技術分野
本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ由来の抗原を用いたワクチン並びにその製造方法及びその使用に関する。
背景技術
トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）はヒト及び多くの温血動物に対して感染性を有する寄生虫である。健康人へのトキソプラズマ感染（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）が死に至ることはまれであるが、感染が生涯にわたってつづくとともに、宿主の種々の器官でシスト（嚢胞）の形成がみられる。ヒトにおけるトキソプラズマ感染の症状としては、堕胎、胎児における重度の脳炎及び視覚障害がみられ、特に免疫障害がある人では種々の臨床症状が現れる。エイズ患者での中枢神経系へのトキソプラズマの日和見感染は死に至ることが多い。エイズ感染の拡大や臓器移植等における免疫抑制により、Ｔゴンディ感染の危険性が増大している。一方、家畜へのＴゴンディ感染は堕胎を引き起こすため、重大な経済的損失をもたらす。
これまでは、家畜への感染を防止するためのワクチンの開発に多くの努力が注がれてきており、Ｔゴンディの変種を用いた生ワクチンはいくらかの成果をあげている。しかし、これまでの生ワクチンは、その副作用、シェルフライフ（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）の短さ及び高価であるために、市場に広く受け入れられてはいない。また、生ワクチンは、危険な復帰突然変異（ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、予期できない大量感染及びヒトへの不慮の感染を引き起こす危険がある。
そのため、最近ではこのような危険を避けるために、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）に対するサブユニットワクチンやＤＮＡワクチンの開発に興味が集まっている。Ｔゴンディからは多くの抗原が単離され、それをコードする遺伝子の配列が決定されてクローン化されている。表面抗原の一つであるＳＡＧ１（Ｐ３０）は、表面抗原の中で最も支配的な抗原である。このため、トキソプラズマ・ゴンディに対するサブユニットワクチンの研究は、主として抗原ＳＡＧ１（Ｐ３０）について行われてきた。
しかしながら、抗原Ｐ３０は、トキソプラズマ・ゴンディに対するワクチン用免疫原としては、必ずしも有効なものではなかった。
発明の開示
従って本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ由来のサブユニット抗原タンパク質を用いた、トキソプラズマ・ゴンディに対する新規なワクチンを提供しようとするものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、トキソプラズマ・ゴンディ由来のタンパク質サブユニットの内、ＳＲＳ１，Ｐ２２及びＰ５４が、他のタンパク質サブユニットＰ３０及びＰ４３に比べて非常に高い免疫原性を有することを見出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）由来の抗原ＳＲＳ１，Ｐ２２又はＰ５４を含んで成る、トキソプラズマ・ゴンディに対するワクチンを提供する。
本発明はまた、抗原ＳＲＳ１を含んで成り、該抗原ＳＲＳ１が配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：２に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＳＲＳ１抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、ワクチンを提供する。
本発明はまた、抗原Ｐ２２を含んで成り、該抗原Ｐ２２が配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：４に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＰ２２抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、ワクチンを提供する。
本発明はまた、抗原Ｐ５４を含んで成り、該抗原Ｐ５４が配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは配列番号：６に示すアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有し且つＰ５４抗原が有する免疫原性を維持している蛋白質である、ワクチンを提供する。
本発明はまた、配列番号：１に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、ＳＲＳ１抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成るワクチンを提供する。
本発明はまた、配列番号：３に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされおり、Ｐ２２抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成るワクチン提供する。
本発明はまた、配列番号：５に記載の塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、Ｐ５４抗原と同等の免疫原性を有するタンパク質を含んで成るワクチンを提供する。
本発明はさらに、前記のワクチンの製造方法において、前記抗原タンパク質をコードるＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から前記抗原タンパク質を採取する工程を含んで成る方法を提供する。
本発明はさらに、ヒト以外の哺乳動物をトキソプラズマ・ゴンディに対して免疫する方法であって、前記のワクチンをヒト以外の哺乳類に投与することを特徴とする方法を提供する。
