JPWO2002062852A1 - Receptor protein expressed on cells - Google Patents

Abstract

The present invention provides antibodies that specifically bind to the TR430 protein (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) or an analog thereof. The present invention further provides a method for screening a test compound that regulates NF-κB transcription activity in a cell expressing the TR430 protein, or a compound obtained by this method. The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating a disease associated with an increase or a decrease in NF-κB activity inside cells, comprising the antibody or the compound obtained by the screening method.

Description

を好ましいＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして使用することができ、これによりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の６２０番〜１２５５番ヌクレオチド部分を増幅することができる。
本発明で使用することができるノザンハイブリダイゼーション法は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）中に記載される手順に従って行うことができる。概略すると、細胞から抽出したＴＲ４３０ｍＲＮＡを変性ゲル上で電気泳動した後、その核酸をニトロセルロース膜などに転写して、その膜上の標的配列を、当該配列にハイブリダイズできるプローブを使用して検出する。ノザンハイブリダイゼーション法において使用することができるプローブは、ＴＲ４３０ｍＲＮＡの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列を有するものである。
本発明において使用するプローブは、少なくとも２２塩基対、好ましくは２００〜１０００塩基対、最も好ましくは２００〜６００塩基対の配列からなるプローブである。本発明において使用するプローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１５０〜３５０番ヌクレオチド、４００〜７００番ヌクレオチド、等にハイブリダイズできるようなプローブであることが望ましい。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば、約２５℃から約３７℃のインキュベーション温度、約６×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸塩バッファー）から約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度、約０％から２５％のホルムアミド濃度、および約６×ＳＳＣの洗浄溶液、のような場合があるが、これには限定されない。高度にストリンジェントな条件の例としては、例えば、約５５℃から約６８℃のインキュベーション温度、約１×ＳＳＣから約０．１×ＳＳＣのバッファー濃度、約５５％から約７５％のホルムアミド濃度、および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、もしくは脱イオン水からなる洗浄溶液、のような場合があるが、これらには限定されない。一般的に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分〜２４時間であり、１もしくはそれ以上の洗浄工程を含み、および洗浄インキュベーション時間は約１〜１５分である。
３．免疫原の調製
本発明においては、免疫原として、ＴＲ４３０タンパク質に対して実質的に特異的に反応する抗体を産生するための免疫原性を有するタンパク質を調製する。例えば、このような免疫原として、ＴＲ４３０ａタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）そのもの、ＴＲ４３０ｇタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）そのもの、またはそれらの類似体を使用することができる。
ここで、ＴＲ４３０ａタンパク質もしくはＴＲ４３０ｇタンパク質の類似体とは、欠失、置換、付加により、これらのタンパク質のアミノ酸配列とは少なくとも１つのアミノ酸が異なっているタンパク質であって、同様の免疫原性を有しているものをいう。当該類似体は、同様の活性もしくは同様の免疫原性を有しているものであればその配列同一性（例えばアミノ酸配列にして６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性など）は問題とされない。さらに、この類似体は、アミノ酸残基数を特に限定するものではなく、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質（４３０アミノ酸残基）と同じ程度の長さを有するタンパク質、ＧＳＴなどの他のタンパク質と融合されてアミノ酸残基数が増加したキメラタンパク質、あるいはアミノ酸残基数が少なくとも４残基、好ましくは少なくとも８残基、より好ましくは少なくとも１０残基程度の短いものであってもよい。したがって、本発明の類似体には、例えばＴＲ４３０タンパク質のフラグメント、ＴＲ４３０の細胞外ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸２６〜１６２番）のようなものが含まれるが、これには限定されるものではない。
本発明で使用することができるＴＲ４３０タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、ＴＲ４３０遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を遺伝子工学的に発現して得たものであっても、またはヒト組織サンプル、例えば末梢血リンパ球から単離・精製したものであってもよい。さらに本発明で使用することができるＴＲ４３０タンパク質の類似体は、上述したように遺伝子工学的に発現させたＴＲ４３０タンパク質もしくは組織サンプルから単離・精製したものを、好ましいタンパク質分解酵素で分断することにより生じたフラグメントであっても、あるいは目的の配列を有するポリペプチドを人工的に合成すること、例えば目的の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させること、もしくは固相ペプチド合成法などの化学的合成により調製してもよいが、これらには限定されない。
ＴＲ４３０タンパク質をＴＲ４３０遺伝子のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に基づいて調製する場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）などに記載されているような、当該技術分野において周知の遺伝子工学的方法を使用することができる。具体的には、本発明においては、ＴＲ４３０タンパク質を、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、もしくは哺乳動物細胞発現系などを使用して発現させることができる。
例えば以下に記載する方法により、ＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸２６〜１６２番）を大腸菌発現系を用いて発現させることができる。ＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸番号２６〜１６２）をコードする塩基配列を、プライマー：

