JPWO2002057782A1 - 新規スクリーニング方法 - Google Patents
新規スクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002057782A1 JPWO2002057782A1 JP2002558012A JP2002558012A JPWO2002057782A1 JP WO2002057782 A1 JPWO2002057782 A1 JP WO2002057782A1 JP 2002558012 A JP2002558012 A JP 2002558012A JP 2002558012 A JP2002558012 A JP 2002558012A JP WO2002057782 A1 JPWO2002057782 A1 JP WO2002057782A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cart peptide
- cart
- receptor
- peptide
- anxiety
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/22—Anxiolytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
ＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
Description
技術分野
本発明は、ＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法、不安神経症およびうつ病の治療薬のスクリーニング方法、新規な不安神経症およびうつ病の治療薬、に関する。
背景技術
精神科領域の薬剤は臨床において偶然効力が認められた薬剤およびそれらの薬剤の発展型である薬剤開発が主流である。現在、抗不安薬としてはベンゾジアゼピン（ＢＺ）類および５−ＨＴ１Ａ受容体作用薬が、抗うつ薬としてはＳＳＲＩなどが臨床において使用されている。これらの薬剤の発見および創出により薬剤治療は飛躍的に進歩したが、これらの薬剤は発症原因に基づいて創出されたものではないため、難治性の患者や奏効しない症状が残される結果となった。
ＳＳＲＩはうつ病の他、パニック障害および強迫性障害にも有効であることが報告されている（Ｉｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６，５，１９９２）。さらに、うつ病に対してＢＺ類が有効であるとする見解もあり、実際に臨床において処方される場合が多い。実際、臨床においてうつ病患者の６０〜７０％は不安症を併発しており、不安症の４０〜９０％はうつ病を併発していると言われている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５４，７５，１９９３）。精神疾患の診断基準（ＤＳＭ−ＩＩＩ）で不安神経症がパニック障害と全般性不安症（ＧＡＤ；ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｎｘｉｅｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に分類されたことからも明確なように、最近、精神疾患の概念と治療は大きく変化しつつある。
上述のように、不安神経症（ＧＡＤ、パニック障害）およびうつ病の発症には類似性があると示唆されており、薬剤開発においてもこれまでの概念とは異なるアプローチが求められている。最近の病態生理学の進歩により、不安神経症およびうつ病の発症機序として両者ともストレスが深く関与していることが示唆されている。ストレスにより引き起こされる脳内反応としては、視床下部−下垂体−副腎系の機能異常を代表とする神経内分泌系の機能異常が知られている。このような背景から、最近、視床下部に存在し、神経内分泌系に影響を与える神経ペプチドがうつ・不安の発症原因として注目されている。
このような神経ペプチドとしてコルチコトロピン・リリーシング・ファクター（ＣＲＦ）などが挙げられる。ＣＲＦは視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）系の亢進などストレス反応の中心的役割を果たすことが示され、不安・うつ病との関連も示唆されている。ストレスにより視床下部室傍核におけるＣＲＦ ｍＲＮＡの発現が増加するが、これがＨＰＡ系活性化の原因となると考えられている。視床下部室傍核は下垂体に投射系を有し、ストレスによるＨＰＡ活性に対して重要な役割を果たしている。ストレス負荷により視床下部室傍核においてＣＲＦ以外にも種々ペプチドの発現が変化する。ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）は１９９５年にクローニングされた遺伝子であり（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５，２４７１，１９９５）、そのｍＲＮＡは視床下部に多く分布しており、視床下部の中でも室傍核に高発現していることが報告されている。ＣＡＲＴペプチドに関する研究の現時点での概要は次の通りである。
ＣＡＲＴはコカインあるいはアンフェタミン投与によって側坐核においてその発現が誘導される遺伝子としてＰＣＲ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙによりクローニングされた遺伝子である。１２９個のアミノ酸をコードし、生体内での活性ペプチドは４８個のアミノ酸からなるＣＡＲＴ（５５−１０２）であることが示唆されている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２８，２６３，１９９８）。最近、ＣＡＲＴペプチドの生理機能の一つが解明された。ＣＡＲＴペプチドは脳室内投与により食欲抑制を起こし、逆に、抗ＣＡＲＴペプチド抗体は食欲を亢進した（Ｎａｔｕｒｅ，３９３，７２，１９９８）。さらに、ＣＡＲＴ ｍＲＮＡは肥満モデルの視床下部腹内側核において減少し、レプチン投与により増加した（Ｎａｔｕｒｅ，３９３，７２，１９９８）。以上のことからＣＡＲＴペプチドの食欲調節への関与が示唆されている。しかしながら、ＣＡＲＴペプチドと不安・うつ病との関連は不明であり、さらに、ＣＡＲＴペプチド受容体の同定も未だなされていない。
発明の開示
本発明者らは、不安神経症およびうつ病の新たな作用機序を見出すべく鋭意研究を行った結果、ストレスによりＣＡＲＴ ｍＲＮＡが視床下部において増加すること、ＣＡＲＴペプチドがストレスやうつ・不安惹起に関連する神経核である青斑核神経活動を増加させること、ＣＡＲＴペプチドが実験動物において強力な不安惹起作用を有することを発見した。
この知見にもとづきＣＡＲＴペプチドの作用の阻害が不安神経症およびうつ病の治療に有効ではないかと予想し、ＣＡＲＴペプチド受容体を探索したところ、ある種の動物組織より調製した膜画分が該受容体を含有することを見出した。さらに、該受容体を用いてスクリーニングすることにより得られたアンタゴニストが抗不安作用を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）ＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、
（２）ＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、
（３）以下の工程を含む（１）又は（２）のスクリーニング方法、
（ａ）標識ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を混合し、０〜４２℃でインキュベートする工程、
（ｂ）ＣＡＲＴペプチド受容体と結合する標識ＣＡＲＴペプチドの量を測定する工程、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程を被験物質存在下および非存在下で実施し、両者を比較する工程、
（４）ＣＡＲＴペプチド受容体が、ＣＡＲＴペプチドと時間依存性、受容体数依存性および飽和性を持って結合するものである（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（５）ＣＡＲＴペプチド受容体が、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭとなるＣＡＲＴペプチド受容体である（１）〜（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）ＣＡＲＴペプチド受容体として、動物組織又は細胞から調製した膜画分を用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７）ＣＡＲＴペプチド受容体として、下垂体から調製した膜画分を用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（８）標識ＣＡＲＴペプチドが、酵素又は放射性同位元素で標識されたものである（３）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（９）ＣＡＲＴペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドである（２）〜（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（１０）うつ病又は不安神経症治療薬創製のための（１）〜（９）のいずれかに記載のスクリーニング法、