発明の実施の形態
本発明の抗原タンパク質は、遺伝子組換え方法により、これをコードする遺伝子の発現により得るのが便利である。本発明に使用する抗原の遺伝子はイントロンを含まないので、抗原をコードするＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡを用いることができ、例えばトキソプラズマ・ゴンディのゲノムＤＮＡを用い、既知の配列に基いて設計したプライマー対を用いて、上記ゲノムＤＮＡを鋳型として使用してＰＣＲ法などによりクローニングすることができる。また常法に従い、ｃＤＮＡライブラリーを用いて抗原をコードするｃＤＮＡをクローニングすることもできる。クローニングの具体例は実施例１に記載する。
典型的な配列の例として、ＳＲＳ１抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に記載し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：２に記載する。また、Ｐ２２抗原蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に記載し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：４に記載する。さらに、Ｐ５４抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：５に記載し、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号：６に記載する。
従って、典型的な例として、本発明のＳＲＳ１抗原タンパク質は配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、Ｐ２２抗原タンパク質は配列番号：４に示すアミノ酸配列を有し、そしてＰ５４抗原タンパク質は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する。しかしながら、ある生物活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸の欠失、付加、他のアミノ酸による置換等により修飾されても生来の生物活性を維持することがよく知られている。
従って、本発明の抗原タンパク質には、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を維持しているタンパク質も含まれる。このような修飾された抗原タンパク質も含めて、本発明においてはＳＲＳ１抗原タンパク質と称する。
同様に、本発明の抗原タンパク質には、配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、配列番号：４に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を維持しているタンパク質も含まれる。このような修飾された抗原タンパク質も含めて、本発明においてはＰ２２抗原タンパク質と称する。
同様にして、本発明の抗原タンパク質には、配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、配列番号：６に示すアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の免疫原性を維持しているタンパク質も含まれる。このような修飾された抗原タンパク質も含めて、本発明においてはＰ５４抗原タンパク質と称する。
上記の修飾において、修飾されるアミノ酸の数は、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等常用のアミノ酸配列修飾手段により修飾可能な範囲であり、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、例えば１〜数個のアミノ酸の範囲である。
このような修飾された抗原タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号：１，３又は５に示す塩基配列を有するＤＮＡを、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等の常用手段により修飾することにより得られる。さらに、Ｃ−末端が短縮された抗原タンパク質をコードするＤＮＡは、前記の塩基配列の所定の位置に終止コドンを導入することによっても得られる。
ある生物活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされれば、そのＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、上記の生物活性を有するタンパク質をコードしていることがしばしばである。
あるＤＮＡの塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、その塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣまたはこれと同等の塩濃度の溶液等で予備洗浄を行った後に、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを得るためには、洗浄を０．１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
従って本発明の抗原タンパク質には、配列番号：１に示される塩基配列によりコードされる蛋白質のみならず、配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つ配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の免疫原性を有するタンパク質も本発明に含まれ、このようなタンパク質を含めてＳＲＳ１抗原タンパク質と称する。
