JPS63501263A - Methods and media for improving somatic embryo formation - Google Patents
Methods and media for improving somatic embryo formationInfo
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- JPS63501263A JPS63501263A JP61505569A JP50556986A JPS63501263A JP S63501263 A JPS63501263 A JP S63501263A JP 61505569 A JP61505569 A JP 61505569A JP 50556986 A JP50556986 A JP 50556986A JP S63501263 A JPS63501263 A JP S63501263A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 本出願は１９８３年５月１９日出願の出願番号（Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ、）４９６ 、１８６号の一部継続出願である。[Detailed description of the invention] This application was filed on May 19, 1983 and has application number (Serial No.) 496. This is a continuation-in-part application of No. 186.
関するものであり、さらに詳細には試験管内で体細胞組織から胚を分化Ｉｎする のに特に適した改良培地とその培地を用いる方法に関する。It relates to the differentiation of embryos from somatic tissue in vitro, and more particularly to the differentiation of embryos from somatic tissue in vitro. This invention relates to an improved culture medium particularly suited for use in culture and methods for using the culture medium.
背景の技術 最近の遺伝子工学の進歩によって、植物の品種改良をする省は、昔からの品種改 良技術に固有の長時間貸やすことを避けることができるようになってきた。しか しこれらの新技術を適用するには困難な点が残っている。これは、単細胞および 多細胞生物は、すべての遺伝情報を変えるのに異なった処理工程を必要とするか らである。Background technology Recent advances in genetic engineering have enabled the Ministry of Plant Breeding to replace traditional breeding methods. It has become possible to avoid the long-term rentals inherent in good technology. deer However, challenges remain in applying these new technologies. This includes single cells and Do multicellular organisms require different processing steps to change all their genetic information? It is et al.
微生物においては、のちの世代の細胞においても変更が再生されるという自信の もとに細胞レベルでの変更を行っている。In microorganisms, there is confidence that the changes will be reproduced in later generations of cells. Changes are made at the cellular level.
植物のような多細胞生物においては、細胞レベルで遺伝子操作を行ない、それか ら新しい特性を発現する成熟植物を再生し、育成すると有利である。例えば特定 の変更を行なうためのプラスミド挿入、または遺伝子全体を操作するためのプロ トプラスト融合などによって外来の遺伝物質は宿主細胞に組み込まれる。さらに 成熟植物を用いる従来の植物品種改良技術による遺伝子操作も農業上有益な植物 品種に新しい特性を組み込むのに用いられる。［ジョン ワイリー アンド ザ ンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙａｎｄ ５ｏｎｓ） ニューヨーク（１９６０年） 刊行のアラート、ア（Ｌａｎｇｍａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ、） ｏンドン（１ ９７２年）刊行のシモ植物の細胞および組織の試験管内培養では、培養物は栄養 分を与え、生育力を維持させる培地中に置かれることが必要である。一般に用い られる組織培養の培地の例がティシュ−カルチャー アソシエーション（Ｔｉｓ ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ） 、メジｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）第３巻第５３９頁−５４８頁のファ ング・１ル（Ｈｕａｎｇ、 Ｌ、）及びティー・ムラシゲ（■、ＨｕｒａＳｈｉ ＯＱ）著プラント ティシュ−カルチャー メディア：メジャー コンスティチ ュエント、ゼア ブレバレージョン、アンド サム アプリケ、−ションズ（Ｐ ｌａｎｔ Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ ： Ｍａｊｏｒ Ｃｏｎ ５ｔｉｔｕｅｎｔｓ、 ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｐａｒ−ａｔｉｏｎ ａｎｄ ５Ｏ ＩＩｌｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）及びユニバーシティ オブ ニューイン グランド プリンタリー（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｒ１ｎｔｅｒｙ）、オーストラリア、ニューサウスウエールズ州アーミデー ル（１９７６年）刊行 デ フォラサート、７−）Ｉ、ｔ−エイ（ｄｅ Ｆｏｓ ｓａｒｄ、 Ｒ，Ａ、） 名−ｊ＜シュー ゛カルチ・シー フォア ブラン］ ・ ブロパゲーターズ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｐａｇａｔｏｒｓ）などにおいて概説されている。この培養ｌ１１ｍの維 持は植物、器官、１１織または細胞の培養において推奨される。In multicellular organisms such as plants, genetic manipulation is performed at the cellular level; It is advantageous to regenerate and grow mature plants that express new characteristics. For example, specific Plasmid insertions to make changes, or procedures to manipulate entire genes. Foreign genetic material is integrated into host cells, such as by toplast fusion. moreover Genetic manipulation using conventional plant breeding techniques using mature plants can also produce agriculturally useful plants. Used to incorporate new characteristics into varieties. [John Wiley and the John Wileyand 5ons New York (1960) Publication Alert, A (Langman Group Ltd,) Ondon (1 In the in vitro culture of cells and tissues of Simophytes (1972), the culture is They need to be placed in a medium that gives them a lot of moisture and maintains their viability. commonly used An example of a tissue culture medium that can be used is provided by the Tissue Culture Association (Tis). sueCulture As5ocation), Rockville (Rockvi lle), Medicine Manual) Volume 3, pages 539-548 Huang, L. and HuraShige T. OQ) Written by Plant Tissue Culture Media: Major Konstichi There Brave Region, And Sam Applique, -tions (P lant Ti5sueCulture Media: Major Con 5tituents, their preparation and 5O IIle applications) and University of New Inn Grand Printery (University of New England) Pr1ntery), Armiday, New South Wales, Australia Published by Le (1976) De Fossert, 7-) I, t-ei (de Fos sard, R, A,) name-j ・Bropagators (Tissue Cu1ture for Plant) Propagators) and others. The fibers of this culture l11m Recommended for culturing plants, organs, tissues or cells.
不定胚形成培養においては、一般に植物体細胞は栄養導されカルスとして知られ る無定形の細胞群を作出する。In somatic embryogenic culture, plant cells are generally vegetated into what is known as callus. Create amorphous cell groups.
このカルスは継代培養によって維持することができ、大量増殖が可能である。こ のカルスを更に誘導して分化させ、それによって成熟植物の有機組織および器官 を作出することができる。不定廊は他の既存の胚からの培養組織中でもまた形成 する。親の胚の範囲は未成熟の球状の段階のものから成熟したもの、発芽中のも のまで及ぶ。This callus can be maintained by subculturing and can be grown in large quantities. child The callus of the plant is further induced to differentiate, thereby forming organic tissues and organs of the mature plant. can be created. Adventitious corridors also form in cultured tissue from other pre-existing embryos. do. Parental embryos range from immature globular stages to mature and germinating stages. Extends to.
［ツァイトシュリフト フィール ブランツエンフイジオロギー （！ｅｉｔ、 Ｐｔｌａｎｇｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、）第１１１巻：第９５頁−１０４頁（１９ ８３年）中のルボット、イー（Ｌｕｐｏｔｔｏ、 Ｅ、）著ブＯバゲーション オブ アン エンブリオニックカルチャー オブ メジカゴ サテイバ Ｌｌ（ Ｐｒｏｐａｏａｔｉｏｎ ｏｒ ａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｄｉｃａａ。[Zeitschrift Feel Brandz Enphysiologie (!eit, Ptlangenphysiol, Volume 111: Pages 95-104 (19 BuO Vagation by Lupotto, E. (1983) Of An Embryonic Culture Of Mejikago Sativa Ll ( Propaoation or an embedded culture of Hedicaa.
５ａｔｉｖａｌ Ｌ、）参照］にのように、植物ｔｆｉｌＸ培養において、不定 胚は未分化カルスまたは既存の胚から生じる。In plant tfilX culture, indeterminate Embryos arise from undifferentiated callus or from pre-existing embryos.
かかる方法に°より、遺伝的変化はＩ胞または胚のレベルで影響され次の発育の 間それを維持し、同一の遺伝的特性を持つ完全な植物体を作出できる。これによ って、植物育種家は、植物の増殖時の通常の遺伝的障壁を避けることができ、か つ一層均一で有益な農作物を得ることができる。By such methods, genetic changes can be effected at the level of the I-vesicle or embryo and can be transmitted during subsequent development. It can be maintained for a long time to produce a complete plant with identical genetic characteristics. This is it This allows plant breeders to avoid the normal genetic barriers when propagating plants. It is possible to obtain more uniform and profitable agricultural products.
現在の技術を利用すると、不定胚形成の方法では１グラムのＩＢ胞から何千もの 植物をつくることができる。Using current technology, somatic embryogenesis methods can produce thousands of embryos from one gram of IB vesicles. You can make plants.
［ティー・エイ・ソープ（Ｔ、八、 Ｔｈｏｒｐｅ）１１２ ｍ、アカデミツク プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）刊行 プラント ティシュ−カルグ ーｔ −１９８１（Ｐｌａｎｔ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｊｌｔｕｒｅ−１９８１）第 ４５頁−１１３頁、１９８１年の中のエバンス、ディー・エイ（Ｅｖａｎｓ Ｄ 、 Ａ、） 、ダブリュー・アール・シャープ（ｗ、 Ｒ。[T.A. Thorpe (T, 8, Thorpe) 112 m, Academic Press (Academic Press) Published Plant Tissue Calg -t-1981 (Plant Ti5sue Cjlture-1981) No. Evans, D.A., pp. 45-113, 1981. , A, ), W R Sharp (w, R.
５ｈａｒｐ）及びシー・イー・フリック（Ｃ，Ｅ、 Ｆｌｉｃｋ）著グロウス アンド ビヘイビャー オブ セル カルチャーズ：エンブリオジエネシス ア ンド オーガノジエネシス（Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｏｒｇａ ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）参照］。これらの胚を発芽させ、成熟植物が発育し１ワる 温室または畑に移植することができる。植物育種家はこれらの植物を用いて、遺 伝学上有用な変種を回収したり各種のものをクローン的に増殖させて、植物育種 計画に使用する。5harp) and Growth by C.E. Flick And Behavior of Cell Cultures: Embryogenesis A Growth and behavior of cell cultures:embryogenesis and orga (reference: nogenesis)]. These embryos are allowed to germinate and a mature plant develops. Can be transplanted into a greenhouse or field. Plant breeders use these plants to Plant breeding by collecting genetically useful varieties and clonally propagating various species. Use for planning.
体細胞部分の培養組織から得られる胚的な組織の口と質を決定するのにいくつか の方法が知られている。不定胚のｐは胚の発育の段階と関連のある構造物の生産 量を決定することによって測定できる。［フジムラ、ティー（Ｆｕｊｉｍｕｒａ 、 Ｔ、）及びエイー’１ｍ］？ミネ（Ａ、にｏｍａｍｉｎｓ）著シンクロニゼ イション オブ ツマチック エンプリオジエネシス イン ７ カロット セ ル サスペンション カルナｔ −（Ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ−ｏｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ ｃａｒｒｏｔ ｃ ｅｌｌ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）、プラント フィジオＯシイ （Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏΩＶ）第６４巻：第１６２頁−１６４頁（１９ ７９年） ；ヴエルマ、ディー・シー（Ｖｅｒｍａ、 Ｄ、 Ｃ，）及びディー ・ケイ・ドウガル（Ｄ、に。Several methods are used to determine the quality and texture of embryonic tissues obtained from cultured tissues of somatic parts. method is known. In somatic embryos, p is the production of structures related to the stage of embryonic development. It can be measured by determining the amount. [Fujimura, Tea , T,) and A'1m]? Synchronize by Mine (A, Niomamins) Ision of Tumatic Empriosiesis in 7 Carrots Le Suspension Karnat - (Synchronization of somatic embryo-oenesis in a carrot c ell 5uspension culture), plant physiotherapy (Plant physioloΩV) Volume 64: Pages 162-164 (19 79); Verma, D. C. and D. ・K. Dougal (D, to.
Ｄｏｕｇａｌｌ）著 インフルエンス オブ カーボハイドレーツ オン イオ ンティタテイブ アスペクツ オブグロウス アンド エンブリオ フォーメー ション イン ワイルド カロット サスペンション カルチャーズ（Ｉｎｆｌ ｕｅｎｃｅ ｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉ ｖｅａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ ｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ ｉｎ ｗｉｌｄｃａｒｒｏｔ ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒ ｅｓ）プラント フィジオロジイ（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）第５９ 巻二Ｍ８１頁−８５頁（１９７７年）参照］。この測定は解剖顕微鏡を使って生 物相ｆＪを計数することによって一般に行われる。Dougall) Influence of Carbohydrates on Io Intitative Aspects of Growth and Embryo Formation In Wild Karot Suspension Cultures (Infl uence or carbohydrates on quantity veaspects of growth and embryo form tion in wildcarrot 5uspension culture es) Plant Physiology (Plant Physiology) No. 59 See Vol. 2 M, pp. 81-85 (1977)]. This measurement is performed using a dissecting microscope. This is generally done by counting the physical phase fJ.
不定胚の品質は各種の方法によって評価することができる。胚の発達は一般に肉 眼で、球状、ハート形、魚雷型及び幼植物の段階をさがりことによって決定され る。The quality of somatic embryos can be assessed by various methods. The development of the embryo is generally Determined by ocular, globular, heart-shaped, torpedo-shaped and descending plant stages. Ru.
