JPWO2002052261A1 - マイクロアレイによるハイスループットスクリーニングシステム - Google Patents
マイクロアレイによるハイスループットスクリーニングシステム Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002052261A1 JPWO2002052261A1 JP2002553110A JP2002553110A JPWO2002052261A1 JP WO2002052261 A1 JPWO2002052261 A1 JP WO2002052261A1 JP 2002553110 A JP2002553110 A JP 2002553110A JP 2002553110 A JP2002553110 A JP 2002553110A JP WO2002052261 A1 JPWO2002052261 A1 JP WO2002052261A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cluster
- gene
- disease
- test compound
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002493 microarray Methods 0.000 title abstract description 12
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 title description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 81
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 78
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 61
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 40
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 31
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000054 Coronary Restenosis Diseases 0.000 description 1
- 206010056489 Coronary artery restenosis Diseases 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010046798 Uterine leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 201000004240 prostatic hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、特定の疾患の治療のための候補化合物の判定およびスクリーニングに関する。
背景技術
特定の疾患の治療用化合物の同定のための典型的なハイスループットスクリーニング(HTS)法においては、単純なアッセイが開発されている。例えば、2つのタンパク質間の相互作用が特定の疾患での病態生理学的プロセスのひとつとして同定されると、その相互作用を特異的にブロックする薬剤を同定できるアッセイが構築される。しかしながら、このアッセイは、人工的な遺伝子導入によってコードされたタンパク質間の特殊なイベントを、人工的なレポーターアッセイによって検出するという原理に基づいているため、この方法において単離された化合物が実際に天然状態の細胞において生物学的な効果を有するかどうか不明であるという欠点があった。
また、天然状態の細胞を用いたスクリーニングは通常の実験スケールで行うことは可能であるが、一度に多数の検体、特に多数の遺伝子についてハイスループットで行うには限界があった。
そこで、実際に天然状態の細胞においても効果が期待できる疾患治療のための化合物を効率的に同定しスクリーニングしうる方法の開発が期待されていた。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、天然の細胞内においても生物学的な効果が期待できる疾患治療のための候補化合物を判定およびスクリーニングするための新規な方法を提供することにある。
マイクロアレイは一度のアッセイで何千もの遺伝子の発現を並行して解析することができ、その複数の実験によるデータを基にして、さらなる解析を行うことにより、共制御される遺伝子群をクラスターとして分類、同定することができる。酵母における研究では、このようなクラスターを生じさせる変異は、クラスターの上流のパスウェイに位置する遺伝子に高頻度に起こることが立証されている(Timothy R.et al.,Functional Discovery via a Compendium of Expression Profiles.Cell 2000;102(1):109−126)。本発明者らは、かかる事実に着目し、ある疾患に関連した遺伝子(疾患遺伝子)の下流に位置するクラスターとして同定される遺伝子群(クラスター遺伝子)の発現を指標とすることにより、疾患遺伝子の発現をモニターすることが可能であると考えた。即ち、本発明者らは、クラスター遺伝子の発現を、疾患遺伝子の発現のレポーターとして利用できると考えた。
そこで、次ぎに、本発明者らは、かかる着想を疾患治療の候補化合物のスクリーニングに応用すべく鋭意研究を行った。その結果、疾患遺伝子の発現の天然の指標としてのクラスター遺伝子の発現をマイクロアレイ上で網羅的に検出することによる、疾患治療のための候補化合物を効率的に同定しスクリーニングする方法を開発することに成功した。
本発明の方法においては、まず、特定の疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを固定した基板を作製する。次いで、この基板上のオリゴヌクレオチドに対し、被検化合物処理した疾患に関連する細胞由来のcDNAを接触させ、被検化合物処理した疾患に関連する細胞におけるクラスター遺伝子の発現をモニターする。次いで、処理に用いた被検化合物の中から、クラスター遺伝子の発現を正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復させるような化合物を選択する。これにより、疾患治療の候補化合物を取得することができる。この方法でレポーターとして使用するクラスター遺伝子は、天然状態で細胞内に存在することから、化合物の細胞に対する効果を直接反映する。従って、上記方法によって取得される化合物は、疾患の治療の際に、実際に効果を奏することが大いに期待される。