本発明抗原タンパク質にはまた、配列番号：３に示される塩基配列によりコードされる蛋白質のみならず、配列番号：３に示す塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つ配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の免疫原性を有するタンパク質も本発明に含まれ、このようなタンパク質を含めてＰ２２抗原タンパク質と称する。
本発明抗原タンパク質にはさらに、配列番号：５に示される塩基配列によりコードされる蛋白質のみならず、配列番号：５に示す塩基配列を有するＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、且つ配列番号：６に示すアミノ酸配列を有する蛋白質と同等の免疫原性を有するタンパク質も本発明に含まれ、このようなタンパク質を含めてＰ５４抗原タンパク質と称する。
なお、参考のため、トキソプラズマ・ゴンディのＰ３０抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：７及び８に示し、そしてＰ４３抗原タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：９及び１０に示す。
本発明の抗原タンパク質は、それをコードするＤＮＡを常法に従って発現せしめることにより製造することができる。一旦、所定のタンパク質をコードするＤＮＡがクローニングされれば、それを発現させて所定のタンパク質を製造するのは常用技術に過ぎない。すなわち、本発明の抗原タンパク質は、それをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養し、その培養物から前記抗原タンパク質を採取すればよい。その具体例を実施例１に示す。
実施例
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．抗原タンパク質の製造
トキソプラズマ・ゴンディＲＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、次の表１に示すプライマーを用いて、５種類の抗原タンパク質をコードするＤＮＡを増幅した。
次に、上記のクローニングしたＤＮＡの各々を、大腸菌発現ベクターｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ニューヨーク、米国、から入手）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、このベクターにより大腸菌を形質転換し、この大腸菌を常法に従って培養して、前記抗原タンパク質を、遺伝子１０リーダーペプチドとの融合タンパク質として発現せしめた。培養した大腸菌細胞を遠心分離により集め、超音波処理（Ｕｌｔｒａ Ｓｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＵＰ−１５８，Ｔａｉｔｅｃｈ）により細胞破砕物を調製し、１８，０００×Ｇにおいて遠心分離することにより融合タンパク質を沈澱せしめた。
生成したペレットを洗浄し、リン酸緩衝液に再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により分離し、クマッシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ；ＣＢＢ）により染色した。融合タンパク質の含量を、抗原に対応するＳＤＳ ＰＡＧＥ−ＣＢＢバンドの濃度により決定した。同様にして、前記融合タンパク質の一部分を構成する遺伝子１０ペプチドを調製した。
前記大腸菌からのコード遺伝子のそれぞれをｐＵＣ１９（東洋紡）にサブクローニングし、そしてＰＲＩＳＭ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＥ Ａｐｐｌｒｉｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、日本）を用いて、標準的方法により配列決定した。得られたＤＮＡのコード領域の塩基配列を配列番号：１（ＳＲＳ１）、配列番号：３（Ｐ２２）、配列番号：５（Ｐ５４）、配列番号：７（Ｐ３０）、及び配列番号：９（Ｐ４３）に示し、そしてこれらによりコードされているアミノ酸配列を配列番号：２（ＳＲＳ１）、配列番号：４（Ｐ２２）、配列番号：６（Ｐ５４）、配列番号：８（Ｐ３０）、及び配列番号：１０（Ｐ４３）に示す。
実施例２．免疫感作実験
この実験のため、上記５種類の抗原タンパク質ＳＲＳ１，Ｐ２２，Ｐ５４，Ｐ３０及びＰ４３、並びに比較のために上記５種類の抗原タンパク質を混合したもの（混合抗原と称する）、融合タンパク質の一部分を構成する遺伝子１０ペプチド（Ｇｅｎｅ１０と称する）、及びトキソプラズマ・ゴンディの細胞溶解物（ＴＬと称する）を用いた。この細胞溶解物ＴＬの全タンパク質量は、ＴＬをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）と共に３７℃にて１時間インキュベートした後の５６２ｎｍにおける吸光度により測定した。
実験用Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、Ｃｌｅａ Ｊａｐａｎ（静岡）から購入した。このマウスは８週令で実験に供した。マウスは、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅにより認可された動物実験ガイドラインに従って扱った。
前記すべての抗原は使用前にリン酸緩衝液により１μｇ／μＬの濃度に調製し、０．１ｍｇのタンパク質をマウスの腹腔内に２週間間隔で２回投与した。初回は、フロインド完全アジュバントと共に投与し、２回目はフロインド不完全アジュバントと共に投与した。
前記第２回目の抗原投与から２週間後に、トキソプラズマのチャレンジを行った。すなわち、トキソプラズマ・ゴンディＢｅｖｅｒｌｙ株のブラデイゾイト（ｂｒａｄｙ ｚｏｉｔｅ）の新鮮な細胞３００個を０．５ｍＬのリン酸緩衝液に懸濁し、マウスの腹腔内に接種した。チャレンジ後４ヶ月間、生存及び臨床的所見について観察を行った。この間生存したマウスについては４ヶ月後に殺した後、脳内の組織シストを観察した。無菌リン酸緩衝液を、摘出した脳に加えて３ｍＬとし、ガラスホモジナイザーによりホモジナイズし、氷上に保持した。脳懸濁液の１０μＬのスポット１０個を顕微鏡により観察した。