（１１）ＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物をうつ病又は不安神経症治療薬として選出する（１０）のスクリーニング方法、
（１２）（１０）又は（１１）のスクリーニングにより得られた化合物を含有することを特徴とするうつ病又は不安神経症治療剤、
（１３）うつ病又は不安神経症治療薬の改善に有効な量のＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストを含有するうつ病又は不安神経症治療剤、
（１４）ＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とする、ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体の結合を阻害する化合物のスクリーニング方法、
（１５）［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭであるＣＡＲＴペプチド受容体、
（１６）温血動物にＣＡＲＴペプチドを投与することを特徴とする不安惹起モデル、
（１７）温血動物がマウスである（１６）の不安惹起モデル、
（１８）ＣＡＲＴペプチドを脳室内投与したものである（１６）又は（１７）の不安惹起モデル、
（１９）ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を含有するＣＡＲＴペプチド受容体アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キット、に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）ＣＡＲＴペプチド
本発明において、ＣＡＲＴペプチドとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列で１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列で、ラット下垂体単離細胞においてｃ−ｆｏｓ誘導活性を有するものを意味する。好ましくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである。さらに、うつ病・不安神経症治療薬創製のためのスクリーニングに使用する場合は、配列番号３で表されるペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列で１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を用いることが好ましい（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、４２８、２６３−２６８（１９９８））。配列番号３で表されるペプチドは図１に示すような２次構造を有する。
標識ＣＡＲＴペプチドとは、例えばＣＡＲＴペプチドをフルオレッセンイソチアネート、ビオチン、酵素又は放射性同位元素で標識したものを挙げることができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を挙げることができる。放射性同位元素としては、［３Ｈ］、［１２５Ｉ］等を挙げることができる。ＣＡＲＴペプチドの標識は、それ自体公知の方法により行うことができる。
（２）ＣＡＲＴペプチド受容体
ＣＡＲＴペプチド受容体とは、ＣＡＲＴペプチドと特異的かつ量依存的に結合するものを意味する。また、後述するスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭであるものが好ましい。
ＣＡＲＴペプチド受容体は、動物組織あるいは細胞から調製することが可能である。好ましくは温血動物の組織から調製したＣＡＲＴペプチド受容体である。例えば、ラット下垂体をトリス塩酸緩衝液等の緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離により取得される沈査をトリス塩酸緩衝液に懸濁し、ＣＡＲＴペプチド受容体を含む粗膜標品を得ることができる。
（３）スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とするスクリーニング方法であり、好ましくはＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とするスクリーニング方法であり、さらに好ましくは （ａ）標識ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を混合し、０〜４２℃でインキュベートする工程 （ｂ）ＣＡＲＴペプチド受容体と結合する標識ＣＡＲＴペプチドの量を測定する工程 （ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程を被験物質存在下および非存在下で実施し、両者を比較する工程を含むスクリーニング方法である。
標識ＣＡＲＴペプチドの量の測定は、それ自体公知の方法により測定することができ、例えば、放射性同位元素で標識したものは液体シンチレーションカウンターあるいはγカウンターなどにより放射活性を測定することにより算出することができ、酵素で標識したものは発色基質と反応させた後、比色法により測定することで算出することができる。
被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
スクリーニングは、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合実験においてＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物を選出することが好ましい。
（４）ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニスト
ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストとは、ＣＡＲＴペプチドと受容体との結合を拮抗する作用を有する化合物を意味し、競合的拮抗薬および非競合的拮抗薬を含む。
好ましくは、細胞あるいは脳組織膜を使用した受容体結合実験において濃度依存的な［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合拮抗作用を示し、ＣＡＲＴペプチドによって引き起こされる生理作用（例えばｃ−ｆｏｓ誘導活性）を阻害する化合物である。さらに好ましくは［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合実験においてＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物である。
（５）不安神経症およびうつ病治療薬
本発明に係わる不安神経症およびうつ病治療薬は、通常製剤化されて使用される。本発明に用いるＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストを有効成分として含有する製剤は、通常医薬品の製剤の際に使用される製剤用助剤である担体や賦形剤、その他の添加物と混合され調製される。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、あるいは静注、筋注などの注射剤、坐剤、経皮等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
うつ病・不安神経症治療薬の改善に有効な量は、症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常経口投与の場合には成人一人当たり、１日につき１〜１，０００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇの範囲で、これを１日１回から数回に分けて投与するか、又は非経口投与の場合には成人１人当たり、１日につき１〜５００ｍｇの範囲で、これを１日１回から数回に分け静脈内投与するか、又は、１日１時間〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。勿論、前記したように、投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
（６）不安惹起モデル
本発明の不安惹起モデルは、ＣＡＲＴペプチドを脳室内に投与することにより得られ、これを通常の不安神経症・うつ病治療薬の試験系、例えば、高架式十字迷路に用いることができる。
産業上利用可能性
本発明により新規な作用機序に基づく食欲抑制に有用な化合物、不安神経症およびうつ病治療に有効な化合物のスクリーニング方法、不安惹起動物モデルを提供するとともに、不安神経症およびうつ病の新規な治療剤の提供が可能となった。
実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１［拘束ストレスによる視床下部ＣＡＲＴ ｍＲＮＡ発現の変化］
動物は９週齢のＳＤラット（日本チャールスリバー）を用い、１時間の拘束ストレスを負荷した。ストレス負荷後、ラットを断頭にて屠殺した。脳を素早く取り出した後、視床下部を分離し、直ちに液体窒素により凍結した。視床下部からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
８ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中にて、２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後のゲルを２０×ＳＳＣ［３Ｍ塩化ナトリウム，０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］で洗浄した後、キャピラリー法を用いてナイロンメンブレン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ：デュポン、もしくはＨｙｂｏｎｄ−Ｎ：アマシャムファルマシアなど）にブロッティングした。ブロッティングしたＲＮＡをＵＶ照射でナイロンメンブレン上に固定した。メンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液［０．１％Ｆｉｃｏｌｌ，０．１％ポリビニルピロリドン，０．１％ウシ血清アルブミン］および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中に入れ、５５℃で３時間インキュベートした。上記のプレハイブリダイゼーション緩衝液に５％硫酸デキストランを加えたハイブリダイゼーション緩衝液に、ＤＩＧ ＲＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）でＤＩＧラベルしたＣＡＲＴ ｃＲＮＡプローブを加え、この溶液中にてメンブレンを５５℃で終夜インキュベートした。メンブレンを、室温にて０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液中で５分間の洗浄を二度行った後、６８℃にて０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ緩衝液中で１５分間の洗浄を２度行った。
シグナルの検出は、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット、ＡＰ標識抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（ともにロシュ・ダイアグノスティックス）、およびＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＴＲＯＰＩＸ）を用いて行った。メンブレンを０．１％ＳＤＳ溶液中で１０分間煮沸し、ＣＡＲＴプローブをストリップした。メンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液中に入れ、４２℃で３時間インキュベートした。その後、ＰＣＰ ＤＩＧプローブ合成キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて作製したＧ３ＰＤＨプローブを加えたハイブリダイゼーション緩衝液中にて、４２℃で終夜インキュベートした。メンブレンを、室温にて０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液中で５分間の洗浄を二度行った後、４２℃にて０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ緩衝液中で１５分間の洗浄を２度行った。シグナルの検出はＣＡＲＴの場合と同様に行った。
ＣＡＲＴおよびＧ３ＰＤＨのシグナル強度は、それぞれルミ・イメージャー（ロシュ・ダイアグノスティックス）で計測し、ＣＡＲＴシグナル強度を内部標準であるＧ３ＰＤＨシグナル強度で補正した。
図２中の記号＊＊はダンネット検定により有意差検定を行った時、ｐ＜０．０１で対照群と比較して有意な差があることを示す。
図２に示した結果から明らかな通り、ストレス負荷により視床下部ＣＡＲＴ ｍＲＮＡは有意に増加した。
実施例２［ラット青斑核神経活動に対するＣＡＲＴペプチドの作用］
動物はＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本チャールスリバー）を用い、ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）麻酔下で実験を行った。青斑核（ＬＣ）ノルアドレナリン神経活動の導出は以下の方法で行った。すなわち、脳固定装置（成茂）に動物を固定後、出血に注意しながら頭皮を切開し頭蓋骨を露出させた。ラムダ縫合より（Ａ：−３ｍｍ、Ｌ：１．２ｍｍ、Ｖ：−７．５ｍｍ）の位置に歯科用ドリルで約２ｍｍ四方の穴を開けた。この位置より単一神経の活動電位記録用の微小ガラス電極を挿入した。電極の抵抗は２−８ＭΩとし、２Ｍ ＮａＣｌを充填して用いた。ＬＣ上の静脈洞を避けるためガラス電極は前方に２０°の角度をつけて脳内へ挿入した。青斑核ノルアドレナリン神経活動の同定は活動電位の波形およびｄｏｒｓａｌ ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｂｕｎｄｌｅ（ラムダ縫合よりＡ：＋１．５ｍｍ、Ｌ：０．８ｍｍ、Ｖ：−５．７ｍｍ）の電気刺激による逆行性ｆｉｅｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌを指標として行った。安定した青斑核ノルアドレナリン神経活動を約５分間記録した後、ＣＡＲＴペプチド（３μｇ：配列番号３）を脳室内投与した。投与後約１０−１５分間、神経活動の変化を観察した。対照群として溶媒投与群を設けた。ＣＡＲＴペプチドによる作用は、投与前の神経活動発火頻度に対する投与後の増加率で示した。
図３中の記号＊はダンネット検定により有意差検定を行った時、ｐ＜０．０５で対照群と比較して有意な差があることを示す。
図３に示した結果から明らかな通り、ＣＡＲＴペプチド（３．０μｇ）は青斑核神経活動を有意に増加させた。
実施例３［［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合実験］
ラット下垂体を２０ｍｌ／ｇの割合の０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリドを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４あるいはｐＨ９．０）ホモジナイズした後、４８，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離した。遠心分離により得られた沈査を同緩衝液で再ホモジナイズし、ホモジネートを４８，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離した。この操作を２度繰り返した。沈査を０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリドおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４あるいはｐＨ９．０）に懸濁し、粗膜標品として結合実験に用いた。
粗膜標品（０．５ｍｌ）を［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド（アマシャム：配列番号３）と２５℃でインキュベートした。インキュベート終了後、反応液を受容体結合実験用セルバーベスターを用い、予め０．３％ポリエチレンイミン溶液に２時間浸したＧＦ／Ｂガラス繊維濾紙上に吸引濾過した。濾紙を０．１％ウシ血清アルブミンおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４あるいはｐＨ９．０）３ｍｌで３度洗浄した。濾紙の放射活性をγカウンターにて測定した。１μＭのＣＡＲＴペプチド存在下における結合量を非特異的結合とし、１μＭのＣＡＲＴペプチド非存在下の結合である総結合から非特異的結合を差し引いたものを特異的結合とした。
［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチドのタンパク質（ＣＡＲＴペプチド受容体を含む膜画分のタンパク質）濃度依存的な結合量を、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭを用い、インキュベーション時間は２時間で検討した。その結果、タンパク質濃度約１００μｇ／ｍｌまで、タンパク量依存的な結合を示した（図４）。また、インキュベーション時間依存的な結合量の増加を、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌで検討した。その結果、インキュベーション時間１０分で結合は飽和状態に達した（図５）。また、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度と結合量の増加を、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌで検討した。その結果、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度量依存的な結合を示した（図６）。
［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析には［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．２ｎＭ〜６ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間とした。その結果、高親和性（Ｋｄ＝２．７０ｎＭ）の［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合部位が確認された。結合部位数（Ｂｍａｘ）は、１ｍｇタンパク質あたり、５．８４ｐｍｏｌであった（図７）。