即ち、本発明は、細胞内においても生物学的な効果が期待できる疾患治療のための候補化合物の新しい判定およびスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔1〕以下の(a)から(d)の工程を含む、被検化合物が特定の疾患を治療するための候補化合物となるか否かを判定する方法、
(a)(i)被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および
(ii)疾患に関連するクラスターを構成する複数のクラスター遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
(b)工程(a)(i)のcDNAと工程(a)(ii)の基板を接触させる工程、
(c)基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を測定する工程、
(d)被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程、
〔2〕以下の(a)から(e)の工程を含む、特定の疾患を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法、
(a)(i)被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および
(ii)疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
(b)工程(a)(i)のcDNAと(ii)の基板を接触させる工程、
(c)基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を測定する工程、
(d)被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程、
(e)被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を、対照細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現レベルに回復させる被検化合物を選択する工程、
〔3〕〔2〕に記載の方法によって単離される、特定の疾患を治療するための候補化合物、を提供するものである。
本発明は、被検化合物が特定の疾患を治療するための候補化合物となるか否かを判定する方法を提供する。
本発明の方法においては、まず、(i)被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および(ii)疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する(工程(a))。
本発明における「疾患細胞」とは、疾病を呈する生物由来の細胞を意味する。好ましくは、患部組織における細胞である。また、疾患を代表する株化された細胞(例えば、疾患が癌であれば、癌細胞株)もまた本発明の「疾患細胞」に含まれる。
疾病を呈する生物としては、特に制限はない。ヒトの疾患の治療薬の候補化合物をスクリーニングする目的であれば、好ましくは哺乳動物(例えば、ラットやマウスなどのヒト疾患のモデル哺乳動物)であり、最も好ましくはヒトである。例えば、治療すべき疾患と、好ましい疾患細胞の例として以下のものを挙げることができる。
癌:癌組織、癌細胞株
増殖性疾患:前立腺肥大、子宮筋腫、子宮内膜症等の疾患由来細胞株、モデル動物細胞もしくは患者細胞
循環器疾患:高血圧、動脈硬化、心筋梗塞、冠動脈再狭窄等の疾患由来細胞株、モデル動物細胞もしくは患者細胞
その他糖尿病、炎症性疾患、免疫疾患、感染症等への適用も考えられる。
本発明において「被検化合物で処理した疾患細胞」とは、被検化合物と直接接触させた疾患細胞、および被検化合物を接種した生物由来の細胞の双方を含む意である。例えば、疾患細胞がヒト疾患のモデル哺乳動物由来である場合には、被検化合物を投与した疾患モデル動物由来の細胞も本発明の「被検化合物で処理した疾患細胞」に含まれる。
疾患細胞の被検化合物での処理は、例えば、単離細胞であれば、Scherfら(U Scherf,D T Ross,M Waltham,L H Smith,J K Lee,L Tanabe,K W Kohn,W C Reinhold,T G Myers,D T Andrews,D A Scudiero,M B Eisen,E A Sausville,Y Pommier,D Botstein,P O Brown & J N Weinstein,A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer.Nat Genet.2000,24.236−244)の文献に記載の方法によって行うことができる。また、生物個体であれば、化合物を経口的または非経口的に投与することにより行うことができる。
本発明のスクリーニングに用いられる被検化合物としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる
疾患細胞からのcDNAの調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。cDNAの調製の好ましい態様においては、まず疾患細胞から全RNAの抽出を行う。全RNAの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全RNA抽出には純度の高い全RNAが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット全て用いることが可能である。例えばAmbion社“RNA later”を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社”Isogen”を用いて全RNAの抽出を行う。基本的にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。即ち細胞をハーベストし、PBSで洗浄後RNA laterに再懸濁後4℃に少なくとも1時間置く。15K、5分間遠心後上清を除きペレットを細分化する。2x106cellsあたり1mlのIsogenを加え完全に混合し、5分間室温放置、その後クロロホルム抽出を2回行う。その後イソプロパノール処理、80%エタノールで洗浄後乾燥させ、RNAseフリーの水に懸濁、溶解する。