さらに、全ホモジネートをおよそ３等分し、３匹のＳＰＦマウスの腹腔に注射した。これらのマウスを、臨床所見によるトキソプラズマ感染、ＥＬＩＳＡによる血清分析、及び顕微鏡による脳シストの観察により試験した。
すべてのマウスにおいて、見かけ上の実験的トキソプラズマ感染が認められた。チャレンジの約１週間後、数日間にわたり、マウスの活動が低下し、毛が立った。その後、Ｐ２２，ＳＲＳ１，Ｐ５４又は混合抗原を投与されたマウスの内の幾匹かは前記の症状が消滅し、生存し、他のマウスは死亡した。トキソプラズマの細胞溶解物（ＴＬ）により免疫されたマウスは他の群に比べて症状が穏和であったが、実験期間中に生存率は徐々に低下した。Ｐ２２，ＳＲＳ１，Ｐ５４又は混合抗原を投与された群の累積死亡率は、バックグラウンドに比べて有意に低かった。結果を表２に示す。
チャレンジから４ヵ月後に生存していたマウスの脳における組織シストを測定したところ、Ｐ２２，ＳＲＳ１又はＰ５４抗原を投与されたマウスでは検出されなかったが、トキソプラズマ細胞溶解物（ＴＬ）を投与されたマウスにおいては２０００個以上のシストが観察された。各マウスの結果を次の表３に示す。
シストの形成を他の方法により試験するため、Ｐ２２又はＳＲＳ１を投与され、チャレンジ後４ヵ月後生存したマウスの脳のホモジネートを他のマウスに注射したところ、すべてのマウスにおいて注射後２ヵ月目に有意な臨床所見は見られず、ＥＬＩＳＡにおいて血清陽性応答は生じず、そして脳中に組織シストは存在しなかった。
以上の通り、本発明のトキソプラズマ・ゴンディに対するワクチンは、トキソプラズマ感染から動物を保護し、シストの生成を防止した。
【配列表】
TECHNICAL FIELD The present invention relates to a vaccine using an antigen derived from Toxoplasma gondii, a method for producing the same, and use thereof.
BACKGROUND ART Toxoplasma gondii is a parasite that is infectious for humans and many warm-blooded animals. Toxoplasmosis in healthy people is rarely fatal, but cysts are formed in various organs of the host as the infection continues throughout life. Symptoms of toxoplasma infection in humans include abortion, severe encephalitis in the fetus, and visual impairment, and various clinical symptoms appear particularly in immunocompromised persons. Opportunistic infection of the central nervous system with toxoplasma in AIDS patients is often fatal. The risk of T-Gondi infection is increasing due to the spread of AIDS infection and immunosuppression in organ transplantation and the like. On the other hand, transmission of T. Gondii to livestock causes abortion, resulting in significant economic losses.
To date, much effort has been devoted to the development of vaccines to prevent transmission to livestock, and live vaccines using variants of T. Gondii have achieved some success. However, live vaccines to date have not been widely accepted in the market due to their side effects, short shelf life and high cost. Also, live vaccines carry the risk of causing dangerous reverse mutations, unexpected mass transmission and accidental transmission to humans.
Therefore, in recent years, in order to avoid such dangers, there has been an interest in the development of subunit vaccines and DNA vaccines against T. gondii. Many antigens have been isolated from T. gondii, and the genes encoding them have been sequenced and cloned. SAG1 (P30), one of the surface antigens, is the most dominant antigen among surface antigens. For this reason, studies of subunit vaccines against Toxoplasma gondii have mainly been performed on the antigen SAG1 (P30).