を用いたＰＣＲにより増幅し、増幅されたＰＣＲ産物をいったんｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ社）にクローニングした。挿入された配列の確認後、このベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断し、得られた制限酵素断片を、同様に制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断したｐＥＴ−３２ａ（ノバジェン社）中にサブクローニングし、大腸菌チオレドキシン融合発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを構築した。
発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換し、終濃度１ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導し、当該大腸菌を３７℃で培養することにより、目的とするチオレドキシン−ＴＲ４３０細胞外ドメイン融合タンパク質を発現させる。この発現タンパク質は不溶性であるため、発現誘導後の菌体からタンパク質を抽出した後、６Ｍ尿素溶液で溶解した。溶解液中の目的とする発現タンパク質をＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製造者の指示に従い、吸着・溶出し、当該タンパク質の精製を行った。さらに溶出画分を１００倍強の体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノールに対して室温にて終夜透析し、続いて１００倍強の体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ ＮａＣｌに対して室温にて終夜透析した。透析画分を遠心分離して、目的とする発現タンパク質がほぼ単一バンドとして検出されるにまで精製された。
４．抗体の産生
本発明においては、上述したように調製した免疫原を使用して、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に対して特異的に結合する抗体を産生することができる。本発明において、抗体という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれをも含む。このような抗体は、当該技術分野において周知の方法に従って調製することができる。
ここで、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に特異的に結合する抗体とは、前記タンパク質またはその類似体上に存在するいずれかのペプチド部分に対しては結合するが、それ以外の配列を有するペプチド部分に対しては実質的に結合することができない抗体のことをいう。このような特徴を有する抗体は、例えば細胞膜表面のＴＲ４３０タンパク質またはその類似体を特異的に検出するため、もしくは当該タンパク質またはその類似体に結合してその機能を調節するため、に使用することができる。ここで当該タンパク質またはその類似体の機能の調節とは、当該タンパク質またはその類似体自体を活性化または不活性化することのみならず、当該タンパク質またはその類似体自体の活性化または非活性化した結果として細胞内部で生じるシグナル伝達物質を活性化または非活性化することをも含む概念をいう。
この抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物を、上述したように調製した免疫原を用いて免疫化することにより作成する。免疫化する際には、抗体を産生させる動物の免疫活性を増強するために、アジュバントとともに投与することができる。アジュバントの例としては、Ｍａｒｔｉｎ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照することができる。アジュバントとして、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、もしくはアルミニウムアジュバントなどのいずれをも使用することができる。油中水型エマルジョンの例としては、フロイント（Ｆｌｅｕｎｄ）の完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバントなど、水中油型エマルジョンの例としてはＲＩＢＩアジュバントシステム（ＲＩＢＩ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．）など、そしてアルミニウムアジュバントの例としては硫酸アルミニウムカリウム、などを使用することができるが、これらのものに限定されるものではない。
ポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法により作製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲））。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の動物を、上述したように調製した免疫源と上述したアジュバントとを混合して投与、免疫化することにより、ポリクローナル抗体を作成する。前記動物を数回にわたり免疫化した後、動物の血液を微量採取し、ＴＲ４３０タンパク質と実質的に特異的に結合するという特徴を有する抗体が実際に産生されていることを確認する。動物血液中に目的とする抗体が産生されている場合には、その動物から得た血清を、プロテインＡカラム、抗原吸着カラム、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、逆相カラムなどを用いて精製することにより、目的とするポリクローナル抗体を得ることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）などの酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ウェスタンブロット法、およびフローサイトメトリーに使用することができ、あるいは細胞培養上清中に添加して培養細胞の活性を調節すること、そして生体内に投与して標的となる細胞の活性を調節すること、当該技術分野で周知の方法に従った免疫組織化学、などにも使用することができるが、これら以外の用途に使用することもできる。
モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法により作製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲））。免疫化した動物がマウスの場合、まず、上述したように調製した免疫原をアジュバントとともにマウスに数回にわたり投与し、免疫化を行う。数回の免疫化の後、前記マウスの血液を微量採取し、ＴＲ４３０タンパク質と実質的に特異的に結合するという特徴を有する抗体が実際に産生されていることを確認する。マウス血液中に目的とする抗体が産生されている場合には、マウスを犠死させて脾細胞を単離し、マウス由来のミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得る。このようにして得られたハイブリドーマ細胞のうち、標的タンパク質であるＴＲ４３０タンパク質もしくはその類似体に特異的に結合する抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞をクローン化する。
次いで、このようにして得られたハイブリドーマ細胞を培養条件下で培養してその培養上清を採取するか、もしくはハイブリドーマ細胞をマウス腹腔に投与して当該マウス腹腔内に貯留する腹水を採取する。得られた培養上清もしくはマウス腹水を、プロテインＡカラム、抗原吸着カラム、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、逆相カラムなどを使用して精製することにより、マウスモノクローナル抗体を得ることができる。
モノクローナル抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡなどのＥＩＡ、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、およびフローサイトメトリーに使用することができ、あるいは細胞培養上清中に添加して培養細胞の活性を調節すること、そして生体内に投与して標的となる細胞の活性を調節すること、当該技術分野で周知の方法に従った免疫組織化学、などにも使用することができるが、これら以外の用途に使用することもできる。
５．抗体を用いたＴＲ４３０ａの発現解析
本発明者は、上述した方法により調製した抗体を用いて、ＴＲ４３０タンパク質の発現解析を試みた。目的の抗体を使用してＴＲ４３０タンパク質の発現解析を行うためには、免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法などの方法を使用することができる。
固型組織におけるＴＲ４３０タンパク質の発現解析を行う場合、この抗体を用いて免疫組織化学を行うことが好ましい。免疫組織化学の手法は、当該技術分野において周知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲）などに記載される方法に従って、例えば、パラフィン固定組織切片、細胞塗沫もしくは凍結組織切片を使用して行うことができる。パラフィン固定切片を使用する場合には脱パラフィンした後、細胞塗沫は細胞をメタノール、パラホルムアルデヒドなどで固定化した後、凍結組織切片を使用する場合にはコンパウンドを除去した後、ＴＲ４３０タンパク質またはその類似体に特異的に結合する抗体を組織切片に接触させて、続いてこの抗体を二次抗体もしくはアビジン−ビオチンシステムなどを使用して検出することにより、ＴＲ４３０タンパク質が当該組織で発現しているかどうかを確認することができる。
血球系細胞や培養細胞などの浮遊系細胞におけるＴＲ４３０タンパク質の発現解析を行う場合、例えば、この抗体を用いてフローサイトメトリー、免疫沈降法などを行うことが好ましい。例えばフローサイトメトリーを行う場合、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）／２％牛胎児血清（ＦＢＳ）中に懸濁した細胞（例えば、１０^６／１００μＬ）に対して目的とする抗体を添加し、細胞に抗体を結合させる。遠心分離後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで再懸濁した後、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ３、ＦＩＴＣなどの蛍光色素でラベルされた適量の二次抗体を添加して、細胞に結合した目的の抗体と結合させる。このように処理した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンディキンソン社）を用いて解析することにより、細胞表面にＴＲ４３０タンパク質が発現しているかどうかについてを解析した。
本発明のＴＲ４３０遺伝子は、多種類のヒト組織の中でも、主として末梢血リンパ球で発現されていることが確認された（図１）。この結果は、以前にＷＯ９９／５２９２４においても明らかにされている知見と一致する。
本発明においてはさらに末梢血リンパ球に含まれる多種類の細胞のうちどの細胞で発現されているかを明らかにするため、ＦＩＴＣラベルされた抗ヒトＣＤ３もしくは抗ヒトＣＤ１９抗体などの抗体も用いて、ヒト末梢血リンパ球についてのフローサイトメトリーを行った。その結果、ＴＲ４３０タンパク質は、Ｂ細胞上に発現していることが初めて明らかになった（図２）。
さらに本発明においてヒト白血病細胞株におけるＴＲ４３０タンパク質の発現を上述したフローサイトメトリーにより調べたところ、Ｂ細胞系列以外の細胞株６例中、５例においてＴＲ４３０タンパク質の発現が同定された（図３）。この知見および本願発明のＴＲ４３０遺伝子がヒトの眼由来のレチノブラストーマ細胞のｃＤＮＡから単離されたことから判断して、本発明のＴＲ４３０タンパク質は、広く腫瘍化した細胞に発現していることが示唆される。
本発明の一態様において、本発明のタンパク質の上述する性質を利用することにより、上述した方法により得られた抗体を、腫瘍化した細胞の検査、診断、抗腫瘍治療中の予後観察に利用することができる。すなわち、本発明の抗体を用いて、被検体体内における腫瘍化した細胞の存在を検出することができる。具体的には、
（ｉ）被検体から採取した被検細胞に対してＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明の一態様において、被検細胞が浮遊細胞である血液細胞の場合、
（ｉ）被検体から採取した被検血液細胞に対して、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を使用してフローサイトメトリーを行うこと；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検血液細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明の別の態様において、浮遊細胞もしくは固型組織からのバイオプシーなどを塗沫の状態で使用する場合、
（ｉ）被検体から採取した被検細胞をスライドグラス上に固定し、この被検細胞に対してＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検細胞中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明のさらに別の態様において、切除されたヒト固型組織を用いる場合、
（ｉ）被検体から採取した被検組織切片に対して、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を適用すること；および；
（ｉｉ）Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体に対しては陰性であるが、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識する抗原に対しては陽性である細胞を検出すること；
により、被検組織切片中に腫瘍化した細胞が存在することを検出することができる。
本発明において腫瘍化した細胞は特定のものには限定されず、例えば血液細胞の腫瘍化した細胞としては白血病細胞、骨髄性白血病細胞、リンパ球系系白血病細胞、などが存在し、腫瘍化した固型組織由来細胞としてはレチノブラストーマ細胞、小細胞肺癌細胞、大細胞肺癌細胞、肝癌細胞、腎臓癌細胞、胃癌細胞、黒色腫細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞、などが存在するが、これらには限定されない。Ｂ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、などが知られているが、これらには限定されない。
本発明のさらに別の態様においては、ＴＲ４３０タンパク質を特異的に認識することができる抗体、およびＢ細胞特異的マーカー抗原を特異的に認識する抗体を含む、腫瘍化した細胞の検出キットを提供することもできる。このキットは、フローサイトメトリー、免疫組織化学、などに使用することができる。したがって、フローサイトメトリーに使用することができるように、キットに含まれるこれらの抗体に対して蛍光色素を直接結合させてもよく、あるいはこれらの抗体を特異的に認識することができる蛍光色素結合二次抗体をキット中に含むこともできる。あるいは、免疫組織化学において使用することができるように、キットに含まれる抗体に対してホースラディッシュペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼを直接結合させてもよく、あるいはホースラディッシュペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、アルカリホスファターゼを結合させた、これらの抗体を特異的に認識することができる二次抗体をキット中に含むこともできる。
６．Ｂ細胞におけるシグナル伝達経路の解析
上述したように、ＴＲ４３０タンパク質は、末梢血Ｂ細胞およびヒト白血病細胞などの腫瘍化した血液細胞の細胞表面に発現する、１回膜貫通型のＴＮＦＲ／ＮＧＦＲファミリーに属するタンパク質であることが明らかになった。本発明では次いで、このＴＲ４３０タンパク質を、上述した方法により得られた抗体で刺激することにより、ＴＲ４３０発現細胞中においてどのような細胞内シグナル伝達反応が生じるかについて調べることができる。
Ｂ細胞は、骨髄に由来する抗体産生細胞の前駆細胞であり、細胞膜表面上に抗原特異的受容体でもある免疫グロブリン（Ｂ細胞抗原受容体、以下ＢＣＲという）を保有している。Ｂ細胞はＢＣＲに特異的なリガンドによる刺激を受けると、Ｂ細胞の膜上に発現する共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と会合または協同し、それにより初めてＢＣＲを介する外部からのシグナルを細胞内部に伝達する。このように共受容体がＢＣＲシグナルを制御することにより、Ｂ細胞は強力に反応すべき抗原に対しては強力に反応し、一方で反応すべきでない抗原に対しては反応しなくなる。
Ｂ細胞上に発現するＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子ＣＤ４０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡからのシグナルは、ＢＣＲからのシグナルを修飾し、Ｂ細胞の運命を決定することも知られている（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４，９９５；Ｂｕｌｏｗ ａｎｄ Ｂｒａｍ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８，１３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，２６０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１２９；Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｒｅｄｄｙ（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７，３２６１）。ＴＮＦＲからの刺激が細胞内部でどのようなシグナル伝達を経由するかについては従来報告されており、ＴＲＡＤＤおよび／またはＲＩＰを介したＴＲＡＦ２の活性化（ＴＮＦＲＩ）もしくはＴＲＡＦ２の直接的な活性化（ＴＮＦＲＩＩ）に引き続いて、ＮＩＫ、ＩκＢなどを介して、その一つの結果としてＮＦ−κＢの活性化が生じることがわかっている。
本発明において、上述した方法により産生される抗体を使用して、細胞表面に発現するＴＲ４３０タンパク質を刺激することにより、末梢血Ｂ細胞あるいは腫瘍化した細胞などにどのような刺激が伝達されるかを調べることができる。上述した従来の知見から、ＴＲ４３０タンパク質の刺激とＮＦ−κＢの活性との間に何らかの関係があると推測される。
ＴＲ４３０タンパク質とＮＦ−κＢ活性との間にどのような関係があるかを調べるため、本発明の一態様において、ＴＲ４３０遺伝子を一過性に導入し過剰発現させた細胞において、ＮＦ−κＢレポーターアッセイを行うことができる。例えば、上述した方法により産生されたポリクローナル抗体が、ＮＦ−κＢ結合部位を有するプロモーターを活性化できるかどうかを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現増強をレポーターとして、調べることができる。ＴＲ４３０遺伝子を一過性に導入し過剰発現させるために使用することができる細胞としては、例えばヒト胎児腎細胞株２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、などを使用することができる。
ＴＲ４３０タンパク質を一過性に導入し過剰発現させた細胞を本発明の抗体で刺激したところ、細胞内部で、最終的にＮＦ−κＢの活性が著しく上昇することがわかった（図５）。このことから、当該細胞表面に存在するＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメインを、本発明の抗体により刺激すると、その刺激が細胞内部に伝達され、最終的にＮＦ−κＢ活性が著しく増大することが示唆される。このことからまた、ＴＲ４３０タンパク質は、細胞外からの何らかの未知のシグナルに対する受容体として機能していることが示唆される。このＢ細胞内部で活性化されるＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、Ｂ細胞の生存、増殖に中心的な転写因子として機能していることが知られている（Ｇｒｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３，４００；Ｆｒａｎｚｏｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１１，３４８２；Ｇｒｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７，６６３；Ｋｏｎｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９，１９６５）。
本発明の一態様において、上述した抗体によるＴＲ４３０タンパク質への刺激が、細胞内部においてどのようなシグナルカスケードの活性化を引き起こすのかを調べるために、本発明において、酵母２ハイブリッド（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ）スクリーニングを行うことができる。この方法を用いることにより、例えば、ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメイン（１８７〜４３０番アミノ酸部分）に対して選択的に結合することができるタンパク質を選択することができる。
本発明の酵母２ハイブリッドスクリーニングは、例えば、ＴＲ４３０細胞内ドメインをコードする塩基配列をＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインプラスミド（ｐＢＴＭ１１８）にクローニングして囮タンパク質発現ベクターを構築し、ｐＡＣＴ２にクローニングされたヒト末梢血白血球ライブラリ（クローンテック社）ともにレポーター酵母株Ｌ４０に導入することにより行うことができる。実際的には、例えばＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（クローンテック社）などの商業的に入手可能なキットを、製造者の指示書に基づいて使用して行うことができる。
上述したような酵母２ハイブリッドスクリーニングを行ったところ、２種類のキナーゼ、ＴＲＡＫ１（ＴＲ４３０−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ １）およびＴＲＡＫ２が、ＴＲ４３０タンパク質に選択的に結合することができるタンパク質として見出された。これらのタンパク質をコードする遺伝子を配列決定し、配列相同性に関して検索したところ、ＴＲＡＫ１はＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＦ０９９９８９として登録されているヒトＳｔｅ−２０関連キナーゼ、ＳＰＡＫのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）と同一の配列を有していることがわかった。ＴＲＡＫ２は、同様に、ＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＢ０１７６４２として登録されているヒト酸化ストレス応答性分子１（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ−ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ １）のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）と同一の配列を有していることがわかった。
さらに、上述したように同定されたキナーゼ、ＴＲＡＫ１およびＴＲＡＫ２から、さらにその下流においてどのようなシグナルカスケードを形成しているのかについて、例えば免疫沈降法、リン酸化タンパク質の定量など、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲）に記載された方法などを使用して調べることができる。
サイトカイン受容体を介したＮＦ−κＢの活性化において、ＴＲＡＦファミリータンパク質もしくはＮＩＫの変異体がドミナントネガティブ分子として阻害的に働くことが示されている（Ｍａｌｉｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５，５４０）。このような研究結果から、本明細書の先に述べた様に、サイトカイン受容体シグナルによるＮＦ−κＢ活性化に際してはＴＲＡＦファミリータンパク質およびＮＩＫが重要な働きをしていることが知られている。
本発明の一態様においては、上述のＮＦ−κＢレポーターアッセイ、および免疫沈降法、リン酸化タンパク質の定量など、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（前掲）に記載された方法などを使用して、ＴＲＡＦ２および／またはＮＩＫの活性化または不活性化を介してＮＦ−κＢ活性の調節に関与しているかどうかについて検討することができる。ＴＲＡＦ２のドミナントネガティブ体、ＮＩＫのドミナントネガティブ体は、ＴＲ４３０タンパク質によるＮＦ−κＢ活性化を阻害した。したがって、細胞表面ＴＲ４３０からのシグナルは、ＴＲＡＦ２、そしてＮＩＫが関与するカスケードにより、最終的にＮＦ−κＢに刺激を伝達することが示唆される。
