JPS63304996A - Fused protein and production thereof - Google Patents
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- JPS63304996A JPS63304996A JP62138917A JP13891787A JPS63304996A JP S63304996 A JPS63304996 A JP S63304996A JP 62138917 A JP62138917 A JP 62138917A JP 13891787 A JP13891787 A JP 13891787A JP S63304996 A JPS63304996 A JP S63304996A
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は新しい融合タンパク質に関する。本発明によっ
て融合タンパク質を大量に製造することができる。本発
明の融合タンパク質から得られるペプチドは、すい臓細
胞に作用してインスリン分泌を促進させるので医薬品と
して有用である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION <Industrial Application Field> The present invention relates to a new fusion protein. According to the present invention, fusion proteins can be produced in large quantities. The peptide obtained from the fusion protein of the present invention acts on pancreatic cells to promote insulin secretion and is therefore useful as a pharmaceutical.
〈従来の技術〉
本発明に係わるペプチドは、唾液中から見出されたアミ
ノ酸４４個からなるペプチドであり、唾液ペプチドｐ−
ｃと命名されている（Ｓ、 ｌ５ｅｎ＋ｕｒａｅｔ ａ
ｌ、、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８６．７９−８６
（１９７９）） ｏ この唾液ペプチドＰ−Ｃ（以下、
ペプチドＰ−Ｃと略ス）ハ、すい臓細胞に作用してイン
スリン分泌を促進させるので医薬品として有用な可能性
がある。<Prior art> The peptide according to the present invention is a peptide consisting of 44 amino acids found in saliva, and is a salivary peptide p-
c (S, l5en+uraet a
l,, J,Biochem,, 86.79-86
(1979)) o This salivary peptide P-C (hereinafter referred to as
Peptide PC (abbreviated as s)) acts on pancreatic cells and promotes insulin secretion, so it may be useful as a pharmaceutical.
しかし今までに有利な製造力はなかった。アミノ酸合成
では収率が悪く、一方このペプチドを遺伝子組換え法に
より大腸菌で直接製造しようとすると、著しく収率が悪
い。But until now there was no advantageous manufacturing capacity. Amino acid synthesis results in poor yields, and on the other hand, when this peptide is directly produced in Escherichia coli using genetic recombination methods, the yield is extremely poor.
〈発明が解決しようとする問題点〉
本発明の目的は、ペプチドＰ−Ｃを効率良く生産するた
めの新しい融合タンパク質を提供することにあり、さら
にかかる融合タンパク質を遺伝子操作の手法を用いて生
産することにある。<Problems to be Solved by the Invention> An object of the present invention is to provide a new fusion protein for efficiently producing peptide PC, and furthermore, to provide a new fusion protein for efficiently producing peptide PC, and furthermore, to produce such a fusion protein using genetic engineering techniques. It's about doing.
く問題点を解決するための手段〉 上記の目的は以下の本発明により達成される。Means to solve problems〉 The above objects are achieved by the following invention.
すなわち本発明は、下記アミノ酸配列を有するペプチド
Ｐ−Ｃと、
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉ ｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇ
Ｉ ｎ−Ｇ ｌ ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−８ｅｒ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ
分子量１万以上のタンパク質とを切断可能に連結してな
る融合タンパク質、およびかかる融合タンパク質をコー
ドする遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換された
形質転換体を培養することを形質転換する融合タンパク
質の製造方法に関する。That is, the present invention provides peptide PC having the following amino acid sequence, and Gly-Arg-Pro-Gln-Gly-Pro-P.
ro-Gln-Gln-Gly-Gly-His-Gl
n-Gln-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro
-Pro-Pro-G I y-Lys-Pro-G
I n-G ly-Pro-Pro-Pro-G I
n-Gly-Gly-Arg-Pro-Gln-Gl
y-Pro-Pro-Gln-Gly-Gln-8er
-Pro-Gln A fusion protein formed by cleavably linking a protein with a molecular weight of 10,000 or more, and an expression vector containing a gene encoding such a fusion protein. The present invention relates to a method for producing a fusion protein.
ペプチドＰ−Ｃと連結する本発明の分子量１万以上のタ
ンパク質は、特に限定されないが発現量が多く安定なも
のが好ましく、例えばトリプトファン合成酵素Ｅ（以下
ＴｒｐＥと略す）や、β−ガラクシトダーゼ等大腸菌の
タンパク質であって、大腸菌にとって無害であり大腸菌
に多量蓄積され得るもの、あるいはヒトインターフェロ
ン−γ（以下ヒトＩＦＮγと略す）、ヒトインターフェ
ロンβ（以下ヒトＩＦＮβと略す）等が好ましく、特に
ＴｒｐＥが好ましく用いられる。The protein of the present invention having a molecular weight of 10,000 or more that is linked to the peptide P-C is not particularly limited, but is preferably one that is highly expressed and stable, such as tryptophan synthase E (hereinafter abbreviated as TrpE), β-galactidase, etc. Proteins that are harmless to E. coli and can be accumulated in large quantities in E. coli, human interferon-γ (hereinafter abbreviated as human IFNγ), human interferon β (hereinafter abbreviated as human IFNβ), etc. are preferred, and TrpE is particularly preferred. used.