However, the antigen P30 was not always effective as a vaccine immunogen against Toxoplasma gondii.
DISCLOSURE OF THE INVENTION Accordingly, the present invention seeks to provide a novel vaccine against Toxoplasma gondii using a subunit antigen protein derived from Toxoplasma gondii.
The present inventors have conducted various studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, among the protein subunits derived from Toxoplasma gondii, SRS1, P22 and P54 are much higher than the other protein subunits P30 and P43. The present inventors have found that they have immunogenicity and completed the present invention.
Thus, the present invention provides a vaccine against Toxoplasma gondii comprising the antigen SRS1, P22 or P54 from Toxoplasma gondii.
The present invention also comprises the antigen SRS1, wherein the antigen SRS1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the deletion, addition and deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. And / or a protein having an amino acid sequence modified by substitution with another amino acid and maintaining the immunogenicity of the SRS1 antigen.
The present invention also comprises the antigen P22, wherein the antigen P22 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the deletion, addition and deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. And / or a protein having an amino acid sequence modified by substitution with another amino acid and maintaining the immunogenicity of the P22 antigen.
The present invention also comprises the antigen P54, wherein the antigen P54 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, or the deletion, addition and deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. And / or a protein having an amino acid sequence modified by substitution with another amino acid and maintaining the immunogenicity of the P54 antigen.
The present invention also provides a vaccine comprising a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and having an immunogenicity equivalent to that of the SRS1 antigen. I will provide a.
The present invention also provides a vaccine comprising a protein encoded by a DNA that hybridizes to a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and having an immunogenicity equivalent to that of the P22 antigen. I do.
The present invention also relates to a vaccine comprising a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and having an immunogenicity equivalent to that of the P54 antigen. I will provide a.
The present invention further comprises the step of culturing a host transformed with an expression vector containing a DNA encoding the antigen protein, and collecting the antigen protein from the culture, in the method for producing a vaccine. I will provide a.
The present invention further provides a method of immunizing a non-human mammal against Toxoplasma gondii, wherein the vaccine is administered to a non-human mammal.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The antigen protein of the present invention is conveniently obtained by a gene recombination method by expressing a gene encoding the same. Since the antigen gene used in the present invention does not contain introns, genomic DNA can be used as DNA encoding the antigen. For example, a primer pair designed based on a known sequence using genomic DNA of Toxoplasma gondii can be used. And can be cloned by PCR or the like using the above genomic DNA as a template. In addition, cDNA encoding the antigen can be cloned using a cDNA library according to a conventional method. Specific examples of cloning are described in Example 1.
As an example of a typical sequence, the nucleotide sequence of DNA encoding the SRS1 antigen protein is described in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence of the DNA encoding the P22 antigen protein is described in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 4. Further, the nucleotide sequence of the DNA encoding the P54 antigen protein is described in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence encoded thereby is described in SEQ ID NO: 6.
Thus, as a typical example, the SRS1 antigen protein of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the P22 antigen protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the P54 antigen protein has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. : 6. However, it is well known that the amino acid sequence of a protein having a certain biological activity retains its natural biological activity even when modified by deletion, addition, or substitution of another amino acid.
Therefore, the antigenic protein of the present invention includes not only the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 but also the deletion, addition and / or deletion of one or more amino acids from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Also included are proteins that have been modified by substitution with other amino acids and that maintain the same immunogenicity as the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In the present invention, such modified antigen proteins are referred to as SRS1 antigen proteins.
Similarly, the antigenic protein of the present invention includes not only the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 but also deletion, addition and / or deletion of one or more amino acids from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Alternatively, a protein modified by substitution with another amino acid and maintaining the same immunogenicity as the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is also included. In the present invention, such modified antigen proteins are also referred to as P22 antigen proteins.