タンパク質濃度依存的な結合量、インキュベーション時間依存的な結合量の増加、スキャッチャード解析の試験により、この［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合試験で得られた高親和性の特異的結合は、ＣＡＲＴペプチドの受容体を標識していることを明らかにした。
化合物の作用の検討の際は、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間とした。被験物質は１００％ＤＭＳＯ溶液に溶解し、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチドと同時に膜標品に添加した。１０−８Ｍ〜１０−５Ｍ濃度での抑制曲線からＩＣ５０値を算出した。
上記結合実験を用いて、化合物のスクリーニングを行った結果、（化１）で表される化合物（以下、ＰＳＡ０９６１）
を見出した。図８に示した結果から明らかな通り、ＰＳＡ０９６１はラット下垂体膜への［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合を濃度依存的に抑制し、そのＩＣ５０値は１．４８μＭであった。
実施例４［マウスにおけるＣＡＲＴペプチド誘発不安惹起作用］
動物は体重２４−３３ｇのＩＣＲ系雄性マウス（日本チャールスリバー）を用いた。試験に用いた高架式十字迷路は、開放路（幅５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）および閉鎖路（幅５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）の十字型迷路よりなり、開放路は０．３ｃｍ、閉鎖路は２０ｃｍの高さの透明のプレキシガラスで覆った。迷路は床より３８．５ｃｍの位置に設置固定した。照度は装置の中央で５０−６０ルクスとした。マウスは十字迷路の中央に頭を開放路に向けて置き測定を開始し、５分間の開放路における滞在時間を測定した。結果を図９に示した。
ＣＡＲＴペプチドは０．０２％ＫＣｌおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水に溶解し、試験の１時間前に０．１μｇ／マウスの割合で脳室内投与した。抗不安薬はＣＡＲＴペプチド脳室内投与３０分前に腹腔内投与した。ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストはＣＡＲＴペプチドと同時に脳室内投与した。
図９中の記号＊＊はダンネット検定により有意差検定を行った時、Ｐ＜０．０１で対照群と比較して有意な差があることを示し、記号＃＃はダンネット検定により有意差検定を行った時、Ｐ＜０．０１でＣＡＲＴペプチド投与群と比較して有意な差があることを示す。
図９（ａ，ｂ）に示した結果から明らかな通り、ＣＡＲＴペプチド投与群は開放路における滞在時間が著しく有意に減少した。しかし、この減少した開放路における滞在時間はジアゼパムあるいはブスピロンを０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇの用量を腹腔内投与することにより有意に、かつ用量依存的に拮抗された。同様に、ＣＡＲＴペプチド投与による開放路における滞在時間の短縮はＰＳＡ０９６１により有意に拮抗された（図９（ｃ））。
従って、ＣＡＲＴペプチドは不安様症状およびストレス反応を引き起こし、ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストとして作用を示す化合物は不安様症状を抑制する作用を有することから、うつ病又は不安神経症治療薬として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＡＲＴペプチドのアミノ酸配列を表す。図２は、ラット視床下部ＣＡＲＴ ｍＲＮＡ発現の拘束ストレスによる影響を示す。図３は、青斑核神経活動に対するＣＡＲＴペプチドの作用を示す。図４は、膜画分のタンパク質濃度と［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド−ＣＡＲＴペプチド受容体の特異的結合量の関係示す。図５は、インキュベーション時間と［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド−ＣＡＲＴペプチド受容体の特異的な結合量の関係を示す。図６は、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度と［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド−ＣＡＲＴペプチド受容体の特異的な結合量の関係を示す。図７は、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析の結果を示す。図８は、ラット下垂体膜への［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合に対するＰＳＡ０９６１の作用を示す。図９は、マウス高架式十字迷路試験におけるＣＡＲＴペプチドの不安惹起作用およびそれに対する抗不安薬、ＰＳＡ０９６１の作用を示す。
本発明は、ＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法、不安神経症およびうつ病の治療薬のスクリーニング方法、新規な不安神経症およびうつ病の治療薬、に関する。
背景技術
精神科領域の薬剤は臨床において偶然効力が認められた薬剤およびそれらの薬剤の発展型である薬剤開発が主流である。現在、抗不安薬としてはベンゾジアゼピン（ＢＺ）類および５−ＨＴ１Ａ受容体作用薬が、抗うつ薬としてはＳＳＲＩなどが臨床において使用されている。これらの薬剤の発見および創出により薬剤治療は飛躍的に進歩したが、これらの薬剤は発症原因に基づいて創出されたものではないため、難治性の患者や奏効しない症状が残される結果となった。
ＳＳＲＩはうつ病の他、パニック障害および強迫性障害にも有効であることが報告されている（Ｉｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６，５，１９９２）。さらに、うつ病に対してＢＺ類が有効であるとする見解もあり、実際に臨床において処方される場合が多い。実際、臨床においてうつ病患者の６０〜７０％は不安症を併発しており、不安症の４０〜９０％はうつ病を併発していると言われている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５４，７５，１９９３）。精神疾患の診断基準（ＤＳＭ−ＩＩＩ）で不安神経症がパニック障害と全般性不安症（ＧＡＤ；ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｎｘｉｅｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）に分類されたことからも明確なように、最近、精神疾患の概念と治療は大きく変化しつつある。
上述のように、不安神経症（ＧＡＤ、パニック障害）およびうつ病の発症には類似性があると示唆されており、薬剤開発においてもこれまでの概念とは異なるアプローチが求められている。最近の病態生理学の進歩により、不安神経症およびうつ病の発症機序として両者ともストレスが深く関与していることが示唆されている。ストレスにより引き起こされる脳内反応としては、視床下部−下垂体−副腎系の機能異常を代表とする神経内分泌系の機能異常が知られている。このような背景から、最近、視床下部に存在し、神経内分泌系に影響を与える神経ペプチドがうつ・不安の発症原因として注目されている。
このような神経ペプチドとしてコルチコトロピン・リリーシング・ファクター（ＣＲＦ）などが挙げられる。ＣＲＦは視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）系の亢進などストレス反応の中心的役割を果たすことが示され、不安・うつ病との関連も示唆されている。ストレスにより視床下部室傍核におけるＣＲＦ ｍＲＮＡの発現が増加するが、これがＨＰＡ系活性化の原因となると考えられている。視床下部室傍核は下垂体に投射系を有し、ストレスによるＨＰＡ活性に対して重要な役割を果たしている。ストレス負荷により視床下部室傍核においてＣＲＦ以外にも種々ペプチドの発現が変化する。ｃｏｃａｉｎｅ−ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＣＡＲＴ）は１９９５年にクローニングされた遺伝子であり（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５，２４７１，１９９５）、そのｍＲＮＡは視床下部に多く分布しており、視床下部の中でも室傍核に高発現していることが報告されている。ＣＡＲＴペプチドに関する研究の現時点での概要は次の通りである。
ＣＡＲＴはコカインあるいはアンフェタミン投与によって側坐核においてその発現が誘導される遺伝子としてＰＣＲ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙによりクローニングされた遺伝子である。１２９個のアミノ酸をコードし、生体内での活性ペプチドは４８個のアミノ酸からなるＣＡＲＴ（５５−１０２）であることが示唆されている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２８，２６３，１９９８）。最近、ＣＡＲＴペプチドの生理機能の一つが解明された。ＣＡＲＴペプチドは脳室内投与により食欲抑制を起こし、逆に、抗ＣＡＲＴペプチド抗体は食欲を亢進した（Ｎａｔｕｒｅ，３９３，７２，１９９８）。さらに、ＣＡＲＴ ｍＲＮＡは肥満モデルの視床下部腹内側核において減少し、レプチン投与により増加した（Ｎａｔｕｒｅ，３９３，７２，１９９８）。以上のことからＣＡＲＴペプチドの食欲調節への関与が示唆されている。しかしながら、ＣＡＲＴペプチドと不安・うつ病との関連は不明であり、さらに、ＣＡＲＴペプチド受容体の同定も未だなされていない。