また、ペプチドＰ−Ｃと分子量１万以上のタンパク質と
の連結順序は、特に限定しないが分子量１万以上のタン
パク質が新しい融合タンパク質のＮ末端側に、ペプチド
Ｐ−ＣがＣ末端側に配置する方がより好ましい。Furthermore, the order in which the peptide P-C is linked to the protein with a molecular weight of 10,000 or more is not particularly limited, but the protein with a molecular weight of 10,000 or more is placed on the N-terminal side of the new fusion protein, and the peptide P-C is placed on the C-terminal side. is more preferable.
切断可能に連結するとは、後に融合タンパク質からペプ
チドＰ−Ｃを容易に切断できる部位を両者の連結部分に
設けることであり、例えばメチオニンを介してペプチド
Ｐ−Ｃと分子ｍ１万以上のタンパク質を結合するように
設計すれば、後に生産された融合タンパク質をブロモシ
アン分解することにより、容易に切断分離することがで
きる。Cleavably linking means to provide a site in the connecting portion between the two that allows the peptide P-C to be easily cleaved from the fusion protein later.For example, when the peptide P-C and a protein with a molecular weight of 10,000 or more are linked via methionine. If designed to do so, the fusion protein produced later can be easily cleaved and separated by bromocyanolysis.
また部位特異的なプロテアーゼの切断部位を連結部分に
設けることもできる。もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。Furthermore, a site-specific protease cleavage site can be provided at the connecting portion. Of course, the present invention is not limited to these.
遺伝子操作の手法を用いて本発明の融合タンパク質を得
るには、ペプチドＰ−Ｃおよび分子量１万以上のタンパ
ク質のそれぞれをコードする遺伝子を、切断可能な部位
をコードする遺伝子を介して連結したＤＮＡに、発現の
ための適当な制御部位を結合することにより、ベクター
内での発現が達成される。In order to obtain the fusion protein of the present invention using genetic engineering techniques, genes encoding the peptide P-C and a protein with a molecular weight of 10,000 or more are linked via a gene encoding a cleavable site. Expression within the vector is achieved by joining the appropriate control sites for expression to the vector.
ペプチドＰ−Ｃをコードする遺伝子は、前記の４４個の
アミノ酸配列をコｉドする遺伝子であって、下記に示す
塩層配列がその代表例である。The gene encoding peptide PC is a gene cocoding the above-mentioned 44 amino acid sequence, and the salt layer sequence shown below is a typical example thereof.
この遺伝子は化学的に合成することができる。This gene can be chemically synthesized.
例えば、第１図に示すようにＡ−１〜Ａ−７およびＢ−
１〜Ｂ−７の１４本のオリゴマーを合成し、それを第２
図に示す方法により結合することにより、全合成するこ
とができる。For example, as shown in FIG. 1, A-1 to A-7 and B-
Synthesize 14 oligomers 1 to B-7, and add them to the second
Total synthesis can be achieved by combining by the method shown in the figure.
本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子を利用して
、遺伝子組換え法によりかかる融合タンパク質を生産さ
せるための宿主としては、動植物細胞、酵母、大腸菌等
が用いられる。本発明方法にあっては大腸菌を用いる方
法が好ましく、以下その方法について説明する。大腸菌
内で発現させるためには、転写開始のためのプロモータ
ー配列および翻訳のためのＳＤ配列、ＡＴＧコドンをそ
の前部に付与する必要がある。プロモーター配列として
は、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌｐｐ等の遺伝子のプ
ロモーター、あるいはｔｒｐとｌａＣの融合プロモータ
ーであるｔａｃプロモーター等が知られているが、プロ
モーターとしての活性を有する配列であればどのような
ものでも良い。Animal and plant cells, yeast, Escherichia coli, and the like are used as hosts for producing the fusion protein by genetic recombination using the gene encoding the fusion protein of the present invention. In the method of the present invention, a method using E. coli is preferred, and this method will be explained below. In order to express it in E. coli, it is necessary to add a promoter sequence for transcription initiation, an SD sequence for translation, and an ATG codon to its front part. As promoter sequences, promoters of genes such as lac, trp, recA, and lpp, and the tac promoter, which is a fusion promoter of trp and laC, are known, but any sequence that has promoter activity can be used. Anything is fine.