Similarly, the antigenic protein of the present invention includes not only the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 but also deletion and addition of one or more amino acids to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 And / or proteins modified by substitution with other amino acids and maintaining immunogenicity equivalent to that of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. In the present invention, such a modified antigen protein is also referred to as P54 antigen protein.
In the above modification, the number of amino acids to be modified is in a range that can be modified by a conventional amino acid sequence modifying means such as site-directed mutagenesis, PCR, and the like, and is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, Preferably it is in the range of 1 to 10, for example 1 to several amino acids.
A DNA encoding such a modified antigen protein can be obtained, for example, by modifying a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, or 5 by a conventional means such as a site-directed mutagenesis method or a PCR method. Can be Furthermore, DNA encoding an antigen protein with a shortened C-terminus can also be obtained by introducing a stop codon at a predetermined position in the above nucleotide sequence.
Once a DNA encoding a protein having a biological activity is cloned, a DNA that hybridizes to the DNA under stringent conditions often encodes the protein having the biological activity described above.
A DNA capable of hybridizing with a base sequence of a certain DNA includes a base having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the base sequence. DNA containing a sequence or the like is used. Hybridization can be performed according to a known method, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization under stringent conditions is usually carried out in a hybridization solution of 5 × SSC or a salt concentration equivalent thereto for about 12 hours at a temperature of 37 to 42 ° C. Alternatively, it can be carried out by performing preliminary washing with a solution having a salt concentration equivalent thereto or the like and then washing with 1 × SSC or a salt concentration equivalent thereto. Further, in order to obtain higher stringency, washing can be carried out by washing in 0.1 × SSC or a solution having a salt concentration equivalent thereto.
Therefore, the antigenic protein of the present invention includes not only the protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, but also a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. And a protein having the same immunogenicity as the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is also included in the present invention, and such a protein is referred to as SRS1 antigen protein.
The antigenic protein of the present invention includes not only the protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 but also a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. A protein which is encoded and has the same immunogenicity as the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is also included in the present invention, and such a protein is referred to as P22 antigen protein.
The antigenic protein of the present invention further includes not only a protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 but also a DNA that hybridizes under stringent conditions to a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5. A protein encoded and having the same immunogenicity as the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is also included in the present invention, and such a protein is referred to as P54 antigen protein.
For reference, the nucleotide sequence of the DNA encoding the P30 antigen protein of Toxoplasma gondii and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively, and the nucleotide sequence of the DNA encoding the P43 antigen protein and the corresponding The amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively.
The antigen protein of the present invention can be produced by expressing a DNA encoding it according to a conventional method. Once the DNA encoding a given protein has been cloned, expressing it to produce the given protein is only a routine technique. That is, the antigen protein of the present invention may be obtained by culturing a host transformed with an expression vector containing a DNA encoding the antigen protein according to a conventional method, and collecting the antigen protein from the culture. A specific example is shown in Example 1.
EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Embodiment 1 FIG . Production of antigen proteins DNAs encoding five types of antigen proteins were amplified using the genomic DNA of Toxoplasma gondii RH strain as a template and the primers shown in Table 1 below.
Next, each of the cloned DNAs was inserted into the EcoRI site of an Escherichia coli expression vector pGEM (obtained from Promega, New York, USA), Escherichia coli was transformed with the vector, and the Escherichia coli was cultured in a conventional manner. Thus, the antigen protein was expressed as a fusion protein with the gene 10 leader peptide. The cultured Escherichia coli cells were collected by centrifugation, and cell lysates were prepared by sonication (Ultra Shomogenizer UP-158, Taitech), and the fusion protein was precipitated by centrifugation at 18,000 × G.
The resulting pellet was washed, resuspended in phosphate buffer, separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), and stained with Coomassie brilliant blue (CBB). The content of the fusion protein was determined by the concentration of the SDS PAGE-CBB band corresponding to the antigen. Similarly, a gene 10 peptide constituting a part of the fusion protein was prepared.
