JPWO2002063033A1

JPWO2002063033A1 - Screening method

Info

Publication number: JPWO2002063033A1
Application number: JP2002562769A
Authority: JP
Inventors: 尚高須
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-02-08
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2004-06-10
Also published as: WO2002063033A1

Abstract

骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）試験物質をｉｎｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程；および（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程；を含む方法。この方法により、ｉｎｖｉｔｒｏにおける試験物質の破骨細胞前駆細胞への作用が、迅速かつ簡便に評価できる。A method of screening for a substance that affects bone resorption, comprising: (a) contacting a test substance with an osteoclast precursor cell and an osteoclast-inducing substance in vitro; and (b) wherein the test substance is an osteoclast. Confirming the effect on the differentiation of the precursor cells into osteoclasts. According to this method, the effect of a test substance on osteoclast precursor cells in vitro can be quickly and simply evaluated.

Description

技術分野
本発明は骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングするための新規な方法に関し、さらに詳細には、破骨細胞前駆細胞に影響を与える物質をｉｎｖｉｔｒｏにおいてスクリーニングするための新規な方法に関する。
背景技術
骨吸収に作用を及ぼす物質は、代謝性骨疾患（例えば、骨粗鬆症、腎性骨異栄養症）等の代謝性骨疾患に対する治療効果が期待できる。こうした物質を治療薬などとして開発するためには、骨吸収に作用を及ぼす物質のスクリーニングが不可欠であり、現在までに様々なスクリーニング法が開発されている。
従来の、骨吸収に作用を及ぼす物質をｉｎｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法は、器官培養系を用いる方法と共存培養系を用いる方法に大別される。しかし、骨吸収は様々な因子が複雑に絡み合って生じるため、各種の化合物の作用を正確にかつ簡便に評価することは難しく、ｉｎｖｉｖｏでは骨吸収抑制活性を示す化合物がｉｎｖｉｔｒｏのスクリーニング系では骨吸収促進活性を示すこともある。
器官培養系を用いる方法においては、^４５Ｃａ（ＲａｉｓｚＬＧ１９６３Ｎａｔｕｒｅ１９７：１０１５）あるいは^３Ｈ−ｐｒｏｌｉｎｅ（ＳｔｅｒｎＢＤ，ｅｔ．ａｌ．１９６５ＰｒｏｃＳｏｃＥｘｐＢｉｏｌＭｅｄ１１９：５７７）等でラベルしたマウス胎児の骨（長管骨または頭頂骨）を試験化合物を含む培養液中で培養し、培養液中に遊離された放射性ラベル体の量から骨吸収の強度を評価する。非標識カルシウム（^４０Ｃａ）を使用する方法もある（Ｈｏｈｍａｎｎｅｌ，ｅｔ．ａｌ．１９８３Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１１２：１２３３）。本系には、成熟破骨細胞以外にも、骨芽細胞、造血系細胞、あるいはそれらの前駆細胞等の多種の細胞が含まれる。従って本系において検出される骨吸収の亢進は、既存の破骨細胞の活性化や破骨細胞への分化促進による破骨細胞数の増加以外に、骨芽細胞からのコラゲナーゼ分泌促進による作用も含まれると考えられる。破骨細胞前駆細胞に直接作用してその分化を抑制することが知られているエストロゲンの作用は、この系では確認されていない。従って、器官培養系を用いる方法は、破骨細胞前駆細胞への直接作用を検出するには適当でない可能性がある。また、操作が煩雑である、大量の放射性元素を使用するなどの問題もある。
共存培養系を用いる方法は、血液幹細胞（破骨細胞前駆細胞）が破骨細胞へ分化する過程の活性化を、産生された破骨細胞の数を指標として評価するものである。破骨細胞前駆細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでは、骨芽細胞様ストローマ細胞共存下、骨吸収促進因子（副甲状腺ホルモン、プロスタグランディン類など）の刺激によって破骨細胞となる。本系において破骨細胞前駆細胞及び破骨細胞形成支持細胞として使用する細胞は、１）骨髄細胞のみ（須田立雄ら、１９９２マクロファージ実験マニュアル（徳永徹ら、編）ｐ．６０、講談社、ＴａｋａｈａｓｈｉＮ，ｅｔ．ａｌ．１９８８Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２２：１３７３）、２）骨髄細胞または脾臓細胞と頭頂骨由来骨芽細胞様ストローマ細胞（ＴａｋａｈａｓｈｉＮ，ｅｔ．ａｌ．１９８８Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２３：２６００）等が挙げられる。
本系においては、骨芽細胞側から破骨細胞前駆細胞側へのシグナルを遮断するＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）が破骨細胞抑制因子として同定されているが（ＳｉｍｏｎｅｔＷＳ，ｅｔ．ａｌ．１９９７Ｃｅｌｌ８９：３０９、ＴｓｕｄａＥ，ｅｔ．ａｌ．１９９７ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｒａｍｕｎ２３４：１３７、ＹａｓｕｄａＨ，ｅｔ．ａｌ．１９９８Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ３９：１３２９）、破骨細胞前駆細胞側に直接作用するエストロゲンの作用は、器官培養系同様、この系では確認されていない。従ってこの系も、破骨細胞前駆細胞への直接作用を検出するには適当でない可能性がある。
例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３または１α−ヒドロキシビタミンＤ_３などのビタミンＤ誘導体は、骨粗鬆症モデルラットを用いた実験や臨床試験の結果等から、ｉｎｖｉｖｏで骨吸収抑制活性を有することが知られており（ＳｈｉｒａｉｓｈｉＡ，ｅｔ．ａｌ．２０００ＪＢｏｎｅＭｉｎｅｒＲｅｓ１５：７７０、ＳａｉｒａｎｅｎＳ，ｅｔ．ａｌ．２０００ＣａｌｃｉｆｉｅｄＴｉｓｕｅＩｎｔ６７：１２２）、既に骨粗鬆症などの代謝性骨疾患の治療薬として広く臨床で使用されている。薬理量においては、骨吸収抑制活性が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３による骨量維持または増加作用に大きく寄与していると考えられている。
こうした１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の骨吸収抑制活性は、（ａ）小腸からのカルシウム吸収促進、（ｂ）副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌抑制などにより、骨吸収を間接的に抑制するものであり、従来のｉｎｖｉｔｒｏのスクリーニング系では評価できないものと考えられていた。実際、上述の器官培養系においては１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３には骨吸収促進活性しか観察されておらず（赤津拓彦ら、１９８９実験医学７：１２７２）、共存培養系においてもビタミンＤ誘導体は骨芽細胞を介して破骨細胞形成促進因子として作用する。これらの結果は、ｉｎｖｉｖｏで１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の示す骨吸収抑制活性とは整合しないものである。
しかし、近年の研究より、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３は上記（ａ）、（ｂ）では説明しきれない骨吸収抑制活性を有することが明らかとなってきている（ＳａｉｒａｎｅｎＳ，ｅｔ．ａｌ．２０００ＣａｌｃｉｆｉｅｄＴｉｓｕｅＩｎｔ６７：１２２、ＥｎｄｏＫ−１，ｅｔ．ａｌ．２０００ＪＢｏｎｅＭｉｎｅｒＲｅｓ１５：１７５）。この（ａ）、（ｂ）によらない骨吸収抑制活性が、破骨細胞への直接作用によるものであれば、従来のｉｎｖｉｔｒｏのスクリーニング系では評価できない可能性がある。
近年、破骨細胞形成は、骨芽細胞あるいは骨芽細胞様ストローマ細胞の膜上に存在するＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）の発現が、破骨細胞形成因子によって上昇するために誘導されることが明らかとなった。更に可溶型ＲＡＮＫＬ（ｓｏｌｕｂｌｅＲＡＮＫＬ、ｓＲＡＮＫＬ）でも破骨細胞形成能を有することが報告された。
Ｉｔｏｎａｇａらは、従来のように骨芽細胞あるいは骨芽細胞様ストローマ細胞を活性化する代わりに、一定量のｓＲＡＮＫＬを添加して破骨細胞を誘導する破骨細胞形成系を考案した（ＩｔｏｎａｇａＩ，ｅｔ．，ａｌ．１９９９ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ２６４：５９０）。この系においては、ヒト末梢血単核食細胞由来の破骨細胞前駆細胞を、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、ｓＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）の存在下で２１日間培養後、誘導された破骨細胞が吸収する骨吸収窩の面積を測定している。その結果、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３が破骨細胞形成に抑制的に働きうることが示された。この系においては骨芽細胞あるいは骨芽細胞様ストローマ細胞からの影響を無視できるため、試験物質の破骨細胞前駆細胞への直接作用がｉｎｖｉｔｒｏで評価できるが、培養期間が長いこと、評価方法が煩雑であること等から、さらなる改良が望まれていた。
以上述べたように、従来の器官培養系や共存培養系を使用して、骨吸収に作用する物質をスクリーニングする方法では、試験物質の破骨細胞前駆細胞への直接作用がｉｎｖｉｔｒｏでは十分評価できなかった。また、Ｉｔｏｎａｇａらの方法では、骨芽細胞等の他の細胞からの影響は無視できるが、迅速性や簡便性等の点でさらなる改良が望まれていた。
発明の開示
本発明は、試験物質の破骨細胞前駆細胞への直接作用が、迅速かつ簡便に評価できるｉｎｖｉｔｒｏでのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
このような背景を受けて、筆者は試験物質の骨吸収への影響をｉｎｖｉｔｒｏで評価可能な系を探索し、破骨細胞前駆細胞への直接作用を検討する系を見いだした。そしてこの系が試験化合物のｉｎｖｉｖｏでの骨吸収抑制あるは亢進作用強度の指標として使用できるのではないかと考え、新規のスクリーニング系として提案するに至った。
すなわち、本発明は
（ａ）試験物質をｉｎｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程、および
（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程、
を含む、骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
また、本発明の別の側面によれば、上記の方法によって得られたビタミンＤ誘導体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の方法によって得られたビタミンＤ誘導体を有効成分として含有する医薬が提供される。
本発明のまた別の側面によれば、破骨細胞前駆細胞、破骨細胞誘導物質および所望により好適な培地を含むキットが提供される。
さらに、本発明の別の側面によれば、ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性を測定することを特徴とする破骨細胞形成抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。
また、本発明の別の側面によれば、物質がビタミンＤ誘導体であって、さらにＶＤＲＥを介する転写促進活性を測定し、ＶＤＲＥを介する転写促進活性が活性型ビタミンＤよりも弱く、ＡＰ−１による転写促進活性を阻害する活性が活性型ビタミンＤによりも強いビタミンＤ誘導体を選択することを特徴とする、破骨細胞形成抑制作用を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。
さらに加えて、本発明の別の側面によれば、かかる方法によって得られる骨粗鬆症の予防及び／又は治療薬が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明のより具体的な態様、並びに本発明を実施するための方法につき説明するが、本発明は下記の記載によって限定されるものではない。
なお、本発明において、「破骨細胞前駆細胞への直接作用」とは、破骨細胞以外の細胞、例えば、骨芽細胞様ストローマ細胞、骨芽細胞、造血系細胞、あるいはそれらの前駆細胞等を介する作用でないことを意味する。
本発明の方法は、骨吸収に影響を与える物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）試験物質をｉｎｖｉｔｒｏにおいて破骨細胞前駆細胞および破骨細胞誘導物質と接触させる工程、および（ｂ）試験物質が破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化に与える影響を確認する工程を含む。
本発明の方法に使用される試験物質としては、骨吸収に影響を与える物質が好ましく、特に、破骨細胞前駆細胞へ直接影響を与えることのできる物質が好ましい。こうした物質は、破骨細胞前駆細胞への直接的作用のみでなく、骨芽細胞様ストローマ細胞、骨芽細胞、造血系細胞、あるいはそれらの前駆細胞等を介する作用をさらに有していてもよい。例えば、各種ホルモン（エストロゲン等）、各種ビタミン（ビタミンＤ誘導体等）、各種サイトカインが挙げられ、特にビタミンＤ誘導体が好ましい。
