JPS63503071A - Dihydrorhodamine and its halogenated derivatives - Google Patents
Dihydrorhodamine and its halogenated derivativesInfo
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- JPS63503071A JPS63503071A JP50272987A JP50272987A JPS63503071A JP S63503071 A JPS63503071 A JP S63503071A JP 50272987 A JP50272987 A JP 50272987A JP 50272987 A JP50272987 A JP 50272987A JP S63503071 A JPS63503071 A JP S63503071A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 ジヒドロローダミン及びそのハロゲシ化誘導体本発明は、新規なジヒドロローダ ミン類並びに共有ハロゲン化された標識用及び結像用化合物若しくは治療用化合 物に関し、さらに詳細には放射性ハロゲン化されたジヒドロローダミン化合物に 関するものである。本発明の化合物は、生存哺乳動物細胞を検出し、標識し、結 像し又は治療処置するために使用することができる。これらは、成る種の腫瘍細 胞につき使用するのに特に価値がある。何故なら、これらは通常の細胞による保 持と比較して腫瘍細胞による保持が増大するからである。[Detailed description of the invention] Dihydrorhodamine and its halogenated derivative The present invention provides a novel dihydrorhodamine Mines and covalently halogenated labeling and imaging or therapeutic compounds regarding radioactive halogenated dihydrorhodamine compounds. It is related to The compounds of the present invention can be used to detect, label, and bind living mammalian cells. It can be used for imaging or therapeutic treatment. These are the types of tumor cells that consist of It is particularly valuable for use in cells. This is because they are not protected by normal cells. This is because retention by tumor cells increases compared to retention.
従来、ローダミン１２３（ずなわち浸透性陽イオン染料）を生存哺乳動物細胞の ミトコンドリア染色として或いはミトコンドリア機能及び膜電位を研究するため のプローブとして使用することが提案されている。この化合物は正常細胞におけ るよりも成る種の腫瘍細胞において長く保持され、かつ成る種の腫瘍細胞に対し インビトロ及びインビボにて選択的毒性を示す。Traditionally, rhodamine 123 (a penetrating cationic dye) has been used to treat living mammalian cells. As a mitochondrial stain or to study mitochondrial function and membrane potential It has been proposed to be used as a probe for This compound is found in normal cells. is retained for longer in tumor cells of different species than those of other species; Shows selective toxicity in vitro and in vivo.
従来、ローダミン１２３を１１２５及び１１３１で放射性沃素′化しかつこれを 結像用若しくは放射線治療剤として使用することがバドマナバーン等によりジャ ーナル・ヌクレイツク・メジスン、第２６巻、第１２４頁（１９８５）に提案さ れ、又タクール等によりラジオファーマス−デカル・ケミストリーに関する第５ 回国際シンポジューム１１−Ｐ−７（１９８４）に提案されている。しかしなが ら、今回、溶液におけるローダミンの第四窒素原子に対する陽電荷は共有沃素化 されたローダミンの生成を妨げることが判明した。寧ろ、たとえばクロラミンＴ のような慣用の沃素化法或いはイオドゲン法は対応の第四沃化アンモニウム（ｇ なわちイオン性化合物）の生成をもたらし、ここで沃素はたとえば生物液のよう な水性媒体において他の非放射性イオンによりイオン化及び置換を受ける。Conventionally, rhodamine 123 was radioiodinated with 1125 and 1131, and this was Its use as an imaging or radiotherapeutic agent has been improved by Badmanabhan et al. Proposed in Nar Nukleitsk Medicine, Vol. 26, p. 124 (1985). Also, Thakur et al. published the fifth chapter on Radiopharmaceutical Chemistry. It was proposed in the International Symposium 11-P-7 (1984). But long et al., this time, the positive charge on the quaternary nitrogen atom of rhodamine in solution is due to covalent iodination. was found to inhibit the production of rhodamine. Rather, for example, chloramine T Conventional iodination or iodogen methods such as the corresponding quaternary ammonium iodide (g i.e. ionic compounds), where iodine is undergoes ionization and displacement by other non-radioactive ions in aqueous media.
さ゛らに、水素化された臭化エチジウムは生存哺乳動物細胞により吸収されて、 その内部で再酸化されることがギャロップ等によりバイオテクニークス、第２巻 、第３２〜３６頁（１９８４）に報告されている。Additionally, hydrogenated ethidium bromide is absorbed by living mammalian cells and Gallop et al., Biotechniques, Vol. , pp. 32-36 (1984).