７．ＴＲ４３０タンパク質のリガンドの同定
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩに対するリガンドとして、ＴＮＦファミリーに属する分子であるＡＰＲＩＬ（ａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）やＢＬｙＳが知られている。このうち、ＡＰＲＩＬは血清非存在下での癌細胞の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで促進し、ＡＰＲＩＬを過剰発現させたＮＩＨ−３Ｔ３株は、ヌードマウスにおいて高率で腫瘍形成を引き起こすことが知られている。また、ＢＣＭＡ可溶型受容体は、ＡＰＲＩＬによる細胞増殖を抑制し、ヌードマウスにおける癌増殖を抑制する。これらのことより、ＡＰＲＩＬとその受容体は癌増殖に関わる重要な因子である、と考えられている（Ｈａｈｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，１１８５；Ｒｅｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１６７７；Ｗａｒｅ（２００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，Ｆ３５）。一方で、ＡＰＲＩＬはＢＣＭＡ、ＴＡＣＩともに発現していない癌細胞の増殖を促進することから、ＡＰＲＩＬをリガンドとする別の受容体の存在が示唆されている（Ｗａｒｅ（２００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，Ｆ３５）。
ＴＲ４３０タンパク質は白血病細胞株で高確率でその発現が検出されたこと（図３参照）、および、ＴＲ４３０タンパク質の刺激によりＮＦ−κＢの活性化が起こることから（図５参照）、本発明者は、ＴＲ４３０がＡＰＲＩＬ受容体の候補である可能性があると考え、その検討を行った。
本発明においては、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する分子のリガンドであるＡＰＲＩＬ、ＢＬｙＳを用いて、ＴＲ４３０に対する刺激活性を有しているか否かについて、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳとＴＲ４３０との一過的共発現系で、これらのリガンドによる刺激の結果、ＮＦ−κＢの活性化が生じるかどうかを指標にして、評価した。
ＨＥＫ２９３細胞を使用するＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳとＴＲ４３０との一過的共発現系は、ＡＰＲＩＬまたはＢＬｙＳ発現プラスミドをそれぞれＴＲ４３０発現プラスミドと同時にＨＥＫ２９３細胞に導入することにより作成した。
ＢＬｙＳとＴＲ４３０とをＨＥＫ２９３細胞に共発現した場合には、ＴＲ４３０の活性化によるＮＦ−κＢ活性化レベルを刺激しなかった。その一方で、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０とをＨＥＫ２９３細胞に同時に発現させると、ＮＦ−κＢレポーター活性は増強した（図８）。ＢＬｙＳがＴＲ４３０を発現するＨＥＫ２９３細胞においてＮＦ−κＢ活性を増大することができなかった、という事実は、ＢＬｙＳがＴＲ４３０を刺激しないことと共に、この細胞がＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ分子を発現していないことを示す。その一方で、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０とを共発現させた場合には、当該ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦ−κＢが活性化されるという事実は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩを発現していない細胞においても、ＡＰＲＩＬによりＴＲ４３０が刺激され、その後の細胞内シグナル伝達が機能し、結果的にＮＦ−κＢが活性化される、という経路を示唆する。したがって、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０とがこれまで知られていなかったリガンド−受容体関係を有していることが推測される。すなわち、ＴＲ４３０に対する未知リガンドがＡＰＲＩＬであると推測される。
本発明者はさらにＡＰＲＩＬが血清非存在下で増殖を支持するＪｕｒｋａｔ細胞において、ＴＲ４３０が発現されており、その一方でＢＣＭＡ、ＴＡＣＩは発現していないことをノーザンブロット法で確認した（図９）。この知見もまた、ＴＲ４３０に対する未知リガンドがＡＰＲＩＬであるという推測を支持するものである。
さらに、本発明者は、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０が結合することを一過的共発現系での免疫沈降法により確認した（図１０）。これらの結果は、ＴＲ４３０がＡＰＲＩＬの受容体であることを示しており、このことから、可溶性ＴＲ４３０受容体や中和抗体、もしくは低分子化合物などによりＴＲ４３０機能を阻害できれば、ＡＰＲＩＬ刺激によっておこる癌細胞の増殖促進、Ｂ細胞の異常増殖に基づく疾病を抑制する効果があることが示唆される。
８．ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する化合物の単離スクリーニング方法
本発明はまた、ＴＲ４３０タンパク質の機能を調節する候補化合物をスクリーニングする方法を提供することができる。本発明で提供することができるスクリーニング方法は、
（ｉ）ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞に候補化合物を接触させ；
（ｉｉ）候補化合物を接触させたＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞、および候補化合物を接触させていないＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞との間で、両細胞内部でのＮＦ−κＢ転写活性を比較し；
（ｉｉｉ）候補化合物の接触によりＮＦ−κＢ転写活性化を調節する程度を検出し；そして
（ｉｖ）ＮＦ−κＢ転写活性化を調節する化合物を選択する；
ことを含む。工程（ｉ）を行う前に、ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞を、あらかじめＴＲ４３０アゴニストを添加することにより活性化させてもよい。ＴＲ４３０アゴニストによる活性化により、候補化合物によるＴＲ４３０タンパク質の機能の調節の程度をより明瞭に検出することができる。
上記工程（ｉ）において使用するＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞は、例えばＹ７９などのヒト培養細胞株や末梢血Ｂ細胞、前述した腫瘍化した細胞などのＴＲ４３０タンパク質をもともと発現する細胞であってもよく、もしくはもともとはＴＲ４３０タンパク質を発現していないがＴＲ４３０遺伝子を導入して形質転換した細胞であってもよい。
候補化合物がＮＦ−κＢ活性を調節する程度は、ＮＦ−κＢの活性化に直接的に機能するＩκＢのリン酸化および分解、ＮＦ−κＢ結合部位を有するＤＮＡに結合する核タンパク質の量を検出することにより、測定することができる。もしくは、ＮＦ−κＢ転写活性化により発現を誘導されるレポーターをＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞に導入し、候補化合物により活性化されたＮＦ−κＢがレポーターの発現を誘導する程度を検出することもでき、また同様にして候補化合物によるＮＦ−κＢ活性化抑制をレポーターの発現を抑制する程度として検出することもできる。現在使用することができるレポーターとして、例えばＮＦ−κＢ活性化をルシフェラーゼ活性として検出可能なｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃ（ストラタジーン社）などを使用することができるが、これらには限定されない。
ＴＲ４３０タンパク質を介したシグナル伝達を調節する候補化合物は、ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインとＴＲＡＫ１を候補化合物の存在下で接触させるか、または、ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインとＴＲＡＫ１を接触させた後にさらに候補化合物と接触させることにより、ＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインとＴＲＡＫ１の結合を調節するかどうかに基づいて選択することができる。
タンパク質相互作用の調節を検出するためには、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ＢＩＡＣＯＲＥ（アマシャムファルマシア社）等の生体分子間相互作用を用いた方法、などを用いることができる。タンパク質は天然の発現細胞から精製でき、また大腸菌、動物細胞や昆虫細胞を宿主とした組み換えタンパク質として発現させ、精製して用いることもできる。公知の方法によりタンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、各種酵素、免疫的なタグを用いて標識しておくことにより、タンパク質間相互作用の検出を容易にすることができる。また、酵母または動物細胞を宿主とした２ハイブリット法（クローンテック社）などを用いてタンパク質相互作用の調節を検出することもできる。
動物細胞においてＴＲ４３０タンパク質とＴＲＡＫ１組み換えタンパク質を同時に発現させ、その相互作用を免疫沈降法により検出できる（図６）。一方の組み換えタンパク質を固相化し、これに結合するタンパク質量を酵素免疫学的に検出することもできる。たとえば、ＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインをＧＳＴ融合タンパク質として発現精製し、直接もしくは抗ＧＳＴ抗体などをもちいて間接的に固相化する。これにＦＬＡＧタグをつけたＴＲＡＫ１を加え、候補化合物とともにインキュベーションする。洗浄後、固相化したＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインに結合するＴＲＡＫ１の量をＦＬＡＧタグを認識する抗体を用いて検出する。固相化する分子を入れ替えても同様にタンパク質相互作用に対する作用を評価でき、タグの種類、融合タンパク質の種類をかえて実施することもできる。
ＴＲＡＫ１とＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメインの相互作用を酵母２ハイブリット法を用いて検出できる。たとえば、ＴＲ４３０細胞内ドメイン／ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質を発現させるプラスミドと、ＴＲＡＫ１／ＧＡＬ４転写活性化ドメイン融合タンパク質を発現させるプラスミドをレポーター株に導入し、相互作用をβガラクトシダーゼ活性として検出できる（図７）。
本発明の別の態様においては、上述したスクリーニング方法により得られた化合物を提供することもできる。このような化合物は、ＴＲ４３０タンパク質を介して当該ＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞の機能を調節することができる。ここでＴＲ４３０タンパク質を発現する細胞の機能とは、ＴＲ４３０タンパク質を刺激することにより細胞内部でＮＦ−κＢ活性の増大または減少が関連する機能をいう。より具体的には、ＮＦ−κＢ活性の増大または減少が関連する機能とは、Ｂ細胞の増殖・分化・生存、抗体産生、抗体のサブクラススイッチング、腫瘍化した血液細胞の増殖・生存、などのことをいうが、これらには限定されない。
あるいは、候補化合物の存在下でＴＲＡＫ１のキナーゼ活性を検出し、タンパク質リン酸化を調節するかどうかに基づいてＮＦ−κＢ活性を調節する候補化合物を選択することができる。
キナーゼ活性を検出するためには、反応系において［γ^３２Ｐ／^３３Ｐ］ＡＴＰを用いることにより、放射活性的に検出することができる。リン酸基の転移を受けるタンパク質としては、ＴＲＡＫ１を使用することができ、あるいはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、Ｍｙｅｌｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＨＡＳ−Ｉ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ Ｈｅａｔ ａｎｄ Ａｃｉｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｉｎｓｕｌｉｎ）などの外来性タンパク質を基質として使用することもできるが、これらに限定されない。
これらの場合においては、反応後の酸不溶画分に取り込まれたラジオアイソトープ量を定量することにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後にオートラジオグラフィーを行うことにより、タンパク質のリン酸化を評価することもできる。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ、アマシャムファルマシア社）や、マルチスクリーンアッセイシステム（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ミリポア社）を使用して、スクリーニングをハイスループット化することもできる。
９．ＴＲ４３０タンパク質の機能に基づく医療用途
本発明の一態様においては、ＴＲ４３０タンパク質に結合する抗体もしくは本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を使用して細胞表面に発現するＴＲ４３０タンパク質を刺激し、細胞内部のＮＦ−κＢの転写活性化を調節することができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を使用して、ＴＲ４３０タンパク質を刺激して生じるシグナルを媒介するタンパク質の機能を調節し、ＮＦ−κＢの転写活性化を調節することができる。その結果、これらの抗体もしくは化合物によりＢ細胞あるいは腫瘍化した細胞の発現する機能を調節することができ、ＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患の治療などを目的として利用することもできる。
本発明において、Ｂ細胞の発現する機能という用語は、Ｂ細胞自身の増殖機能、抗体産生機能、生存機能などについて言及するが、これらには限定されない。本発明において、腫瘍化した細胞の発現する機能という用語は、その細胞自身の増殖機能、生存機能などについて言及するが、これらには限定されない。またこれらの細胞の機能の調節という用語は、上述した細胞の機能を増強する場合、抑制する場合の両方の概念に言及する。したがって、これらの細胞の機能を調節することは、具体的には、例えば、これらのＢ細胞もしくは腫瘍化した細胞自身の増殖機能の増強もしくは抑制、Ｂ細胞の抗体産生機能の増強もしくは抑制、生存機能の増強もしくは抑制などが含まれる。
ＮＦ−κＢからＩκＢが遊離してＮＦ−κＢが核内に移行すると、主に炎症・免疫応答に関わる遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子の他、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−２受容体α遺伝子などの様々な遺伝子、の発現を制御することが知られている（Ｊａｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，３３３−３４２）。この他にも、ＮＦ−κＢはアポトーシスの制御だけでなく、ボディープラン（Ｍｅｒｃｕｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１，２２６−２３２；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｔｒｅｎｄ Ｇｅｎｅｔ．１５，２２９−２３５）にも関与していることが知られている。
マウスでは、ＴＮＦ受容体様分子からの過剰な刺激が与えられた場合、リンパ節症、プラズマ細胞増加症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患様の症状を引き起こすことがわかっている（Ｋｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，３３７０−３３７５；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４，９９５−９９９）。これらの疾患は、本来アポトーシスにより除去されるべき細胞群の細胞死プログラムがＴＮＦ受容体様分子からの生存シグナルにより阻害されるためであると考えられており、同様の機構が腫瘍細胞の生存にも関与しているのではないかと示唆されている（Ｌａａｂｉ ａｎｄ Ｓｔｒａｓｓｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９，８８３；Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ３６，２５５；Ｆｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，２２００；Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９２，９９０）。
上述したように、本発明の一態様においては、ＴＲ４３０タンパク質に結合する抗体もしくは本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を使用して、細胞内部のＮＦ−κＢの転写活性化を調節し、その結果これらの抗体もしくは化合物をＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患の治療などを目的として利用することもできる。
抗体を患者の治療目的で用いる場合には、抗体自体の免疫原性が少ないことから、ヒト抗体またはヒト化抗体を使用することが好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｏｃｉ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６，１９９７参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３，９９−１２１，１９９１）。
本明細書中で細胞内部のＮＦ−κＢ活性を増大するとは、外部からＴＲ４３０タンパク質を刺激することにより細胞内部にシグナルが形成され、ＩκＢのリン酸化を介して、標的遺伝子の活性化を引き起こす程度に、ＮＦ−κＢの転写因子としての活性が高まった状態をいう。Ｂ細胞中においてＮＦ−κＢ活性が増大した場合、Ｂ細胞分化、抗体のサブクラススイッチング、生存能の増強、などの機能を発揮することが知られている。
一方、本明細書中で細胞内部のＮＦ−κＢ活性を低下するとは、ＩκＢのリン酸化が生じることなく、標的遺伝子の活性化を引き起こす程度にまでＮＦ−κＢの転写因子としての活性が亢進していない状態、もしくはそれ以下の活性を示す状態をいう。例えば、Ｂ細胞中においてＮＦ−κＢ活性が低下した場合、アポトーシスなどの現象が生じることが知られている。
したがって、ＴＲ４３０タンパク質刺激によってもたらされるＮＦ−κＢ活性化を中和できるＴＲ４３０タンパク質に特異的に結合することができる抗体は、本来はアポトーシスにより除去されるべき細胞が細胞内部でのＮＦ−κＢ活性が増大するために生存することにより生じる疾患を治療するために用いることができる。細胞内部のＮＦ−κＢ活性の増大と関連する疾患としては、リンパ節症、プラズマ細胞増加症、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、癌、などが知られているが、これらには限定されない。
本発明の一態様において、本発明のＴＲ４３０タンパク質に対して特異的に結合することができる抗体を治療的有効量で含む医薬組成物を提供することができる。このような医薬組成物は、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患を治療するために用いることができる。
上述した抗体を含む医薬組成物は、皮下投与及び非経口投与を含むいずれかの適当な投与経路から投与することができる。好ましくは非経口投与により被検体に投与する。非経口投与の例には静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与および腹腔内投与などが含まれる。本発明においては、静脈内投与および腹腔内投与が好ましい。医薬組成物中で投与する１回当たりの抗体の治療的有効量は、典型的には患者の体重１ｋｇ当り約０．２〜２０ｍｇの範囲であってよい。しかしながら、投与量および投与方法は主として抗体を含む医薬組成物の用途、治療すべき患者の年齢、体重、および患者の症状等を含む状況を考慮して医師により決定されるものであり、上述した投与量および投与方法には限定されない。
非経口投与のためには、抗体は一般に医薬的に許容可能なビヒクルと共に単位投与剤形として、例えば溶液剤、懸濁剤、乳剤などに製剤化される。この様なビヒクルは本質的に非毒性である。この様なビヒクルの例には水、塩溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれる。非水ビヒクル、例えば硬化油及びオレイン酸エチルを使用することもできる。キャリヤーとしてリポゾームを使用することができる。例えば、抗体は典型的にはこの様なビヒクル中に約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
本発明の別の一態様において、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を治療的有効量で含む医薬組成物を提供することができる。このような医薬組成物は、細胞内部でのＮＦ−κＢ活性の増大もしくは減少と関連する疾患を治療するために用いることができる。
上述した化合物を含む医薬組成物は、皮下投与及び非経口投与を含むいずれかの適当な投与経路から投与することができる。経口投与には舌下投与、胃内投与、小腸内投与などが含まれる。非経口投与の例には静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与および腹腔内投与などが含まれる。本発明においては、静脈内投与および腹腔内投与が好ましい。医薬組成物中で投与する１回当たりの化合物量は、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇであり、１日当たり１回〜３回投与することが好ましい。しかしながら投与量および投与方法は、投与すべき化合物の種類、化合物を含む医薬組成物の用途、治療すべき患者の年齢、体重、および患者の症状等を含む状況を考慮して医師により決定されるものであり、これらには限定されない。
実施例
以下に実施例を提供する。これらの実施例は本発明を具体的に説明するために記載するものであり、本発明の技術的範囲を限定するために記載するものではない。
実施例１：遺伝子・タンパク質構造の解析
シグナル配列、Ｐｆａｍ ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ Ｃｙｓリッチモチーフ、一回膜貫通ドメインを有するＴＮＲ受容体スーパーファミリーに属するサイトカイン受容体分子を、Ｙ７９細胞株（理研細胞銀行より入手）由来のｃＤＮＡライブラリより、クローニングした。配列解析の結果、アリルの違いに由来すると考えられる二種類の転写産物を同定した。これらの遺伝子の一つがコードするＴＲ４３０ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、ＷＯ９９／５２９２４に記載されているＴ１２９と同一分子であった。ＴＲ４３０ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）はＴ１２９タンパク質のアミノ酸配列、すなわちＴＲ４３０ａタンパク質のアミノ酸配列の、アミノ酸残基１８７番目のＬｙｓがＧｌｕに、２７３番目のＨｉｓ残基がＡｒｇへ置換したアミノ酸配列をコードするクローンであった。
実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析
Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ Ｐａｎｅｌ（クローンテック、カタログ番号Ｋ１４２０−１、Ｋ１４２１−１、Ｋ１４２５−１）を用い、ＴＲ４３０遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ法による組織発現解析を行った。増幅の際に用いたプライマーは以下の通りである：