好ましくはｔｒｐプロモーターのような強いプロモータ
ーを用いることが良い。ＳＤ配列はりボゾームＲＮＡの
結合部位であり、翻訳には必須の部位である。本発明に
おいてはＳＤ配列について代表例を示すが特に限定する
ものではない。このように構成された融合タンパク質発
現のための制御部位に、翻訳のための信号ＡＴＧコドン
を付与した融合タンパク質を暗号化する塩基配列を連結
することにより発現は達成される。Preferably, a strong promoter such as the trp promoter is used. The SD sequence is a binding site for ribosomal RNA and is an essential site for translation. In the present invention, typical examples of SD sequences are shown, but the present invention is not particularly limited. Expression is achieved by linking a base sequence encoding a fusion protein provided with a signal ATG codon for translation to the thus constructed control site for expression of the fusion protein.
このようにして得られたＤＮＡを宿主に導入するには、
ベクターＤＮＡを利用する。大腸菌で用いられるベクタ
ーＤＮＡとしてはｐＢＲ３２２、ｐｓｃｌｏｌなどに代
表されるプラスミドＤＮＡ。To introduce the DNA obtained in this way into a host,
Use vector DNA. Vector DNA used in E. coli includes plasmid DNA such as pBR322 and pscroll.
およびλファージのようなファードＤＮＡが挙げられる
がいずれをも用い得る。このベクターＤＮＡと前記の融
合タンパク質を発現するよう構成されたＤＮＡを連結し
て発現ベクターとする。第４図にヒトＩＦＮβとペプチ
ドＰ−Ｃの融合タンパク質の発現ベクターの作製方法の
一例を、第５図にヒトＩＦＮγとペプチドＰ−ｃの融合
タンパク質の発現ベクターの作製方法の一例を、第６図
にＴｒｐＥとペプチドＰ−Ｃの融合タンパク質の発現ベ
クターの作製方法の一例を各々示す。次に公知の方法Ｃ
ＭａｎｆａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｔｏｎｉｎ
ｇ ’Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｕｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２） ｐ２５Ｇ−２５５〕
に従い、大腸菌と発現ベクターを接触させれば形質転換
体を得ることができる。and phaged DNA such as λ phage, any of which can be used. This vector DNA is ligated to a DNA configured to express the fusion protein described above to obtain an expression vector. Fig. 4 shows an example of a method for producing an expression vector for a fusion protein of human IFNβ and peptide P-C, Fig. 5 shows an example of a method for producing an expression vector for a fusion protein of human IFNγ and peptide P-c, and Fig. 6 shows an example of a method for producing an expression vector for a fusion protein of human IFNγ and peptide P-c. Each figure shows an example of a method for producing an expression vector for a fusion protein of TrpE and peptide PC. Next, known method C
Manfatis et al. Molecular atonin
g 'Co1d Spruing Harbor La
laboratory (1982) p25G-255]
Accordingly, a transformant can be obtained by contacting E. coli with an expression vector.
形質転換された大腸菌株について、天然培地、半合成培
地、合成培地を用いて公知の方法で培養することにより
、融合タンパク質を得ることができる。得られた融合タ
ンパク質は一般的な方法で精製できるが、融合したタン
パク質の性質を利用すると便利である。例えば、Ｔｒｐ
ＥやヒトＩＦＮγまたはヒトＩＦＮβの抗体を結合した
抗体カラムを用いれば、一段でほぼ純品に近い融合タン
パク質が得られる。A fusion protein can be obtained by culturing the transformed E. coli strain using a natural medium, semi-synthetic medium, or synthetic medium by a known method. Although the obtained fusion protein can be purified by standard methods, it is convenient to utilize the properties of the fused protein. For example, Trp
By using an antibody column bound with E, human IFNγ, or human IFNβ antibodies, a nearly pure fusion protein can be obtained in one step.
精製した融合タンパク質をブロモシアン分解することに
より、天然と全く同じ形でペプチドｐ−Ｃを分離するこ
とができる。By subjecting the purified fusion protein to bromocyanolysis, the peptide p-C can be separated in exactly the same form as its natural form.
く実 施 例〉
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明は無論これに限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples below, but the present invention is of course not limited thereto.