破骨細胞誘導物質とは、直接的あるいは間接的に破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ誘導する能力を有する物質のことであるが、破骨細胞前駆細胞に直接的に作用して破骨細胞へ誘導できることが望ましい。例えば、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）等が挙げられる。なお、ＲＡＮＫＬは通常膜結合型であるため、培養系では可溶型（ｓＲＡＮＫＬ）を用いることが好ましい。
骨吸収への影響としては、骨吸収の亢進であっても抑制であってもよい。破骨細胞前駆細胞への影響としては、誘導される破骨細胞数の増加あるいは減少、成熟した破骨細胞の活性化、破骨細胞の寿命の調節等が挙げられる。
本発明のスクリーニング法に使用される破骨細胞前駆細胞は、特に限定されないが、骨髄、脾臓、末梢血由来であることが好ましく、骨髄あるいは脾臓由来であることが特に好ましい。また、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ウシ等由来であることが好ましく、マウス由来であることが特に好ましい。例えば、マウスの骨髄由来の破骨細胞前駆細胞を調製するには、まずマウスの脛骨の骨髄腔より骨髄細胞を採取し、血清を含まない培養液で洗浄後、血清含有培養液中に約１〜１０×１０^５個／ｍｌ、好ましくは約４×１０^５個／ｍｌの濃度で浮遊させることが好ましい。このようにして、採取された骨髄細胞を適当量のＭ−ＣＳＦの存在下で培養することで、破骨細胞前駆細胞を誘導することができる。Ｍ−ＣＳＦ等で誘導された破骨細胞前駆細胞に、破骨細胞誘導物質を作用させることで破骨細胞を誘導することができる。
本発明の方法の工程（ａ）においては、試験物質と破骨細胞誘導物質とを含む好適な培地において破骨細胞前駆細胞を培養する。こうした工程により、破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化を誘導する。
培地としては、抗生物質を含むα−ＭＥＭ／ＦＢＳ（ウシ胎児血清）等が好ましく用いられる。培地中にはＭ−ＣＳＦを含む。培養条件は、通常、約３７℃、約５％ＣＯ_２の存在下に行われる。培養期間は、試験物質の種類や添加量、使用する破骨細胞前駆細胞の種類や培養時の細胞密度等にもよるが、通常２日〜１０日、好ましくは２〜１週間、さらに好ましくは約３〜５日間である。
本発明の方法の工程（ｂ）においては、試験物質の骨吸収に及ぼす作用を確認するために、試験物質が破骨細胞前駆細胞の破骨細胞への分化に与えた影響を、例えば、誘導された破骨細胞の数やその骨吸収能等から評価する。簡便性、迅速性の点からは、誘導された破骨細胞数を測定することが好ましい。破骨細胞数測定のためには、染色して顕微鏡下で計数することが好ましい。染色には、通常の組織化学的染色、免疫組織学的染色等が使用できるが、簡便性、迅速性などの点では、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色等が好ましい。
例えば、試験物質を加えた場合に誘導された破骨細胞数と、試験物質を加えなかった場合に誘導された破骨細胞数と比較することで、試験物質の効果を評価してもよい。あるいは、試験物質の骨吸収に及ぼす作用を評価する基準として、何らかの標準物質を使用してもよい。標準物質の種類は特に限定されず、ホルモン、ビタミン、サイトカイン等、任意の物質を適宜使用できる。例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、エストロゲン、ＴＮＦ−α等を標準物質として使用し、これを加えた場合よりも破骨細胞数の減少あるいは増加効果の高い化合物を選択すれば、骨吸収抑制作用あるいは亢進作用の高い有利な化合物を探索することができる。
さらに、本願の方法の別の態様としては、破骨細胞誘導物質の阻害剤を培養液中に加えれば、試験物質による破骨細胞数の変化がその破骨細胞誘導物質を介する作用なのか介さない作用なのかが検出できる。
こうした本発明の方法により選択されるビタミンＤ誘導体は、骨吸収の異常を伴う疾患、特に骨吸収の抑制あるいは亢進がその発症または進行に関与する疾患の治療薬として有用であると予想される。中でも、破骨細胞の形成または活性化過程に異常がみられる疾患、特に破骨細胞数の減少あるいは増加がその発症または進行に関与する疾患の治療薬として有用である可能性があり、例えば、骨粗鬆症、腎性骨異栄養症等の代謝性骨疾患や、慢性関節リウマチ、変形性関節炎等の関節疾患が挙げられる。
本発明の方法により選択されるビタミンＤ誘導体を疾患の治療薬として用いる場合、その剤型は特に限定されず、用途などに応じて、錠剤、カプセル剤、分散剤、溶液、懸濁液、乳剤など任意の形態をとることができる。
投与経路としては、経口投与でも非経口投与でもよく、非経口投与では静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、外用など任意の投与経路を使用できる。
また、投与量も特に限定されず、患者の体重、性別、病状の度合いなどに応じて適宜設定することができ、一般的には０．００１μｇ／ｋｇ／日〜１０００μｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１μｇ／ｋｇ／日〜１００μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ／日〜１０μｇ／ｋｇ／日程度である。
また、投与回数も限定されず、上記投与量を一日一回から数回に分けて投与してもよく、投与期間も、数日〜数週間または数週間〜数カ月間に渡って投与することができる。
本発明のキットは、上述の本発明の方法を行うためのものであり、破骨細胞前駆細胞と破骨細胞誘導物質とを含むが、所望により好適な培地を含んでもよい。
破骨細胞誘導物質としては、直接的あるいは間接的に破骨細胞前駆細胞を破骨細胞へ誘導する能力を有する物質が挙げられる。例えば、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）等が挙げられる。なお、ＲＡＮＫＬを使用する場合には、可溶型を用いることが好ましい。
破骨細胞前駆細胞としては、特に限定されないが、骨髄、脾臓、末梢血由来であることが好ましく、骨髄あるいは脾臓由来であることが特に好ましい。また、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ウシ由来であることが好ましく、マウス由来であることが特に好ましい。本願のキットにおいては、こうした破骨細胞前駆細胞は、容易に培養可能な状態に回復できるような形態で保持されていることが好ましい。例えば、グリセリンやＦＢＳ等を含むα−ＭＥＭ等の培地中で凍結保存した状態や、培養用のフラスコで培養してある状態などである。
また、本発明のキットは、所望により、破骨細胞を検出するための試薬やＭ−ＣＳＦ、培養用プレート、使用説明書、標準物質等を含んでもよい。さらに、破骨細胞誘導物質、Ｍ−ＣＳＦ、試験物質、標準物質等の溶解用バッファーを含んでもよい。破骨細胞を検出するための試薬としては、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）等の他に、放射線、蛍光、酵素等で標識された抗体（例えば、ビトロネクチンレセプター等）等が挙げられる。
本発明のスクリーニング法においては、試験化合物のＶＤＲＥを介する転写促進活性が測定される。ＶＤＲＥとは、ビタミンＤ誘導体などのリガンドが結合したビタミンＤ受容体が結合して作用することによってその下流にある遺伝子の発現が活性化される。ＤＮＡ上の調節配列の１種である。例えば、ビタミンＤの副作用である高カルシウム血症は、ＶＤＲＥを介して生じると考えられている。ＶＤＲＥのＤＮＡ塩基配列は、生物種、並びに同一の生物種の中でも調節の対象となる遺伝子の種類などに応じて異なる場合があるが、本発明においては何れのＶＤＲＥ配列を使用しても構わない。例えば、マウスのオステオポンチン遺伝子のＶＤＲＥ配列を使用してレポーター遺伝子アッセイ系でスクリーニングすることができる。他のＶＤＲＥ配列としては、例えば、ラットオステオカルシン遺伝子、ヒトオステオカルシン遺伝子、ラットカルビンディン−Ｄ_９Ｋ遺伝子、ヒトカルビンディン−Ｄ_９Ｋ遺伝子、マウスカルビンディン−Ｄ_９Ｋ遺伝子、ラット２４−ハイドロキシラーゼ遺伝子、ヒト２４−ハイドロキシラーゼ遺伝子、ニワトリインテグリンβ３遺伝子などが挙げられ、これらも本発明の方法で使用できる。
本発明のスクリーニング法においては、試験化合物の転写因子ＡＰ−１の活性阻害作用が測定される。転写因子とは、一般的には、核内においてＤＮＡからＲＮＡへの転写反応に必要なタンパク質性の因子を意味し、本発明においては特に特定遺伝子の上流の特定の塩基配列を認識して結合することによってその遺伝子の発現を制御する因子を意味する。
ＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ−１）複合体は、Ｊｕｎファミリーのホモ二量体あるいはＦｏｓファミリーのヘテロ二量体から構成され、ＡＰ−１結合部位であるＴＲＥ配列に結合する転写因子である。Ｊｕｎファミリーとしては、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤが、Ｆｏｓファミリーとしては、ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２が同定されている。
ＡＰ−１結合部位を有する遺伝子としては、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αなどのサイトカインや、ＩＣＡＭ−１などの接着分子、コラゲナーゼなどの酵素が知られており、これらの遺伝子のＡＰ−１結合部位を使用したレポーター遺伝子アッセイも利用可能である。ＡＰ−１結合部位のＤＮＡ塩基配列は、生物種、並びに同一の生物種の中でも調節の対象となる遺伝子の種類などに応じて異なる場合があるが、本発明においては何れのＡＰ−１結合部位の配列を使用しても構わない。
ＶＤＲＥを介する転写促進活性、並びにＡＰ−１の活性阻害作用の測定は、当該技術分野で知られている任意の方法により行うことができ、その方法は特に限定されない。好ましくは、レポーター遺伝子アッセイ法が挙げられる。レポーター遺伝子アッセイ法とは、例えば、ＶＤＲＥ配列、プロモーター配列および好適なレポーター遺伝子をこの順序で連結させたベクターとビタミンＤ受容体の発現ベクターとをそれぞれ構築し、好適な宿主にこれらのベクターを同時にトランスフェクションした後、試験物質を添加して細胞を培養し、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を測定することによって、試験物質のＶＤＲＥを介する転写促進活性を評価する方法である。レポーター遺伝子を含むベクターをトランスフェクションする宿主の種類も特に限定されず、当業者ならば当分野で常用される好適な宿主を適宜選択することができる。宿主細胞の非限定的例としては、ヒト由来細胞では、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、ＣａＣＯ−２、ＳａＯＳ、Ｋ５６２、サル由来細胞では、ＣＶ−１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、マウス由来細胞では、ＰＣ−１２、ＲＯＳ１７／２．８、ハムスター由来細胞では、ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１などが挙げられる。
ベクター宿主にトランスフェクションする方法も特に限定されず、当業者ならば当分野で常用される方法の中から適宜選択することができる。トランスフェクション法の非限定的例としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などが挙げられる。
レポーター遺伝子とは、プロモーターやエンハンサーの転写活性などを調べるためにＤＮＡに組込まれる目印用の遺伝子であり、その発現量を測定できる遺伝子であれば特に限定されないが、一般的には検出が簡単で定量化可能なものが好ましい。例えば、発色または発光反応を触媒する酵素の遺伝子などが好適であり、この場合、細胞溶解液に発色反応の基質を添加することによって呈した発色の程度を測定することにより発現した酵素量、即ち転写促進活性を評価することができる。あるいはまた、ＥＬＩＳＡ法などを使用して、抗体によってタンパク質を定量することによってもレポーター遺伝子の発現量を測定できる。
レポーター遺伝子の具体例としては、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）遺伝子、β−Ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子、ｈＧＨ（分泌型ヒト成長ホルモン）遺伝子、ＳＥＡＰ（ヒト分泌型アルカリフォスファターゼ）遺伝子、ＧＦＰ（グリーンフルオレッセントタンパク質）遺伝子およびＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子などが挙げられる。
レポーター遺伝子としてＣＡＴ遺伝子を使用するＣＡＴアッセイでは、転写活性を測定したい調節領域の塩基配列をＣＡＴ遺伝子の上流に接続したレポーター遺伝子ベクターを細胞にトランスデクションなどにより導入して一過性に発現させる。一般的には１２〜７２時間後に細胞抽出液を調製し、それにアセチルＣｏＡとクロラムフェニコールを加えて反応させ、アセチル化されたクロラムフェニコールを薄層クロマトグラフィーなどにより分離同定する。即ち、ＣＡＴアッセイでは、遺伝子の転写活性は、クロラムフェニコールをアセチル化する酵素活性として測定される。
また、ルシフェラーゼは、式：
ルシフェリン＋Ｏ_２ → オキシルシフェリン＋光
で示される発光反応を触媒する発光性酵素の総称である。ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として使用することにより、細胞抽出液に基質と酵素を与えて発光反応を起こさせ、発光の度合いを測定することによりルシフェラーゼの発現量を評価することができる。
上記したようなレポーター遺伝子アッセイ法は、例えば、Ｓ．Ｋ．Ｎｏｒｄｅｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｕｅｓ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．４５４−４５６（１９８８）などに記載されている当業者に公知の常法により行うことができる。あるいはまた、レポーター遺伝子アッセイ法は、ベーリンガーマンハイム社、クロンテック社またはプロメガ社などから市販されているレポーター遺伝子アッセイ用試薬を使用し、その説明書に従って簡便に行うこともできる。
