【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
■−リンパ趨性性ウィルス
この出願は、本明細書に一体化した１９８５年１１月１４日付は出願の本出願人
による米国特許出願第７９８．１２６＠の部分継続出願である。
発明の背景
本発明は、霊長類のＴ−リンパ趨性性ウィルス、並びにこれらウィルスの分析、
及びこれら分析に用いる物質に関するものである。
ヘルパＴ−リンパ球に優先的に感染する１群の近縁なヒトレトロウィルスはヒト
Ｔ−リンパ趨性性ウィルス（ＨＴＬＶ）と呼ばれている。）−ＩＴＬＶ−Ｉと呼
ばれる１種類のＨＴＬＶイエス等（１９８０） 、プロシーディング・ナショナ
ル・アカデミ−・サイエンス・ＬＪＳＡ、第７７巻、第７４１５頁］。ＨＴＬＶ
−Ｉに関連するウィルスは、特にアジア及びアフリカの旧世界の霊長類動物など
非ヒト霊長動物に関連するが、新世界の霊長類及び原猿類には関連しないと報告
されている。ヒト、アフリカミドリザル及びサル属（Ｍａｃａｃａ）動物からの
霊長類ウィルスは、ＨＴＬＶ−Ｉに関連するが、これとは異なっている［グオ等
（１９８４） 、サイエンス、第２２３巻、第１１９５頁：ツジモト等（１９８
５） 、パイロロジー、第１４４巻、第５９頁］。
ＨＴＩ Ｖ−Ｉｌｌ又はリンパ腺症関連ウィルス（ｒＬＡＶＪ若しくはｆＡＲＶ
Ｊ ）として種々命名されている他の種類の）−（Ｔ Ｌ Ｖは、後天的免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）を有する患者からの原型ウィルスである［ボポビッ゛り等
（１９８４） 、サイエンス、第２２４巻、第４９７頁；ザラフジン等（１９８
４） 、サイエンス、第２２４巻、第５００頁；シュプバッハ等（１９８４）、
サイエンス、第２２４巻、第５０３頁；ザルンガドハルン等、サイエンス、第２
２４巻、第５０６頁］。ＨＴ Ｌ Ｖ −ｍ感染細胞からの各種の抗原蛋白が報
告されており、これらの蛋白は次のものを包含する：
（１）主ウィルス核蛋白としての２４ｋｄ蛋白（ｐ２４）と１７ｋｄボスホ蛋白
（ｐｐｌ ７）とを生成する５５ｋｄ（コａｇポリ蛋白（ｐ５５）［シュプバツ
ハ等（１９８４） 、サイエンス、第２２４巻、第５０３へ・５０５頁］、及び
（２） アミノ末端に１２５ｋｄグリコ蛋白（ｑｐｌ ２０）を生成するエンベ
ロプグリニ］蛋白（ｇｐ１６０）［エセックス及びリー、１９８４年１１月９日
付は出願の米国特許出願第６７０．３５１号及び１９８５年１１月７日付けのそ
の部分継続出願、これら両者をここに参考のため引用する］。
発明の要点
サル動物に感染しかつＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩに近縁である外生Ｃ型レトロウィ
ルスが見出された。特に、サルニつリンパ趨性性ウィルス−１（ＳＴＬＶ−ＩＩ
Ｉ）で感染した細胞は、ＨＴＩ Ｖ−ｍ感染細胞により産生される各主蛋白に対
し一般に免疫学上交差反応性である蛋白を産生する。５ＴＬＶ−Ｉ［Ｉはアフリ
カミドリザル（ＡＧＭ）及びサル属動物に感染し、かつ他の霊長動物にも感染し
うる。本明細書に使用するアフリカミドリザルという用語は、セルコピチフス（
Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ）属、特にＣ，エチオプス（ａｅｔｈｉｏｐｓ）
の種類として分類された全ての動物を包含する。５ＴＬＶ−１の増殖特性、Ｔ−
４トロピズム及び超微細構造形態は、ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩのものと同様であ
る。ザル属動物に感染する５ＴＬＶ−１（ＳＴＬＶ−■ ）は、免疫不全症及び
免疫抑制病を含めヒトにおいＡＣ
てＨＴＬＶ−Ｉｌｌが誘発する作用と同様な生物学的作用を誘発する。アフリカ
ミドリザルに感染する５ＴＬＶ−Ｉ［１（ＳＴＬＶ−１＞は病気を発生しないと
思われる。本ＧＭ
明細書において５ＴＬＶ−Ｉｎという用語は、５ＴＬＶ−■ 及びその地金ての
種類、サブ種類、並びにサルに感ＧＭ
染するような他のＨＴＬＶ−Ｉｌｌに類似
■-Lymphatic virus
This application is filed on November 14, 1985, which is hereby incorporated by reference.
is a continuation-in-part of U.S. Patent Application No. 798.126@.
Background of the invention
The present invention relates to primate T-lymphotropic viruses, analysis of these viruses,
and substances used in these analyses.
A group of closely related human retroviruses that preferentially infect helper T-lymphocytes are human
It is called T-lymphatic virus (HTLV). ) - called ITLV-I
One type of HTLV revealed (1980), Proceedings National
Le Academy Sciences LJSA, Volume 77, Page 7415]. HTLV
-I-related viruses, especially in Old World primates of Asia and Africa.
Reported to be related to non-human primates but not New World primates and prosimians
has been done. from humans, African green monkeys, and Macaca animals.
Primate viruses are related to, but distinct from, HTLV-I [Guo et al.
(1984), Science, Vol. 223, p. 1195: Tsujimoto et al. (198
5), Pyrology, Vol. 144, p. 59].
HTI V-Ill or lymphadenopathy-associated virus (rLAVJ or fARV
Other types of )-(TLV) variously named as J) are acquired immunodeficiency.
The prototype virus from a patient with AIDS syndrome [Bopovitli et al.
(1984), Science, Vol. 224, p. 497; Zarafuzin et al. (198
4), Science, Vol. 224, p. 500; Schupbach et al. (1984),
Science, Vol. 224, p. 503; Zarungadharun et al., Science, No. 2
Volume 24, page 506]. Various antigenic proteins from HTLV-m infected cells are reported.
These proteins include:
(1) 24kd protein (p24) and 17kd bospho protein as main viral nuclear proteins
(ppl 7) and 55kd (coag polyprotein (p55)
Ha et al. (1984), Science, Vol. 224, pp. 503 and 505], and
(2) Envelope that produces 125 kd glycoprotein (qpl 20) at the amino terminus
Ropgrini] protein (gp160) [Essex and Leigh, November 9, 1984
No. 670.351 dated November 7, 1985.
Continuation-in-Part Application, both of which are incorporated herein by reference].
Key points of the invention
Exogenous type C retrovirus that infects monkeys and is closely related to HTLV-III.
Luz was found. In particular, simian lymphotropic virus-1 (STLV-II)
Cells infected with HTI V-m
and generally produce proteins that are immunologically cross-reactive. 5TLV-I [I stands for Africa
It infects the Great Ceramic Monkey (AGM) and other primates, and also infects other primates.
sell. As used herein, the term African green monkey refers to the term African green monkey.
Cercopithecus), especially C. aethiops
It includes all animals classified as species. Proliferation properties of 5TLV-1, T-
4-tropism and ultrastructural morphology are similar to those of HTLV-III.
Ru. 5TLV-1 (STLV-■), which infects monkeys, causes immunodeficiency and
AC in humans including immunosuppressive diseases
HTLV-Ill induces biological effects similar to those induced by HTLV-Ill. Africa
5TLV-I [1 (STLV-1>) that infects green monkeys does not cause disease.
Seem. Book GM
In the specification, the term 5TLV-In refers to 5TLV-■ and its base metal.
Types, sub-types, and monkey-like GM
Similar to other HTLV-Ill such as
【〕たレトロウィルスの全てを包含す
るよう使用する。
本出願人は、ざらに免疫学的技術によってＳ Ｔ Ｌ Ｖ −”ＡＧＭとは実質
的に区別することができずかつ５ＴＬＶ−■ と同様にＡＩＤＳ若しくはＡＲＣ
のような徴候を感ＧＭ
染ヒトに生ぜしめないと思われるヒトウィルス、すなわちＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ
を突き止めた。ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶという用語は、免疫学的交差反応の強さ及
び幅（識別される決定子の個数）によって示されるように免疫学上ＨＴＬＶ−ｎ
ｕに対するよりも５ＴＬＶ−ＩＩＩに対し一層近縁であるウィルスを示すために
使用される。ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶという用語は便宜上ヒトウィルスを説明する
ために使用するが、必ずしも、５ＴＬＶ−１とＨＴ Ｌ Ｖ〜１ｖとの間の相違
を意味するものではない。
５ＴＬＶ−ＩＩＩ及びＨＴＬＶ−ＩＶ（７）発見及’Ｃｆ特性化は、幾つかの面
において重要である。第一に、５ＴＬＶ−ＩＩＩ及びＨＴＬＶＩＶ−感染細胞は
、一般に下記するようにサル又はヒトの試料の分析に有用な抗原決定子の原料を
提供する。第二に、５ＴＬＶ−Ｉｎ感染に対し特に危険な動物種類、すなわちア
フリカミドリザルを各種の生物学的試薬の研究開発につき使用される。たとえば
、アフリカミドリザルの組織は口腔ポリオワクチンの製造に使用される。ＡＩＤ
Ｓ類似の病気が５ＴＬＶ−Ｉ［１感染動物組織から生産したポリオワクチン若し
くはその他の製品に不注意に移行する機会を減少させることが望ましい（しかし
ながら、これは生じないと思われる）。
第三に、５ＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＶは感染４ｊＪＬｔ若ＧＭ
しくはヒトにおいて病気を発生しないと思われるが、病気発生性のＨＴ Ｌ Ｖ
−ＩＩＩに対し免疫学上交差反応性であるため、５ＴＬＶ−Ｉ［［若しくはＨ
Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＶに基づくワクチンはＡＩＤＳに対し保護を示すであろう。
ＳＴＩ Ｖ−１若Ｌ ＜ ハＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ抗原決定子を有するペプチド
及びこれらを用いる分析したがって、本発明の第一面は一般に、５ＴＬＶ−Ｉｎ
若しくはｌ−（Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＶで感染した細胞ラインからの蛋白の抗原決定
子に実質的に同一である少なくとも１種の抗原決定子を有するほぼ純粋なポリペ
プチドを特徴どし、蛋白は次のものから選択される：（ａ）約１６０，０００ダ
ルトンの分子ｆｆｌ （ｍ、 Ｗ、 ）を有するグリコ蛋白：約１２０，０００
ダルトンのｍ、ｗ、を有するグリコ蛋白：約５５，０００ダルトンのｍ、ｗ、を
有するｃｏａｃ＋蛋白：約２４，０００ダルトンのｍ、ｗ、を有するｑａｇ蛋白
；及び約３２ 、０００ダルトンのｍ、ｗ、を有するグリコ蛋白。ここで「蛋白
抗原決定子に対し実質的に同一である抗原決定子を有するポリペプチド」という
表現は：（ａ）は蛋白抗原決定子と共に所定の抗体と反応する抗原決定子からな
るポリペプチドを意味し＝（ｂ）は（ｉ）天然に産生された蛋白又はその断片を
分離するか、或いは（ｉｉ）蛋白抗原決定子と同一のアミノ酸配列を合成するこ
とによって誘導されるしたとえばチャンク等（１９８５） 、ネイチャー、第３
１５巻、第１５１頁の一般的方法によるＤＮＡの発現又は化学合成による］。以
下説明すルヨウニ、５ＴＬＶ−Ｉ［及び１−ＩＴＬＶ−ＩＶ細胞蛋白はＨＴＬＶ
−ＩＩＩ細胞蛋白に対し免疫学上交差反応性であるが、Ｓ Ｔ Ｌ Ｖ −Ｉｌ
ｌ若しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ蛋白と所定の抗体との反応は対応するＨＴＬＶ
−Ｉ［Ｉ蛋白と同じ抗体との反応と比較して異なっている。したがって、５ＴＬ
Ｖ−Ｉｎ及びＨＴＬＶ−ＩＶ抗原決定子は本発明の目的につき実質的に同一であ
るが、５ＴＬＶ−１び１−ＩＴＬＶ−ＩＶ決定子ｔ、ｔ（、Ｉ”ｔＬもＨＴＬＶ
−■決定子と実質的に同一でない。
好ましくは、ポリペプチド抗原決定子は、５ＴＬＶ−好ましくはこのポリペプチ
ドは上記蛋白の１種又はその断片であり、特に好ましくはこのポリペプチドはグ
リコジル化型又は非グリコジル化型のＱｐ３２若しくはＱｐ１６０若しくは（Ｈ
）１２０グリコ蛋白である。さらに、好ましくはこのポリペプチドはＨＴＬＶ−
１／ＬＡＶグリコ蛋白Ｄ４１に対し実質的に交差反応性でない。さらに、このポ
リペプチド抗原決定子はＨＴＬＶ−ＩＩＩグリコ蛋白決定子に対するよりも５Ｔ
ＬＶ−Ｉｎ若しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶグリコ蛋白の決定子に対し一層強い反
応性を示す。必要な免疫決定子を有する他の有用なポリペプチドは合成ポリペプ
チドを包含する。
本発明の第一面における上記ポリペプチドは、特に試料をポリペプチドと共に培
養しかつ免疫複合体が生成されるかどうかを決定することにより、Ｔ−リンパ賭
け性ウィルス抗原に対する抗体の存在につき分析するのに有用である。さらに、
上記ポリペプチドは、上記４種の蛋白の１種の決定子に対し免疫学上交差反応性
である抗原決定子の存在につき生物学的試料（たとえばヒト若しくはサル）を分
析するのに有用な抗体を生成させるために使用することもできる。この分析は、
試料を生成された抗体と共に培養しかつ免疫複合体が生成されるかどうかを決定
して行なわれる。分析すべき決定子は、上記蛋白自身或いはその他のポリペプチ
ドに存在しうる。これらは体液或いはリンパ球において自由に循環する。この分
析は、上記蛋白に見られる抗原決定子に対し免疫反応性を有するモノクローナル
若しくはポリクローナル抗体を用いて公知の免疫分析法により行なうことができ
る。たとえば、競合免疫分析又は免疫測定（サンドインチ）分析を用いることが
できる。第一面の分析は好ましくはサル試料につき行なわれるが、これらはヒト
試料についても行なうことができる。
サル試料の分析
本発明の第一面はヒト試料並びにサル試料につき行ないうる分析を特徴とするが
、本発明には特にサル試料に対する分析を特徴とする第二面が存在する。この面
において、ウィルス抗原に対する抗体の分析は上記と同様に行ないうるが、より
広い種類のポリペプチドを使用することができる。すなわち、第二面は、上記し
た蛋白に対し「実質的に同一」である抗原決定子を有するようなポリペプチドを
用いる抗体の分析に限定されない。これらの分析は、ポリペプチド決定子が蛋白
決定子に対し「実質的に同一」であるかどうかとは無関係に、上記５種のＳ Ｔ
Ｌ Ｖ −１，若しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ蛋白の１種の決定子に対し免疫
学上交差反応性である抗原決定子を有する任意のポリペプチドを用いる。第二面
の分析に用いるポリヘプ−） ｉ’ ハＨＴ Ｌ Ｖ−１、ＨＴＬＶ−ＩＶ若し
くは５ＴＬＶ−ＩＶ）で感染した細胞ラインから得られるものを包含する。
第二面の分析に用いるポリペプチドは、エセックス及びり−に係る米国特許出願
第６７０．３６１号（１９８２年１１月９日付は出願、これを参考のためここに
引用する）に記載されたグリコ蛋白（グリコジル化型若しくは非グリコジル化型
）を包含する。
抗イデイオタイプ試薬が、抗体上の部位に対し免疫学上交差反応性である抗原部
位の検出に有用であることが示されている［ボトクニャック等、サイエンス（１
９８２） 、第２１５巻、第１６３７〜１６３７頁］。したがって、この種の抗
イデイオタイプ抗体（又は遺伝学上活性なその断片）を５ＴＬＶ−Ｉ１１ウィル
ス抗原に対する抗体の存在を分析するのに用いることが、できる。
特に、これは５ＴＬＶ−Ｉ［１若しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ感染細胞蛋白の活
性決定子に対し抗イデイオタイプである抗体又はその断片を包含する。この種の
抗イデイオタイプ抗体は、蛋白に対する抗体に対して生成させることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を使用する。
さらに、本発明の第二面は、一般的に上記したように５ＴＬＶ−ＩＩＩ若しくは
ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ感染細胞の５種の蛋白の１種に対し免疫学上交差反応性で
あるポリペプチドに対し生成された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）と共
に試料を培養することによって、５ＴＬＶ−１［１の蛋白の抗原決定子につきサ
ル試料を分析することを特徴とする。好ましくは、この抗体は５ＴＬＶ−Ｉｎ若
しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶで感染した細胞の蛋白、特にこの種の細胞のｇｐ３
２、Ｃ１ｐ１２０若しくは０ｐ１６０に対して生成される。
ワクチン
最後に第三面において、本発明は５ＴＬＶ Ｉ［ｌＡＧＭ、ド、たとえばｃｉｐ
１２ｏ若しくは０ｐ１６０、或いはＨＴＬＶ−Ｉ［Ｉに対し反応するこれら分子
のペプチドフラクションからなるワクチンを特徴とする。これは、医薬上許容し
うるキャリヤに存在させることができる。さらに、ワクチンハＳ Ｔ Ｌ Ｖ
−ＩＩＩ 若しくは）（ＴＬＶ−ＩＶｒ感染した細胞ＧＭ
からの蛋白又はその変化した形態をも含むことができる。
本発明の他の特徴及び利点は、好適実施例に関する以下の説明から明らかとなる
であろう。
好適実施例の説明
先ず最初に図面につき簡単に説明する。
■、■
第１〜８図は放射線標識した５ＴＬＶ−Ｉ［１若しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ感
染細胞溶解物の調製物による各種血清試料の免疫沈澱につきＳＤＳ／ＰＡＧＥを
用いて示す写真であり、第９図は５ＴＬＶ−Ｉ［１及びｌ−Ｉ Ｔ Ｌ Ｖ −
ＩＶのウェスタンプロット分析を示す写真である。
■、蛋白の獲得
これらの蛋白は５ＴＬＶ−Ｉ［１若しくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶで感染した細胞
ラインから分離される。基準５ＴＬＶ−Ｉ［１及びＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶ細胞ラ
インは、感染リンパ球及びＨＬＩＴ−７８細胞の同時培養から誘導された。ＨＵ
Ｔ−７８細胞ラインはガズター等、ブラッド、第５５巻、第４０９頁（１９８０
） ：ポイエズ等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・
ＵＳＡ１第７７巻、第６８１５頁（１９８０）に報告された充分特性化されてい
る成熟ヒトＴ−細胞ラインである。これら２種のＨＬＪＴ ７８／５ＴＬＶ Ｉ
［ＩＡＧＭ細胞ラインはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託
されて、ＡＴＣＣＮＱＣＲＬ８９４２及び８９４３が付与されている。ＨＴＬＶ
−ＩＶ／ＨＵＴ−７８細胞７−１’ ンはＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ２１２９とＬｒ奇
寄託れている。適切な蛋白は遺伝学的に地図化することができ、次いでこれら蛋
白を遺伝子工学によって作成することができるであろう。
好適蛋白はｇｐ１６０／１２０グリ−１蛋白であって、ドデシルｒＡＩＷ ｔ
ｔ＝リウムポリアクリルアミドグル電気泳動（Ｓ ［、、’） Ｓ ／ Ｐ Ａ
Ｇ Ｅ ） 、リ−なわらグル電気泳動！により測定１ノで約１２０．０００
グルトーン及び１６０．０００ダルトンの分子量を有し、さら８・＝（これらの
蛋白は０．１５Ｎ４烙１化す１〜リウムと０．０５１Ｊｌ・・リスｊ福酸１ス日
）Ｈ７，２と′１ソロ１・・す］・−ンＸ１００と１％デオキシコリン酸す１ヘ
リウムとＯｏ１ソロドデシル硫酸す１ヘリウムと１ｍＭ弗化−ノエニルメヂルス
ルホ、−ルとよりなるＳＤＳ緩衝液に対し可溶ｔｔである。１・・リド・ンＸ
、−１００は非イオン型表面活性剤である（オクチルフェア／キシポリＴトキシ
（９ｉ０）エタノール）。１６０．０００タ゛ル１〜ンのグリコ蛋白の非グリコ
ジル化成分は約９０．０００ダルトンの分子量を有しかつ免疫性であって、成る
種の抗原決定子をグリコ蛋白白身と共に共有する。
他の各種の細胞ラーインｂＳ下！Ｖ−１１１若しくはｌ−（Ｔ Ｉ−Ｖ −１■
で感染さゼ、ることができる３、特に＋（９１０胞、ＮＣ３７細胞、（ルト３細
胞、［ルｌ−４ｆｉｌｌ胞及びＣＥＮ細胞を挙げることが′ｃ′きる。新規なこ
れらグリコ蛋白の正確な寸法は異なる細胞ライン（−で僅か（Ｃ異なるが、グリ
コ蛋白の共通な免疫学的交差反応性の部分は細胞ラインとは無関係に同一である
と思わジル。何故なら１．：ｍ ｉｔ ハＳ Ｔ Ｌ Ｖ−Ｉｌｌ若（］＜ ハ
ｌ（Ｔ Ｌ Ｖ −ＩＶによって誘発された蛋白であるからである。かくして、
ウィルスを有する任意の細胞が、新規なグリコ蛋白の適当な原料となる。
ウィルスを有する感染細胞から蛋白を得るには、これら細胞を代謝（票識しくた
とえば３３５−システィンにより）、かつＳＴ［−■−■感染動物又ハＨＴ’ｌ
Ｖ−ＩＶ感染ヒトカら得られた抗血清により免疫沈澱させる。これらグリコ蛋
白は、１ノンチル−レクヂン親和性り１７１へ・グラフィーによって感染細胞溶
解物から作成しかつこれをＳ ＯＳ 、、／ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ Ｇこかけること
ができる。Ｌ′：とえば、これらのグリコ蛋白若６／Ｓ丁ｔ、−，ｖ −ｍ−若
ｔ、 ＜ １．ｔ ＨＴ Ｌ Ｖ−ＩＶ −感染細胞”） −１’ ／ Ｌ：存
在する。１−ＩＵＴ７８細胞には感染動物若１ノ＜はヒトからの新鮮なウィルス
分離物を感染させることができる。グリコ１蛋白は、これら細胞ラインの細胞か
らその溶解及びＳＤＳグル電気泳動によつＣ８易虹分離覆−ることかＣきる。
■０分−板
精↓しされかつ分離されノ、＝グリ］蛋白或いはこれに対し免疫学士交差反応性
である任意の抗原を、標準抗原としてこの抗原（、二対し７持異性である抗体の
存在につき生物学的試料で検出するための任意慣用の分析手順で用いることかで
き、（〕たがって〕５ＴＬ−＼／−１ｌｌしくはＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶで感染し
た細胞の試料における存在を検出するにも使用することかできる。
グリコ蛋白又はこれに対し免疫学士交差反応性であるポリペプチドは、慣用の手
順により放ｑ４線免疫分析に使用するための１１２５又は３３５若しくはＨ３に
より、又は蛍光免疫分析用のフルオレシンにより、又は酵素免疫分析用の酵素に
より、或いはごオチンーアビジン結合分析のためのどオチンにより標識すること
ができる。これは所望に応じて競合免疫分析、或いは２種の抗体を用いる二重抗
体分析にて使用し、ｅ！、識し又は標識しないこともでき、いずれの場合もイデ
ィオタイプ：抗イデイオタイプの種類の抗体を使用し、或いは特に抗Ｆｃ抗体を
用いる第２抗体型を使用することができ、又はその他の分析で用いることができ
る。
或いは、これらグリコ蛋白又はこれに対し免疫学上交差反応性であるポリペプチ
ドはたとえば不溶性樹脂のような不溶相に固定化することができ、さらに抗グリ
コ蛋白抗体の検出を前記不溶相に対するその結合を測定して行なうことができる
。不溶相はざらにラテックス粒子を包含し、これは新規なグリコ蛋白又はその免
疫学上交差反応性のポリペプチドで被覆しかつ抗グリコ蛋白抗体に露呈すると凝
集する。ざらに他の不溶相は試験管、試験瓶、滴定ウェルなどを包含し、これに
新規なグリコ蛋白又はその免疫学上交差反応性のポリペプチドを結合させること
ができ、かつこれに対する抗体を二重抗体技術或いは蛋白−Ａ依存性技術によっ
て検出することができる。
Ｓ Ｔ Ｌ Ｖ−Ｉｌｌ−若しくはト（ＴＬ−Ｖ−ＩＶ−誘発された細胞表面抗
原を識別する抗体の分析は、ＭＷ １２０．０００ダルトン、１Ｇ０，０００ダ
ル１〜ン及び９０．０００ダルトンのグリコ蛋白又は非グリコジル化成分をそれ
ぞれ粗製型で使用することができ、これら蛋白を実質的に純粋な形で使用するこ
とに限定されない。
たとえば、グリコ蛋白を最初に実質的に精製し、次いで混合することもできる。
或いは、より粗製の混合物を使用することもできる。
上記診断法を行なうのに必要な部材は、キット内に収めることができる。この種
のキットは１つ若しくはそれ以上の容器を収容すべく分室にしたキャリヤを備え
、これら容器のそれぞれは試験を行なうのに必要な１個若しくはそれ以上の部材
を含む。
たとえば、第１容器は精製グリコ蛋白又はその免疫学上交差反応性のポリペプチ
ドの一方又は両者を検出可能に標識され又は不溶化された形態で含有することが
できる。
第２容器は二重抗体結合分析に有用なポリク１コーナル若しくはモノクローナル
の抗−１９Ｇ抗体、或いはグリコ蛋白若しくはその免疫学上交差反応性のポリペ
プチドにおける標識を検出するのに要する部材（たとえば発色性基質）を含むこ
とができる。
他の容器は種々異なる量のグリコ蛋白又はその免疫学」−交差反応性のポリペプ
チドを含んで、実験結果を内挿しうるような標準曲線を作成するのに使用するこ
とができる。これらの材料はキット中へそれ白身で又は溶液として又は凍結乾燥
して或いはたとえば不活性蛋白などの他の不活性物質と混合して存在させること
もできる。
試験される生物学的試料は血液、血清、リンパ球、尿、組織、唾液、糞尿などを
包含する。特に興味あるものは、ワクチン製造に使用すべきア゛ノリカミトリザ
ルの血液又はぞの他の組織のスクリーニングである
以下の特定実施例は、本発明の範囲に限定を加えることなく本発明の特徴を充分
説明することを目的とする。
実施例１及び２ ：５ＴＬＶ−Ｉ［１抗原による第１図は、ＨＵＴ−７８／５Ｔ
ＬＶ−ＩＩＩ （レーンａ）ＡＣ
及び未感染の比較ＨＵＴ−７８（レーンｂ）のグリコ蛋白調製物と各種のサル血
清試料との反応性を示している。グリコ蛋白は、デオキシコリン酸ナトリウムを
欠如した第２図につぎ下記するようなＲＩＰＡ緩衝液で作成した細胞の可溶性細
胞溶解物から作成する。溶解物をレンチル−レクチン−セフセファ０−スＣ１−
４８の比にて通過させる。グリコ蛋白を緩衝液［０，１５Ｍ Ｎａα、０．０５
ＭトリスＨＣｆ！、ｐＨ７，２，１％トリトンＸ−１００及び０．２Ｎメチル−
α−Ｄ−マンノシド］でルラ・ムから溶出させる。溶出した結合フラクションを
、予め蛋白へど−ズと反応させた１０μ２の試験血清と反応させる［たとえばエ
セックス等（１９８３） 、サイエンス、第２２０巻、第８５９頁に記載の一般
的技術で使用されるコ。使用した血清は次の通りである。レーン１及び２：ヒト
基準ＨＴＬＶ−■、陽性血清；レーン３：ヒト基準ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、陰性血清
：レーン４及び５：５ＴＬＶ−ＩＩ陽性マ、カークサル血清：レーン６：５ＴＬ
Ｖ−ｎｌ陰性マカークサル血清。免疫沈澱物を１００℃にて２分間煮沸すること
により蛋白へビーズから溶出させる［試料緩衝液二〇、１クリーランド試薬；２
％ＳＤＳ；０．０８Ｍトリス−ＨＣｌ：ｐＨ６，８：１０％グリセリン：０．２
％ブロモフェノールブルー］。試料を１０．０％アクリルアミド分割用ゲルにて
レムリの不連続緩衝系［レムリ（１９７Ｑ） 、ネイチャー（ロンドン）、第２
２７巻、第６８０頁］にしたがい３，５％積層ゲルを用いてＳＤＳ／ＰＡＧＥに
より分析する。
第２図において、ＨｔＪＴ−７８／５ＴＬＶ−Ｉ［ＩＭＡＣ（レーンａ）及びＨ
ＵＴ−７８（レーンｂ）は対数増殖期のピークにて収穫しかつ［Ｓ３５］システ
イン［１５０Ｃｉ ／ｒｒｄｌ ：比活性１０００〜１０５０Ｃｉ ／ミリモル
；ニュー・イングランド・ヌクレア社］に８〜１０時間露出させる。細胞をＲＩ
ＰＡ緩衝液［０，１５Ｍ ＮａＣｆ！、０．５トリス−ＨＣＪ！、ｐＨ７，２，
１％デオキシコリン酸ナトリウム、０．１％５Ｃ３Ｉで破壊することにより、可
溶性細胞溶解物を１作成する。次いで、この溶解物をｉ ｏｏ、 ｏｏｏ ｇに
て１時間遠心分離する。溶解物を次の試験血清１０威と反応させる：レーン１：
モノクローナル抗−１）２４（ＨＴＬＶ−Ｉ［１）；レーン２及び３：ヒト基準
ＨＴＬＶ−Ｉ、陽性血清：レーン４：ヒト基準ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、陰性血清；レ
ーン５及び６：マカークサル基準５ＴＬＶ−Ｉ１１陽性血清：レーン７：マカー
クサル基準５ＴＬＶ−Ｉ１１陰性血清。
第１図及び第２図の両者において５ＴＬＶ−１−感染マカークサル血清は５ＴＬ
Ｖ−Ｉ −感染細胞のｇｐｉ ２０ＡＣ
／ｇｌ）１６０蛋白を識別する。
実施例３：
第３図に示したように、実施例２に記載した手順をＨＴＬＶ−１−感染Ｈ９細胞
について行ない、その際レーン１〜５には第２図にてレーン１〜５で記載した血
清を使用しかつレーン６には５ＴＬＶ−Ｉ［［につき陰性の代表的マカークサル
血清を使用する。
実施例４−６
ＳＴＬＶ−Ｉ［１細胞蛋白によるサルで検出される５ＴＬＶ−Ｉ［１
第４図においては、次の血清試料につきＨＵＴ７８／５ＴＬＶ−ＩＩＩ （ａ）
及びＨＵＴ７８ （ｂ）を用いて上記手順を行なった：レーン（１）モノクロー
ナル抗−ｐ２４（１−ＩＴＬＶ−Ｉ［１）： レーン（２）ＨＴＬＶ−Ｉ［１に
対し陽性のヒト基準血清：レーン（３）ＨＴＬＶ〜■に対し陰性のヒト基準血清
：レーン（４）ＳＴＬＶ−Ｉ［［に対し陽性のマカークサル血清；レーン（５）
及び（６）ＳＴＬＶ−ＩＩ［に対し陽性のＡＧＭ血清；レーン（７）ＳＴＬＶ−
ＩＩＩに対し陰性のＡＧＭ：レーン（８）ＳＴＬＶ−ＩＩに対し陰性のヒト血清
：レーン（９）ＳＴＬＶ−１に対し陰性のチンパンジー血清。
５ＴＬＶ−Ｉ［１の１６０．１２０．５５及び２４ｋｄウイルス抗原を、陽性マ
カークサル血清及びＩ（ＴＬＶ−１［１陽性血清によって免疫沈澱させる。
第５図は、５ＴＬＶ−Ｉｌｌで感染した７匹の異なるアフリカミドリザルにおけ
る蛋白発現を示している。これらサルからの細胞培養物を）（ＵＴ７８細胞との
同時培養によって得た。
細胞培養物を３３５−システィンで代謝標識し、かつ全細胞溶解物のＲＩＰ−３
ＤＳ／ＰＡＧＥを次のものを用いて行なった： （ａ）ＳＴＬＶ−１抗体陽性の
ＡＧＭ血清試料：（ｂ）ＳＴＬＶ−１抗体陰性のＡＧＭ血清試料； （Ｃ）ＡＩ
ＤＳ関コンプレックスを有するヒトからの１（ＴＬＶ−Ｉ１１抗体陽性の基準血
清試料。Ｃとして示したレーンは、同様に標識したＨＵＴ７８未感染細胞を示し
ている。
特に、上記培養物からの細胞を［３３５］システイン［−１５０Ｃｉ ／ｍｌ
；比活性１０００−１０５０Ｃｉ ／ミリモル：ニュー・イングランド・ヌクレ
ア社（ＮＥＮ）］に対し４〜６時間露出させた。ＲＩＰＡ緩衝液［０，１５Ｍ
Ｎａｐ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，２，１％デオキシコリン酸ナトリ
ウム及び０．１％５Ｃ３Ｉで細胞を破壊することにより可溶性細胞溶解物を作成
し、かつ１００，０００ｃ）にて１時間遠心分離することにより清澄化させた。
細胞溶解物の各群を蛋白Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ （蛋白Ａ−ビーズ、シグ
マ社）に結合された１０μｅの試験血清と反応させた。免疫沈澱物を、０．１Ｍ
クリ−ランド試薬、２％５ＤＳ１０．０８Ｍ１−リス−ＨＣｌ１． ｐＨ６，８
，１０％グリセリン及び０．２％ブロムフェノールブルーを含有する試料緩衝液
で１００℃にて２分間煮沸することにより溶出させた。これらの試料を、レムリ
（１９７０） 、ネイチャー、第２２１巻、第６８０頁の不連続緩衝系により３
．５％積層ゲルを用いて１０．０％アクリルアミド分割用ゲルで分析した。
第５図に示したように、７種の培養物（レーン１〜７）の全てから得られた溶解
物は、基準抗体陽性のアフリカミドリザルから得た血清と反応させた際、約１６
０ｋｄ、１２０ｋｄ、５５ｋｄ及び２４ｋｄのバンドを示した。未感染ＨＵＴ７
８細胞からの溶解物については同じバンドが見られへかつｌ、二（１）−ン′Ｃ
）１、ざら（５−５こね、らの（翫白は、７（・Ｆの感染細胞１８養物から冑し
テ溶１好物をＳ −ｒ ｌ−、、Ｖ −川に対する抗体を欠如し１．たア−，ノ
リカミトリリールからの代表面白れへと反Ｆ１箇＼せｌ、二際ｆＪ： ｆ：）検
出され４禾かった。ヒＩ〜Ａ Ｒ（／患貨からの血清（６１，５５１＜ ｄ及び
２４ｋｃｊ屯白・り識別し・かつ分ρ７蓮物１−７から作成４＼れた溶解物（９
１おけろ約１２０ｋｄ及び１６０ｋｄのくｔ白（：１対（７僅か４に反応性９
： Ｌ、’ ７こが、同じバンドは未感染＋−ｉ Ｕ Ｔ ７ｓ細胞で（よ欠如
した。
第（３図は、ウィルスの分離（、刀戊功（５，・た同じ７種の胃なるアフリカミ
ドリザルからの血清試料ｃ＝、ｉる免疫沈澱を示し、Ｓ Ｔ Ｌ Ｖ−ＩＩＩ
ｔｉｌｌ胞ライシライン物１）及び未感染ΔＧＭ
トＩＵ丁７ε３細胞（レーン１＝７）から作成（）た細胞溶解物と反応ざｉ４ｋ
。Ｓ−１［−Ｖ−ＩＩＩ （分離物１）感染（レーン Ｇ Ｍ
ａ）７ｉ、（月−（ｔＪＴ７８末感Ｓ（１］ ）ｂ）細胞溶解物ｔ 、ｈ 記ト
同様に作成した２、１ノーン１＝１＋はＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩ抗体陽性ヒｉ−
△１１）Ｓ若（−ツク＆に Ａ ＲＣ患者からの血清試料を含み、レーン）ｆ−
−は叶仝／、Ｊ：ｔＵ較抗体陰性ヒト血清を含有し、１ノーン１−・−７はウィ
ルス分離物１〜７が得１うれだアフリカミドリザルからの血清試料であり；Ｉ／
−ンε３−１２はｓＴＬＶ−ｍＭＡｃ。
に対リ−る抗体につさ陽性であった代表的なアフリカミドリザルからの血清試料
であり：レーン１３はＳＴＬＶ−ＩＩＩＭＡｃ【、一対一する抗体につき陰性で
あった代表的なアフリカミドリザル血清である。
第６図に示したように、ウィルス陽性すルからの血清は特異的にｑｐ１６０／１
２０を沈澱させたのに対（）、これら血清訊、料の３３種のみがさらＭ ｐ ５
５及びＦ） ２４ Ｌこ対重る反応性を示し１σ：１、仙の＞７ノリカミドリ４
Ｆ ／ｌノ血清の分析は同’Ｊな現象を示し、Ｊこで４２伸のＳＴＩ ｖ−ｍ
陽性血清試料のうＧＭ
ち１１種（２６％）が、Ｑ ［）１６０／１２０４．、：対する反応性のイｉ！
。
ＧＪ′ＩＩ） ５５及びｐ ２４ ｃＪ対する反応性をち示（）た。ｊ、・たが
つＣ１（−のウィルスの高分子Φグリ■］蛋白は明゛らかし：感染ザル（Ｊ］お
いて最も免疫性の種類である。
さら（こ、アフリカミドリザルからのＳＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩ 陽ＧＭ
↑１血清を、Ｕ＜ Ｉ Ｐ／５ｉ−）Ｓ −ＰＡＧＥによりＨＴ Ｌ Ｖ−ＩＩ
Ｉ 、、’Ｌ Ａ Ｖ生白に対する抗体（３つき分析し、その際これら血清の約
５０％が１−１ＴＬ Ｖ−［１蛋白Ｃ＝対【）反応性を示した。この交差反応性
を検出づ−るための他の診断分析を行ない、その際同じ血清試料をＨ丁＋、ｖ−
ｉｕｔ：対する［［ＩＳΔによって分析しり（工Ｌ／’／ ｈ ロヌク１７７ｊ
−，：ｍ ツクス礼） 。Ｓ Ｔ Ｌ Ｖ−ＩＩＩ ＡＧへ。
ウィルス及び抗体陽性サルは、８種の血清試料にｊ′３ける５種（４二ｄｊいて
ＲＩト） ＳＯ３／ＰＡＧＥにより１−ＩＴＩＶ−ＩＩＩ蛋白（こ対する抗体を
示ｊ）だの（こ対ｌ）、ＥＬＩＳＡはこれら８種の試料のうち２種を１−１ ’
Ｔ−Ｌ Ｖ −Ｉｌｌ陽性として検出した。したがつて、５ｌｌＶ−１１１特異
性蛋白に対する抗体の存在は、ウィルス分離に最も緊密に関連すると思われる。
ＲＩＰ及びＳ Ｄ Ｓ ／ Ｐ Ａ Ｇ ［分析は、ト（ＴＬ’ｖ”−Ｉ１１キ
ツ１〜ＥＬＩＳΔに比較（］て、感染ザルに（（３ける関連ウィルスに対する交
差反応性抗体の検出につき一層感受性が人であると思われる。
実施例７
健康な個人（売春婦又は手術思考）からの血清試料をダカール、セネガルニテ得
、コレラ市販のＨＴＬＶ−１１１／ＬＡＶＥ［ＩＳＡキット分析によってスクリ
ーニングした。
ＦＬＩＳＡ−陽性試料を、上記に一般的に記載したＲＩＰ／ＳＯ３／ＰＡＧＥよ
り分析して疑似陽性を排除した。
陽性試料は仝てｐ２４、ｐ５５及びｇ０１２０／ｑｌ）１６０を包含する全ての
ｓ ＴＬ Ｖ−ｍウィルス抗原に対し強力な反応性を示した。これら試料の僅か
２７％が仝ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＩＩ ／ Ｌ Ａ Ｖ抗原に対し反応性を示した
。これら試料の成るものは主たるＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ抗原に対し検出可能
な抗体を示さなかったのに対し、他のものはｐ２４及びｐ５５Ｑａｇ関連抗原に
対してのみ抗体を示した。全ての場合、ト（ＴＬＶ−ＩＩＩＧｐＩ ２０及び（
］ｐ１６０に対する反応性は、５ＴＬＶ−１１１Ｑｐ１２０／１６０に対スル反
応性と比較して弱く、或いは全く存在しなかった。ざらにバリン等、ランセラ１
〜、第１１巻、第１３８７頁以降（１９８５）の一般的技術によるウェスタンブ
ロワ１〜分析で分析した際、検出可能なｑｐ４１に対する抗体を欠如した。
これら西アフリカ土人からの代表的血清試料を第７図に示し、５ＴＬＶ−ｎｌ抗
体陽性アフリカミドリザルからの比較血清試料をも示す。特に、西アフリカに居
住するヒトからの血清試料を、全細胞溶解物を用いるＲ Ｉ Ｐ−３ＤＳ／ＰＡ
ＧＥにより次のように分析した。ＨＴＬＶ−１（ＢＨ１０ウィルス）感染モルト
−＝３細胞、未感染モルト−３細胞、ト（ＵＴ〜７８感染５ＴＬＶ−Ｉｌｌ 及
び未感染モルト−３細胞かＧＭ
らの細胞を対数増殖期のピークにて収穫し、かつ（Ｓ３５）システィン（−１５
０Ｃｉ ／ｍＩ：比活性１０００−１０５（）Ｃｉ ／ミリモル、ニュー・イン
グランド・ヌクレア社（ＮＥＮ）］に対し４−６時間露出させた。細胞をＲＩＰ
Ａ緩衝液［０，１５ＭＮａＧ、０．０５Ｍトリス−ｔ（０２、ｐＨ７，２，１％
デオキシコリン酸ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ］で破壊することにより可溶性
細胞溶解物を作成し、かつｉｏｏ、ｏｏｏｇにて１時間遠心分離することにより
清澄化させた。細胞溶解物の各群を、蛋白Ａ−セアロースＣｌ−４Ｂ（蛋白Ａ−
ビーズ、シグマ社）に結合した次の試験血清１０μ２と反応させた：（レーン１
〜・２）ＳＴＩ Ｖ−１抗体陽性アフリカミドリザル；（レーンＧＭ
３） Ｓ Ｔ Ｌ Ｖ ＩＩＩ Ａａ Ｍに対する抗体を持った健康な西アフリ
カ比較；（レーン４〜８）ＳＴＬＶ−１に対し反応ＧＭ
性を有する西アフリカ売春婦からの血清：（レーン９）西アフリカの５ＴＬＶ−
Ｉｌｌ 及びＨＴＬＶ−１血清陰性の売ＧＭ
春婦：及び（ｌ）−ン１０）ＳＴＬＶ−ＩＩＩ 及［）”ＨＴＬＶＧＭ
−ｍにつき血清陰性の健康な西アフリカ比較。
免疫沈澱物を、０．１Ｍクリ−ランド試薬と２％ＳＤＳと０．０８Ｍトリス−Ｈ
Ｑ！、ｐＨ６，８と１０％グリセリンと０．２％ブロムフェノールブルーとを含
有する試料緩衝液にて１００℃で２分間煮沸することにより溶出させた。これら
の試料を、レムリの上記不連続緩衝系にしたがう３．５％積層ゲルによつて１０
．Ｏ％アクリルアミド分割用ゲルで分析した。
実施例８
ＨＴＬＶ−ＩＶの分離
ＨＴ Ｌ Ｖ −ＩＶを分離するため、末梢血液リンパ球を８人の５ＴＬＶ−■
ＡＧＭ抗体陽性のヒトから得、これらをＨＵＴ−７８細胞と共に培養した。ウィ
ルス分離の手順は一般に５ＴＬＶ ＩＩＩＡＧＭにつき上記したものと同じであ
り、或いはカンキ等（１９８５） 、サイエンス、第２３０巻、第９５１頁に記
載された手順と同様である。注目すべきことに、標的細胞のインビトロ細胞分解
は観察されなかった。したがって、ＨＵＴ−７８細胞を５日目の各培養物につき
１回添加した。
２１日〜２８日の培養にて、不規則性かつ複数積の巨大細胞が出現した。開始後
１４日目から、全ての細胞培養物を膜免疫蛍光性（ＭＩＦ）及びＲＩ Ｐ−８Ｄ
Ｓ／ＰＡＧＥにより上記したようにウィルス蛋白発現につき監視し、その際ＳＴ
ＬＶ−ＩＩＩＡＧＭ、ＨＴＬＶ Ｉ［Ｉ／ＬＡＶ及びＨＴＬＶ−Ｉウィルス蛋白
に対し既知の抗体反応性を示す基準血清を用いた。２８〜３５日間の培養後、５
ＴＬＶ−ＩＩＩ関連のウィルス蛋白がＭＩＦ及びＲＩ Ｐ−３ＤＳ／ＰＡＧＥの
両者により３種の培養物で検出された。
これら３種の培養物からの無細胞の上澄液をボポビツク等（１９８４） 、サイ
エンス、第２２４巻、第４９７頁及びサラフジン等（１９８４） 、サイエンス
、第２２４巻、第５００頁により従来記載されているＭＣＩ＋依存性逆転写酵素
につき監視した。バックグランド（７６〜８６０ｃｐｍ）に対し毎分３．５００
〜９３．０００カウント（ｃｐｍ ）が、５ＴＬＶ−１ウイルス蛋白を発現する
３種の細胞培養物で観察され、かつウィルス蛋白に対し陰性であった培養物では
観察されなかった。
５ＴＬＶ−Ｉ［１に対し抗原交差反応性を示す細胞培養物を電子顕微鏡によって
検査した。レトロウィルスに特徴的な粒子が感染細胞膜から出芽しているのが観
察された。細胞外ウィルス粒子は、サル及びヒトのＴ−リンパ油付性ウィルスに
つき記載したと同様な電子濃密の円筒状核を示した。西アフリカの５ＴＬＶ−１
抗体陽性のヒトから得られた３種の培養物全てで見られたレトロウィルス粒子の
超微細構造形態は、アの両者から得られた５ＴＬＶ−ＩＩＩ型ウィつス粒子のス
パイク蛋白は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶウィルス粒子で一般に観察されるもの
よりも顕著であったことに注目される。西アフリカ５ＴＬＶ−Ｉ［Ｉ関連ウィル
ス培養物からのウィルス生産レベルは、肉眼検査及び逆転写酵素活性の両者に基
づき、１−（ＴＬＶ−Ｉ／ＬＡＶ感染Ｈ９細胞で観察されたものと同様であった
。
実施例９
ＨＴＬＶ−ＩＶ（７）抗ａ （７） 同定第８図に示したように、３種の１−Ｉ
ＴＬＶ−ＩＶ細胞培養物（レーン１〜３） 、５ＴＬＶ−ＩＩＩ△ＧＭ基準感染
ＨＵＴ−７８（Ｓ）及び未感染ＨＵＴ−７８細胞（ｃ）からの全細胞溶解物を上
記と同様に作成し、かっＲＩＰ−３ＤＳ／ＰＡＧＥにより次のように分析した。
細胞溶解物の各群を次の試験血清と反応させた：西アフリカからの陰性血清試料
；５ＴＬＶ−ＩＩＩ及びＨＴＬＶ−Ｉ［１に対し陰性のウィルス及び抗体；個人
１からの５ＴＬＶ−１１１抗体陽性血清：個人２からの５ＴＬＶ−Ｉ［１抗体陽
性血清；個人３からの５ＴＬＶ−ＩＩＩ抗体陽性血清ニアフリカミトリザルから
の基準５ＴＬＶ−ＩＩＩ抗体陽性血清；及びＡＩＤＳ患者からの基準ＨＴＬＶ−
Ｉ抗体陽性血清。
５ＴＬＶ−■及びＨＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶ（７）両者に対スル抗体を欠如した
陰性比較個人からの血清は、５種の溶解物のいずれにおいても特異性蛋白を識別
しなかった。逆に、５ＴＬＶ−［１−陽性培養物１．２及び３からの溶解物は、
それら自身の血清或いは基準５ＴＬＶ−ＩＩＩ抗体陽性アフリカミドリザルから
の血清（レーン１．２及び３）と反応させた際約１６０、’１２０．５５及び２
４ｋｄのバンドを示した。これらのバンドは、基準５ＴＬＶ−Ｉ［１の全細胞溶
解物ＧＭ
（レーンＳ）から沈澱させた同様な電気泳動移動度を有する蛋白とは区別できな
かった。これらのバンドは、同じ血清を未感染ＨＵＴ−７８細胞溶解物（レーン
Ｃ）又は西アフリカからの抗体陰性のヒトより得られた培養物から同様に作成し
た全細胞溶解物と反応させた際、検出できなかった。基準Ｕ、Ｓ、ＡＩＤＳ患者
からの血清はＳＴＬＶ−ＩＩＩＡＧＭの５５及び２４ｋｄ蛋・白を識別し、かつ
培養物１〜３における同じ蛋白に対し同様に反応した。高分子量蛋白ｇｐ１２０
／１６０に対して極く僅かの反応性が観察された。
第９図に示したように、ウェスタンプロット法によって識別された５ＴＬＶ Ｉ
［ＩＡＧＭのウィルス抗原はｐ２４、ｐ１５、ｐ５３、ｐ６４、（Ｈ）１２０及
びＣ］ｐ３２を含む。
ｐ２４及びｐ１５はｇａｇ関連性でありが）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶの同様な
ウィルス蛋白に対し類似性である。１２０ｋｄ蛋白は幾種かの５ＴＬＶ−ＩＩＩ
及びＨＴＬＶ−ＩＶ抗体陽性の血清試料で示されている。この蛋白は、しばしば
ウェスタンプロット法では殆んど検出されないがＲＩ Ｐ−８ＤＳ／ＰＡＧＥに
よりＨＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶ抗体陽性試料で容易ニ検出さｈるＨＴＬＶ−Ｉ［
Ｉ−ＬＡＶ ０ｐ１２０に類似スルト思われる。バリン等、ランセット、第１１
巻、第１３８７頁（１９８５）のウェスタンプロット技術を用いる３２ｋｄの不
鮮明なバンドは、レンチル−レクチン調製物及びＲＩＰ−３ＤＳ／ＰＡＧＥを用
いて観察された同様に出現する３２ｋｄグリコ蛋白と相関する。ｐ３２蛋白は、
ＨＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶ（７）ＨＴＬＶ−ＩＶのｐ６４及びｐ５３はＨＴＬＶ
−Ｉ［／ＬＡＶの２種のｐｏｌｉ伝子生成子生成物わちｐ５３及びｐ６４に類似
している。
次の例で示すように、ウエンタンプロットを行なうことができる。培養物１〜３
からの無細胞ウィルス並びに基準細胞ラインからの５ＴＬＶ−１［［ＡＧＭウィ
ルスを上澄液から回収し、かつこれをバリン等の一般的技術によるウェスタンプ
ロット法にかけた。これらのストリップを、第８図に関連して記載したと同じ血
清試料と共に培養した。アフリカミドリザルからのＳ Ｔ ［、、−Ｖ−ｎｕ
抗体陽性基準血清は５ＴＬＶ−Ａ Ｇ Ｍ
”Ａ（うＭの０ｆ）３２、［）２４、［）５３及びｐ６４、並びに西ア“フリ１
】の売春婦から得た３種のウィルス調製物におけろ同様なバンドに対し反応性を
示し一ノた（第９図）。ＳＴＩ Ｖ−１］１−関ｊ中ウィルス（ＨＴＩ□Ｖ −
ＩＶ ）を生じた個人からの血清試料を用いＣ同様な蛋白が識別されたが、ただ
し］）１２０ｋＴ対する識別に若干の変動があった。比較抗体陰性血清は、４杆
のウィルス調製物のいずれに５これらのバンドを検出（７なかった。
第５〕図に示【ノたように、３種の［七Ｔ’ Ｌ Ｖ−ＩＶ細噌培養物（１〕−
ン１−３＞のウィルス調製物並びに５ＴＩＶ−ＩＩＩＡ（３を行なった。スｉ・
リップの各群を次のものと反応させた：西アメリカからの陰性血清試料：ｓ”ｒ
ｌ−ｖ−■及びトＩＴＬＶ−■に対し陰性のウィルス及び抗体：個人１からの５
ＴＬＶ−■抗体陽性血清；個人２からの５ＴＩＶ−Ｉ１１抗体陽性血清：個人３
からのＳ Ｔ ［−Ｖ−１抗体陽性血清；及びアフリカミドリザルからの基準Ｓ
ＴＩ Ｖ−１抗体陽性血清。
し免疫学上交差反応性であるが、現在のデータは各宿主において病原性を減少し
又は全く示さない。ＳＴＬＶ−ＩＡＧＭ。
１ｆ丁Ｌ Ｖ−ＩＶ又はその１部若しくは誘導体は、ＨＴ ｌ−Ｖ −ＩＩＩに
対（〕保護を与えるためのワクチンとしで使用することができるであろう。
特に、５−Ｔ−［−Ｖ−１１１又（Ｊｌ−（ＴＩ−Ｖ−ＩＶへ７チト抗原ＧＭ
の１〜リブシン分解ペプチド分析を用いて、１〜（ＴＩＶ−、−１に灼し交差反
応する抗原決定子を決定Ｊ−ることかできる。これらの決定子を含むポリペプチ
ドは、組換ＤＮΔ技術（こより処理された生物又は細胞を用いて合成することが
できる。得られたポリペプチドを回収ｉノかつ医桑十許容゛しうるキレリヤに含
ませ−（個人（こ接種し、ＨＴＬＶ−１感染に対し保護を与えるコとができル１
．特（ζ゛、ＳＴＩ Ｖ−’ＮＡ及ヒＨ１１Ｖ−ＮＶノ乱几ｙ蛋白の保存（きれ
たエピ（・−ブは、ＨＴ ｔ−Ｖ〜■／ＬＡＶワクチン開発に対するイミューノ
ゲンの（］芙補である。
ケオディー、ドリースマン及び工セックスＧこより１９８５年１０月２４日付け
で出願された「合成ベブブド及び診断に対するその使用、並び（こＡＩＤＳ及び
ＡＲＣに対するワクチン」と題する米田特許出願第７９０．８３０号をここ（、
−参考のためその全体につき引用し、その明細書は８丁［Ｖ−１１１又はト（Ｔ
ＩＶ−ＩＶのポリペプチド抗原に基づくワクチンを得るため（こ使用しうる１つ
の方法を開示Ｌ］でいる、２
Ｈ−Ｈ−Ｈ−１２３４５６７８９ｔｏ １１ １２ １３ａｂｏｂａｂｏｂａｂ
ｏｂｏｂｏｂ ｏｂａｂａｂａｂｏｂａｂａｂａｂＦＩＧ、６
国際調量報告
一呻＋ｉｌが１１ム酬師”” ＰＣＴ／ｌ］５８６１０！８３ []Includes all retroviruses.
Use it as you see fit. Applicants have shown that STLV-"AGM is virtually indistinguishable by general immunological techniques and that, like 5TLV-, it produces AIDS- or ARC-like symptoms in infected humans. We have identified a human virus, HTLV-IV, that appears to be unique to humans.The term HTLV-IV is based on the strength of immunological cross-reactivity and
Used to indicate a virus that is immunologically more closely related to 5TLV-III than to HTLV-nu, as indicated by the spread (number of determinants identified). The term HTLV-IV is used for convenience to describe the human virus, but does not necessarily imply a difference between 5TLV-1 and HTLV-1v. The discovery and characterization of 5TLV-III and HTLV-IV (7) is important in several aspects. First, 5TLV-III and HTLVIV-infected cells generally provide a source of antigenic determinants useful for analysis of monkey or human samples as described below. Second, there are animal species that are particularly at risk for 5TLV-In infection, viz.
Green monkeys are used for research and development of various biological reagents. For example, African green monkey tissue is used to produce oral polio vaccines. A disease similar to AIDS is caused by 5TLV-I [1] polio vaccine produced from infected animal tissue or
It is desirable to reduce the chance of inadvertent transfer to other products (but
However, this does not seem to occur). Third, although 5TLV-1 and HTLV-IV do not appear to cause disease in infected young GM or humans, they are immunologically cross-reactive with disease-causing HTLV-III; Vaccines based on 5TLV-I [[ or H TLV-IV will show protection against AIDS. Accordingly, a first aspect of the present invention generally relates to the use of 5TLV-In or l-(TLV-IV-infected peptides and assays using them). Substantially pure polypeptides having at least one antigenic determinant that is substantially identical to the protein antigenic determinant from the cell line.
and the protein is selected from: (a) about 160,000 Da;
Glycoprotein with molecules ffl (m, W, ) of Daltons: about 120,000 Glycoproteins with m, w, of Daltons: about 55,000 Coac+ proteins with m, w, of Daltons: about 24,000 Daltons a qag protein with an m, w of about 32,000 Daltons; and a glycoprotein with an m, w of about 32,000 Daltons. Here, the expression "a polypeptide having an antigenic determinant that is substantially identical to a protein antigenic determinant" means: (a) is a polypeptide that consists of an antigenic determinant that reacts with a protein antigenic determinant with a given antibody;
= (b) means a polypeptide that can be obtained by (i) isolating a naturally produced protein or a fragment thereof, or (ii) synthesizing an amino acid sequence identical to the protein antigenic determinant.
(e.g., by DNA expression or chemical synthesis according to the general methods of Chank et al. (1985), Nature, Vol. 3, 15, p. 151). Below
Although the 5TLV-I and 1-ITLV-IV cell proteins described below are immunologically cross-reactive with HTLV-III cell proteins, they are immunologically cross-reactive with STL V-Ill or HTLV-IV proteins. The reaction with a given antibody is different compared to the reaction with the same antibody with the corresponding HTLV-I[I protein. Therefore, 5TL V-In and HTLV-IV antigenic determinants are substantially identical for purposes of the present invention.
However, the 5TLV-1 and 1-ITLV-IV determinants t, t(, I"tL are also not substantially identical to the HTLV-determinants. Preferably, the polypeptide antigenic determinant is a 5TLV-preferably polypeptide
The polypeptide is one of the above-mentioned proteins or a fragment thereof, particularly preferably this polypeptide is
Qp32 or Qp160 or (H)120 glycoprotein in lycosylated or non-glycosylated form. Furthermore, preferably the polypeptide is not substantially cross-reactive with HTLV-1/LAV glycoprotein D41. Additionally, this port
The lypeptide antigenic determinant has a stronger reactivity against the 5T LV-In or HTLV-IV glycoprotein determinant than against the HTLV-III glycoprotein determinant.
shows responsiveness. Other useful polypeptides with the necessary immune determinants are synthetic polypeptides.
Includes chido. The polypeptide according to the first aspect of the present invention is particularly suitable for culturing a sample with the polypeptide.
T-lymph gambling by determining whether immune complexes are generated.
It is useful for analyzing for the presence of antibodies against viral antigens. Furthermore, the polypeptide may be used to separate biological samples (e.g., human or monkey) for the presence of antigenic determinants that are immunologically cross-reactive with one of the four proteins described above.
It can also be used to generate antibodies useful for analysis. This analysis is performed by incubating the sample with the produced antibodies and determining whether immune complexes are produced. The determinants to be analyzed are the above proteins themselves or other polypeptides.
It can exist in They circulate freely in body fluids or lymphocytes. this minute
The analysis can be performed by known immunoassay methods using monoclonal or polyclonal antibodies that are immunoreactive with antigenic determinants found in the above proteins.
Ru. For example, a competitive immunoassay or an immunoassay (sandinch) assay can be used. Although the front page analyzes are preferably performed on monkey samples, they can also be performed on human samples. Analysis of Monkey Samples While the first aspect of the invention features analyzes that can be performed on human samples as well as monkey samples, there is a second aspect of the invention that specifically features analyzes on monkey samples. In this respect, analysis of antibodies to viral antigens can be carried out in the same way as described above, but a wider variety of polypeptides can be used. In other words, the second side is
The present invention is not limited to the analysis of antibodies using polypeptides that have antigenic determinants that are "substantially identical" to a protein that has been identified. These analyzes are performed on one of the five STLV-1 or HTLV-IV proteins, regardless of whether the polypeptide determinant is "substantially identical" to the protein determinant. Any polypeptide having antigenic determinants that are immunologically cross-reactive with species determinants is used. Polyhep used for analysis of the second surface) i' HTLV-1, HTLV-IV or
5TLV-IV). The polypeptide used in the second side analysis was a glycosylated polypeptide described in U.S. patent application Ser. Includes proteins (glycosylated or non-glycosylated). The anti-idiotype reagent is immunologically cross-reactive with sites on the antibody.
It has been shown to be useful for detecting
982), Vol. 215, pp. 1637-1637]. Therefore, this type of anti-idiotypic antibody (or genetically active fragment thereof) can be used against the 5TLV-I11 virus.
can be used to analyze the presence of antibodies against antigens. In particular, this may affect the activity of 5TLV-I [1 or HTLV-IV infected cell proteins].
Includes antibodies or fragments thereof that are anti-idiotypic against sex determinants. This type of anti-idiotypic antibody can be raised against antibodies to the protein. Preferably, monoclonal antibodies are used. Additionally, a second aspect of the invention provides a method for treating polypeptides that are immunologically cross-reactive with one of the five proteins of 5TLV-III or HTLV-IV infected cells, as generally described above. together with the produced antibody (preferably monoclonal antibody).
By incubating the sample in
It is characterized by analyzing a sample. Preferably, the antibody is 5TLV-In young.
or against proteins of cells infected with HTLV-IV, particularly gp32, C1p120 or 0p160 of this type of cell. Vaccines Finally, in a third aspect, the invention features a vaccine consisting of a peptide fraction of these molecules reactive against 5TLV I[lAGM, de, eg cip 12o or 0p160, or HTLV-I[I. This can be present in a pharmaceutically acceptable carrier. Additionally, the vaccine may also contain proteins from STLV-III or ) (TLV-IVr infected cells GM) or altered forms thereof. Other features and advantages of the invention are described below with respect to preferred embodiments. DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS First of all, a brief description of the drawings will be made. Figures 1-8 show radiolabeled 5TLV-I [1 or HTLV-IV]
Figure 9 is a photograph showing the immunoprecipitation of various serum samples by preparation of stained cell lysates using SDS/PAGE; It's a photo. , Obtaining the Proteins These proteins are isolated from cell lines infected with 5TLV-I[1 or HTLV-IV. Reference 5TLV-I[1 and HTLV-IV cell lines]
In was derived from co-culture of infected lymphocytes and HLIT-78 cells. The HUT-78 cell line was reported in Gazter et al., Blood, vol. 55, p. 409 (1980); Poyez et al., Proceedings National Academy of Sciences USA 1, vol. 77, p. 6815 (1980). well-characterized
This is a mature human T-cell line. These two HLJT 78/5TLVI [IAGM cell lines have been deposited with the American Type Culture Collection and have been assigned ATCCNQCRL 8942 and 8943. HTLV-IV/HUT-78 cells 7-1' have been deposited with ATCC No. VR2129. Suitable proteins can be genetically mapped and then these proteins
White could be created by genetic engineering. A preferred protein is the gp160/120 glyc-1 protein, which can be synthesized by dodecyl rAIW t t = lium polyacrylamide glue electrophoresis (S[,,')S/PAGE), li-nawaraglu electrophoresis! It has a molecular weight of approximately 120,000 glutone and 160,000 daltons, as measured by 1, and these proteins are composed of 0.15 N4 1 - 1 ~ Li and 0.051 Jl... ) H7,2 and '1 Solo 1...S]--N X100 and 1% deoxycholic acid
1 helium and 1mM fluoride-noenyl medillus
It is soluble in an SDS buffer consisting of Ruphor, -R. 1. Lido-NX, -100 is a non-ionic surfactant (Octyl Fair/XypolyT Toxy (9i0) ethanol). 160,000 types of non-glycoproteins
The zylated component has a molecular weight of about 90,000 daltons and is immunogenic, sharing with the glycoprotein whites a species of antigenic determinants. Other types of cell line bS bottom! V-111 or l-(TI-V-1) can be infected with 3, especially +(910 cells, NC37 cells, (root 3 cells)
Cells, [1-4 fill cells and CEN cells may be mentioned. New Nako
The exact dimensions of these glycoproteins differ slightly (C) in different cell lines (−,
It appears that the common immunological cross-reactive parts of the coproteins are the same regardless of the cell line. Because 1. :m it is a protein induced by TLV-IV. Thus, any virus-bearing cell will have the appropriate amount of the new glycoprotein. In order to obtain proteins from infected cells that contain viruses, these cells must be metabolized.
(e.g., with 335-cysteine), and with antisera obtained from ST[--infected animals or HT'I V-IV-infected humans. These glycoproteins
White indicates lysis of infected cells by 171 non-chilledin affinity.
You can create it from a solution and run it on SOS,.../PAGE. L': For example, these glycoproteins 6/S-t, -, v-m-t, < 1. tHTLV-IV-infected cells") -1'/L: present
Exists. 1-IUT78 cells can be infected with fresh virus isolates from young infected animals or humans. Glyco 1 protein is expressed in these cell lines.
It is possible to easily separate and cover C8 by its dissolution and SDS gel electrophoresis. The purified and isolated protein or any antigen that is cross-reactive to this antigen is used as a standard antigen, and the presence of antibodies that are 2 to 7 isomeric. Can be used in any conventional analytical procedure for detection in biological samples.
(Therefore) infected with 5TL-\/-1ll or HTLV-IV.
It can also be used to detect the presence of cells in a sample. Glycoproteins or polypeptides that are immunologically cross-reactive to them can be prepared using conventional methods.
1125 or 335 or H3 for use in radioactive Q4 immunoassays depending on the order.
or with fluorescin for fluorescent immunoassays, or with enzymes for enzyme immunoassays.
or with avidin for avidin binding analysis. This can be done using a competitive immunoassay or a dual antibody assay using two antibodies, if desired.
Used in body analysis, e! , may be marked or unmarked; in either case, the
Anti-idiotype: antibodies of the anti-idiotype type can be used, or a second antibody type can be used, especially anti-Fc antibodies, or can be used in other assays.
Ru. Alternatively, these glycoproteins or polypeptides that are immunologically cross-reactive with them
The compound can be immobilized on an insoluble phase, such as an insoluble resin, and can also be
Detection of coprotein antibodies can be carried out by measuring their binding to the insoluble phase. The insoluble phase contains mostly latex particles, which contain the novel glycoprotein or its immunosorbents.
coated with epidemiologically cross-reactive polypeptides and can aggregate when exposed to anti-glycoprotein antibodies.
collect. In addition, other insoluble phases include test tubes, test bottles, titration wells, etc., to which the novel glycoprotein or its immunologically cross-reactive polypeptide can be bound, and to which antibodies can be raised. by heavy antibody technology or protein-A dependent technology.
can be detected. S T L V-Ill- or T (TL-V-IV-induced cell surface anti-
Analysis of antibodies that identify the original
glycoproteins or non-glycosylated components of 1 to 90,000 daltons.
Each is available in crude form, making it possible to use these proteins in substantially pure form.
but not limited to. For example, the glycoprotein can be first substantially purified and then mixed. Alternatively, cruder mixtures can also be used. The components necessary to perform the above diagnostic methods can be included in a kit. Kits of this type include a carrier compartmentalized to accommodate one or more containers, each of which contains one or more of the components necessary to conduct the test. For example, the first container contains purified glycoproteins or their immunologically cross-reactive polypeptides.
One or both of the compounds can be present in detectably labeled or insolubilized form. The second container contains polyclonal or monoclonal anti-19G antibodies useful for double antibody binding analysis, or glycoproteins or their immunologically cross-reactive polypeptides.
Containing the necessary components (e.g., a chromogenic substrate) to detect the label in the peptide
I can do it. Other containers contain different amounts of glycoproteins or their immunology - cross-reactive polypeptides.
can be used to create a standard curve that can be used to interpolate experimental results.
I can do it. These materials can also be present in the kit neat or as a solution or lyophilized or mixed with other inert substances such as, for example, inert proteins. Biological samples tested include blood, serum, lymphocytes, urine, tissue, saliva, feces, etc. Of particular interest is the anolycamitriza that should be used in vaccine production.
The following specific examples are intended to fully illustrate the features of the present invention without limiting the scope of the invention. Examples 1 and 2: 5TLV-I[1 antigen Figure 1 shows glycoprotein preparations of HUT-78/5TLV-III (lane a) AC and uninfected comparative HUT-78 (lane b) and various monkey blood
It shows the reactivity with the supernatant sample. Glycoproteins were soluble in cells prepared with RIPA buffer as shown in Figure 2 below, lacking sodium deoxycholate.
made from cell lysate. The lysate is passed through a ratio of lentil-lectin-cefcephas C1-48. Glycoproteins were added to buffer [0.15 M Naα, 0.05 M Tris HCf! , pH 7, 2, 1% Triton X-100 and 0.2N methyl-α-D-mannoside]. The eluted bound fraction is reacted with 10μ2 of test serum that has been previously reacted with proteinase [e.g.
Co. used in the general technique described in Sex et al. (1983), Science, Vol. 220, p. 859. The serum used was as follows. Lanes 1 and 2: Human reference HTLV-, positive serum; Lane 3: Human reference HTLV-III, negative serum; Lanes 4 and 5: 5TLV-II positive macaque serum; Lane 6: 5TL V-nl negative macaque serum. Proteins were eluted from the beads by boiling the immunoprecipitate at 100°C for 2 minutes [sample buffer 20, 1 Cleland's reagent; 2% SDS; 0.08M Tris-HCl: pH 6,8: 10% glycerin]. :0.2% bromophenol blue]. Samples were analyzed using SDS using a 10.0% acrylamide resolving gel and a 3.5% stacking gel according to Laemmli's discontinuous buffer system [Laemmli (197Q), Nature (London), Vol. 227, p. 680]. /PAGE
Analyze more. In Figure 2, HtJT-78/5TLV-I [IMAC (lane a) and HUT-78 (lane b) were harvested at the peak of logarithmic growth phase and [S35] system.
(New England Nuclear Co.) for 8 to 10 hours. Cells were soaked in RI PA buffer [0,15M NaCf! , 0.5 Tris-HCJ! , pH 7.2, 1% sodium deoxycholate, 0.1% 5C3I.
Make one soluble cell lysate. The lysate is then centrifuged for 1 hour at ioo, ooog. The lysate is reacted with the following test sera: lane 1: monoclonal anti-1)24 (HTLV-I[1); lanes 2 and 3: human reference HTLV-I, positive serum: lane 4: human reference HTLV -III, negative serum;
Lanes 5 and 6: Macar standard 5TLV-I11 positive serum: Lane 7: Macar
Kusal reference 5TLV-I11 negative serum. In both Figures 1 and 2, 5TLV-1-infected macaque serum identifies gpi20AC/gl)160 proteins in 5TLV-I-infected cells. Example 3: As shown in Figure 3, the procedure described in Example 2 was carried out on HTLV-1-infected H9 cells, with lanes 1-5 being replaced by those described in Figure 2 as lanes 1-5. blood
A representative macaque serum negative for 5TLV-I is used in lane 6. Example 4-6 STLV-I [5TLV-I [1] detected in monkeys by 1-cell protein. The above procedure was performed: lane (1) monochrome
null anti-p24 (1-ITLV-I[1): Lane (2) Human reference serum positive for HTLV-I[1: Lane (3) Human reference serum negative for HTLV~: Lane (4) STLV -I [ Human serum negative for STLV-1: Lane (9) Chimpanzee serum negative for STLV-1. The 160.120.55 and 24 kd viral antigens of 5TLV-I[1 were
Immunoprecipitated by Kirk monkey serum and TLV-1 [1 positive serum.
This shows the protein expression. Cell cultures from these monkeys were obtained by co-culture with UT78 cells. Cell cultures were metabolically labeled with 335-cysteine and RIP-3 DS/PAGE of whole cell lysates was performed using We performed: (a) AGM serum samples positive for STLV-1 antibodies; (b) AGM serum samples negative for STLV-1 antibodies; (C) AGM serum samples positive for TLV-I11 antibodies from humans with AI DS-related complexes; reference blood
Clear sample. The lane labeled C shows similarly labeled HUT78-uninfected cells. In particular, cells from the above culture were treated with [335]cysteine [-150Ci/ml; specific activity 1000-1050Ci/mmol:
(NEN)] for 4 to 6 hours. RIPA buffer [0.15M Nap, 0.05M Tris-HCl, pH 7, 2, 1% sodium deoxycholate
Soluble cell lysates were made by disrupting cells with 5C3I and 0.1% 5C3I and clarified by centrifugation at 100,000c for 1 hour. Each group of cell lysates was separated from Protein A-Sepharose CL-4B (Protein A-Beads, Sig.
The test serum was reacted with 10 μe of test serum conjugated to A. Immunoprecipitates were prepared in 0.1M Cleland's reagent, 2% 5DS10.08M1-Lis-HCl1. Elution was carried out by boiling at 100°C for 2 minutes in a sample buffer containing 10% glycerin and 0.2% bromophenol blue, pH 6.8. These samples were processed using the discontinuous buffer system of Laemmle (1970), Nature, vol. 221, p. 680 for 3. A 5% stacking gel was used and analyzed on a 10.0% acrylamide resolving gel. As shown in Figure 5, lysates from all seven cultures (lanes 1 to 7) showed approximately 160 kd, It showed bands of 120kd, 55kd and 24kd. The same bands were seen for lysates from uninfected HUT78 cells; Infected cells 18 were removed from the food, and the cells lacked antibodies against the S-r l-, V-river.
From the Rikamitri reel to the representative fun, anti-F1 piece\sel, second fJ: f:) inspection
It was served for 4 hours. Serum from patients (61,551 < d and 24 kcj ton white, lysate prepared from lotus plants 1-7, and lysate prepared from lotus plants 1-7 (9 1, approximately 120 kd) and 160 kd protein (7:1), which was only reactive with 4:L,'7, but the same band was absent in uninfected +-iUT7s cells. Isolation of viruses
Serum sample from Drizal (C=) shows immunoprecipitated cell lysate prepared from STL V-III still cell line 1) and uninfected ΔGM ToIU7ε3 cells (lane 1=7). Reacted to i4k. S-1[-V-III (Isolate 1) Infection (Lane GM a) 7i, (Mon-(tJT78 terminal S(1)) b) Cell lysate t, h Note 2, prepared similarly 1 = 1+ is HTLV-III antibody positive i- △11) S young (-tuk&ni A contains serum samples from RC patients, lane) f- - is Kano/, J: tU comparison Contains antibody-negative human serum, 1None 1-・-7
Isolates 1-7 were serum samples from African green monkeys obtained; Lane 13 is a representative serum sample from an African green monkey that was positive for antibodies directed against STLV-III MAc. . As shown in Figure 6, serum from virus-positive animals specifically precipitated qp160/120, whereas only 33 of these serum samples specifically precipitated qp55 and qp55. F) 24L showed overlapping reactivity with 1σ:1, and analysis of 4F/l serum showed the same phenomenon, with 42 STI v-m positive sera in J. Eleven GM types (26%) of the samples were Q[)160/1204. , : Reactivity to i! . GJ'II) 55 and p24 cJ (). The protein C1 (-) is clearly the most immunogenic type in infected monkeys (J). V-III positive GM ↑1 sera were analyzed by U<I P/5i-) S-PAGE for antibodies against HTLV-III, . 50% showed reactivity with 1-1TL V-[1 protein C=[].Another diagnostic assay was performed to detect this cross-reactivity, in which the same serum samples were tested with v-iut: [[Analyzed by ISΔ (Engineering L/'/h Ronuku 177j -, :m Tsukusuri). To S T L V-III AG. Virus and antibody positive monkeys were analyzed by eight serum samples. Five types of samples (42 and RI) were detected by SO3/PAGE, and antibodies against 1-ITIV-III protein were detected by ELISA. species was detected as 1-1' T-LV-Ill positive. Therefore, the presence of antibodies against the 5llV-111 specific protein appears to be most closely associated with virus isolation. RIP and SDS/PAG [Analysis is performed using
Compared to ELIS
Humans appear to be more sensitive to the detection of differentially reactive antibodies. Example 7 Serum samples from healthy individuals (prostitutes or surgical patients) were obtained in Dakar, Senegal, and screened for cholera by commercially available HTLV-111/LAVE [ISA kit analysis.
-ning. FLISA-positive samples were processed by RIP/SO3/PAGE as generally described above.
False positives were eliminated by further analysis. Positive samples showed strong reactivity against all sTL V-m viral antigens including p24, p55 and g0120/ql)160. Only 27% of these samples showed reactivity to the HTLV-III/LAV antigen. Some of these samples showed no detectable antibodies to the major HTLV-III/LAV antigens, whereas others showed antibodies only to p24 and p55Qag related antigens. In all cases, the reactivity towards TLV-IIIGpI 20 and ( )p160 was similar to that of 5TLV-111Qp120/160.
The reactivity was weak compared to the reactivity, or it did not exist at all. Western blot using the general technique of Zarani Balin et al., Lancera 1~, Vol. 11, pp. 1387 et al. (1985).
It lacked detectable antibodies to qp41 when analyzed with the Row 1~ assay. Representative serum samples from these West African natives are shown in Figure 7.
Comparative serum samples from body-positive African green monkeys are also shown. Especially in West Africa.
Serum samples from living humans were analyzed by RIP-3DS/PAGE using whole cell lysates as follows. HTLV-1 (BH10 virus) infected malt-3 cells, uninfected malt-3 cells, to (UT~78 infected 5TLV-Ill and
Uninfected and uninfected Malt-3 cells or GM cells were harvested at the peak of logarithmic growth phase and treated with (S35) cysteine (-150Ci/mI: specific activity 1000-105()Ci/mmol, new incubator).
Grand Nuclair (NEN)] for 4-6 hours. Create a soluble cell lysate by disrupting cells with RIP A buffer [0,15M NaG, 0.05M Tris-t (02, pH 7, 2, 1% sodium deoxycholate and 0.1% SDS]), Each group of cell lysates was clarified by centrifugation for 1 hour in ioo, ooog. (Lanes 1 to 2) African green monkeys positive for STI V-1 antibodies; (Lane GM 3) Healthy West African monkeys with antibodies against STI V III Aa M
(Lanes 4 to 8) Sera from West African prostitutes seronegative for STLV-1: (Lane 9) GM prostitutes seronegative for 5TLV-1 and HTLV-1 from West Africa: and (L) )-10) Comparison of healthy West African seronegative subjects for STLV-III and [)'HTLVGM-m. Immunoprecipitates were mixed with 0.1 M Cleland's reagent, 2% SDS, and 0.08 M Tris-H Q!, Contains pH 6.8, 10% glycerin and 0.2% bromophenol blue.
Elution was performed by boiling the sample buffer at 100°C for 2 minutes. These samples were loaded with a 3.5% stacking gel according to Laemmli's discontinuous buffer system for 10. Analyzed on O% acrylamide resolving gel. Example 8 Isolation of HTLV-IV To isolate HTLV-IV, peripheral blood lymphocytes were obtained from eight 5TLV-AGM antibody positive humans and cultured with HUT-78 cells. Wi
The procedure for pulse separation is generally the same as described above for the 5TLV IIIAGM.
Or as described in Kanki et al. (1985), Science, Vol. 230, p. 951.
The procedure is similar to that listed. Of note, no in vitro cell degradation of target cells was observed. Therefore, HUT-78 cells were added once to each culture on day 5. Irregular and multi-celled giant cells appeared after 21 to 28 days of culture. From day 14 after initiation, all cell cultures were monitored for viral protein expression by membrane immunofluorescence (MIF) and RIP-8D S/PAGE as described above, with ST LV-IIIAGM, HTLV I[ Reference sera showing known antibody reactivity to I/LAV and HTLV-I viral proteins were used. After 28-35 days of culture, 5 TLV-III related viral proteins were detected in the three cultures by both MIF and RIP-3DS/PAGE. Cell-free supernatants from these three cultures were collected as described by Bopowicz et al. (1984),
The MCI+-dependent reverse transcriptase as previously described by Enns, Vol. 224, p. 497 and Sarafzin et al. (1984), Science, Vol. 224, p. 500, was monitored. 3.500 to 93.000 counts per minute (cpm) relative to background (76 to 860 cpm) were observed in three cell cultures expressing 5TLV-1 viral proteins and negative for viral proteins. It was not observed in the culture. Cell cultures showing antigenic cross-reactivity to 5TLV-I[1 were examined by electron microscopy. Particles characteristic of retroviruses are seen budding from the infected cell membrane.
It was noticed. Extracellular virus particles are present in monkey and human T-lymphoid viruses.
It showed an electron-dense cylindrical nucleus similar to that described above. The ultrastructural morphology of retroviral particles observed in all three cultures obtained from 5TLV-1 antibody-positive humans in West Africa was similar to that of 5TLV-III virus particles obtained from both A.
It is noted that Pike protein was more prominent than commonly observed in HTLV-III/LAV virus particles. West Africa 5TLV-I [I related Will
Virus production levels from virus cultures are determined based on both visual inspection and reverse transcriptase activity.
The results were similar to those observed in 1-(TLV-I/LAV-infected H9 cells. Example 9 HTLV-IV(7) Anti-a (7) Identification As shown in Figure 8, three types of Total cell lysates from 1-I TLV-IV cell cultures (lanes 1-3), 5TLV-IIIΔGM standard infected HUT-78 (S) and uninfected HUT-78 cells (c) were
It was prepared in the same manner as described above and analyzed by RIP-3DS/PAGE as follows. Each group of cell lysates was reacted with the following test sera: negative serum sample from West Africa; virus and antibodies negative for 5TLV-III and HTLV-I [1; 5TLV-111 antibody positive serum from individual 1 :5TLV-I from individual 2 [1 antibody positive
5TLV-III antibody-positive serum from individual 3; reference 5TLV-III antibody-positive serum from a African amitoris monkey; and reference HTLV-I antibody-positive serum from an AIDS patient. Serum from a negative control individual that lacked antibodies to both TLV-5 and HTLV-I [1/LAV (7) did not identify specific proteins in any of the five lysates. Conversely, lysates from 5TLV-[1-positive cultures 1.2 and 3 were reacted with their own serum or serum from reference 5TLV-III antibody-positive African green monkeys (lanes 1.2 and 3). It showed bands of approximately 160, '120.55 and 24 kd. These bands are derived from whole cell lysates of reference 5TLV-I [1].
indistinguishable from a protein with similar electrophoretic mobility precipitated from lysate GM (lane S).
won. These bands were generated similarly using the same serum from uninfected HUT-78 cell lysates (lane C) or from cultures obtained from antibody-negative humans from West Africa.
It could not be detected when reacting with whole cell lysate. Sera from reference U, S, AIDS patients discriminated between the 55 and 24 kd proteins of STLV-IIIAGM and reacted similarly to the same proteins in cultures 1-3. Very little reactivity was observed towards the high molecular weight protein gp120/160. As shown in Figure 9, the viral antigens of 5TLV I [IAGM were p24, p15, p53, p64, (H)120 and
and C] p32. p24 and p15 (although gag-related) are similar to similar viral proteins of HTLV-III/LAV. The 120 kd protein has been demonstrated in some 5TLV-III and HTLV-IV antibody positive serum samples. This protein is often barely detected by Western blotting but is detected by RIP-8DS/PAGE.
It appears to be more similar to HTLV-I/LAV 0p120, which is easily detected in HTLV-I/LAV antibody-positive samples. The 32 kd protein using the Western blot technique of Ballin et al., The Lancet, Vol. 11, p. 1387 (1985).
A clear band was detected using the lentil-lectin preparation and RIP-3DS/PAGE.
This correlates with the similarly occurring 32kd glycoprotein observed in The p32 protein is similar to the two poli gene product products of HTLV-I[/LAV (7), p64 and p53 of HTLV-IV, p53 and p64. A Wenthan plot can be performed as shown in the following example. Cell-free virus from cultures 1-3 as well as 5TLV-1 [[AGM virus] from the reference cell line.
The supernatant is recovered from the supernatant, and this is Western-produced using common techniques such as valine.
I applied the lot method. These strips were filled with the same blood as described in connection with Figure 8.
were incubated with the supernatant samples. ST [,, -V-nu antibody positive reference sera from African green monkeys are 5TLV-A GM"A (UM0f)32, [)24, [)53 and p64, and Western African green monkey 1] Three virus preparations obtained from prostitutes showed reactivity to similar bands (Figure 9). A similar protein was identified using serum samples from individuals who had contracted the STI V-1]1-Kanzhongzhong virus (HTIV-IV), but only
]) There was some variation in the discrimination against 120kT. Comparative antibody-negative sera detected these bands in none of the four virus preparations (7). Viral preparations of 5TIV-IIIA (1) and 5TIV-IIIA (3) were performed. Each group of samples was reacted with: Negative serum samples from Western America: Viruses and antibodies negative for s''r l-v- and TLV-: 5 TLV-antibody positive sera from individual 1; 5TIV-I11 antibody positive sera from individual 2: ST[-V from individual 3 STLV-1 antibody-positive sera; and reference STLV-1 antibody-positive sera from African green monkeys.Although immunologically cross-reactive, current data indicate reduced or no pathogenicity in each host.STLV -IAGM. 1f-LV-IV or a part or derivative thereof could be used as a vaccine to confer protection against HT-III. [-V-111 or (Jl-(TI-V-IV to
The corresponding antigenic determinants can be determined. Polypeptides containing these determinants
Polypeptides can be synthesized using organisms or cells treated by recombinant DNA technology. 1.Special (ζ゛, STI V-'NA and human H11V-NV protein preservation) , Immuno for HT t-V~/LAV vaccine development
Yoneda Patent entitled "Synthetic Bebubud and its Use for Diagnosis and Vaccine against AIDS and ARC" filed on October 24, 1985 by Keodie, Driesman and Kosek G. Application No. 790.830 is hereby incorporated by reference in its entirety, the specification of which is incorporated herein by reference. one thing that can be done
2 H-H-H-123456789to 11 12 13abobabobab obobobobabababobabababFIG, 6 International Measurement Report 1 groan + il is 11 times the ruler"" PCT/l]58610!83