実施例１
ｐｃ遺伝子の設計と合成
ペプチドＰ−Ｃの４４アミノ酸のＮ末端に大腸菌での翻
訳開始に必要なメチオニンを付加した４５アミノ酸をコ
ードするＤＮＡ配列を、大腸菌のコドン使用頻度（Ｇｒ
ａｎｔｈａｍ、 Ｒ，ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ、 Ａ
ｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、、 ９． ｒ４３−ｒ７４（１９
８１））をもとに考察した。Example 1 Design and synthesis of pc gene A DNA sequence encoding 45 amino acids with methionine added to the N-terminus of the 44 amino acids of peptide P-C, which is necessary for initiation of translation in E. coli, was prepared based on the codon usage frequency (Gr) of E. coli.
antham, R, et al, Nucl, A
c1ds, Res, 9. r43-r74 (19
81)).
さらに終止コドンＴＡＡに加えて、Ｎ末側に制限酵素Ｃ
１ａＩの切断部位を、Ｃ末側にＢｇｌＩ［の切断部位を
つけた１４７塩基対のＰＣ遺伝子をＡ１〜Ａ７およびＢ
１〜Ｂ７の１４本のオリゴマー（１６〜２５マー）に分
けて合成した（第１図参照）。Furthermore, in addition to the stop codon TAA, the restriction enzyme C
A1 to A7 and B
The oligomers were synthesized into 14 oligomers (16-25 mers), numbered 1 to B7 (see Figure 1).
末端のオリゴマーＡ１およびＢ１を除いた１２本のオリ
ゴマーの５′端をリン酸化したあと、相補的な２本ある
いは３本のオリゴマー 各１５０ｐｍｏ ｌをアニーリ
ング（７０℃、１５分間加熱後室温までゆっくり冷す操
作）して、６本の二本鎖ＤＮＡとした。これら６本のＤ
ＮＡをＴ４ＤＮＡす′ガーゼを用いて結合することによ
り、ＰＣ遺伝子を合成した（第２図参照）。After phosphorylating the 5' ends of the 12 oligomers excluding terminal oligomers A1 and B1, 150 pmol each of two or three complementary oligomers were annealed (heated at 70°C for 15 minutes and then slowly cooled to room temperature. 6 double-stranded DNAs were obtained. These six D
The PC gene was synthesized by joining NA to T4 DNA using gauze (see Figure 2).
実施例２
ｐ−ｃ発現ベクターｐＫＭＰＣの作製
ｐＫＭＰＣは大腸菌トリプトファンプロモーターの支配
下にＰＣ遺伝子が置かれたベクターである。作製方法は
以下の通りである（第３図参照）。Example 2 Preparation of pc expression vector pKMPC pKMPC is a vector in which the PC gene is placed under the control of the E. coli tryptophan promoter. The manufacturing method is as follows (see Figure 3).
実施例１で得られたＰＣ遺伝子断片１ 、５ ｐｉｏｌ
とｐ ＫＭ６ （Ｔａｎａｋａ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、
、 Ｊ、 ＩＦＮ、 Ｒｅｓ、。PC gene fragments 1 and 5 piol obtained in Example 1
and p KM6 (Tanaka, T. et al.
, J. , ,FN, ,Res.
６、４２９−４３５ （１９８Ｂ））のＣ１ａＩ／Ｂｇ
ｌＩＩ長鎖断片約０．１ｐ■ｏｆをＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させたあと、大腸菌ＭＣ１０６１ｒｅｃＡ
（−）を形質転換し、７７個の形質転換体を得た。３
２Ｐ末端ラベルしたオリゴマーＢ１およびＢ３をプロー
ブとしたコロニーハイブリダイゼーションの結果、この
うち１８個がＰＣ遺伝子を含むことがわかった。さらに
、ＰＣ遺伝子内に存在する制限サイトの確認を行なった
ところ、１８個のうち１３個が正しいＰＣ遺伝子を持つ
と推測された。 こうして得られたクローンの１つ６・
５のＨｐａＩ／ＢｇｌＩ１１７５塩基対のＤＮＡｆ７ｉ
：ＭＩ ３ｍｐｌ ＯおよびＭ１３ｍｐＨのＨｉｎｃＩ
Ｉ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し、デオキシ−７−ジアザ
グアノシントリフォスフエイトを用いたジデオキシ法（
Ｍｌｚｕｓａｗａ、 Ｓ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｎｕｃｌ
、 Ａｃ１ｄｓ、 Ｒｅｓ、、 １４．１３１９−１３
２４ （１９８Ｂ）］でＤＮＡ塩基配列決定したところ
、設計通りの配列を持つことが確認された。6, 429-435 (198B)) C1aI/Bg
After ligating approximately 0.1pof of lII long-chain fragments using T4 DNA ligase, E. coli MC1061recA
(-) to obtain 77 transformants. 3
As a result of colony hybridization using 2P end-labeled oligomers B1 and B3 as probes, 18 of them were found to contain the PC gene. Furthermore, when the restriction sites present in the PC gene were confirmed, 13 out of 18 were estimated to have the correct PC gene. One of the clones thus obtained6.
