプレートとの抗原性の差についてさらに調べた。
２４例のＳＬＥ患者の血清と、２４例の健常者の血清とについて、ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとＰＬＬで前処理してヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとにおいて抗ＤＮＡ抗体反応を測定した。また、それぞれのプレートでヌクレオソームＤＮＡ抗原を付着させないプレートにおいても抗ＤＮＡ抗体反応を測定した。ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートにおける測定結果を図１７に、ＰＬＬで前処理してヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートにおける測定結果を図１８に表す。
ＰＬＬで前処理したプレートでは、ヌクレオソームＤＮＡ抗原を付着させないプレート（図中−Ａｇ）に対するＳＬＥ患者の血清の反応性が高かった。また、ヌクレオソームＤＮＡ抗原を付着させたプレート（図中＋Ａｇ）に対する健常者の血清の反応性も高かった。このことから、ＰＬＬで前処理したプレートにおいては、非特異的反応が排除できないことが分かった。
前記ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとＰＬＬで前処理してヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートとにおいて、各々で測定された健常者の平均＋３ＳＤを正常域として、ＳＬＥ患者の測定値を比較した結果を図１９に表す。前者における陽性率が４１．６％（１０／２４）であったのに対し、後者における陽性率は１６．６％（４／２４）であり、ＰＬＬで前処理せずにヌクレオソームＤＮＡを付着させたプレートがＳＬＥの診断に関して格段に優れていることが明確になった。
これらのことから、ＰＬＬで前処理しないＤＮＡプレート、即ち、ＰＬＬを介さずに付着されたＤＮＡプレートがより正確にＤＮＡ抗原に対する免疫応答を測定することができ、ＳＬＥ等の正確な診断に用いることができることが明らかになった。
（実施例１３）
ヌクレオソームＤＮＡをプレートに直接吸着（コーティング）する場合の溶媒中のＮａＣｌ濃度と抗体反応度、つまり、コーティング効率について、抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体価の高い１例のＳＬＥ患者の血清を用いて調べた。
０．１４Ｍ、０．２５Ｍ及び０．５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝に、それぞれヌクレオソームＤＮＡ（０．５μｇ／ｍｌ）を溶解してプレートに吸着させた場合について、抗ＤＮＡ抗体の測定を行った。測定結果を図２０に表す。０．２５Ｍの場合が最も抗ＤＮＡ抗体の反応性がよく、コーティング効率がよいことが分かる。
さらに、２４例のＳＬＥ患者及び２４例の健常者を対象とした前記３種の濃度で作製されたプレートにおける抗ＤＮＡ抗体の測定を行った。０．１４ＭのＮａＣｌ濃度で作製したプレートの測定結果を図２１に、０．２５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したプレートの測定結果を図２２に、０．５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したプレートの測定結果を図２３にそれぞれ表す。０．２５Ｍ以上のＮａＣｌ濃度で作製したプレートにおいて、特に抗ＤＮＡ抗体の検出に優れていることが分かった。
本発明によると、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームを、形態安定性を維持し、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるモノヌクレオソームの製造方法、前記モノヌクレオソオームの製造方法により製造されたモノヌクレオソーム、取扱性に優れたモノヌクレオソーム製造用キット、モノヌクレオソーム分析、自己免疫病診断等に好適なヒストン検査方法、前記モノヌクレオソームを含む、ヌクレオソームに特異的で各種診断等に好適な抗体の測定方法、簡便かつ確実な自己免疫病診断方法、高性能で取扱性に優れた自己免疫病診断用キット、自己免疫病診断等をはじめ各種用途に好適なヌクレオソームＤＮＡを、簡便な操作で効率よく、しかも高純度で得ることができるヌクレオソームＤＮＡ製造方法、高性能で取扱性に優れたＤＮＡプレート、前記ＤＮＡプレートの効率的な製造方法、及び、自己免疫病診断等に好適な抗ＤＮＡ抗体測定法を提供することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、２Ｃ１０−核タンパク質複合体が捕獲されているプロテインＡカラムの洗浄液を濃縮し、そこから得たＤＮＡ抽出物を、２％アガロースゲル電気泳動した結果を示す写真である。
図２は、２Ｃ１０−プロテインＡカラム溶出液を濃縮し、スーパーデックス２００−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにて解析したヌクレオソームのプロファイル（マイクロコッカル・ヌクレアーゼ処理前）を示すグラフである。
図３は、図２のサンプルをマイクロコッカル・ヌクレアーゼ（ＭＮ）で処理した後のスーパーデックス２００−ＨＰＬＣクロマトグラフィーのプロファイル（モノヌクレオソームと、ＭＮで切断されたリンカーＤＮＡの形成がよくわかる）を示すグラフである。
図４は、図３のモノヌクレオソームに相当する部分（−）の、スーパーデックス２００−ＨＰＬＣによるリクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
図５は、培養細胞又は末梢リンパ球から得られたヌクレオソームのＳｎｐｅｒｄｅｘ２００−ＨＰＬＣによるリクロマトグラフィー（代表例）の結果を示すグラフである。
図６は、図５のモノヌクレオソームに相当する部分（−）の、スーパーデックス２００−ＨＰＬＣによるリクロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
図７は、アポトーシスを起こした培養細胞由来のモノヌクレオソームと、正常な培養細胞由来のモノヌクレオソームを０．５％アガロース電気泳動により分画した結果を示す写真である。
図８は、モノヌクレオソームを構成するＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示す写真である。
図９は、モノヌクレオソームを構成するコアヒストンを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画して解析した結果を示す写真である。
図１０は、正常な細胞由来の全ヒストン（Ｈ１を含む）の１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動像を示す写真である。
図１１は、ＥＬＩＳＡによるモノヌクレオソームに特異的な抗体の測定結果を示すグラフである。
図１２は、ＥＬＩＳＡによるモノヌクレオソームに特異的な抗体のサブクラス別測定結果を示すグラフである。
図１３は、ヌクレオソームＤＮＡをアガロース電気泳動した結果を示す写真である。
図１４は、ヌクレオソームＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び仔牛胸腺ＤＮＡをそれぞれＤＮＡ抗原とするＤＮＡプレートに対する、ＳＬＥ患者血清の免疫応答を示すグラフである。
図１５は、ＰＬＬ前処理なしのプレートにおける抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体反応の抑制効果を示すグラフである。
図１６は、ＰＬＬ前処理したプレートにおける抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体反応の抑制効果を示すグラフである。
図１７は、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレートにＰＬＬ前処理なしでヌクレオソームＤＮＡをコートしたプレート及びコートしないプレートに対するＳＬＥ患者血清の抗体反応を示す図である。
図１８は、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレートにＰＬＬ前処理してヌクレオソームＤＮＡをコートしたプレート及びコートしないプレートに対するＳＬＥ患者血清の抗体反応を示す図である。
図１９は、ＰＬＬ前処理の有無と抗ヌクレオソームＤＮＡ抗体価の関係を示す図である。
図２０は、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレートにヒトヌクレオソームＤＮＡをコーティングする場合のＮａＣｌ濃度の効果を抗ＤＮＡ抗体価により測定した結果を示すグラフである。
図２１は、０．１４ＭのＮａＣｌ濃度で作製したＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応の測定結果を示す図である。
図２２は、０．２５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応の測定結果を示す図である。
図２３は、０．５ＭのＮａＣｌ濃度で作製したＤＮＡプレートの抗ＤＮＡ抗体反応の測定結果を示す図である。Technical field
The present invention relates to a mononucleosome and a nucleosome DNA suitable for diagnosing an autoimmune disease, and a diagnostic method using any one of the mononucleosome and the nucleosome DNA, and more specifically, an efficient production of the mononucleosome and the nucleosome DNA. A method, a mononucleosome suitable for diagnosis and the like produced by the method for producing a mononucleosoam, a kit for producing a mononucleosome capable of effectively producing the mononucleosome, a histone inspection method useful for analysis of a mononucleosome, etc., A method for measuring an antibody specific to a nucleosome including a mononucleosome, a simple and reliable method for diagnosing an autoimmune disease, a kit for diagnosing an autoimmune disease excellent in handling, suitable for diagnosing an autoimmune disease having the nucleosome DNA DNA plate, Method for efficiently producing serial DNA plate, and to a suitable anti-DNA antibody assay in autoimmune diseases diagnosis.
Background art
Nucleosomes are unit structures that form the basic structure of chromatin (chromatin). The nucleosome is composed of a nucleosome core composed of 1.75 turns of DNA around a histone octamer, which is an aggregate of two molecules of histones H2a, H2b, H3, and H4, and a site at the beginning and end of winding of DNA. It is composed of one molecule of H1 histone bound. H2a, H2b, H3 and H4 histones mainly interact from the center of the molecule to the C-terminal side, and are ionically bound to DNA in the N-terminal region. Each nucleosome is linked to each other by a linker DNA, and is regularly arranged. When a nucleus isolated from a cell is treated with a nuclease, the linker DNA is cleaved, and a monomer (that is, a mononucleosome) and a multimer such as a dimer or a trimer are cut out in units of nucleosomes.
When the monomeric linker DNA is completely cleaved, H1 histone is released, and a cylindrical shape having a diameter of 11 nm and a height of 5, 5 nm containing an aggregate of four other histone molecules and 146 base pair DNA. Nucleosome core. It is thought that the nucleosomes are linked to form a fiber (nucleofilament) having a diameter of about 1 nm, and further have a higher-order structure to form a fiber having a diameter of 30 nm.
The concept and identity of the nucleosome are described in Kornberg, R .; D. The chromatin structure was defined by histone and DNA repeating units (Chromatin structure; a repeating unit of histones and DNA), Science, 184: 868-871 (1974), from which the history of nucleosome research began.
Separation and purification of nucleosomes are described in Kornberg, R .; D. Preparation of Nucleosomes and Chromatin (Preparation of Nucleosomes and Chromatin), Method Enzymol. 170: 3-14 (1989). In this method, a cell nucleus is separated from an organ or tissue, digested with a micrococcal nuclease (hereinafter abbreviated as MN), and the time required for the transfer from mononucleosome to polynucleosome by a sucrose concentration gradient / ultracentrifugation method. It is a classic method of separating by applying.
As a simplified version of the method of Kornberg et al., Widlund, H .; R. Et al; Identification and Characterization of Genomic Nucleosome-Positioning Sequences, J. Am. Mo. Biol. , 267: 807-817 (1997).
However, this method requires removal of histone H1 from chromatin, separation of MN-cleaved nucleosomes by agarose gel electrophoresis, and then cutting out the gel to extract nucleosomes, which makes the operation complicated. There was a problem that it took time. In addition, there is a problem that the recovery rate and purity of nucleosomes are low, and it is impossible to recover linker DNA.
In addition, as a result of detailed analysis of four types of monoclonal antibodies that were conventionally believed to be specific for double-stranded DNA, two types of anti-nucleosomes, two of which have stronger affinity for nucleosomes than double-stranded DNA, Antibodies (Christine Stemmer et al .; Dual Reactivity of Several Monoclonal Anti-Nucleosome Antibiotic Activity of Several Monoclonal Anti-Nucleosome Autoantibodies Against Double-Stranded DNA and Short Segments of Histone H3). (Stranded DNA and a short segment of histone H3), J. Biol. Chem., 271: 21257-21261 (1996). reference).
Frank, F.C. And Dornicova, J .; Nucleosomes Generated in Protein-Free Hybridoma Cell Culture Supernatants: Demonstration of Programmed Cell Death (Nucleosome Occurring in Protein-Free Hybridoma Cell-Culture: Evidence for Programmable Cell. 284: 285-287 (1991) report that an immune complex of a nucleosome and a monoclonal antibody is formed in a culture of an anti-DNA monoclonal antibody-producing hybridoma.
Recently, in relation to the production of anti-chromatin antibodies, which are considered to be important for the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE), which is a collagen disease, attention has been paid to the relationship with apoptosis in which cells are destroyed while retaining the nucleosome form. Have been. Even if blood cells are taken as an example, living organisms repeatedly live and die at least one million cells per minute. One death is apoptosis. The theory that nucleosomes derived from such apoptosis are acting as autoantigens for anti-nucleosome antibody production and anti-DNA antibody production has been noted (for review, see Amoura, Z. et al., SLE). Important role of nucleosomes in A. [The key role of nucleosomes in lnpus], Arthritis Rheum., 42: 833-843 (1999)).
Also, it has been reported that anti-nucleosome antibodies, along with anti-DNA antibodies, have very important clinical significance in early diagnosis and understanding of the pathology of systemic lupus erythematosus (Corristidis, GN et al., Nucleosome Glomerular incorporation: Evidence of receptor-mediated mesangial cell binding [Glomerular uptake of nucleosomes: evidence for receptor produced mesenical cell binding], Kidney Int, et al., Rel. The origin and production of anti-chromatin autoantibodies is based on T cell-dependent immunity with autoantigens [Genesis and evolution of antichr. M. autoantibodies in murine lupus implications T-dependent immunization with self antigen], J. Clin. Invest., 91: 1687-1696 (1993); When MRL / n exhibits proteinuria, the anti-nucleosome antibody is detected prior to the anti-DNA antibody and the anti-histone antibody [Nucleomesome-restricted antibodies are detected before-antisones-m-antisone-antisone-antisone-m-antisone-m-antisone-m-antisone-m-antisponto-m-antisone-m-antisone-m-antisone-m-antisone-m-antisone-miso-anti-Ms. / Lpr and + / + m ce with proteinuria], Arthritis Rheum, 37:. 1684-1688 (1994) reference).
Nucleosomes derived from apoptosis are ideal for accurate detection of anti-nucleosome autoantibodies. Structural details differ between nucleosomes obtained as a result of apoptosis that occurs spontaneously or pathologically, and nucleosomes obtained by artificially cleaving chromatin that retains a normal structure with endonuclease. it is conceivable that. When considering the autoimmune phenomenon, it is considered that nucleosomes obtained by apoptosis are variously modified and easily acquire so-called autoantigenicity. Therefore, the emergence of anti-nucleosome antibodies that have recently attracted attention in SLE, which is a typical autoimmune disease, is considered to be such modified nucleosomes serving as antigens. The body of the modified nucleosome may be a modification of a core histone, for example, phosphorylation, acetylation, methylation, ADP-ribosylation, glycosylation, ubiquitination and the like. If the modified nucleosome can be isolated with high purity, the state of modification can be retrieved from a change in mobility by 15-17% SDS-PAGE or 0.5% agarose gel electrophoresis.
In order to elucidate the mechanism of such an autoimmune disease, a method capable of isolating a modified nucleosome that can serve as an autoantigen with high purity and high yield is required. There was a problem that the method was insufficient.
On the other hand, as a method for diagnosing systemic autoimmune diseases, especially systemic lupus erythematosus (SLE), and measuring anti-DNA antibodies for grasping the pathological conditions, many methods have been tried in the past (Kanai ,: Metabolism, 20: 253-261, 1983). The list is shown in Table 1.

Among these methods, the Farr method has a reputation as an accurate measurement method.However, the Farr method requires that DNA antigens be labeled with a radioactive substance, and this method has the disadvantage that it cannot be measured except in advanced medical facilities. is there. In contrast, the ELISA method is frequently used at the laboratory level at present. Whereas the Farr method performs an antigen-antibody reaction in a liquid state, the ELISA method involves attaching an antigen to a plastic plate or the like. In order to efficiently attach a DNA antigen to a solid phase, a technique is generally used in which a plastic plate is previously coated with a basic protein, for example, poly-L-lysine (PLL), and then the DNA is attached.
However, when antibodies are measured by this method, it is ruled out that antibodies to nucleosome-like structures formed by ionic bonds between PLL and DNA or artificial antibodies against unknown antigens are included in the measured antibodies. There is a drawback that you can not.
A method for directly attaching to a plate without using a spacer such as PLL has been developed for accurate measurement of an anti-DNA antibody, but it has not been put to practical use yet.
As described above, nucleosomes derived from apoptosis act as autoantigens for the production of anti-DNA antibodies in connection with the production of anti-chromatin antibodies, mainly anti-DNA, which is considered to be important for the pathogenesis of SLE. The theory that there is is attracting attention (Amoura, Z. et al ,: Arthritis Rheum. 42: 833-843, 1999).
Thus, while it has been pointed out that human nucleosomes are self-antigens, at present anti-DNA antibody measurements are not human nucleosome DNA, but calf thymus-derived DNA and recombinant DNA are used as antigens, There was a problem that accurate diagnosis was not always possible. This is because it is not easy to prepare human nucleosome DNA as an antigen.
An object of the present invention is to solve the above-mentioned various problems and achieve the following objects. That is, the present invention provides a method for producing a mononucleosome, which is capable of obtaining nucleosomes suitable for various uses including autoimmune disease diagnosis and the like while maintaining morphological stability, efficiently by simple operation, and high purity. Mononucleosomes produced by the method for producing mononucleosoams, kits for producing mononucleosomes with excellent handling properties, mononucleosome analysis, histone inspection methods suitable for autoimmune disease diagnosis, etc., including the mononucleosomes, specific to nucleosomes Suitable for various uses, such as antibody measurement methods suitable for various diagnostics, simple and reliable autoimmune disease diagnostic methods, autoimmune disease diagnostic kits with high performance and excellent handling, autoimmune disease diagnostics, etc. Nucleosome DNA production that can obtain nucleosome DNA efficiently and with high purity by simple operation Law, excellent DNA plate handleability high performance, efficient method for producing the DNA plate, and aims to provide a suitable anti-DNA antibody assay in autoimmune diseases diagnosis.
Disclosure of the invention
The inventor of the present invention has earnestly studied to solve the above-mentioned problems, and as a result, has obtained the following knowledge. That is, the nucleosome is adsorbed to a protein A column or the like via an antibody specific to the nucleosome, and then eluted with a Tris buffer solution containing a high concentration of sodium chloride, and the nucleosome assembly is micrococcal It is a finding that mononucleosomes can be easily and efficiently produced with high purity by recovering only mononucleosomes by HPLC or the like after treatment with nuclease or the like to obtain mononucleosomes.
The present invention is based on the above findings by the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is,
<1> a capture collection step of capturing and collecting nucleosomes contained in a sample by using an antibody specific to the nucleosomes;
A dissociation and recovery step of dissociating and recovering the captured nucleosome from the antibody,
An isolation and purification step of isolating and purifying mononucleosomes from the recovered nucleosomes based on molecular weight,
And a method for producing a mononucleosome.
<2> The method for producing a mononucleosome according to <1>, wherein the antibody is at least one selected from an anti-nucleosome antibody, an anti-DNA antibody, and an anti-histone antibody.
<3> The method for producing a mononucleosome according to <1> or <2>, wherein the antibody has an antigen-binding ability at a salt concentration of 140 mM.
<4> the antibody, wherein the antibody has an amino acid sequence of the variable region of 2C10 or an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and has the antigen specificity of 2C10. The method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <3>.
<5> The method for producing a mononucleosome according to <4>, wherein the antibody is 2C10.
<6> The production of the mononucleosome according to any one of <1> to <5>, wherein in the capture collection step, the antibody is bound to a solid phase having affinity for the antibody so that the antibody captures nucleosomes. Is the way.
<7> The method for producing a mononucleosome according to <6>, wherein the solid phase is a protein A column.
<8> The method according to any one of <1> to <5>, wherein, in the capture and collection step, the antibody is previously bound to a solid phase, and the sample is brought into contact with the solid phase, whereby the antibody captures nucleosomes. Is a method for producing a mononucleosome.
<9> The method according to any one of <1> to <8>, wherein, in the isolation and purification step, a fraction having a molecular weight of 200,000 to 250,000 is collected using a gel filtration column to isolate and purify the mononucleosome. This is a method for producing a mononucleosome.
<10> The method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <9>, wherein the nucleosome is treated with a nuclease capable of cleaving into mononucleosome units before the capture collection step.
<11> The method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <9>, wherein the nucleosome is treated with a nuclease capable of cleaving into mononucleosome units after the dissociation recovery step and before the isolation and purification step.
<12> The method for producing a mononucleosome according to <10> or <11>, wherein the nuclease is a micrococcal nuclease.
<13> a step of crushing the cells in a solution having a low salt concentration and releasing nucleosomes into the solution;
A collection step of collecting the nucleosome,
A nuclease treatment step of suspending the collected nucleosomes in a solution having a low salt concentration and treating with a nuclease that can be cleaved into mononucleosome units,
An isolation and purification step of producing a mononucleosome from the solution after the nuclease treatment using an antibody specific to the nucleosome and / or based on the molecular weight;
And a method for producing a mononucleosome.
<14> The method for producing a mononucleosome according to <13>, wherein the antibody used in the isolation and purification step is 2C10.
<15> The method for producing a mononucleosome according to <13> or <14>, wherein in the isolation and purification step, a fraction having a molecular weight of 200,000 to 250,000 is separated using a gel filtration column.
<16> A mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <15>.
<17> The mononucleosome according to <16>, having a purity of 98% or more.
<18> an antibody specific to the nucleosome for capturing and collecting the nucleosome contained in the sample,
A column for isolating mononucleosomes from the captured and collected nucleosomes based on molecular weight,
It is a kit for producing a mononucleosome, comprising:
<19> The kit for producing a mononucleosome according to <18>, wherein the antibody is 2C10.
<20> A test histone is recovered from a mononucleosome obtained from a test sample by the method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <15>, and an electrophoresis pattern of the test histone and a control histone are obtained. A method for testing histones, comprising comparing the electrophoresis pattern with a histone pattern.
<21> a solid phase immobilizing step of immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <15>,
A reaction step of reacting the test sample with the immobilized mononucleosome,
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome,
And a method for measuring an antibody specific to a nucleosome.
<22> The method for measuring an antibody specific to a nucleosome according to <21>, wherein the mononucleosome is a nucleosome derived from apoptosis.
<23> The method for measuring an antibody specific to a nucleosome according to <21> or <22>, wherein the test sample is serum or plasma of an autoimmune disease patient.
<24> In the solid phase immobilization step, the immobilized mononucleosome is blocked with a blocking solution containing at least skim milk, and in the reaction step, the sample is diluted with at least a reaction solution containing skim milk, and the sample is diluted with the solid phase. The method for measuring an antibody specific to a nucleosome according to any one of <21> to <23>, wherein the antibody is reacted with the converted mononucleosome.
<25> The reaction solution is Tris, NaCl, NaN ₃ The method for measuring an antibody specific to a nucleosome according to <24>, wherein the antibody comprises serum albumin, skim milk, and EDTA.
<26> The method for measuring a nucleosome-specific antibody according to any one of <21> to <25>, wherein in the measurement step, an anti-human antibody recognizing an IgG subclass is reacted as a secondary antibody.
<27> a solid phase immobilizing step of immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <15>,
A reaction step of reacting the test sample with the immobilized mononucleosome,
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome,
An evaluation step of evaluating the antibody titer,
A method for diagnosing an autoimmune disease, comprising:
<28> Including a solid phase obtained by immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <12>, a buffer, and any one of a plate and a column A kit for diagnosing an autoimmune disease, characterized in that:
<29> a capture collection step of capturing and collecting nucleosomes contained in the sample using an antibody specific to the nucleosome;
A dissociation and recovery step of dissociating and recovering the captured nucleosome from the antibody,
An isolation and purification step of isolating and purifying mononucleosomes from the recovered nucleosomes based on molecular weight,
A nucleosome DNA isolation / purification step of isolating / purifying nucleosome DNA from the isolated / purified mononucleosome,
A method for producing nucleosomal DNA comprising:
<30> a mononucleosome production process comprising the method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <15>,
And a step of isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes.
<31> A nucleosome DNA produced by the method for producing nucleosome DNA according to <29> or <30>, wherein the nucleosome DNA derived from human is immobilized on a plate. Plate.
<32> A DNA comprising the mononucleosome according to <16> or <17>, wherein the nucleosome DNA isolated and purified from a human-derived mononucleosome is immobilized on a plate. Plate.
<33> The DNA plate according to <31> or <32>, wherein the nucleosome DNA is a double-stranded nucleosome DNA, and the average chain length of the nucleosome DNA is 145 bp to 200 bp.
<34> The DNA plate according to any one of <31> to <33>, wherein the nucleosome DNA is directly immobilized on the plate.
<35> The DNA plate according to any one of <31> to <34>, wherein the plate comprises polystyrene.
<36> The method for producing a mononucleosome according to any one of <1> to <15>, wherein the sample is a human-derived sample;
A nucleosome DNA isolation and purification step of isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes,
Immobilizing step of immobilizing the nucleosome DNA on a plate,
A method for producing a DNA plate, comprising:
<37> In the solid phase immobilization step, the nucleosomal DNA is added to the plate by dissolving it in either Tris buffer or boric acid-caustic soda buffer containing 0.1 M to 1.0 M NaCl. 36>.
<38> A nucleosome DNA produced by the nucleosome DNA production method according to <29> or <30>, which is a human-derived nucleosome DNA, comprising 0.1 M to 1.0 M NaCl on the plate. A DNA plate manufacturing method characterized by dissolving in any one of Tris buffer solution and boric acid-caustic soda buffer solution and adding the resulting solution to solid phase.
<39> The DNA plate according to any one of <31> to <35>,
A reaction step of reacting the test sample with nucleosomal DNA immobilized on the DNA plate;
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the nucleosome DNA,
And a method for measuring anti-DNA antibodies.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(Method for producing mononucleosome)
The method for producing a mononucleosome of the present invention comprises a capture and collection step of capturing and collecting nucleosomes contained in a sample with an antibody specific to the nucleosome.
A dissociation and recovery step of dissociating and recovering the captured nucleosome from the antibody,
Isolating and purifying mononucleosomes from the recovered nucleosomes based on molecular weight.
In the present invention, the term “nucleosome” means not only a monomer (mononucleosome) having nucleosomes as a unit, but also multimers such as dimers and trimers, a mixture thereof, and further, all nucleosomes. A containing sample (ie, nucleosome source) is also meant.
Examples of the nucleosome-containing sample include, for example, those obtained by separating cell nuclei from cells directly separated from human or animal organs or tissues, those obtained by separating cell nuclei from general cultured cells, and cultured cells secreting nucleosomes (KML ₁ -7 cells (Kanai, Y. et al. Purification of a novel B cell growth and differentiation factor associated with the lupus Syndrome, Syndrome, Immunol., L.L., 3292-Lol, 3292-L. et al .: Continuous growth and differentiation of human myloid cells in suspension culture. Nature, 270: 347-349, 1997), and the like.
In the present invention, "mononucleosome" refers to a nucleosome monomer composed of about 146 base pairs of double-stranded DNA and core histones (H3, H2B, H2A and H4).
The capturing and collecting step is a step of capturing and collecting nucleosomes contained in a sample using an antibody specific to the nucleosome.
In the present invention, the term “antibody specific to nucleosomes (hereinafter, sometimes simply referred to as“ antibody ”)” means an antibody that shows a specific reaction to a nucleosome which is a complex of DNA and histone, It may be any as long as it can form an immune complex with the nucleosome itself, a double-stranded DNA constituting the nucleosome, or a histone constituting the nucleosome, It may be one that shows a specific reaction with nucleosomes and also shows a reaction with a single-stranded double-stranded DNA or a single histone. Antibodies specific to the nucleosomes also include known antibodies that were believed to be specific for double-stranded DNA, but rather were found to have higher affinity for nucleosomes. The antibody specific to the nucleosome is preferably one that reacts more strongly with the nucleosome than double-stranded DNA, and one that can be adsorbed to an affinity column such as a protein A column via Fc of the antibody.
Examples of the affinity column include, in addition to protein A, Pharmacia Biotech (PB) Hitaffinity column and the like. Specifically, a 1 ml or 5 ml column of Hitrap NHS-activated is preferably used. The method for adsorbing (coupling) the antibody specific to the nucleosome to the affinity column is not particularly limited. When 2C10 described later is used as the antibody, for example, a coupling buffer (0. 2M NaHCO ₃ /0.5M sodium chloride, pH 8.3) to adjust 2C10 to 0.5-1.0 mg / ml. The operation after adsorption coupling is performed according to the protocol specified for each affinity column. It can be performed according to.
The antibody specific to the nucleosome is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Monoclonal antibody 2C10 (belonging to IgG2b, which is an autoantibody produced by an MRL / lpr mouse-derived B-cell hybridoma, which is known as an autoimmune disease model, is preferable in that proteins non-specifically bound to the column can be removed. ) Is particularly preferred in that it has an antigen binding ability even at a high salt concentration.
The monoclonal antibody 2C10 is specific for double-stranded DNA (see Kubota, T. et al., Immunol. Lett. 14: 53-58, 1986) and was made by the group of the present inventors. , And the production method thereof is described in the above-mentioned Immunol lett. For details on properties and the like, see Kubota, T., et al., Enhancement of oxidative cleavage of DNA by the binding sites of DNA by the binding site of two anti-double-stranded DNA antibodies (Enhancement of oxidative cleavage of DNA by the binding sites). of two anti-double-stranded DNA antibodies). Biol. Chem. 271: 6555-6561 (1996).
The amino acid sequence of the variable region of the light chain of the monoclonal antibody 2C10 has been identified as follows (Jang YJ, Stollar BD, et al., Mol Immunol 1998 Dec; 35 (18): 1207-1217).

Those having the antigen specificity of the monoclonal antibody 2C10 include, for example, a humanized antibody having a variable region of 2C10, and one to about twenty, more easily, one or several amino acids of the variable region of 2C10. A person skilled in the art can easily obtain a mutant by deleting, substituting or adding the above. Antibodies specific to nucleosomes including the mononucleosome also include the variants.
The method for producing the monoclonal antibody 2C10 is briefly described below.
The spleen of a 6-month-old MRL / lpr mouse was minced with an ophthalmic scalpel in a plastic dish containing a culture solution (DMEM), and then crushed with a frosted surface of two slide glasses. Release lymphocytes from connective tissue. Centrifuge the floating cells after a few minutes. Immediately, cell fusion between mouse myeloma cells (SP2) and lymphocytes is performed for 2 minutes in the presence of 44.4% by mass polyethylene glycol (PEG). Immediately after the fusion, PEG was diluted and removed with a culture solution, and finally, the medium was replaced with a selection medium, HAT. ₂ Incubator (5 mass% CO ₂ In the presence). Two weeks later, the anti-DNA antibody titer of the culture supernatant of each well in which the colonies grew was measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), and the 2C10 hybridoma in the well having a high anti-DNA antibody titer was selected. The monoclonal antibody 2C10 can be obtained by appropriately culturing the 2C10 hybridoma (T. Kubota et al., Immuno lett., 14: 53-58, 1986/1987).
Next, the properties of the monoclonal antibody 2C10 will be briefly described below.
The monoclonal antibody 2C10 reacts with the double-stranded portion in the single-stranded DNA, but has a strong affinity for the ΦX174 plasmid DNA, which is a template of the double-stranded DNA, and has the A · T of the base sequence. Preferred and excellent anti-double stranded DNA antibody.
Incidentally, the monoclonal antibody 2C10 was previously considered to be specific for double-stranded DNA, but in the research up to the present invention, in the process of purifying the anti-double-stranded DNA antibody using a protein A column, It was found that it has strong affinity not only for double-stranded DNA but also for nucleosomes. Therefore, in the method for producing a mononucleosome of the present invention, not only an antibody specific to double-stranded DNA, but also an antibody specific to nucleosome, or an antibody specific to both double-stranded DNA and nucleosome is used. It is thought that it is possible.
The “protein A column” is a column in which protein A, which is a protein having a molecular weight of 42,000 and derived from the bacteria wall of Staphylococcus aureus, is immobilized on a column. Since the protein A binds to a constant region (Fc fragment) of IgG, it can bind to an immune complex without interfering with an antigen-antibody reaction. Utilizing this property, the protein A column method for capturing an immune complex with the protein A is an established method for purifying IgG. Examples of commercially available protein A columns that can be used in the present invention include Hitwrap Protein A columns (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
In the present invention, the antibody serving as a medium for adsorbing nucleosomes to a column such as a protein A column may be present in a free form in a solution such as a culture solution containing nucleosomes, or may be a column such as a protein A column. May be fixed in advance. The column may be a carrier column other than the protein A column. When the antibody is present in the liquid in a free form, after forming an immune complex in the solution, the formed immune complex is passed through a column such as a protein A column, whereby the antibody Adsorbed to the protein A column via the moiety. When the antibody is immobilized on a protein A column or a suitable carrier column, by flowing a solution containing the nucleosome through the column, the nucleosome is adsorbed via the antibody immobilized on the protein A column. Can be.
As a method for immobilizing the antibody on the protein A column, a conventionally known method can be used. Specifically, the protein A column is equilibrated with a buffer mainly composed of Tris in a pH range of 6.8 to 8.3, and the antibody or the antibody-nucleosome complex which has been equilibrated with the same buffer in advance flows into the column. After circulating it several times over the same column, the column is washed with Tris buffer without antibody or antibody-immune complex. The column passing solution after washing is A ₂₆₀ = 0.0 is preferred.
When the nucleosome and the antibody (immune complex) are contained in the culture supernatant or the like, it is preferable to concentrate the supernatant by a means such as ultrafiltration before pouring the supernatant into the protein A column. By performing the concentration, more efficient production of mononucleosomes can be achieved. When concentration is performed by ultrafiltration, for example, a diaflow membrane (PH30) (manufactured by Millipore) having a molecular weight of 30,000 cutoff can be used.
The dissociation and recovery step is a step of dissociating and recovering the nucleosomes captured and collected in the capture and collection step from the antibody. The dissociation and recovery can be performed by dissociating the nucleosome-specific antibody with the nucleosome using a high-concentration sodium chloride solution or the like. As a result, only the nucleosome can be separated.
The eluate used to dissociate nucleosomes can be appropriately selected according to the purpose, and for example, the concentration of sodium chloride is about 0.8 to 1.2 M, preferably 0.6 to 0.1 M. 8M, particularly preferably 1.2M, and a buffer having a pH of about pH 4.5 to 9.0, preferably pH 6 to 8, and particularly preferably pH 7 to 7.5. Specifically, a Tris buffer having a concentration of about 25 to 100 mM, preferably 25 to 75 mM, and particularly preferably 25 to 50 mM is suitably exemplified.
The type of salt and the type of buffer in the eluate are not particularly limited and can be appropriately selected. In addition to the above, examples include a phosphate buffer and a carbonate buffer.
Before dissociating nucleosomes from a carrier such as a protein A column, it is essential to completely remove the proteins non-specifically bound to the column by washing. The washing solution used at that time includes, for example, Tris buffer (25 mM Tris, 140 mM sodium chloride, pH 7.4) and the like, and the concentration, kind of salt, pH and the like can be appropriately adjusted depending on various conditions. Whether or not the non-specific binding protein has been completely removed can be confirmed, for example, by the absorbance at 260 nm being 0.00.
2C10-chromatin complex bound to protein A (2C10 hybridoma itself) or a protein A column to which 2C10 has been previously bound or a culture supernatant bound to an affinity column to which 2C10 has been covalently immobilized. Of nucleosomes (from monomers to oligos or polymers) are prepared in a Tris buffer (25 mM Tris, 0.04% by mass NaN) containing 1.2 M sodium chloride. ₃ , PH 7.4) (hereinafter referred to as buffer B) as an eluent. The eluate is concentrated using an ultra-free membrane (molecular weight cut off 30,000, Millipore) and equilibrated with Tris buffer A containing 0.25 M sodium chloride (hereinafter referred to as “buffer C”). HPLC using a superdex 200 column can separate only mononucleosomes. However, the culture supernatant contains much more oligomers and polymers than that, and in order to recover the monomer efficiently, the eluate (after concentration) in buffer A is digested with micrococcal nuclease (MN). Then, the reaction is stopped after making the monomer as much as possible. Preferably, the monomers are separated by the HPLC. At this time, the linker DNA connecting the nucleosomes, which could not be recovered by the conventional sucrose concentration gradient ultracentrifugation method or the gel excision method, is also eluted at a molecular weight of about 10K by this chromatography (FIG. 3). This cleaved linker DNA is most suitable for cloning to know genetic information.
The isolation and purification step is a step of isolating and purifying mononucleosomes from the mononucleosomes recovered in the dissociation and recovery step based on the molecular weight.Specifically, a protein A column eluate containing nucleosomes is optionally purified by nucleosomes. Is digested with a nuclease capable of cleaving into mononucleosome units (for example, micrococcal nuclease (MN) or the like), and then the mononucleosome is purified from the collected nucleosomes based on the molecular weight.
The purification based on the molecular weight can be performed by, for example, recovering only the mononucleosome in high yield using high performance liquid chromatography (HPLC), or using a gel filtration column to remove the molecular weight from 200,000 to 25,000. This can be done by collecting 10,000 fractions.
The HPLC column is preferably a column capable of separating a molecular weight of 10,000 to 1,000,000. For example, a column of Superdex 200 (Superdex200) (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), a column of Superdex100 (Superdex100) ( Amersham Pharmacia Biotex Co., Ltd.).
The HPLC developing solvent has a sodium chloride concentration of about 140 to 1200 mM, preferably 250 mM; a concentration of sodium azide or the like is about 0.02 to 0.1% by mass, preferably 0.04% by mass. A 25% to 75 mM, preferably 25 mM, Tris buffer solution (pH 6.8 to 8.3, preferably pH 7,4), which is a mass%, is exemplified. The concentration, pH and the like can be appropriately selected according to the purpose.
After equilibrating the HPLC column with the above-mentioned developing solvent, the eluate of the protein A column is allowed to flow, and the mononucleosome peak fraction is collected to obtain an isolated and purified mononucleosome. The protein concentration of the mononucleosome for storage is preferably about 100 to 1000 μg / ml, and preferably 500 μg / ml when measured with a BCA protein assay kit (manufactured by PIERCE) using bovine serum albumin as a standard. Is more preferred.
Mononucleosomes were detected by 15% SDS-PAGE electrophoresis to identify core histones H3, H2a, H2b, H4 and their modified products, excluding H1, and to collect DNA only when the size of DNA extracted from nucleosomes was 150 to 200 bp. This can be done by confirming what is done by 1 to 2% agarose gel electrophoresis.
Although a certain amount of mononucleosomes can be recovered by directly subjecting the eluate of the protein A column to HPLC, it is preferable that the eluate be treated (digested) with micrococcal nuclease (MN) before the eluate. Thereby, the recovery rate of mononucleosomes can be significantly increased by decomposing the polymerized nucleosomes into mononucleosomes. Examples of micrococcal nuclease (MN) that can be used for digestion of the eluate include micrococcal nuclease EC 3.13.11 (manufactured by Sigma). The concentration of the solution containing the nucleosome to be digested is preferably about 1 to 100 units / ml, more preferably about 5 to 50 units / ml.
Digestion with micrococcal nuclease requires Ca ²⁺ About 1 to 10 mM, preferably 2.5 mM, and 0.25 to 1 U, preferably 0.5 U of micrococcal nuclease (MN), and added at 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C. for 45 to 120 minutes. , Preferably by keeping it warm for 60 minutes. The reaction volume can be set as appropriate, for example, 200 μl. Immediately after the completion of the incubation, 5 mM (EGTA) is added to inactivate the micrococcal nuclease to stop the reaction. The insoluble matter is removed with a microfuge (13 K rpm, 5 minutes), and the supernatant is subjected to HPLC to perform an isolation and purification step.
When the antibody is immobilized on the protein A column, the sample containing nucleosomes may be treated (digested) with a micrococcal nuclease before the capture and collection step. As a result, it is possible to increase the recovery of mononucleosomes as in the case of treating (digesting) before the isolation and purification step.
The purity of the mononucleosome obtained by the present invention is usually 95% by mass or more, preferably 99% by mass or more. It should be noted that the thing contained in the obtained mononucleosome peak fraction is a mononucleosome, which means that DNA extracted from the fraction by the method of Ishizaka et al. (Ishizaka et al., Nucleic Acid Res., 19: 5792, 1991). Is detected in a concentration of 150 to 200 base pairs by 2% by mass agarose gel electrophoresis, and only core histones (histones H3, H2B, H2A, and H4) are detected by 15% by mass SDS-PAGE. , Histone H1 is not detected.
In the method for producing a mononucleosome of the present invention, since the separation of the mononucleosome is extremely strict, the purity of the DNA separated from the obtained nucleosome is high, which contributes to the efficiency of cloning for obtaining the genetic information. Can be.
The method for producing mononucleosomes of the present invention can produce modified nucleosomes, which are attracting attention in autoimmune diseases and the like, and can contribute to elucidation of the mechanisms of those diseases, the physiological significance of apoptosis, etc. Also has great significance.
In addition, as part of the genome project, elucidation of disease susceptibility and drug resistance has been promoted on a large scale in terms of single-nucleotide polymorphism (SNP). However, it covers the entire genome and requires enormous manpower and money. On the other hand, the analysis of SNP in nucleosome units is considered to be lower cost and more efficient. Therefore, in performing SNP analysis in units of nucleosomes, the method for producing mononucleosomes of the present invention can greatly contribute.
As another embodiment of the method for producing a mononucleosome of the present invention, a cell is crushed in a solution having a low salt concentration, and a releasing step of releasing nucleosomes into the solution,
A collection step of collecting the nucleosome,
A nuclease treatment step of suspending the collected nucleosomes in a solution having a low salt concentration and treating with a nuclease that can be cleaved into mononucleosome units,
An isolation and purification step of producing a mononucleosome from the solution after the nuclease treatment using an antibody specific to the nucleosome and / or based on the molecular weight.
When producing mononucleosomes from cells that do not release nucleosomes into the culture medium under normal conditions, the mononucleosomes may be isolated after releasing the nucleosomes into the solution by the release step. The nuclease treatment step can be performed in the same manner as the treatment (digestion) using the nuclease, and the isolation and purification step can be performed as described above.
(Mononucleosome)
The mononucleosome of the present invention is produced by the method for producing a mononucleosome of the present invention.
Since the mononucleosome of the present invention is produced under strict conditions, the purity is usually as high as 95% by mass or more, preferably 99% by mass or more, excellent in storage stability, and well maintaining the original form of the mononucleosome. (Excellent in form retention). Therefore, it can be suitably used for various measurements and diagnoses.
Further, the mononucleosome of the present invention can be stably stored for a long period of time. Specifically, Tris, NaCl and NaN ₃ At 4 ° C. in Tris buffer (TBS) supplemented with NaCl, or in TBS containing 1% by weight bovine serum albumin (BSA), 0.4% by weight skim milk, 10% by weight Block Ace, and 1 mM EDTA. Even after storage for 2 months, the mononucleosome still maintained its antigenicity. Nucleosomes are generally of low stability and are destroyed on freezing, which is a great advantage.
In addition, a mononucleosome derived from apoptosis retains the modification by apoptosis and easily acquires self-antigenicity, and thus can be particularly suitably used for antibody measurement (autoimmune disease diagnosis) of an autoimmune disease patient.
(Mononucleosome production kit)
The kit for producing a mononucleosome of the present invention is an antibody specific to the nucleosome for capturing and collecting the nucleosome contained in the sample,
A column for isolating mononucleosomes from captured and collected nucleosomes based on molecular weight.
By using the kit for producing a mononucleosome of the present invention in the method for producing a mononucleosome of the present invention, a mononucleosome that is suitable for various uses including mononucleosome analysis, autoimmune disease diagnosis, etc., and has excellent storage stability, It can be easily and efficiently produced with good form stability and high purity.
(Histone inspection method)
The histone test method of the present invention comprises recovering a test histone from a mononucleosome obtained by the method for producing a mononucleosome of the present invention, and comparing the electrophoretic pattern of the test histone with the electrophoretic pattern of a control histone. Including.
In an autoimmune phenomenon in an autoimmune disease, a nucleosome modified by apoptosis is considered to be an antigen, and the main body of the modified nucleosome is considered to be a core histone modification. Therefore, by examining the modification of the core histone of the mononucleosome, the state of modification of the nucleosome can be grasped and used for diagnosis and elucidation of an autoimmune disease.
In the histone test method, specifically, a mononucleosome obtained from a test sample by the method for producing a mononucleosome of the present invention is analyzed by SDS-PAGE. This analysis can be performed by comparing the analysis results of histones obtained from normal cells by SDS-PAGE.
(Method for measuring antibodies specific to nucleosomes)
Immobilizing step of immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome of the present invention,
A reaction step of reacting the test sample with the immobilized mononucleosome,
Measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome.
In the solid phase immobilization step, a mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome of the present invention is used. This mononucleosome has a high purity of usually 95% by mass or more, preferably 99% by mass or more, and retains the shape of the mononucleosome well (excellent in shape stability). Therefore, it is suitable as an antigen against a nucleosome-specific antibody.
In addition, a mononucleosome derived from apoptosis obtained by the method for producing a mononucleosome of the present invention retains the modification by apoptosis and easily acquires autoantigenicity, and thus is particularly suitable for antibody measurement of a patient with an autoimmune disease. It is.
The mononucleosome immobilization buffer is not particularly limited and may be appropriately selected as long as it does not change the form of the mononucleosome. For example, a 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) is used. be able to.
The solid phase used in the solid phase immobilization step is not particularly limited as long as it can immobilize mononucleosomes, and can be appropriately selected. For example, a polystyrene microtiter plate Immulon2HB (manufactured by Dynex Technology Co., Ltd.) Dynex Technologies, Chantilly, VA) and the like can be suitably used. The conditions for the immobilization of the mononucleosome can be appropriately selected depending on the type of the solid phase and the like, and specific examples of the immobilization include using the polystyrene microtiter plate as the solid phase. In this case, it was adsorbed overnight at 4 ° C. at a concentration of 1 μg / ml via poly-L-lysine (PLL) (1 μg / ml distilled water) which has been conventionally used for adsorbing dsDNA antigen to a plate. A method in which excess antigen is once removed by suction and then washed with NaCl-added Tris buffer is preferably used.
In the solid phase immobilization step, to block the non-immobilized mononucleosome solid phase, to prevent non-specific reaction, after immobilizing the mononucleosome to the solid phase, blocking the solid phase with a blocking solution Is preferred. Since nucleosomes have a complex higher-order structure, they are particularly affected by nonspecific reactions, and play a large role in blocking. The blocking can be performed by reacting the solid phase and the blocking solution and then washing the solid phase and the blocking solution. As the blocking solution, a solution containing at least skim milk is preferable, and Tris, NaCl and NaN ₃ A solution containing 0.1 to 0.3% by mass of skim milk in a NaCl-added Tris buffer (TBS) consisting of
When the reaction step is not started immediately after the solid phase immobilization step, TBS or a reaction solution described below is added to each well, sealed with a plate seal, and stored at 4 ° C.