今回、ジヒドロローダミン類及びハロゲン化ジヒドロローダミン類は、哺乳動物 細胞により吸収され、蛍光性の原ローダミンまで酸化されかつ保持されることが 判明した。ざらに、ローダミン自身と異なり、ジヒドロローダミン類は慣用のハ ロゲン化法によって共有ハロゲン化することができ、この種の化合物のハロゲン は細胞によって取込まれ、これら細胞に毒性照射に対する向上した感受性を付与 する。したがって、ハロゲン化されかつ放射線ハロゲン化されたジヒドロローダ ミン類は検出剤、標識剤、結像剤又は治療剤として有用である。This time, dihydrorhodamines and halogenated dihydrorhodamines are Can be taken up by cells, oxidized to fluorescent raw rhodamine and retained found. In general, unlike rhodamine itself, dihydrorhodamines are The halogen of this type of compound can be covalently halogenated by halogenation method. is taken up by cells and confers on these cells increased sensitivity to toxic irradiation. do. Therefore, halogenated and radiation halogenated dihydrorhoda Mins are useful as detection agents, labeling agents, imaging agents, or therapeutic agents.
本発明は、構造式： ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は水素又は低級アルキル（好ましくは １〜５個の炭素原子を有する）であり、Ｘｌ、×２、×３及びＸ４は水素、低級 アルキル（好ましくは１〜５個の炭素原子を有する）、ハロゲン若しくは放射性 ハロゲンであり、Ｙは−ＧＯＯＲ５若しくは一３Ｏ３Ｒ５であり、Ｚは水素、− ＧＯＯＲ５若しくは一３Ｏ３Ｒ５である］ を有する化合物、並びにこの種の化合物の水溶性塩を提供する。好ましくは、こ れらの塩は生理学上許容しうるものである。たとえば、これらは塩素バークロレ ート、テトラフルオロポレート並びにたとえばＹ及びＺの両者が一３Ｏ３Ｈであ ［式中、Ｒ１−Ｒ５、×１〜Ｘ４並びにＹ及びＺは上記の意味を有する］ を有する化合物からなる水溶液を哺乳動物細胞と接触させて、前記化合物を前記 細胞によって吸収させる方法をも提供する。The present invention has the structural formula: [In the formula, R1, R2, R3, R4 and R5 are hydrogen or lower alkyl (preferably 1 to 5 carbon atoms), and Xl, x2, x3 and X4 are hydrogen, lower alkyl (preferably having 1 to 5 carbon atoms), halogen or radioactive halogen, Y is -GOOR5 or -3O3R5, Z is hydrogen, - GOOR5 or -3O3R5] and water-soluble salts of such compounds. Preferably, this These salts are physiologically acceptable. For example, these tetrafluoroporate and, for example, when both Y and Z are 13O3H. [In the formula, R1-R5, x1 to X4, and Y and Z have the above meanings] contacting mammalian cells with an aqueous solution consisting of a compound having Also provided are methods for cellular uptake.
好ましくはＸｌ、Ｘ２ Ｘ３及び×４の少なくとも１つはハロゲン若しくは放射 性ハロゲンであり、他のものは水素である。Preferably at least one of Xl, X2, X3 and x4 is halogen or radiation the other is hydrogen.
本発明のジヒドロローダミン化合物は、対応のローダミン化合物を常法で水素化 し又は還元することにより、たとえば水性媒体中での硼水素化物（たとえば硼水 素化ナトリウム）での還元により作成することができる。この種の対応のローダ ミン化合物にはローダミンＢ、ローダミン３Ｂ、ローダミン６−Ｇｌ０−ダミン １９、ローダミン１１０、ローダミンロダン放射性同位元素でハロゲン化した後 のジヒドロローダを有し、またローダミン１１０の構造は：を有し、ざらにロー ダミン１１６の構造は：である。ジヒドロローダミン生成物は×１、×２、Ｘ３ 及び×４が水素であるような上記構造（１）を有する。ジヒドロローダミンは、 たとえばクロラミンＴ１すなわちイオゲンのような任意の常法により或いはＮ− クロルスクシンイミド法によって、又は塩素、臭素、沃素若しくはアスクチンの １個若しくはそれ以上の原子を芳香族アミン中へ導入するのに有効なその他任意 の方法によって共有ハロゲン化することができる。アミン置換されたベンゼン環 における４個の可能位置Ｘ１〜×４のいずれか１個若しくはそれ以上に共有結合 されたハロゲンを有する化合物は、所望に応じて互いにクロマトグラフィーによ って分離することができる。しかしながら分離は必須でなく、２種若しくはそれ 以上の異なるハロゲン化された化合物を含有する混合物も個々の純化合物と同様 に有用である。The dihydrorhodamine compound of the present invention can be obtained by hydrogenating the corresponding rhodamine compound by a conventional method. borohydride (e.g. borohydride) in an aqueous medium by It can be created by reduction with sodium chloride). Loader for this kind of support The min compounds include rhodamine B, rhodamine 3B, and rhodamine 6-Gl0-damine. 