5 HpaI/BglI1175 base pair DNAf7i
: MI 3mpl O and M13mpH HincI
I/BamHI site and the dideoxy method using deoxy-7-diazaguanosine triphosphate (
Mlzusawa, S. et al., Nucl.
, Ac1ds, Res, 14.1319-13
24 (198B)], it was confirmed that the DNA sequence was as designed.
実施例３
β・Ｐ−Ｃ発現ベクターｐβＰＣの作製ｐβＰＣは、ヒ
トＩＦＮβのＣ末端アミノ酸Ａｓｎの後にＳｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｍｅｔの３アミノ酸をはさんでペプチドＰ−Ｃがつ
ながった融合タンパク質を発現させるベクターである。Example 3 Preparation of β・P-C expression vector pβPC pβPC consists of Ser-Th after the C-terminal amino acid Asn of human IFNβ.
This is a vector that expresses a fusion protein in which the peptide PC is linked with three amino acids of r-Met.
作製方法は以下の通りである（第４図参照）。The manufacturing method is as follows (see Figure 4).
まず、実施例２のｐＫＭＰＣをＣ１ａＩで切断してから
、ＤＮＡポリメラーゼＩ ｋｌｅｎｏｗ断片処理により
平滑末端化したあと、５ａｌＩで切断しＰＣ遺伝子を含
む短鎖断片を分離した。次に、ｐＫＭ６−ＣＸｈｏ（特
願昭６２−５６６７６）をＸｈｏＩで切断してから、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩｋｌｅｎｏｖ断片処理により平滑末
端化したあと、５ａｌＩで切断しヒトＩＦＮβ遺伝子を
含む長鎖断片を分離した。これら二つのＤＮＡ断片を７
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合することにより、ｐβＰ
Ｃを作製した。ヒトＩＦＮβ遺伝子とペプチドＰＣ遺伝
子の結合部位の配列をジデオキシ法により決定し、目的
通りの配列であることを確認した。First, pKMPC of Example 2 was cut with C1aI, blunt-ended by DNA polymerase I klenow fragment treatment, and then cut with 5alI to isolate a short fragment containing the PC gene. Next, pKM6-CXho (Japanese Patent Application No. 62-56676) was cut with XhoI, and then D
After blunt-ending with NA polymerase Iklenov fragment treatment, the long-chain fragment containing the human IFNβ gene was isolated by cutting with 5alI. These two DNA fragments are 7
pβP by ligation using 4DNA ligase.
C was produced. The sequence of the binding site between the human IFNβ gene and the peptide PC gene was determined by the dideoxy method, and it was confirmed that the sequence was as desired.
このベクターから合成されるβ・Ｐ−Ｃ融合タンパク質
は２１３アミノ酸からなり、ブロモシアン分解によりヒ
トＩＦＮβ由来の４つのペプチド（３５，２６，５５そ
れに５２アミノ酸）とペプチドＰ−Ｃ（４４アミノ酸）
に分かれる。The β/P-C fusion protein synthesized from this vector consists of 213 amino acids, and 4 peptides derived from human IFNβ (35, 26, 55, and 52 amino acids) and the peptide P-C (44 amino acids) are synthesized by bromocyanolysis.
Divided into.
実施例４
γ・Ｐ−Ｃ発現ベクターｐγＰＣの作製ｐγＰＣは、ヒ
トＩＦＮγのＣ末端アミノ酸Ｇ１ｎの後にＡｓｎＡｓｎ
−３ｅｒ−の３つのアミノ酸をはさんでペプチドＰ−Ｃ
がつながった融合タンパク質を発現させるベクターであ
る。作製方法は以下の通りである（第５図参照）。Example 4 Preparation of γ・P-C expression vector pγPC pγPC consists of AsnAsn after the C-terminal amino acid G1n of human IFNγ.
Peptide P-C between three amino acids of -3er-
This is a vector that expresses a fusion protein in which The manufacturing method is as follows (see Figure 5).