次いで、抽出した全RNAを鋳型として、逆転写酵素を用いてcDNAの合成を行い、cDNA試料を調製する。全RNAからのcDNAの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。
調製したcDNA試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法で実施することができる(L Luo et al.,Gene expression profiles of laser−captured adjacent neuronal subtypes.Nat Med.1999,117−122)。
例えばcDNA合成および蛍光標識を次のようにして行うことができる。基本的には逆転写反応時に蛍光標識したdUTPを用いることによって行う。例えば10mgの全RNAに2mlのランダムヘキサマー(2mg/ml)、2mlのオリゴdTプライマー(0.5mg/ml)とRNAase free−H20を全量10μlになるように混合し、70℃で10分間加温する。1分間氷上で冷却後保冷したまま直ちに15mlのlabeling mix、2.5mlのCy dUTP(AP Biotech)、1mlのRNaseOUT(Life Tech)および2.0μlのSuperscript II(Life Tech)reverse transcriptaseを混合し、42℃で2時間反応させる。反応後氷上で冷却し20ml 5x second strand synthesis buffer、50ml水と1ml大腸菌DNAリガーゼを加え、16℃で1時間後直ちに4.5mlの25mM EDTA(pH8)を加え反応を止める。5mlの1.0M NaOHを添加混合し、70℃で10分間加温する。5mlの1.0M HClを加え中和する。
本発明において「クラスター」とは、ある疾患に関連する遺伝子(疾患遺伝子)の作用機序において、下流にある共通のパスウェイに属する遺伝子群を意味する。クラスターを構成する遺伝子の同定は、例えば下記の方法によって行うことができる。各実験で同一の対照サンプルを用いて行った1連のアッセイでは、多くの異なるサンプルの発現プロファイルが比較解析される。一般に2次元クラスタリング法が用いられ、多数サンプルに対する個々の遺伝子の発現プロファイルが順序付けられる(Iyer et al.,1999;Golub et al 1999;Hughes et al 2000)。クラスタリング技術を用いた典型的な出力データを図1に単純化して示した。これらクラスタリングの方法はヒエラルキカル(階層的)であり、結果として最も類似した遺伝子発現プロファイルを持つサンプル同士は1つの軸に整列化され、また最も類似したサンプル発現プロファイルをもつ遺伝子は他方の軸上に整列化されることになる。このように1つの軸上に整列した遺伝子群が、クラスター遺伝子として同定される。
本発明のクラスター遺伝子として抽出される遺伝子数は、該遺伝子がレポーターとして機能するために、複数の遺伝子を抽出することが好ましく、一般にクラスター遺伝子として抽出される遺伝子数が多いほど、レポーターとしての精度が上昇する。強力なレポーターとして機能させるために、クラスターとして抽出するのに要求される最小限の遺伝子数は、それぞれのクラスターごとに実験的、経験的に決定されるが、通常10個以上、好ましくは20個以上、より好ましくは50個以上である。一般的にはクラスター遺伝子として抽出される遺伝子数は10〜20で十分であると想定される。既にガンにおいてはクラスタリングされるいくつかの遺伝子が同定されている(Alizadeh et al.,2000;Perou et al.,2000)。さらにより多くのガンが現在分析されているため、現存するクラスターが再確認されたり、新たなクラスターが同定発見されてくることが予想される。これらのほとんどのクラスターは10以上の遺伝子を含んでおり、本発明における強力なレポーターとして機能することが期待される。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にマイクロアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。マイクロアレイで用いられる命名法はこれまでサザンブロティングのような従来のハイブリダイゼーション技術において用いられてきたものとは若干異なる。マイクロアレイにおいてはスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという(Nature Genetics Volume 21 supplement page 1参照)。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する場合がある。
マイクロアレイ技術の利点は、ハイブリダイゼーションの溶液量が非常に少なく、固定されたヌクレオチドプローブに、細胞の全RNAに由来するcDNAを含む非常に複雑なターゲットをハイブリダイズすることできることである。一般にマイクロアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non−porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用しすることができる。ヌクレオチドの固定(マイクロアレイ)には2つのタイプがあり、一つはAffymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたマイクロアレイであり、もう一つは主としてStanford大学で開発されたcDNAマイクロアレイである。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術(Affymetrix社)、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、クラスター遺伝子と特異的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドであれば特に制限はない。本発明のヌクレオチドプローブには、オリゴヌクレオチド、またはcDNAが含まれる。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、クラスター遺伝子と実質的にハイブリダイズし、クラスター遺伝子以外の遺伝子とは実質的にハイブリダイズしないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、検出するクラスター遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明においてその発現を検出したいクラスター遺伝子に応じて、その種類の数が決定される。例えば、クラスター遺伝子として10個抽出した場合、10個それぞれの遺伝子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチドプローブを基板に固定する。その際、それぞれの遺伝子に対応したヌクレオチドプローブは必ずしも1種類に限定される必要はなく、検出したいクラスター遺伝子の任意の領域と相補性を有する複数種のヌクレオチドプローブの混合物であってもよい。