転写促進活性またはＡＰ−１の活性阻害作用を評価するための別法としては、例えば、ゲルシフトアッセイ法、ラン−オン（Ｒｕｎ−ｏｎ）アッセイ法およびラン−オフ（Ｒｕｎ−ｏｆｆ）アッセイ法などが挙げられる。
ゲルシフトアッセイ法は、ＤＮＡの結合性因子を反応させた後に非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行うと、タンパク質と結合したＤＮＡの移動度が結合していないＤＮＡの移動度より小さくなるので、これをラベルしたＤＮＡを用いて検出するものである。
Ｒｕｎ−ｏｎアッセイ法も、特定の遺伝子の転写活性を調べる方法の一つである。細胞より単離した核を用いて、試験管内で転写合成を行わせると、転写開始点からの新たな合成は起こらず、細胞の状態ですでに転写が開始しているＲＮＡ鎖の継続としての、ＲＮＡが伸長する合成反応のみが観察される。そこで、単離核を用いた系で転写産物をラジオアイソトープで標識し、標識されたＲＮＡから、調べたい遺伝子をプローブにより選択的に検出する。このことにより、特定の遺伝子の核を単離した時点での転写活性を測定し、経時変化や転写の相対量を比較検討することができる。
Ｒｕｎ−ｏｆｆアッセイ法もインビトロ転写法の一つで、鋳型ＤＮＡを直鎖状にし、一定の長さの転写産物を合成する方法である。鋳型ＤＮＡは、転写開始点より数百塩基下流を制限酵素で切断したものを用いる。この直鎖状の鋳型ＤＮＡを用いてインビトロ転写法を行うと、ＲＮＡポリメラーゼは切断部位で鋳型ＤＮＡより解離し転写反応が止まるため、一定の長さのＲＮＡができる。この時、反応中に標識リボヌクレオチドを入れており、ＲＮＡを標識、電気泳動後、オートラジオグラムを作製しＲＮＡ量を測定する。
本発明のスクリーニング法においては、ＶＤＲＥを介する転写促進活性よりもＡＰ−１の活性阻害作用の方が相対的に強い化合物が選択される。これは、ＶＤＲＥを介する転写促進活性よりも転写因子の活性阻害作用が強く発現されることにより、ビタミンＤ誘導体の副作用である血中カルシウム上昇作用がないか弱いところで、骨量増加作用などの有用な生理活性が発現するとの予測に基づくものである。従って、スクリーニングの際にＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性をどの程度に設定するかは、選択される化合物の用途などに応じて適宜選択することができ、特定の値に限定されるべきものではない。
本スクリーニング法の好ましい実施態様においては、ＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性を評価するための基準として標準物質を使用することができる。標準物質の種類は特に限定されず、任意の物質を適宜使用できる。例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を標準物質として使用し、この標準物質よりもＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性が高い化合物を選択すれば、副作用の少ない有利な化合物を探索することができる。
特に、ＶＤＲＥを介する転写促進活性またはＡＰ−１の活性阻害作用を本発明のスクリーニング法で測定する場合、一般的には各試験物質のＥＣ５０値またはＩＣ５０値を測定することで各試験物質のＶＤＲＥを介する転写促進活性またはＡＰ−１の活性阻害作用を評価することができる。また、ＡＰ−１の活性阻害作用に対する選択性は、以下の式：
［試験化合物のＡＰ−１の活性阻害作用を標準物質（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３）のものと比較した相対値］／［試験化合物のＶＤＲＥを介する転写促進活性を標準物質（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３）のものと比較した相対値］
で表される値で評価し、この値が一般的には１より高い場合、特に好ましくは１０以上の場合を、標準物質（例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３）よりも転写因子の活性阻害作用に対する選択性が高い化合物として評価することができる。
本発明の破骨細胞形成抑制剤の有効成分となる化合物としては、具体的には１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−｛（２Ｓ）−ヒドロキシ−３−メチルブトキシ｝−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン（化合物７）、１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｓ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン（化合物８）、１α，３β−ジヒドロキシ−（２０Ｒ）−（２−エチル−２−ヒドロキシブチルチオ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０（１９），１６−テトラエン（化合物９）を好適に使用することができる。これらの化合物は、特開平１０−２３１２８４号公報に記載された方法などで製造することができる。
実施例
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
下記の実施例１、２で使用した材料、試薬などは以下の通りである。
６−９週齢のｄｄＹマウスは日本エスエルシー（株）より購入した。α−ＭＥＭ培地（Ａｌｐｈａｍｏｄｉｆｉｅｄｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ）、ＦＢＳおよび抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）は、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社より購入した。マウスＭ−ＣＳＦ、マウスＲＡＮＫＬおよびマウスＯＰＧは、Ｒ＆ＤＳＹＳＴＥＭ社より購入した。マウスＴＮＦ−αは、Ｇｅｎｚｙｍｅ社より購入した。ＴＲＡＰ染色用試薬の基質（ｎａｐｈｔｏｌＡＳ−ＭＸｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と色素（ｆａｓｔｒｅｄｖｉｏｌｅｔＬＢｓａｌｔ）とは、Ｓｉｇｍａ社より購入した。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３は中外製薬株式会社にて製造されたものを使用した。
実施例１
（１）破骨細胞前駆細胞の調製
６−９週齢のマウスを頸椎脱臼にて死亡させた後、脾臓を取り出した。脾臓を裁断して、血清を含まないα−ＭＥＭ中ですりつぶし、遠心して細胞を回収し、培養用α−ＭＥＭ培地（ペニシリン最終濃度５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン最終濃度５０μｇ／ｍｌおよびＦＢＳ最終濃度１０％を含む）で３回洗浄後、再度培養用α−ＭＥＭ培地に４×１０^６個／ｍｌの濃度で浮遊させた。こうして得られたマウス脾臓細胞浮遊液を、４８穴平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社、コード番号３０７８）に１穴あたり２×１０^６個ずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。３日後に、プレートに付着した細胞のみを残して、浮遊細胞を培地吸引とＰＢＳ（リン酸緩衝液）洗浄によって完全に除去した。こうして得られた付着細胞が単球−マクロファージ系の破骨細胞前駆細胞であり、骨芽細胞様ストローマ細胞は混在しないことを、アルカリフォスファターゼ染色によって確認した（ＫｏｂａｙａｓｈｉＫ，ｅｔ．ａｌ．２０００ＪＥｘｐＭｅｄ１９１：２７５）。
（２）試験物質の破骨細胞数への影響の検討
上記のようにして調製された破骨細胞前駆細胞を、上述の培養用α−ＭＥＭ培地（ペニシリン最終濃度５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン最終濃度５０μｇ／ｍｌおよびＦＢＳ最終濃度１０％を含む）にｓＲＡＮＫＬ（最終濃度４０ｎｇ／ｍｌ）と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（最終濃度１×１０^−８ｍｏｌ／Ｌ）とを添加した培養液中で、さらに３日間（プレートから浮遊細胞をＰＢＳで洗浄・除去してプレート付着細胞のみを残した時点を起算とする）培養した。
陽性コントロールとしては、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の代わりにＯＰＧ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）を添加したこと以外は同様の実験を行った。さらに、陰性コントロールとして、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３もＯＰＧも添加しないこと以外は同様の実験を行った。さらに、実験系の手技などによるバックグラウンドが存在しないことを確認するために、Ｍ−ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、ＯＰＧのいずれも添加しないこと以外は同様の実験を行った。
培養終了後、プレート中の細胞を２０％ホルマリンにて固定し、従来法に従ってＴＲＡＰ染色を行った。最終的に染色された３核以上の細胞を破骨細胞として、顕微鏡下で１穴あたりの破骨細胞数をすべて数えた。結果を図１に示す。実験は各群ごとにｎ＝３で行った。
図１から明らかなように、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を濃度１０^−８ｍｏｌ／Ｌで加えた群においては、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３もＯＰＧも添加しない陰性コントロール群と比べて、約６６％の破骨細胞形成阻害活性が観察された。一方、ＯＰＧ２００ｎｇ／ｍｌを加えた陽性コントロール群では、破骨細胞形成が１００％阻害された。Ｍ−ＣＳＦ、ｓＲＡＮＫＬ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、ＯＰＧのいずれも添加しない群においては、破骨細胞の形成が認められなかった。
実施例２
ｓＲＡＮＫＬの代わりにＴＮＦ−α（最終濃度５×１０^−９ｍｏｌ／Ｌ）を使用したこと以外は、上述の実施例１と同様に実験を行った。結果を図２に示す。実験は各群ごとにｎ＝３で行った。図２に示すように、ＴＮＦ−αによって誘導される破骨細胞形成能は、ＯＰＧの添加によっては遮断されなかったが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３（最終濃度１×１０^−８ｍｏｌ／Ｌ）の添加によって約５５％抑制された。
近年、ｓＲＡＮＫＬ以外にＴＮＦ−αによっても破骨細胞前駆細胞から破骨細胞が誘導されることが示されているが、こうしたＴＮＦ−αによる破骨細胞の誘導は、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞誘導作用を阻害するＯＰＧでは遮断されないことが明らかとなっている。本実施例の結果は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３が、ＴＮＦ−αによる破骨細胞形成刺激に対しても抑制的に働くことを示すものであり、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３がＯＰＧとは異なる作用機序で破骨細胞形成を抑制できることが明らかになった。また、本スクリーニング系によって、ＯＰＧでは抑制できない破骨細胞への作用を検出できることも明らかになった。
実施例３〜８
実施例３〜８においては以下の材料、試薬などを使用した。
マウス骨髄細胞は、オス６−９週齢のｄｄＹまたはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本エスエルシーより購入）、あるいはビタミンＤ受容体欠損マウス（入手先）から両下腿骨を取り出し、シリンジを用いて培地で骨髄を取り出した。細胞数は酸性条件下で血球系を除去してカウントし、４８ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに２ｘ１０^５細胞／ｗｅｌｌになるように分配して培養を行った。細胞培養用の培地には１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するα−ＭＥＭを使用した。Ｍｏｕｓｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ（ＩＦＮ−γ）はＰＢＬより購入した。ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（細胞増殖／細胞毒性測定用試薬）はＤＯＪＩＮＤＯから購入した。ＴａｑＭａｎＥＺＲＴ−ＰＣＲｋｉｔ（定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定キット）はＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｒｅｍｓから購入した。リン酸化検出キットであるＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓＩκＢ−ａ（Ｓｅｒ３２）ＡｎｔｉｂｏｄｙＫｉｔ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）ＡｎｔｉｂｏｄｙＫｉｔ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）ＡｎｔｉｂｏｄｙＫｉｔ，Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ＡｎｔｉｂｏｄｙＫｉｔはＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹから購入した。Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＲＡＮＫａｎｔｉｂｏｄｙはＲ＆Ｄ社から購入した。また、抗ＴＲＡＦ６抗体はＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
ビタミンＤ誘導体として下記の化合物を使用した。これらの化合物は国際出願ＷＯ００／４９４０３および特開平１０−２３１２８４号に記載の方法に従って合成した。