まず、実施例２のｐＫＭＰＣをＰＣ遺伝子の上流にある
Ｃ１ａＩで切断後、ＤＮＡ’ポリメラーゼＩ ｋｌｅ
ｎｏｗ断片処理により平滑末端化してから、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてＥｃｏＲＩリンカ−を付けることによ
り、Ｃ１ａＩサイトをＥｃｏＲＩサイトに変えたベクタ
ーｐＫＭＰＣ（Ｃ−Ｅ）を作製した。次に、ｐＫＭＰＣ
（Ｃ−Ｅ）をＥｃｏＲＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ ｋｌｅｎｏｗ断片処理により平滑末端化してから、
ＢｇｌＩＩで切断しＰＣ遺伝子からなる１５１塩基対の
ＤＮＡ断片を分離した。また、ｐ５ｈｕγＮ Ｉ−ＣＫ
ｐｎ（特願昭６２−５６６７６）をＫｐｎＩで切断後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑末端化してから
、ＢａｍＨＩで切断したあと、大腸菌アルカリフォスフ
ァターゼ処理により末端のリンを除いたベクターを調製
した。これら二つのＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガーゼを
用いて結合することにより、ｐγＰＣを作製した。ヒト
ＩＦＮγ遺伝子とＰＣ遺伝子のつなぎ目の配列が正しい
ことは、再生したＥｃｏＲＩサイトにより確認した。First, pKMPC of Example 2 was cut with C1aI located upstream of the PC gene, and then treated with DNA' polymerase Ikle.
After making blunt ends by now fragment treatment, T4 DNA
A vector pKMPC (C-E) in which the C1aI site was changed to an EcoRI site was created by adding an EcoRI linker using ligase. Next, pKMPC
After cleaving (C-E) with EcoRI, the ends were made blunt by DNA polymerase I Klenow fragment treatment, and then
It was cut with BglII and a 151 base pair DNA fragment consisting of the PC gene was isolated. Also, p5huγN I-CK
After cutting pn (patent application No. 62-56676) with KpnI,
A vector was prepared by making the ends blunt by T4 DNA polymerase treatment, cutting with BamHI, and removing terminal phosphorus by E. coli alkaline phosphatase treatment. pγPC was produced by ligating these two DNA fragments using 74 DNA ligase. The correctness of the sequence at the junction between the human IFNγ gene and the PC gene was confirmed using the regenerated EcoRI site.
このベクターから合成されるγ・Ｐ−Ｃ融合タンパク質
は１９０アミノ酸からなり、ブロモシアン分解によりヒ
トＩＦＮγ由来の５ケのペプチド（それぞれ４５，３２
，４０．１７それに１２アミノ酸からなるペプチド）と
ペプチドＰ−Ｃに分かれる。The γ/P-C fusion protein synthesized from this vector consists of 190 amino acids, and 5 peptides derived from human IFNγ (45 and 32
, 40.17 and 12 amino acids) and peptide PC.
実施例５
ＴｒｐＥφＰ−Ｃ発現ベクターｐＡＴＨ３ＰＣの作製
ｐＡＴＨ３ＰＣは、ＴｒｐＥの５２０アミノ酸のＮ末側
の３２３アミノ酸の後に、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−３
ｅ ｒ−Ｍｅ ｔの５ケのアミノ酸をはさんでペプチド
Ｐ−Ｃがつながった融合タンパク質を発現させるベクタ
ーである。作製方法は以下の通りである（第６図参照）
。Example 5 Preparation of TrpEφP-C expression vector pATH3PC pATH3PC has Pro-Pro-Asn-3 after the 323 amino acids on the N-terminal side of the 520 amino acids of TrpE.
This is a vector that expresses a fusion protein in which the peptide PC is connected between five amino acids of er-Met. The manufacturing method is as follows (see Figure 6).
.
まず、実施例４のｐＫＭＰＣ（Ｃ−Ｅ）をＥｃｏＲＩと
５ａｌＩで切断しＰＣ遺伝子を含む４００塩基対の断片
を分離した。次に、大腸菌のトリプトファンプロモータ
ーの支配下に置かれたＴｒｐＥタンパク質のＮ末端３２
３アミノ酸までの遺伝子を持つベクターｐＡＴＨ３を、
ＥｃｏＲＩと５ａｌＩで切断してから大腸菌アルカリフ
ォスファターゼ処理により末端のリンを除いた。これら
二つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合す
ることにより、ｐＡＴＨ３ＰＣを作製した。First, pKMPC(C-E) of Example 4 was cut with EcoRI and 5alI to isolate a 400 base pair fragment containing the PC gene. Next, the N-terminal 32 of the TrpE protein was placed under the control of the E. coli tryptophan promoter.
Vector pATH3 containing genes up to 3 amino acids,
After cutting with EcoRI and 5alI, terminal phosphorus was removed by treatment with E. coli alkaline phosphatase. pATH3PC was created by ligating these two DNA fragments using T4 DNA ligase.
ＴｒｐＥ遺伝子とＰＣ遺伝子のつなぎ目の配列が正しい
ことは、再生したＥｃｏＲＩサイトにより確認した。The correctness of the sequence at the junction between the TrpE gene and the PC gene was confirmed using the regenerated EcoRI site.