基板に結合するヌクレオチドプローブの長さは、通常cDNAを固定する場合100〜4000ベースであり、好ましくは200〜4000ベースであり、さらに好ましくは500〜4000ベースである。オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常15〜500ベースであり、好ましくは30〜200ベースであり、さらに好ましくは50〜200ベースである。
本発明の好ましい態様として、複数の疾患に対する治療用候補化合物のスクリーニングを行うことができる。この場合、複数の疾患に関連するそれぞれのクラスターから抽出される複数種のクラスター遺伝子を、それぞれ基板に固定する。
基板へのオリゴヌクレオチドの固定の工程は、一般に「プリント」とも呼ばれる。具体的には、例えば以下ようにプリントすることができるが、これに限定されるものではない。数種のオリゴヌクレオチドプローブを4.5mm x 4.5mmの一つの領域内にプリントする。その際、それぞれのアレイをプリントするのには一つのピンを用いて行うことが可能である。従って48ピンのツールを用いた場合、48回の繰り返したアレイを一つの標準的な顕微鏡用スライドにプリントすることが可能である(図4)。これはとりも直さず48の異なる化合物を一枚のスライド上でアッセイできることを意味している。
本発明においては、次いで、工程(a)(i)のcDNAと工程(a)(ii)の基板を接触させる(工程(b))。
本工程により、クラスター遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な基板上のヌクレオチドプローブに対し、cDNA試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には下記のハイブリダイゼーションの条件を示すことができる。
バッファー:5xSSC,1% SDS,50% ホルムアミド(formamide)
反応温度:42℃
反応時間:12−16時間
洗浄ストリンジェンシー:1xSSC、42℃10分
1つの基板上で独立した複数のアッセイを行うためには、ハイブリダイゼーションの際に、周辺の試料同士が混ざるのを防ぐ必要があるため、物理的バリアを形成することが好ましい。例えば、基板自体または基板の表層物質を物理的に仕切ることによって分割された領域を作製することができる。具体的には、例えば下記の3つの方法を挙げることができる(図3)。一つ目はスライド内に溝を切ることである(図3A)。充分な深さと量があれば過剰量のハイブリダイゼーションバッファーがあっても周辺のエリアを汚染することなくこれらの溝内に排出、保持されコンタミネーションを防ぐことができる。二つ目はそれぞれのアレイを隔離するためのラバーシール、またはプラスチックシールを使用することである(図3B)。最後はアレイの周辺に単一物質、もしくは混合物質をプリントし、ハイブリダイゼーション溶液の浸潤を防ぐバリアを作ることである(図3C)。例えば、グリッダーのソリッドピンをバリアの目的でプリントすることができる。また、疎水性の物質をプリントすることで、アレイ間のバッファーの流出を防ぐことができる。このように基板表面上にバリアを組み立ててプリントすることによって、1つの表層に独立した多数のハイブリダイぜーションが可能となる。
本発明においては、次いで、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を測定する(工程(c))。
本発明においては、cDNA試料中にクラスターを構成する遺伝子由来のcDNAが存在する場合、基板に固定されたヌクレオチドプローブと該cDNAとがハイブリダイズする。従って、ハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、クラスター遺伝子の発現量を測定することができる。ハイブリダイズしたcDNAの検出は、cDNA試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、cDNAが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
本発明においては、次いで、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する(工程(d))。
本発明の好ましい態様においては、疾患細胞および対照細胞のそれぞれの細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を同時に測定する。本発明において「対照細胞」とは、疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、被検化合物処理により、正常な状態へ回復することを判定するのに適した細胞を意味する。対照細胞は、好ましくは正常細胞である。本発明の方法においては、2種類の細胞由来のcDNA試料について、異なる蛍光物質で標識を施すことにより、1回の測定でそれぞれの細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を同時に測定することができる。例えば、上記それぞれのcDNA試料の一方を蛍光物質であるCy5で、他方をCy3で標識することができる。それぞれの蛍光シグナルの相対強度は、疾患細胞および対照細胞それぞれにおけるクラスター遺伝子の発現量に応じた相対量を示す(Duggan et al.,Nat.Genet.21:10−14,1999)。このように測定される発現量が、疾患細胞および正常細胞それぞれにおいて実質的に同等であれば、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量は、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているものと判定される。このとき疾患細胞を処理した化合物は、発現レベルが回復したクラスター遺伝子によって特徴づけられる疾患に対し、治療効果を有することが期待される。