ＲＡＮＫ，ＯＰＧ，ＲＡＮＫＬ，ＶＤＲｍＲＡＮ測定に使用した増幅用プライマー及びプローブは以下の通り。

実施例３：破骨細胞形成抑制作用
破骨細胞前駆細胞に直接作用してその分化誘導を促す因子としてｓＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αが同定された。特にＴＮＦ−αは病的条件下で作用すると考えられている。そこで骨髄細胞から誘導した破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）をこれら２つの因子で刺激した時の１，２５Ｄ_３の抑制作用を観察した。マウスから採取した骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下３日間培養してプレートに接着性を示す細胞（ＢＭＭφ）を得た。更にＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、ｓＲＡＮＫＬ（４０ｎｇ／ｍｌ）またはＴＮＦα（５ｘ１０^９ｍｏｌ／Ｌ）を添加して３日間３７℃で培養を行い破骨細胞を産生させた。ビタミンＤ誘導体の破骨細胞形成抑制効果を観察する際は後半の３日間に各誘導体を添加した。培養終了後に培地を除去し、細胞をホルマリン（２０％ホルマリン）で固定してエタノール−アセトンによる細胞膜破壊を行った。その後ＴＲＡＰ染色を行って３核以上のＴＲＡＰ染色された破骨細胞の数を顕微鏡下でカウントした。骨髄細胞から誘導した破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）をｓＲＡＮＫＬまたはＴＮＦαで刺激した時の１，２５Ｄ_３の抑制作用を観察した結果、ｓＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−αいずれの刺激で破骨細胞誘導を行っても、１，２５Ｄ_３は濃度依存的にそれらの誘導を抑制した。またその時のＩＣ_５０は１０^−９〜１０^−８ｍｏｌ／Ｌであった（図３）。
実施例４：破骨細胞形成抑制作用に対するＶＤＲ依存性の検討
活性型ビタミンＤは従来のＶＤＲを介する作用以外に、ＶＤＲを介さない作用が知られている。そこで１，２５Ｄ_３による破骨細胞形成抑制作用がＶＤＲに依存的な作用であるか否かについて、ＶＤＲ遺伝子欠損マウス（ＶＤＲ−ＫＯマウス）由来の骨髄から調製した破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）を用いて検討した。実験方法は前記実施例３と同様に行った。その結果、ＶＤＲ−ＫＯ由来の破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）を用いた場合には、１，２５Ｄ_３１０^−７ｍｏｌ／ｌにおいて全く抑制作用が観察されなかった。このことは活性型ビタミンＤの破骨細胞形成抑制作用はＶＤＲ依存的であることを示す（図４）。
実施例５：破骨細胞形成抑制作用に関する細胞分化段階の検討
骨髄由来のマクロファージ系の細胞が破骨細胞に分化するまでには、（１）Ｍ−ＣＳＦによる破骨細胞前駆細胞への分化過程と、（２）ｓＲＡＮＫＬ＋Ｍ−ＣＳＦによる成熟破骨細胞への分化過程が存在する。活性型ビタミンＤがどちらの過程に主に作用してその抑制作用を発揮するのかを確認するため、図５に示すように添加時期を変えて実験を行った。尚、図５におけるケース１は対象として行った。その結果、養期間中一切１，２５Ｄ_３１０^−８ｍｏｌ／Ｌを添加しない場合（図５におけるケース２）、および、１，２５Ｄ_３１０^−８ｍｏｌ／Ｌを（１）の分化過程にのみ添加した場合（図５におけるケース４）は同程度に破骨細胞形成が誘導されたのに対し、１，２５Ｄ_３１０^−８ｍｏｌ／Ｌを（２）の分化過程のみに添加した場合（図５におけるケース３）、および、１，２５Ｄ_３１０^−８ｍｏｌ／Ｌを（１）と（２）の両方の分化過程に添加した場合（図５におけるケース５）には、同程度に破骨細胞形成が抑制された。以上の結果から、活性型ビタミンＤはｓＲＡＮＫＬ＋Ｍ−ＣＳＦによる成熟破骨細胞への分化過程において抑制作用を発揮していることが示された（図５）。
実施例６：破骨細胞前駆細胞の延命、増殖に対する作用
実施例５で示された活性型ビタミンＤの主な作用段階であるｓＲＡＮＫＬ＋Ｍ−ＣＳＦによる成熟破骨細胞への分化過程においては、Ｍ−ＣＳＦは破骨細胞前駆細胞の増殖／延命に寄与していると考えられている（ＭｉｙａｍｏｔｏＴ，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｂｌｏｏｄ，９６，ｐ４３３５−４３４３）。そこでこれらの細胞に対してｓＲＡＮＫＬを添加しない条件で活性型ビタミンＤを３日間刺激した時の細胞数の変化を検討した。上記と同様にマウスから採取した骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下３日間培養して破骨細胞前駆細胞（ＢＭＭφ）を得た。これらの細胞に対してＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と１，２５Ｄ３１０^−９〜１０^−７ｍｏｌ／Ｌを添加し、更に３日間培養した。その後ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８を用いて各ｗｅｌｌの培地用量の１／１０量の反応液を培地に直接添加し、３７℃で９０分間反応させた。４５０ｎｍ（参考波長６５０ｎｍ）の吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）で測定して細胞数を比較し、１，２５Ｄ_３の細胞増殖性への影響を評価した。その結果１，２５Ｄ_３１０^−９〜１０^−７ｍｏｌ／Ｌでは細胞数はｃｏｎｔｒｏｌとまったく差を認めなかった。このことは、活性型ビタミンＤは細胞の増殖や延命よりも、ｓＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成刺激を阻害していることを示している（図６）。
実施例７：破骨細胞形成抑制作用に影響する要因の検討
活性型ビタミンＤはＶＤＲを介してＡＰ−１による転写活性を阻害することが知られている（ＡｌｒｏｙＩ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，ｐ５７８９−５７９９；ＴｏｗｅｒｓＴＬ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，ｐ１０３８８−１０４８８）。一方で、従来から提唱されているＶＤＲ応答配列（ＶＤＲＥ）を介した転写促進活性を有することも知られている。そこで活性型ビタミンＤの破骨細胞形成抑制活性がＡＰ−１阻害活性とＶＤＲＥ転写活性のいずれの作用に基づくものであるかを検討した。具体的には、１１種類のビタミンＤ誘導体を用いてこれらの活性との相関関係を検討した。ＡＰ−１阻害活性とＶＤＲＥ転写活性の測定は、国際出願ＷＯ００／４９４０３に記載の方法に従った。各化合物の活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）に対するＡＰ−１阻害活性比率とＶＤＲＥ転写活性比率との関係を図７に示した。さらに、各化合物の１０^−９ｍｏｌ／Ｌにおける破骨細胞形成阻害作用（１，２５Ｄ_３に対する％阻害作用）と、活性型ビタミンＤに対するＡＰ−１阻害作用比率およびＶＤＲＥ転写活性比率との相関図を図８に示した。その結果、破骨細胞形成阻害作用はＡＰ−１阻害活性と非常に高い相関が確認された（相関係数Ｒ^２＝０．７８）が、ＶＤＲＥ転写活性とはほとんど相関が認められなかった（相関係数Ｒ^２＝０．０８）。特に化合物８と化合物９に着目すると、ＡＰ−１阻害活性は両化合物とも１，２５Ｄ_３と比較して約２０−３０倍高い一方、ＶＤＲＥ転写活性では化合物９は１，２５Ｄ_３と同程度であるのに対し、化合物９は１，２５Ｄ_３の１／１０程度の活性しか有していない。しかしながら、両化合物は１，２５Ｄ_３と比較して強力な破骨細胞形成抑制作用を示しており、ＡＰ−１阻害活性との相関関係を非常によく反映していることが示された（図９）。これらの結果は、ＡＰ−１阻害活性を測定することで破骨細胞形成阻害作用を有する化合物をスクリーニングすることができることを示す。
実施例８：破骨細胞形成抑制作用メカニズムの検討：その１
ｓＲＡＮＫＬの刺激は破骨細胞前駆細胞膜上に存在するＲＡＮＫを介して細胞内にシグナルが伝えられる。従って、ＲＡＮＫの発現が抑制されたり、あるいはｓＲＡＮＫＬのｄｅｃｏｙ受容体であるｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）の発現が上昇することによって１，２５Ｄ_３による破骨細胞形成抑制作用が発揮されている可能性が考えられる（ＳｉｍｏｎｅｔＷ，ｅｔ．ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ，８９，ｐ３０９−３１９）。そこで、ＲＡＮＫ，とＯＰＧのｍＲＮＡの発現が１，２５Ｄ_３刺激で変化するか否かを調べた。対照としてＶＤＲ，ＲＡＮＫＬのｍＲＮＡの発現も測定した。マウスから採取した（ＢＭＭφ）を得た。これらの細胞に対してＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）と１，２５Ｄ_３１０^−８ｍｏｌ／Ｌを添加し、更に３日間培養した。培養終了後、細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを回収し（ＳＶｔｏｔａｌＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａを使用）、ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。内部標準としてＧＡＰＤＨを測定して補正を行った。その結果ＲＡＮＫｍＲＮＡは１，２５Ｄ_３刺激で全く変化しなかった。また、ＯＰＧｍＲＮＡは１，２５Ｄ_３により発現が抑制された。これらの結果は、１，２５Ｄ_３による破骨細胞形成抑制作用がＲＡＮＫｍＲＮＡの発現を抑制したり、ＯＰＧｍＲＮＡの発現を上昇させることによりもたらされているのではないことを示す（図１０）。
実施例９：破骨細胞形成抑制作用メカニズムの検討：その２
ＲＡＮＫを介する細胞内シグナル伝達経路に対する活性型ビタミンＤの作用を検討した。ＲＡＮＫのシグナル伝達に関与する分子としてＩκＢ（ＷｅｉＳ，ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２，ｐ１２９０−１２９５）、ＪＮＫ（ＷｏｎｇＢＲ，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，ｐ２５１９０−２５１９４）とｐ３８ＭＡＰＫ（ＭａｔｓｕｍｏｔｏＭ．，ｅｔ．Ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，ｐ３１１５５−３１１６１）が知られていることから、これらの分子のリン酸化を活性の指標として１，２５Ｄ_３の影響を調べた。陽性対照としてはこれらの経路を抑制することが知られているＩＦＮ−γを使用した（ＴａｋａｙａｎａｇｉＨ．，ｅｔ．ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０８，ｐ６００−６０５）。１〜２ｘ１０^７個のマウス由来骨髄細胞をＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下３．５ｃｍディッシュ上で３日間培養し、破骨細胞前駆細胞を得た（ＢＭＭφ）。これらの細胞を低濃度のウシ胎児由来血清中（０．３％ＦＢＳ）でＭ−ＣＳＦ存在下（ＩκＢとｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化）または非存在下（ＪＮＫとＥＲＫ１／２のリン酸化）、２４時間培養した。抑制効果を観察したい検体（１，２５Ｄ_３１０^−８ｍｏｌ／ＬとＩＦＮ−γ １００Ｕ／ｍｌ）はこの時から添加した。翌日、組成が同一の新しい培地に交換し、２時間後にｓＲＡＮＫＬ８０ｎｇ／ｍｌで１５分間細胞を刺激した。反応終了後直ちに培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後、Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ（Ｎａｋａｒａｉ、ＣａｔａｌｏｇＮｏ．３０５６６−２２）で細胞を溶解した。超音波破砕を行った後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔにより各タンパク質のリン酸化を測定。その結果１，２５Ｄ_３はこれらの活性化には全く影響を及ぼさないことが明らかとなった（図１１）。陽性対象であるＩＦＮ−γはすべてのタンパク質のリン酸化を抑制した。
産業上の利用の可能性
上述のように、本発明のスクリーニング法は、ｉｎｖｉｔｒｏでの試験化合物の骨吸収抑制あるは亢進作用強度の検出法として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ｓＲＡＮＫＬによる破骨細胞産生誘導に対する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の抑制効果を示すグラフである。図中のバーは平均値±標準偏差を示す。
図２は、ＴＮＦ−αによる破骨細胞産生誘導に対する１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３の抑制効果を示すグラフである。図中のバーは平均値±標準偏差を示す。
図３は、ｓＲＡＮＫＬおよびＴＮＦ−αによる骨髄細胞由来破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞形成におよぼす活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）の抑制作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌは１，２５Ｄ_３を添加していない場合を示す。
図４は、正常マウスおよびＶＤＲ遺伝子欠損マウス（ＶＤＲ−ＫＯマウス）から採取した骨髄細胞由来破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞形成におよぼす活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）の抑制作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌは１，２５Ｄ_３を添加していない場合を示す。
図５は、活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）の添加時期による破骨細胞形成抑制作用を示す図である。
図６は、Ｍ−ＣＳＦによる破骨細胞前駆細胞の増殖作用に対する活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）の作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌは１，２５Ｄ_３を添加していない場合を示す。
図７は、各化合物の活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）に対するＡＰ−１阻害活性比率とＶＤＲＥ転写促進活性比率との関係を示す図である。図中の数字は化合物番号を示す。
図８は、各化合物の活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）に対するＡＰ−１阻害活性比率およびＶＤＲＥ転写促進活性比率と破骨細胞形成抑制作用（１，２５Ｄ_３に対する％阻害作用）との関係を示す図である。Ｒ^２は相関係数を示す。
図９は、活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３）、化合物８、および化合物９の各濃度における破骨細胞形成抑制作用を示す図である。図中ｃｏｎｔｒｏｌはいずれの化合物も添加していない場合を示す。
図１０は、骨髄由来破骨細胞前駆細胞における各タンパク質のｍＲＮＡ発現量に対する活性型ビタミンＤ（１，２５Ｄ_３：１ｘ１０^−８Ｍ）の作用を示した図である。縦軸はいずれも無刺激状態からの変化率を示す。
図１１は、骨髄由来破骨細胞前駆細胞におけるＩκＢ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の程度を示す図である。図中＋は添加、−は非添加を示す。 Technical field
The present invention relates to a novel method for screening substances that affect bone resorption, and more particularly, to a novel method for screening substances that affect osteoclast precursor cells in vitro.
Background art
Substances acting on bone resorption can be expected to have therapeutic effects on metabolic bone diseases such as metabolic bone diseases (eg, osteoporosis, renal osteodystrophy). In order to develop such a substance as a therapeutic drug or the like, it is essential to screen for a substance that acts on bone resorption, and various screening methods have been developed to date.
Conventional methods for screening substances that affect bone resorption in vitro are roughly classified into methods using an organ culture system and methods using a co-culture system. However, since bone resorption is caused by various factors intricately intertwined with each other, it is difficult to accurately and simply evaluate the effects of various compounds. In vivo, a compound showing a bone resorption inhibiting activity cannot be used in an in vitro screening system. It may also exhibit bone resorption promoting activity.
In a method using an organ culture system,⁴⁵Ca (Raisz LG 1963 Nature 197: 1015) or³Mouse fetal bone (long tube bone or parietal bone) labeled with H-proline (Stern BD, et. Al. 1965 Proc Soc Exp Biol Med 119: 577) or the like is cultured in a culture solution containing a test compound, and cultured. The strength of bone resorption is evaluated from the amount of radiolabel released in the solution. Unlabeled calcium (⁴⁰There is also a method using Ca) (Hohmann, et. Al. 1983 Endocrinology 112: 1233). The present system includes, in addition to mature osteoclasts, various types of cells such as osteoblasts, hematopoietic cells, or precursor cells thereof. Therefore, the enhancement of bone resorption detected in this system not only increases the number of osteoclasts by activating existing osteoclasts but also promotes differentiation into osteoclasts, and also has the effect of promoting collagenase secretion from osteoblasts. It is considered to be included. The action of estrogen, which is known to directly act on osteoclast precursor cells to suppress their differentiation, has not been confirmed in this system. Thus, methods using organ culture systems may not be suitable for detecting direct effects on osteoclast precursor cells. There are also problems such as complicated operations and use of a large amount of radioactive elements.
The method using the co-culture system evaluates activation of a process in which blood stem cells (osteoclast precursor cells) are differentiated into osteoclasts, using the number of produced osteoclasts as an index. In vitro, osteoclast precursor cells become osteoclasts by stimulation of bone resorption-promoting factors (parathyroid hormone, prostaglandins, etc.) in the presence of osteoblast-like stromal cells. Cells used as osteoclast precursor cells and osteoclast-forming supporting cells in this system are: 1) bone marrow cells only (Tatsuo Suda et al., 1992 Macrophage Experiment Manual (Toru Tokunaga et al., Eds.) P. 60, Kodansha, Takahashi N) Et al., 1988 Endocrinology 122: 1373), 2) bone marrow cells or spleen cells and parietal bone-derived osteoblast-like stromal cells (Takahashi N, et. Al. 1988 Endocrinology 123: 2600).
In this system, OPG (osteoprotegerin) that blocks a signal from the osteoblast side to the osteoclast precursor cell side has been identified as an osteoclast inhibitor (Simonet WS, et. Al. 1997 Cell 89: 309, Tsuda E, et.al. 1997 Biochem Biophys Res Coramun 234: 137, Yasuda H, et.al. 1998 Endocrinology 39: 1329), the action of estrogen acting directly on the osteoclast precursor cells side is based on the organ culture system. Similarly, it has not been identified in this system. Therefore, this system may also not be suitable for detecting direct effects on osteoclast precursor cells.
For example, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Or 1α-hydroxyvitamin D₃It is known that such vitamin D derivatives have bone resorption inhibiting activity in vivo based on the results of experiments and clinical tests using osteoporosis model rats (Shiraishi A, et. Al. 2000 J Bone Miner Res. 15: 770, Sairanen S, et al. 2000 Calcified Tissue Int 67: 122), which has already been widely used clinically as a therapeutic drug for metabolic bone diseases such as osteoporosis. In pharmacologic dose, bone resorption inhibiting activity is 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃It is thought to greatly contribute to the maintenance or increase of bone mass.
Such 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃The bone resorption inhibitory activity of indirectly suppresses bone resorption by (a) promoting calcium absorption from the small intestine, (b) suppressing secretion of parathyroid hormone (PTH), and the like. Conventional in vitro screening It was thought that the system could not evaluate. In fact, in the organ culture system described above, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Only a bone resorption-promoting activity was observed (Takuhiko Akazu et al., 1989 Experimental Medicine 7: 1272), and even in a co-culture system, the vitamin D derivative acts as an osteoclast formation promoting factor via osteoblasts. . These results indicate that 1α, 25-dihydroxyvitamin D in vivo₃Does not match the bone resorption inhibiting activity shown by
However, recent studies have shown that 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Has been shown to have a bone resorption inhibiting activity that cannot be explained in the above (a) and (b) (Sairanen S, et. Al. 2000 Calcified Tissue Int 67: 122, Endo K-1, et. Al. 2000 J Bone Miner Res 15: 175). If the bone resorption inhibitory activity not due to (a) and (b) is due to a direct action on osteoclasts, it may not be possible to evaluate the activity using a conventional in vitro screening system.
In recent years, it has become clear that osteoclastogenesis is induced by the expression of RANK ligand (RANKL) present on the membrane of osteoblasts or osteoblast-like stromal cells, which is increased by osteoclast-forming factors. became. Furthermore, it has been reported that soluble RANKL (soluble RANKL, sRANKL) also has osteoclast-forming ability.
Devised an osteoclast-forming system that induces osteoclasts by adding a certain amount of sRANKL instead of activating osteoblasts or osteoblast-like stromal cells as in the prior art (Itonaga I). , Et., Al. 1999 Biochem Biophys Res Commun 264: 590). In this system, osteoclast precursor cells derived from human peripheral blood mononuclear phagocytes are converted to 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃After culturing for 21 days in the presence of sRANKL and M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), the area of the bone resorption fossa where the induced osteoclasts resorb is measured. As a result, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Has been shown to be able to suppress osteoclast formation. In this system, the effects of osteoblasts or osteoblast-like stromal cells can be neglected, so the direct action of test substances on osteoclast precursor cells can be evaluated in vitro. Is further complicated, and thus further improvement has been desired.
As described above, in the method of screening for a substance that acts on bone resorption using a conventional organ culture system or co-culture system, the direct effect of a test substance on osteoclast precursor cells is sufficiently evaluated in vitro. could not. In the method of Itonaga et al., The influence from other cells such as osteoblasts can be neglected, but further improvement has been desired in terms of quickness and simplicity.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide an in vitro screening method in which the direct action of a test substance on osteoclast precursor cells can be evaluated quickly and easily.