［アンミラト、ビー・ヴ＜、（Ａｍｍｉｒａｔｏ、 Ｐ、 Ｖ、）著 ジエフエ クツ オブ アブシジック アシッド オン ザデベロップメント オブ ツマ チック エンブリオズＩｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ５ｏＩＩｌａＮｃ ｅｍｂｒｙｏ ｓ ｆｒｏＩＩｌｃｅｌｌｓ ｏｆ ｃａｒａｗａｙ（Ｃａｒｕｍ ｃａｒｒｉ Ｌ、）） 、ボタニカル ガゼツト（ＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｚｅｔｔｅ）第 ′１３５巻、第 ３２８頁−３３７頁（１９７４年）参照］。[Written by Ammirato, V. Shoes of Absisic Acid on The Development of Tsuma Chic Embryo Opment of 5oIIlaNc embryo s froII cells of caraway (Carum carri) L,)), Botanical Gazette No. '135, pp. 328-337 (1974)].
胚の発達または質は、個々の不定胚から１ｑられる幼植物の生育数からも決定で きる。［トルー・アール・エル・ダブリュー（Ｄｒｅｗ、 Ｒ，Ｌ、 Ｗ、）著 ザ デベロブメントオブ カロット（ダウカス キャロタ Ｌ、）エンブリオ イズ（プライブト フロム セル サスペンションカルチャー〉インツウ プラ ントレツツ オン ア シュガーフリー ペイサル メディウム（Ｔｈｅ ｄｅ ｖｅｌｏ吐ｅｎｔｏｆ ｃａｒｒｏｔ （Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ、） ｅｍｂｒｙｏｉｄｓ （ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ５ｕｓｐｅｎｓ ｊｏｎ Ｃｕ１ｔｕｒｅ） １ｎｔｏ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ Ｏｎ ａｓｕｇａ ｒ−ｆｒｅｅ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ホーチ力ルチュラル リサーチ（ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）第１９巻、第１９頁（１９７ ９年）参照］。しかし幼植物の形成は、畑で使用するのに実際上必要な胚の生産 はを決める上で重要であるにもかかわらず、はとんど測定されていない。Embryo development or quality can also be determined from the number of plantlets produced per q from each somatic embryo. Wear. [Written by Drew, R, L, W. The Development of Carot (Daucus Carota L,) Embryo IS (Private From Cell Suspension Culture Intu Pla) Entretstu on a Sugar Free Paysal Medium (The de velo entof carrot (Daucus carota L,) Embryoids (derived from cell 5 uspens jon Culture) 1nto plantlets On asuga r-free basal medium), Hochi Riki Natural Research ( Horticultural Research) Volume 19, Page 19 (197 9)]. However, the formation of seedlings is the production of embryos that are practically necessary for use in the field. Despite its importance in determining , , is rarely measured.
胚の収伍を改善するための方法が開示されている。例えば、不定胚を形成するに は、胚形成を行なわせる培地中にアンモニウム源が必要である。［ハルベリン、 ダブリュー（Ｈａｌｐｅｒｉｎ、 Ｗ、）及びディー・エフ・ウエザレル（Ｄ、 Ｆ、 Ｗｅｔｈｅｒｅｌｌ）著 アンモニウム リクワイヤメント フォア エンプリオジエネシス イン ヴイトロネイチｖ −（Ｎａｔｕｒｅ）第２０５ 巻、第５１９頁−５２０頁（１９６５年）、ならびにウォーカー、ケイ・エイ（ ｗａｌｋｅ’ｒ、に、Ａ、）及びニス・ジエイ・サトウ、（Ｓ、 Ｊ、 ５ａｔ ｏ）著 モルフオジエネシス′イン カルス ティシュ−オブ メジカゴ サヂ バ：ザ ロール オブ アンモニウム イオンイン ツマチック エンプリオジ エネシス（ＨＯｒｐｈＯΩｅ−ｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｈｅｄｉｃａｇｏ ５ａｔｉｖａ ： ｔｈｅｒｏｌｅ ｏｆ ａｎ＋ ａｏｎｉｕｉ ｉｏｎ ｉｎ ５ｏｉａＮｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ） プラント セル ティシュ−オーガン カルチャー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１ｌ Ｔ ｉ５ｓｕｅ Ｏｒｇａｎ Ｃｕ１ｔｕｒｅ）第１巻、第１０９頁−１２１頁（１ ９８１年）参照］。はとんどの植物細胞培養培地はいくらかのアンモニウムを含 有しているから、高収量で高品質の胚を得るにはアンモニウム濃度を適当なレベ ルに調節することが重要であると考えられてぎた。A method for improving embryo convergence is disclosed. For example, to form a somatic embryo requires a source of ammonium in the medium to allow embryogenesis to take place. [Halbelin, Halperin (W.) and D.F. Wetherell (D. F. Wetherell) Ammonium Requirement Fore Empriogienesis in Vitro Neici v - (Nature) No. 205 Vol., pp. 519-520 (1965), and Walker, K.A. walk'r, Ni, A,) and Niss J. Sato, (S, J, 5at o) Written by Morphogenesis' in Callus Tissue of Medikago Saji B: The Roll of Ammonium Ionin Tumatic Emprioji Enesis (HOrphOΩe-nesis in callus tissue of Hedicago 5ativa: therole of an+ aoniui ion in 5oiaNc embryogenesis) Plant Cell Tissue Organ Culture (Plant Ce1l T i5sue Organ Culture) Volume 1, pp. 109-121 (1 981)]. Most plant cell culture media contain some ammonium. Therefore, to obtain high yield and high quality embryos, the ammonium concentration must be kept at an appropriate level. It has long been thought that it is important to adjust the
［ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）及びサトウ（Ｓａｔ、）の前記文献、ナラヒニウ エサレル、ティー ・Ｘ ７ （Ｗｅｔｈｅｒｅｌｌ、 ｏ、 Ｆ、）及びディ ー・ケイ・ドウガル（Ｄ、 Ｋ、 Ｄｏｕｏａｌｌ）著 ソーシズ オブ ナイ トロジエン サポーテイング グロウス アンド エンブリオジエネシス イン カルチＶ −ド ワイルド キャロット ティシュ−（５ｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｏｅｎ ５ｕｐｐｏｒｔｉｎｏ ａｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｍｂｒｙ ｏｏｅｎｅｓｉｓ １ｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｌｄ ｃａｒｒｏｔ ｔｉｓｓ ｕｅ） 、フイジオロジア プランタラム（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｔａ Ｐｌａｎ ｔａｒｕｎ）第３７巻、第９７頁−１０３頁（１９７６年）参照］。[Walker and Sat, supra, Narahiniu Wetherell, T.X 7 (Wetherell, o, F,) and Di - Sources of Nye by Kay Dougall (D, K, Douoall) Trosien Supporting Growth and Embryology In Culchi V - Wild Carrot Tissue - (5 sources of nitroen 5upportino arrow and embodiment ooenesis 1 cultured wild carrot tiss ue), Physiologta Plan Tarun) Vol. 37, pp. 97-103 (1976)].
植物細胞培養組織および成熟植物においては、アンモニウムとグルタミン又はグ ルタミン酸塩はｍｕによって容易に相互転化される。［オジマ・ケイ（Ｏｊ ｉ ｍａ、 Ｋ、 ）及びケイ・オーヒラ（に、０ｈｉｒａ）著、ニュートリショナ ルリクワイヤメンツ オブ カルス アンド セル ザスイヤーズ オブ プラ ント ティシュ−カルチャー１９８７ （Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｐｌａｎ ｔ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ −１９８７）第２６５頁−２７５頁（１９ ８７年）、ティー・エイ・ソープ（Ｔ、Ａ。In plant cell cultures and mature plants, ammonium and glutamine or Lutamate is easily interconverted by mu. [Ojima Kei Ma, K, ) and Kei Ohira (ni, 0hira), Nutritiona Requirements of Callus and Cell The Sears of Pura Frontiers of Plan 1987 t Ti5sue Culture-1987) pages 265-275 (19 1987), T.A. Thorpe (T.A.).
Ｔｈｏｒｐｅ＞ 、編ｔｉ、ユニバーシティ オブ カルガリ オフセット プ リンティング ザービセズ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＯｒＣａｌｇａｒｙ ０ｆ ｆｓｅｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ ５ｅｒｖｉｃｅｓ） ；ミツリン、ビー・ジェイ （Ｈｉｆｌｉｎ、Ｂ、Ｊ、）及びビー・エル・リ−（Ｐ、 Ｌ。Thorpe>, edited by University of Calgali Offset Linting Thervices (University OrCalgary 0f fset Printing 5 services); Mitsurin, B.J. (Hiflin, B.J.) and B.L. (P.L.).
しｅａ）著 アンモニウム アシミレージョン（八ｍｍｏｎｉｔ＋ｍａｓｓ；ｍ ＋＋ａｔ；ｏｎ） 、ザ バイオケミストリー オプ プランタ（Ｔｈｅ Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）、第６巻、第１９６頁−２０１頁 （１９８０年）、ビー・スタツク（Ｐ、 Ｓｔｕｍｐｆ）及びイー・フン（Ｅ、 Ｃｏｎｎ ） ｇ５集、アカデミツク プレス、（＾ｃａｄｅ１ｃ Ｐｒｅｓ ｓ、） ；ドウガル、ディー・ケイ（Ｄｏｕｏａｌｌ、 Ｄ、 Ｋ、 ）著、カ レント ブロブレムズ イン ザ レギュレーション オブ ナイトロジエン メタポリズム インプラント セル カルチャーズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｂ ｌｅＩＩｌｓｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｒ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｅｔａｂｌｉｓｍ ｉｎ ｐｌａｎｔｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ） 、プラ ント ティシュ−カルチャーアンド イツツ バイオテクノロジカル アプリケ ーション（Ｐｌａｎｔ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）タブリュー・パーツ、 （Ｗ、 ａａｒｚ、 ）イー・ラインハード（Ｅ、Ｒｅ１ｎｈａｒｄ）、及びエ ム・エイチ・ゼンク、（Ｈ，Ｈ，Ｚｅｎｋ、 ）’編集、スブリンガー フエア ラーク（ＳＤｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｏ） 、ベルリン 第７６頁−８１頁（ １９７７年）参照］。 植物の代謝においてアンモニウムがグルタミン及びグル タミン酸塩に対し近い関係にあることは不定胚形成におけるアミノ酸の効果に関 する組織的な研究の配録から認められる。ニンジンの細胞を用いた研究で、アン モニウムを植物ＩＢ胞培養培地から除外し、アミノ酸単独での不定胚形成に及ぼ す効果が試験された。［ウエザレル（Ｗｅｔｈｅｒｅｌ ｌ）及びドウガル、（ Ｄｏｕｇａｌｌ）著の前記文献参照；カマダ、エイチ（にａｍａｄａ、 Ｈ，） 及びエイチ・ハラダ（Ｈ，Ｈａｒａｄａ、）著 スタディーズ オン ザ オル ガノジエネシス イン キャロット ティシュ−カルチャーズ■、エフエクツ オブ アミノ アシツズ アンドインオーガニック ナイトロジエナス コンバ ウンズオン ツマチック エンプリオジエネシス（５ｔｕｄｉｅｓｏｎ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔ ｕｒｅｓ ＩＩ。ammonium assimilation (8mmonit+mass; m ++at;on), The Biochemistry Op Planta (The Bi chemistry of Plants), Volume 6, pp. 196-201 (1980), B. Stumpf (P.) and E. Hung (E. Conn) g5 collection, Akademik Press, (＾cade1c Pres s, ); Written by Douoall, D.K. Rent Bloblems in the Regulation of Nitrogen Metaporism Implant Cell Cultures (Current prob leIIlsin the regulation or nitrogen metablism in plantcell cultures), plastic Tissue Culture and Biotechnical Appliqué (Plant Ti5sue Cu1ture and its Bi otechnologicalApplication) table parts, (W, aarz,) E, Reinhard, and E. M H Zenk, (H, H, Zenk, )’ editor, Sbringer Fair Lark (SDringer-Verlao), Berlin, pp. 76-81 ( (1977)]. In plant metabolism, ammonium is converted into glutamine and glucose. The close relationship to tamates may be related to the effect of amino acids on somatic embryogenesis. It is recognized from the distribution of systematic research. In research using carrot cells, an monium was excluded from the plant IB vesicle culture medium, and somatic embryo formation with amino acids alone Its effectiveness was tested. [Wetherel and Dougal, ( See the above-mentioned document written by Dougall; Kamada, H. and H. Harada, Studies on the Or. Ganogienesis in Carrot Tissue Cultures■, FX Of Amino Asitsuz Andin Organic Nitrogenus Comba Unzuon Tumatic Empriosiesys (5tudieson the Organogenesis in carrot tissue cult ures II.
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓｃｏａ＋ｐｏｕｎｄｓ Ｏｎ ＳｏｍａｔｉＣｅＩＩ ｌｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ツアイトシュリフト フィール ブランツエンフ イジオＯギ−（Ｚｅｉｔ。Effects of amino acids and inorganic nitrogenouscoa+pounds On SomatiCeII lbryogenesis), zeitschrift feel brandzemph Zeit.
Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ）第９１巻：第４５３頁−４６３頁（ １９７９年）参照］。ウエザレルとドウガルはアミノしなかったことを見出した 。一方、カマダとハラダは、アンモニウムがない場合またはアンモニウムと硝酸 塩がない場合には、アラニンとグルタミンが胚形成に有効な〔ライナート、ジエ イ（Ｒｅｉｎｅｒｔ、 Ｊ、 ）及びエム・タザワ（Ｈ、Ｔａｚａｗａ）著 ラ イルクング フォノ シュテイクシュトツフフエアビンドウンゲン ラント フ ォノ オーキシン アウフ ディー エムブリオゲネーゼ イン ゲヴエーベタ ルトウーレン （旧ｒｋｕｎｇ ｖｏｎ ５ｔｉｃｋｓｔｏｆｆｖｅｒｂｉｎｄ ｕｎａｅｎ ｕｎｄ ｖｏｎ ＡｕＸ１ｎ ａｕｆ ｄｉｅ Ｅｌｌｌｌｌｒｌ ｌｏ（ｌｅｎｅｓｅ ｉｎＧｅｗｅｂｅｋｕｌｔｕｒｅｎ） プランタ（Ｐｌａ ｎｔａ）第３７巻、第２３９頁 （１９６９年）参照］。Pflanzenphysiology) Volume 91: Pages 453-463 ( (1979)]. Wetherell and Dougal found that amino did not . On the other hand, Kamada and Harada are used in the absence of ammonium or with ammonium and nitric acid. In the absence of salt, alanine and glutamine are effective for embryogenesis [Reinert, Diesel]. Written by Reinert, J. and M. Tazawa (H.) Irkung Fono Steigstuchfuerbindungen Landfu Ono Auxin Auf Die Embryogenese in Gevebeta Lutwooren (formerly rkung von 5tickstoffverbind unaen und von AuX1n auf die Ellllllrl lo (lenese in Gewebekulturen) Planta (Pla nta) Vol. 37, p. 239 (1969)].
上記の研究から、アンモニウム及びアミノ酸のような還元型窒素源には対応関係 があることを示している。From the above studies, there is a correspondence between reduced nitrogen sources such as ammonium and amino acids. It shows that there is.
（ウエザレルとドウガルの前記文献及びカマダとハラダの前記文献参照）。アン モニウムとアミノ酸との代謝の同等性については、タザワとライナートの研究に よっても示されている［タザワ、エム（ＴａＺａＷａ、 Ｈ，）及びライナート 、ジエイ（Ｒｅｉｎｅｒｔ、 Ｊ、）著によるエクストラセルラー アンド イ ントラセルラー ケミカル エンバイＯンメンツ イン リレーション ツウ エンプリオシ１ｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｖｉｒｏｔｖ ｅｎｔｓ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔ。(See Wetherell and Dougal, supra, and Kamada and Harada, supra). Ann Regarding the metabolic equivalence of monium and amino acids, the research by Tazawa and Reinert [Tazawa, M. (Tazawa, H.) and Reinert et al. Extra Cellular and I by Reinert, J. intracellular chemical environment in relation two Empriosi 1ntracellular chemical envirotv ents in relationship.
ｅａ＋ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ） 、プロトプラズマ（Ｐｒ ｏｔｏｐｌａＳａ＋ａ ）第６８巻、第１５１頁−１１３頁（１９６９年）参照 ］。不定胚形成を行なうニンジン培養１！ｌ胞中のアンモニウムの内部レベルの 研究において、アンモニウムのレベルは、培養細胞にアンモニウム、アミノ酸ま たは硝ｖｉ塩の何れを供給するかに関係なく、培ａｍ胞中の胚形成の鼻と関連し ていることが明らかになった。ＮＨ４Ｉの内部レベルは不定胚形成を促進するの に重要な要因であるとの結論に達した。この内部ＮＨ４’レベルは外部から供給 されるＮＨ４”またはアミノ酸あるいは硝酸塩からＮ Ｈ’４”への生物的還元 によってもたらされる。ＮＨｓｏは内部において有機窒素化合物に変換されて、 通常の細胞の要求に応じてアミノ酸となって供給される（タザワとライナートの 前記文献参照）。従って、アミノ酸はアンモニウムを放出する役割を果たし、そ れが胚形成を刺激すると考えられている。ea+bryogenesis in vitro), protoplasma (Pr otoplaSa+a) Volume 68, pp. 151-113 (1969) ]. Carrot culture for somatic embryo formation 1! Internal levels of ammonium in cells In research, ammonium levels have been tested to increase ammonium, amino acids, or amino acids in cultured cells. related to the nose of embryogenesis in the cultured follicle, regardless of whether it is supplied with nitrate or nitrate. It became clear that Internal levels of NH4I promote somatic embryogenesis It was concluded that this is an important factor. This internal NH4’ level is supplied externally. Biological reduction of NH4” or amino acids or nitrates to NH4” brought about by. NHso is internally converted to organic nitrogen compounds, Supplied as amino acids according to normal cellular requirements (Tazawa and Reinert) (See the above literature). Therefore, amino acids play a role in releasing ammonium and It is believed that this stimulates embryogenesis.
胚の発達をより向上させるとされてきた要因はアブシジン酸、ゼアチン、ジベレ リン酸、高濃度の蔗糖と光である。アンミラト、ビー・ライ（Ａｍｍ１ｒａｔｏ 、Ｐ、Ｖ、）及びエフ・シー・ステワード（Ｆ、Ｃ，Ｓｔｅｗａｒｄ）著 ザム エフエクツ オブ エンバイロンメント オン ザ デベロｔｈｅ ｄｅｖｅ ｌｏｐｏｍｅｎｔ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｒｏＩＩｌｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆ ｒｅｅｃｅｌｌｓ ）ボタニカル ガゼツト（Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｚｅｔ ｔｅ ）第１３２巻：第１４９頁−１５８頁（１９７１年）、ならびにアンミラ ト、ビー・ライ（Ａｍｍｉｒａｔｏ、 Ｐ、 Ｖ、 ）著 ホルモナルコントロ ール オブ ツマチック エムプリオ デベロ・プメント フロム カルチヤー ド セルズ オブ カラウェイ。イシタラクションズ オブ アブシシック ア シッド、ゼアチン アンド ジベレリン酸 アシッド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ ｃｏ ｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｏｍｅｎｔ ｆｒｏｌｌ ＣＬＩＩｔＬｌｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｃａｒａｗａｙ、Ｉｎ ｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ、 ｚｅａｔｔｎ ａ ｎｄ ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ ａｃｉｄ）プラント フィジオロジイ（Ｐｌａ ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）第５９巻、第５７９頁−５８６頁（１９７７年） 参照］。胚の品質にアンモニウム及びアミノ酸の効果が認められたという報告は 未だない。Factors that have been shown to improve embryonic development are abscisic acid, zeatin, and gibberate. Phosphoric acid, high concentration of sucrose and light. Ammirat, Bhi Rai (Amm1rato) , P.V.) and F.C. Steward. Effects of Environment on the developer Lopoment of embryos froIIlcultured f reecells) Botanical Gazette te) Volume 132: Pages 149-158 (1971), and Ammira Hormonal Control by Ammirato, P., V. Rule of Tumatic Empurio Developer Pment From Culture Do Cells of Calaway. Ishita Actions of Absishic A Acid, zeatin and gibberellic acid (Hormonal co. ntrol of somatic embryo development froll CLIItLlred cells of caraway, In teractions ofabscisic acid, zeattn a nd gibberellic acid) Plant Physiology (Pla nt Physiology) Volume 59, pp. 579-586 (1977) reference]. There are reports that ammonium and amino acids have an effect on embryo quality. Not yet.
アンミラト、ビー・ライ著ザ レギュレーション オブソマチック エムプリオ デベロブメント イン プラント セル カルチヤード： サスペンション カルチャー テクニークス アンド ホルモン リクワイヤメンツ（Ｔｈｅ ｒ ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ ｎｔｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ： ５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｑｕｉ ｒｅｍｅｎｔｓ） 、バイオ／チクノロシイ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） 第１巻第６８頁−７４頁（１９８３年）参照。］ さらに、胚の品質の尺度としての植物再生率は今まで的に用いられたこともなか った。胚の成熟度は肉眼により胚の形態を評価することによって決定されてきた 。しかしこの方法は個々の胚からの植物の再生率を測定してない。The Regulation Obsomatic Empurio by Anmirat and Bee Lai Development In-Plant Cell Cultivation: Suspension Culture Techniques and Hormone Requirements (The r egulation of somatic assembly developme ntin plant cell cultures: 5uspension culturetechniques and hormone requirements rements), Bio/Technology See Vol. 1, pp. 68-74 (1983). ] Furthermore, plant regeneration rate as a measure of embryo quality has never been used. It was. Embryo maturity has been determined by visually assessing embryo morphology. . However, this method does not measure the rate of plant regeneration from individual embryos.
従って、植物の組織から作出される不定胚の口及び品質を向上させる方法と物質 を提供するのが本発明の一つの目的であ゛る。Therefore, methods and substances for improving the mouth and quality of somatic embryos produced from plant tissue. It is one object of the present invention to provide the following.
不定胚形成のために最適な還元型窒素源を供給するのも本発明の目的の一つであ る。One of the objectives of the present invention is to supply an optimal reduced nitrogen source for somatic embryo formation. Ru.
又、不定胚形成によって多種類の植物の大音増殖を可能にする方法と物質を供給 することも本発明のもう一つの目的である。We also provide methods and materials that enable large-scale multiplication of many types of plants through somatic embryo formation. It is another object of the present invention to.
更に、同一の遺伝子型ならびに表現型の特性を持ち、生存し得る不定胚を多回に 生産するための方法と物質を提供するのもまた本発明の目的である。Furthermore, viable somatic embryos with identical genotypic and phenotypic characteristics are produced multiple times. It is also an object of the present invention to provide methods and materials for the production.
本発明のその他の目的、利点及び特徴を以下の説明ならびに実施例によって明ら かにする。Other objects, advantages and features of the present invention will become apparent from the following description and examples. I'll do it.
発明の開示 本発明は最適量のアミノ酸と還元型窒素源を添加することによって植物細胞から 高品質の不定胚を多数作出するための新規で改良させた方法と物質を提供する。Disclosure of invention The present invention enables plant cells to be extracted from plant cells by adding optimal amounts of amino acids and reduced nitrogen sources. New and improved methods and materials for producing large numbers of high quality somatic embryos are provided.
本発明の一つの面は、アンモニウムイオン源を含有する培地であって、これにプ ロリン、アラニン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、オルニチ ン、グルタミンＮＷＡやそれらのアミド、アルキルエステルやジペプチジル誘導 体から成る群から選ばれる１種類以上のアミノ酸が該アミノ酸を添加しない培地 で形成される胚に比較して、不定胚の数あるいは質を向上させるに十分な量で添 加されている植物細胞培養培地を提供することである。One aspect of the invention is a medium containing an ammonium ion source, which loline, alanine, arginine, glutamine, asparagine, serine, ornithi Glutamine NWA and their amides, alkyl esters and dipeptidyl derivatives A medium in which one or more types of amino acids selected from the group consisting of the following amino acids are not added: supplemented in sufficient quantity to improve the number or quality of somatic embryos compared to embryos formed in The purpose of the present invention is to provide a plant cell culture medium that has been supplemented.
本発明のもう一つの面は、アンモニウムイオンを実質的に含有せ゛ず、プロリン 、アルギニン アスパラギン、オルニチン、リジン、及びそれらのアミド、アル キルエステル及びジペプチジル誘導体の群から選ばれる１種類以上のアミノ酸を 添加した培地であって、作出される不定胚の数または質を該アミノ酸を添加しな い培養培地で作出される不定胚に比較して大巾に向上させるのに十分な量で該ア ミノ酸が添加されていることを特徴とする植物細胞培養培地を提供することであ る。Another aspect of the present invention is that it is substantially free of ammonium ions and contains proline. , arginine, asparagine, ornithine, lysine, and their amides, al one or more amino acids selected from the group of kill esters and dipeptidyl derivatives; The number or quality of somatic embryos produced is reduced without the addition of the amino acid. in sufficient amounts to significantly improve somatic embryos produced in a different culture medium. To provide a plant cell culture medium characterized by adding amino acids. Ru.
本発明の培地を使用する方法もまた提供される。Also provided are methods of using the media of the invention.
第１図は作出された不定胚の数の増加を培地に加えられたアミノ酸の濃度の関数 として、グラフに表わしたものである。Figure 1 shows the increase in the number of somatic embryos produced as a function of the concentration of amino acids added to the medium. It is expressed in a graph as .
本発明を実施するための最良の態株 本発明は、不定胚形成を促進するのに充分な伍の選ばれたアミノ酸を含有する植 物細胞や組織の培養培地を使用して植物の体細胞組織から作出された不定胚の債 と質を向上させる方法を提供する。Best strain for carrying out the present invention The present invention provides implants containing five selected amino acids sufficient to promote somatic embryogenesis. Somatic embryos produced from somatic plant tissue using cell and tissue culture media and provide ways to improve quality.