本発明の好ましい態様においては、種々の疾患に対するそれぞれのクラスター遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドプローブが結合した基板を利用して、これら疾患に対する被検化合物の効果の判定を行い、該化合物が効果を奏することが期待される疾患を特定することができる。発現量が正常レベルへ回復したクラスター遺伝子に対し、その機能的に上流に位置する疾患遺伝子は、該化合物の標的となるものと推定される。
さらに本発明は、上記の判定方法を利用した、特定の疾患を治療するための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法においては、上記工程(a)〜(d)に次いで、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を、対照細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現レベルに回復させる被検化合物を選択する(工程(e))。
本発明の方法によれば、特定の疾患を治療するための候補化合物をハイスループットスクリーニングすることが可能である。こうして本発明の方法によりスクリーニングされた化合物は、人工的なレポーターを利用してスクリーニングされた化合物と比較して、天然の細胞内における生物学的な効果が得られる高い期待を有する。このように本発明のスクリーニングにより単離された化合物もまた、本発明に含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1]二次元クラスタリング解析
多数遺伝子の多数癌サンプルにおける二次元クラスタリング解析を行った。図1は、16の異なった遺伝子パネルに対する38の異なった癌サンプルのスクリーニングの仮想結果を示す。全ての癌サンプルは、共通の対照サンプルに対して解析を行った。
図1では2次元クラスタリングによって癌サンプルと遺伝子の両方がグループもしくはクラスターに順序付けられる。16の異なる遺伝子はそれぞれ8個の遺伝子からなる2つのクラスターに分割され、それぞれのクラスターはその中の全てのテストサンプルの中で類似した発現パターンをとっている遺伝子群である。同様に38の癌は19個ずつの2つのクラスターに分割され、それぞれは解析した遺伝子の中で類似した発現パターンをもつ癌サンプルからなる。しばしば同一のクラスターに分類された既知遺伝子の機能を参照比較することにより、他の遺伝子が既知遺伝子と関連した機能をもつことが明らかになる。例えば繊維芽細胞における8613の遺伝子の血清添加に対する発現応答を時間的変化で追った結果では、10個の異なったクラスターに分類されることが明らかになった(Iyer et al 1999)。このようなクラスターは組織再構成、細胞壁維持や特殊な化合物の生合成といったような特定の細胞過程に関与する遺伝子で構成されている。
[実施例2]ハイスループットスクリーニング(HTS)マイクロアレイ
疾患の細胞株を一つの化合物で処理し、クラスターの応答性を指標に用いた。即ちこれらのクラスターの遺伝子発現が正常レベルに回復するような化合物の同定を、HTSマイクロアレイ解析系により行った。このアッセイにおいては無処置の疾患組織を対照としてひとつの化合物で処理した疾患組織との比較を行った。
結果を図2に示す。横列の11の遺伝子はひとつの疾患に対して同定されたひとつのクラスターである。正常組織(右側アレイ)と比較して疾患組織(左側アレイ)において上昇しているクラスターの発現を低下させる様な化合物はさらに詳細な評価を行う対象候補である。この解析法では化合物のターゲットそのものは直接同定できないが、そのターゲットは影響があったクラスターの中、もしくはさらに上流にあるものと推定できる。
産業上の利用の可能性
本発明は、細胞内においても生物学的な効果を有する疾患治療のための候補化合物のハイスループットスクリーニング方法を提供する。本発明の方法においては、治療のための候補化合物のスクリーニングをする際に、細胞中に本来存在する遺伝子の発現を指標とすることから、被検化合物の細胞に対する効果を直接反映しており、本発明の方法によって取得される化合物は、疾患の治療薬として実際に効果を奏することが大いに期待される。また、本発明の方法では、一回の解析により、種々の疾患のための治療用候補化合物のスクリーニングを同時に行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
図1は、多数遺伝子の多数癌サンプルにおける二次元クラスタリング解析を示す写真である。赤色(主にタイプB/クラスター1からなる領域、およびタイプA/クラスター2からなる領域)は全てのサンプルにおいて中央値を越える発現を示した遺伝子を示す。緑色(主にタイプA/クラスター1からなる領域、およびタイプB/クラスター2からなる領域)は中央値以下に発現した遺伝子を示す。色の強度(濃淡)はテスト(癌)対 対照サンプル間においての発現の割合に相関する。
図2は、ハイスループットスクリーニングマイクロアレイの結果を示す写真である。横列の11の遺伝子は一つの疾患に対して同定された一つのクラスターである。主に右パネルの上から4、5、8、10、11、12列目の11の遺伝子は赤色であり、主に左パネル8列目、および右パネル1、2、3列目は緑色である。
図3は、アレイ間でのバリアを作ることが可能な3種の基板の概要を示す図である。Aはそれぞれのアレイ間でのチャンネル、Bは高くしたシール、Cはソリッドピンを用いたその他のバリアまたは疎水性物質のプリントを示す。
図4は、一枚のスライドに48の異なるテストサンプルを解析するための48のエリアに物理的に分けたスライドの図である。それぞれのエリアはシングルピンでプリントする。
Claims (3)
- 以下の(a)から(d)の工程を含む、被検化合物が特定の疾患を治療するための候補化合物となるか否かを判定する方法。
(a)(i)被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および