19, rhodamine 110, after halogenation with rhodamine rhodan radioisotope The structure of rhodamine 110 is: The structure of Damin 116 is: Dihydrorhodamine products are x1, x2, x3 and has the above structure (1) in which x4 is hydrogen. Dihydrorhodamine is by any conventional method such as chloramine T1 or iogen or N- by the chlorsuccinimide method or by the chlorine, bromine, iodine or asktin method. Any other effective for introducing one or more atoms into the aromatic amine. can be covalently halogenated by the method of Amine-substituted benzene ring Covalent bond to any one or more of the four possible positions X1 to x4 in Compounds containing halogens can be chromatographically separated from each other if desired. can be separated. However, separation is not essential, and two types or Mixtures containing these different halogenated compounds are similar to individual pure compounds. It is useful for
たとえば塩素、臭素、沃素若しくはアスクチンのようなハＣ２１Ｈ１８Ｎ２０３ に対するる訓算値： ７２．９６％Ｃ、ミン化合物は、ローダミン１２３或いは 他の任意のこの種の薬剤と同様に標識剤、結像剤若しくは治療剤として使用する ことができ、その際単にこの化合物をたとえば通常の塩水のような水性媒体或い は任意の生理学上許容しうる媒体に溶解させかつこれを処理することが望ましい 生存哺乳動物細胞と接触させ、次いで化合物をこれら細胞により吸収させかつ細 胞質に存在せしめる。such as chlorine, bromine, iodine or asktin Estimated value for: 72.96% C, min compound is rhodamine 123 or Use as a labeling, imaging or therapeutic agent in the same way as any other agent of this type The compound can then simply be added to an aqueous medium such as normal saline or is preferably dissolved in and processed in any physiologically acceptable medium. contact with living mammalian cells and then allow the compound to be absorbed by these cells and Make it exist in the cytoplasm.
以下の特定実施例により本発明を一層充分に説明するが、これらは本発明の範囲 を限定するものでない。The invention will be more fully illustrated by the following specific examples, which do not fall within the scope of the invention. It is not intended to limit the
塩酸塩（１００ｍｇ 、０．２６ミリモル；イーストマン・コダック社）を５０ ｄの水に溶解しかつ５０ｍ１のＣＨ２Ｃｅ２を添加した。過剰の固体ＮａＢＨ４ を、激しく磁気撹拌しながらほぼ全部の色が放出されるまで少しづつ添加した。Hydrochloride (100 mg, 0.26 mmol; Eastman Kodak Company) at 50 d of water and added 50 ml of CH2Ce2. Excess solid NaBH4 was added in portions with vigorous magnetic stirring until almost all the color was released.
１時間後、淡橙色の有機層を分離し、かつ水層をＣＨ２Ｃｅ２で２回抽出した。After 1 hour, the pale orange organic layer was separated and the aqueous layer was extracted twice with CH2Ce2.
有機層を合して無水Ｎａ２ＳＯ４に通過させ、かつ減圧蒸発させた。粗製の油状 反応混合物を溶出剤としてＣＨ２Ｃｌ２における１０％酢酸エチルを用いるフラ ッシュクロマトグラフィー（Ｃ）により精製して、８０ｍｇの僅かに桃橙色の油 を得た（収率８８％）。この精製された油を少量のＣＨ２Ｏで２に溶解しかつヘ キサンで沈澱させた。桃白色の固定ジヒドロローダミン１２３をヘキサンで洗浄 しかつ１部を分析にかけた（ｍ、 ｐ、１６３−１６５℃：５．５０％Ｎ、７． ８８％Ｎ；実測値： ７２．８２％Ｃ１５，２４％Ｈ１８，０９％Ｎ）。Ｈｌ ＮＭＲ（ＣＤ＜、ａ ）σ＝ ３．９３ （ｓ。The combined organic layers were passed through anhydrous Na2SO4 and evaporated under reduced pressure. crude oily The reaction mixture was evaporated using 10% ethyl acetate in CH2Cl2 as eluent. Purified by flash chromatography (C) to give 80 mg of slightly pink-orange oil. was obtained (yield 88%). Dissolve this refined oil in 2 with a small amount of CH2O and Precipitated with xane. Wash pink-white fixed dihydrorhodamine 123 with hexane. and a portion was subjected to analysis (m, p, 163-165°C: 5.50% N, 7. 88%N; Actual value: 72.82%C15, 24%H18, 09%N). Hl NMR (CD<, a) σ = 3.93 (s.