Each of the coding genes from the E. coli was subcloned into pUC19 (Toyobo) and sequenced using PRISM Cycle Sequencing Systems (PE Appliris Biosystems, Japan) by standard methods. The nucleotide sequence of the coding region of the obtained DNA is shown in SEQ ID NO: 1 (SRS1), SEQ ID NO: 3 (P22), SEQ ID NO: 5 (P54), SEQ ID NO: 7 (P30), and SEQ ID NO: 9 (P43). ) And the amino acid sequences encoded by them are shown in SEQ ID NO: 2 (SRS1), SEQ ID NO: 4 (P22), SEQ ID NO: 6 (P54), SEQ ID NO: 8 (P30), and SEQ ID NO: 10 (P43).
Embodiment 2 FIG . Immunization experiment For this experiment, the above five antigen proteins SRS1, P22, P54, P30 and P43, and the above five antigen proteins mixed for comparison (referred to as mixed antigen) , A gene 10 peptide constituting part of the fusion protein (referred to as Gene 10), and a cell lysate of Toxoplasma gondii (referred to as TL) were used. The total protein amount of the cell lysate TL was measured by absorbance at 562 nm after incubating the TL with Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce) at 37 ° C. for 1 hour.
Experimental Special Pathogen Free (SPF) female BALB / C mice were purchased from Clear Japan (Shizuoka). The mice were subjected to experiments at the age of 8 weeks. Mice were treated according to the guidelines of animal experiments approved by the Japan Association for Laboratory Animal Science.
All the antigens were adjusted to a concentration of 1 μg / μL with phosphate buffer before use, and 0.1 mg of the protein was intraperitoneally administered to mice twice at two-week intervals. The first was administered with Freund's complete adjuvant and the second with Freund's incomplete adjuvant.
Two weeks after the second antigen administration, a challenge with Toxoplasma was performed. That is, 300 fresh cells of bradyzoite of Toxoplasma gondii Beverly strain were suspended in 0.5 mL of phosphate buffer and inoculated intraperitoneally into mice. Four months after challenge, observations were made for survival and clinical findings. Mice that survived during this period were killed 4 months later, and then tissue cysts in the brain were observed. Sterile phosphate buffer was added to the extracted brain to make 3 mL, homogenized with a glass homogenizer, and kept on ice. Ten 10 μL spots of the brain suspension were observed under a microscope.
In addition, all homogenates were approximately aliquoted and injected intraperitoneally into three SPF mice. The mice were examined by clinical observation of Toxoplasma infection, serum analysis by ELISA, and observation of brain cysts by microscopy.
In all mice, apparent experimental Toxoplasma infection was observed. Approximately one week after the challenge, over a period of several days, the mouse activity decreased and the hair grew. Thereafter, some of the mice receiving P22, SRS1, P54 or the mixed antigen disappeared from the above symptoms, survived, and the other mice died. Mice immunized with Toxoplasma cell lysate (TL) had milder symptoms than the other groups, but the survival rate gradually declined during the experiment. Cumulative mortality in the groups receiving P22, SRS1, P54 or the mixed antigen was significantly lower than the background. Table 2 shows the results.
Tissue cysts in the brains of mice surviving four months after challenge were not detected in mice receiving the P22, SRS1 or P54 antigen, but were detected in mice receiving the Toxoplasma cell lysate (TL). In, more than 2,000 cysts were observed. The results for each mouse are shown in Table 3 below.
To test cyst formation by another method, P22 or SRS1 was administered and the brain homogenate of mice that survived 4 months post-challenge was injected into other mice, and in all mice 2 months after injection No significant clinical findings were found, no seropositive response occurred in the ELISA, and no tissue cysts were present in the brain.
As described above, the vaccine against Toxoplasma gondii of the present invention protected animals from Toxoplasma gondii infection and prevented cyst production.
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