本発明はまた、そのような細胞や組織を培養するために、不定胚の伍と質を向上 させるのに充分な巳でアンモニウムイオン源と選択されたアミノ酸とを含有する 培地を与えることに°よって作出される不定胚の通と質を向上させる方法を提供 する。またこのような植物組織培養培地を使用する方法をも提供する。The present invention also improves the quality and quality of somatic embryos for culturing such cells and tissues. containing an ammonium ion source and a selected amino acid in sufficient strength to Provides a method to improve the viability and quality of somatic embryos produced by feeding medium do. Also provided are methods of using such plant tissue culture media.
アミノ酸は必要とされるアンモニウム培地成分に対する、単なる均等物の役割を 果たすということは以前からいわれているが、驚りべきことに、アミノ酸が、ア ンモニウムイオンの置換物質としてアンモニウムの回当ｍ濃度より以上に不定胚 の生産を増大させることが見出された。さらに、驚くべきことに、選択されたア ミノ酸にアンモニウムイオン源を追加すると、単なるアンモニウムイオン濃度の 増加による附加的効果からは予測され得ない、大巾なメリットが得られることが 明らかになった。Amino acids serve as mere equivalents to the required ammonium media components. Surprisingly, it has been said that amino acids As a substitute for ammonium ions, the concentration of ammonium in somatic embryos was found to increase the production of Additionally, surprisingly, the selected Adding an ammonium ion source to amino acids increases the concentration of ammonium ions. It is possible that large-scale benefits can be obtained that cannot be predicted from the additional effects of the increase. It was revealed.
プロリン、アルギニン、リジン、アスパラギン、オルニチン、およびそれらのア ミド、アルキルエステルおよびジペプチジル誘導体から成るグループから選ばれ るアミノ酸を含有し、かつ実質的にアンモニウムイオンを含有しない培地は、培 養された体細胞組織から誘導された不定胚の母と質を向上させることが判明した 。Proline, arginine, lysine, asparagine, ornithine, and their amino acids selected from the group consisting of mido, alkyl esters and dipeptidyl derivatives. A medium that contains amino acids that contain amino acids and is substantially free of ammonium ions is found to improve the quality and quality of somatic embryos derived from cultivated somatic tissue .
また、アンモニウムイオンの他に、プロリン、アラニン、アルギニン、グルタミ ン、リジン、アスパラギン、セリン、オルニチン、グルタミン酸塩、およびそれ らのアミド、アルキルエステルおよびジペプチジル誘導体から成る群から選ばれ る１種−以上のアミノ酸を胚形成または胚からの植物体再生を促進するのに十分 な口で含有する培地が、同様に胚形成を向上させることも見出された。In addition to ammonium ions, proline, alanine, arginine, and glutamine lysine, asparagine, serine, ornithine, glutamate, and selected from the group consisting of amides, alkyl esters and dipeptidyl derivatives of one or more amino acids sufficient to promote embryogenesis or plant regeneration from the embryo. It has also been found that a culture medium containing 10% of the total number of embryos improves embryogenesis as well.
驚くべきことに、本発明の培地は、肝組織の分化誘導、再生、および維持に従来 用いられている一般的な培地に比較して、カルス組織からの不定胚の生産】を、 増加させることが発見された。これらの不定胚形成過程の各段階において、本発 明の培地を使うことによって従、来の結果よりもはるかに多量の胚的な組織が得 られる。さらに、アルファルファ、セロリ、ワタ、トウモロコシおよびイネを含 む各種の有用植物で本発明の実施による有意性が得られた。Surprisingly, the culture medium of the present invention is effective in inducing differentiation, regeneration, and maintenance of liver tissue. Production of somatic embryos from callus tissue compared to common media used It was discovered that increasing At each stage of these somatic embryo formation processes, the main By using Ming's medium, we obtained much more embryonic tissue than previously possible. It will be done. Additionally, it contains alfalfa, celery, cotton, corn and rice. The present invention has been shown to be effective in various useful plants.
本発明の実施によって改良される植物細胞培養培地には従来から知られている植 物組織培養培地があり、例えばファング、エル （Ｈｕａｎｇ Ｌ、）とティー ・ムラシゲ（Ｔ。The plant cell culture medium improved by the practice of the present invention includes conventionally known plants. There are many tissue culture media, such as Huang L. and T. ・Murashige (T.
Ｈｕｒａｓｈｉｇｅ）による前記文献において概説された培地、及・ライーｍｌ ンガー（Ｂ、Ｖ、Ｃｏｎｇｅｒ）Ｉ２集、シーアールシープレス インク（ＣＩ ＩＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）、１７２頁以降、において概説された培地などがあ り、その説明や調製法は参考として本明細書に援用する。一般に、植物培養培地 には植物の栄養素、糖のようなエネルギー源、植物ホルモン、および水溶液のｌ ）Ｈおよび、浸透圧バランスを調節するための緩＠塩類などが含まれる。Hurashige) and Lye ml. Conger (B, V, Conger) Volume I2, CRC Press, Inc. (CI ICPress, Inc.), pages 172 et seq. and their descriptions and preparation methods are incorporated herein by reference. Generally, plant culture media contains plant nutrients, energy sources such as sugars, plant hormones, and aqueous solutions. )H and mild salts to adjust the osmotic pressure balance.
このような植物細胞培養培地の一例としては、シエンクーヒルデプラント（Ｓｃ ｈｅｎｋ ａｎｄＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ） （Ｓ Ｈ）培地が知られている。An example of such a plant cell culture medium is Schienkuhildeplant (Sc Henk and Hildebrandt (SH) medium is known.
シエンク、アール・ニー（Ｓｃｈｅｎｋ。Schenk, R.N.
Ｒ，ｕ、 ）及びエイ・シー・ヒルデブランド（＾、Ｃ０Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ ｔ）著、ミー ティア ム７ ンＦ −ｒ ’） ニー ’）ス フォア′イン ダクション アンド グロウス オブモノコチレドナス アンド ジコチレドナ ス プラント セル カルチシース（Ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕ ｅｓ ｆｏｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｒ ｍｏｎｏｃｏ ｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ａｎｄｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ ｐｌａｎｔ ｃ ｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ） 、カナディアンジャーナル オブ ボタエイ（Ｃ ａｎ、Ｊ、ＢＯｔ、）第５０巻：第１９９頁（１９７２年）、の文献がありその 説明および調製法は参考として本明細書に援用する。以下に用いるホルモン非含 有ＳＨ培地は上記文献に開示された培地であり、主要な塩類、ビタミン類、およ び蔗糖を含有するが、２．４−・Ｄ、ｐＣＰＡおよびキネチンを含有していない 。R, u, ) and A. C. Hildebrand (^, C0 Hildebrand T) Author, Metierm 7 Daction and Growth of Monokochiredonas and Jikochiredonas Plant cell culti sheath (Medium and technique es forinduction and growth or monoco tyledonous and dicotyledonous plant c ell cultures), Canadian Journal of Botaei (C An, J. BOt, ) Vol. 50: p. 199 (1972). Descriptions and methods of preparation are incorporated herein by reference. Hormone-free for use in The SH medium is a medium disclosed in the above-mentioned document, and contains major salts, vitamins, and Contains sucrose but does not contain 2.4-D, pCPA and kinetin .
ムラシゲ−スクーグ（ＭＳ）として知られる培地もＳＨ培地の代わりに使用でき る［ムラシゲ、ティー（Ｈｕｒａｓｈｉｇｅ、 Ｔ、 ）及びエフ・スクーグ（ Ｆ、５ｋＯＯＱ） ＝、アリバイズド ミーディアム フォア ラピッド グロ ウス アンド バイオアッセイズ ウィズ タバコ ティシュ−カルヂシーズ（ Ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ｔａｂａｃｃｏ ｔｉｓｓｕｅ、ｃｕｌｔｕ ｒｅｓ）及び調製法も又参考として本明細書に援用する。以下に用いるホルモン ”非含有ＭＳ培地は上記文献に開示されている培地であって、主要な塩類、ビタ ミン類、および蔗糖を含んでいるが、インドール−３−酢酸とキネチンを含有し ていない。A medium known as Murashige-Skoog (MS) can also be used in place of SH medium. [Hurashige, T.] and F. Skoog ( F, 5kOOQ) =, Alivised Medium Fore Rapid Gro Us and Bioassays with Tobacco Tissue Cardiacies ( A revised medium for rapid growth and bioassays with Tabacco tissue, culture res) and methods of preparation are also incorporated herein by reference. Hormones used for ``MS medium without containing main salts, vitamins, etc. is the medium disclosed in the above-mentioned document. Contains minerals and sucrose, but contains indole-3-acetic acid and kinetin. Not yet.
本発明の実施において使用される基本的な植物細胞培養培地の選定は、選定され た植物体ｉＩ胞組織の種類によって一部支配されるが、実際に植物細胞のに４織 培養や不定胚形成の経験のある人にとっては常識に属するものである。The selection of basic plant cell culture media used in the practice of this invention It is partly determined by the type of plant tissue, but there are actually four types of tissue in plant cells. This is common knowledge for those who have experience in culture and somatic embryo formation.
多くの重要な作物および園芸植物の品種が組織培養や不定胚形成によって増殖で きることが明らかになっている。これらの品種には次のものがあるがこれに限定 されるものではない。Many important crop and horticultural plant varieties can be propagated by tissue culture or somatic embryogenesis. It is clear that it can be done. These varieties include, but are not limited to: It is not something that will be done.
アルファルファ アーモンド アスパラガス リンゴ ビート バナナ 芽キャベツ（ブラッセ コーヒー ルズ・スブラウト） ナツメヤシ ーノンノ グレープフルーツ カリフラワー レモン ナス オリーブ タマネギ オレンジ ホウレンソウ モモ トマト 果実類 球 根 植 物 ブラックベリー ユリ ブドウ デイリリイ（ｄａｙｌｉｌｙ ＞パイナツプル イースターリリイ イチゴ ヒヤシンス 観 葉 植 物 囮 シルバーベース セントポーリア （５ｅｖｅｒ ｖａｓｅ） ベニウヂワベゴニア キク クリタンザス ガーベラ デーシイ （ｃｒｙｔａｎｔｈｕｓ） （ｇｅｒｂｅｒａ ｄａｉｓｙ ）ディーフエンバ ッキア属 グロキシニア１１２葉植物 ペチュニア ドラセナ バラ エイデルリーフ ラン ポインセチア ゴムの木 アト［１パ（ａｔｒｏｐａノチョウセンニンジン シ ダ 類 ピレヂウム オーストラリア ヘゴシダ （１）Ｖｒｅｔｈｉｕａ＋ ）ボストン シダ ラビットフット シダ 松 （ｒａｂｂｉｔｓｆｏｏｔ ｆｅｒｎ） ボブラビカクシダ （ｑｕａｋｉｎｇ ａｓｐｅｎ ）ツルギシダ アメリカスギ 大麦 トウモロコシ キビ ペンニセタム（ｐｅｎｎｉｓｃｔｕｍ）コムギ 不定胚形成の可能性のある種について、アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ）刊行、ソープ（Ｔｈｏｒ９ｅ）編集、プラント ティシュ−カ ル−チャ一二メソツヅアンド アブレケーションズ イン アグリカルブ・シー （Ｐｌａｎｔ Ｔｉ５ｓｕｒｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ ： Ｈｅｔｈｏｄｓ−ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃ！Ｊｌｔｕｒｅ ） （１９８１ 年）、中の４５頁以降のエバンス・ディー・エイ（Ｅｖａｎｓ、Ｄ、＾、）他著 ［クロウス アンド ビヘービャー オブ セルカルチャーズ：゛エンブリオジ エネシス アンド オーガノジエネシスＪ （Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｂｅｈａ ｖｉｏｒ ｏｆ Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ： Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ）の中に一層広範囲に記載されており、 参考としてその関連部分を本゛明１１１ｍに援用する。alfalfa almond asparagus apple beet banana Brussels sprouts (Brassé coffee) Luz sbrout) date palm -Nonno Grapefruit cauliflower lemon Eggplant Olive onion orange Spinach peach tomato Fruits, bulbs, roots, plants blackberry lily Grape Daylily (daylily>Pinenut Pull Easter Lily) strawberry hyacinth ornamental leaf plant decoy Silver base Saintpaulia (5ever vase) Redflower Begonia Chrysanthemum Clitanzas Gerbera Dacy (crytanthus) (gerbera daisy) difuemba Chia genus Gloxinia 112 leaf plant Petunia Dracaena rose Eider Leaf Orchid poinsettia Rubber tree atropa (atropa ginseng) Ferns Pyradigium Australia Hego fern (1) Vrethiua+) Boston fern rabbit foot fern pine (rabbitsfoot fern) aspen) Japanese cedar barley corn millet Pennisctum wheat Academic Press (Academic Press) for species with the potential for somatic embryogenesis. Published by Press, edited by Thor9e, Plant Tischka Lucha 12 Methods and Abbreviations in Agricarb Sea (Plant Ti5sure Curture: Hethods-and Applications in Agric! Jlture) (1981 Evans, D.A. et al., page 45 onwards [Crows and Behavior of Cell Cultures: Embryoji] Enesis and Organogienesis J (Growth and Beha vior of Ce1lCultures: Embryogenesis and Organogenesis), which are more extensively described in The relevant portions are incorporated herein as a reference.
