JPS637752B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はシユードモナス・エスピー・No.419
（Pseudomonas sp・No.419）に属し、唯一の炭素
源としてメタノール及びグルコースのみを資化し
得る細菌をメタノールを主たる炭素源とする培地
に培養し、培養液から細菌の菌体を分離すること
を特徴とする細菌菌体の製造方法である。 従来、微生物菌体の製造原料として糖蜜、亜硫
酸パルプ廃液およびｎ―パラフインなどが使用さ
れて来た。しかしながら、これ等の発酵原料には
供給および価格の点で問題がある。 近い将来に予測される食糧問題の解決策とし
て、ケロシン、ナフサ、軽油およびｎ―パラフイ
ン等の炭化水素を微生物に利用させる発酵法も検
討されているが、これ等の原料は発癌性物質など
を含むとされ、また発酵廃液の処理法等未だ多く
の実用面での問題をかゝえている。本発明者らは
化学工業により純粋に大量に得られ、しかも水溶
性が大であることなどから好適な発酵原料とし
て、メタノールを強力に資化する細菌を検索した
結果、従来の報告に見られない新しい細菌を見い
出し、本発明を完成した。 本発明で使用するシユードモナス属に属する新
菌種シユードモナス・エスピー・No.419
（Pseudomonas sp・No.419）は昭和52年12月４日
付けで工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第4051号として受託されている。その菌学的
性質は下記の通りである。 １ 形態的性質 １％メタノール添加無機塩培地に30℃２日間
培養した。 細胞は桿状、大きさ0.4〜0.7×１〜３ミクロ
ン、普通細胞は単独又は２連、極単鞭毛で運動
する、グラム染色陰性、胞子を形成せず、抗酸
性染色は陰性である。 ２ 各種培地に於ける培養的性質 （特にことわらないかぎり30℃で３日間培養
した） 肉汁寒天培養：生育せず。 メタノール含有無機塩平板培養：生育良
好。 コロニー：円形、凸円状、全縁、表面平
滑、光沢あり、黄白色〜黄色、半透明、
僅かに粘性。 メタノール含有無機塩斜面培養：生育良
好。線状生育、表面平滑、光沢あり、辺縁な
めらか。黄白色〜黄色、半透明、僅かに粘
性、培地に水溶性色素の生成はない。 メタノール含有肉汁寒天斜面培養：生育良
好培養的性質はメタノール含有無機遠培地の
場合とほぼ同様。 肉汁液体培養：生育せず。 メタノール含有無機塩液体培養：生育良
好。一様に混濁し、リングを形成する。（長
期培養により、この菌種は菌株によつて薄い
被膜を形成する場合もある。） メタノール含有ゼラチン高層穿刺培養：表
面に生育する。 培地を液化しない。 リトマスミルク培養：変化せず。（生育な
し） ３ 生理的性質 硝酸塩の還元：還元する。（常法の培地に
１％程度のメタノールを添加した変法によつ
た。） 脱窒反応：なし。 MRテスト：陰性。 VPテスト：陰性。 インドールの生成：陰性。 硫化水素の生成：陰性。 デンプンの加水分解：陰性。 クエン酸塩の利用性：陰性。 無機窒素源の利用性：硝酸塩及びアンモニ
ウム塩を利用する。 色素の生成：水溶性色素は生成せず。（メ
タノール含有無機塩寒天培地に培養せる場合
菌体は黄色に色づく事は前記の如し。） ウレアーゼ：陽性。 オキシダーゼ：陽性。 カタラーゼ：陽性。 生育の範囲：PH５〜９の範囲で生育する。
PH６〜８が好ましい。温度10゜〜35℃で生育
する。27゜〜33℃が好ましい。 酸素に対する態度：好気性 溶血性：陰性。 ペニシリン感受性（2.5IU／ml）：陰性。 オキシテトラサイクリン感受性（10γ／
ml）：陰性。 食塩耐性：1.5％の食塩含有培地に生育す
るが、２％以上では生育出来ない。 糖類の発酵性（Hugh and Leifson法によ
る）

【表】 各糖類よりガスの発生は総て陰性であつた。 炭素源の資化性： グルコース及びメタノールを良好に資化生育
する。ホルムアルデヒドの資化性は試験方法に
依り、また菌株によつて資化性は異なるが、No.