−ＣＯ２ＣＨ３） ５．９３ （ｓ、 Ｃ５’ ）、６．１５ （ｄのｄ、Ｊ＝ ２、８、２ＨＳ Ｃ７’、３Ｍ 、 ６．３０ （ｄ、２Ｈ，Ｃ９′ 、 １′ ）、 ６．７０ （ｄ、２Ｈ，Ｃ６’ 、４’ ）、 ７．０−７．１７（ｍ、 ３１−１、Ｃ３，４，５）、７．６５ （ｄのｄ、ＩＨ。-CO2CH3) 5.93 (s, C5'), 6.15 (d of d, J= 2, 8, 2HS C7', 3M, 6.30 (d, 2H, C9', 1' ), 6.70 (d, 2H, C6', 4'), 7.0-7.17 (m, 31-1, C3,4,5), 7.65 (d of d, IH.
Ｃ６）。この生成物はＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が水素であり、Ｒ５がメブメで ありかつＸｌ、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４が水素である上記構造（１）を有した。C6). In this product, R1, R2, R3 and R4 are hydrogen and R5 is mebume. and had the above structure (1) in which Xl, X2, X3 and X4 are hydrogen.
ジヒドロローダミン１２３ （４３ｍｇ、０．１２ミリモル）を５０ｄのＣＣｌ ４及び１ｍｉののＣＨ２（，２２に溶解させ、かつ赤色光の下で水中にて冷却し た。０．５ｍｆ！のＭｅＯＨ及び０．５ｄの０．２Ｍ Ｎ １−１４０Ａ Ｃに お（ブる１ ７ｍｇのＮ ａ Ｉ （Ｄｍｆｉ’Ｅ：ｔｌ拌しながら添加し、か つ５０ｄのＣＣ（！ａにおける１７ｍｇ（０，１３ミリモル）のＮ−クロルスク シンイミドの冷溶液を少しづつ添加した。反応混合物を字部まで加温しかつ撹拌 を１時間続けた。水及びＮａＢＨ４を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ ４で脱水し、かつ減圧蒸発させた。赤色の油状生成物をＣＨ２Ｃｅ２における５ ％ＥｔＯＡＣを用いるフラッシュクロマトグラフィーにかけて、２６ｍｇのＡ（ ４４％）を７１１１（＋のＣ（９％）と共に回収した。試料を最少量のエーテル に溶解し、ヘキサンで沈澱させ、かつ分析にかけた。Dihydrorhodamine 123 (43 mg, 0.12 mmol) in 50 d CCl 4 and 1 mi of CH2 (,22) and cooled in water under red light. Ta. 0.5mf! of MeOH and 0.5d of 0.2M N 1-140A C Add 17 mg of N a I (Dmfi'E: tl while stirring, and 17 mg (0,13 mmol) of N-chlorsk in 50 d CC (!a) A cold solution of cinimide was added in portions. Warm the reaction mixture to the mark and stir continued for an hour. Add water and NaBH4, separate the organic layer, and add anhydrous Na2SO. 4 and evaporated under reduced pressure. Red oily product in CH2Ce2 26 mg of A( 44%) was recovered along with 7111 (+ C (9%). , precipitated with hexane, and analyzed.
（Ｃ２１ｔ−ｈ ７ ＩＮ２０３に対するる計算値： ５３．４１％Ｃ１３，６ ３％Ｈ１２６，８７％Ｉ：実測値：５３．２１％Ｃ，３，９７％Ｈ１２７，０８ ％Ｉ）。ＨＩ ＮＭＲ（ＣＤＣｊ３）σ＝ ３．８８ （Ｓ、−ＣＯ２ＣＨ３） 、５．９３ （ｓ、 Ｃ−ｓ′）、６．１５ （ｄのｄ、Ｊ＝ ３、８ １−１ ２． Ｃ−７’ ）、 ６．２８ （ｄ、 Ｊ＝３、Ｃ−９’）、 ６．３８ （Ｓ、 Ｃ−１’ ＞ ６．６７ （ｄ、 Ｊ＝ ８Ｈ２，Ｃ−６’ ）、 ７ ．１５ （Ｓ、 Ｃ−４’ ）、 ６．９７−７．２０ （ｍ、 Ｃ−３、４， ５）、 ７．６７ （ｍ、 Ｃ−６＞。(Calculated value for C21t-h 7 IN203: 53.41%C13,6 3%H126,87%I: Actual value: 53.21%C, 3,97%H127,08 %I). HI NMR (CDCj3) σ = 3.88 (S, -CO2CH3) , 5.93 (s, C-s'), 6.15 (d of d, J = 3, 8 1-1 2. C-7'), 6.28 (d, J=3, C-9'), 6.38 (S, C-1'>6.67 (d, J=8H2, C-6'), 7 ．． 15 (S, C-4'), 6.97-7.20 (m, C-3, 4, 5), 7.67 (m, C-6>.