Against this background, the author searched for a system capable of evaluating the effect of a test substance on bone resorption in vitro, and found a system for examining the direct action on osteoclast precursor cells. We thought that this system could be used as an indicator of the in vivo inhibition or enhancement of the test compound's bone resorption, and thus proposed a novel screening system.
That is, the present invention
(A) contacting the test substance with an osteoclast precursor cell and an osteoclast-inducing substance in vitro;
(B) confirming the effect of the test substance on the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts;
And a method for screening for a substance that affects bone resorption.
According to another aspect of the present invention, there is provided a vitamin D derivative obtained by the above method.
According to still another aspect of the present invention, there is provided a medicine containing the vitamin D derivative obtained by the above method as an active ingredient.
According to another aspect of the present invention, there is provided a kit comprising an osteoclast precursor cell, an osteoclast-inducing substance, and optionally a suitable medium.
Further, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for screening a substance having an osteoclast formation inhibitory activity, which comprises measuring the activity of inhibiting the transcription promoting activity of AP-1.
According to another aspect of the present invention, the substance is a vitamin D derivative, and the transcription promoting activity via VDRE is measured. The transcription promoting activity via VDRE is weaker than that of active vitamin D. A method for screening a substance having an osteoclast formation-inhibiting action, characterized by selecting a vitamin D derivative having an activity of inhibiting the transcription promoting activity of the vitamin D stronger than active vitamin D.
Still further, according to another aspect of the present invention, there is provided an agent for preventing and / or treating osteoporosis obtained by such a method.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, more specific embodiments of the present invention and a method for carrying out the present invention will be described, but the present invention is not limited by the following description.
In the present invention, "direct action on osteoclast precursor cells" refers to cells other than osteoclasts, such as osteoblast-like stromal cells, osteoblasts, hematopoietic cells, or precursor cells thereof. Means that the action is not through.
The method of the present invention is a method of screening for a substance that affects bone resorption, comprising: (a) contacting a test substance with an osteoclast precursor cell and an osteoclast-inducing substance in vitro; and (b) Confirming the effect of the test substance on the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts.
As the test substance used in the method of the present invention, a substance that affects bone resorption is preferable, and in particular, a substance that can directly affect osteoclast precursor cells is preferable. Such a substance may have not only an action directly on osteoclast precursor cells, but also an action via osteoblast-like stromal cells, osteoblasts, hematopoietic cells, or precursor cells thereof. . For example, various hormones (such as estrogen), various vitamins (such as vitamin D derivatives), and various cytokines can be mentioned, and vitamin D derivatives are particularly preferable.
An osteoclast-inducing substance is a substance that has the ability to directly or indirectly induce osteoclast precursor cells into osteoclasts. It is desirable to be able to induce cells. For example, RANKL, TNF-α (tumor necrosis factor α) and the like can be mentioned. Since RANKL is usually a membrane-bound type, it is preferable to use a soluble type (sRANKL) in a culture system.
The effect on bone resorption may be enhancement or suppression of bone resorption. Effects on osteoclast precursor cells include an increase or decrease in the number of induced osteoclasts, activation of mature osteoclasts, regulation of the life of osteoclasts, and the like.
The osteoclast precursor cells used in the screening method of the present invention are not particularly limited, but are preferably derived from bone marrow, spleen, and peripheral blood, and particularly preferably derived from bone marrow or spleen. It is preferably derived from mice, rats, rabbits, humans, cows, etc., and particularly preferably derived from mice. For example, in order to prepare mouse bone marrow-derived osteoclast precursor cells, first, bone marrow cells are collected from the bone marrow cavity of the mouse tibia, washed with a serum-free culture solution, and added to a serum-containing culture solution. -10 × 10⁵Pcs / ml, preferably about 4 × 10⁵It is preferable that the suspension is performed at a concentration of particles / ml. Thus, by culturing the collected bone marrow cells in the presence of an appropriate amount of M-CSF, osteoclast precursor cells can be induced. Osteoclasts can be induced by causing an osteoclast-inducing substance to act on osteoclast precursor cells induced by M-CSF or the like.
In step (a) of the method of the present invention, osteoclast precursor cells are cultured in a suitable medium containing a test substance and an osteoclast-inducing substance. These steps induce differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts.
As the medium, α-MEM / FBS (fetal bovine serum) containing an antibiotic is preferably used. The medium contains M-CSF. Culture conditions are usually about 37 ° C. and about 5% CO 2.₂Done in the presence of The culture period depends on the type and amount of the test substance, the type of osteoclast precursor cells to be used, the cell density at the time of culture, and the like, but is usually 2 to 10 days, preferably 2 to 1 week, and more preferably About 3-5 days.
In step (b) of the method of the present invention, in order to confirm the effect of the test substance on bone resorption, the effect of the test substance on the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts is determined, for example, by induction. Evaluation is made based on the number of osteoclasts and their bone resorption ability. It is preferable to measure the number of induced osteoclasts from the viewpoint of simplicity and rapidity. For measuring the number of osteoclasts, it is preferable to stain and count under a microscope. For staining, ordinary histochemical staining, immunohistological staining and the like can be used, but in terms of simplicity and rapidity, tartaric acid-resistant acid phosphatase staining and the like are preferable.
For example, the effect of the test substance may be evaluated by comparing the number of osteoclasts induced when the test substance was added with the number of osteoclasts induced without the test substance. Alternatively, some standard substance may be used as a criterion for evaluating the effect of the test substance on bone resorption. The type of the standard substance is not particularly limited, and any substance such as a hormone, a vitamin, and a cytokine can be appropriately used. For example, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃, Estrogen, TNF-α, or the like as a standard substance, and selecting a compound having a higher effect of reducing or increasing the number of osteoclasts than the case where it is added, an advantageous compound having a high effect of inhibiting or enhancing bone resorption. Can be searched.
Further, as another embodiment of the method of the present application, if an inhibitor of an osteoclast-inducing substance is added to a culture solution, it is difficult to determine whether the change in the number of osteoclasts caused by the test substance is an effect mediated by the osteoclast-inducing substance. No effect can be detected.
Such a vitamin D derivative selected by the method of the present invention is expected to be useful as a therapeutic agent for a disease associated with abnormal bone resorption, particularly a disease in which suppression or enhancement of bone resorption is involved in the onset or progression of the disease. Among them, diseases in which abnormalities are observed in the formation or activation process of osteoclasts, in particular, may be useful as therapeutic agents for diseases in which the decrease or increase in the number of osteoclasts is involved in the onset or progression thereof, for example, Examples include metabolic bone diseases such as osteoporosis and renal osteodystrophy, and joint diseases such as rheumatoid arthritis and osteoarthritis.
When the vitamin D derivative selected by the method of the present invention is used as a therapeutic agent for a disease, its dosage form is not particularly limited, and depending on the use, tablets, capsules, dispersants, solutions, suspensions, emulsions Any form can be adopted.
The administration route may be oral administration or parenteral administration. For parenteral administration, any administration route such as intravenous, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or external use can be used.
The dose is not particularly limited, and can be appropriately set depending on the patient's weight, sex, degree of medical condition, and the like, and is generally 0.001 μg / kg / day to 1000 μg / kg / day, preferably It is about 0.01 μg / kg / day to 100 μg / kg / day, more preferably about 0.1 μg / kg / day to 10 μg / kg / day.
In addition, the number of administrations is not limited, and the above dosage may be administered once a day or divided into several times, and the administration period may be several days to several weeks or several weeks to several months. Can be.
The kit of the present invention is for performing the above-described method of the present invention, and contains an osteoclast precursor cell and an osteoclast-inducing substance, and may optionally contain a suitable medium.
Examples of the osteoclast-inducing substance include substances having an ability to directly or indirectly induce osteoclast precursor cells into osteoclasts. For example, RANKL, TNF-α (tumor necrosis factor α) and the like can be mentioned. In addition, when using RANKL, it is preferable to use a soluble type.
The osteoclast precursor cells are not particularly limited, but are preferably derived from bone marrow, spleen, or peripheral blood, and particularly preferably derived from bone marrow or spleen. It is preferably derived from a mouse, rat, rabbit, human, or cow, and particularly preferably derived from a mouse. In the kit of the present application, it is preferable that such osteoclast precursor cells are maintained in a form that can be easily recovered to a cultivable state. For example, there are a state of being frozen and stored in a medium such as α-MEM containing glycerin and FBS, and a state of being cultured in a culture flask.
Further, the kit of the present invention may contain a reagent for detecting osteoclasts, M-CSF, a culture plate, an instruction manual, a standard substance, and the like, if desired. Furthermore, it may contain a lysis buffer such as an osteoclast-inducing substance, M-CSF, a test substance, or a standard substance. As a reagent for detecting osteoclasts, in addition to tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the like, an antibody (for example, vitronectin receptor or the like) labeled with radiation, fluorescence, an enzyme, or the like can be given.
In the screening method of the present invention, the VDRE-mediated transcription promoting activity of a test compound is measured. With VDRE, the expression of a gene downstream thereof is activated by the action of a vitamin D receptor to which a ligand such as a vitamin D derivative is bound. A type of regulatory sequence on DNA. For example, hypercalcemia, a side effect of vitamin D, is thought to occur via VDRE. The DNA base sequence of VDRE may be different depending on the species of the organism and the type of gene to be regulated among the same species of organism, but any VDRE sequence may be used in the present invention. . For example, the VDRE sequence of the mouse osteopontin gene can be used to screen in a reporter gene assay system. Other VDRE sequences include, for example, rat osteocalcin gene, human osteocalcin gene, rat calbindin-D_9KGene, human calbindin-D_9KGene, mouse calbindin-D_9KGene, rat 24-hydroxylase gene, human 24-hydroxylase gene, chicken integrin β3 gene and the like, and these can also be used in the method of the present invention.
In the screening method of the present invention, the activity of a test compound to inhibit the activity of the transcription factor AP-1 is measured. The transcription factor generally means a protein factor required for a transcription reaction from DNA to RNA in the nucleus, and in the present invention, specifically recognizes and binds to a specific base sequence upstream of a specific gene. Means a factor that controls the expression of that gene.
The AP-1 (activator protein-1) complex is a transcription factor that is composed of a Jun family homodimer or a Fos family heterodimer and binds to a TRE sequence that is an AP-1 binding site. C-Jun, JunB, and JunD have been identified as the Jun family, and c-Fos, FosB, Fra-1, and Fra-2 have been identified as the Fos family.
Examples of the gene having an AP-1 binding site include cytokines such as interleukin-1, interleukin-2, interleukin-5, GM-CSF, and TNF-α, adhesion molecules such as ICAM-1, and enzymes such as collagenase. And a reporter gene assay using the AP-1 binding site of these genes is also available. The DNA base sequence of the AP-1 binding site may be different depending on the species of the organism and the type of the gene to be regulated among the same species of organisms. May be used.
The measurement of the VDRE-mediated transcription promoting activity and the activity inhibiting action of AP-1 can be performed by any method known in the art, and the method is not particularly limited. Preferably, a reporter gene assay method is used. The reporter gene assay method is, for example, constructing a vector in which a VDRE sequence, a promoter sequence and a suitable reporter gene are ligated in this order, and an expression vector for a vitamin D receptor, and simultaneously transferring these vectors to a suitable host. After transfection, a test substance is added, the cells are cultured, and the expression level of a reporter gene in the cells is measured to evaluate the VDRE-mediated transcription promoting activity of the test substance. The type of host to which the vector containing the reporter gene is transfected is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately select a suitable host commonly used in the art. Non-limiting examples of host cells include Jurkat cells, HeLa cells, HepG2, CaCO-2, SaOS, K562 for human-derived cells and CV-1, COS-1, COS- for monkey-derived cells. 7. PC-12 and ROS17 / 2.8 are derived from mouse-derived cells, and CHO-K1 and BHK-21 are derived from hamster-derived cells.