このベクターから合成されるＴｒｐＥ拳Ｐ−Ｃ融合タン
パク質は３７２アミノ酸からなり、ブロモシアン分解に
よりＴｒｐＥ由来の６ケのペプチド（Ｎ末から、１４４
，３８，５２，５９．３それに３２アミノ酸からなるペ
プチド）とペプチドＰ−Ｃに分かれる。The TrpE-P-C fusion protein synthesized from this vector consists of 372 amino acids, and 6 TrpE-derived peptides (from the N-terminus to 144
, 38, 52, 59.3 and a peptide consisting of 32 amino acids) and peptide PC.
実施例６
大腸菌ＨＢＩＯＩによるＰ−Ｃ融合タンパク質の発現
ｐＡＴＨ３ＰＣのベクターで形質転換した大腸菌ＨＢＩ
ＯＩを作製し、Ｐ−Ｃ融合タンパク質の発現を調べた。Example 6 Expression of PC fusion protein using E. coli HBIOI E. coli HBI transformed with pATH3PC vector
OI was prepared and the expression of the P-C fusion protein was examined.
全菌体タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析したところ、本融合タンパク質は分子量約４
万の場所に明瞭な太いバンドとして観察され、全菌体タ
ンパク質のおよそ２０％の効率で生産されていることが
わかった。Analysis of whole bacterial protein by SDS polyacrylamide gel electrophoresis revealed that this fusion protein has a molecular weight of approximately 4.
It was observed as a clear thick band at 10,000 locations, and it was found that the protein was produced at approximately 20% efficiency of the total bacterial protein.
〈発明の効果〉
本発明により、天然型ペプチドＰ−Ｃが分離できる融合
タンパク質を効率良く生産する系を樹立することができ
た。ペプチドＰ−Ｃは、その遺伝子を発現ベクターｐＫ
Ｍ６（前述）に挿入し、これで大腸菌ＨＢ １０１を形
質転換しても非常にわずかしか発現しないが、本発明の
融合タンパク質は同様の遺伝子操作技術により著しい発
現が確認された。得られた融合タンパク質から、医薬品
として有用と考えられているペプチドＰ−Ｃを容易に分
離することができる。<Effects of the Invention> According to the present invention, it was possible to establish a system for efficiently producing a fusion protein from which the natural peptide PC can be separated. Peptide P-C is expressed in the gene expression vector pK
Even when E. coli HB 101 is transformed with the fusion protein inserted into M6 (described above), very little expression is obtained, but significant expression of the fusion protein of the present invention was confirmed by similar genetic engineering techniques. Peptide PC, which is considered to be useful as a pharmaceutical, can be easily separated from the obtained fusion protein.
第１図は、本発明のペプチドＰ−Ｃ遺伝子の構造を示す
ものである。
第２図は、本発明のペプチドＰ−Ｃ遺伝子の合成法を示
すものである。
第３図は、本発明のペプチドＰ−Ｃ発現ベクターｐＫＭ
ＰＣの合成法を示すものである。
第４図は、本発明のヒトインターフェロンβ−ペプチド
Ｐ−Ｃ融合タンパク質発現ベクターｐβＰＣの合成法を
示すものである。
図中のａはベクターの作製手順を、ｂはヒトインターフ
ェロンβ遺伝子とペプチドＰ−Ｃ遺伝子の融合部分の構
造を、Ｃは融合蛋白質の構造とブロモシアン分解物の大
きさく各ペプチドのアミノ酸の数）を、それぞれ示すも
のである。
第５図は、本発明のヒトインターフェロンγ−ペプチド
Ｐ−Ｃ融合タンパク質発現ベクターｐγＰＣの合成法を
示すものである。
図中のａはベクターの作製手順を、ｂはヒトインターフ
ェロンγ遺伝子とペプチドＰ−Ｃ遺伝子の融合部分の構
造を、Ｃは融合タンパク質の構造とブロモシアン分解物
の大きさく各ペプチドのアミノ酸の数）を、それぞれ示
している。
第６図は、本発明のトリプトファンＥ−ペプチドＰ−Ｃ
融合タンパク質発現ベクターｐＡＴＨ３ＰＣの合成法を
示すものである。
図中のａはベクターの作製手順を、ｂはトリブトファン
Ｅ遺伝子とペプチドＰ−Ｃ遺伝子の融合部分の構造を、
Ｃは融合タンパク質の構造とブロモシアン分解物の大き
さく各ペプチドのアミノ酸の数）を、それぞれ示してい
る。
特許出願人 東 し 株 式 会 社第１ｖ！ＪFIG. 1 shows the structure of the peptide PC gene of the present invention. FIG. 2 shows a method for synthesizing the peptide PC gene of the present invention. FIG. 3 shows the peptide PC expression vector pKM of the present invention.