発明の開示
本発明者らは、不安神経症およびうつ病の新たな作用機序を見出すべく鋭意研究を行った結果、ストレスによりＣＡＲＴ ｍＲＮＡが視床下部において増加すること、ＣＡＲＴペプチドがストレスやうつ・不安惹起に関連する神経核である青斑核神経活動を増加させること、ＣＡＲＴペプチドが実験動物において強力な不安惹起作用を有することを発見した。
この知見にもとづきＣＡＲＴペプチドの作用の阻害が不安神経症およびうつ病の治療に有効ではないかと予想し、ＣＡＲＴペプチド受容体を探索したところ、ある種の動物組織より調製した膜画分が該受容体を含有することを見出した。さらに、該受容体を用いてスクリーニングすることにより得られたアンタゴニストが抗不安作用を有することを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）ＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、
（２）ＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法、
（３）以下の工程を含む（１）又は（２）のスクリーニング方法、
（ａ）標識ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を混合し、０〜４２℃でインキュベートする工程、
（ｂ）ＣＡＲＴペプチド受容体と結合する標識ＣＡＲＴペプチドの量を測定する工程、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程を被験物質存在下および非存在下で実施し、両者を比較する工程、
（４）ＣＡＲＴペプチド受容体が、ＣＡＲＴペプチドと時間依存性、受容体数依存性および飽和性を持って結合するものである（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（５）ＣＡＲＴペプチド受容体が、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭとなるＣＡＲＴペプチド受容体である（１）〜（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（６）ＣＡＲＴペプチド受容体として、動物組織又は細胞から調製した膜画分を用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７）ＣＡＲＴペプチド受容体として、下垂体から調製した膜画分を用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（８）標識ＣＡＲＴペプチドが、酵素又は放射性同位元素で標識されたものである（３）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（９）ＣＡＲＴペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドである（２）〜（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（１０）うつ病又は不安神経症治療薬創製のための（１）〜（９）のいずれかに記載のスクリーニング法、
（１１）ＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物をうつ病又は不安神経症治療薬として選出する（１０）のスクリーニング方法、
（１２）（１０）又は（１１）のスクリーニングにより得られた化合物を含有することを特徴とするうつ病又は不安神経症治療剤、
（１３）うつ病又は不安神経症治療薬の改善に有効な量のＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストを含有するうつ病又は不安神経症治療剤、
（１４）ＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とする、ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体の結合を阻害する化合物のスクリーニング方法、
（１５）［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭであるＣＡＲＴペプチド受容体、
（１６）温血動物にＣＡＲＴペプチドを投与することを特徴とする不安惹起モデル、
（１７）温血動物がマウスである（１６）の不安惹起モデル、
（１８）ＣＡＲＴペプチドを脳室内投与したものである（１６）又は（１７）の不安惹起モデル、
（１９）ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を含有するＣＡＲＴペプチド受容体アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キット、に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）ＣＡＲＴペプチド
本発明において、ＣＡＲＴペプチドとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、又は、配列番号１のアミノ酸配列で１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列で、ラット下垂体単離細胞においてｃ−ｆｏｓ誘導活性を有するものを意味する。好ましくは配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドである。さらに、うつ病・不安神経症治療薬創製のためのスクリーニングに使用する場合は、配列番号３で表されるペプチド又は配列番号３のアミノ酸配列で１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を用いることが好ましい（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、４２８、２６３−２６８（１９９８））。配列番号３で表されるペプチドは図１に示すような２次構造を有する。
標識ＣＡＲＴペプチドとは、例えばＣＡＲＴペプチドをフルオレッセンイソチアネート、ビオチン、酵素又は放射性同位元素で標識したものを挙げることができる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を挙げることができる。放射性同位元素としては、［３Ｈ］、［１２５Ｉ］等を挙げることができる。ＣＡＲＴペプチドの標識は、それ自体公知の方法により行うことができる。
（２）ＣＡＲＴペプチド受容体
ＣＡＲＴペプチド受容体とは、ＣＡＲＴペプチドと特異的かつ量依存的に結合するものを意味する。また、後述するスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭであるものが好ましい。
ＣＡＲＴペプチド受容体は、動物組織あるいは細胞から調製することが可能である。好ましくは温血動物の組織から調製したＣＡＲＴペプチド受容体である。例えば、ラット下垂体をトリス塩酸緩衝液等の緩衝液中でホモジナイズした後、遠心分離により取得される沈査をトリス塩酸緩衝液に懸濁し、ＣＡＲＴペプチド受容体を含む粗膜標品を得ることができる。
（３）スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とするスクリーニング方法であり、好ましくはＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とするスクリーニング方法であり、さらに好ましくは （ａ）標識ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を混合し、０〜４２℃でインキュベートする工程 （ｂ）ＣＡＲＴペプチド受容体と結合する標識ＣＡＲＴペプチドの量を測定する工程 （ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程を被験物質存在下および非存在下で実施し、両者を比較する工程を含むスクリーニング方法である。
標識ＣＡＲＴペプチドの量の測定は、それ自体公知の方法により測定することができ、例えば、放射性同位元素で標識したものは液体シンチレーションカウンターあるいはγカウンターなどにより放射活性を測定することにより算出することができ、酵素で標識したものは発色基質と反応させた後、比色法により測定することで算出することができる。
被験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
スクリーニングは、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合実験においてＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物を選出することが好ましい。
（４）ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニスト
ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストとは、ＣＡＲＴペプチドと受容体との結合を拮抗する作用を有する化合物を意味し、競合的拮抗薬および非競合的拮抗薬を含む。