若干の例外があるが、遊離のカルボキシル１１およびＴｉ離の置換されていない α−炭素原子でのアミノ基の一般的な特徴を持つ多くのアミノ酸が従来から公知 である。With some exceptions, free carboxyl 11 and unsubstituted Ti release Many amino acids with the general characteristics of an amino group at the α-carbon atom have been known for some time. It is.
プロリンは、注目すべき例外である。何故なら、プロリンのα−７ミノ基は、現 実にα−イミノ酸になるように置換されているからである。Proline is a notable exception. This is because the α-7 amino group of proline is This is because it is actually substituted to become an α-imino acid.
アミノ酸は一般に蛋白質アミノ酸と非蛋白質アミノ酸に分類され、その中の蛋白 質アミノ酸には広く一般に認められたものが２０種類ある。これらのアミノ酸は ４つの小分類に分けられる。すなわち、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バ リン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメヂオニンを含む 非極性または疎水性置換体を有するもの：セリン、スレオニン、チロシン、アス パラギン、グルタミン、システィンおよびお゛そらくグリシンを含む非荷電極性 ＲＪＩを有するアミノ酸：アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む負荷電Ｒ基 を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、およびおそらくヒスデシンを含む正荷 電ＲＭを有するアミノ酸である。Amino acids are generally classified into protein amino acids and non-protein amino acids. There are 20 types of amino acids that are widely recognized. These amino acids are It is divided into four subcategories. i.e. alanine, leucine, isoleucine, Contains phosphorus, proline, phenylalanine, tryptophan, and medionine Those with nonpolar or hydrophobic substitutions: serine, threonine, tyrosine, as Uncharged polarity containing paragine, glutamine, cysteine and possibly glycine Amino acids with RJI: negatively charged R groups including aspartic acid and glutamic acid Amino acids with: positive charges including lysine, arginine, and possibly hisdecine It is an amino acid with electric RM.
この２０種の一般的なアミノ酸のほかに、蛋白質中に、まれにしか、または全然 見られない多くの他のものがある。ヒドロキシリジンとヒドロキシプロリンはｔ ＳＩ維状缶状蛋白質み、まれに見出される。また、β、γおよびΔ型の数多くの 一般のアミノ酸と同様に、最も一般的゛には、アルギニン合成の中間体であるシ トルリンやオルニチンを含む１５０４をこえるその他のアミノ酸がＴ１離の、又 は結合した形で、各種の細胞や組織に存在することが知られている。In addition to these 20 common amino acids, there are also rare or no amino acids found in proteins. There are many others that are not seen. Hydroxylysine and hydroxyproline are t SI fibrous can protein is found rarely. Also, numerous β, γ and Δ types As with all amino acids, the most common is arginine, an intermediate in the synthesis of More than 1504 other amino acids, including toluline and ornithine, is known to exist in a combined form in various cells and tissues.
上述の基本的なアミノ酸の構造に加えて、本発明において機能する能力を変える ことなしに多くの方法によってアミノ酸の構造を修飾することができる。これら の変更の中には、アミノ基およびカルボキシル基を加えることによって、それぞ れアミノ酸アミド、およびアミノ酸アルキルエステルを形成することが含まれる 。さらに、α−カルボキシル基とα−アミノ基を用いて２つのアミノ酸を架橋さ せることによってアミノ酸のジペプチジル誘導体をつくることができる。各一対 のアミノ酸は潜在的に２つのジペプチジル誘導体を有すると考えられる。In addition to the basic amino acid structure described above, altering the ability to function in the present invention The structure of amino acids can be modified in many ways without any modification. these Among the modifications are the addition of amino and carboxyl groups, respectively. formation of amino acid amides, and amino acid alkyl esters. . Furthermore, two amino acids are cross-linked using an α-carboxyl group and an α-amino group. Dipeptidyl derivatives of amino acids can be produced by one pair each It is believed that the amino acid potentially has two dipeptidyl derivatives.
また、本発明において重要な事は、本発明のアミノ酸含有培地を補うために、ア ンモニウムイオン（１４Ｈ４°）源を供給することである。アンモニウムイオン 源は植物組織培養技術において又よく知られているものである。典型的には、例 えば塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム又は硫酸アンモニウムのような、ア ンモニウムイオン荷とバランスをとるアニオンにより構成された一定岱の非毒性 のアンモニウム塩を含有する培地によりアンモニウムイオンを供給する。他のア ンモニウムイオン源は、ウォーカー、クー・エイ（賀ａｌｋｅｒ、に、Ａ、）及 びニス・ジエー・サトウ（Ｓ、 Ｊ、 ５ａｔｏ）著のプラント セル ティシ ュ−オーガン カルチｔ −（Ｐｌａｎｔ Ｃｅ１ｌ ＴｉｓｓｕｅＯｒｇａｎ Ｃｕ１ｉｕｒｅ ）第１巻第１０９頁−１２１頁（１９８１年）中に示されて おり、該当箇所を本明細書に援用する。Moreover, what is important in the present invention is that in order to supplement the amino acid-containing medium of the present invention, The purpose is to provide an ammonium ion (14H4°) source. ammonium ion The sources are also well known in the plant tissue culture art. Typically, e.g. Ammonium chloride, ammonium phosphate or ammonium sulfate. A constant amount of non-toxicity composed of anions that balance the ammonium ion charge. Ammonium ions are supplied by a medium containing an ammonium salt. other a Ammonium ion sources were developed by Walker, A. Plant Cell Tici written by Binis J. Sato (S, J, 5ato) Tissue Organ Cu1iure) Vol. 1, pp. 109-121 (1981) The relevant portions are incorporated herein by reference.
以下の実施例は本発明の種々の面を説明するためのものである。実施例は請求の 範囲で排他的に明確にされている本発明の範囲を限定するものとしてとらえられ るべきではない。The following examples are provided to illustrate various aspects of the invention. Examples of claims Nothing shall be construed as limiting the scope of the invention which is defined exclusively in the scope. Shouldn't.
を行うのに使用する方法は良く知られており、その方法を選択した植物種に適応 させるにはほんのわずかの変更を加えるのみで足りる。例えば、前記プラント ティシュ−カルチｔ −（Ｐｌａｎｔ Ｔｉ５ｓｕｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ） ：メ ソッズアンド アプリケーションズ イン アグリ力ルヂシー（Ｈｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ） 、 ’Ｊ−ブ（Ｔｈｏｒｐｅ）編集（１９８１年）を参照せよ。この文献の適切な部 分を援用して本明細書の記載に代える。The methods used to do this are well known and adapted to the selected plant species. All it takes is a few changes to make it work. For example, the plant Tissue Culti T-(Plant Ti5sue Culture): Me Hethods and Applications in Agriculture and Applications in Agriculture), See J. Thorpe (ed. 1981). Appropriate section of this document The contents of this specification are incorporated by reference.
例えば、アルファルファでは、胚形成は通例ソーンダース及びピンガム（Ｓａｕ ｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｂｉｎｇｈａｍ）のレーゲンＳ（Ｒｅｇｅｎ Ｓ）系統で 日常的に分化誘導することができ、これは プロダクション オブ アルファル ファ プラント フロム カルス ティシュ−（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆＡ ｌｆａｌｆａ’ＰＩａｎｒｓ ｆｒｏｍ Ｃａ１ｌｕｓ Ｔｉ５ｓｕｅ）、クロ ’）ブ サイエンス （Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ、）、第１２巻：第８０４頁−８０８ 頁（１９７２年）に記載されている。For example, in alfalfa, embryogenesis typically occurs in Saunders and Pingham (Sau). enders and Bingham) Regen S (Regen S) line. Differentiation can be induced on a daily basis, which is the production of alfal Fa Plant From Callus Tissue (Production of A lfalfa'PIanrs from Callus Ti5sue), black ') Crop Sci, Volume 12: Pages 804-808 (1972).
る第２期循環選抜で得られた裁培品種し−ゲンＳの植物体を使用した。葉柄の表 面を５０％濃度のクロロツクス（商標名）で５分間殺菌し水で洗浄した後、ジエ ンクーヒルデブランド（Ｓｃｈｅｎｋ−ｔｌｉ １ｄｅｂｒａｎｄｔ）培地［シ エンク、アール・ニー及びニー・シー・ヒルデブランド（Ｓｃｈｅｎｋ。Plants of the cultivar Shigen S obtained in the second round of cyclic selection were used. petiole surface After disinfecting the surface with 50% concentration Clorotux (trade name) for 5 minutes and washing with water, Schenk-tli 1debrandt medium [Schenk-tli 1debrandt] Schenk, R. N. and C. Hildebrand.
Ｒ，Ｕ、 ａｎｄ Ａ、１１． ｔｌｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ）、（１９７２年） 前記参照］の塩類、ビタミン類及び！！糖を含有するホルモン非含有ＳＨ培地上 で培養し、カルスを誘導した。この培地は２５μＭのα−ナフグーレン酢酸、１ ０μＭのキネチン及び０．８％（１４／Ｖ）の寒天を含有していた（維持用培地 と称す）。外植片組織上で形成したカルスを残りの非カルス組織からは３週間間 隔で継代培養され、培養は２７℃において間接光下で培養された。R, U, and A, 11. (1972) See above] salts, vitamins and! ! On sugar-containing hormone-free SH medium to induce callus. This medium contained 25 μM α-nafgulene acetate, 1 It contained 0 μM kinetin and 0.8% (14/V) agar (maintenance medium ). Callus formed on explant tissue was separated from remaining non-callus tissue for 3 weeks. The cultures were subcultured at intervals and grown under indirect light at 27°C.
３−９ｇのカルスを維持用培地プレートから最終時継代培養開始後１７日目ない し２４日目に回収して、５０μＭの２．４−ジクロロフェノキシ酸Ｆｉ！ｉ（２ ，４−Ｄ）及び５μＭのキネチン（Ｂ）を含有する１ ０Ｑｄの液体ＳＨ培地に 分化誘導するために移した［ウォーカー、クー・ニー（Ｗａｌｋｅｒ。17 days after the start of final subculturing, 3-9 g of callus was transferred from the maintenance medium plate. Collected on day 24, 50 μM of 2.4-dichlorophenoxy acid Fi! i(2 , 4-D) and 10Qd liquid SH medium containing 5 μM kinetin (B). Transferred to induce differentiation [Walker, K. Nie.
に、Ａ、） 、Ｘム−エル・ウエンデルン（Ｈ，Ｌ、１Ｊｅｎｄｅｌｎ）及びイ ー・ジー・ジ°ヤウォルスキ（Ｅ、Ｇ、Ｊａｗｏｒｓｋｉ）、プラントサイエン ス レターズ（Ｐｌａｎｔ ＳＣｉ、 ＬＯｔｔ、）第１６巻、第２３頁−３０ 頁（１９７９年）に記載されている］。細胞は５００ｄのフラスコ中で３日間、 ２７℃において１００ｒ、 ｐ、ｍ、の回転速度のオニビタルシェーカー（Ｏｒ ｂｉｔａｌ ５ｈａｋｅｒ）上で間接光下で培養した。A, ), X Muel Wendeln (H, L, 1Jendeln) and I - G. Jaworski, Plant Science Letters (Plant SCi, LOtt,) Volume 16, Pages 23-30 (1979)]. Cells were grown in 500d flasks for 3 days. An onbital shaker (Or The cells were cultured under indirect light on a Vital 5haker.
分化誘導細胞を、無菌的に一連のカラムふるい［フィッシャー サイエンティフ ィック（Ｆｉｓｃｈｅｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］上で温和な減圧下で大きさ によってふるい分けた。細胞塊は３５メツシユ（４８０μｍ）を通過するが、力 を加えて保持された細胞は、誘導培養液１００ｍｆ！容量毎に、ホルモンを含ま ないＳＨ培地５００−で洗浄した。洗浄用培地を減圧によって除去した。得られ た細胞塊の新鮮重量を測定し、１ｎｅのホルモン非含有５ｔ−１培地酉り ｉ５ Ｑｍｙ新！！￥重の細胞を再懸濁させた。７５Ｉｎ９（０，５ｍｉりの再懸濁細 胞を６０ａｍＸ１５ａｍの大きさのべ１〜す皿中の約１０ｄの固体寒天培地上に ピペットで移した。The differentiation-induced cells were aseptically passed through a series of column sieves [Fisher Scientific]. size under mild vacuum on a Fischer 5 scientific sieved by. The cell mass passes through 35 meshes (480 μm), but the force The cells maintained by adding 100mf of induction culture medium! Contains hormones for each volume Washed with SH medium 500-min. Washing medium was removed by vacuum. obtained The fresh weight of the cell mass was measured, and it was added to 1ne of hormone-free 5t-1 medium. Qmy new! ! The cells were resuspended. 75In9 (0.5 mil resuspension) Place the cells on about 10 d of solid agar in a 60 am x 15 am dish. Transferred with a pipette.