１００ｄのＣＣｅ４に；ｊ−３けル８６．０ｍｆＪ （０，２５ミリモル）のジ ヒドロローダミンの溶液を、３〜４ｄのＣＨ２Ｃｅ２の添加によって作成した。100d of CCe4; j-3 kel 86.0mfJ (0.25 mmol) di A solution of hydrorhodamine was made by addition of 3-4 d of CH2Ce2.
５ｍｌのＭｅＯＨ及び５ｒｎｌの０．２ＭＮＨ４０ＡＣにおける１５０ｍ（１（ １，０ミリモル）のＮａＩの溶液を添加し、かつ混合物を撹拌しながら水浴中で 冷却した。150 m(1( 1,0 mmol) of NaI and stirred the mixture in a water bath. Cooled.
１００ｄのＣＣり４にあける１３３．５ｍＱ （１，０ミリモル）のＮ−クロル スクシンイミドの冷溶液を１度に全部添加し、かつこの混合物を水浴中で０．５ 時間撹拌した。撹拌を室温にて０．５時間続け、その後に水及び少量の固体Ｎａ ＢＨａを添加した。激しく娠とうした後に有機層を分離し、かつ水層をＣＨ２Ｃ ｅ２で数回洗浄した。有機層を合して無水Ｎａ２ＳＯ４で濾過しかつ溶剤を減圧 除去した。１．５Ｃｍのカラムにおけるフラッシュクロマトグラフィーを残留物 につき＝ ０．８７ 、 Ｃ２０Ｈ１４１２Ｎ２０３に対する計算値：４２．１ ７行ない、その際ＣＨ２Ｃｆｆ２における１％ＥｔＯＨ８５ｄとＣＨ２Ｃｌ２２ における５％ＥｔＯＨ５０ｍ！！とＣＨ２Ｃｌ２における１０％ＥｔＯＨ４０ｄ とを使用し、５ｍｌのフラクショクを回収した。４種の生成物を単離しかつＮＭ Ｒによって特性化した。133.5 mQ (1.0 mmol) of N-chlor in a 100 d CC hole 4 Add the cold solution of succinimide all at once and stir the mixture in a water bath to 0.5 Stir for hours. Stirring was continued for 0.5 h at room temperature, then water and a small amount of solid Na BHa was added. After vigorous gestation, the organic layer was separated and the aqueous layer was purified with CH2C. Washed several times with e2. The organic layers were combined, filtered through anhydrous Na2SO4, and the solvent was removed under reduced pressure. Removed. Flash chromatography the residue on a 1.5 cm column per = 0.87, calculated value for C20H1412N203: 42.1 7 lines, then 1% EtOH85d in CH2Cff2 and CH2Cl22 5% EtOH in 50m! ! and 10% EtOH40d in CH2Cl2 5 ml of fraction was collected. Four products were isolated and NM Characterized by R.
Ａ ： ２３ｍｇ、収率２１％、Ｒｆ（５％ＥｔＯＨ／Ｃｌ−１２Ｃｅ２中）＝ ０．３５゜前記で作成したＡと同一。A: 23 mg, yield 21%, Rf (in 5% EtOH/Cl-12Ce2)= 0.35° Same as A created above.
３ ： １３ｍｇ、収率１１％、Ｒ１（５％ＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃ（１２中）＝ ０．６０ 。Ｃ２０Ｈ１５Ｉ Ｎ２０３に対する計算値：５３．４１％％Ｈ１２ ６，０８％Ｉ）。１−１１ ＮＭＲ（ＣＤＣ３）σ＝ ３．９８（ｓ、−ＣＯ２ ＣＨ３）、６．０８ （Ｓ、 Ｃ−５’）、６゜３０（ｄのｄ、Ｊ＝ ３．８ Ｈｌ、Ｃ−７’）、６．３５ （ｄ、 Ｊ＝８Ｈ２，Ｃ−３’）、６．５６ （ ｄ１Ｊ＝ ３ Ｈｚ、Ｃ−９’ ） ６．７８ （ｍ、 Ｃ−４’ 、 ６’ ）、６．８８−７．４２ （ｍ。3: 13 mg, yield 11%, R1 (5% EtOH/CH2C (in 12) = 0.60. Calculated value for C20H15I N203: 53.41%%H12 6,08% I). 1-11 NMR (CDC3) σ = 3.98 (s, -CO2 CH3), 6.08 (S, C-5'), 6゜30 (d of d, J = 3.8 Hl, C-7'), 6.35 (d, J=8H2, C-3'), 6.56 ( d1J = 3 Hz, C-9') 6.78 (m, C-4', 6' ), 6.88-7.42 (m.
Ｃ−３，４，５）、７．２２ （ｍ、 Ｃ−６＞。C-3, 4, 5), 7.22 (m, C-6>.