419菌株は僅かに資化する時もある。次に列記
する多くの各種炭素源を試験したが資化するも
のは見られなかつた。 糖類：Ｌ―アラビノース、Ｄ―キシローズ、Ｄ―
マンノーズ、Ｄ―ガラクトース、Ｄ―フラクト
ース、マルトース、シヨ糖、乳糖、トレハロー
ス、及びデンプン。 アルコール類：エタノール、ｎ―プロパノール、
ｎ―ブタノール、イノシトール、Ｄ―ソルビト
ール、Ｄ―マンニトール。 有機酸類：ギ酸、醋酸、ピルビン酸、コハク酸、
クエン酸、乳酸、マロン酸、プロピオン酸、フ
マール酸、リンゴ酸、安息香酸、2.5―ジヒド
ロキシ安息香酸、ｐ―ヒドロキシ安息香酸、ｍ
―ヒドロキシ安息香酸、ｐ―アミノ安息香酸、
アニス酸、アントラニル酸。 アミノ酸：DL―グリシン、Ｌ―アラニン、Ｌ―
ロイシン、DL―イソロイシン、Ｌ―アルギニ
ン、Ｌ―リジン、DL―メチオニン、DL―アス
パラギン酸、Ｌ―グルタミン酸、Ｌ―アスパラ
ギン、グルタミン、トリプトフアン。 アミン類：モノメチルアミン、ジメチルアミン、
トリメチルアミン、モノエチルアミン。 アミド類：ホルムアミド、アセトアミド。 炭化水素類：メタン、エタン、プロパン、ブタ
ン。 分離源：土壌及び汚水 ※１ １％メタノール添加無機塩培地の組成：硫
安２ｇ、燐酸１カリ1.5ｇ、燐酸２カリ２ｇ、
硫酸マグネシウム0.3ｇ、僅量無機塩類溶液
（硫酸マグネシウム６ｇ、塩化カルシウム0.015
ｇ、硫酸亜鉛0.14ｇ、硫酸第一鉄0.028ｇ、硫
酸銅0.025ｇ、モリブデン酸ソーダ0.024ｇ、塩
化コバルト0.024ｇ、硫酸マンガン0.084、を
100mlの蒸溜水に溶解したもの）１mlを490mlの
水道水に溶解し第１液とする。別に寒天15ｇ〜
20ｇを500mlの水道水に溶解して第２液とし、
別々に１Kg／cm²の加圧下に10分間殺菌して40〜
50℃に冷却後、無菌的に両液を合併し更に無菌
的にメタノール10mlを添加する。 ※２ 炭素源の資化性試験は前記１％メタノール
添加無機塩培地の組成の内、メタノールを除き
水道水に替えて蒸溜水を用い、寒天を含む組成
のものを基礎培地とし、これに前記の炭素源の
内、糖類及びアミノ酸類では0.5％（Ｗ／Ｖ）
量、有機酸類は0.1％（Ｗ／Ｖ）量、メチルア
ミン類0.5％〜0.2％量、アミド類0.1％量を少量
の蒸溜水に溶解後、無菌過してそれぞれ相当
量を別に殺菌後40〜50℃に冷却した基礎培地に
無菌的に添加し、処定量とした後寒天平板培地
として使用した。尚、アセトアルデハイド、ア
セトン、ベンゼン、フエノール、有機酸の内、
蟻酸、プロピオン酸等は更に0.01％量の添加に
ついても試験した。尚、有機酸類は苛性ソーダ
にて中和後、無菌処理して使用した。炭化水素
類は空気と同量に混合した気体中に培養し試験
した。種菌はメタノール添加無機塩培地に１日
前培養した菌体を無菌水に懸濁し、接種した。
培養は30℃にて10日間以上培養して、生育の有
無によつて判定した。更に判定困難のものにつ
いては同一組成の液体培地で確めた。硝酸塩還
元性、デンプン及びゼラチンの加水分解等の生
理的性質の一部の試験の内、そのまゝでは生育
不能の培地を用いる場合には１％程度メタノー
ルを添加して菌を生育せしめて試験した。 今までに多くのメタノール資化性細菌が分離さ
れ、報されて来ている。バージイズ・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
ー第８版1974年によれば、これ等の菌学的性質を
有する細菌を属せしめるべき適当な属は見当らな
い。しかし唯一の炭素源としてC₁化合物の内で
はメタノールを利用する以外に糖類の内グルコー
スを利用して生育出来る故、その形能的特徴及び
炭素源資化性以外の生理的諸性質を考え合わせれ
ばシユードモナス（Pseudomonus）属に属せし
めるのが最も妥当と考えられる。メタノール資化
細菌の内C₁化合物のみ資化する細菌はメチロモ
ナス（Methylomonas）属に属せしめた方が適当
であろうと発明者等はすでに報告して来たが〔ジ
ヤーナル・オブ・ゼネラル・アプライド・ミクロ
ビオロジー19巻11頁1973年、また国際C₁化合物
利用微生物会議（東京）1974年、及びミクロビア
ル・グロウス・オン・シーワン・コンパウンド
（Microbial Growth on C₁―Compounds）11頁
1975年〕本発明の細菌はC₁化合物のみならず、
C₆化合物のグルコースも利用し同じ程度の生育
を示す事もあつて、メチロモナス属細菌とは区別
されるべきである。 メタノール資化性細菌については現在までに多
くの学術報告並びに特許出願がなされており、関
係学術誌及び特許公告公報並びに特許公開公報に
多くの新菌種が報告されているが、本発明の細菌
と同一の性質を有するものは見当らない。従つて
本細菌はシユードモナス属の新菌種と考えられシ