The method for transfecting the vector host is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately select from methods commonly used in the art. Non-limiting examples of transfection methods include the calcium phosphate method, DEAE-dextran treatment, electroporation, lipofection, and the like.
A reporter gene is a marker gene incorporated into DNA for examining the transcriptional activity of a promoter or enhancer, and is not particularly limited as long as its expression level can be measured, but is generally easy to detect. Those that can be quantified are preferred. For example, a gene for an enzyme that catalyzes a color-forming or luminescent reaction is suitable.In this case, the amount of an enzyme expressed by measuring the degree of color development exhibited by adding a substrate for a color-forming reaction to a cell lysate, that is, The transcription promoting activity can be evaluated. Alternatively, the expression level of the reporter gene can also be measured by quantifying the protein with an antibody using an ELISA method or the like.
Specific examples of the reporter gene include CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene, Luc (luciferase) gene, β-Gal (β-galactosidase) gene, hGH (secretory human growth hormone) gene, and SEAP (human secretory type). Alkaline phosphatase) gene, GFP (green fluorescent protein) gene, GUS (β-glucuronidase) gene and the like.
In a CAT assay using a CAT gene as a reporter gene, a reporter gene vector in which the nucleotide sequence of a regulatory region whose transcriptional activity is to be measured is connected upstream of the CAT gene is introduced into cells by transduction and transiently expressed. . Generally, after 12 to 72 hours, a cell extract is prepared, acetyl-CoA and chloramphenicol are added thereto and reacted, and acetylated chloramphenicol is separated and identified by thin-layer chromatography or the like. That is, in the CAT assay, the transcription activity of a gene is measured as an enzyme activity for acetylating chloramphenicol.
Luciferase has the formula:
Luciferin + O₂ → Oxyluciferin + light
Is a generic term for luminescent enzymes that catalyze the luminescent reaction shown by. By using luciferase as a reporter gene, a luminescence reaction is caused by giving a substrate and an enzyme to a cell extract, and the expression level of luciferase can be evaluated by measuring the degree of luminescence.
Reporter gene assays such as those described above are described, for example, in K. Norden, Biotechniques, Vol. 6, pp. 454-456 (1988) and the like, which are well known to those skilled in the art. Alternatively, the reporter gene assay method can be carried out simply by using a reporter gene assay reagent commercially available from Boehringer Mannheim, Clontech, Promega, or the like and following the instructions.
Alternative methods for evaluating the transcription promoting activity or the activity inhibiting effect of AP-1 include, for example, a gel shift assay, a run-on assay and a run-off assay. No.
In the gel shift assay, when the electrophoresis is performed using a non-denaturing polyacrylamide gel after reacting the binding factor of DNA, the mobility of the DNA bound to the protein becomes smaller than the mobility of the unbound DNA. , Which are detected using labeled DNA.
The Run-on assay is also one of the methods for examining the transcription activity of a specific gene. When transcription synthesis is performed in vitro using a nucleus isolated from a cell, new synthesis from the transcription start site does not occur, and as a continuation of the RNA strand that has already started transcription in the cell state. Only the synthesis reaction in which the RNA elongates is observed. Thus, the transcript is labeled with a radioisotope in a system using an isolated nucleus, and the gene to be examined is selectively detected from the labeled RNA using a probe. This makes it possible to measure the transcriptional activity at the time when the nucleus of the specific gene is isolated, and to compare and examine changes over time and the relative amount of transcription.
The Run-off assay is also one of the in vitro transcription methods, in which a template DNA is linearized to synthesize a transcript of a certain length. As the template DNA, one obtained by cutting a few hundred bases downstream from the transcription start point with a restriction enzyme is used. When an in vitro transcription method is performed using this linear template DNA, RNA polymerase is dissociated from the template DNA at the cleavage site and the transcription reaction is stopped, so that RNA of a certain length is formed. At this time, a labeled ribonucleotide is added during the reaction, and after labeling and electrophoresis of the RNA, an autoradiogram is prepared and the amount of the RNA is measured.
In the screening method of the present invention, a compound is selected which has a stronger activity of inhibiting the activity of AP-1 than the activity of promoting transcription via VDRE. This is because the activity of inhibiting the activity of a transcription factor is more strongly expressed than the activity of promoting transcription via VDRE, and thus there is no or weak blood calcium elevation which is a side effect of the vitamin D derivative. It is based on the prediction that a physiological activity will be expressed. Therefore, the degree of selectivity for the activity-inhibiting action of AP-1 at the time of screening can be appropriately selected according to the use of the selected compound and the like, and should be limited to a specific value. Not something.
In a preferred embodiment of the present screening method, a standard substance can be used as a criterion for evaluating the selectivity for the activity inhibitory action of AP-1. The type of the standard substance is not particularly limited, and any substance can be appropriately used. For example, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Is used as a standard substance, and if a compound having a higher selectivity for the activity-inhibiting action of AP-1 than this standard substance is selected, an advantageous compound with less side effects can be searched for.
In particular, when the VDRE-mediated transcription promoting activity or AP-1 activity inhibitory effect is measured by the screening method of the present invention, generally, the VDRE of each test substance is measured by measuring the EC50 value or IC50 value of each test substance. Can be used to evaluate the transcription promoting activity or AP-1 activity inhibiting effect. In addition, the selectivity for the activity inhibitory effect of AP-1 is represented by the following formula:
[The inhibitory effect of the test compound on the activity of AP-1 was determined using a standard substance (eg, 1α, 25-dihydroxyvitamin D).₃) / [VDRE-mediated transcription promoting activity of a test compound was measured using a standard substance (eg, 1α, 25-dihydroxyvitamin D).₃)]
In general, when this value is higher than 1, particularly preferably 10 or more, a standard substance (for example, 1α, 25-dihydroxyvitamin D) is used.₃) Can be evaluated as a compound having a higher selectivity for the activity inhibitory action of the transcription factor than that of the compound.
Specific examples of the compound serving as an active ingredient of the osteoclast formation inhibitor of the present invention include 1α, 3β-dihydroxy- (20S)-{(2S) -hydroxy-3-methylbutoxy} -9,10-secopregna. -5,7,10 (19), 16-tetraene (compound 7), 1α, 3β-dihydroxy- (20S)-(2-ethyl-2-hydroxybutylthio) -9,10-secopregna-5,7, 10 (19), 16-tetraene (compound 8), 1α, 3β-dihydroxy- (20R)-(2-ethyl-2-hydroxybutylthio) -9,10-secopregna-5,7,10 (19), 16-tetraene (compound 9) can be suitably used. These compounds can be produced, for example, by the method described in JP-A-10-231284.
Example
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
Materials and reagents used in Examples 1 and 2 below are as follows.
6-9 week old ddY mice were purchased from Japan SLC, Inc. α-MEM medium (Alpha modified minimum medium), FBS and antibiotics (penicillin-streptomycin) were purchased from GIBCO BRL. Mouse M-CSF, mouse RANKL and mouse OPG were purchased from R & D SYSTEM. Mouse TNF-α was purchased from Genzyme. The TRAP staining reagent substrate (naphtol AS-MX phosphate) and dye (fast red violet LB salt) were purchased from Sigma. 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Used was manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Example 1
(1) Preparation of osteoclast precursor cells
A 6-9 week old mouse was killed by cervical dislocation, and the spleen was removed. The spleen is cut, triturated in serum-free α-MEM, centrifuged to collect the cells, and cultured for α-MEM medium (penicillin final concentration 50 units / ml, streptomycin final concentration 50 μg / ml and FBS final concentration 10 μm / ml). %), And 4 × 10 5 again in α-MEM medium for culture.⁶The cells were suspended at a concentration of cells / ml. The mouse spleen cell suspension thus obtained was placed in a 48-well flat bottom plate (Falcon, code No. 3078) at 2 × 10 4 per well.⁶Put each piece at 37 ℃, 5% CO₂And cultured. Three days later, the floating cells were completely removed by aspirating the medium and washing with PBS (phosphate buffer), leaving only the cells attached to the plate. It was confirmed by alkaline phosphatase staining that the adherent cells thus obtained were monocyte-macrophage osteoclast precursor cells and osteoblast-like stromal cells were not mixed (Kobayashi K, et. Al. 2000 J Exp). Med 191: 275).
(2) Examination of the effect of the test substance on the number of osteoclasts
The osteoclast precursor cells prepared as described above are added to the above-described α-MEM medium for culture (containing a final concentration of penicillin of 50 units / ml, a final concentration of streptomycin of 50 μg / ml and a final concentration of FBS of 10%) in sRANKL ( (Final concentration 40 ng / ml) and 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃(Final concentration 1 × 10^-8(mol / L) and further cultured for 3 days (starting from the time when the floating cells were washed and removed from the plate with PBS to leave only the cells attached to the plate).
As a positive control, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃The same experiment was performed except that OPG (final concentration: 200 ng / ml) was added instead of. Further, as a negative control, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃The same experiment was performed except that neither OPG nor OPG was added. Furthermore, in order to confirm that there was no background due to experimental procedures or the like, M-CSF, sRANKL, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃, And OPG, except that neither was added.
After completion of the culture, the cells in the plate were fixed with 20% formalin, and subjected to TRAP staining according to a conventional method. The cells stained with three or more nuclei finally stained were regarded as osteoclasts, and the number of osteoclasts per well was counted under a microscope. The results are shown in FIG. The experiment was performed with n = 3 for each group.
As is clear from FIG. 1, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃The concentration 10^-8In the group added in mol / L, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃About 66% of the osteoclast formation inhibitory activity was observed as compared with the negative control group to which neither OPG nor OPG was added. On the other hand, in the positive control group to which 200 ng / ml of OPG was added, osteoclast formation was inhibited by 100%. M-CSF, sRANKL, 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃In the group to which neither OPG nor OPG was added, formation of osteoclasts was not observed.
Example 2
Instead of sRANKL, TNF-α (final concentration 5 × 10^-9(mol / L), and the experiment was performed in the same manner as in Example 1 described above. FIG. 2 shows the results. The experiment was performed with n = 3 for each group. As shown in FIG. 2, the ability of TNF-α to induce osteoclast formation was not blocked by the addition of OPG, but 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃(Final concentration 1 × 10^-8(mol / L) was suppressed by about 55%.
In recent years, it has been shown that osteoclasts are induced from osteoclast precursor cells by TNF-α in addition to sRANKL, but such induction of osteoclasts by TNF-α is due to RANKL-induced osteoclast induction. It has been shown that OPG that inhibits is not blocked. The results of this example show that 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Act on osteoclast formation stimulation by TNF-α, indicating that 1α, 25-dihydroxyvitamin D₃Can suppress osteoclast formation by a different mechanism of action from OPG. In addition, it was revealed that the present screening system can detect an effect on osteoclasts that cannot be suppressed by OPG.
Examples 3 to 8
In Examples 3 to 8, the following materials, reagents, and the like were used.
Mouse bone marrow cells were obtained by removing both lower leg bones from 6- to 9-week-old male ddY or C57BL / 6J (purchased from Japan SLC) or vitamin D receptor deficient mice (obtained) and using a syringe to culture the bone marrow using a bone marrow. Was taken out. The cell number was counted by removing the blood cell system under acidic conditions, and 2 × 10 4 cells were placed on a 48-well plate.⁵Culture was performed by distributing cells / well. Α-MEM containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin was used as a medium for cell culture. Mouse interferon-γ (IFN-γ) was purchased from PBL. Cell Counting Kit-8 (reagent for measuring cell proliferation / cytotoxicity) was purchased from DOJINDO. TaqMan EZ RT-PCR kit (quantitative RT-PCR measurement kit) was purchased from PE Applied Biosystems. PhosphoPlus IκB-a (Ser 32) Antibody Kit, Phospho-p38 MAPK (Thr 180 / Tyr 182) Antibody Kit, Phospho-SAPK / JPho / ThrP18 / ThrP18 / ThrP18 / ThrP18 / ThrP18 / ThrP18 / ThrP18) p42 MAP Kinase (Thr 202 / Tyr 204) Antibody Kit was purchased from Cell Signaling TECHNOLOGY. Biotinylated anti-mouse RANK antibody was purchased from R & D. The anti-TRAF6 antibody was purchased from Santa Cruz Biotechnology.
The following compounds were used as vitamin D derivatives. These compounds were synthesized according to the methods described in International Application WO00 / 49403 and JP-A-10-231284.

The amplification primers and probes used for RANK, OPG, RANKL, VDRmRAN measurement are as follows.

Example 3: Inhibition of osteoclast formation
SRANKL and TNF-α were identified as factors that directly act on osteoclast precursor cells to promote their differentiation induction. In particular, TNF-α is thought to act under pathological conditions. Thus, when osteoclast precursor cells (BMMφ) derived from bone marrow cells were stimulated with these two factors, 1,25D₃Was observed. Bone marrow cells collected from the mouse were cultured in the presence of M-CSF (10 ng / ml) for 3 days to obtain cells (BMMφ) showing adhesiveness to the plate. Furthermore, in the presence of M-CSF (10 ng / ml), sRANKL (40 ng / ml) or TNFα (5 × 10⁹(mol / L) and cultured at 37 ° C. for 3 days to produce osteoclasts. When observing the osteoclast formation inhibitory effect of the vitamin D derivative, each derivative was added during the latter three days. After completion of the culture, the medium was removed, the cells were fixed with formalin (20% formalin), and the cell membrane was disrupted with ethanol-acetone. Thereafter, TRAP staining was performed, and the number of TRAP-stained osteoclasts of three or more nuclei was counted under a microscope. 1,25D when osteoclast precursor cells (BMMφ) derived from bone marrow cells were stimulated with sRANKL or TNFα₃As a result of observing the inhibitory effect of osteoclasts, sRANKL and TNF-α induced 1,25D₃Inhibited their induction in a concentration-dependent manner. IC at that time₅₀Is 10^-9-10^-8mol / L (FIG. 3).
Example 4: VDR dependence on osteoclast formation inhibitory effect
Activated vitamin D is known to have a VDR-independent action in addition to the conventional VDR-mediated action. So 1,25D₃Whether or not the osteoclast formation inhibitory effect of osteoblasts is a VDR-dependent effect was examined using osteoclast precursor cells (BMMφ) prepared from bone marrow derived from a VDR gene-deficient mouse (VDR-KO mouse). . The experimental method was the same as in Example 3. As a result, when VDR-KO-derived osteoclast precursor cells (BMMφ) were used, 1,25D₃  10^-7No inhibitory effect was observed at mol / l. This indicates that the inhibitory effect of active vitamin D on osteoclast formation is VDR-dependent (FIG. 4).
Example 5: Examination of cell differentiation stage on osteoclast formation inhibitory action
Before the differentiation of bone marrow-derived macrophage cells into osteoclasts, (1) the process of differentiation into osteoclast precursor cells by M-CSF, and (2) the differentiation into mature osteoclasts by sRANKL + M-CSF There is a process. In order to confirm which process active vitamin D mainly acts to exert its inhibitory effect, an experiment was conducted by changing the addition time as shown in FIG. Note that Case 1 in FIG. 5 was used as a target. As a result, during the feeding period, 1,25D₃  10^-8mol / L is not added (case 2 in FIG. 5), and 1,25D₃  10^-8When mol / L was added only to the differentiation process of (1) (case 4 in FIG. 5), osteoclast formation was induced to the same extent, whereas 1,25 D₃  10^-8mol / L was added only to the differentiation process of (2) (case 3 in FIG. 5), and 1,25D₃10^-8When mol / L was added to both the differentiation processes (1) and (2) (case 5 in FIG. 5), osteoclast formation was suppressed to the same extent. From the above results, it was shown that active vitamin D exerts an inhibitory action in the process of differentiation into mature osteoclasts by sRANKL + M-CSF (FIG. 5).
Example 6: Effect on survival and proliferation of osteoclast precursor cells
In the process of differentiation into mature osteoclasts by sRANKL + M-CSF, which is the main action step of active vitamin D shown in Example 5, M-CSF contributes to the proliferation / life extension of osteoclast precursor cells. (Miyamoto T, et. Al., (2000) Blood, 96, p4335-4343). Therefore, changes in the number of cells when these cells were stimulated with active vitamin D for 3 days without adding sRANKL were examined. As described above, bone marrow cells collected from mice were cultured in the presence of M-CSF (10 ng / ml) for 3 days to obtain osteoclast precursor cells (BMMφ). M-CSF (10 ng / ml) or M-CSF (10 ng / ml) and 1,25D3 10^-9-10^-7mol / L, and further cultured for 3 days. Thereafter, using a Cell Counting Kit-8, a reaction solution of 1/10 of the medium volume of each well was directly added to the medium, and reacted at 37 ° C. for 90 minutes. Absorbance at 450 nm (reference wavelength 650 nm) was measured with a microplate reader (Benchmark, BIO-RAD) to compare cell numbers, and to determine 1,25D₃Was evaluated for its effect on cell proliferation. As a result, 1,25D₃  10^-9-10^-7At mol / L, the number of cells did not differ from control at all. This indicates that active vitamin D inhibits sRANKL-stimulated osteoclast formation rather than cell proliferation and survival (FIG. 6).
Example 7: Examination of factors affecting osteoclast formation inhibitory action
Activated vitamin D is known to inhibit the transcriptional activity by AP-1 via VDR (Alloy I, et. Al., (1995) Mol. Cell. Biol., 15, p. 5789-5799; Towers TL, et.al., (1998) J. Biol. Chem., 273, p10388-10488). On the other hand, it is also known to have a transcription promoting activity via a conventionally proposed VDR response element (VDRE). Therefore, it was examined whether the activity of inhibiting the formation of osteoclasts of active vitamin D is based on either the AP-1 inhibitory activity or the VDRE transcription activity. Specifically, the correlation with these activities was examined using 11 types of vitamin D derivatives. The measurement of AP-1 inhibitory activity and VDRE transcription activity followed the method described in International Application WO00 / 49403. Active vitamin D of each compound (1,25D₃FIG. 7 shows the relationship between the AP-1 inhibitory activity ratio and the VDRE transcription activity ratio with respect to ()). In addition, 10^-9mol / L of osteoclast formation inhibitory action (1,25D₃FIG. 8 shows a correlation chart between the percentage of the active vitamin D and the AP-1 inhibitory activity ratio and the VDRE transcription activity ratio. As a result, a very high correlation was confirmed between the osteoclast formation inhibitory activity and the AP-1 inhibitory activity (correlation coefficient R²= 0.78), but hardly correlated with the VDRE transcription activity (correlation coefficient R²= 0.08). Paying particular attention to compound 8 and compound 9, AP-1 inhibitory activity of both compounds was 1,25D₃Approximately 20-30 fold higher compared to₃Compound 9 is 1,25D₃Has only about 1/10 the activity. However, both compounds have 1,25D₃Showed a stronger inhibitory effect on osteoclast formation compared to that of, indicating that the correlation with AP-1 inhibitory activity was very well reflected (FIG. 9). These results indicate that a compound having osteoclast formation inhibitory activity can be screened by measuring AP-1 inhibitory activity.
Example 8: Examination of the mechanism of inhibitory action on osteoclast formation: Part 1
Stimulation of sRANKL transmits a signal into cells via RANK present on the osteoclast precursor cell membrane. Therefore, by suppressing the expression of RANK or increasing the expression of osteoprotegerin (OPG) which is a sRANKL decoy receptor, 1,25D₃It is possible that osteoclast formation-suppressing action is exerted by the enzyme (Simonet W, et. Al., (1997) Cell, 89, p309-319). Therefore, the expression of mRNA of RANK and OPG was 1,25D₃It was examined whether or not it changed upon stimulation. As a control, expression of VDR and RANKL mRNA was also measured. (BMMφ) obtained from a mouse was obtained. M-CSF (10 ng / ml) or M-CSF (10 ng / ml) and 1,25D₃  10^-8mol / L, and further cultured for 3 days. After completion of the culture, total RNA was collected from the cells (using SV total RNA purification kit, Promega), and quantitative RT-PCR was performed using PRISM 7700 (PE Applied Biosystems). GAPDH was measured as an internal standard for correction. As a result, RANK mRNA was 1,25D₃The stimulus did not change at all. OPG mRNA is 1,25D₃Caused the expression to be suppressed. These results are based on 1,25D₃Shows that osteoclast formation-suppressing action of is not caused by suppressing the expression of RANK mRNA or increasing the expression of OPG mRNA (FIG. 10).
Example 9: Examination of osteoclast formation inhibitory action mechanism: Part 2
The effect of active vitamin D on RANK-mediated intracellular signaling pathway was examined. As molecules involved in RANK signal transduction, IκB (Weis S, et. Al., (2001) Endocrinology, 142, p1299-1295), JNK (Wong BR, (1997) J. Biol. Chem., 272, p25190- 25194) and p38 MAPK (Matsumoto M., et. Al., (2000) J. Biol. Chem., 275, p31155-31161), the phosphorylation of these molecules is used as an indicator of activity. 1,25D₃The effect of was investigated. IFN-γ, which is known to suppress these pathways, was used as a positive control (Takayanagi H., et. Al., (2000) Nature, 408, p600-605). 1-2x10⁷Each mouse-derived bone marrow cell was cultured for 3 days on a 3.5 cm dish in the presence of M-CSF (10 ng / ml) to obtain an osteoclast precursor cell (BMMφ). These cells were incubated with low concentrations of fetal bovine serum (0.3% FBS) in the presence (phosphorylation of IκB and p38 MAPK) or absence (phosphorylation of JNK and ERK1 / 2) of M-CSF, 24 Cultured for hours. Specimens (1,25D₃  10^-8mol / L and IFN-γ 100 U / ml) were added from this time. The next day, the medium was replaced with a fresh medium of the same composition, and two hours later, the cells were stimulated with sRANKL 80 ng / ml for 15 minutes. Immediately after completion of the reaction, the medium was removed, washed twice with PBS, and lysed with Sample buffer (Nakarai, Catalog No. 30566-22). After sonication, phosphorylation of each protein was measured by SDS-PAGE and western-blot. As a result, 1,25D₃Had no effect on their activation (FIG. 11). IFN-γ, a positive control, suppressed phosphorylation of all proteins.
Industrial potential
As described above, the screening method of the present invention is useful as a method for detecting bone resorption inhibition or enhancement of a test compound in vitro.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows 1α, 25-dihydroxyvitamin D against sRANKL-induced osteoclast production.₃6 is a graph showing the effect of suppressing the above. The bar in the figure indicates the mean value ± standard deviation.
FIG. 2 shows 1α, 25-dihydroxyvitamin D against induction of osteoclast production by TNF-α.₃6 is a graph showing the effect of suppressing the above. The bar in the figure indicates the mean value ± standard deviation.
FIG. 3 shows that activated vitamin D (1,25D) affects sRANKL and TNF-α on osteoclast formation from bone marrow cell-derived osteoclast precursor cells.₃FIG. In the figure, control is 1,25D₃Shows the case where is not added.
FIG. 4 shows activated vitamin D (1,25D) that affects osteoclast formation from bone marrow cell-derived osteoclast precursor cells collected from normal mice and VDR gene-deficient mice (VDR-KO mice).₃FIG. In the figure, control is 1,25D₃Shows the case where is not added.
FIG. 5 shows activated vitamin D (1,25D₃FIG. 4 is a graph showing the effect of inhibiting osteoclast formation by the timing of addition of ()).
FIG. 6 shows the active vitamin D (1,25D-D) on the proliferation action of osteoclast precursor cells by M-CSF.₃FIG. In the figure, control is 1,25D₃Shows the case where is not added.
FIG. 7 shows the active vitamin D (1,25D₃FIG. 3 is a graph showing the relationship between the ratio of AP-1 inhibitory activity and the ratio of VDRE transcription promoting activity for The numbers in the figure indicate compound numbers.
FIG. 8 shows the active vitamin D (1,25D) of each compound.₃) And the ratio of VDRE transcription promoting activity to osteoclast formation (1,25D₃It is a figure which shows the relationship with (% inhibition effect with respect to). R²Indicates a correlation coefficient.
FIG. 9 shows activated vitamin D (1,25D₃FIG. 4 shows the inhibitory action of osteoclast formation at each concentration of compound 8 and compound 9. In the figure, control indicates the case where no compound was added.
FIG. 10 shows activated vitamin D (1,25D) versus mRNA expression of each protein in bone marrow-derived osteoclast precursor cells.₃: 1x10^-8It is the figure which showed the effect | action of M). The vertical axis indicates the rate of change from the non-stimulated state.
FIG. 11 is a diagram showing the degree of phosphorylation of IκB, JNK, and p38 MAPK in bone marrow-derived osteoclast precursor cells. In the figure, + indicates addition and-indicates no addition.