(ii)疾患に関連するクラスターを構成する複数のクラスター遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
(b)工程(a)(i)のcDNAと工程(a)(ii)の基板を接触させる工程、
(c)基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量を測定する工程、
(d)被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程。 - 以下の(a)から(e)の工程を含む、特定の疾患を治療するための候補化合物をスクリーニングする方法。
(a)(i)被検化合物で処理した疾患細胞由来のcDNA、および
(ii)疾患に関連するクラスターを構成する複数の遺伝子とそれぞれハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する工程、
(b)工程(a)(i)のcDNAと(ii)の基板を接触させる工程、
(c)基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたcDNAを検出することにより、被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を測定する工程、
(d)被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスター遺伝子の発現量が、正常細胞におけるクラスター遺伝子の発現レベルに回復されているか否かを判定する工程、
(e)被検化合物で処理した疾患細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現量を、対照細胞におけるクラスターを構成する遺伝子の発現レベルに回復させる被検化合物を選択する工程。 - 請求項2に記載の方法によって単離される、特定の疾患を治療するための候補化合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2000391709 | 2000-12-22 | ||
JP2000391709 | 2000-12-22 | ||
PCT/JP2001/011288 WO2002052261A1 (fr) | 2000-12-22 | 2001-12-21 | Systeme de criblage a haut rendement par plaques de microtitration |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2002052261A1 true JPWO2002052261A1 (ja) | 2004-04-30 |
JP3786204B2 JP3786204B2 (ja) | 2006-06-14 |
Family
ID=18857809
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002553110A Expired - Fee Related JP3786204B2 (ja) | 2000-12-22 | 2001-12-21 | マイクロアレイによるハイスループットスクリーニングシステム |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040101878A1 (ja) |
EP (1) | EP1353178A4 (ja) |
JP (1) | JP3786204B2 (ja) |
WO (1) | WO2002052261A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2740334C (en) | 2010-05-14 | 2015-12-08 | National Research Council | Order-preserving clustering data analysis system and method |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5744300A (en) * | 1993-03-24 | 1998-04-28 | Geron Corporation | Methods and reagents for the identification and regulation of senescence-related genes |
JP2001514907A (ja) * | 1997-08-15 | 2001-09-18 | アフィメトリックス・インコーポレーテッド | クラスタ解析を利用した多形検出 |
WO2000035473A2 (en) * | 1998-12-18 | 2000-06-22 | Scios Inc. | Methods for detection and use of differentially expressed genes in disease states |
US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
US6177248B1 (en) * | 1999-02-24 | 2001-01-23 | Affymetrix, Inc. | Downstream genes of tumor suppressor WT1 |
CA2300639A1 (en) * | 1999-03-15 | 2000-09-15 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods and apparatus for analyzing gene expression data |
-
2001
- 2001-12-21 EP EP01271864A patent/EP1353178A4/en not_active Ceased
- 2001-12-21 US US10/451,494 patent/US20040101878A1/en not_active Abandoned
- 2001-12-21 WO PCT/JP2001/011288 patent/WO2002052261A1/ja active Application Filing
- 2001-12-21 JP JP2002553110A patent/JP3786204B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20040101878A1 (en) | 2004-05-27 |