This shows a method for synthesizing PC. FIG. 4 shows a method for synthesizing the human interferon β-peptide PC fusion protein expression vector pβPC of the present invention. In the figure, a shows the vector preparation procedure, b shows the structure of the fusion portion of the human interferon β gene and peptide P-C gene, and C shows the structure of the fusion protein and the size of the bromocyanate-digested product (the number of amino acids in each peptide). , respectively. FIG. 5 shows a method for synthesizing the human interferon γ-peptide PC fusion protein expression vector pγPC of the present invention. In the figure, a shows the vector preparation procedure, b shows the structure of the fusion portion of the human interferon γ gene and peptide P-C gene, and C shows the structure of the fusion protein and the size of the bromocyanate-digested product (the number of amino acids in each peptide). are shown respectively. FIG. 6 shows tryptophan E-peptide P-C of the present invention.
1 shows a method for synthesizing the fusion protein expression vector pATH3PC. In the figure, a shows the procedure for producing the vector, and b shows the structure of the fusion part of the tributophane E gene and the peptide PC gene.
C shows the structure of the fusion protein and the size of the bromo cyanide degradation product (number of amino acids in each peptide), respectively. Patent applicant Higashishi Co., Ltd. No. 1! J
Claims (6)
万以上のタンパク質とを切断可能に連結してなる融合タ
ンパク質。 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ(1) Peptide with the following amino acid sequence and molecular weight 1
A fusion protein formed by cleavably linking more than 10,000 proteins. Gly-Arg-Pro-Gln-Gly-Pro-P
ro-Gln-Gln-Gly-Gly-His-Gl
n-Gln-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro
-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Gln-
Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-G
ly-Arg-Pro-Gln-Gly-Pro-Pr
o-Gln-Gly-Gln-Ser-Pro-Gln
トファン合成酵素Ｅである特許請求の範囲第（１）項記
載の融合タンパク質。(2) The fusion protein according to claim (1), wherein the protein having a molecular weight of 10,000 or more is E. coli tryptophan synthase E.
万以上のタンパク質とを切断可能に連結してなる融合タ
ンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより
、形質転換された形質転換体を培養することを特徴とす
る融合タンパク質の製造方法。 Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ(3) Peptide with the following amino acid sequence and molecular weight 1
1. A method for producing a fusion protein, which comprises culturing a transformant transformed with an expression vector containing a gene encoding a fusion protein formed by cleavably linking 10,000 or more proteins. Gly-Arg-Pro-Gln-Gly-Pro-P
ro-Gln-Gln-Gly-Gly-His-Gl
n-Gln-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro
-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Gln-
Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-G
ly-Arg-Pro-Gln-Gly-Pro-Pr
o-Gln-Gly-Gln-Ser-Pro-Gln
ン合成酵素Ｅである特許請求の範囲第（３）項記載の融
合タンパク質の製造方法。(4) The method for producing a fusion protein according to claim (3), wherein the protein having a molecular weight of 10,000 or more is tryptophan synthase E.
特許請求の範囲第（３）項記載の融合タンパク質の製造
方法。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】(5) The method for producing a fusion protein according to claim (3), wherein the gene encoding the peptide has the following sequence. [There is a gene sequence] [There is a gene sequence] [There is a gene sequence]
項記載の融合タンパク質の製造方法。(6) Claim No. (3) for transforming E. coli
A method for producing the fusion protein described in Section 2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62138917A JPS63304996A (en) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Fused protein and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62138917A JPS63304996A (en) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Fused protein and production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63304996A true JPS63304996A (en) | 1988-12-13 |
Family
ID=15233164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62138917A Pending JPS63304996A (en) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Fused protein and production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63304996A (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS615788A (en) * | 1984-03-30 | 1986-01-11 | イステイチユト フアルマコロジコ セロノ ソチエタ ペル アツイオニ | Somatostatin hybrid polypeptide gene |
| JPS6211932A (en) * | 1985-07-10 | 1987-01-20 | Hitachi Ltd | Information retrieving method |
-
1987
- 1987-06-04 JP JP62138917A patent/JPS63304996A/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS615788A (en) * | 1984-03-30 | 1986-01-11 | イステイチユト フアルマコロジコ セロノ ソチエタ ペル アツイオニ | Somatostatin hybrid polypeptide gene |
| JPS6211932A (en) * | 1985-07-10 | 1987-01-20 | Hitachi Ltd | Information retrieving method |
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