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用い、製造者の指示に従い、反応液を調製した。プライマーの終濃度は４００ｎＭ、鋳型ｃＤＮＡの容量は１２．５μｌあたり０．５μｌであった。ＰＣＲ反応サイクルは、９４℃ １ｍｉｎの後、９４℃ ３０秒間、６０℃ ３０秒間、７２℃ １分間を１サイクルとして３２サイクル行った。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により解析した結果を図１に示す。遺伝子発現は、末梢血白血球、脾臓に限局していたことから、ＴＲ４３０遺伝子は血球系細胞で優勢に発現していることが示唆された。
実施例３：受容体細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体の作製
抗原として用いる受容体細胞外ドメインタンパク質を、大腸菌発現系により、以下の様に調製した。ＴＲ４３０タンパク質の細胞外ドメイン（アミノ酸番号２６−１６２）をコードする塩基配列を、プライマーＷＡＬＴ−ＮｆとＷＡＬＴ−Ｎｒを用いたＰＣＲにより増幅し、いったんｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ社）にクローニングし配列確認を行った。配列の確認後、このベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩで切断し、得られた制限酵素断片を、ｐＥＴ−３２ａ（ノバジェン社）中にサブクローニングし、大腸菌チオレドキシン融合発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを構築した。ＰＣＲに用いたプライマー配列は以下の通りである：