The reaction step is a step in which a test sample is reacted with the immobilized mononucleosome, and the test sample is preferably serum or plasma of a healthy person or patient, and is a disease such as an autoimmune disease. Serum or plasma of a patient suspected of having an autoimmune disease is particularly preferred in that it can be used for the diagnosis of the disease.
The method of reacting the sample with the mononucleosome is not particularly limited and may be appropriately selected as long as the method allows an antibody specific to the nucleosome in the sample to bind to the mononucleosome. For example, when the microtiter plate is used, the method can be performed by diluting a sample with a reaction solution, reacting the sample with shaking, removing by suction after the reaction, and washing.
The reaction solution for diluting the sample preferably contains skim milk from the viewpoint of preventing the non-specific reaction, and preferably contains 1% by mass bovine serum albumin (BSA), 0.4% by mass skim milk, and 10% by mass block. Ace is particularly preferred, which is TBS containing 1 mM EDTA. The BSA is preferably albumin fraction V (Albumin, Fraction V, Boehringer Mannheim, Germany, Boehringer Mannheim), the block ace is preferably Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., and the EDTA is EDTA disodium salt (Dohjin Chemical Co., Ltd.). Is preferred.
The measurement step is a step of measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome, but is not particularly limited as long as the antibody that binds to the mononucleosome can be measured, and can be appropriately selected according to the purpose. it can. In the measurement step, a secondary antibody that recognizes an antibody that binds to the mononucleosome may be measured instead of the antibody. For example, when the microtiter plate is used, immediately after the washing, an alkaline phosphatase (AP) conjugated anti-human IgG antibody (goat) dilution is added to each well, shaken, washed, and then washed. p-Nitrophenyl phosphate (PNP) (Sigma, St. Louis, MO) reagent is added to each well, and a shaking reaction is again performed to develop a color. The color is measured by measuring the degree of color development (absorbance) immediately after the reaction at an absorption wavelength of 405 nm using an auto-reader. A control or a blind test is an absorbance obtained when serum or plasma is not added in the above series of reaction systems, and a value obtained by subtracting this from the absorbance in each sample is an actually measured value. Although the antibody titer can be represented as an actual measured value of the absorbance, it is preferable that a standard curve is prepared in advance with a high-titer serum, and the antibody titer in the sample is displayed in units of units in comparison with the standard curve.
The measurement step may also include a step of reacting an anti-human antibody recognizing an IgG subclass as a secondary antibody. In this case, measurement of an antibody for each subclass is particularly preferable.
That is, there are four subclasses of IgG antibodies, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, and the deviation of the subclass of the nucleosome-specific antibody of the patient may characterize the disease pathology. Therefore, if the antibody for each subclass can be measured, the disease state can be better understood.
For the measurement of the antibody by subclass, for example, a biotin-labeled anti-human subclass antibody (mouse) (Zymed, San Francisco, CA) is used instead of the alkaline phosphatase (AP) conjugated anti-human IgG antibody (goat). After the reaction and washing, alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Zymed, San Francisco, Calif.) Is reacted, and PNP as a substrate is added in the same manner as described above to cause color development, and absorbance can be measured with an autoreader.
The method for measuring an antibody specific to a nucleosome of the present invention uses a mononucleosome having a high purity and a well-preserved original form. This is an extremely accurate measurement method that always shows a low antibody titer when the antigen is negative. Also, if necessary, the composition of the blocking agent and the reaction solution can be adjusted to prevent the nonspecific reaction and reduce the background threshold. Further, if necessary, the condition of an autoimmune disease patient such as SLE can be analyzed in more detail by measuring the antibody for each subclass.
The method for measuring an antibody specific to a nucleosome of the present invention can measure an antibody specific to a nucleosome with extremely high accuracy, and is used for diagnosis of autoimmune diseases, particularly SLE, lupus nephritis, vasculitis, CNS lupus, and child SLE It is extremely effective for diagnosis of
(Diagnostic method for autoimmune diseases)
The method for diagnosing an autoimmune disease of the present invention is a solid-phase immobilizing step of immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome of the present invention,
A reaction step of reacting the sample with the immobilized mononucleosome,
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome,
Evaluating the antibody titer.
In the method for diagnosing an autoimmune disease, a nucleosome-specific antibody is measured by the method described in the method for measuring a nucleosome-specific antibody, and the measured antibody titer is evaluated. In the evaluation of the antibody titer, for example, a positive value or a negative value can be evaluated based on whether the value exceeds a predetermined threshold value by, for example, three times the average value + the standard deviation.
Further, an anti-human antibody that recognizes an IgG subclass is used as a secondary antibody, and a nucleosome-specific antibody is measured for each IgG subclass, and the antibody titer is determined for each predetermined IgG subclass. It is also possible to evaluate whether the threshold is exceeded. In addition, the evaluation can be performed by analyzing the antibody titer pattern for each subclass. The assessment by subclass is more representative of the condition.
(Autoimmune disease diagnostic kit)
The kit for diagnosing an autoimmune disease of the present invention includes a solid phase obtained by immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome of the present invention, a buffer, and any one of a plate and a column.
The autoimmune disease diagnostic kit is produced by the method for producing a mononucleosome of the present invention, and contains a mononucleosome having excellent morphological stability in high purity, so that it is possible to measure a nucleosome-specific antibody with extremely high accuracy. It is very effective in diagnosing autoimmune diseases, especially SLE. Further, the autoimmune test kit can be hermetically sealed by filling with a buffer solution, and is excellent in storage stability because the storage stability of the nucleosome is high. The kit for diagnosing an autoimmune disease may further include a reaction solution, a diluting solution, a washing solution, a secondary antibody, and the like, as necessary. Further, the secondary antibody may be an anti-human subclass antibody.
The kit for diagnosing an autoimmune disease can be produced, for example, by the method described in the immobilization step of the method for measuring a nucleosome-specific antibody.
(Method for producing nucleosome DNA)
The method for producing a nucleosome DNA of the present invention includes a mononucleosome production step comprising the method for producing a mononucleosome of the present invention,
There is no particular limitation except for a nucleosome DNA isolation / purification step of isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes.
The nucleosome DNA isolation / purification step for isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes can be carried out by appropriately selecting from known methods (Kanai, Y et al: Introduction and natural occurrence of serum nuclear DNA in a number of autoimmune DNA in autoimmune DNA / amounts). / Lprice: its relation to apoptosis in the thymus. Immunol Lett. 46: 207-214, 1995). For example, a fixed amount of the purified nucleosome is suspended in Tris-EDTA buffer containing 1% SDS and 0.5 mg / ml Proteinase K, and treated at room temperature for 60 minutes. Next, a three-fold amount of a denaturant containing 6 M NaI (sodium iodide) is added, and the mixture is heated at 60 ° C. for 15 minutes. The DNA solubilized by this operation is precipitated with 50% isopropyl alcohol, and the precipitated DNA is dissolved in the above-mentioned Tris-EDTA buffer, a small amount of RNase is added, and a method of decomposing RNA that may be mixed is used. be able to.
The nucleosome DNA produced by the nucleosome DNA production method is a highly pure DNA derived from mononucleosomes because it is extracted from mononucleosomes having high purity and good shape as described above. According to agarose gel electrophoresis of the nucleosome DNA produced by one example of the method for producing nucleosome DNA, there is a strong band around 150 bp, which is considered to be mononucleosome double-stranded DNA. The average chain length of these nucleosome DNAs is preferably 145 bp to 200 bp, and may contain a small amount of 320 to 400 bp DNA.
The nucleosome DNA produced by the method for producing nucleosome DNA can be obtained from a human-derived sample, so that human-derived nucleosome DNA can be obtained. This is excellent in that it is possible to eliminate non-specific reactions and to use nucleosome DNA that has a strong possibility of becoming a self-antigen for the production of anti-DNA antibodies, as noted in recent years. The method for producing nucleosome DNA of the present invention provides a method for easily and accurately producing such nucleosome DNA which has not always been easy to produce, and thus is suitable for diagnosis of SLE and the like. Nucleosomal DNA can be provided.
(DNA plate)
The DNA plate of the present invention is not particularly limited, except that it is a nucleosome DNA produced on the plate by the above-described nucleosome DNA production method, and the human-derived nucleosome DNA is immobilized. The DNA plate of the present invention may be a DNA plate comprising nucleosome DNA isolated and purified from the human-derived mononucleosome on a plate. These DNA plates have attracted attention in recent years for using human DNA as an antigen for judging pathological conditions such as SLE, which can eliminate non-specific reactions caused by using heterologous DNA. It is excellent in using nucleosome DNA that is likely to be a self-antigen for anti-DNA antibody production.
The DNA plate is formed by directly immobilizing nucleosome DNA on the plate, and the antibody against PLL of a conventional plate to which DNA is attached via a basic protein such as poly-L-lysine (PLL) is used. In addition, it is preferable because problems due to an antibody reaction with an unknown antigen structure formed by a PLL-DNA complex can be eliminated. The material of the plate is preferably a material containing polystyrene because DNA can be directly attached thereto, and microtiter plates Immulon2HB, Immulon4HB and ImmulonHB (Dynex Technologies, Chantilly, VA, manufactured by Dynex Technology) are particularly preferable.
As described above, the DNA plate of the present invention reduces the background of normal serum, thereby increasing the reliability of the antibody titer of the target disease serum, and is useful for measuring the anti-DNA antibody reaction for determining the pathological condition such as SLE. It can be used very suitably.
(DNA plate manufacturing method)
The method for producing a DNA plate of the present invention is the method for producing a mononucleosome, wherein the sample is a human-derived sample,
A nucleosome DNA isolation and purification step of isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes,
There is no particular limitation except that the method includes a solid-phase immobilizing step of immobilizing the nucleosome DNA on a plate.
In the solid phase immobilization step, it is preferable that nucleosome DNA is directly attached to the plate without a pretreatment such as PLL.
The mononucleosome immobilization buffer is not particularly limited and may be appropriately selected as long as it does not change the form of the nucleosome DNA, but the viewpoint of attaching the nucleosome DNA without pretreatment such as PLL. Therefore, the immobilization buffer is preferably a Tris buffer or boric acid-caustic soda buffer containing 0.1 M or more and 1.0 M or less NaCl, and Tris containing 0.1 M or more and 1.0 M or less NaCl. Buffers are more preferred. It is particularly preferable that the concentration of NaCl is 0.25 M or more from the viewpoint of coating efficiency and anti-DNA antibody reactivity of the produced DNA plate.
The solid phase used in the solid phase immobilization step is not particularly limited as long as it can immobilize nucleosome DNA, and can be appropriately selected.From the viewpoint of directly attaching the nucleosome DNA to a plate, polystyrene is used. Microtiter plate is preferable, and Immulon2HB (Dynex Technologies, Chantilly, VA, manufactured by Dynex Technology) is particularly preferable. The conditions for the immobilization of the nucleosome DNA can be appropriately selected according to the type of the solid phase and the like. As a specific example of the immobilization, the polystyrene microtiter plate is used as the solid phase. In this case, a solution of nucleosomal DNA in a Tris buffer solution containing 0.25 M NaCl at a concentration of 0.5 μg / ml was adsorbed overnight at 4 ° C., and the excess antigen was once removed by suction. A method of washing with an added Tris buffer is preferably used.
Blocking can be performed according to the method for immobilizing nucleosomes.
The method for producing a DNA plate of the present invention comprises a Tris buffer comprising, on a plate, a nucleosome DNA that is a human-derived nucleosome DNA produced by the nucleosome DNA production method and contains 0.1 M or more and 1.0 M or less of NaCl. Alternatively, the solid phase may be formed by dissolving in any one of a boric acid-caustic soda buffer solution and adding.
(Anti-DNA antibody measurement method)
The anti-DNA antibody measurement method of the present invention comprises using the DNA plate,
A reaction step of reacting the test sample with nucleosomal DNA immobilized on the DNA plate;
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the nucleosome DNA,
The measurement step can be appropriately selected according to the method for measuring an antibody specific to the nucleosome.
Example
Hereinafter, examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited to these examples. The materials, usage amounts, ratios, processing contents, processing procedures, and the like shown in the following examples can be appropriately changed as long as the effects of the present invention are not impaired.
(Example 1)
Production of mononucleosome from supernatant of cultured hybridoma cells producing anti-double-stranded DNA antibody
An autoantibody 2C10 (belonging to IgG2b) specific to double-stranded DNA produced by an MRL / lpr mouse-derived B cell hybridoma known as an autoimmune disease model has already been established as a method for separating and purifying an IgG antibody. The antibody was separated from the culture supernatant of the hybridoma using the protein A column method described above, and the separated antibody was analyzed for its components by SDS-polyacrylamide gel (PAGE) electrophoresis. (Kanai et al .: Separation of autoantigen from hybridoma monoclonal antibody and its application, Ministry of Health and Welfare specific disease Mixed connective tissue disease research group 1993 research report pp56 -59, 1994).
The protein A column in which the 2C10-nucleoprotein complex has been captured is referred to as a 25 mM Tris buffer containing 1.2 M sodium chloride (hereinafter, this 25 mM Tris buffer containing 1.2 M sodium chloride is referred to as “buffer A”). ) Was used as an eluent for dissociation and elution, and the eluate was concentrated to extract DNA. When the obtained DNA extract was examined by 2% agarose gel electrophoresis, mononucleosomal DNA (about 150 base pairs) and its polymer were detected (FIG. 1).
On the other hand, when the protein was examined by SDS-PAGE (15%), only core histones, that is, histones H3, H2b, H2a and H4 were detected. From these results, it was revealed that mononucleosomes and multimers of various degrees of polymerization exist in the eluate.
Based on the above fact, we attempted to recover mononucleosomes on a larger scale. The 2C10 hybridoma was cultivated in a large amount (about 1 liter) in a serum-free medium (the medium may be a DMEM or RPMI normal medium supplemented with 5% by mass of fetal bovine serum), and the culture supernatant was subjected to diaflow membrane PM30 having a molecular weight cutoff of 30,000. It was concentrated 20 times by ultrafiltration using (Millipore). The concentrated solution was poured into the above-mentioned Hittrap Protein A column (5 ml) (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) to capture the nucleoprotein complex, and a 25 mM Tris buffer solution containing 140 mM sodium chloride (hereinafter referred to as 140 mM sodium chloride) was used. The 25 mM Tris buffer containing sodium chloride was washed with "Buffer C" (pH 7.4) to completely remove non-specifically bound proteins. Removal of non-specifically bound proteins was complete when the absorbance at 260 nm was 0.00. Next, nucleosomes were eluted with buffer A. This eluate contained mononucleosomes and oligo or polynucleosomes in which two or more mononucleosomes were linked.
Next, in order to isolate only mononucleosomes, high-performance liquid chromatography using a Superdex 200 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) capable of separating molecules having a molecular weight of 10,000 to 1,000,000. (HPLC) was introduced. As a developing solvent, 25 mM Tris buffer containing 250 mM sodium chloride and 0.04% by mass sodium azide (hereinafter, 25 mM Tris buffer containing 250 mM sodium chloride and 0.04% by mass sodium azide is referred to as “buffer B ") (PH 7.4).
FIG. 2 shows the absorbance profile of the eluted fraction. The peak of the mononucleosome fraction was detected at the position of the molecular weight of 200,000 to 250,000 behind the large peak of the polynucleosome fraction.
To increase the yield of mononucleosomes, polynucleosomes were digested into mononucleosome units. Specifically, Ca was added to the obtained eluate. ²⁺ Was added to a concentration of 2.5 mM and micrococcal nuclease to a concentration of 0.5 unit / ml to 200 μl, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes. Immediately after the completion of the incubation, HGTA was added to a concentration of 5 mM to stop the reaction. Insolubles were removed with a microfuge (15 k rpm).
The resulting supernatant was subjected to HPLC using a Superdex 200 column equilibrated with buffer B (321 pump, manufactured by Gilson). FIG. 3 shows the absorbance profile of the eluted fraction. By performing nuclease treatment before applying to the gel filtration column, the fraction of mononucleosomes could be increased. FIG. 4 shows the result of re-chromatography of this fraction. It could be purified as almost a single peak. On the other hand, by using this method, a linker DNA connecting between mononucleosomes could be simultaneously recovered (FIG. 3).
The mononucleosome peak fraction was concentrated with ULTRAFREE (50 k cut-off) (Millipore). The protein concentration of the concentrate was measured using a BCA protein assay kit (manufactured by Peerce) and was found to be 300 to 500 μg / ml.
In addition, except for the cell culture solution before concentration, a protease inhibitor cocktail, complete TM, EDTA-free (Boehringer Mannheim) was added as prescribed to prevent protein degradation, and furthermore, A serine protease inhibitor AEBSF (4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride) (manufactured by Sigma) was added to 100 μM. The same applies to the following embodiments.
(Example 2)
Production of mononucleosome from general culture cell supernatant
The method for producing a mononucleosome of the present invention can also be applied to general established cells that do not produce double-stranded DNA and / or nucleosome-specific antibodies or cells directly isolated from animal tissues including humans (primary cultured cells). .
MML / lpr mouse-derived cell line cell KML as an autoimmune disease model ₁ -7 (Kanai et al., Intl. Archs. Allergy Appl. Immunol., 81: 92-94, 1986) disclose nucleosomes in their culture supernatants without stimulation, regardless of serum-supplemented and serum-free media. It is known to secrete. Therefore, this culture supernatant can be used as a source of nucleosomes as it is.
In addition, nucleosomes can be released into the culture supernatant by addition of an apoptosis-inducing agent even in established various commercially available cancer cell lines or primary culture cells. Can be used as
After concentrating the culture supernatant to an appropriate concentration (10 to 20 times), the culture supernatant is treated (digested) with micrococcal nuclease (MN) and applied to a protein A column on which monoclonal antibody 2C10 is immobilized.
The protein A column is washed with buffer C to remove non-specifically bound proteins, and then eluted with buffer A. The eluate is immediately dialyzed against buffer B and then concentrated. This concentration can be performed by ultrafiltration using the diaflow membrane PM30 if the volume is large, and can be performed using the ultrafree if the volume is small.
Hereinafter, in the same manner as in Example 1, the above concentrated solution was subjected to HPLC using a Superdex 200 column to recover mononucleosomes. The fractionation pattern by HPLC was the same as in FIGS.
The immobilization of the monoclonal antibody 2C10 was performed as follows.
The protein A column was equilibrated with the Tris buffer described in paragraph No. 0060, and 2C10 (0.5 to 1.0 mg / ml) prepared with the Tris buffer was charged. The flow rate in the column is 5 ml / min and there are two cycles (the second time the adsorption is perfect). After adsorption and immobilization, the column was again equilibrated with Tris buffer.
(Example 3)
Production of nucleosomes from cultured cells or peripheral blood mononuclear cells
Hypotonic buffer (50 mM Tris, 50 mM potassium chloride, 0.5 mM magnesium chloride, 0.15 mM 2-ME, 0.25 M sucrose, 0.2 mM AEBSF, 0.04% by mass sodium azide (NaN ₃ ), PH 7.4) 2 x 10 per 10 ml ⁸ Suspend cells and use Potter Teflon ^(R) Homogenize manually with a homogenizer (20 strokes). This was centrifuged at 500 g for 7 minutes to sediment the cell nuclei. Cell nuclei were washed once with the above buffer to remove impurities.
Next, the washed nuclei were suspended in 0.5 ml of a buffer having the same composition as the above buffer except that sucrose was not contained, and 1.25 U / ml of micrococcal nuclease (MN) and 5 mM Ca ²⁺ Was added, and the enzyme was digested in the same manner as in Example 1. The reaction was stopped by adding EGTA to 5 mM. Centrifugation was performed at 13k for 5 minutes. Buffer B was added to the obtained precipitate, and the soluble fraction was collected by centrifugation at 13k. The soluble fraction was immediately applied to a monoclonal antibody 2C10-bound protein A column, and only the bound nucleosomes were selectively eluted with the above eluate (buffer A). After concentrating the obtained eluate, it was subjected to HPLC using the same Superdex 200 column as in Example 2 to isolate mononucleosomes. The results of the isolation of mononucleosomes by HPLC are shown in FIG.
Furthermore, when the obtained mononucleosome fraction was applied to a Superdex 200 column again, it was purified as a substantially single peak shown in FIG.
On the other hand, the mononucleosome could also be purified by directly applying to a Superdex 200 column without using an antibody 2C10 binding column to fractionate a fraction having a molecular weight of 200,000 to 250,000. When the purification was performed without using the 2C10 binding column, the purity was slightly inferior to that when the purification was performed using the 2C10 binding column. However, when subjected to HPLC again, almost the same effect as in the case of the 2C10 column was obtained.
(Example 4)
In the present Example 4, a comparative analysis was performed between the mononucleosome derived from the cultured cells having undergone apoptosis obtained in Example 2 and the mononucleosome derived from the normal cultured cells obtained in Example 3.
Both nucleosomes were fractionated by 0.5% agarose electrophoresis. As shown in FIG. 7, nucleosomes derived from cells that underwent apoptosis compared to mononucleosomes derived from normal cells migrated as broad bands.
Further, in order to analyze these mononucleosomes in detail, the core histone and DNA constituting the mononucleosome were analyzed respectively.
As for DNA, when the migration pattern, position, and the like were compared by agarose gel electrophoresis, no significant difference was observed (FIG. 8).
On the other hand, core histones were analyzed by fractionating histone components by 15% SDS-PAGE. FIG. 9 shows the results. Histones derived from normal cells showed a fractionation pattern similar to the normal pattern of H3, H2b, H2a and H4 shown in FIG. However, abnormalities were observed in the fractionation pattern of the core histones derived from the apoptotic cells. That is, the band corresponding to H2b decreased, and two new bands appeared so as to sandwich the band of H4.
Since the production of the mononucleosome unit was simplified in this way, the separation of histone, which was conventionally difficult to isolate, was also simplified. Further, it is possible to easily analyze biological phenomena based on histones and diagnose and clarify diseases as described above.
(Example 5)
Immobilization of nucleosomes on ELISA plate
The conditions for immobilizing the antigen on the ELISA plate when examining the immune response to the self antigen were examined. First, the solvent for antigen attachment was examined. Experience has shown that a 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) is often used for immobilizing an antigen on a plate. Therefore, it was determined whether the carbonate buffer was suitable as a solvent for attaching an antigen to the plate. Then, the presence or absence of morphological change of nucleosome by the buffer was examined. Specifically, 0.5 M NaCl, which is a nucleosome solvent, was replaced with the 50 mM carbonate buffer, and examined by HPLC using a Superdex 200 column equilibrated with the buffer. As a result, no change was observed in the elution position and pattern due to the replacement of the solution. This proved that the buffer could be used as a solvent for antigen attachment.
Next, a polystyrene microtiter plate Immulon2HB (Dynex Technologies, Chantilly, Va., Manufactured by Dynex Technology) was used as a support for the antigen, and nucleosomes were used on the support to adsorb the dsDNA antigen to the plate. Was adsorbed overnight at 4 ° C. at a concentration of 2 μg / ml via poly-L-lysine (PLL) (Sigma, St. Louis, MO, manufactured by Sigma) (1 g / ml distilled water). After the adsorption, the excess antigen was once removed by suction, and then NaCl-added Tris buffer (25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0.04% by mass NaN) was added. ₃ , PH 7.4) (TBS). About 10 ml of TBS was used per plate. After washing, 100 μl of a blocking solution (TBS containing 2% by mass skim milk (Difco, Detroit, MI) containing 2% by mass) was added to each well, and the mixture was allowed to react for 1 hour to shield a site where no antigen was attached. Finally, an antigen-attached plate was prepared by washing four times with TBS in the same manner as the washing after the antigen adsorption. Until use, 100 μl of TBS was added to each well, sealed with a plate seal, and stored at 4 ° C.
(Example 6)
Anti-nucleosome antibody measurement in patient serum
Anti-nucleosome antibody measurements were performed on the sera of 12 SLE patients and 26 healthy subjects during treatment.
Serum was collected from each of 12 SLE patients and 26 healthy subjects.
The serum was diluted 100-fold with a reaction solution [TBS containing 1% by mass bovine serum albumin (BSA), 0.4% by mass skim milk, 10% by mass block ace, and 1 mM EDTA], and 50 μl was added to each well of a microtiter plate. Were added one by one. The BSA used was albumin fraction V (Albumin, Fraction V, Boehringer Mannheim, Germany, manufactured by Boehringer Mannheim), the block ace used was Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., and the EDTA used was EDTA disodium salt (Dohjin Chemical). .
The microtiter plate was reacted for 30 minutes at room temperature with gentle shaking on a horizontal shaker. Immediately after the reaction, the reaction solution was removed by suction, and the plate was washed four times with TBS containing 0.05% by mass of Tween 20 in the same manner as in the washing of the plate after antigen attachment.
Immediately after the washing, an alkaline phosphatase (AP) conjugated anti-human IgG antibody (goat) (Zymed, San Francisco, Calif., Manufactured by Jimdo) was diluted 2,000-fold with the reaction solution, and added to each well. The shaking reaction was carried out at room temperature for 30 minutes as in the case described above. After washing as in the case of the serum, 2.5 mM Mg ²⁺ 100 μl of p-nitrophenyl phosphate (PNP) (Sigma, St. Louis, MO) reagent, which is an AP substrate adjusted to 1 mg / ml with an added carbonate buffer (50 mM, pH 9.8), is used. Each well was added to each well, and shaken at room temperature for 30 minutes in the same manner as in the case of the serum.
Immediately after the reaction, the degree of color development (absorbance) was measured at an absorption wavelength of 405 nm using an autoreader. The control or blind test was the absorbance obtained when no serum was added in the above series of reaction systems, and the value obtained by subtracting the absorbance was used as the actual measurement location. The antibody titer was represented by absorbance.
The measurement results are shown in FIG. Of the 12 sera collected from SLE patients under treatment, 2 sera showed extremely high antibody titers to nucleosomes and were determined to be positive. All 26 sera collected from healthy subjects showed low antibody titers, and the background threshold defined by the average value + 3 times the standard deviation (m + 3SD) was lower than the antibody titers of the two positive sera. It was extremely low. In addition, the reason that the sera from SLE patients other than the two patients determined to be positive do not show high titers is because the drug already prescribed during treatment is already in a state near to cure. This indicates that there are not already many nucleosome-specific antibodies in the serum.
From the above results, the nucleosome-specific antibody can be measured with very high accuracy by the measurement method of the present invention, and the nucleosome-specific antibody measurement method of the present invention is extremely effective for SLE diagnosis. Has been demonstrated.
(Example 7)
Measurement method for each antibody subclass
There are four subclasses of IgG antibodies, IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. The bias of the patient's subclass of nucleosome-specific antibodies may characterize the disease pathology. Therefore, measurement of antibodies by subclass is important for understanding the disease pathology.
For the case showing the highest value of the nucleosome antibody in FIG. 11 of Example 6, the antibody for each subclass was measured.
For the measurement of the antibody by subclass, a biotin-labeled anti-human subclass antibody (mouse) (Zymed, San Francisco, CA) was used instead of the alkaline phosphatase (AP) conjugated anti-human IgG antibody (goat) of Example 6. did. The reaction mode and reaction time were the same as described above. Next, alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Zymed, San Francisco, Calif.) Was reacted, and finally, PNP as a substrate was added as in Example 6, color was developed, and the absorbance was measured with an autoreader.
The measurement results are shown in FIG.
(Example 8)
Production of nucleosomal DNA
Mononucleosomes were produced from human promyelocytic leukemia cell culture strain HL-60 chromatin in the same manner as in Example 1, and nucleosome DNA was further extracted. Extraction of nucleosomal DNA was carried out by a known method (Kanai, Y et al: Induction and natural occultence of serum nuclear DNA in autoimmune MTS / lpr / lpm e. -214, 1995). Specifically, a fixed amount of the purified nucleosome was suspended in Tris-EDTA buffer containing 1% SDS and 0.5 mg / ml Proteinase K, and treated at room temperature for 60 minutes. Next, a three-fold amount of a denaturant containing 6 M of NaI (sodium iodide) was added, and the mixture was heated at 60 ° C. for 15 minutes. The DNA solubilized by this operation was precipitated with 50% isopropyl alcohol. The precipitated DNA was dissolved in the above-mentioned Tris-EDTA buffer, and a small amount of RNase was added to decompose RNA that might be present.
FIG. 13 shows the agarose gel electrophoresis pattern of the nucleosomal DNA. A single band was observed around 150 bp, indicating that mononucleosome DNA was extracted.
(Example 9)
Immobilization of nucleosomal DNA on ELISA plate
The nucleosomal DNA obtained in Example 8, its parent genomic DNA of HL-60 cells, and conventionally used calf thymus DNA were immobilized on an ELISA plate. Genomic DNA of HL-60 cells was extracted from chromatin of the cells according to the method for extracting DNA from nucleosomes. The size of the genomic DNA was approximately 20 kbp, whereas nucleosomal DNA was approximately 150 bp.
Next, a polystyrene microtiter plate Immulon2HB (Dynex Technologies, Chantilly, VA, manufactured by Dynex Technology) was used as a support for the antigen, and the DNA was added to the support at a concentration of 0.5 μg / ml. It was dissolved in Tris buffer (pH 7.4) containing 25 M NaCl, added at 25 ng / well, and adsorbed at 4 ° C. overnight. After the adsorption, the excess antigen was once removed by suction, and then NaCl-added Tris buffer (25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0.04% by mass NaN) was added. ₃ , PH 7.4) (TBS). About 10 ml of TBS was used per plate. After washing, 100 μl of a blocking solution (TBS containing 2% by mass skim milk (Difco, Detroit, MI) containing 2% by mass) was added to each well, and the mixture was allowed to react for 1 hour to shield a site where no antigen was attached. Finally, an antigen-attached plate was prepared by washing four times with TBS in the same manner as the washing after the antigen adsorption. Until use, 100 μl of TBS was added to each well, sealed with a plate seal, and stored at 4 ° C.
(Example 10)
Measurement of anti-DNA antibody using DNA plate
The serum of one SLE patient was subjected to anti-DNA antibody measurement using the microtiter plates of Example 9 in the same manner as the anti-nucleosome antibody measurement of Example 6. FIG. 14 shows the measurement results. The patient's immune response to human nucleosomal DNA was found to be much stronger than to calf thymus DNA. In addition, it was found that nucleosomal DNA had a stronger immune response than human genomic DNA. This tendency was also observed in the other three SLE patients with high anti-DNA antibody titers.
(Example 11)
Antibody suppression experiment
For the serum used in Example 10, an inhibition experiment was performed in which the antibody in the serum was previously absorbed in a solution using an antigen, and then the activity of the anti-nucleosomal DNA antibody was measured. Nucleosome DNA, genomic DNA and calf thymus DNA were used as antigens, respectively. FIG. 15 shows the results of the suppression experiment. The amount of calf thymus DNA required to inhibit anti-nucleosomal DNA antibody activity by 40% was three times that of nucleosomal DNA, which revealed the weak antigenicity of heterologous DNA.
A similar suppression experiment was performed on a plate prepared by pretreating a microtiter plate with PLL and then adding nucleosomal DNA (500 ng / ml) to the microtiter plate. FIG. 16 shows the results of the suppression experiment. In this case, the amount of calf thymus DNA required to inhibit the anti-nucleosomal DNA antibody activity by 40% was 1.3 times that of nucleosomal DNA, which was lower than that of the plate not pretreated with PLL, and the difference from the heterologous DNA was small. It becomes inconspicuous. This is thought to be due to the modification of the DNA antigen structure by the PLL. That is, it is considered that the inhibitory effect of the original DNA antigen became inconspicuous because the antibody activity measured by the DNA plate pre-treated with PLL included a reaction to an unknown antigen newly formed by DNA and PLL. Can be
(Example 12)
The difference in antigenicity between the plate to which DNA was attached without pre-treatment with PLL and the plate to which DNA was attached with pre-treatment with PLL was further examined.
The sera of 24 SLE patients and the sera of 24 healthy subjects were tested on the plate to which nucleosome DNA was attached without pretreatment with PLL and the plate to which nucleosome DNA was attached by pretreatment with PLL. The DNA antibody reaction was measured. The anti-DNA antibody reaction was also measured on each plate to which no nucleosomal DNA antigen was attached. FIG. 17 shows the measurement results of the plate to which the nucleosome DNA was attached without pre-treatment with PLL, and FIG. 18 shows the measurement results of the plate to which the nucleosome DNA was attached after pre-treatment with PLL.
In the plate pretreated with PLL, the reactivity of the serum of the SLE patient to the plate to which the nucleosome DNA antigen was not attached (-Ag in the figure) was high. Moreover, the reactivity of the serum of a healthy subject to the plate (+ Ag in the figure) to which the nucleosome DNA antigen was attached was also high. This indicated that non-specific reactions could not be excluded from the plate pretreated with PLL.
In the plate to which nucleosome DNA was attached without pre-treatment with the PLL and the plate to which nucleosome DNA was attached with pre-treatment with PLL, the average + 3SD of healthy subjects measured in each of the plates was regarded as a normal range, and the SLE patients were treated. FIG. 19 shows the result of comparing the measured values. The positive rate in the former was 41.6% (10/24), whereas the positive rate in the latter was 16.6% (4/24), indicating that nucleosome DNA was attached without pretreatment with PLL. Plates were found to be significantly better at diagnosing SLE.
From these facts, a DNA plate that is not pre-treated with PLL, that is, a DNA plate attached without using PLL, can more accurately measure an immune response to a DNA antigen, and is used for accurate diagnosis of SLE and the like. It became clear that we could do it.
(Example 13)
The NaCl concentration in the solvent and the antibody reactivity when nucleosome DNA was directly adsorbed (coated) to the plate, that is, the coating efficiency, that is, the coating efficiency was examined using the serum of one SLE patient with a high anti-nucleosome DNA antibody titer.
The anti-DNA antibody was measured when nucleosome DNA (0.5 μg / ml) was dissolved in Tris buffer containing 0.14 M, 0.25 M, and 0.5 M NaCl and adsorbed on the plate. The measurement results are shown in FIG. It can be seen that the case of 0.25M has the highest anti-DNA antibody reactivity and the best coating efficiency.
Further, anti-DNA antibodies were measured on plates prepared at the above three concentrations for 24 SLE patients and 24 healthy subjects. FIG. 21 shows the measurement results of the plate prepared at the 0.14 M NaCl concentration, FIG. 22 shows the measurement results of the plate prepared at the 0.25 M NaCl concentration, and FIG. 22 shows the measurement results of the plate prepared at the 0.5 M NaCl concentration. Each is shown in FIG. It was found that a plate prepared at a NaCl concentration of 0.25 M or more was particularly excellent in detecting an anti-DNA antibody.
According to the present invention, a method for producing mononucleosomes, which can obtain nucleosomes suitable for various uses including autoimmune disease diagnosis and the like while maintaining morphological stability, can be efficiently obtained by simple operation, and can be obtained with high purity, Mononucleosomes produced by the method for producing nucleosoohms, kits for producing mononucleosomes with excellent handling properties, mononucleosome analysis, histone inspection methods suitable for autoimmune disease diagnosis, etc., including the mononucleosomes, specific to nucleosomes Nucleosome suitable for various uses including antibody measurement method suitable for various diagnoses, simple and reliable method for autoimmune disease diagnosis, autoimmune disease diagnostic kit with high performance and excellent handling, autoimmune disease diagnosis, etc. Nucleosome DNA production that can obtain DNA efficiently and with high purity by simple operation Law, handling excellent in DNA plates high performance, efficient method for producing the DNA plate, and can provide a suitable anti-DNA antibody assay in autoimmune diseases diagnosis.
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing the results of concentrating a washing solution of a protein A column in which a 2C10-nucleoprotein complex is captured, and subjecting a DNA extract obtained therefrom to 2% agarose gel electrophoresis.
FIG. 2 is a graph showing the profile of nucleosomes (before micrococcal nuclease treatment) analyzed by concentrating the eluate of the 2C10-Protein A column and analyzing by Superdex 200-HPLC chromatography.
FIG. 3 shows the profile of Superdex 200-HPLC chromatography after treating the sample of FIG. 2 with micrococcal nuclease (MN) (it clearly shows the formation of mononucleosomes and linker DNA cleaved with MN). It is a graph shown.
FIG. 4 is a graph showing the results of rechromatography of a portion (-) corresponding to the mononucleosome in FIG. 3 by Superdex 200-HPLC.
FIG. 5 is a graph showing the results of rechromatography (representative example) of nucleosomes obtained from cultured cells or peripheral lymphocytes by Snperdex 200-HPLC.
FIG. 6 is a graph showing the results of rechromatography of the portion (-) corresponding to the mononucleosome in FIG. 5 by Superdex 200-HPLC.
FIG. 7 is a photograph showing the results of fractionation of mononucleosomes derived from apoptotic cultured cells and mononucleosomes derived from normal cultured cells by 0.5% agarose electrophoresis.
FIG. 8 is a photograph showing a result of analyzing DNA constituting mononucleosomes by agarose gel electrophoresis.
FIG. 9 is a photograph showing the results obtained by fractionating and analyzing core histones constituting a mononucleosome by 15% SDS-PAGE.
FIG. 10 is a photograph showing an electrophoresis image of 15% SDS-PAGE of all histones (including H1) derived from normal cells.
FIG. 11 is a graph showing the results of measurement of antibodies specific to mononucleosomes by ELISA.
FIG. 12 is a graph showing the measurement results by subclass of antibodies specific to mononucleosomes by ELISA.
FIG. 13 is a photograph showing the result of agarose electrophoresis of nucleosome DNA.
FIG. 14 is a graph showing the immune response of SLE patient sera to DNA plates using nucleosome DNA, genomic DNA and calf thymus DNA as DNA antigens, respectively.
FIG. 15 is a graph showing the effect of suppressing the anti-nucleosomal DNA antibody reaction in a plate without PLL pretreatment.
FIG. 16 is a graph showing the inhibitory effect of anti-nucleosomal DNA antibody reaction on a plate pretreated with PLL.
FIG. 17 shows the antibody response of SLE patient sera to plates coated with nucleosomal DNA without PLL pretreatment on Immulon 2HB plates and uncoated plates.
FIG. 18 is a diagram showing antibody responses of SLE patient sera to a plate coated with nucleosome DNA by PLL pretreatment on an Immulon 2HB plate and a plate not coated with nucleosome DNA.
FIG. 19 shows the relationship between the presence or absence of PLL pretreatment and the anti-nucleosome DNA antibody titer.
FIG. 20 is a graph showing the results of measuring the effect of NaCl concentration when an Immulon 2HB plate is coated with human nucleosomal DNA by anti-DNA antibody titer.
FIG. 21 is a diagram showing the results of measuring the anti-DNA antibody reaction of a DNA plate prepared at a NaCl concentration of 0.14 M.
FIG. 22 is a diagram showing the results of measuring the anti-DNA antibody reaction of a DNA plate prepared at a NaCl concentration of 0.25 M.
FIG. 23 is a diagram showing the results of measuring the anti-DNA antibody reaction of a DNA plate prepared at a 0.5 M NaCl concentration.

Claims (39)

A capture collection step of capturing and collecting nucleosomes contained in the sample with an antibody specific to the nucleosomes;
A dissociation and recovery step of dissociating and recovering the captured nucleosome from the antibody,
An isolation and purification step of isolating and purifying mononucleosomes from the recovered nucleosomes based on molecular weight,
A method for producing a mononucleosome, comprising: The method for producing a mononucleosome according to claim 1, wherein the antibody is at least one selected from an anti-nucleosome antibody, an anti-DNA antibody, and an anti-histone antibody. The method for producing a mononucleosome according to claim 1 or 2, wherein the antibody has an ability to bind to an antigen at a salt concentration of 140 mM. The antibody according to claim 1, wherein the antibody has an amino acid sequence of the variable region of 2C10, or an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and has an antigen specificity of 2C10. Item 4. The method for producing a mononucleosome according to any one of Items 3 to 3. The method for producing a mononucleosome according to claim 4, wherein the antibody is 2C10. The method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 5, wherein in the capture collection step, the antibody is bound to a solid phase having an affinity for the antibody so that the antibody captures nucleosomes. . The method for producing a mononucleosome according to claim 6, wherein the solid phase is a protein A column. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein in the capture collection step, the antibody is previously bound to a solid phase, and the sample is brought into contact with the solid phase, whereby the antibody captures nucleosomes. A method for producing a mononucleosome. 9. The mononucleosome according to any one of claims 1 to 8, wherein in the isolation / purification step, a fraction having a molecular weight of 200,000 to 250,000 is collected using a gel filtration column to isolate and purify the mononucleosome. Manufacturing method. The method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 9, wherein the nucleosome is treated with a nuclease capable of cleaving into mononucleosome units before the capture collection step. The method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 9, wherein the nucleosome is treated with a nuclease capable of cleaving into mononucleosome units after the dissociation and recovery step and before the isolation and purification step. The method for producing a mononucleosome according to claim 10 or 11, wherein the nuclease is a micrococcal nuclease. A release step of disrupting the cells in a low salt solution and releasing nucleosomes into the solution;
A collection step of collecting the nucleosome,
A nuclease treatment step of suspending the collected nucleosomes in a solution having a low salt concentration and treating with a nuclease that can be cleaved into mononucleosome units,
An isolation and purification step of producing a mononucleosome from the solution after the nuclease treatment using an antibody specific to the nucleosome and / or based on the molecular weight. 14. The method for producing a mononucleosome according to claim 13, wherein the antibody used in the isolation and purification step is 2C10. 15. The method for producing a mononucleosome according to claim 13, wherein in the isolation and purification step, a fraction having a molecular weight of 200,000 to 250,000 is separated using a gel filtration column. A mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15. 17. The mononucleosome according to claim 16, which has a purity of 98% or more. An antibody specific to the nucleosome for capturing and collecting the nucleosome contained in the sample,
A column for isolating mononucleosomes from the captured and collected nucleosomes based on molecular weight,
A kit for producing a mononucleosome, comprising: 19. The kit for producing a mononucleosome according to claim 18, wherein the antibody is 2C10. A test histone is recovered from a mononucleosome obtained from a test sample by the method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15, and an electrophoresis pattern of the test histone and a control histone are prepared. A histone inspection method, comprising comparing with an electrophoresis pattern. A solid phase immobilizing step of immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15,
A reaction step of reacting the test sample with the immobilized mononucleosome,
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome,
A method for measuring a nucleosome-specific antibody, comprising: 22. The method for measuring a nucleosome-specific antibody according to claim 21, wherein the mononucleosome is a nucleosome derived from apoptosis. The method for measuring a nucleosome-specific antibody according to claim 21 or 22, wherein the test sample is serum or plasma of an autoimmune disease patient. In the immobilization step, the immobilized mononucleosome is blocked with a blocking solution containing at least skim milk, and in the reaction step, the sample is diluted with at least a reaction solution containing skim milk, and then the sample is immobilized on the solid phase. The method for measuring an antibody specific to a nucleosome according to any one of claims 21 to 23, wherein the method is reacted with a mononucleosome. The method for measuring an antibody specific to a nucleosome according to claim 24, wherein the reaction solution contains Tris, NaCl, NaN ₃ , serum albumin, skim milk, and EDTA. 26. The method for measuring a nucleosome-specific antibody according to any one of claims 21 to 25, wherein in the measurement step, an anti-human antibody recognizing an IgG subclass is reacted as a secondary antibody. A solid phase immobilizing step of immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15,
A reaction step of reacting the test sample with the immobilized mononucleosome,
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the mononucleosome,
An evaluation step of evaluating the antibody titer,
A method for diagnosing an autoimmune disease, comprising: A solid phase obtained by immobilizing the mononucleosome produced by the method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15; a solid phase; a buffer; and a plate or a column. A diagnostic kit for autoimmune diseases, characterized by: A capture collection step of capturing and collecting nucleosomes contained in the sample with an antibody specific to the nucleosomes;
A dissociation and recovery step of dissociating and recovering the captured nucleosome from the antibody,
An isolation and purification step of isolating and purifying mononucleosomes from the recovered nucleosomes based on molecular weight,
A nucleosome DNA isolation / purification step of isolating / purifying nucleosome DNA from the isolated / purified mononucleosome,
A method for producing nucleosome DNA, comprising: A mononucleosome production process comprising the method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15,
A nucleosome DNA isolation and purification step of isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes,
A method for producing nucleosome DNA, comprising: A nucleosome DNA produced by the method for producing a nucleosome DNA according to claim 29 or 30, wherein a human-derived nucleosome DNA is immobilized on a plate. . A DNA plate comprising the mononucleosome according to claim 16 or 17, wherein a nucleosome DNA isolated and purified from a human-derived mononucleosome is immobilized on the plate. . 33. The DNA plate according to claim 31, wherein the nucleosome DNA is a nucleosome-constituting double-stranded DNA, and the average length of the nucleosome DNA is 145 bp or more and 200 bp or less. 34. The DNA plate according to any one of claims 31 to 33, wherein the nucleosome DNA is directly immobilized on the plate. 35. The DNA plate according to any one of claims 31 to 34, wherein the plate comprises polystyrene. The method for producing a mononucleosome according to any one of claims 1 to 15, wherein the sample is a human-derived sample,
A nucleosome DNA isolation and purification step of isolating and purifying nucleosome DNA from mononucleosomes,
Immobilizing step of immobilizing the nucleosome DNA on a plate,
A method for producing a DNA plate, comprising: The solid phase immobilization step, wherein the nucleosome DNA is added to the plate by dissolving it in either Tris buffer or borate-caustic soda buffer containing 0.1 M or more and 1.0 M or less of NaCl. The method for producing a DNA plate according to item 6. A nucleosome DNA produced by the method for producing a nucleosome DNA according to claim 29 or 30, wherein the nucleosome DNA is derived from a human, and contains 0.1 M or more and 1.0 M or less of NaCl. A method for producing a DNA plate, comprising: dissolving in either a Tris buffer solution or a boric acid-caustic soda buffer solution; Using the DNA plate according to any one of claims 31 to 35,
A reaction step of reacting the test sample with nucleosomal DNA immobilized on the DNA plate;
A measurement step of measuring a specific antibody that binds to the nucleosome DNA,
A method for measuring anti-DNA antibodies, comprising:

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