別法として、３００ｍ９（２ｍ ）の再懸濁細胞を５０−のエーレンマイシーフ ラスコ中に入っている８！ｎ１のホルモン非含有液体ＳＨ培地に移すと、液体培 養で不定胚形成が起こることになる。この不定胚形成用培地は、３％（Ｗ／Ｖ） のｌ＋！糖を含有しホルモンを含まないＳＨ培地（２，６ｍＨ相当のＮＨＪ’） であった。Ｓ ｌ−１のＮＨＪ ８２ ＰＯ４”を周当１のＮａＨ２Ｐ’０４で 置換することによってアンモニウムイオン非含有培地を作成した。２５ｍＭのＮ Ｈ４”を含有する対照培地は、１２．５ｍＭの（ＮＨ４）２ ＳＯ４を補ったア ンモニウムイオン非含有培地から成ってし）だ。すべての有機及び無機の還元型 窒素源は０．２μｍの′ａ′Ａによって滅菌した後、新たにオートクレーブで殺 菌した培地に添加した。Alternatively, 300 m (2 m) of resuspended cells were 8 in Lasco! When transferred to hormone-free liquid SH medium of n1, the liquid culture Somatic embryo formation will occur due to feeding. This somatic embryo formation medium is 3% (W/V) nol+! SH medium containing sugar and no hormones (NHJ' equivalent to 2.6 mH) Met. NHJ 82 PO4” of S l-1 with NaH2P’04 of 1 per week An ammonium ion-free medium was created by substituting the medium. 25mM N Control medium containing H4'' was supplemented with 12.5mM (NH4)2SO4. It consists of a medium that does not contain ammonium ions). All organic and inorganic reduced forms The nitrogen source was sterilized with 0.2 μm 'a'A and then freshly sterilized in an autoclave. It was added to the cultured medium.
各培養処理は一般に１０反復で行った。ベトリ皿の場合は、その皿をバラフィル ム（ｐａｒａｆｉｌｎ＋）で包んで２１日間培養した。 培養フラスコの場合は スポンジで栓をしてサランラップでおおい、オービタルシェーカー上で１００ ｒ、ｐ、ｍ、の回転速度で１４日間培養した。培養は、２７℃において、クール ホワイトの蛍光管を固体培地の場合には２８Ｃｔｔｔの距離から、液体培地の場 合には２００（Ｊの距離から、１２時間日長で行った。Each culture treatment was generally performed in 10 replicates. If it is a veterinary dish, fill the dish with a rose filler. The cells were wrapped in parafiln+ and cultured for 21 days. In the case of a culture flask Seal with a sponge, cover with saran wrap, and place on an orbital shaker for 100 minutes. Culture was performed for 14 days at rotation speeds of r, p, m. Culture is cooled at 27°C. In the case of a solid medium, hold a white fluorescent tube at a distance of 28 Cttt, and in the case of a liquid medium, In this case, the experiment was carried out at a distance of 200 J with a photoperiod of 12 hours.
培養後に、実体顕微鏡を用いて倍率１０でカルス上の組織の緑色中心を数えるこ とによって、胚形成を視覚的に測定した。胚の大きさは、目盛付ぎ接眼スケール を用いて倍率１０で測定した。胚の形は視覚検査で決定した。初期培養の２１日 目に、胚をアミノ酸処理から０．８％の寒天で固化した２５μＭのジベレリン酸 と０．２５μＭのα−ナフチレン酢酸を含有したホルモン非含有の％ＳＨ培地へ 無菌的に移すことによって、胚を根と苗条軸（第１次初生葉）とを有する完全な 植物に生長させた。After culturing, count the green centers of the tissue on the callus using a stereomicroscope at a magnification of 10. Embryogenesis was measured visually by. Embryo size is measured using a graduated ocular scale The measurement was performed using a magnification of 10. Embryo shape was determined by visual inspection. 21 days of initial culture In the eyes, embryos were treated with 25 μM gibberellic acid solidified in 0.8% agar from amino acid treatment. and into hormone-free %SH medium containing 0.25 μM α-naphthylene acetic acid. By aseptically transferring, the embryos are transformed into complete cells with roots and shoot axes (primary leaves). grown into plants.
１、アンモニウムイオン含有培地中での不定胚形成本発明に従って、豆科の代表 として、アルファルファ（刈り工互ユーユユヱ１）の品種、レーゲンＳの組織を 、上記に概略したように培養して２．６ａＨのアンモニウムイオンを含有゛する 培地中での不定胚形成を検定した。すべての蛋白アミノ酸を１〜１００ｍＭ Ｑ 度で検査した。この最初のスクリーニングから２つの反応型が明らかになり、こ れらの結果に基づいて、ふるい分けられた細胞を用いて更に試験を行った。対照 ＳＨ培地（２，６ｍＨＮ Ｈ４°）に比較して生育に対して有毒であったり不定 胚形成に抑制的であるということがわかった第１反応型のアミノ酸は表２中から 除かれている。これらのアミノ酸は、硫黄と芳香族物質とほとんどの分岐鎖化合 物を含Ｉνでいた。これらのアミノ酸には対照ＳＨ培地より以上に不定胚形成を 促進したものはなかったと同時に、これらのアミノ酸のいずれも１ｍＭまたは１ ０ｍＭの濃度でカルスの生育を抑制したかカルスの褐色化を生じたという点で有 害であった。1. Somatic embryo formation in ammonium ion-containing medium According to the present invention, representatives of the leguminous family As for the structure of Regen S, a cultivar of alfalfa (Cutter Mutual Yuyuyu 1), , cultured as outlined above to contain 2.6 aH of ammonium ion. Somatic embryo formation in the culture medium was assayed. All protein amino acids 1-100mM Q It was inspected at degree. Two reaction types emerged from this initial screen; Based on these results, further tests were performed using sieved cells. contrast Compared to SH medium (2.6mHN H4°), it is toxic or unstable for growth. Amino acids of the first reaction type that were found to be inhibitory to embryogenesis are listed in Table 2. It is excluded. These amino acids contain sulfur and aromatics and most branched chain compounds. It contained Iν. These amino acids inhibit somatic embryogenesis more than the control SH medium. Neither of these amino acids at 1 mM or 1 It was significant in that it suppressed callus growth or caused callus browning at a concentration of 0mM. It was harmful.
最初のスクリーニングから１９だ第２反応型は、ＳＨ対照に比べて、胚形成を一 層促道したか胚の大きさを増加させた（表２を参照）。これらのアミノ酸に関し て詳しい濃度依存性研究を行い、結果を第１図に示した。不定胚形成を促進する のに最も効果的であったア、ミノ酸はプロリンであり、このアミノ酸は２．６ｍ ＨＮ ８４°の対照よりも約３倍近くも多くの胚を生じさせ、 アルファルファ ＣＤ＞における至適アンモニウム濃度である２５ａ＋ＨＮ Ｈ４”の２倍の効果 を生じた［ウォーカー等（１４ａｌｋｅｒｅｔ’ ａｔ、 ’）の前記文献］。The second reaction type, 19 years after the initial screening, showed that the second reaction type had a uniform effect on embryogenesis compared to the SH control. This increased the size of the embryo (see Table 2). Regarding these amino acids A detailed concentration dependence study was conducted, and the results are shown in Figure 1. Promote somatic embryo formation The amino acid that was most effective for HN produced approximately 3 times more embryos than the 84° control, and alfalfa Double the effect of 25a+HN H4”, which is the optimal ammonium concentration at CD> [Walker et al.
アラニン、アルギニン、グルタミン及びリジンはいずれも効果がより低かったが 、およそ２５ｎ＋ＨＮＨａ°のレベルまで胚形成を促進した。セリンとアスバり 少なかったが、胚の大きさを増加させた。 アルファルファでの不定胚形成を促 進するということがわかったアミノ酸と他の窒素源を表２にまとめる。プロリン のエステル型とアミド型が、ジペプチドであるプロリルアラニンと同じく、胚の 数と質を向上させる活性が非常に高いということに注目すべきである。非蛋白ア ミノ酸であるオルニチンもまた活性があるということは興味深い。Alanine, arginine, glutamine and lysine were all less effective, but , promoted embryogenesis to levels of approximately 25n+HNHa°. Serin and Asbari Although it was small, it increased the size of the embryo. Promote somatic embryo formation in alfalfa Table 2 summarizes the amino acids and other nitrogen sources that have been found to promote biochemistry. proline Like the dipeptide prolylalanine, the ester and amide forms of It should be noted that the activity of increasing quantity and quality is very high. non-protein a It is interesting that the amino acid ornithine is also active.
表２ アルファルファの不定胚形成における還元型窒素源の効果 オルニヂン （Ｄ）における至適アンモニウム濃度である２５ｍＨＮ Ｈ４”″の２倍の効果 を生じた［ウォーカー等（賛ａｌｋｅｒｅｔ ａｔ、 ）の前記文献〕。アラニ ン、アルギニン、グルタミン及びリジンはいずれも効果がより低かったが、およ そ２５ｍＨＮＨ４”のレベルまで胚形成を促進した。セリンとアスパラギンは、 ５日対照に比べて胚形成の促進には効果がより少なかったが、胚の大きさを増加 させた。 アルファルファでの不定胚形成を促進するということがわかったアミ ノ酸と他の窒素源を表２にまとめる。プロリンのエステル型とアミド型が、ジペ プチドであるプロリルアラニンと同じく、胚の数と質を向上させる活性が非常に 高いということに注目すべきである。非蛋白アミノ酸であるオルニチンもまた活 性があるということは興味深い。Table 2 Effect of reduced nitrogen source on somatic embryo formation of alfalfa Ornidin Twice the effect of 25 mHN H4”, which is the optimal ammonium concentration in (D) [Walker et al., supra)]. Arani arginine, glutamine, and lysine were all less effective, but Serine and asparagine promoted embryogenesis up to the level of 25mHNH4''. It was less effective in promoting embryogenesis than the 5-day control, but increased embryo size. I let it happen. An amino acid found to promote somatic embryo formation in alfalfa No acids and other nitrogen sources are summarized in Table 2. The ester and amide forms of proline are Similar to prolylalanine, which is a peptide, it is highly active in improving embryo number and quality. It should be noted that the price is high. Ornithine, a non-protein amino acid, is also active. It's interesting that there is a gender.
嚢２ アルファルファの不定胚形成における゛−型富窒素源効果 オルニチン セリン 前述の方法を用いて胚の大きざを視覚的に検査することによって胚の質を測定し た。データを表３に示す。Sac 2: Effect of ``-type nitrogen-rich source on somatic embryo formation in alfalfa ornithine Serin Determine embryo quality by visually inspecting embryo size using methods previously described. Ta. The data are shown in Table 3.
表３ 不定胚の大きさに及ぼす７元型窒素処理の効果 処 理 長 さ 幅 対熱（２５１１１ＨＮ Ｈ４◆） ０．８０５±０．０８４ ０．３８３±０． ０１９１ＱＯｍＭ Ｌ−プロリン１，１４３±０．０８１ ０．８６７± ０． ０４６３０＋１１Ｍ Ｌ−アラニン１．１６３±０．０９０ ０．７４４±０． ０３７１ｏｏｍＭ Ｌ−アラニン１．１９２±０．１０２ ０．８３３±０．０ ４９３０ｍＭ Ｌ−アルギ １．５２１± ０．１４２ ０．６６３±０．０４ ８二ン ３ｈ＋Ｍ Ｌ−グルタ １．３４２±０．１２２ ０．７７３± ０．０５１ミ ン ３１１１Ｍ Ｌ−リジン １．１６３±０．０９６ ０．６５２±Ｑ、 ０３９ １０１ＭＬ−７スバ １．２３９±０．１０２ ０．６１０±０．０３４ラギン 表２と表３のデータに基づいて、アミノ酸添加物の胚の大きさの改善効果は次の 順序にランクづけすることができる。 。Table 3 Effect of heptadyl nitrogen treatment on the size of somatic embryos Processing length width Heat resistance (25111HN H4◆) 0.805±0.084 0.383±0. 0191QOmM L-proline 1,143±0.081 0.867±0. 04630+11M L-alanine 1.163±0.090 0.744±0. 0371oomM L-alanine 1.192±0.102 0.833±0.0 4930mM L-Algi 1.521±0.142 0.663±0.04 82in 3h+M L-Gluta 1.342±0.122 0.773±0.051mi hmm 3111M L-lysine 1.163±0.096 0.652±Q, 039 101ML-7 Suba 1.239±0.102 0.610±0.034 Ragin Based on the data in Tables 2 and 3, the effect of amino acid additives on improving embryo size is as follows: Can be ranked in order. .
アルギニン≧グルタミン〉アラニン〉プロリン＞ＮＨ４Ｉ前述の方法を用いて、 胚の、根と苗条軸とを有する完全な植物への再生を観察して表にまとめた。結果 は次のごとくである。Arginine≧Glutamine>Alanine>Proline>NH4I Using the above method, Regeneration of the embryos into complete plants with roots and shoot axes was observed and tabulated. result is as follows.