ユードモナス・エスピー・No.419（Pseudomonas
sp・No.419）と命名した。 本発明の培養に使用する培地は、メタノールを
主たる炭素源として含有している事が必要であ
り、更に窒素源、無機物、ビタミンその他生長促
進物質などの適量を含有する培地ならば、合成培
地または天然培地のいずれでもよい。 主原料のメタノールは細胞毒性があり、培地中
の濃度は６％以下に保つ事が必要である。菌の生
育および増殖の良好なのは２％以下である事が好
ましい。 本細菌はグルコースも資化し生育するのでメタ
ノールとグルコースとを混合して使用する事も可
能である。 窒素源としてはたとえば硝酸塩、アンモニウム
塩などの無機窒素化合物また尿素、コーン・ステ
イープ・リカー、カゼイン加水分解物、ペプト
ン、アミノ酸液などの有機窒素含有物が用いられ
る。更にアンモニヤを菌の生育を阻害しない程度
に生育に応じて少量づつフイードする方法も可能
である。 無機塩の内、培地成分として最も重要なものは
燐酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、鉄塩等で
あり、必要に応じてマンガン塩、亜鉛塩、カルシ
ウム塩、銅塩等を僅量添加する。この他ビタミン
類およびアミノ酸類が菌株によつては生育必須ま
たは生育促進物質として添加する場合もある。 培養温度は普通20〜35℃で良いが、増殖の最適
なのは27〜32℃であつて、PHは６〜８の範囲で好
気的に培養される。培養方式は回分培養または連
続培養のいずれでもよい。 メタノールを初めから高濃度に与える事なく、
初め少量添加し、消費に応じて追加補充する事は
その毒性から見ても好ましい方法である。また窒
素源としてアンモニウム塩を利用する場合は培養
期間中にアンモニアが消費され、培養液のPHがが
低下する。この場合、培養液のPHを菌株の生育好
条件に保つため、苛性カリ、苛性ソーダ等のアル
カリまたはアンモニヤ等で中和する。 このようにして細菌を培養したのち、菌体を培
養液から分離する。分離法は、遠心分離法または
過法を用いる。前記分離法を行なうに当り、培
養液に各種の凝集剤を添加して菌体を凝集させた
り、また培養液のPHを低下させ、更に加熱する等
の方法により菌体を凝集せしめる等の前処理を行
なえば分離が容易となり能率的でありこれ等の方
法も併せて適用し得る。 分離菌体は洗浄され乾燥して、そのまゝ或は適
当な物質と混合してまた種々の処理をほどこして
飼料、食品、医薬品およびこれ等の工業原料とし
て利用される。 本発明によつて、工業生産により容易に入手し
得るメタノールを原料として使用することが出
来、この物質は水溶性で培養及び菌体洗滌が容易
であり、純すいな原料であつて不純物より由来す
る発ガン性物質は含まず、輸送並びに爆発の危険
もガス状炭化水素に比し極めて少ない等工業上有
利な方法である。 以下、実施例によつてさらに詳しく説明する。 実施例 １ 発酵培地として（NH₄）₂SO₄3ｇ、KH₂PO₄2
ｇ、K₂HPO₄7ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、Fe⁺⁺2
mg、M⁺⁺2mg、Yeastex0.1ｇを水道水1000mlに溶
解しPHを6.8に調製し、500ml容坂口フラスコに液
量50mlあて分注し、120℃、10分間殺菌して冷却
した後、各フラスコにメタノール１ｇ宛無菌的に
添加し、これに上記と同じ培地を用いて30℃で24
時間前培養して得られたシユードモナス・エスピ
ー・No.419の菌体を含む前培養液を２mlあて接種
し、30℃で48時間振盟培養した。培養後培養液を
遠心分離して集菌し真空デシケーター中でシリカ
ゲル上に60℃で乾燥し培養液1000ml当り4.3ｇの
割合で乾燥菌体が得られた。 実施例 ２ 実施例１とメタノールを添加前の同じ組成の培
地を10、20容ジヤーフアメンターに入れ、１
Kg／cm²10分間殺菌し、これにメタノール１（Ｖ／
Ｖ）％添加して培養液とした。同様組成培地であ
らかじめ30℃で24時間培養したシユードモナス・
エスピー・No.419を容量で３％添加し30℃で通気
撹拌培養を行なつた。PHは自動的に6.8にアンモ
ニア水の添加によつて維持され、メタノールはそ
の消費量に合わせて、かつ培養液中のメタノール
濃度が0.05〜0.5を維持するように連続的に添加
された。培養40時間後にメタノールの添加量は培
養液１あたり80mlに達した。培養を停止し、菌
体を遠心分離で集菌しこれを80℃24時間乾燥して
培養液１あたり22.6ｇの乾燥菌体を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス・エスピー・No.419に属す細
   菌を、メタノールを主たる炭素源とする培地に培
   養し、培養液から細菌菌体を分離することを特徴
   とする微生物菌体の製造方法。