好ましくは、細胞あるいは脳組織膜を使用した受容体結合実験において濃度依存的な［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合拮抗作用を示し、ＣＡＲＴペプチドによって引き起こされる生理作用（例えばｃ−ｆｏｓ誘導活性）を阻害する化合物である。さらに好ましくは［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合実験においてＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物である。
（５）不安神経症およびうつ病治療薬
本発明に係わる不安神経症およびうつ病治療薬は、通常製剤化されて使用される。本発明に用いるＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストを有効成分として含有する製剤は、通常医薬品の製剤の際に使用される製剤用助剤である担体や賦形剤、その他の添加物と混合され調製される。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、あるいは静注、筋注などの注射剤、坐剤、経皮等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
うつ病・不安神経症治療薬の改善に有効な量は、症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常経口投与の場合には成人一人当たり、１日につき１〜１，０００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇの範囲で、これを１日１回から数回に分けて投与するか、又は非経口投与の場合には成人１人当たり、１日につき１〜５００ｍｇの範囲で、これを１日１回から数回に分け静脈内投与するか、又は、１日１時間〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。勿論、前記したように、投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
（６）不安惹起モデル
本発明の不安惹起モデルは、ＣＡＲＴペプチドを脳室内に投与することにより得られ、これを通常の不安神経症・うつ病治療薬の試験系、例えば、高架式十字迷路に用いることができる。
産業上利用可能性
本発明により新規な作用機序に基づく食欲抑制に有用な化合物、不安神経症およびうつ病治療に有効な化合物のスクリーニング方法、不安惹起動物モデルを提供するとともに、不安神経症およびうつ病の新規な治療剤の提供が可能となった。
実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１［拘束ストレスによる視床下部ＣＡＲＴ ｍＲＮＡ発現の変化］
動物は９週齢のＳＤラット（日本チャールスリバー）を用い、１時間の拘束ストレスを負荷した。ストレス負荷後、ラットを断頭にて屠殺した。脳を素早く取り出した後、視床下部を分離し、直ちに液体窒素により凍結した。視床下部からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。
８ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中にて、２．２Ｍホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後のゲルを２０×ＳＳＣ［３Ｍ塩化ナトリウム，０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］で洗浄した後、キャピラリー法を用いてナイロンメンブレン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ：デュポン、もしくはＨｙｂｏｎｄ−Ｎ：アマシャムファルマシアなど）にブロッティングした。ブロッティングしたＲＮＡをＵＶ照射でナイロンメンブレン上に固定した。メンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液［０．１％Ｆｉｃｏｌｌ，０．１％ポリビニルピロリドン，０．１％ウシ血清アルブミン］および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中に入れ、５５℃で３時間インキュベートした。上記のプレハイブリダイゼーション緩衝液に５％硫酸デキストランを加えたハイブリダイゼーション緩衝液に、ＤＩＧ ＲＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）でＤＩＧラベルしたＣＡＲＴ ｃＲＮＡプローブを加え、この溶液中にてメンブレンを５５℃で終夜インキュベートした。メンブレンを、室温にて０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液中で５分間の洗浄を二度行った後、６８℃にて０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ緩衝液中で１５分間の洗浄を２度行った。
シグナルの検出は、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット、ＡＰ標識抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメント（ともにロシュ・ダイアグノスティックス）、およびＣＤＰ−ｓｔａｒ（ＴＲＯＰＩＸ）を用いて行った。メンブレンを０．１％ＳＤＳ溶液中で１０分間煮沸し、ＣＡＲＴプローブをストリップした。メンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液中に入れ、４２℃で３時間インキュベートした。その後、ＰＣＰ ＤＩＧプローブ合成キット（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて作製したＧ３ＰＤＨプローブを加えたハイブリダイゼーション緩衝液中にて、４２℃で終夜インキュベートした。メンブレンを、室温にて０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液中で５分間の洗浄を二度行った後、４２℃にて０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ緩衝液中で１５分間の洗浄を２度行った。シグナルの検出はＣＡＲＴの場合と同様に行った。
ＣＡＲＴおよびＧ３ＰＤＨのシグナル強度は、それぞれルミ・イメージャー（ロシュ・ダイアグノスティックス）で計測し、ＣＡＲＴシグナル強度を内部標準であるＧ３ＰＤＨシグナル強度で補正した。
図２中の記号＊＊はダンネット検定により有意差検定を行った時、ｐ＜０．０１で対照群と比較して有意な差があることを示す。
図２に示した結果から明らかな通り、ストレス負荷により視床下部ＣＡＲＴ ｍＲＮＡは有意に増加した。
実施例２［ラット青斑核神経活動に対するＣＡＲＴペプチドの作用］
動物はＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本チャールスリバー）を用い、ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）麻酔下で実験を行った。青斑核（ＬＣ）ノルアドレナリン神経活動の導出は以下の方法で行った。すなわち、脳固定装置（成茂）に動物を固定後、出血に注意しながら頭皮を切開し頭蓋骨を露出させた。ラムダ縫合より（Ａ：−３ｍｍ、Ｌ：１．２ｍｍ、Ｖ：−７．５ｍｍ）の位置に歯科用ドリルで約２ｍｍ四方の穴を開けた。この位置より単一神経の活動電位記録用の微小ガラス電極を挿入した。電極の抵抗は２−８ＭΩとし、２Ｍ ＮａＣｌを充填して用いた。ＬＣ上の静脈洞を避けるためガラス電極は前方に２０°の角度をつけて脳内へ挿入した。青斑核ノルアドレナリン神経活動の同定は活動電位の波形およびｄｏｒｓａｌ ｎｏｒａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ｂｕｎｄｌｅ（ラムダ縫合よりＡ：＋１．５ｍｍ、Ｌ：０．８ｍｍ、Ｖ：−５．７ｍｍ）の電気刺激による逆行性ｆｉｅｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌを指標として行った。安定した青斑核ノルアドレナリン神経活動を約５分間記録した後、ＣＡＲＴペプチド（３μｇ：配列番号３）を脳室内投与した。投与後約１０−１５分間、神経活動の変化を観察した。対照群として溶媒投与群を設けた。ＣＡＲＴペプチドによる作用は、投与前の神経活動発火頻度に対する投与後の増加率で示した。
図３中の記号＊はダンネット検定により有意差検定を行った時、ｐ＜０．０５で対照群と比較して有意な差があることを示す。
図３に示した結果から明らかな通り、ＣＡＲＴペプチド（３．０μｇ）は青斑核神経活動を有意に増加させた。
実施例３［［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合実験］
ラット下垂体を２０ｍｌ／ｇの割合の０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリドを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４あるいはｐＨ９．０）ホモジナイズした後、４８，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離した。遠心分離により得られた沈査を同緩衝液で再ホモジナイズし、ホモジネートを４８，０００×ｇで２０分間、４℃にて遠心分離した。この操作を２度繰り返した。沈査を０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリドおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４あるいはｐＨ９．０）に懸濁し、粗膜標品として結合実験に用いた。