（：、 ： ２６ｍｇ、ｑｉ１７％、Ｒｆ（５％ＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｅ２中）＝ ０．７２ 、 Ｃ２０Ｈ１４１２Ｎ２０３に対する計算値：４２．１７％Ｃ１ ２，７０％Ｈ１４２，４３％Ｉ；実測値：、！１２．９８％Ｃ１３，０４％Ｈ１ ４１，７０％Ｉ）、ｌ−１１ＮＭＲ（ＣＤＣｊ３）：（７＝４．００ （Ｓ、− ＣＯ２ＣＨ３）、６．０５ （Ｓ、 Ｃ−５’ ）、６．４３ （Ｃ−１’ 、 ９’ ）、７．２２ （ｓ、 Ｃ−４’ 、６’ ）、６．９８−７．２３ （ ｍ、 Ｃ−３，４，５）、７．７５ （ｄのｄ、Ｊした： ２６ｍｇ、収率（１ ７％）のＣ［Ｒｉ（２５％ヘキサン中の％Ｃ１２，７０％Ｈ１４２，４３％Ｉ： 実測値：４１．２０％Ｃ１２，９０％Ｈ１４２，７２％ Ｉ ）、Ｈ’ ＮＭＲ （ＣＤＣｊ３”）：ａ＝３．９７（Ｓ、−ＣＯ２ＣＨ３）、 ６．０８ （ｓＳ Ｃ−５’ ）、６．３２ （ｄ、Ｊ＝８ Ｈｚ、Ｃ−３’ ）、６．６２ （ｓ 、Ｃ９’ ＞６゜７３ （ｄ、Ｊ＝ ８ Ｈｚ、Ｃ−４’ ）、 ７．２２ （ ５１Ｃ−６′） 、 ６．８７−７．３３ （ｍ、Ｃ−３、４，５）、 ７．７ ３ （ｄのｄＳＪ＝ ３．８ ＨｚＳＣ−６＞。(:, : 26 mg, qi 17%, Rf (in 5% EtOH/CH2Ce2) = 0.72, Calculated value for C20H1412N203: 42.17%C1 2,70%H142,43%I; Actual value:,! 12.98%C13.04%H1 41,70%I), l-11NMR (CDCj3): (7=4.00 (S, - CO2CH3), 6.05 (S, C-5'), 6.43 (C-1', 9'), 7.22 (s, C-4', 6'), 6.98-7.23 ( m, C-3,4,5), 7.75 (d of d, J: 26 mg, yield (1 7%) of C[Ri (%C12, 70%H142, 43%I in 25% hexane: Actual value: 41.20% C12, 90% H142, 72% I), H' NMR (CDCj3”): a=3.97 (S, -CO2CH3), 6.08 (sS C-5'), 6.32 (d, J=8 Hz, C-3'), 6.62 (s , C9' > 6°73 (d, J = 8 Hz, C-4'), 7.22 ( 51C-6'), 6.87-7.33 (m, C-3, 4,5), 7.7 3 (dSJ of d = 3.8 HzSC-6>.
１’ 、３’ 、７’ −トリイオドジヒドロローダミン（Ｅ） ： ２０ｄのメタノール及び６ｄの０．２Ｍ ＮＨ４０Ｈにおける８６ｍｇ （０， ２５ミリモル）のジヒドロローダミンの溶液へ、１０ｍ１のメタノール及び２． ５ｄの０．２Ｍ ＮＨａ ＯＨにおける１８７．５ｎ＋ｃ＋ （１，２５ミリモ ル）のＮａｌの溶液を添加した。窒素をこの撹拌溶液中へバブリングさせ、かつ １５０ｍｇ （０，３５ミリモル、１．４ミリ当量）のイオドゲンを１度に全部 添加した。撹拌を窒素下で１時間続けた。この反応混合物を濾過し、かつメタノ ールを濾液から減圧下に除去した。濾過ケーキをＣＨ２Ｃ２２で数回洗浄し、か つ水層をＣｌ−１２０ｊ２で数回抽出した。ＣＨ２（，２２フラクシヨンを合し 、かつ溶剤を減圧下で除去した。残留物を２〜３ｍｌのＣｌ−１２０で２に溶解 させ、少量のシリカゲルに吸着させ、かつＣＨ２Ｃ１２を減圧下で除去した。乾 燥シリカゲルの反応混合物をフラッシュクロマトグラフィー用の１．５ｃｍカラ ムの上部にヘキサン中の２５％ＥｔＯＨを用いて加えた。次の３種の主たる生成 物を回収Ｅ ｔＯＨ＞ ＝ ０．２７ ］ ：１１ｍｃ＋ （７％）のＤ （Ｒ ｆ＝ ０．４３ ） ：及び１４ｍｇ（８％）のＥ（ＲＯ，５８）。1', 3', 7'-triiododihydrorhodamine (E): 86 mg (0, 25 mmol) of dihydrorhodamine, 10 ml of methanol and 2. 187.5n+c+ (1,25mm) in 0.2M NHa OH of 5d A solution of Nal (1) was added. Bubbling nitrogen into the stirred solution and 150 mg (0.35 mmol, 1.4 milliequivalent) of iodogen all at once Added. Stirring was continued under nitrogen for 1 hour. The reaction mixture was filtered and the methane The filtrate was removed from the filtrate under reduced pressure. Wash the filter cake several times with CH2C22 and The aqueous layer was extracted several times with Cl-120j2. CH2(,22 fractions combined , and the solvent was removed under reduced pressure. Dissolve the residue with 2-3 ml of Cl-120 in 2 The mixture was allowed to absorb onto a small amount of silica gel, and the CH2C12 was removed under reduced pressure. dry The reaction mixture on dry silica gel was transferred to a 1.5 cm column for flash chromatography. 25% EtOH in hexanes was added to the top of the column. The following three main types of generation Collect materials E tOH>=0.27]: 11mc+(7%) D(R f = 0.43): and 14 mg (8%) of E (RO, 58).
ｆ＝ （Ｃ２０Ｈ１ａ １３ Ｎ２０３に対する計算値：３４．８４％Ｃ１２，０９％ Ｈ，５２，５８％■；実測値： ３４．６１％Ｃ，２，３０％Ｈ１５３、７３％ Ｉ＞、ＨＩ ＮＭＲ（ＣＤＣｊ３）：ｃｙ＝ ３．９８ （ｓ、−ＣＯ２ＣＨ３ ）、６．１０ （Ｓ、 Ｃ−５’ ）、 ６．５８ （Ｃ−１′）、 ７．２２ （Ｓ、 Ｃ−４’ 、６’ ）、６．８０−７．３０ （ｍ。f= (Calculated value for C20H1a 13 N203: 34.84%C12,09% H, 52,58% ■; Actual value: 34.61% C, 2,30% H153, 73% I>, HI NMR (CDCj3): cy=3.98 (s, -CO2CH3 ), 6.10 (S, C-5'), 6.58 (C-1'), 7.22 (S, C-4', 6'), 6.80-7.30 (m.
Ｃ−３、４，５）、 ７．７５ （ｍ、 Ｃ−６＞。C-3, 4, 5), 7.75 (m, C-6>.
例３ 数滴のＣＨ２Ｃｅ２を添加したＣＣ（！ａにあ（プる例１のジヒドロローダミン の２．５ｍＭ溶液を作成し、かつｉｍｆ！のこの溶液へ２壜のＮａ１２５１ （ １４，２ｍＣ１）の内容物を添加した。これらの壜を１０成の０．２Ｍ ＮＨ４ ０ＡＣと１０μｅのメタノールとで２回濯ぎ、かつ得られた混合物を密栓し、水 浴中で撹拌した。ＣＣｅ４中のＮ−クロルスクシンイミドの２．５ｍＭ溶液を添 加しかつ壜を密栓し、アルミニウム箔で覆い、そして室温にて激しく１時間撹拌 した。１ｄの水と数１０μｅの１ＭＮａＢＨ４とを添加し、かつ撹拌を赤色の大 部分が消失するまで続けた。ＣＣａ層をピペットで取出しかつ残部の水層を少量 のＣＨ２（１２で２回洗浄した。溶剤を合した有機層から窒素流の下で蒸発させ 、かつ１ｄのメタノール及び少量の固体ＮａＢＨ４を着色残留物へ添加した。メ タノールを蒸発させ、無色となった残留物を５％Ｅ ｔ ＯＡ Ｃ／ ＣＨ２Ｃ Ｉ！ｘ中に溶解させ、かつフラッシュクロマトグラフィーを同じ溶剤により０． ８ｘ １２ｃｍカラムにて１フラクション当り８５滴を用いて行なった。ＴＬＣ 放射能写真技術にて単一スポットを示したフラクションを合して、４．２２ｍＣ １のＡ（第１表）と１ 、３６ｍＣｉの８と１．４９ｍＣ１のＣと０．４０ｍＣ １のＤとを得た。Example 3 Added a few drops of CH2Ce2 to the dihydrorhodamine of Example 1 Make a 2.5mM solution of imf! Add 2 bottles of Na1251 to this solution ( The contents of 14,2mC1) were added. These bottles were filled with 10 parts of 0.2M NH4. Rinse twice with 0AC and 10μe of methanol, and seal the resulting mixture with water. Stir in bath. Add a 2.5 mM solution of N-chlorsuccinimide in CCe4. Seal the kashikatsu bottle, cover with aluminum foil, and stir vigorously for 1 hour at room temperature. did. Add 1 d of water and several tens of μe of 1M NaBH4, and turn the stirring to a red large Continue until the part disappears. Remove the CCa layer with a pipette and remove a small amount of the remaining water layer. of CH2(12). The solvent was evaporated from the combined organic layers under a stream of nitrogen. , and 1 d of methanol and a small amount of solid NaBH4 were added to the colored residue. Mail Evaporate the tanol and convert the colorless residue to 5%EtOAC/CH2C I! x and flash chromatography using the same solvent. It was performed using 85 drops per fraction on an 8 x 12 cm column. T.L.C. The fractions that showed a single spot in the radiographic technique were combined to yield 4.22 mC. 1 A (Table 1) and 1, 36 mCi 8 and 1.49 mC1 C and 0.40 mC I got a D of 1.
ＴＬＣにて２個以上のスポットを示すフラクションを合しかつ２５％ＦｔＯＡＣ ／ヘキサンを用いて再びクロマトグラフィにかけた。このクロマトグラフィーか ら０．１８ｍＣ１の８と０．５３ｍＣ１のＣと０．１６ｍＣ１のＤと０．０９ｍ Ｃ１のＦと０．０２ｍＣ１の未同定物質とを単離し、この未同定物質はＦよりも 大きいＲｆをＴ Ｌ Ｃにて有した。放射性沃素化した仝収率は８．４５ｍＣ１ （６０％）であり、その５０％がＡ、１８％が８．２４％がＣ１ｉ” ’、ｉ、 、：。Combine the fractions showing two or more spots on TLC and add 25% FtOAC. Chromatographed again using /hexane. Is this chromatography? et 0.18mC1 8 and 0.53mC1 C and 0.16mC1 D and 0.09m F of C1 and an unidentified substance of 0.02mC1 were isolated, and this unidentified substance was more active than F. It had a large Rf at TLC. The radioiodinated yield was 8.45mC1 (60%), of which 50% is A, 18% is 8.24% is C1i'', i, , :.
がＤかつ１％がＥであった。was D and 1% was E.
第１表 化合物 ＸＩ Ｘ２ Ｘ３ Ｘ４ Ａ Ｉ ＨＨＨ Ｂ ｌ−（ＨＩ Ｈ 化合物 ＲＩ Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５ Ａ ＨＨＨＨＣＨ３ Ｂ ＨＨＨＨＣ１−＋３ ＣＨＨＨｌ−Ｉ ＣＨ３ Ｄ ＨＨＨＨＣＨ２ Ｆ ＨＨＩ−（ＨＣＨ３ 各フラクションに存在する個々の化合物を特性化するため、同じ反応を非放射性 沃化ナトリウムを用いて行ない、かつクロマトグラフィーにより得られた個々の フラクションをＮＭＲによって特性化した。１１２５を含有するフラクションを ＴＬＣ上にてＮＭＲ−標準物質と比較することにより同定した。Table 1 Compound XI X2 X3 X4 A I HHH B l-(HI H Compound RI R2R3R4R5 A HHHHCH3 B HHHHC1-+3 CHHHl-I CH3 D HHHHCH2 F HHI-(HCH3 The same reaction was performed non-radioactively to characterize the individual compounds present in each fraction. performed using sodium iodide and obtained by chromatography. The fractions were characterized by NMR. The fraction containing 1125 Identification was made by comparison with NMR-standards on TLC.
仙のジヒドロローダミン並びにハロゲン化されかつ放射性ハロゲン化されたその 誘導体を、同様な方法によって作成することができる。Sacred dihydrorhodamine and its halogenated and radiohalogenated forms Derivatives can be made by similar methods.
ジヒドロローダミン１２３自身はこの化合物の水溶液を生存咄乳動物細胞に施こ すと非蛍光性化合物であるが、細胞のミドコントリアンに存在すれば蛍光顕微鏡 により観察され、このことは細胞内で蛍光性ローダミン１２３まで酸化されるこ とを示している。この化合物のハロゲン化は、細胞による国際調査報告 １酎譬１ｆｌ１１１１ｆｉａｌ＾Ｃ）が＋ｅａ＋−６＋１１１＋コトｆｆ１ｒ’ ＋Ｒ＋ｉｅｌｌｔｚＭＭｏ＋ａDihydrorhodamine 123 itself is produced by applying an aqueous solution of this compound to living mammalian cells. It is a non-fluorescent compound; observed, and this indicates that fluorescent rhodamine 123 can be oxidized intracellularly. It shows. The halogenation of this compound has been reported in an international investigation by Cell 1 chutan 1 fl1111 fial^C) is +ea+-6+111+kotoff1r' +R+ielltzMMo+a
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