２５＋ａＭ Ｎ Ｈ４” ３３．３％＋４．２１００ｍＭ Ｌ−プロリン ５４ ．０％＋６．４５０ｍＭ 、 Ｌ−アラニン ６３．５％＋４．４３０ｍＭ Ｌ −アルギニン ５９．０％＋６．２３０ｍＭ Ｌ−グルタミン ６７．０％＋３ ．４表４のデータに基づくと、胚の幼植物への再生に対する添加物の効果は次の ごとくである。25+aM N H4” 33.3%+4.2100mM L-proline 54 ．． 0% + 6.450mM, L-alanine 63.5% + 4.430mM L -Arginine 59.0% + 6.230mM L-glutamine 67.0% + 3 ．． 4 Based on the data in Table 4, the effects of additives on the regeneration of embryos into plantlets are as follows: That's it.
グルタミン〉アラニン≧アルギニン〉プロリン＞Ｎ８４゜これらのデータ間の関 係から、胚の大きさは胚の幼植物への再生についての良い指標となり、従って本 願発明の技術で作出された胚の質の、良い指標であることがね成の促進に対する 添加アミノ酸の至３ｇｆｆ１を測定した。これらのデータを表５及び６に示す。Glutamine>Alanine>Arginine>Proline>N84゜The relationship between these data Therefore, the size of the embryo is a good indicator for the regeneration of the embryo into a plantlet, and therefore the present study It is a good indicator of the quality of embryos produced using the technology of the patented invention for promoting embryonic development. Up to 3gff1 of added amino acids was measured. These data are shown in Tables 5 and 6.
表５ ２．６ｍＭＮＨ４”の存在下にアミノ酸を固体寒 培地に添加することに よる、 対照（２，６１００−− ＠１ＨＮＨ４°） し−プロリン ３３０ １０−３００ （１００）Ｌ−アラニン ３１４ ２０ −・１５０ （７５−１００）Ｌ−グルタミン １７５ ２０−５０ （３０− ４０）し−アルギニン ２４４ ５−５０ ” （３０−，４０）Ｌ−アスパラ １５５ ０．５−３ （１）ギン し−オルニチン １５６ １−３ （１−３）Ｌ−セリン １６０ ０．５−２ （１）Ｌ−リジン ２３３ １−１０ （３）し−プロリン ２４０３−・２ ００ （５０−１００）アミド Ｌ−ブロリンメ ２４１ ５−２５ （１０）チルエステル Ｌ−プロリル ２１０ ３０−２００ （５０−１００＞＝１−アラニン 表６２．６ｍ１４Ｎ Ｈ４°の存在下に液体培地にアミ対照（２，’６ ｍＨＮ Ｈ＜” ） １００ Ｌ−プロリン ５２８ １０−３００ （１００）Ｌ−アラニン ２４０ ２５ −２００ （５０）Ｌ−グルタミン ２４３ ５−７５ （５０）Ｌ−アルギニ ン １６８ ５−７５ （５０）Ｌ−リジン １８０ １−１０ （３）Ｂ、セ リ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｃ）の体細胞培養セリ科の代表として、セロリの 種子〔アビウム グラベオレンズ（＾ｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、カル マリオ（Ｃａｌｍａｒｉｏ）品種］を１−２週間で発芽させた。得られた苗を１ ０％のクロロックス（商標名）の溶液で２０分間殺菌した。子葉又は胚軸を外植 片として、それを２５μＭの２．４−Ｄと５μＭのベンジルアデニンとを含有す るホルモン非含有の０．８％固体寒天Ｓｌｌ培地上に置いた。カルス形成が開始 した後（３〜４週間）、カルスを２．５μＭの２．４−Ｄと０．５μＭのキネチ ンとを含有するＳＨ培地に移した。熱に不安定な添加物を濾過減菌してから温か い培地に添加した。必要な時に、改良スパーチルを使ってこれに一定１を充填す るごとによって、特定伍の接種組織を得た。Table 5 Addition of amino acids to solid cold medium in the presence of 2.6mM NH4” evening, Control (2,6100-- @1HNH4°) Shi-proline 330 10-300 (100) L-alanine 314 20 -・150 (75-100) L-glutamine 175 20-50 (30- 40) Shi-Arginine 244 5-50” (30-,40) L-Asparagus 155 0.5-3 (1) Gin Shi-ornithine 156 1-3 (1-3) L-serine 160 0.5-2 (1) L-lysine 233 1-10 (3) Shi-proline 2403-・2 00 (50-100) amide L-Brolinme 241 5-25 (10) Tyl ester L-prolyl 210 30-200 (50-100>=1-alanine Table 62.6m14N Ami control (2,’6) in liquid medium in the presence of H4° mHN H<”) 100 L-proline 528 10-300 (100) L-alanine 240 25 -200 (50) L-Glutamine 243 5-75 (50) L-Argini 168 5-75 (50) L-lysine 180 1-10 (3) B, Se Somatic cell culture of Umbelliferacaceae As a representative of the Umbelliferae family, celery Seeds [Avium graveolens (^pium graveolens), cal Calmario cultivar] was germinated in 1-2 weeks. 1 of the obtained seedlings Sterilize with 0% Clorox® solution for 20 minutes. Explant cotyledons or hypocotyls As a piece, it was added to a solution containing 25 μM 2.4-D and 5 μM benzyladenine. The cells were placed on 0.8% solid agar Sll medium without hormones. Callus formation begins After treatment (3-4 weeks), calli were treated with 2.5 μM 2.4-D and 0.5 μM Kinethi. The cells were transferred to SH medium containing Heat-unstable additives are sterilized by filtration before heating. was added to the medium. When necessary, fill this with constant 1 using modified spatyl. A specific grade of inoculated tissue was obtained by various procedures.
その後のカルスの継代培養は、１μＭのビクロラムと０．５μＭのベンジルアデ ニンを添加したＳｔ（培地上で行った。不定胚を作出する為に、７５ｍ３のカル ス細胞を、濾過減菌した添加物を含有するホルモン非含有の０．８％固体寒天培 地に移して、アルファルファと同じ条件下で２４℃において１８−３０日間培養 した。Subsequent subculturing of calli was carried out using 1 μM vichloram and 0.5 μM benzylidene. The experiment was carried out on St (medium) supplemented with Nin. In order to create somatic embryos, 75 m3 of culture Cells were cultured on filter-sterilized, hormone-free 0.8% solid agar medium containing additives. Transfer to soil and culture for 18-30 days at 24°C under the same conditions as alfalfa. did.
プロリン、−アラニン及びグルタミンのアミノ酸で処理した胚を、ＮＨ４’対照 で処理した胚と比較した。培地を５０ｍＨのアラニンで処理すると他のいずれの 処理よりも胚形成が高頻度に起こったと同時に、他の培地の場合よりも子葉と根 と第１次葉の発達が寸ぐれた胚がｔ９られた。Embryos treated with amino acids proline, -alanine and glutamine were compared to NH4' control. compared with embryos treated with When the medium was treated with 50 mH of alanine, no other At the same time, embryogenesis occurred more frequently than in other treatments, as well as in cotyledons and roots than in other media. Embryos with poorly developed primary lobes were harvested at t9.
形成された胚の総数の順序は次の如くであった。The order of the total number of embryos formed was as follows.
２０２０−１Ｏ０アラニン＞ ５０ｍＨプロリン＞ ２５ｍＭグルタミン−Ｎ＞ ２５ｍＨＮ Ｈ４” プロリンはグルタミンよりも胚形成を促進したが、グルタミンは苗条の胚をより 良り発達させた。アンモニウム処理した培地の場合には、他のいずれの処理の場 合よりも生長した胚が小さく数が少なかった。グルタミン酸は、３０ｍＨ濃度で 単独にセロリ再分化培地に添加すると、２５１１１８Ｎ ＨＪ’で処理した場合 に比べてセロリの胚の数を増加させる。上記の濃度のアラニン、プロリン、グル タミＮＨ４’で処理されたものに比べて幼植物体への再生率が、高かった。2020-1O0 Alanine> 50mH Proline> 25mM Glutamine-N> 25mHN H4” Proline promoted embryogenesis more than glutamine, but glutamine promoted embryogenesis in shoots more. Well developed. In the case of ammonium-treated media, any other treatment The embryos that grew were smaller and fewer in number than in the case of mating. Glutamic acid at a concentration of 30mH When added to celery regeneration medium alone, when treated with 251118N HJ' Increases the number of embryos in celery compared to. Alanine, proline, and glucose at the above concentrations The regeneration rate to seedlings was higher than that treated with TamiNH4'.
Ｃ，イネ科（ａｒａｍｉｎｅａｅ）の体細胞培養イネ科の代表径として、トウモ ロコシ（ｚｅａ ｌｌ１ａｙｓ）の不定胚形成を、本発明の培地を用いて行った 。C. Somatic cell culture of Poaceae (aramineae) As a representative diameter of Poaceae, corn Somatic embryo formation of Zea ll1ays was performed using the medium of the present invention. .
受精後１０日目のトウモロコシの穂を収穫して、これらの穂から無菌的に未成熟 な胚を切り出した。胚を２１日間、３％の蔗糖と５μＭの２．４−Ｄとを添加し たトロミネラル塩培地［チュー、シー・シー（Ｃｈｕ、Ｃ，Ｃ，）、ワン、シー 、シー（Ｗａｎｇ、Ｃ０Ｃ，）、スン、シー、ニス（Ｓｕｎ、 Ｃ，Ｓ、 ）、 シュー、シー（Ｈｓｕ、 Ｃ，）、イン、シー、シー（Ｙｉｎ、に、Ｃ１）及び チュー、シー、ワイ（Ｃｈｕ、 Ｃ，Ｙ、 ）ｉ、エスタブリツシュメント オ プ アン エフイシエント ミディアム フォー アンサ−カルチャー オプ ライス スルーコンパラティブ エクスベリメンツ オン ザ ナイトロジエン ソーセズ（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｒＡｆｉｃｉｅｎｔＩ Ｉｌｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｒｉｃｅ ｔ ｈｒｏｕｇｈＣｏＩｌｌｐａｒａｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｏｎ ｔｈ ｅ ｎ＋ｔｒｏｇｅｎ ５ｏｕｒｃｅｓ）、サイエンティア シニカ（Ｓｃｉ、 Ｓｉｎ、）１６巻第１３５９頁〜６８８頁）］に置床した。培養後に、Ｌ−プロ リンの存在下または非存在下に形成された各カルス上の胚集合体の形成率を測定 した。結果を表７に示す。この表中、反応パーセントは、胚の外植片を２８７− １１６５回反復した時の不定胚形成の平均回数である。Ears of corn are harvested 10 days after fertilization, and immature plants are aseptically extracted from these ears. The embryo was excised. Embryos were incubated with 3% sucrose and 5 μM 2.4-D for 21 days. Tromineral salt medium [Chu, C, C, Wang, C. , See (Wang, C0C,), Sun, See, Nis (Sun, C, S,), Hsu, See (Hsu, C,), In, See, See (Yin, ni, C1) and Chu, C, Y, Establishment O Puan Efficient Medium Four Answer Culture Op Rice Through Comparative Experiments on the Nitrogen Establishment of an Affiliate Iledium for another culture of rice hroughCoIllparative experiment Onth e n + trogen 5 sources), Scientia Sinica (Sci, Sin, Vol. 16, pp. 1359-688)]. After culturing, L-pro Measure the formation rate of embryo aggregates on each callus formed in the presence or absence of phosphorus did. The results are shown in Table 7. In this table, the percent response is 287- This is the average number of somatic embryo formations when repeated 1165 times.
表７ ト モロコシにおける胚カルス形成に対するＬ−プロリンの効果 ６ ２０、６ イネ科（Ｇｒａ［ｌ１ｉｎｅａｅ）植物を含む不定胚形成の別の実施例として、 イネ、オリザ サチバ（Ｏｒｙｚａ ５ａｔｉｖａ）、を本発明″の方法に従っ て再生した。Table 7 Effect of L-proline on embryonic callus formation in sorghum 6 20, 6 Another example of somatic embryogenesis involving Graineae plants is Rice, Oryza sativa (Oryza 5ativa), was grown according to the method of the present invention. I played it.
オリザ サチバの種子の穀皮を取り除き、表面を滅菌してから、ムラ′シゲース クーグ（ＭＳ）塩類（（Ｈｕｒａｓｈｉｇｅ、Ｔ、 ａｎｄ Ｆ、５ｋｏｏａ） （１９６２年）、前記文献を参照］に４％の蔗糖、０．２６ｍＨのトリプトフ ァン、５μＭの２．４−Ｄ及び１μＭのキネチンを加え、ｐＨが６．２でゲル化 剤として２．５ｇ／ｆｌのゲルライトを含有する培地上に置いた。１５−２１日 後に、解剖顕微鏡を使って種子の胚盤上の胚形、成率を測定した。Ｌ−プロリン を用いた場合と用いない場合の処理を表８に示す。After removing the husk of Oryza sativa seeds and sterilizing the surface, Koog (MS) salts ((Hurashige, T, and F, 5kooa) (1962), 4% sucrose, 0.26 mH tryptopophenyl Add 5 μM 2.4-D and 1 μM kinetin and gel at pH 6.2. The cells were placed on a medium containing 2.5 g/fl Gelrite as an agent. 15-21 days Later, the embryo shape and growth rate on the scutellum of the seeds were measured using a dissecting microscope. L-proline Table 8 shows the processing when using and not using.
族８．イネのカルス培養時における ３０ ６４．９ Ｄ、アオイ科の体細胞培養 アオイ科植物の体細胞組織に対する本発明の実施例として、本鈴明により作成し た培地中で２種のワタの培養組織を再生した。Family 8. During rice callus culture 30 64.9 D. Somatic cell culture of Malvaceae As an example of the present invention for the somatic tissue of a mallow plant, it was created by Akira Motosuzu. Cultured tissues of two types of cotton were regenerated in the same culture medium.
ゴシビウム・ヒルスタム（Ｇ ＯＳｓｙｌｌｉｕｍ ｈｉｒｓＩＪｔｔｌｍ） ：ゴシビウム・ヒルスタムの表面殺菌した種子からの培養組織を、ムラシゲ−ス クーグ（Ｈｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）塩類、３％の蔗糖、０．５ μＭのＮＡＡ、５μＭの２−イソペンタニルアデニン及び０．８％の寒天培地に 移し、４週間の継代培養を行なった。培養細胞をまず１０日間培養し胚を分化誘 導した。この場合の培地は０，５μＭの２．４−り及び０，２μＭのキネチン、 あるいは１μＭのＮＡＡと０．５μＭのキネチンを含有するもので、ブロリ、ン を添加または無添加とし、液体培養を行った。そして細胞をホルモンを含有せず 、３％の蔗糖と１０１１１Ｍのし−グルタミンを有するＳＨ培地に移し、再生を 行った。Gossyllium hirstum (G OSsyllium hirsIJttlm) : Cultured tissues from surface-sterilized seeds of Gossybium hirsutum were cultured using Murashige. Hurashige and Skoog salts, 3% sucrose, 0.5 μM NAA, 5 μM 2-isopentanyladenine and 0.8% agar. The cells were transferred and subcultured for 4 weeks. Cultured cells are first cultured for 10 days and embryos are induced to differentiate. guided. In this case, the medium contained 0.5 μM 2.4-ri and 0.2 μM kinetin, Alternatively, one containing 1 μM NAA and 0.5 μM kinetin, Liquid culture was performed with or without addition of . and cells without hormones , transferred to SH medium with 3% sucrose and 10111M salt-glutamine for regeneration. went.
４週間経過後、成熟子葉を有する胚形成について培養組織を評価した。その結果 を表９に示ず。After 4 weeks, cultures were evaluated for embryogenesis with mature cotyledons. the result are not shown in Table 9.
表９．液体培養での子葉ワタ（ゴシビウム・ヒルスタム）の子葉期胚の再生に及 ぼ コシピウム・り０ツチアナム（Ｑ ｏｓｓｙｐｉｕｍ ｋｌｏｔｚｓ−ｃｈｔａ ｎｕｍ） ：表面殺菌した種子からの培養物を、ムラシゲ−スクーグ塩類、３％ の蔗糖、０．５μＭのＮＡＡ及び５μＭの２−イソペンタニルアデニンの培地に 移し、継代培養を行なった。カルスをＭＳ塩類、３％の蔗糖及び０．２μＭのビ クロラムの培地で１０日間培養した後、植物体を再生する為にホルモンを含まな い培地にＬ−グルタミンを添加して２１日間培養した。その結果を表１０に示す 。Table 9. Regeneration of cotyledon stage embryos of cotyledonous cotton (Gossybium hirsutum) in liquid culture. Bo Q ossypium klotzs-chta num): Cultures from surface-sterilized seeds were mixed with Murashige-Skoog salts, 3% of sucrose, 0.5 μM NAA and 5 μM 2-isopentanyladenine. The cells were transferred and subcultured. Callus was treated with MS salts, 3% sucrose and 0.2 μM bicarbonate. After 10 days of cultivation in chloram medium, the plants were grown without hormones in order to regenerate. L-glutamine was added to the fresh medium and cultured for 21 days. The results are shown in Table 10. .
表１０ ゴシビウム・クロツヂアナム（Ｇ ｏｓｓｙ−ｐｉｕｍ ｋｌｏｔｚｓ ｃｈｉａｎｕｍ ）におけるＬ−グルタミンの胚形成に及ぼす効果 ２０ ３、５ ２、アミノ酸とアンモニウムイオン源との相互作用かけ、その後、固体培地で培 養した。プロリン、アルギニン、及びＮＨ４“の濃度を様々に変化させて、一種 類の添加物を単独に使用する際のａ１！ｉｅ度が別の添加物を添１、プロリン： プロリン濃度を３ｉ）ｍ）ｌ乃至３００Ｉｌ１Ｍの範囲にわたり、またＮＨ４ °の添加母を０ないし２５ｍＨにわたって変化させた。その結果を表１１に示す 。Table 10 Gossy-pium klotzs Effect of L-glutamine on embryogenesis in C. chianum) 20 3, 5 2. Interaction between amino acids and ammonium ion source, followed by culturing on solid medium. fed. By varying the concentrations of proline, arginine, and NH4, a1 when using the same additive alone! ie degree added with another additive 1, proline: The proline concentration ranged from 3i)m)l to 300Il1M, and NH4 The addition rate of ° was varied from 0 to 25 mH. The results are shown in Table 11. .
２、アルギニン： 項目１と同様に、アルギニン濃度を変えるとともに培地に添 加するＮＨ４”の濃度を変化させた。その結果を表１１に示す。2. Arginine: Same as item 1, change the arginine concentration and add it to the medium. The concentration of NH4'' added was varied. The results are shown in Table 11.
表１１ アルファルファにおけるアミノ酸とアンモニウムイオンとの相互作用（ ７回 以上の一験で１ひた胚の平均数） プロリン濃度（ｍＨ） ３０ １００ ３ゼＨＨ４°ｖｉ度（ｍＨ） ０ ３２Ｇ ４７０ １３３ １．０ ’ ５０２ ７４７ ５４１ ２．６ ７５３ ７３１ ８２５ １０．０ ８８７ ８１１ ５７２ アルギニン漠度（ｍＨ） ＮＨａ”１度（ｍＨ） ０ １０ ３０ １０００ １２ １４７ １２Ｂ ９ ９ １．０ ７０ ２５２ ２４６ １５７２．６ ２０７ ２９８ ３０Ｂ ２６ ４１０．０ ３４０ ４０８ ４１１ ３１１２５．０ ３３５ ２９７ ２３ ３ １４８いずれのケースにおいても最″３ａｆｆｌのアルギニン又はプロリン に対して、同じく最適口のＮＨ４”を加えたとぎに相乗効果を発揮することを示 している。Table 11 Interaction between amino acids and ammonium ions in alfalfa ( 7 times The average number of embryos in the above experiment) Proline concentration (mH) 30 100 3zeHH4°vi degrees (mH) 0 32G 470 133 1.0’ 502 747 541 2.6 753 731 825 10.0 887 811 572 Arginine vagueness (mH) NHa” 1 degree (mH) 0 10 30 1000 12 147 12B 9 9 1.0 70 252 246 1572.6 207 298 30B 26 410.0 340 408 411 31125.0 335 297 23 3 148 In any case, the maximum amount of arginine or proline It has been shown that a synergistic effect is produced when NH4, which is also at the optimum level, is added to are doing.
また表１１の実施例の部分的繰返しで、ＮＨａ’とＬ−プロリンとの種々の濃度 に対応する不定胚の数量と植物体への再生率を下記の通り測定した。Also, by partially repeating the example in Table 11, various concentrations of NHa' and L-proline The number of somatic embryos and the rate of regeneration into plants were measured as follows.
表１２．不定胚の量と質に及ぼすアンモニウムイオンとプロリンとの効果 ０ ２、６ ３Ｇ±５４±３ ０ ２５ ６０±６９±５ １０ ２．６ ９５±１２２５±５ ３０ ２．６ １３４±１７４２±７ １００ ２．６ １７５±１９４２±４３０ １０ １８７±２４４２±６ 上記の結果からプロリンにアンモニウムイオンを加えた培地が胚の敗退を増加す ること、また多少にかかわらずアンモニウムイオンの存在下でプロリンが胚の品 質を向上することが明らかである。Table 12. Effects of ammonium ion and proline on the quantity and quality of somatic embryos 0 2, 6 3G±54±3 0 25 60±69±5 10 2.6 95±1225±5 30 2.6 134±1742±7 100 2.6 175±1942±430 10 187±2442±6 The above results indicate that the medium containing ammonium ions in addition to proline increases the loss of embryos. It is also important to note that in the presence of more or less ammonium ions, proline is It is clear that it improves quality.
３、アンモニウムイオンを実質的に含まない培地へのア例と同じ方法でアルファ ルファＩＢｌ胞を分化誘導し、固体培地、で培養した。アミノ酸の濃度を一定範 囲内で変化させるとともに、不定胚形成に及ぼす影響について試験した。その結 果を表１３に示す。3. Add alpha to a medium substantially free of ammonium ions using the same method as in Example 3. The Luca IBl cells were induced to differentiate and cultured on a solid medium. The concentration of amino acids is kept within a certain range. The effect on somatic embryo formation was examined. The result The results are shown in Table 13.
表１３．実質的にＮＨ４°を含まない固体寒天培地にアミノ酸を添加することに よる、 アルファルファの不定胚形成の促進 添加物 促進最大値％ 濃度範囲ｍＨ至適濃度ｍＨ対照 ｉｏｏ −− （ＮＨｓ”不在） Ｌ−プルリン ５２５ ６−３００ （１０−３０）Ｌ−アルギニン １，２０ ０ １−１００ （２０−５０）［−アスパラギン ７５０ １−１００ （２ −１０）Ｌ−オルニチン ９００ ０．３−３ （１）Ｌ−リジン ５００ １ −１０ （３）ＮＨ４°の実質的不在下において、上記のアミノ酸は培地におけ る単独の還元型窒素源として不定胚形成を促進することが表１３に示されている 。さらに、オルニチンを除き、上記に示された濃度範囲全域にわたって、上記ア ミノ酸の添加により、大きさ、形、成熟度において、形成された胚め質の実質的 向上が得られた。Table 13. Adding amino acids to a solid agar medium that does not substantially contain NH4° evening, Promotion of somatic embryo formation in alfalfa Additive Maximum promotion value % Concentration range mH Optimal concentration mH Control ioo -- (NHs” absent) L-Purulin 525 6-300 (10-30) L-Arginine 1,20 0 1-100 (20-50) [-Asparagine 750 1-100 (2 -10) L-ornithine 900 0.3-3 (1) L-lysine 500 1 -10 (3) In the substantial absence of NH4°, the above amino acids Table 13 shows that somatic embryo formation is promoted as a sole reduced nitrogen source. . Furthermore, with the exception of ornithine, the above-mentioned Due to the addition of amino acids, the formed embryonic plasm is substantially reduced in size, shape and maturity. Improvement was obtained.
４、アミノ酸の組合せ 次の表は、アミノ酸を組合せたものをＮＨ４”の不在下で、アルファルファ培養 物に添加した際の効果について示している。アミノ酸を組合せることにより、胚 の数の増加において相乗効果が得られる。4. Combination of amino acids The following table shows the combinations of amino acids grown on alfalfa in the absence of NH4. It shows the effects when added to substances. By combining amino acids, embryo A synergistic effect is obtained in increasing the number of
実験１ ５０ｍＨＬ−プロリン ８０ ３０ｍＨＬ−グルタミン ５０ ５０ｎ＋Ｈプロリン＋３０ｍＨグルタミン ２４８実験２ １００ｍＨＬ−プロ リン ２７ｉ００ｍＨＬ−アラニン ７４ １００ｍＨＬ−プロリン＋５０ｍＨＬ−アラニン ２１５３０＋ｎＨＬ−アルギ ニン １３５ １００ｍＨブＯリン→−３０１１ＩＨアルギニン ２１５プロリンと他のアミノ 酸件の組合せを含む処理により、最も大きい、最も質の良い胚の形成が見られた 。Experiment 1 50mHL-proline 80 30mHL-Glutamine 50 50n+H Proline + 30mH Glutamine 248 Experiment 2 100mHL-Pro Phosphorus 27i00mHL-Alanine 74 100mHL-Proline + 50mHL-Alanine 21530 + nHL-Algium Nin 135 100mH proline → -3011IH arginine 215 proline and other amino Treatments containing combinations of acid conditions resulted in the formation of the largest and highest quality embryos. .
理解を深めるため、図及び実施例により本願発明を詳アミノ酸溌度（吐） 第１図 国際調査報告 １″ｌ＊ｕｖ＋Ｉａ１１ｈ＊ｗｈｒｍｎｕａ、、ＣＴ、、、ｑ、 ６．ｎ、、ウ スFor better understanding, the present invention will be explained in detail with figures and examples. Figure 1 international search report 1″l*uv+Ia11h*whrmnua,,CT,,,q,6.n,,u vinegar
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