粗膜標品（０．５ｍｌ）を［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド（アマシャム：配列番号３）と２５℃でインキュベートした。インキュベート終了後、反応液を受容体結合実験用セルバーベスターを用い、予め０．３％ポリエチレンイミン溶液に２時間浸したＧＦ／Ｂガラス繊維濾紙上に吸引濾過した。濾紙を０．１％ウシ血清アルブミンおよび５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４あるいはｐＨ９．０）３ｍｌで３度洗浄した。濾紙の放射活性をγカウンターにて測定した。１μＭのＣＡＲＴペプチド存在下における結合量を非特異的結合とし、１μＭのＣＡＲＴペプチド非存在下の結合である総結合から非特異的結合を差し引いたものを特異的結合とした。
［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチドのタンパク質（ＣＡＲＴペプチド受容体を含む膜画分のタンパク質）濃度依存的な結合量を、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭを用い、インキュベーション時間は２時間で検討した。その結果、タンパク質濃度約１００μｇ／ｍｌまで、タンパク量依存的な結合を示した（図４）。また、インキュベーション時間依存的な結合量の増加を、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌで検討した。その結果、インキュベーション時間１０分で結合は飽和状態に達した（図５）。また、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度と結合量の増加を、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌで検討した。その結果、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度量依存的な結合を示した（図６）。
［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析には［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．２ｎＭ〜６ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間とした。その結果、高親和性（Ｋｄ＝２．７０ｎＭ）の［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合部位が確認された。結合部位数（Ｂｍａｘ）は、１ｍｇタンパク質あたり、５．８４ｐｍｏｌであった（図７）。
タンパク質濃度依存的な結合量、インキュベーション時間依存的な結合量の増加、スキャッチャード解析の試験により、この［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合試験で得られた高親和性の特異的結合は、ＣＡＲＴペプチドの受容体を標識していることを明らかにした。
化合物の作用の検討の際は、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間とした。被験物質は１００％ＤＭＳＯ溶液に溶解し、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチドと同時に膜標品に添加した。１０−８Ｍ〜１０−５Ｍ濃度での抑制曲線からＩＣ５０値を算出した。
上記結合実験を用いて、化合物のスクリーニングを行った結果、（化１）で表される化合物（以下、ＰＳＡ０９６１）
実施例４［マウスにおけるＣＡＲＴペプチド誘発不安惹起作用］
動物は体重２４−３３ｇのＩＣＲ系雄性マウス（日本チャールスリバー）を用いた。試験に用いた高架式十字迷路は、開放路（幅５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）および閉鎖路（幅５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）の十字型迷路よりなり、開放路は０．３ｃｍ、閉鎖路は２０ｃｍの高さの透明のプレキシガラスで覆った。迷路は床より３８．５ｃｍの位置に設置固定した。照度は装置の中央で５０−６０ルクスとした。マウスは十字迷路の中央に頭を開放路に向けて置き測定を開始し、５分間の開放路における滞在時間を測定した。結果を図９に示した。
ＣＡＲＴペプチドは０．０２％ＫＣｌおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水に溶解し、試験の１時間前に０．１μｇ／マウスの割合で脳室内投与した。抗不安薬はＣＡＲＴペプチド脳室内投与３０分前に腹腔内投与した。ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストはＣＡＲＴペプチドと同時に脳室内投与した。
図９中の記号＊＊はダンネット検定により有意差検定を行った時、Ｐ＜０．０１で対照群と比較して有意な差があることを示し、記号＃＃はダンネット検定により有意差検定を行った時、Ｐ＜０．０１でＣＡＲＴペプチド投与群と比較して有意な差があることを示す。
図９（ａ，ｂ）に示した結果から明らかな通り、ＣＡＲＴペプチド投与群は開放路における滞在時間が著しく有意に減少した。しかし、この減少した開放路における滞在時間はジアゼパムあるいはブスピロンを０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇの用量を腹腔内投与することにより有意に、かつ用量依存的に拮抗された。同様に、ＣＡＲＴペプチド投与による開放路における滞在時間の短縮はＰＳＡ０９６１により有意に拮抗された（図９（ｃ））。
従って、ＣＡＲＴペプチドは不安様症状およびストレス反応を引き起こし、ＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストとして作用を示す化合物は不安様症状を抑制する作用を有することから、うつ病又は不安神経症治療薬として有用である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＣＡＲＴペプチドのアミノ酸配列を表す。図２は、ラット視床下部ＣＡＲＴ ｍＲＮＡ発現の拘束ストレスによる影響を示す。図３は、青斑核神経活動に対するＣＡＲＴペプチドの作用を示す。図４は、膜画分のタンパク質濃度と［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド−ＣＡＲＴペプチド受容体の特異的結合量の関係示す。図５は、インキュベーション時間と［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド−ＣＡＲＴペプチド受容体の特異的な結合量の関係を示す。図６は、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度と［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド−ＣＡＲＴペプチド受容体の特異的な結合量の関係を示す。図７は、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析の結果を示す。図８は、ラット下垂体膜への［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合に対するＰＳＡ０９６１の作用を示す。図９は、マウス高架式十字迷路試験におけるＣＡＲＴペプチドの不安惹起作用およびそれに対する抗不安薬、ＰＳＡ０９６１の作用を示す。
Claims (19)
- ＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
- ＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とするＣＡＲＴペプチド受容体のアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
- スクリーニング方法にあって、
（ａ）標識ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を混合し、０〜４２℃で静置する工程
（ｂ）ＣＡＲＴペプチド受容体と結合する標識ＣＡＲＴペプチドの量を測定する工程
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程を被験物質存在下および非存在下で実施し、両者を比較する工程、を含む請求の範囲第１項又は第２項記載のスクリーニング方法。 - ＣＡＲＴペプチド受容体が、ＣＡＲＴペプチドと時間依存性、受容体数依存性および飽和性を持って結合するものである請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- ＣＡＲＴペプチド受容体が、［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭであるＣＡＲＴペプチド受容体を用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- ＣＡＲＴペプチド受容体として、動物組織又は細胞から調製した膜画分を用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- ＣＡＲＴペプチド受容体として、下垂体から調製した膜画分を用いることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 標識ＣＡＲＴペプチドが、酵素又は放射性同位元素で標識されたものである請求の範囲第３項〜第７項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- ＣＡＲＴペプチドが配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドである請求の範囲第２項〜第８項のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- うつ病又は不安神経症治療薬創製のためのスクリーニング方法であって、請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の方法。
- ＩＣ５０が１０μＭ以下の化合物をうつ病又は不安神経症治療薬として選出する請求の範囲第１０項記載の方法。
- 請求の範囲第１０項又は第１１項記載の方法により得られた化合物を含有することを特徴とするうつ病又は不安神経症治療剤。
- うつ病又は不安神経症治療薬の改善に有効な量のＣＡＲＴペプチド受容体アンタゴニストを含有するうつ病又は不安神経症治療剤。
- ＣＡＲＴペプチドおよび被験物質をＣＡＲＴペプチド受容体と接触させることを特徴とする、ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体の結合を阻害する化合物のスクリーニング方法。
- ［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド結合のスキャッチャード解析（［１２５Ｉ］ＣＡＲＴペプチド濃度０．１ｎＭ〜２０ｎＭを用い、タンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌ、インキュベーション時間は２時間）により、Ｋｄ＝０．１〜１０ｎＭであるＣＡＲＴペプチド受容体。
- 温血動物にＣＡＲＴペプチドを投与することを特徴とする不安惹起モデル。
- 温血動物がマウスである請求の範囲第１６項記載の不安惹起モデル。
- ＣＡＲＴペプチドを脳室内投与したものである請求の範囲第１６項又は第１７項記載の不安惹起モデル。
- ＣＡＲＴペプチドおよびＣＡＲＴペプチド受容体を含有するＣＡＲＴペプチド受容体アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001009904 | 2001-01-18 | ||
| JP2001009904 | 2001-01-18 | ||
| PCT/JP2002/000293 WO2002057782A1 (fr) | 2001-01-18 | 2002-01-17 | Procede de criblage |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2002057782A1 true JPWO2002057782A1 (ja) | 2004-07-29 |
Family
ID=18877316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002558012A Pending JPWO2002057782A1 (ja) | 2001-01-18 | 2002-01-17 | 新規スクリーニング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2002057782A1 (ja) |
| WO (1) | WO2002057782A1 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5630896A (en) * | 1995-05-04 | 1996-11-21 | Amgen, Inc. | Methods of preventing neuron degeneration and promoting neur on regeneration |
-
2002
- 2002-01-17 JP JP2002558012A patent/JPWO2002057782A1/ja active Pending
- 2002-01-17 WO PCT/JP2002/000293 patent/WO2002057782A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002057782A1 (fr) | 2002-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mei et al. | Molecular pharmacology of muscarinic receptor heterogeneity | |
| Dubocovich et al. | Selective MT2 melatonin receptor antagonists block melatonin‐mediated phase advances of circadian rhythms | |
| Cuvillo Bernal et al. | Comparative pharmacology of the H1 antihistamines | |
| EP1885366B1 (en) | Pharmacological chaperones for treating obesity | |
| EP1379269B1 (en) | Adenosine a2a receptor antagonists combined with neurotrophic activity compounds in the treatment of parkinson's disease | |
| Rivkees et al. | Functional D1 and D5 dopamine receptors are expressed in the suprachiasmatic, supraoptic, and paraventricular nuclei of primates | |
| JP2002515003A (ja) | 高親和性メラトニン受容体及びその使用 | |
| JP4447783B2 (ja) | 新規なぺプチド類 | |
| EP1340979A2 (en) | Neuropeptide receptor and uses thereof | |
| Butler et al. | Evaluation of plasma substance P and beta‐endorphin levels in children with Prader‐Willi syndrome | |
| CA2234417A1 (en) | Human serum glucocorticoid regulated kinase, a target for chronic renal disease | |
| US20060251651A1 (en) | Antagonist and agonist which bind to a strong binding site of chemokine receptor | |
| JPWO2002057782A1 (ja) | 新規スクリーニング方法 | |
| US7498300B2 (en) | CRFR1 selective ligands | |
| KR100971270B1 (ko) | 이피에프 수용체 에세이, 화합물 및 치료학적 조성물 | |
| IL106112A (en) | Isolation and characterization of a hormone receptor that releases growth hormone | |
| Tsukamura et al. | Peripheral or central administration of motilin suppresses LH release in female rats: a novel role for motilin | |
| Bhargava et al. | Brain and spinal cord kappa opiate receptors and pharmacological responses to U-50,488 H in rats of differing ages | |
| JP2002501382A (ja) | ＧＡＢＡ−Ａ受容体のヒトθサブユニット | |
| US20030171293A1 (en) | Neuropeptide receptor and uses thereof | |
| Tornese et al. | OPEN ACCESS EDITED BY | |
| Conn et al. | GNRH-RECEPTOR-EFFECTOR-RESPONSE COUPLING IN THE PITUITARY GONADOTROPE: A Ca | |
| WO2024013052A1 (en) | Novel use | |
| JP2001348400A (ja) | コルチコトロピン放出因子−結合タンパク質インヒビターおよびその使用 | |
| McGeer | Neurotransmitters |