Claims

A method of screening for a substance that affects bone resorption,
(A) contacting the test substance with an osteoclast precursor cell and an osteoclast-inducing substance in vitro; and (b) confirming the effect of the test substance on the differentiation of the osteoclast precursor cell into an osteoclast. Process;
A method that includes

The method according to claim 1, wherein the osteoclast-inducing substance is RANKL or TNF-α.

3. The method according to claim 1, wherein the test substance is a vitamin D derivative.

4. The method according to claim 1, wherein step (b) comprises counting the number of osteoclasts.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the osteoclast precursor cells are derived from bone marrow or spleen.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the osteoclast precursor cells are derived from a mouse.

A vitamin D derivative obtained by the method according to any one of claims 1 to 6.

A therapeutic agent for a disease in which the process of forming or activating osteoclasts is abnormal, comprising the vitamin D derivative according to claim 7 as an active ingredient.

9. The therapeutic agent according to claim 8, wherein the disease in which an osteoclast formation or activation process is abnormal is a metabolic bone disease.

10. The therapeutic agent according to claim 9, wherein the metabolic bone disease is osteoporosis.

Osteoclast precursor cells;
Osteoclast inducer; and optionally a suitable medium;
A kit for performing the screening method according to any one of claims 1 to 6, comprising:

A method for screening a substance having an osteoclast formation-suppressing activity, which comprises measuring the activity of inhibiting the transcription promoting activity of AP-1.

13. The method according to claim 12, wherein the substance is a vitamin D derivative.

Furthermore, the VDRE-mediated transcription promoting activity is measured, and a vitamin D derivative whose VDRE-mediated transcription promoting activity is weaker than active vitamin D and whose activity of inhibiting the AP-1 transcription promoting activity is stronger than active vitamin D is selected. 14. The method of claim 13, wherein:

An agent for preventing and / or treating osteoporosis obtained by the method according to claim 12.

1α, 3β-dihydroxy- (20S)-{(2S) -hydroxy-3-methylbutoxy} -9,10-secopregna-5,7,10 (19), 16-tetraene, 1α, 3β-dihydroxy- (20S )-(2-Ethyl-2-hydroxybutylthio) -9,10-secopregna-5,7,10 (19), 16-tetraene or 1α, 3β-dihydroxy- (20R)-(2-ethyl-2 -Hydroxybutylthio) -9,10-secopregna-5,7,10 (19), 16-tetraene as an active ingredient.