発現ベクターｐＥＴ３２ａ／ＴＲｅｘを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入して形質転換し、終濃度１ｍＭ ＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導し、当該大腸菌を３７℃で培養した。目的とする発現タンパク質は封入体として不溶性画分に存在した。発現誘導後の菌体を遠心分離し、Ｂ−ＰＥＲ（ピアース社）を用いてタンパク質を抽出した後、さらに遠心分離し、沈殿画分を６Ｍ尿素溶液で溶解した。溶解液中の目的とする発現タンパク質をＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製造者の指示に従い、吸着・溶出し、当該タンパク質の精製を行った。溶出画分を１００倍強の体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノールに対して室温にて終夜透析し、続いて１００倍強の体積の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１Ｍ ＮａＣｌに対して室温にて終夜透析した。透析画分を遠心分離して、可溶性画分を得た。その可溶性画分には、ＴＲ４３０タンパク質細胞外ドメイン融合タンパク質が存在し、この融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色でほぼ単一バンドとして検出されるにまで精製された。
精製されたＴＲ４３０タンパク質細胞外ドメイン融合タンパク質を免疫原として、ウサギを免疫化し、ウサギポリクローナル抗体を作製した。フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ；Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ）をアジュバントとした抗原タンパク質を、日本白色種家兎（雌）に対し、初回のみ０．１５ｍｇ、その後は二週間毎に０．３ｍｇを計５回皮内にブーストして免疫し、抗血清を得た。
免疫前血清および抗血清に対して、プロテインＡに対するアフィニティ精製もしくは抗原タンパク質に対するアフィニティ精製を行い、抗体を精製した。ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡおよびＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化カラムを用い（どちらもアマシャムファルマシアバイオテク社）を用い、製造者の指示に従い、抗体の精製を行った。
実施例４：Ｙ７９細胞株およヒト末梢血における受容体タンパク質発現解析
終夜培養したＹ７９細胞を遠心分離して回収し、１０^６／１００μＬの細胞数になるようリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）／２％牛胎児血清（ＦＢＳ）中に懸濁した。この細胞調製液に対して２μｌの免疫前の血清、もしくは免疫後抗血清のいずれかを添加し、氷上で３０分間インキュベーションした。遠心分離後、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで再懸濁したものに対して、０．５μｌの抗ウサギＣｙ３抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社）を添加し、氷上で３０分間インキュベーションした。遠心分離と再懸濁を繰り返して細胞を二回洗浄した後に、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトンディキンソン社）を用いて、抗体が細胞表面のＴＲ４３０タンパク質に結合するかどうかについて解析した。
図２Ａにおいて、太線が抗血清と抗ウサギＣｙ３抗体を用いた場合、実線が免疫前血清と抗ウサギＣｙ３抗体を用いた場合、点線が抗ウサギＣｙ３抗体のみを用いた場合による染色結果を示す。免疫前の血清ではＴＲ４３０タンパク質発現細胞であるＹ７９細胞は弱くしか染色されない一方で、免疫後の抗血清ではＹ７９細胞が強く染色された。これは、得られた抗血清中に、細胞膜上に発現するＴＲ４３０タンパク質を認識する抗体が含まれていることを示す。
正常健常人男子の血液よりモノ・ポリ分離溶液（大日本製薬）を用い、末梢血単核球細胞を調製した。細胞懸濁液に抗血清もしくは免疫前血清を添加し氷上で３０分間放置した後、遠心分離を行い細胞を洗浄した。懸濁後ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）ラベルされた抗ウサギ抗体を添加し、氷上で３０分間放置した。遠心分離後、再懸濁し、ＦＩＴＣラベルされた抗ヒトＣＤ３もしくは抗ヒトＣＤ１９抗体（ベックマンコールター社）を添加し、さらに氷上で３０分間放置した。遠心後、再懸濁したのちＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで細胞の二重染色パターンを解析した。図２Ｂに示すように、ＣＤ１９陽性細胞が抗血清で選択的に染色されたことから、Ｂリンパ球上にＴＲ４３０タンパク質が発現していることが明らかとなった。対照となる免疫前の血清では顕著な細胞染色は見られなかった。
実施例５：培養細胞株におけるＴＲ４３０タンパク質発現解析
ヒト血球系腫瘍細胞株におけるＴＲ４３０タンパク質発現をアフィニティ精製したウサギ抗ＴＲ４３０ポリクローナル抗体を用いて解析した。フローサイトメトリーによる解析結果を図３に示した。図中において実線が抗ＴＲ４３０抗体、点線が対照ＩｇＧ抗体による染色を示す。急性リンパ芽球白血病細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、急性Ｔ細胞白血病細胞Ｊｕｒｋａｔ、慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２およびＫＵ８１２、骨髄性白血病細胞Ｕ９３７、およびＢリンパ芽球細胞Ｕ２６６に対し抗ＴＲ４３０抗体による染色が観察され、受容体ＴＲ４３０タンパク質の発現が示された。前骨髄性白血病細胞ＨＬ６０には受容体タンパク質の発現は検出されなかった。
実施例６：受容体刺激によるＮＦ−κＢ活性化
ＴＲ４３０刺激によるＮＦ−κＢ活性化能を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮＦ−κＢの複数の結合部位をもつ合成プロモーターをもつレポータープラスミドｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ（ストラタジーン社）を用いて評価した。ＣＭＶプロモーターにより発現調節をうける受容体遺伝子発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＴＲ４３０ａおよびｐｃＤＮＡ−ＴＲ４３０ｇ）とｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃをヒト胎児腎細胞株２９３細胞に一過的に導入し、過剰発現によるＮＦ−κＢレポーター活性化能を調べた。陽性対照としてｐＦＣ−ＭＥＫＫ（ストラタジーン社）、陰性対照として空の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（−）ＭｙｃＨｉｓ（インビトロジェン社）を用いた。２×１０^４細胞を４８ウェルプレート１ウェルあたりに捲き込み、２００μｌ ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳの培地で３７℃、５％ＣＯ_２下で終夜培養した。培地交換後、１ウェルあたり１００ｎｇの発現プラスミドおよび２００ｎｇのレポータープラスミドをＦｕＧＥＮＥ−６（ロッシュダイアグノスティックス社）を用い、細胞へ導入した。２４時間培養後のルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）を用い定量した。図４Ａに示すように、陰性対照ｍｏｃｋに比べ、ＴＲ４３０ａ遺伝子、ＴＲ４３０ｇ遺伝子を過剰発現させることにより、約７から１０倍のＮＦ−ＫＢ活性化が起こった。
ＴＲ４３０タンパク質細胞外ドメインに対する抗血清よる受容体刺激能を、上述の方法に評価した（図４Ｂ）。ＴＲ４３０を過剰発現させた場合、ＮＦ−κＢ活性化能はＦＢＳの濃度に非依存である一方で、終濃度１％のウサギ抗血清を添加することにより、単に過剰発現させた場合に対して更に約１０倍の活性化の増強が見られた。免疫前の血清である対照血清に増強能は認められなかった。また、受容体を発現しない対照空ベクターｍｏｃｋの場合には、抗血清による活性化の増強は認められなかった。抗原タンパク質に対しアフィニティー精製を行ったポリクローナル抗体による受容体刺激によるＮＦ−κＢ活性化を図４Ｃに示した。精製された抗体の添加により活性化シグナルの増強が起こることが示された。
実施例７：酵母２ハイブリッド（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ）スクリーニングによるＴＲ４３０−細胞内ドメインに結合するキナーゼＴＲＡＫ１、ＴＲＡＫ２の同定
ＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインに結合するタンパク質の選択をＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（クローンテック社）を用いて行った。ＴＲ４３０ａタンパク質の細胞内ドメイン（アミノ酸残基番号１８７−４３０）をコードする塩基配列をＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインプラスミド（ｐＢＴＭ１１８）にクローニングし、囮タンパク質発現ベクターを構築した。ｐＡＣＴ２にクローニングされたヒト末梢血白血球ライブラリ（クローンテック社）ともにレポーター酵母株Ｌ４０に導入し、ＨＩＳ３遺伝子発現に対する選択を行った。選択されたクローン配列を解析し、その後、相互作用の選択性の確認をｌａｃＺ遺伝子発現による青白で判定した。結果を図６に示した。ＴＲ４３０の細胞内ドメインに選択的に結合する遺伝子として、二種の互いによく似たＳｔｅ−２０関連キナーゼＳＰＡＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０９９９８９）およびＯＳＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１７６４２）が同定された。相互作用が同定されたキナーゼＳＰＡＫとＯＳＲ１をそれぞれ、ＴＲ４３０と結合することに基づき、以下ではＴＲＡＫ１（ＴＲ４３０−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ１）およびＴＲＡＫ２と呼称する。図６のクローン＃２６は全長配列を含むＴＲＡＫ２遺伝子であり、クローン＃４９、＃６２はそれぞれアミノ酸３４および３６７残基以降の配列をコードするＴＲＡＫ１遺伝子配列であった。ＴＲＡＫ１とＴＲＡＫ２のアミノ酸配列相同性はキナーゼドメインを含むＮ末端側でより高いが、ＴＲＡＫ１の３６７残基以降の配列がＴＲ４３０タンパク質の細胞内ドメインに選択的に結合したことから、ＴＲ４３０タンパク質との結合ドメインはアミノ酸３６７残基以降のＣ末端側配列上に存在すると推測された。
実施例８：免疫沈降によるＴＲ４３０タンパク質とＴＲＡＫ相互作用
酵母２ハイブリッドスクリーニングにより同定されたＴＲ４３０タンパク質細胞内ドメイン結合タンパク質の哺乳動物細胞内での相互作用を一過的共発現系での免疫沈降により確認した。シグナル配列が切断された成熟型ＴＲ４３０（２６−４３０残基）のＮ末端にＩｇκのシグナル配列およびＨＡタグを付加した発現ベクターおよびＴＲＡＫ１、ＴＲＡＫ２のＮ末端にＦＬＡＧタグを付加した発現ベクターをそれぞれ単独もしくは同時に２９３細胞へ導入した。３５ｍｍディシュあたり２×１０^５の細胞を巻き込み、終夜培養した。培地交換後、１ディシュあたりそれぞれ５００ｎｇの発現ベクターをＦｕＧＥＮＥ−６を使い細胞に導入した。２日間培養後、ＰＢＳで一度細胞を洗浄し、細胞抽出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＣＨＡＰＳ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ｐ−ＡＢＳＦ）でタンパク質を可溶化した。このうちの一部を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロティングを行い、導入プラスミド由来のタンパク質発現をマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ社）、ウサギ抗ＨＡ抗体（サンタクルーズ社）を用いて確認した。残り抽出画分について抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース（シグマ社）を用い免疫沈降を行い、共沈するＴＲ４３０タンパク質をウサギ抗ＨＡ抗体で検出した。図５に示すように、ＴＲＡＫ１、もしくはＴＲＡＫ２の存在に依存したＴＲ４３０タンパク質の共沈が確認された。
実施例９：ＴＲ４３０タンパク質細胞内シグナルカスケードの同定
ＴＲ４３０タンパク質刺激を介したＮＦ−κＢ活性化細胞内シグナルカスケードにおける他ＴＮＦ受容体スーパーファミリーにおいてシグナルを介在するＴＲＡＦ２、ＮＩＫの関与を、２９３細胞における共発現系でのＮＦ−κＢレポーターアッセイにより調べた（図７）。ＮＩＫ、ＴＲＡＦ２はそれ単独でＮＦ−κＢの活性化することが知られている。キナーゼ活性を消失するようアミノ酸置換を施したＮＩＫ変異体ＮＩＫ（ＫＫ４２９−４３０ＡＡ）は、過剰発現させることにより、上流からのシグナルに応じた内在性のＮＩＫの活性化を競合的ブロックし、ドミナントネガティブとしてＮＦ−κＢ活性化に阻害的にはたらく（Ｍａｌｉｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５，５４０）。Ｎ末端を欠失させたＴＲＡＦ２変異体ＴＲＡＦ２（２２５−５０１）もＴＲＡＦ２を介した活性化シグナルに対しドミナントネガティブとして働く。ＮＩＫ（ＫＫ４２９−４３０ＡＡ）およびＴＲＡＦ２（２２５−５０１）は、ＴＲ４３０タンパク質からの活性化シグナルに対し阻害的に働いた。これらの結果は、ＴＲ４３０タンパク質の下流のＮＦ−κＢ活性化経路にＴＲＡＦ２、ＮＩＫが関与していることを表している。シグナルカスケードを形成する下流因子を阻害することによりＴＲ４３０タンパク質を介したＮＦ−κＢの活性化シグナルを遮断可能なことを示す。
実施例１０：ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０タンパク質の共発現によるＴＲ４３０タンパク質の活性化
本実施例においては、ＡＰＲＩＬ、ＢＬｙＳによるＴＲ４３０タンパク質活性化の効果の有無をＨＥＫ２９３細胞におけるＮＦ−κＢレポーターアッセイにより調べた。ＡＰＲＩＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４６８８８）およびＢＬｙＳ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１３２６００）をヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ法によりクローニングした。この際使用したプライマーの配列は、以下の通りであった：

であった。
得られた遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン）に組み込み、ＣＭＶプロモーターの調節下で遺伝子発現が制御されるように、発現プラスミドの構築をおこなった。発現プラスミドの構築は、ＰＣＲ増幅産物をいったんｐＧＥＭＴ Ｅａｓｙベクター（プロメガ）に組み込んだ後、ＥｃｏＲＩで切断した目的遺伝子を含むフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、遺伝子の挿入方向がプロモーターに対し、順方向にクローニングされたクローンを選択することにより行った。
１００ｎｇのＴＲ４３０タンパク質発現プラスミド、７５ｎｇ ＮＦ−κＢレポータープラスミド、１００ｎｇのＡＰＲＩＬ発現プラスミドもしくはＢＬｙＳ発現プラスミド、２５ｎｇの形質転換効率校正用のβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを混和し、５０μｌのＤＭＥＭと２μｌ ＦｕＧＥＮＥ混和液に加え、１５分間放置した。その後、継代後終夜培養したＨＥＫ２９３細胞に対して、４８ウエルプレート１ウエルあたり、１０μｌの溶液を培養液２００μｌに対して添加、混合した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で終夜培養をおこなった。ＨＥＫ２９３細胞の培養後のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を用いて定量した。
結果を図８に示す。ＴＲ４３０を過剰発現させていない形質転換細胞においては、ＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ発現を発現させても、レポーター活性の上昇は観測されなかったが、ＴＲ４３０を過剰発現させて同時にＡＰＲＩＬを過剰発現させると約３倍のレポーター活性の上昇がみられた。ＢＬｙＳをＴＲ４３０と共発現しても、レポーター活性の上昇は観測されなかった。
実施例１１：白血病細胞株におけるＴＲ４３０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ遺伝子のノーザンブロット解析
Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｕ９３７細胞株より、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、製造者の指示通りにトータルＲＮＡを調製した。それぞれ１レーンあたり１５μｇの得られたトータルＲＮＡをホルムアルデヒド変性アガロースゲルで電気泳動し、泳動後のサンプルをナイロン膜（ＨｙＢｏｎｄＸＬ、アマシャムファルマシアバイオテク）にキャピラリー法により転写した。
ＴＲ４３０、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡの^３２Ｐ ｃＤＮＡプローブをＲＴＧ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｂｅａｄｓ（−ｄＣＴＰ）（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて作製した。ハイブリダイゼーションプローブは、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡについては全翻訳領域をコードする塩基配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２３６１４およびＺ２９５７５）、ＴＲ４３０については細胞内ドメインをコードする塩基配列領域を鋳型に用い作製した。具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２アミノ酸配列番号１８７から４３０をコードする塩基配列を有する核酸をＴＲ４３０プローブとして使用した（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）。
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションはＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（クローンテック）を用いて、製造者の指示にしたがって行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、製造者の指示書に記載された方法に従って、ストリンジェントな条件、すなわち２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳを用いて室温にて１時間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６５℃にて１時間で行った。その後、ラジオオートグラフィをＢＡＳ５０００（富士フィルム）を用いて行った。
結果を図９に示す。ＴＲ４３０遺伝子の発現が３つの細胞株すべてに検出されたのに対し、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ遺伝子の発現はＲａｊｉのみで認められた。Ｊｕｒｋａｔ、およびＵ９３７細胞にＴＡＣＩ、ＢＣＭＡが発現していないことは、以前別グループにより発表された内容と一致する結果である（Ｒｅｎｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１６７７）。
実施例１２：ＴＲ４３０−ＡＰＲＩＬ複合体の検出
シグナル配列が切断された成熟型ＴＲ４３０（２６−４３０残基）のＮ末にＩｇκのシグナル配列およびＨＡタグを付加したＴＲ４３０発現プラスミド、およびＮ末端にＦＬＡＧタグを付加したＡＰＲＩＬ発現プラスミドまたはＢＬｙＳ発現プラスミドを単独もしくは同時に、ＨＥＫ２９３細胞へ導入した。
６ウェルディシュあたり２×１０^５のＨＥＫ細胞を巻き込み、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを使用して、終夜培養した。培地交換後、１ディシュあたりそれぞれ５００ｎｇの発現ベクター、すなわち５００ｎｇの上記ＴＲ４３０発現プラスミドと５００ｎｇのＡＰＲＩＬ発現プラスミド、または５００ｎｇの上記ＴＲ４３０発現プラスミドと５００ｎｇのＢＬｙＳ発現プラスミドをＦｕＧＥＮＥ−６を使い細胞に導入した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２日間培養した後、ＰＢＳで一度細胞を洗浄し、細胞抽出液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ＣＨＡＰＳ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ｐ−ＡＢＳＦ）でタンパク質を可溶化した。このようにして得られた可溶化タンパク質の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ・ウエスタンブロティングに供し、導入プラスミド由来のタンパク質発現をマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（シグマ）、ウサギ抗ＨＡ抗体（サンタクルーズ）により確認した。残りの抽出画分について抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース（シグマ）を用いて免疫沈降を行い、共沈するＴＲ４３０の有無をラビット抗ＨＡ抗体で検出した。
結果を図１０に示す。ＡＰＲＩＬの存在に依存したＴＲ４３０の共沈が確認され、ＴＲ４３０とＡＰＲＩＬが複合体を形成することが示された（図１０）。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＴＲ４３０遺伝子のヒト組織発現解析結果を示す。
図２は、Ｙ７９細胞株及びヒト末梢血リンパ球の細胞膜上に発現するＴＲ４３０タンパク質の抗血清による検出を示す。
図３は、ヒト白血病細胞株に発現するＴＲ４３０タンパク質の抗ＴＲ４３０抗体による検出を示す。
図４は、ＴＲ４３０遺伝子過剰発現によるＮＦ−κＢの活性化（Ａ）、抗血清添加による受容体からのＮＦ−κＢ活性化シグナルの増強（Ｂ）、および、抗原タンパク質に対しアフィニティ精製されたポリクローナル抗体によるＴＲ４３０受容体を介したＮＦ−κＢの活性化（Ｃ）を示す。
図５は、動物細胞で共発現させたＴＲＡＫ１、ＴＲＡＫ２とＴＲ４３０タンパク質が相互作用する様子を示す。
図６は、酵母２ハイブリッドスクリーニングでＴＲ４３０細胞内ドメインに選択的に結合するクローンを示す。
図７は、ＴＲ４３０のＮＦ−κＢ活性化シグナルを媒介する分子群の効果を示す。
図８は、ＡＰＲＩＬがＴＲ４３０を刺激し、結果的にＮＦ−κＢの活性化をもたらすが、ＢＬｙＳはＮＦ−κＢの活性化を引き起こさないことを示す。
図９は、ＡＰＲＩＬの受容体として知られているＴＡＣＩ、ＢＣＭＡとともに、ＴＲ４３０のｍＲＮＡ発現について、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞、およびＵ９３７細胞に由来するｍＲＮＡを用いたノザンブロット解析の図である。
図１０は、ＡＰＲＩＬとＴＲ４３０の結合を示す、免疫沈降の結果を示す図である。Technical field
The present invention relates to an antibody capable of specifically binding to a protein having SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 (hereinafter collectively referred to as TR430 protein). The present invention further relates to an antibody capable of binding to the protein and modulating the function of the protein. The present invention also relates to a method for detecting a tumorigenic cell using the antibody thus obtained. The present invention also relates to a method for screening a compound capable of regulating the function of the protein, and a compound capable of regulating the function of the protein selected by the screening method. The present invention further relates to a composition comprising an antibody or a compound capable of regulating the function of the protein, for the purpose of regulating a cell function by regulating a cell signal mediated by the protein.
Background art
The present inventors previously collected two types of genes named TR430a gene and TR430g gene from a cDNA library derived from human retinoblastoma cells (obtained from RIKEN Cell Bank). As a result of detailed analysis of the nucleotide sequence of this gene, it was found that it was a type of gene encoding a cytokine receptor molecule belonging to the tumor necrosis factor (TNF) receptor (TNFR) superfamily. It turned out that it is thought to be derived from the allyl difference. The nucleotide sequences of these two genes, the TR430a gene and the TR430g gene, are described in the present invention as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.
When these two nucleotide sequences, the TR430a gene and the TR430g gene (that is, the TR430 gene) were searched using the patent gene database, GENESEQ, the nucleotide sequence of the TR430a gene (SEQ ID NO: 1) was found in International Patent Application WO99 / At 52924 it was found to be identical to the molecule already described as SEQ ID NO: 1. International Patent Application WO 99/52924 discloses a nucleotide sequence identical to the nucleotide sequence of the TR430a gene and its expression distribution. This molecule has an open reading frame of 1290 nucleotides, which is predicted to encode a 430 amino acid residue protein. The amino acid sequence of the protein encoded by this nucleotide sequence is also shown in the international patent application WO99 / 52924, but is also described as SEQ ID NO: 2 in the present specification.
According to International Patent Application WO 99/52924, the N-terminus of this putative protein contains a putative signal sequence consisting of 22 amino acid residues, thus the protein is a putative mature protein consisting of 408 amino acid residues. It is estimated that This putative mature protein is believed to have a single transmembrane domain and a tumor necrosis factor / nerve growth factor receptor (NGFR) (TNFR / NGFR) cysteine-rich region domain.
However, the international patent application WO 99/52924 only describes that the nucleotide sequence was cloned and sequenced. Therefore, the specific function of the protein encoded by the nucleotide sequence has not been known at all. Other groups have not reported any research results other than the nucleotide sequence and amino acid sequence of the TR430 gene.
An object of the present invention is to analyze the specific function of the TR430 protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. An object of the present invention is to first produce an antibody that can specifically bind to a TR430 protein in order to solve the above-mentioned problem. Another object of the present invention is to identify a cell expressing the TR430 protein using the antibody prepared as described above, and to analyze the function of the cell. Furthermore, it is an object of the present invention to regulate cell activity by using such an antibody.
Another object of the present invention is to select a compound that can regulate cell signaling through the TR430 protein in a cell that expresses the TR430 protein. Furthermore, it is also an object of the present invention to regulate cell activity by using such compounds.
Another object of the present invention is to treat a disease associated with an abnormal function of a cell expressing the TR430 protein by modulating the activity of a cell expressing the TR430 protein. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating such a disease.
Disclosure of the invention
The present invention provides antibodies that specifically bind to TR430 protein or an analog thereof.
The present invention further provides NF-κB transcriptional activity in both cells between a cell expressing a TR430 protein contacted with a test compound and a cell expressing a TR430 protein not contacted with the test compound. In comparison, there is provided a method for screening a test compound that regulates the function of a TR430 protein, comprising detecting the degree to which NF-κB transcriptional activation is regulated by contact with the test compound.
The present invention further provides a method for screening a test compound that regulates the function of a signaling molecule that mediates intracellular signaling resulting from stimulation of a TR430 protein.
The present invention further provides a compound capable of regulating NF-κB transcription activation inside a TR430 protein-expressing cell, obtained by the above-described screening method for a test compound that regulates the function of TR430 protein.
The present invention also relates to an NF-κB activity inside a cell, comprising an antibody that specifically binds to a TR430 protein or an analog thereof, or a compound obtained by the screening method, and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical compositions for treating diseases associated with an increase or decrease in
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In practicing the present invention, conventional techniques relating to immunology, molecular biology, microbiology, cell biology, and recombinant DNA can be used unless otherwise indicated in the specification (eg, Sambrook and). Russel, MOLECULAR CLONING: ALABORATORY MANUAL, 3rd edition (2001); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (FM Ausubel et al. Ed. PCR2: A PRACTICAL APPROACH (MJ MacPherson, BD Hames an) d GR Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1989) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (RI Freshney, ed.) (1987).
1. Cloning and analysis of nucleotide sequences
The present inventors have cloned two nucleotide sequences from human retinoblastoma cells, the TR430a gene (SEQ ID NO: 1) and the TR430g gene (SEQ ID NO: 3). These two genes have polymorphisms that appear to be derived from the allele. The putative TR430g protein has a 187 amino acid residue from Lys (TR430a) to Glu (TR430g), compared to the putative TR430a protein. The amino acid residue at position 273 was substituted with His (TR430a) by Arg (TR430g). In this specification, the TR430a gene and the TR430g gene are collectively referred to as the TR430 gene, and the TR430a protein and the TR430g protein are collectively referred to as the TR430 protein unless otherwise specified.
When these sequences were subjected to homology search using the patent gene database, GENESEQ, the nucleotide sequence of the TR430a gene was identical to the nucleotide sequence already disclosed in WO 99/52924. The amino acid sequence of the TR430a protein deduced from the nucleotide sequence of the TR430a gene is shown in SEQ ID NO: 2.
On the other hand, the nucleotide sequence of the TR430g gene (SEQ ID NO: 3) and the amino acid sequence of the TR430g protein (SEQ ID NO: 4) were both novel sequences that have not been reported before.
The TR430a protein is characterized by having a signal peptide sequence consisting of amino acids 1-22 followed by a mature protein part consisting of 408 amino acids (see, for example, WO 99/52924). This protein further comprises a cysteine-rich domain of tumor necrosis factor receptor / nerve growth factor receptor (TNFR / NGFR) consisting of amino acids 51-90, amino acids 163 (extracellular end) to 186 (cytoplasmic end). Is known to have a transmembrane domain (TM domain). From this, the TR430 protein of the present invention has a TNFR / NGFR, which has an extracellular domain that penetrates the cell membrane and receives extracellular stimulus and an intracellular domain that transmits the stimulus to a signal transduction system inside the cell. Was found to be a similar protein.
2. Expression analysis of TR430 mRNA
Tissue distribution of TR430 gene expression can be determined by any method known in the art that can quantify mRNA. In order to examine the tissue distribution of TR430 mRNA, for example, a method such as an RT-PCR method and a Northern hybridization method can be used. As a result of examining the expression distribution of the TR430 gene by such a method, it was found that the expression of the TR430 gene of the present invention was localized in peripheral blood leukocytes and spleen. This result is consistent with previous findings that were expressed in peripheral lymphocytes, spleen and skeletal muscle, and weakly expressed in heart, brain and placenta (WO 99/52924).
In the RT-PCR method that can be used in the present invention, a synthesis reaction of DNA using mRNA as a template is performed in advance by using an RNA-dependent DNA polymerase, that is, reverse transcriptase, and then the DNA is used as a template. This is a method of performing a PCR used as a method. The RT-PCR method can be performed, for example, according to the procedure described in Sambrook and Russel, MOLECULAR CLING: A LABORATORY MANUAL, 3rd edition (2001). Primers for the reverse transcription reaction that can be used to prepare first-strand cDNA in the RT-PCR method of the present invention are oligo dT primers or random hexamer primers.
The primer used in the PCR reaction using the first-strand cDNA prepared by the above reverse transcription reaction can anneal to the sequence of the TR430 gene cDNA, and has a length of 15 to 100 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs. One pair of primers consisting of a pair-length sequence. In the present invention, for example, as a forward primer and a reverse primer, respectively:

Can be used as a preferable primer for RT-PCR, whereby the nucleotides at positions 620 to 1255 of SEQ ID NO: 1 can be amplified.
The Northern hybridization method that can be used in the present invention can be carried out, for example, according to the procedure described in Sambrook and Russel, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd edition (2001). Briefly, after TR430 mRNA extracted from cells is electrophoresed on a denaturing gel, the nucleic acid is transferred to a nitrocellulose membrane or the like, and the target sequence on the membrane is detected using a probe capable of hybridizing to the sequence. I do. Probes that can be used in the Northern hybridization method have a sequence that can hybridize to the sequence of TR430 mRNA under stringent conditions.
The probe used in the present invention is a probe having a sequence of at least 22 base pairs, preferably 200 to 1000 base pairs, and most preferably 200 to 600 base pairs. The probe used in the present invention is preferably a probe that can hybridize to nucleotides 150 to 350, nucleotides 400 to 700, and the like of SEQ ID NO: 1.
Examples of stringent hybridization conditions include, for example, an incubation temperature of about 25 ° C. to about 37 ° C., a hybridization buffer concentration of about 6 × SSC (0.15 M NaCl and 15 mM citrate buffer) to about 10 × SSC. , About 0% to 25% formamide concentration, and about 6 × SSC wash solution. Examples of highly stringent conditions include, for example, an incubation temperature of about 55 ° C. to about 68 ° C., a buffer concentration of about 1 × SSC to about 0.1 × SSC, a formamide concentration of about 55% to about 75%, And about 1 × SSC, 0.1 × SSC, or a wash solution comprising deionized water, but is not limited to these. Generally, the incubation time for hybridization is 5 minutes to 24 hours, includes one or more washing steps, and the wash incubation time is about 1 to 15 minutes.
3. Preparation of immunogen
In the present invention, as the immunogen, a protein having immunogenicity for producing an antibody that reacts substantially specifically with the TR430 protein is prepared. For example, the TR430a protein itself (SEQ ID NO: 2), the TR430g protein itself (SEQ ID NO: 4), or analogs thereof can be used as such an immunogen.
Here, an analog of the TR430a protein or the TR430g protein is a protein in which at least one amino acid is different from the amino acid sequence of these proteins due to deletion, substitution, or addition, and has the same immunogenicity. What you do. If the analog has similar activity or similar immunogenicity, its sequence identity (eg, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 99% in amino acid sequence) % Sequence identity) is not a concern. Further, this analog is not particularly limited in the number of amino acid residues, but is fused with other proteins such as GST and a protein having the same length as the protein of SEQ ID NO: 2 (430 amino acid residues). The chimeric protein may have an increased number of amino acid residues, or may be as short as at least 4 amino acids, preferably at least 8 amino acids, and more preferably at least 10 amino acids. Thus, analogs of the invention include, but are not limited to, for example, fragments of the TR430 protein, the extracellular domain of TR430 (amino acids 26-162 of SEQ ID NO: 2). is not.
The TR430 protein (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) that can be used in the present invention is obtained by genetically expressing the nucleotide sequence of the TR430 gene (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3). Or a human tissue sample, for example, isolated and purified from peripheral blood lymphocytes. Further, analogs of the TR430 protein that can be used in the present invention can be obtained by isolating and purifying a TR430 protein or a tissue sample that has been expressed by genetic engineering as described above with a preferable proteolytic enzyme. Artificially synthesizing a polypeptide having the desired sequence, for example, by expressing a nucleotide encoding the polypeptide having the desired sequence in vitro, or a solid phase peptide synthesis method. May be prepared by chemical synthesis such as, but not limited to.
When the TR430 protein is prepared based on the nucleotide sequence of the TR430 gene (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3), it is described in Sambrook and Russel, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd edition (2001) and the like. Such genetic engineering methods well known in the art can be used. Specifically, in the present invention, the TR430 protein can be expressed using an E. coli expression system, an insect cell expression system, a mammalian cell expression system, or the like.
For example, by the method described below, the extracellular domain of TR430 protein (amino acids 26 to 162 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) can be expressed using an E. coli expression system. A nucleotide sequence encoding the extracellular domain (amino acids Nos. 26 to 162) of the TR430 protein was identified by a primer:

, And the amplified PCR product was once cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega). After confirming the inserted sequence, this vector was cut with restriction enzymes EcoRV and SalI, and the obtained restriction enzyme fragment was subcloned into pET-32a (Novagen) similarly cut with restriction enzymes EcoRV and SalI, An E. coli thioredoxin fusion expression vector pET32a / TRex was constructed.
The expression vector pET32a / TRex was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain for transformation, the protein expression was induced at a final concentration of 1 mM IPTG, and the Escherichia coli was cultured at 37 ° C. to obtain the desired thioredoxin-TR430 cell. Express the ectodomain fusion protein. Since this expressed protein is insoluble, the protein was extracted from the cells after the induction of expression, and then dissolved with a 6 M urea solution. The target expressed protein in the lysate was adsorbed and eluted using a HiTrap Chelating column (Amersham Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions, and the protein was purified. Further, the eluted fraction was dialyzed overnight at room temperature against a slightly more than 100-fold volume of 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0.1 M NaCl, and 0.1 mM 2-mercaptoethanol, followed by a slightly more than 100-fold volume of 50 mM Dialysis was performed overnight at room temperature against Tris-HCl (pH 8) and 0.1 M NaCl. The dialyzed fraction was purified by centrifugation until the expressed protein of interest was detected as a substantially single band.
4. Antibody production
In the present invention, an antibody that specifically binds to the TR430 protein or an analog thereof can be produced using the immunogen prepared as described above. In the present invention, the term antibody includes both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. Such antibodies can be prepared according to methods well known in the art.
Here, an antibody that specifically binds to the TR430 protein or an analog thereof refers to a peptide portion that binds to any peptide portion present on the protein or an analog thereof, but has a sequence other than that. Refers to an antibody that cannot substantially bind. Antibodies having such characteristics can be used, for example, to specifically detect TR430 protein or its analog on the cell membrane surface, or to bind to the protein or its analog and regulate its function. it can. Here, the regulation of the function of the protein or the analog thereof means not only the activation or inactivation of the protein or the analog itself, but also the activation or deactivation of the protein or the analog itself. It refers to a concept that also includes activating or deactivating a signal transducer that results within a cell.
This antibody is prepared by immunizing animals such as mice, rats, rabbits, goats and the like with the immunogen prepared as described above. Upon immunization, it can be administered together with an adjuvant to enhance the immune activity of the animal that produces the antibody. Examples of adjuvants include Martin, REMINGTON'S PHARM. SCI. , 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975)). As the adjuvant, any of a water-in-oil emulsion, an oil-in-water emulsion, and an aluminum adjuvant can be used. Examples of water-in-oil emulsions include Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant, and examples of oil-in-water emulsions include the RIBI adjuvant system (RIBI Immunol. Res. Inc.) and aluminum adjuvants. Examples thereof include potassium aluminum sulfate, but are not limited thereto.
Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art (Current Protocol in Molecular Biology (supra)). Specifically, a polyclonal antibody is prepared by administering and immunizing animals such as mice, rats, rabbits and goats by mixing the immunogen prepared as described above with the adjuvant described above. After several immunizations of the animal, a micro-collection of the animal's blood is made to confirm that antibodies have been produced that are substantially specific for binding to the TR430 protein. When the target antibody is produced in the blood of the animal, the serum obtained from the animal is purified using a protein A column, an antigen adsorption column, a gel filtration column, an ion exchange column, a reverse phase column, or the like. Thereby, a desired polyclonal antibody can be obtained.
Polyclonal antibodies can be used, for example, in enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), radioimmunoassays (RIA), enzyme immunoassays (EIA) such as fluorescence immunoassays (FIA), Western blots, and flow cytometry, or Modulating the activity of cultured cells by adding to the cell culture supernatant, and modulating the activity of target cells by administering in vivo, immunohistochemistry according to methods well known in the art, It can be used for other purposes, but it can also be used for other purposes.
Monoclonal antibodies can be produced by methods well known in the art (Current Protocol in Molecular Biology (supra)). When the immunized animal is a mouse, first, the immunogen prepared as described above is administered to the mouse several times with an adjuvant to immunize the mouse. After several immunizations, a micro-sample of the mouse blood is taken to confirm that antibodies have been produced that are substantially specific for binding to the TR430 protein. When the target antibody is produced in the mouse blood, the mouse is sacrificed, spleen cells are isolated, and the cells are fused with mouse-derived myeloma cells to obtain hybridoma cells. Among the hybridoma cells thus obtained, a hybridoma cell capable of producing an antibody that specifically binds to the target protein TR430 protein or an analog thereof is cloned.
Next, the hybridoma cells thus obtained are cultured under culture conditions and the culture supernatant is collected, or the hybridoma cells are administered to the peritoneal cavity of a mouse and ascites stored in the peritoneal cavity of the mouse is collected. A mouse monoclonal antibody can be obtained by purifying the obtained culture supernatant or mouse ascites using a protein A column, an antigen adsorption column, a gel filtration column, an ion exchange column, a reverse phase column, or the like.
Monoclonal antibodies can be used, for example, in EIAs such as ELISA, RIA, FIA, immunoprecipitation, western blot, and flow cytometry, or can be added to cell culture supernatants to regulate the activity of cultured cells To regulate the activity of target cells by in vivo administration, immunohistochemistry according to methods well known in the art, and the like. Can also be used.
5. Expression analysis of TR430a using antibody
The present inventors attempted to analyze the expression of TR430 protein using the antibody prepared by the above-described method. In order to analyze the expression of the TR430 protein using the target antibody, methods such as immunohistochemistry, flow cytometry, immunoprecipitation, and Western blotting can be used.
When performing expression analysis of TR430 protein in solid tissues, it is preferable to perform immunohistochemistry using this antibody. Techniques for immunohistochemistry are well known in the art, for example, using paraffin-fixed tissue sections, cell smears or frozen tissue sections, according to methods described in, for example, Current Protocol in Molecular Biology (supra). It can be carried out. After deparaffinization when using paraffin-fixed sections, the cell smear was used to fix cells with methanol, paraformaldehyde, etc., and when using frozen tissue sections, after removing the compound, TR430 protein or its Contacting the tissue section with an antibody that specifically binds to the analog, and then detecting this antibody using a secondary antibody or an avidin-biotin system, etc., to determine whether the TR430 protein is expressed in the tissue You can check if.
When analyzing the expression of TR430 protein in suspension cells such as blood cells and cultured cells, for example, it is preferable to perform flow cytometry, immunoprecipitation, or the like using this antibody. For example, when performing flow cytometry, cells (for example, 10%) suspended in phosphate saline (PBS) / 2% fetal bovine serum (FBS) are used.⁶/ 100 μL), and the antibody is bound to the cells. After centrifugation and resuspension in PBS / 2% FBS, an appropriate amount of a secondary antibody labeled with a fluorescent dye such as Rhodamine, Cy3, or FITC is added, and the target antibody bound to the cells is added. Join. The cells thus treated were analyzed using FACSCalibur (Becton Dickinson) to analyze whether the TR430 protein was expressed on the cell surface.
It was confirmed that the TR430 gene of the present invention was mainly expressed in peripheral blood lymphocytes among various types of human tissues (FIG. 1). This result is consistent with the findings previously revealed in WO 99/52924.
In the present invention, in order to further clarify which of various types of cells contained in peripheral blood lymphocytes are expressed, FITC-labeled antibodies such as anti-human CD3 or anti-human CD19 antibody are also used. Flow cytometry was performed on human peripheral blood lymphocytes. As a result, it became clear for the first time that the TR430 protein was expressed on B cells (FIG. 2).
Furthermore, in the present invention, the expression of TR430 protein in the human leukemia cell line was examined by the above-described flow cytometry, and the expression of TR430 protein was identified in 5 of 6 cell lines other than the B cell lineage (FIG. 3). . Judging from this finding and the fact that the TR430 gene of the present invention was isolated from the cDNA of a human eye-derived retinoblastoma cell, the TR430 protein of the present invention was found to be widely expressed in tumorigenic cells. It is suggested.
In one embodiment of the present invention, by utilizing the above-mentioned properties of the protein of the present invention, the antibody obtained by the above-mentioned method is used for examination, diagnosis, and prognosis observation during tumor treatment of antitumor cells. be able to. That is, using the antibody of the present invention, it is possible to detect the presence of tumor cells in a subject. In particular,
(I) applying an antibody that specifically recognizes a TR430 protein to a test cell collected from a test subject and an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen; and
(Ii) detecting cells that are negative for an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen, but are positive for an antigen that specifically recognizes the TR430 protein;
Thus, it is possible to detect the presence of a tumor cell in the test cells.
In one embodiment of the present invention, when the test cells are blood cells that are floating cells,
(I) Performing flow cytometry on a test blood cell collected from a test subject using an antibody that specifically recognizes the TR430 protein and an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen. ;and;
(Ii) detecting cells that are negative for an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen, but are positive for an antigen that specifically recognizes the TR430 protein;
Thereby, it is possible to detect the presence of tumor cells in the test blood cells.
In another embodiment of the present invention, when using a biopsy or the like from floating cells or solid tissue in the form of a smear,
(I) A test cell collected from a test sample is fixed on a slide glass, and an antibody that specifically recognizes the TR430 protein for the test cell and an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen Applying;
(Ii) detecting cells that are negative for an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen, but are positive for an antigen that specifically recognizes the TR430 protein;
Thus, it is possible to detect the presence of a tumor cell in the test cells.
In yet another embodiment of the present invention, when using excised human solid tissue,
(I) applying an antibody that specifically recognizes a TR430 protein and an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen to a test tissue section collected from a test subject; and
(Ii) detecting cells that are negative for an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen, but are positive for an antigen that specifically recognizes the TR430 protein;
Thus, it is possible to detect the presence of tumor cells in the test tissue section.
In the present invention, the tumorigenic cells are not limited to specific ones.Examples of the tumorigenic cells of blood cells include leukemia cells, myeloid leukemia cells, lymphocytic leukemia cells, etc. Solid tissue-derived cells include retinoblastoma cells, small cell lung cancer cells, large cell lung cancer cells, liver cancer cells, kidney cancer cells, gastric cancer cells, melanoma cells, colon cancer cells, pancreatic cancer cells, prostate cancer cells, etc. However, the present invention is not limited to these. Antibodies that specifically recognize B cell-specific marker antigens include, but are not limited to, CD19, CD20, CD22, and the like.
In still another aspect of the present invention, there is provided a kit for detecting a tumorigenic cell, comprising an antibody capable of specifically recognizing a TR430 protein, and an antibody specifically recognizing a B cell-specific marker antigen. You can also. This kit can be used for flow cytometry, immunohistochemistry, and the like. Therefore, a fluorescent dye may be directly bound to these antibodies contained in the kit so that the antibodies can be used for flow cytometry, or a fluorescent dye capable of specifically recognizing these antibodies can be used. A secondary antibody can be included in the kit. Alternatively, horseradish peroxidase, streptavidin, alkaline phosphatase may be directly bound to the antibody contained in the kit, or horseradish peroxidase, streptavidin, alkaline phosphatase may be used in the immunohistochemistry. A bound secondary antibody capable of specifically recognizing these antibodies can also be included in the kit.
6. Analysis of signal transduction pathway in B cells
As described above, it is apparent that the TR430 protein is a single transmembrane TNFR / NGFR family protein that is expressed on the cell surface of tumorized blood cells such as peripheral blood B cells and human leukemia cells. became. Next, in the present invention, by stimulating the TR430 protein with the antibody obtained by the above-described method, it is possible to examine what kind of intracellular signaling reaction occurs in the TR430-expressing cell.
B cells are precursor cells of antibody-producing cells derived from bone marrow, and have immunoglobulins (B cell antigen receptors, hereinafter referred to as BCRs) that are also antigen-specific receptors on the cell membrane surface. When stimulated by a BCR-specific ligand, B cells associate or cooperate with co-receptors expressed on the membrane of the B cell, and thus, for the first time, signal external signals through the BCR to the inside of the cell. To communicate. By controlling the BCR signal by the co-receptor, B cells respond strongly to antigens that should react strongly, but stop responding to antigens that should not react.
It is also known that signals from the molecules CD40, TACI, and BCMA belonging to the TNF receptor superfamily expressed on B cells modify the signals from BCR and determine the fate of B cells (Gross et al. (2000) Nature 404, 995; Bulow and Bram (1997) Science 278, 138; Moore et al. (1999) Science 285, 260; Thompson et al. (2000) J. Exp. Med. 192, 129; Bakerland. Reddy (1998) Oncogene 17, 3261). It has been reported in the past that what kind of signal transduction is stimulated from TNFR inside cells has been reported. Activation of TRAF2 via TRADD and / or RIP (TNFRI) or direct activation of TRAF2 (TNFRII) ), It has been found that one such result is activation of NF-κB via NIK, IκB, and the like.
In the present invention, what kind of stimulation is transmitted to peripheral blood B cells or tumorigenic cells by stimulating the TR430 protein expressed on the cell surface using the antibody produced by the above-described method. You can find out. From the above-mentioned conventional findings, it is speculated that there is some relationship between the stimulation of TR430 protein and the activity of NF-κB.
In order to investigate the relationship between TR430 protein and NF-κB activity, in one embodiment of the present invention, NF-κB reporter assay was performed on cells in which the TR430 gene was transiently introduced and overexpressed. It can be performed. For example, it can be examined whether or not the polyclonal antibody produced by the above-described method can activate a promoter having an NF-κB binding site, using a firefly luciferase gene expression enhancement as a reporter. Cells that can be used to transiently introduce and overexpress the TR430 gene include, for example, human fetal kidney cell line 293 cells, HeLa cells, Jurkat cells, and the like.
When the cells in which the TR430 protein was transiently introduced and overexpressed were stimulated with the antibody of the present invention, it was found that NF-κB activity was significantly increased finally inside the cells (FIG. 5). This suggests that, when the extracellular domain of the TR430 protein present on the cell surface is stimulated by the antibody of the present invention, the stimulation is transmitted to the inside of the cell, and finally the NF-κB activity is significantly increased. You. This also suggests that the TR430 protein functions as a receptor for some unknown signal from outside the cell. It is known that NF-κB (nuclear factor κB) activated inside the B cell functions as a transcription factor central to the survival and proliferation of the B cell (Grummont et al. (1999)). Genes Dev 13,400; Franzoso et al. (1997) Genes Dev.11,3482; Grummont et al. (1998) J.Exp.Med.187,663; Kongen et al. (1995) Genes Dev.9,1965. ).
In one embodiment of the present invention, a yeast two-hybrid (Two-Hybrid) screen is used in the present invention to examine what kind of signal cascade is activated by the above-described antibody stimulation of the TR430 protein inside a cell. It can be performed. By using this method, for example, a protein that can selectively bind to the intracellular domain of the TR430 protein (the 187-430 amino acid portion) can be selected.
In the yeast two-hybrid screening of the present invention, for example, a base sequence encoding a TR430 intracellular domain is cloned into a LexA DNA binding domain plasmid (pBTM118) to construct a decoy protein expression vector, and human peripheral blood leukocytes cloned into pACT2. It can be carried out by introducing both the library (Clontech) and the reporter yeast strain L40. In practice, commercially available kits such as, for example, the MATCHMAKER Two-Hybrid System (Clontech) can be used using the manufacturer's instructions.
When the yeast two-hybrid screening was performed as described above, two kinds of kinases, TRAK1 (TR430-Associated Kinase 1) and TRAK2, were found as proteins capable of selectively binding to the TR430 protein. When the genes encoding these proteins were sequenced and searched for sequence homology, TRAK1 was the nucleotide sequence of human Ste-20-related kinase, SPAK, registered at GenBank under accession number AF099989 (SEQ ID NO: 9). It was found to have the same sequence as TRAK2 also has the same sequence as the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 10) of human oxidative stress responsive molecule 1 (oxidative-stress response 1) registered in GenBank under accession number AB017642. I understood.
Furthermore, from the kinases TRAK1 and TRAK2 identified as described above, what kind of signal cascade is formed further downstream thereof, for example, current protocol in Molecular Biology such as immunoprecipitation and quantification of phosphorylated protein. It can be examined by using the method described in (supra).
In activation of NF-κB through cytokine receptors, it has been shown that a mutant of TRAF family protein or NIK acts as a dominant negative molecule in an inhibitory manner (Malinin et al. (1997) Nature 385, 540). . From the results of such studies, it is known that TRAF family proteins and NIK play an important role in NF-κB activation by cytokine receptor signals, as described earlier in this specification.
In one embodiment of the present invention, TRAF2 and / or TRAF2 and / or TRAF2 and / or NF-κB reporter assay, and the methods described in Current Protocol in Molecular Biology (supra), such as immunoprecipitation and quantification of phosphorylated proteins, are used. Alternatively, it can be examined whether it is involved in the regulation of NF-κB activity through the activation or inactivation of NIK. The dominant-negative form of TRAF2 and the dominant-negative form of NIK inhibited NF-κB activation by TR430 protein. Therefore, it is suggested that the signal from cell surface TR430 ultimately transmits stimulation to NF-κB through a cascade involving TRAF2 and NIK.
7. Identification of ligand for TR430 protein
As ligands for molecules BCMA and TACI belonging to the TNF receptor superfamily, APRIL (a proliferation-inducing ligand) and BLyS which are molecules belonging to the TNF family are known. Among them, APRIL promotes the growth of cancer cells in the absence of serum in vitro, and NIH-3T3 strain overexpressing APRIL is known to cause tumor formation in nude mice at a high rate. . Moreover, the BCMA soluble receptor suppresses cell growth by APRIL and suppresses cancer growth in nude mice. From these, APRIL and its receptor are considered to be important factors involved in cancer growth (Hahne et al. (1998) J. Exp. Med. 188, 1185; Rennert et al. (2000). ) J. Exp. Med. 192, 1677; Ware (200) J. Exp. Med. 192, F35). On the other hand, APRIL promotes the growth of cancer cells that do not express both BCMA and TACI, suggesting the existence of another receptor using APRIL as a ligand (Ware (200) J. Exp. Med. 192, F35).
Since the expression of the TR430 protein was detected with high probability in leukemia cell lines (see FIG. 3), and activation of NF-κB occurred by stimulation of the TR430 protein (see FIG. 5), the present inventors And TR430 were considered to be candidates for APRIL receptors, and were examined.
In the present invention, the use of APRIL or BLyS, which is a ligand of a molecule belonging to the superfamily of TNF receptors, is used to determine whether or not it has a stimulatory activity for TR430, between APRIL or BLyS in HEK293 cells and TR430. In the co-expression system, evaluation was performed by using as an index whether stimulation of these ligands resulted in activation of NF-κB.
A transient coexpression system of APRIL or BLyS with TR430 using HEK293 cells was created by introducing an APRIL or BLyS expression plasmid into the HEK293 cells simultaneously with the TR430 expression plasmid, respectively.
When BLyS and TR430 were co-expressed in HEK293 cells, they did not stimulate NF-κB activation levels due to TR430 activation. On the other hand, when APRIL and TR430 were simultaneously expressed in HEK293 cells, the NF-κB reporter activity was enhanced (FIG. 8). The fact that BLyS failed to increase NF-κB activity in HEK293 cells expressing TR430, together with BLyS not stimulating TR430, indicates that the cells do not express BCMA, TACI molecules. . On the other hand, when APRIL and TR430 are co-expressed, the fact that NF-κB is activated in the HEK293 cells indicates that TR430 is stimulated by APRIL even in cells that do not express BCMA or TACI. And suggests a pathway by which subsequent intracellular signaling functions and consequently activates NF-κB. Therefore, it is inferred that APRIL and TR430 have a previously unknown ligand-receptor relationship. That is, it is presumed that the unknown ligand for TR430 is APRIL.
The present inventors further confirmed by Northern blotting that TR430 was expressed in Jurkat cells in which APRIL supported growth in the absence of serum, while BCMA and TACI were not expressed (FIG. 9). . This finding also supports the speculation that the unknown ligand for TR430 is APRIL.
Furthermore, the present inventors confirmed that APRIL and TR430 bind by immunoprecipitation in a transient co-expression system (FIG. 10). These results indicate that TR430 is an APRIL receptor, indicating that if TR430 function can be inhibited by a soluble TR430 receptor, a neutralizing antibody, or a low molecular compound, cancer cells induced by APRIL stimulation It is suggested that the compound has an effect of promoting the growth of B cells and suppressing a disease based on abnormal proliferation of B cells.
8. Method for isolating and screening compounds that regulate the function of TR430 protein
The present invention can also provide a method for screening a candidate compound that modulates the function of a TR430 protein. The screening method that can be provided in the present invention,
(I) contacting a candidate compound with cells expressing the TR430 protein;
(Ii) comparing the NF-κB transcriptional activity inside the cells between a cell expressing the TR430 protein contacted with the candidate compound and a cell expressing the TR430 protein not contacted with the candidate compound;
(Iii) detecting the extent to which NF-κB transcriptional activation is modulated by contacting the candidate compound; and
(Iv) selecting a compound that modulates NF-κB transcriptional activation;
Including. Before performing step (i), cells expressing the TR430 protein may be activated by adding a TR430 agonist in advance. Activation by a TR430 agonist makes it possible to more clearly detect the degree of modulation of TR430 protein function by a candidate compound.
Cells expressing the TR430 protein used in the above step (i) may be cells that originally express the TR430 protein, such as human cultured cell lines such as Y79, peripheral blood B cells, and the above-described tumorigenic cells. Alternatively, the cells may not originally express the TR430 protein, but may have been transformed by introducing the TR430 gene.
The extent to which a candidate compound modulates NF-κB activity is determined by the phosphorylation and degradation of IκB, which directly functions in NF-κB activation, and the amount of nucleoprotein that binds to DNA having an NF-κB binding site. Thus, it can be measured. Alternatively, a reporter whose expression is induced by NF-κB transcription activation is introduced into cells expressing TR430 protein, and the degree of NF-κB activated by the candidate compound that induces the reporter expression can be detected. Similarly, the suppression of NF-κB activation by a candidate compound can be detected as the extent to which reporter expression is suppressed. As a reporter that can be used at present, for example, pNFkB-Luc (Stratagene) capable of detecting NF-κB activation as luciferase activity can be used, but is not limited thereto.
Candidate compounds that modulate signal transduction via the TR430 protein include contacting the intracellular domain of the TR430 protein with TRAK1 in the presence of the candidate compound, or contacting the intracellular domain of the TR430 protein with TRAK1 for further candidates. Selection can be made based on whether to regulate the binding of TRAK1 to the intracellular domain of the TR430 protein by contacting with the compound.
In order to detect the regulation of the protein interaction, an immunoprecipitation method, an ELISA method, a method using a biomolecular interaction such as BIACORE (Amersham Pharmacia) or the like can be used. The protein can be purified from natural expression cells, or expressed and purified as a recombinant protein using Escherichia coli, animal cells or insect cells as hosts. By labeling the protein with a fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP), various enzymes, or an immunological tag by a known method, it is possible to easily detect the protein-protein interaction. Regulation of protein interaction can also be detected using a two-hybrid method (Clontech) using yeast or animal cells as a host.
The TR430 protein and the TRAK1 recombinant protein are simultaneously expressed in animal cells, and the interaction can be detected by immunoprecipitation (FIG. 6). One of the recombinant proteins can be immobilized and the amount of the protein bound thereto can be detected by enzyme immunology. For example, the TR430 protein intracellular domain is expressed and purified as a GST fusion protein and immobilized directly or indirectly using an anti-GST antibody or the like. The FLAG-tagged TRAK1 is added thereto, and the mixture is incubated with the candidate compound. After washing, the amount of TRAK1 binding to the immobilized TR430 protein intracellular domain is detected using an antibody that recognizes the FLAG tag. Even if the molecules to be immobilized are exchanged, the effect on protein interaction can be similarly evaluated, and the method can be carried out by changing the type of tag and the type of fusion protein.
The interaction between TRAK1 and the intracellular domain of the TR430 protein can be detected using the yeast two-hybrid method. For example, a plasmid expressing the TR430 intracellular domain / LexA DNA binding domain fusion protein and a plasmid expressing the TRAK1 / GAL4 transcription activation domain fusion protein are introduced into a reporter strain, and the interaction can be detected as β-galactosidase activity (FIG. 7).
In another aspect of the present invention, a compound obtained by the above-described screening method can be provided. Such a compound can regulate the function of a cell expressing the TR430 protein via the TR430 protein. Here, the function of the cell that expresses the TR430 protein refers to a function associated with an increase or decrease in NF-κB activity inside the cell by stimulating the TR430 protein. More specifically, functions associated with increase or decrease in NF-κB activity include B cell proliferation / differentiation / survival, antibody production, antibody subclass switching, tumor cell growth / survival, and the like. However, it is not limited to these.
Alternatively, the kinase activity of TRAK1 can be detected in the presence of the candidate compound, and a candidate compound that modulates NF-κB activity can be selected based on whether to modulate protein phosphorylation.
To detect kinase activity, [γ³²P /³³The use of [P] ATP enables radioactive detection. TRAK1 can be used as the protein that undergoes phosphate group transfer, or myelin basic protein (MBP, Myelin Basic Protein), PHAS-I (Phosphorylated Heat and Acid Stable Protein Regulated by Insulin, etc.) Proteins can also be used as substrates, but are not limited to these.
In these cases, by quantifying the amount of radioisotope incorporated in the acid-insoluble fraction after the reaction, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by autoradiography, Protein phosphorylation can also be evaluated. Alternatively, high-throughput screening can be performed using a scintillation proximity assay (SPA, Scintillation Proximity Assay, Amersham Pharmacia) or a multi-screen assay system (MultiScreen Assay System, Millipore).
9. Medical applications based on the function of TR430 protein
In one embodiment of the present invention, TR430 protein expressed on the cell surface is stimulated using an antibody that binds to the TR430 protein or a compound obtained by the screening method of the present invention to activate transcription of NF-κB inside the cell. Can be adjusted. In addition, by using the compound obtained by the screening method of the present invention, the function of a protein that mediates a signal generated by stimulating the TR430 protein can be regulated, and the transcriptional activation of NF-κB can be regulated. As a result, the functions expressed by B cells or tumor cells can be regulated by these antibodies or compounds, and they can also be used for the treatment of diseases associated with an increase or decrease in NF-κB activity. .
In the present invention, the term “function expressed by a B cell” refers to, but is not limited to, the proliferation function, antibody production function, survival function, and the like of the B cell itself. In the present invention, the term “function expressed by a tumor cell” refers to, but is not limited to, the proliferation function, survival function, etc. of the cell itself. The term “regulation of cell function” refers to both the above-mentioned concepts of enhancing and suppressing cell function. Therefore, regulating the function of these cells is, for example, specifically, enhancement or suppression of the proliferation function of these B cells or tumor cells, enhancement or suppression of the antibody production function of B cells, survival. Includes enhancement or suppression of functions.
When IκB is released from NF-κB and NF-κB is translocated into the nucleus, mainly genes involved in inflammation and immune response, such as immunoglobulin genes, IL-2 gene, IL-2 receptor α gene, etc. It is known to regulate the expression of various genes (Janin et al., (1995) Curr. Opin. Immunol. 7, 333-342). In addition to this, NF-κB not only controls apoptosis, but also has a body plan (Mercurio et al., (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11, 226-232; Yin et al., (1999) Trend Genet). 15, 229-235).
In mice, it has been shown that excessive stimulation from TNF receptor-like molecules causes autoimmune disease-like symptoms such as lymphadenopathy, plasmacytosis, and systemic lupus erythematosus (SLE) ( Khare et al. (2000) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 97, 3370-3375; Gross et al., (2000) Nature 404, 995-999). These diseases are thought to be due to the fact that the cell death program of a group of cells that should be eliminated by apoptosis is inhibited by a survival signal from a TNF receptor-like molecule. (Laabi and Strasser (2000) Science 289, 883; Romano et al. (2000) Leuk Lymphoma 36, 255; Furman et al (2000) J. Immunol. 164, 168). Romano et al. (1998) Blood 92,990).
As described above, in one embodiment of the present invention, the transcriptional activation of NF-κB inside cells is regulated using an antibody that binds to the TR430 protein or a compound obtained by the screening method of the present invention. As a result, these antibodies or compounds can be used for the treatment of diseases associated with an increase or decrease in NF-κB activity.
When an antibody is used for the purpose of treating a patient, it is preferable to use a human antibody or a humanized antibody because the antibody itself has low immunogenicity. Human antibodies include mice in which the immune system has been replaced by humans (eg, Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody body, Medicine, Medicine, Int. (See 1997). In addition, a humanized antibody can be prepared by genetic recombination using the hypervariable region of a monoclonal antibody (Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991).
As used herein, increasing the NF-κB activity inside the cell means that the signal is formed inside the cell by externally stimulating the TR430 protein, and the activation of the target gene is induced through the phosphorylation of IκB. And the state in which the activity of NF-κB as a transcription factor is increased. It is known that when NF-κB activity is increased in B cells, it exerts functions such as B cell differentiation, antibody subclass switching, and enhancement of viability.
On the other hand, in the present specification, to decrease the NF-κB activity inside the cell means that the activity of NF-κB as a transcription factor is increased to the extent that the target gene is activated without phosphorylation of IκB. Refers to a state in which no activity is observed, or a state in which the activity is lower. For example, it is known that when NF-κB activity is reduced in B cells, phenomena such as apoptosis occur.
Therefore, an antibody capable of specifically binding to the TR430 protein capable of neutralizing NF-κB activation brought about by stimulation of TR430 protein has a property that cells which should be removed by apoptosis should have NF-κB activity inside the cells. It can be used to treat diseases caused by survival to increase. Diseases associated with an increase in intracellular NF-κB activity include, but are not limited to, lymphadenopathy, plasmacytosis, autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, cancer, and the like.
In one aspect of the present invention, a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of an antibody capable of specifically binding to the TR430 protein of the present invention can be provided. Such a pharmaceutical composition can be used to treat a disease associated with increased or decreased NF-κB activity inside cells.
Pharmaceutical compositions containing the above-described antibodies can be administered by any suitable route of administration, including subcutaneous and parenteral administration. It is preferably administered to a subject by parenteral administration. Examples of parenteral administration include intravenous, intraarterial, intramuscular, and intraperitoneal administration. In the present invention, intravenous administration and intraperitoneal administration are preferred. A therapeutically effective amount of antibody per dose administered in a pharmaceutical composition may typically range from about 0.2 to 20 mg / kg of the patient's body weight. However, the dose and the method of administration are determined by a physician in consideration of the use of the pharmaceutical composition containing the antibody, the age of the patient to be treated, the body weight, and the situation including the patient's symptoms and the like. There is no limitation on the dosage and method of administration.
For parenteral administration, the antibodies will generally be formulated in a unit dosage form, for example, in solutions, suspensions, emulsions, and the like, with pharmaceutically acceptable vehicles. Such vehicles are essentially non-toxic. Examples of such vehicles include water, saline, Ringer's solution, dextrose solution, and 5% human serum albumin. Non-aqueous vehicles such as hardened oils and ethyl oleate can also be used. Liposomes can be used as carriers. For example, antibodies are typically formulated in such vehicles at a concentration of about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml.
In another aspect of the present invention, a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a compound obtained by the screening method of the present invention can be provided. Such a pharmaceutical composition can be used to treat a disease associated with increased or decreased NF-κB activity inside cells.
Pharmaceutical compositions containing the compounds described above can be administered by any suitable route, including subcutaneous and parenteral administration. Oral administration includes sublingual administration, intragastric administration, and small intestinal administration. Examples of parenteral administration include intravenous, intraarterial, intramuscular, and intraperitoneal administration. In the present invention, intravenous administration and intraperitoneal administration are preferred. The amount of the compound administered at a time in the pharmaceutical composition is 0.01 to 100 mg, preferably 0.1 to 50 mg, and it is preferable to administer the compound once to three times a day. However, the dosage and method of administration are determined by the physician in view of the type of compound to be administered, the use of the pharmaceutical composition containing the compound, the age and weight of the patient to be treated, the condition including the patient's condition, etc. And are not limited to these.
Example
Examples are provided below. These examples are provided to specifically explain the present invention, but not to limit the technical scope of the present invention.
Example 1: Analysis of gene / protein structure
A cytokine receptor molecule belonging to the TNR receptor superfamily having a signal sequence, a Pfam TNFR / NGFR Cys-rich motif, and a single transmembrane domain was cloned from a cDNA library derived from the Y79 cell line (obtained from Riken Cell Bank). As a result of sequence analysis, two types of transcripts, which are considered to be derived from allele differences, were identified. TR430a (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) encoded by one of these genes was the same molecule as T129 described in WO 99/52924. TR430g (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) has the amino acid sequence of T129 protein, that is, the amino acid sequence of TR430a protein, in which Lys at amino acid residue 187 is substituted with Glu and His residue at position 273 is substituted with Arg. This was a clone encoding the amino acid sequence.
Example 2: Expression analysis by RT-PCR
Tissue expression analysis of the TR430 gene by RT-PCR was performed using Human MTC Panel (Clontech, catalog numbers K1420-1, K1421-1, K1425-1). The primers used for amplification are as follows:

A reaction solution was prepared using LA Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) as a thermostable DNA polymerase according to the manufacturer's instructions. The final concentration of the primer was 400 nM, and the volume of the template cDNA was 0.5 μl per 12.5 μl. The PCR reaction cycle was performed at 94 ° C. for 1 minute, followed by 32 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute. FIG. 1 shows the results of analyzing the PCR products by agarose gel electrophoresis. Gene expression was restricted to peripheral blood leukocytes and spleen, suggesting that the TR430 gene was predominantly expressed in blood cells.
Example 3: Generation of polyclonal antibody against receptor extracellular domain
A receptor extracellular domain protein used as an antigen was prepared by an E. coli expression system as follows. The nucleotide sequence encoding the extracellular domain (amino acids 26-162) of the TR430 protein was amplified by PCR using primers WALT-Nf and WALT-Nr, and cloned into the pGEM-T Easy vector (Promega) once. Confirmation was made. After confirming the sequence, this vector was cut with restriction enzymes EcoRV and SalI, and the obtained restriction enzyme fragment was subcloned into pET-32a (Novagen) to construct an Escherichia coli thioredoxin fusion expression vector pET32a / TRex. The primer sequences used for PCR are as follows:

The expression vector pET32a / TRex was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain for transformation, protein expression was induced at a final concentration of 1 mM IPTG, and the Escherichia coli was cultured at 37 ° C. The expressed protein of interest was present in the insoluble fraction as inclusion bodies. The cells after the induction of expression were centrifuged, and proteins were extracted using B-PER (Pierce), followed by centrifugation, and the precipitated fraction was dissolved in a 6M urea solution. The target expressed protein in the lysate was adsorbed and eluted using a HiTrap Chelating column (Amersham Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions, and the protein was purified. The eluted fraction was dialyzed overnight at room temperature against a slightly more than 100-fold volume of 50 mM Tris-HCl (pH 8), 0.1 M NaCl, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, followed by a slightly more than 100-fold volume of 50 mM Tris-HCl. It was dialyzed against -HCl (pH 8) and 0.1 M NaCl at room temperature overnight. The dialyzed fraction was centrifuged to obtain a soluble fraction. The soluble fraction contained the TR430 protein extracellular domain fusion protein, which was purified until it was detected as a nearly single band by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining after SDS-PAGE.
Rabbits were immunized using the purified TR430 protein extracellular domain fusion protein as an immunogen to prepare rabbit polyclonal antibodies. An antigen protein using Freund's Complete Adjuvant (FCA; Freund's Complete Adjuvant) as an adjuvant was added to Japanese white rabbits (females) in an amount of 0.15 mg only for the first time and then 0.3 mg every two weeks for a total of 5 weeks. The dermis was boosted and immunized to obtain antiserum.
Pre-immune serum and antiserum were subjected to affinity purification for protein A or affinity purification for an antigen protein to purify the antibody. Antibodies were purified using HiTrap Protein A and HiTrap NHS-activated columns (both from Amersham Pharmacia Biotech) according to the manufacturer's instructions.
Example 4: Analysis of receptor protein expression in Y79 cell line and human peripheral blood
The Y79 cells cultured overnight were collected by centrifugation and collected.⁶The cells were suspended in a physiological saline phosphate (PBS) / 2% fetal bovine serum (FBS) to a cell number of / 100 μL. To this cell preparation, 2 μl of either pre-immune serum or post-immune antiserum was added and incubated on ice for 30 minutes. After centrifugation, 0.5 μl of anti-rabbit Cy3 antibody (Amersham Pharmacia Biotech) was added to the suspension resuspended in PBS / 2% FBS, and incubated on ice for 30 minutes. After the cells were washed twice by repeating centrifugation and resuspension, it was analyzed using FACS Calibur (Becton Dickinson) whether or not the antibody bound to the TR430 protein on the cell surface.
In FIG. 2A, the thick line shows the staining results when using antiserum and anti-rabbit Cy3 antibody, the solid line shows the staining results when using pre-immune serum and anti-rabbit Cy3 antibody, and the dotted line shows the staining results when using only anti-rabbit Cy3 antibody. Y79 cells, which are TR430 protein-expressing cells, were stained only weakly in the serum before immunization, while Y79 cells were strongly stained in the antiserum after immunization. This indicates that the obtained antiserum contains an antibody that recognizes the TR430 protein expressed on the cell membrane.
Peripheral blood mononuclear cells were prepared from blood of normal healthy males using a mono / poly separated solution (Dainippon Pharmaceutical). Antiserum or pre-immune serum was added to the cell suspension, left on ice for 30 minutes, and then centrifuged to wash the cells. After the suspension, an anti-rabbit antibody labeled with Rhodamine was added, and the mixture was left on ice for 30 minutes. After centrifugation, the cells were resuspended, FITC-labeled anti-human CD3 or anti-human CD19 antibody (Beckman Coulter) was added, and the mixture was further left on ice for 30 minutes. After centrifugation, the cells were resuspended, and the double staining pattern of the cells was analyzed by FACSCalibur. As shown in FIG. 2B, CD19-positive cells were selectively stained with antiserum, which revealed that TR430 protein was expressed on B lymphocytes. No significant cell staining was observed in the control pre-immune serum.
Example 5: Analysis of TR430 protein expression in cultured cell lines
TR430 protein expression in human hematological tumor cell lines was analyzed using affinity purified rabbit anti-TR430 polyclonal antibody. The results of analysis by flow cytometry are shown in FIG. In the figure, the solid line indicates staining with the anti-TR430 antibody, and the dotted line indicates staining with the control IgG antibody. Staining with anti-TR430 antibody was observed for acute lymphoblastic leukemia cells CCRF-CEM, acute T-cell leukemia cells Jurkat, chronic myeloid leukemia cells K562 and KU812, myeloid leukemia cells U937, and B lymphoblastoid cells U266, Expression of the receptor TR430 protein was shown. No receptor protein expression was detected in promyelocytic leukemia cells HL60.
Example 6: NF-κB activation by receptor stimulation
The ability to activate NF-κB by TR430 stimulation was evaluated using a reporter plasmid pNF-kB-Luc (Stratagene) having a synthetic promoter having multiple NF-κB binding sites upstream of the firefly luciferase gene. Receptor gene expression vectors (pcDNA-TR430a and pcDNA-TR430g) whose expression is controlled by the CMV promoter and pNF-kB-Luc are transiently introduced into human fetal kidney cell line 293 cells, and the NF-κB reporter is overexpressed. The activation ability was examined. PFC-MEKK (Stratagene) was used as a positive control, and an empty expression vector pcDNA3.1 (-) MycHis (Invitrogen) was used as a negative control. 2 × 10⁴The cells were rolled up per well of a 48-well plate, and 200 μl of DMEM / 10% FBS at 37 ° C., 5% CO 2.₂Cultured overnight. After the medium was exchanged, 100 ng of the expression plasmid and 200 ng of the reporter plasmid per well were introduced into the cells using FuGENE-6 (Roche Diagnostics). Luciferase activity after 24 hours of culture was quantified using a luciferase assay system (Promega). As shown in FIG. 4A, overexpression of the TR430a gene and the TR430g gene resulted in about 7 to 10-fold activation of NF-KB as compared to the negative control mock.
The ability of the antiserum to stimulate the receptor against the extracellular domain of the TR430 protein was evaluated by the method described above (FIG. 4B). When TR430 was overexpressed, the ability to activate NF-κB was independent of the concentration of FBS, whereas the addition of rabbit antiserum at a final concentration of 1% further increased the ability to simply overexpress TR430. An approximately 10-fold enhancement of activation was seen. The control serum, which was the serum before immunization, had no enhancing ability. In addition, in the case of the control empty vector mock which does not express the receptor, the activation by the antiserum was not enhanced. FIG. 4C shows activation of NF-κB by receptor stimulation by a polyclonal antibody obtained by subjecting an antigen protein to affinity purification. It was shown that the addition of the purified antibody caused an enhancement of the activation signal.
Example 7: Identification of kinases TRAK1, TRAK2 that bind to TR430-intracellular domain by yeast two-hybrid (Two-Hybrid) screening
Selection of a protein that binds to the intracellular domain of the TR430 protein was performed using MATCHMAKER Two-Hybrid System (Clontech). The nucleotide sequence encoding the intracellular domain (amino acid residues 187-430) of the TR430a protein was cloned into a LexA DNA binding domain plasmid (pBTM118) to construct a decoy protein expression vector. Both the human peripheral blood leukocyte library (Clontech) cloned into pACT2 was introduced into reporter yeast strain L40, and selection for HIS3 gene expression was performed. The selected clone sequences were analyzed, and then the confirmation of the selectivity of the interaction was judged by blue and white by lacZ gene expression. The results are shown in FIG. Two closely related Ste-20-related kinases, SPAK (GenBank accession number AF099989) and OSR1 (GenBank accession number AB017642), were identified as genes that selectively bind to the intracellular domain of TR430. Based on the binding of the identified kinases SPAK and OSR1 to TR430, respectively, the following describes TRAK1 (TR430-AssociatedKinase1) and TRAK2. Clone # 26 in FIG. 6 was the TRAK2 gene including the full-length sequence, and clones # 49 and # 62 were the TRAK1 gene sequences encoding the sequence starting from amino acid 34 and 367 residues, respectively. Although the amino acid sequence homology of TRAK1 and TRAK2 is higher on the N-terminal side including the kinase domain, the binding to TR430 protein was confirmed because the sequence after residue 367 of TRAK1 selectively bound to the intracellular domain of TR430 protein. The domain was presumed to be present on the C-terminal sequence after amino acid 367 residues.
Example 8: TRAK interaction with TR430 protein by immunoprecipitation
The interaction of the TR430 protein intracellular domain binding protein identified by the yeast two-hybrid screen in mammalian cells was confirmed by immunoprecipitation in a transient co-expression system. An expression vector in which an Igκ signal sequence and an HA tag were added to the N-terminus of a mature TR430 (residues 26 to 430) in which a signal sequence was cleaved, and an expression vector in which a FLAG tag was added to the N-terminus of TRAK1 and TRAK2 were used alone. Alternatively, they were simultaneously introduced into 293 cells. 2 × 10 per 35mm dish⁵Was engulfed and cultured overnight. After the medium was replaced, 500 ng of the expression vector per dish was introduced into the cells using FuGENE-6. After culturing for 2 days, the cells are washed once with PBS, and the cell extract (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1.5 mM MgCl₂The protein was solubilized with 1 mM EGTA, 1% CHAPS, 5 μg / ml leupeptin, 1 mM p-ABSF). SDS-PAGE and Western blotting were performed using a part of them, and the expression of the protein derived from the introduced plasmid was confirmed using mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) and rabbit anti-HA antibody (Santa Cruz). The remaining extracted fraction was subjected to immunoprecipitation using anti-FLAG M2 agarose (Sigma), and the co-precipitated TR430 protein was detected with a rabbit anti-HA antibody. As shown in FIG. 5, co-precipitation of TR430 protein depending on the presence of TRAK1 or TRAK2 was confirmed.
Example 9: Identification of TR430 protein intracellular signal cascade
NF-κB activation via TR430 protein stimulation Involvement of TRAF2 and NIK mediating signals in other TNF receptor superfamilies in the intracellular signal cascade was investigated by NF-κB reporter assay in a co-expression system in 293 cells. (FIG. 7). NIK and TRAF2 alone are known to activate NF-κB. An NIK mutant NIK (KK429-430AA) having an amino acid substitution so as to eliminate the kinase activity competitively blocks the activation of endogenous NIK in response to a signal from upstream by overexpression, and is dominant negative. Act in an inhibitory manner on NF-κB activation (Malinin et al. (1997) Nature 385, 540). The N-terminal deleted TRAF2 mutant TRAF2 (225-501) also acts as a dominant negative for TRAF2-mediated activation signals. NIK (KK429-430AA) and TRAF2 (225-501) acted inhibitory on the activation signal from TR430 protein. These results indicate that TRAF2 and NIK are involved in the NF-κB activation pathway downstream of the TR430 protein. FIG. 4 shows that the activation signal of NF-κB mediated by TR430 protein can be blocked by inhibiting downstream factors that form a signal cascade.
Example 10: Activation of TR430 protein by co-expression of APRIL and TR430 protein
In this example, the presence or absence of the effect of TR430 protein activation by APRIL and BLyS was examined by an NF-κB reporter assay in HEK293 cells. APRIL gene (GenBank Accession No. AF046888) and BLyS gene (GenBank Accession No. AF132600) were cloned from human bone marrow cDNA library by PCR. The sequences of the primers used were as follows:

Met.
The obtained gene was incorporated into a pcDNA3.1 vector (Invitrogen), and an expression plasmid was constructed so that gene expression was controlled under the control of the CMV promoter. To construct an expression plasmid, a PCR amplification product is first inserted into a pGEMT Easy vector (Promega), and then a fragment containing the target gene digested with EcoRI is inserted into the EcoRI site of the pcDNA3.1 vector. Was performed by selecting a clone cloned in the forward direction.
100 ng of the TR430 protein expression plasmid, 75 ng of the NF-κB reporter plasmid, 100 ng of the APRIL or BLyS expression plasmid, and 25 ng of the β-galactosidase expression plasmid for the transformation efficiency calibration, were mixed with 50 μl of DMEM and 2 μl of FuGENE. In addition, it was left for 15 minutes. After that, 10 μl of a solution was added to 200 μl of the culture solution per well of the 48-well plate and mixed with the HEK293 cells cultured overnight after the passage, and then the mixture was added at 37 ° C., 5% CO 2.₂Overnight. Luciferase activity after culturing the HEK293 cells was quantified using a luciferase assay system (Promega).
FIG. 8 shows the results. In the transformed cells in which TR430 was not overexpressed, no increase in reporter activity was observed even when BLyS and APRIL were expressed, but about 3 times when TR430 was overexpressed and APRIL was overexpressed simultaneously. Increased reporter activity. Even when BLyS was co-expressed with TR430, no increase in reporter activity was observed.
Example 11: Northern blot analysis of TR430, TACI, BCMA genes in leukemia cell lines
Total RNA was prepared from Jurkat, Raji, U937 cell lines using Trizol (Gibco BRL) according to the manufacturer's instructions. 15 μg of the obtained total RNA per lane was electrophoresed on a formaldehyde-denatured agarose gel, and the sample after electrophoresis was transferred to a nylon membrane (HyBondXL, Amersham Pharmacia Biotech) by the capillary method.
TR430, TACI, BCMA³²P cDNA probes were prepared using RTG DNA labeling beads (-dCTP) (Amersham Pharmacia Biotech). Hybridization probes were prepared using TACI and BCMA as templates, using the nucleotide sequence encoding the entire translation region (GenBank Accession Nos. AF023614 and Z29575, respectively), and TR430 using the nucleotide sequence region encoding the intracellular domain as a template. Specifically, a nucleic acid having a base sequence encoding SEQ ID NO: 2 amino acid sequence numbers 187 to 430 was used as a TR430 probe (SEQ ID NO: 15).
Prehybridization and hybridization are performed using an Express Hyb hybridization solution (Clontech) according to the manufacturer's instructions, and washing after hybridization is performed in a stringent manner according to the method described in the manufacturer's instructions. The test was performed under the conditions, that is, 1 hour at room temperature using 2 × SSC and 0.05% SDS, and 1 hour at 65 ° C. using 0.1 × SSC and 0.1% SDS. Thereafter, radioautography was performed using BAS5000 (Fuji Film).
FIG. 9 shows the results. While expression of the TR430 gene was detected in all three cell lines, expression of the TACI and BCMA genes was found only in Raji. The absence of TACI and BCMA expression in Jurkat and U937 cells is a result consistent with what was previously published by another group (Rennert et al. (2000) J. Exp. Med. 192, 1677).
Example 12: Detection of TR430-APRIL complex
A mature TR430 (residues 26 to 430) having a truncated signal sequence, a TR430 expression plasmid having an Igκ signal sequence and an HA tag added to the N-terminus, and an APRIL or BLyS expression plasmid having a FLAG tag added to the N-terminus Was introduced alone or simultaneously into HEK293 cells.
2 × 10 per 6 well dishes⁵Of HEK cells and cultured overnight using DMEM / 10% FBS. After the medium was exchanged, 500 ng of the expression vector per dish, that is, 500 ng of the TR430 expression plasmid and 500 ng of the APRIL expression plasmid, or 500 ng of the TR430 expression plasmid and 500 ng of the BLyS expression plasmid were introduced into cells using FuGENE-6. . 37 ° C, 5% CO₂After culturing for 2 days under the conditions, the cells were washed once with PBS, and the cell extract (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1.5 mM MgCl 2₂The protein was solubilized with 1 mM EGTA, 1% CHAPS, 5 μg / ml leupeptin, 1 mM p-ABSF). A part of the solubilized protein thus obtained was subjected to SDS-PAGE / Western blotting, and the expression of the protein derived from the introduced plasmid was confirmed with a mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) and a rabbit anti-HA antibody (Santa Cruz). did. The remaining extracted fraction was subjected to immunoprecipitation using anti-FLAG M2 agarose (Sigma), and the presence or absence of co-precipitated TR430 was detected with a rabbit anti-HA antibody.
The results are shown in FIG. The co-precipitation of TR430 depending on the presence of APRIL was confirmed, indicating that TR430 and APRIL form a complex (FIG. 10).
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of human tissue expression analysis of the TR430 gene by RT-PCR.
FIG. 2 shows detection of TR430 protein expressed on cell membranes of Y79 cell line and human peripheral blood lymphocytes by antiserum.
FIG. 3 shows detection of TR430 protein expressed in a human leukemia cell line by an anti-TR430 antibody.
FIG. 4 shows activation of NF-κB by overexpression of TR430 gene (A), enhancement of NF-κB activation signal from receptor by addition of antiserum (B), and polyclonal affinity-purified to antigen protein FIG. 4 shows activation of NF-κB via TR430 receptor by antibody (C).
FIG. 5 shows how TRAK1, TRAK2 and TR430 protein co-expressed in animal cells interact.
FIG. 6 shows clones that selectively bind to the TR430 intracellular domain in a yeast two-hybrid screen.
FIG. 7 shows the effect of molecules that mediate the NF-κB activation signal of TR430.
FIG. 8 shows that APRIL stimulates TR430, resulting in activation of NF-κB, whereas BLyS does not cause activation of NF-κB.
FIG. 9 is a diagram of Northern blot analysis of mRNA expression of TR430 together with TACI and BCMA known as APRIL receptors, using mRNAs derived from Jurkat cells, Raji cells, and U937 cells.
FIG. 10 is a diagram showing the results of immunoprecipitation showing the binding between APRIL and TR430.

Claims (15)

An antibody that specifically binds to the protein of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or an analog thereof. The antibody according to claim 1, which is a polyclonal antibody. 3. The antibody according to claim 2, which is a rabbit antibody. The antibody according to any one of claims 1 to 3, which is capable of binding to a TR430 protein on the surface of a B cell or a neoplastic cell to regulate the function of the B cell or the neoplastic cell. The antibody according to claim 4, which modulates the function of the B cell or the tumorigenic cell by increasing NF-κB activity inside the cell. The antibody according to claim 4, wherein the antibody regulates the function of the B cell or the tumorigenic cell by reducing NF-κB activity inside the cell. (I) applying an antibody that specifically recognizes a TR430 protein to a test cell collected from a test subject and an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen; and
(Ii) detecting cells that are negative for an antibody that specifically recognizes a B cell-specific marker antigen, but are positive for an antigen that specifically recognizes the TR430 protein;
The presence of tumor cells in the test cells. (I) contacting a candidate compound with cells expressing the TR430 protein;
(Ii) comparing the NF-κB transcriptional activity inside the cells between a cell expressing the TR430 protein contacted with the candidate compound and a cell expressing the TR430 protein not contacted with the candidate compound;
(Iii) detecting the extent to which NF-κB transcriptional activation is modulated by contacting the candidate compound; and (iv) selecting a compound that modulates NF-κB transcriptional activation;
A method for screening a test compound that regulates the function of a TR430 protein. The method according to claim 8, wherein the cell expressing the TR430 protein is a B cell, a tumorigenic cell, or a transformed cell into which the TR430 gene has been introduced. The method according to claim 8 or 9, wherein the cell expressing the TR430 protein is a cell that has been contacted with the antibody according to any one of claims 1 to 6. The method according to any one of claims 8 to 10, wherein NF-κB transcription activation is detected by detecting phosphorylation or degradation of I-κB. The method according to any one of claims 8 to 10, wherein NF-κB transcription activation is detected by detecting an amount of a nucleoprotein that binds to a DNA having an NF-κB binding site. A compound obtained by the screening method according to any one of claims 8 to 12 and capable of regulating NF-κB transcription activation inside a cell expressing a TR430 protein. A method for treating a disease associated with increased NF-κB activity inside a cell, comprising the antibody according to any one of claims 1 to 6 or the compound according to claim 13, and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical composition for A method for treating a disease associated with reduced NF-κB activity inside a cell, comprising the antibody according to any one of claims 1 to 6 or the compound according to claim 13, and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical composition for

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