EP1353178A1 (en) | 2003-10-15 |
EP1353178A4 (en) | 2004-07-14 |
JP3786204B2 (ja) | 2006-06-14 |
WO2002052261A1 (fr) | 2002-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7897750B2 (en) | Strategies for gene expression analysis | |
CA2356696C (en) | Statistical combining of cell expression profiles | |
US6821724B1 (en) | Methods of genetic analysis using nucleic acid arrays | |
Buck et al. | ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments | |
Clarke et al. | Gene expression microarray analysis in cancer biology, pharmacology, and drug development: progress and potential | |
EP0743989B1 (en) | Methed of identifying differentially expressed genes | |
US20030104410A1 (en) | Human microarray | |
US6448387B1 (en) | Polymeric arrays adapted for high expressing polynucleotides | |
Jordan | Historical background and anticipated developments | |
US20030198983A1 (en) | Methods of genetic analysis of human genes | |
US20060105363A1 (en) | Methods for determining transcriptional activity | |
Katsuma et al. | Genome medicine promised by microarray technology | |
JP3786204B2 (ja) | マイクロアレイによるハイスループットスクリーニングシステム | |
Seidel | Introduction to DNA microarrays | |
WO2000003037A1 (en) | Screening arrays of nucleotides to determine correspondence with both sequence and physical properties of a probe | |
CA2457579A1 (en) | Use of intrinsic reporters of cell signaling for high content drug profiling and toxicity screening | |
Charpe | DNA microarray | |
US20040235008A1 (en) | Methods and compositions for profiling transcriptionally active sites of the genome | |
Paoni et al. | Expression profiling techniques for cardiac molecular phenotyping | |
US20070026408A1 (en) | Materials and methods for analysis of atp-binding cassette transporter gene expression | |
US20030082596A1 (en) | Methods of genetic analysis of probes: test3 | |
WO2007087302A2 (en) | Oligonucleotide matrix and methods of use | |
Compton et al. | Gene Expression Profiling |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050831 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051025 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060308 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100331 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100331 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100331 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110331 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110331 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120331 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120331 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130331 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130331 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130331 Year of fee payment: 7 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |