JPS63304994A - Production of leucrose by dextran sucrase produced by streptococcus bovis - Google Patents
Production of leucrose by dextran sucrase produced by streptococcus bovisInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はストレプトコッカスやボヴイス(Strept
ococcus bovis s以下ニス・ボヴイスと
いう)の産生ずるデキストランスクラーゼ(dextr
a、n5ucrase)によるロイクロース(1euc
rose)の製造方法に関する。[Detailed Description of the Invention] [Industrial Application Field] The present invention is applicable to Streptococcus and Streptococcus bovis.
ococcus bovis s) produced by dextransucrase (dextr
a, n5ucrase) by leucrose (1euc
The present invention relates to a method of manufacturing rose.
ロイクロースなどのオリゴ糖は、肥満予防の甘味料、ビ
フィズス菌の増殖因子あるいは虫歯予防の甘味料など医
薬、食品工業の分野での幅広い用途が期待されている。Oligosaccharides such as leuclose are expected to have a wide range of uses in the pharmaceutical and food industries, including as sweeteners to prevent obesity, growth factors for bifidobacteria, and sweeteners to prevent dental caries.
ロイクロースはエイチΦエイチ・ストドーラ(H,Hy
Stodola)らにより、ロイコノストック・メセン
テロイデス(LeuconostocIeSentθr
oides 、以下エル拳メセンテロイデスという)を
用いてデキストラン(dextran)を合成する際に
、微量のロイクロースが生じることが報告されている(
ジャーナル・オブ・アメリカン−ケミカル・ソサイアテ
ィー(J、As、Ches。Roy Claus is HΦ H Stodola (H,Hy
Stodola et al.
It has been reported that a small amount of leuclose is produced when dextran is synthesized using L.
Journal of the American Chemical Society (J, As, Ches.
Soc、)78巻、2514頁(19513)参照)。Soc, Vol. 78, p. 2514 (19513)).
また、ロイクロースはデキストランスクラーゼの転移作
用により生じることも知られている(イー争ジエイ・ブ
ールン(E、J、Bourne)ら、バイオケミカル・
ジャーナル(Bloches、J、)79巻、549頁
(1981)参照)。It is also known that leuclose is generated by the translocation action of dextransucrase (E. J. Bourne et al., Biochemical
Journal (Bloches, J., vol. 79, p. 549 (1981)).
従来より行なわれてきたロイクロースの製造法はデキス
トラン合成時の副産物として生じるロイクロースを分取
するものであり、基本的には発酵法と酵素法に分けられ
るが、そのいずれもエル拳メセンテロイデスを用いて行
なわれている。Conventional methods for producing leuclose involve separating leuucrose produced as a by-product during dextran synthesis, and are basically divided into fermentation methods and enzymatic methods, both of which involve the use of L. mesenteroides. It is being done.
発酵法は、スクロースを含む培地でエル・メセンテロイ
デスを培養し、培地中に副産物として少量束じるロイク
ロースを種々の工程を経て分離・精製するものである。In the fermentation method, L. mesenteroides is cultured in a medium containing sucrose, and a small amount of leucrose, which is bundled as a by-product in the medium, is separated and purified through various steps.
また、酵素法はやはりスクロースを含む培地でエル・メ
センテロイデスを培養し、培地中に産生されるデキスト
ランスクラーゼを酵素源として、スクロース−フルクト
ースの混合系で酵素反応を行ないロイクロースを製造す
るものである。In the enzymatic method, L. mesenteroides is cultured in a medium containing sucrose, and dextransucrase produced in the medium is used as an enzyme source to perform an enzymatic reaction in a sucrose-fructose mixed system to produce leuucrose.
しかしながら、このような製造法に用いるエル・メセン
テロイデスは、栄養要求性が大きいため、その培養に多
種のビタミン、アミノ酸など比較的高価な栄養成分を必
要とし、しかも増殖速度が小さいため、ロイクロースま
たは酵素の産生に数日を要する。However, the L. mesenteroides used in this production method has a high nutritional requirement, so its cultivation requires relatively expensive nutritional components such as various vitamins and amino acids.Moreover, its growth rate is slow, so L. It takes several days for production.
また、酵素法では、完全な基質誘導酵素であるテキスト
ランスクラーゼが、エル・メセンテロイデスによりスク
ロース培地でのみ産生されるため、発酵液中に多量のデ
キストランが蓄積し、産生された酵素の回収が困難であ
ると同時に、デキストランとの複合体形成により不活性
化されやすく、酵素作用最適温度が30℃と比較的低い
ため、反応速度は小さい。In addition, in the enzymatic method, textransucrase, which is a complete substrate-inducing enzyme, is produced by L. mesenteroides only in sucrose medium, so a large amount of dextran accumulates in the fermentation solution, making it difficult to recover the produced enzyme. At the same time, it is easily inactivated by complex formation with dextran, and the optimum temperature for enzyme action is relatively low at 30°C, so the reaction rate is low.
さらに発酵法での収率は極めて低く、酵素法についても
2%スクロースの酵素反応条件下において、対消費糖あ
たり2〜6%と生産効率は低い。Further, the yield in the fermentation method is extremely low, and the production efficiency in the enzyme method is low at 2 to 6% based on consumed sugar under enzyme reaction conditions of 2% sucrose.
したがって、ロイクロースを高収量でしかも迅速に製造
できる新しいプロセスの開発が望まれている。Therefore, it is desired to develop a new process that can rapidly produce leuclose in high yield.
本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意研究を重ねた結果
、牛の第1胃(以下、牛ルーメンという)から分離した
ニス・ボヴイスの産生ずるデキストランスクラーゼによ
るロイクロースの製造法は、培養においてニス・ボヴイ
スが栄養要求性が小さくビタミンとしてはビオチンのみ
を必要とし窒素栄養としては無機窒素のみで生育するこ
と、増殖速度も対数増殖期(logphase) 2〜
6時間、世代交代時間10分程度ときわめて速く、しか
もグルコース培地において効率よくデキストランスクラ
ーゼを産生じ、その際にデキストランが生じないことに
より除菌作用も容易に行なえること、さらにこの産生さ
れた酵素が、デキストランとの複合体を形成することが
ないために反応中の酵素活性低下現象がほとんど見られ
ず、産生された酵素の酵素作用最適温度が40℃と比較
的高いため、2%スクロースの酵素反応条件下における
ロイクロースの収率は対消費糖あたり30%にもおよぶ
ことなどの有利な点を有し、従来のエル・メセンテロイ
デスの産生ずるデキストランスクラーゼによる製造法よ
りもはるかに優れた方法であることを見い出し、本発明
を完成するに至った。The present inventors have conducted intensive research in view of the above circumstances, and have found that a method for producing leucrose using dextransucrase produced by Nis bovis isolated from the rumen of cows (hereinafter referred to as cow rumen) has been developed in culture.・Bovis has low auxotrophy and requires only biotin as a vitamin and grows on only inorganic nitrogen as nitrogen nutrition, and its growth rate is in the log phase 2~
It is extremely fast with a generation change time of about 10 minutes and produces dextransucrase efficiently in a glucose medium, and since no dextran is produced at this time, the sterilization effect can be easily performed. However, because it does not form a complex with dextran, there is almost no decrease in enzyme activity during the reaction, and the optimum temperature for the enzyme action of the produced enzyme is relatively high at 40°C. It has the advantage that the yield of leucrose under enzymatic reaction conditions is as high as 30% based on consumed sugar, and is much superior to the conventional production method using dextransucrase produced by L. mesenteroides. This discovery led to the completion of the present invention.
すなわち本発明は、ニス・ボヴイスをデキストランスク
ラーゼを誘導する炭素源を含む培地で嫌気的に培養し、
産生されたデキストランスクラーゼをスクロースと、あ
るいは受容体の存布下でスクロースと反応させることを
特徴とするニス−ボヴイスの産生ずるデキストランスク
ラーゼによるロイクロースの製造法に関する。That is, the present invention cultivates Nis bovis anaerobically in a medium containing a carbon source that induces dextransucrase,
The present invention relates to a method for producing leuucrose using dextransucrase produced by Nis-Bovis, which is characterized by reacting the produced dextransucrase with sucrose or with sucrose in the presence of a receptor.
本発明の方法に用いるデキストランスクラーゼ生産菌の
代表的なものとして、牛ルーメンから単離した148菌
株があげられる。A representative example of the dextransucrase-producing bacteria used in the method of the present invention is strain 148 isolated from bovine rumen.
この菌株は運動性はなく、ダラム染色は陽性であり、菌
学的形状は連鎖状の球菌である。本菌株はまた、カタラ
ーゼテストには陰性を示し、グルコースがEMP経路を
経て右旋性の乳酸にまで代謝されるいわゆるホモ型乳酸
発酵を示す。This strain is non-motile, Durham staining is positive, and the bacteriological form is streptococci. This strain also showed a negative result in the catalase test, showing so-called homo-lactic acid fermentation in which glucose is metabolized to dextrorotatory lactic acid through the EMP pathway.
また、10℃では生育がみられず、45℃で生育を示し
、また6、5%のNaCl濃度やpH9,8以上での生
育はみられない。さらに、澱粉を強力に分解し、40%
胆汁培地(blle blood agar sedl
um)で成育する性質がある。叙上の菌学的性質から、
148菌株は、バーシーズ・マニアル・オブ拳デタミネ
イティブ・バクテリオロジー第8版記載のニス・ボヴイ
スに属する菌株であることは明らかである。よって、本
菌株をニス・ボヴイスに属する 14g菌株とした。な
お本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号
微工研菌寄第9390号(以下、FERN P−939
0という)として寄託されている。Further, no growth was observed at 10°C, growth was observed at 45°C, and no growth was observed at a NaCl concentration of 6.5% or at a pH of 9.8 or higher. In addition, it strongly decomposes starch, 40%
Bile blood agar sedl
It has the property of growing in um). From the stated mycological properties,
It is clear that strain 148 belongs to Nis bovis, which is described in Bersey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition. Therefore, this bacterial strain was designated as the 14g strain belonging to Nis bovis. This strain has been assigned the accession number FERN P-939 to the Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology.
0).
なお、菌学的性質は、きわめて変異しやすく、自然的な
あるいは人工的な変異(たとえば紫外線照射、ニトロソ
グアニジンなどの変異剤の使用など)により変異するこ
とは周知の事実であるため、人工変異株はもちろん、自
然変異株も含めて、ニス・ボヴイスに属する菌株はデキ
ストランスクラーゼ産生菌としてすべて本発明に使用す
ることができるものとする。It should be noted that mycological properties are extremely susceptible to mutation, and it is a well-known fact that mutations can occur due to natural or artificial mutations (for example, ultraviolet irradiation, use of mutagens such as nitrosoguanidine, etc.). All strains belonging to Nis bovis, including naturally occurring mutant strains, can be used in the present invention as dextransucrase-producing bacteria.
ロイクロースの製造にあたっては、まずニス・ボヴイス
に属するデキストランスクラーゼ産生菌をデキストラン
スクラーゼを誘導する炭素源を含む栄養培地に接種して
、嫌気的に培養し、デキストランスクラーゼをうる。To produce leuclose, first, dextransucrase-producing bacteria belonging to Nis bovis are inoculated into a nutrient medium containing a carbon source that induces dextransucrase, and cultured anaerobically to obtain dextransucrase.
デキストランスクラーゼ産生菌の培養に用いる栄養培地
としてはスクロース、グルコースなどデキストランスク
ラーゼを誘導できる糖類などの炭素源、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源またはイースト
エキス、肉エキスなどのを機窒素源、塩化ナトリウム、
リン酸塩、塩化カルシウムなどの無機塩、その他必要に
応じて、微量のビオチンなどのビタミン類などを添加し
た培地が通常用いられ、培養方法としては液体培養が好
ましい。Nutrient media used for culturing dextransucrase-producing bacteria include carbon sources such as sugars that can induce dextransucrase such as sucrose and glucose, inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate and ammonium nitrate, organic nitrogen sources such as yeast extract and meat extract, and sodium chloride. ,
A medium to which inorganic salts such as phosphates and calcium chloride, and trace amounts of vitamins such as biotin are added as necessary, is usually used, and liquid culture is preferred as the culture method.
とくに、炭素源としてはデキストランスクラーゼの精製
の妨害因子となり、また酵素活性の低下現象を引き起こ
すデキストランが生じないようにグルコースを用いるの
が好ましいが、培養液をそのまま酵素反応に供するばあ
いは酵素産生効率の高いスクロースを用いてもよい。In particular, it is preferable to use glucose as a carbon source to avoid producing dextran, which can interfere with the purification of dextransucrase and cause a decrease in enzyme activity. Sucrose with high efficiency may also be used.
デキストランスクラーゼは、たとえばニス・ボヴイスに
属する 148iii株を栄養培地に接種して、たとえ
ば培地中炭酸ガスを通じながら、温度は25〜50℃好
ましくは40℃付近で、pHはたとえばNa2CO3を
添加しながら5〜7に好ましくは6〜6.5に保持しな
がら培養し、対数増殖期の終期で培養を終了させること
により、培養液中にえられる。Dextransucrase can be produced by inoculating Nis bovis 148iii strain into a nutrient medium, for example, while passing carbon dioxide gas through the medium, at a temperature of 25 to 50°C, preferably around 40°C, and at a pH of 5.0°C, for example, while adding Na2CO3. 7, preferably 6 to 6.5, and is obtained in a culture solution by terminating the culture at the end of the logarithmic growth phase.
えられた培養液はそのままでも酵素反応に供することが
できるが、通常は培養終了後遠心分離などの操作で菌体
を除き、上澄液を使用する。The obtained culture solution can be used as is for the enzyme reaction, but usually after the culture is complete, the bacterial cells are removed by centrifugation or other operations and the supernatant is used.
さらに、その上澄液を通常の精製方法にしたがって精製
して使用してもよいし、さらにまた固定化して用いても
よい。Furthermore, the supernatant may be purified and used according to a conventional purification method, or may be used after being immobilized.
そのような精製方法としては、培養液中の酵素を直接セ
ファデックスゲル(5ephadex” G−50〜
200、ファルマシア・ファインΦケミカルス社製)に
特異的に吸着させ、侠雑物を冷水にて洗浄除去したのち
、酵素を溶出させるものがあげられる。酵素はこの方法
で電気泳動的にほぼ単一の状態にまで精製され、しかも
この精製酵素は糖が全く検出されないという特異性の高
いものである。セファデックスゲルはG−50〜200
(品番)のものが酵素の吸着率が高く、最大でほぼ10
0%近い吸着率を示す。吸着法にはバッチ法も可能であ
るが、好ましくはカラムを用いた吸着法が良好な結果を
示す。ゲルに対する酵素の最大吸着量を分析したところ
、セファデックスゲル(G−200) 1 g (乾燥
重量換算)あたり 180,000単位(単位の条件は
後述)の酵素が吸着され、これは2gの培地で産生され
る酵素量に相当する。また、洗浄に用いる冷水(5〜2
0℃)には、緩衝液などの適当な保護剤を添加すれば酵
素の安定化に効果がある。吸着された酵素の溶出には、
溶出液に様々な糖類を添加し、45℃で溶出させれば効
果的であるが、糖類を添加しない溶出液による45℃の
温水溶出でも約7Q%の溶出が可能である。As such a purification method, the enzyme in the culture solution is directly purified by Sephadex gel (5ephadex" G-50 ~
200 (manufactured by Pharmacia Fine Φ Chemicals), and the enzyme is eluted after the impurities are removed by washing with cold water. By this method, the enzyme is electrophoretically purified to a nearly single state, and this purified enzyme is highly specific in that no sugars are detected. Sephadex gel is G-50~200
(product number) has a high enzyme adsorption rate, with a maximum of approximately 10
Shows adsorption rate close to 0%. Although a batch method is also possible for the adsorption method, preferably an adsorption method using a column shows good results. When the maximum amount of enzyme adsorbed to the gel was analyzed, 180,000 units of enzyme (conditions for units will be described later) were adsorbed per 1 g (dry weight equivalent) of Sephadex gel (G-200), which is equivalent to 2 g of culture medium. corresponds to the amount of enzyme produced in In addition, cold water used for washing (5 to 2
(0°C), adding a suitable protective agent such as a buffer is effective in stabilizing the enzyme. For elution of adsorbed enzyme,
It is effective to add various saccharides to the eluate and elute at 45°C, but elution of about 7Q% is also possible with warm water elution at 45°C using an eluate without the addition of saccharides.
このようなセファデックスゲルへの効率的な吸着現象や
、またえられた酵素から糖が検出されないことなどは本
菌株の産生ずる酵素に特異的なものであり、エル・メセ
ンテロイデスにはみられない現象である。This phenomenon of efficient adsorption to Sephadex gel and the fact that sugars are not detected in the resulting enzyme are specific to the enzyme produced by this strain, and are not observed in L. mesenteroides. It is a phenomenon.
つぎに、このようにしてえられたデキストランスクラー
ゼを用いてロイクロースを製造する方法について説明す
る。Next, a method for producing leucrose using the dextransucrase thus obtained will be explained.
本発明において、ロイクロース製造の基質としてはスク
ロースを用いる。また、受容体としてフルクトースの存
在下でスクロースを用いると効率よく単一のオリゴ糖と
してロイクロースが生成する。添加する糖類の濃度は、
酵素単位を考慮して決定すればよい。In the present invention, sucrose is used as a substrate for Leucrose production. Furthermore, when sucrose is used in the presence of fructose as an acceptor, leuucrose is efficiently produced as a single oligosaccharide. The concentration of added sugars is
It may be determined by considering the enzyme unit.
ただし、スクロースに対するフルクトースのモル濃度比
が低いばあいには高分子のデキストランが主産物として
生じ、フルクトースのモル比を上げるにしたがいデキス
トラン合成が抑制され、ロイクロースの生成割合が増加
する傾向にある。なお、スクロースに対するフルクトー
スのモル比を1:4より大きくするとデキストラン合成
が抑制されるだけでなく、ロイクロース合成そのものも
抑制されることから、効率的なロイクロース生産にはス
クロースとフルクトースとのモル濃度比は1:1〜1:
4であるのが好ましい。However, when the molar concentration ratio of fructose to sucrose is low, the polymer dextran is produced as the main product, and as the molar ratio of fructose is increased, dextran synthesis is suppressed and the production rate of leuucrose tends to increase. Furthermore, if the molar ratio of fructose to sucrose is greater than 1:4, not only will dextran synthesis be inhibited, but also leuclose synthesis itself will be inhibited. is 1:1~1:
4 is preferred.
反応は通常20〜50℃で行なえばよいが、反応速度、
酵素の安定性の面から40℃付近で行なうのが好ましい
。反応液中のpHは5〜7好ましくは5.5〜6.5で
反応させるとよい。また、反応時間は酵素単位および基
質濃度で異なるが、スクロースがほぼ消費されつくした
時点で終了させる。その他反応促進のため微量の金属塩
、たとえば塩化カルシウムなどを添加することもできる
。The reaction may normally be carried out at 20 to 50°C, but the reaction rate,
From the viewpoint of enzyme stability, it is preferable to carry out the reaction at around 40°C. The pH of the reaction solution is preferably 5 to 7, preferably 5.5 to 6.5. Although the reaction time varies depending on the enzyme unit and substrate concentration, the reaction is terminated when sucrose is almost completely consumed. In addition, trace amounts of metal salts such as calcium chloride may be added to promote the reaction.
えられたロイクロースは活性炭カラムによって分離精製
することができる。たとえば、活性炭を詰めたカラムに
酵素反応液を流し、ロイクロースおよびデキストランを
活性炭に吸着させる。ついで蒸留水でその活性炭を充分
に洗浄したのち、2〜4%のエチルアルコール水溶液を
流して目的とするロイクロースを分離精製する。The obtained leucrose can be separated and purified using an activated carbon column. For example, an enzyme reaction solution is passed through a column packed with activated carbon, and leuclose and dextran are adsorbed onto the activated carbon. Next, the activated carbon is sufficiently washed with distilled water, and then a 2 to 4% ethyl alcohol aqueous solution is passed therethrough to separate and purify the target leucrose.
つぎに本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。Next, the present invention will be explained in more detail using Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例においてえられた反応液を、以下の分析試験に供
した。The reaction solution obtained in the example was subjected to the following analytical test.
(高速液体クロマトグラフィー(以下、HPLCという
)による定量分析)
イオン交換樹脂(IR(II” ) 120)などで脱
イオンさせた酵素反応液0.4mlをアセトニトリル1
.5mlとメタノール0.2mlとの混合液に撹拌しな
がら加え、ついで遠心骨R(15,000rpm x
501in)後、上澄液1 mlに内部標準液(0,2
%ラクトース水溶液)1mlを加え、0.45 、ia
非水系フィルターでの処理によりHPLCに供するサン
プルを調製した。この10μgを)IPI、Cに供し、
反応液中のフルクトース、グルコース、スクロース、パ
ラチノースおよびロイクロースを同定し、定量した。(Quantitative analysis by high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC)) 0.4 ml of the enzyme reaction solution deionized with an ion exchange resin (IR (II") 120) etc. was mixed with 1 ml of acetonitrile.
.. 5 ml of methanol and 0.2 ml of methanol while stirring, and then centrifuged bone R (15,000 rpm x
After 501 in), add internal standard solution (0,2 in) to 1 ml of supernatant.
% lactose aqueous solution), add 1 ml, 0.45, ia
Samples for HPLC were prepared by treatment with a non-aqueous filter. 10 μg of this was subjected to IPI, C,
Fructose, glucose, sucrose, palatinose, and leuucrose in the reaction solution were identified and quantified.
測定は、以下の分析条件を用いてトリロータ■(商品名
、日本分光■製)で行ない、検出器として高感度示差屈
折計(センシュー科学■製)を使用した。なお、ロイク
ロースは約l002分後に溶出した。The measurement was carried out using a Trirotor ■ (trade name, manufactured by JASCO ■) using the following analysis conditions, and a high-sensitivity differential refractometer (manufactured by Senshu Kagaku ■) was used as a detector. Note that Leucrose was eluted after about 1002 minutes.
分析条件;
カ ラ ム:センシューφパックNII= −1251
−N (商品名、センシュー科学■
製)、 4.Bφ×250關
流 速:1ml/■in
カラム温度=30℃
溶出液(容量比)ニアセトニトリル/水−またデキスト
ランスクラーゼの酵素活性は、7.5%スクロース溶液
(溶媒0.05Mリン酸緩衝液pH5,5)中で1時間
酵素反応を行なわせ、遊離するフラクトースをソモギ法
(ツチャら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J
、Bact、)。Analysis conditions; Column: Senshu φ pack NII = -1251
-N (product name, manufactured by Senshu Kagaku ■), 4. Bφ x 250 flow rate: 1ml/■in Column temperature = 30℃ Eluate (volume ratio) Niacetonitrile/water The enzymatic reaction was carried out for 1 hour in pH 5.5), and the liberated fructose was removed using the Somogi method (Tucha et al., Journal of Bacteriology
, Bact, ).
64巻、521頁(1982)参照)で定量することに
より求められた。この反応条件で0.52■/ mlの
フラクトースを生成する酵素活性を1単位とした。64, p. 521 (1982)). The enzyme activity that produced 0.52 ml/ml of fructose under these reaction conditions was defined as one unit.
なお、反応液中に生成するデキストラン量は次の方法で
求められた。すなわち反応液1 mlに蒸留水1 ml
を加え充分に撹拌後、この溶液1 mlに無水エタノー
ル1 mlを撹拌しながら加え、遠心分離(15,00
0rpm x 15m1n)後、沈殿物を同エタノール
で2度洗浄し、えられた沈殿物を蒸留水で溶解しfow
lに定容後、さらにここから0.5mlを採取し10m
1に定容を行ない、フェノール硫酸法にて定量した糖量
よりデキストラン量を推算した。The amount of dextran produced in the reaction solution was determined by the following method. That is, 1 ml of distilled water for 1 ml of reaction solution.
After stirring thoroughly, add 1 ml of absolute ethanol to 1 ml of this solution while stirring, and centrifuge (15,000
0 rpm x 15 ml), wash the precipitate twice with the same ethanol, dissolve the obtained precipitate in distilled water, and
After adjusting the volume to l, collect 0.5 ml from this and add 10 m
1, and the amount of dextran was estimated from the amount of sugar determined by the phenol-sulfuric acid method.
実施例1
2R容のフラスコにグルコース50g−、ホリベブトン
10 g sイーストエキス5g、硫安2g。Example 1 In a 2R flask, 50 g of glucose, 10 g of Horibebuton, 5 g of yeast extract, and 2 g of ammonium sulfate were added.
重曹3g、システィン塩酸塩o、sg、リン酸−カリウ
ム2.25g、リン酸二カリウム2.25g5NaC&
0.9g %Mg5Oa 0.09 gおよびCa
CIzo、09 gを加え水道水1gに溶解した。つい
でフラスコに綿栓を施して120℃、15分間殺菌を行
ない培地(以下、(A)培地という)を調製した。Baking soda 3g, cysteine hydrochloride o, sg, potassium phosphate 2.25g, dipotassium phosphate 2.25g5NaC&
0.9g %Mg5Oa 0.09g and Ca
09 g of CIzo was added and dissolved in 1 g of tap water. The flask was then plugged with cotton and sterilized at 120°C for 15 minutes to prepare a medium (hereinafter referred to as (A) medium).
放冷後、炭酸ガスを無菌的に培地内に通じ、培養系を炭
酸ガスによる嫌気条件下にしたのち、同一組成培地にて
10時間前に培養したニス・ボヴイス14g菌株(FE
RN P−9390) 20m1を(A)培地に植菌し
、温度40℃で、Na2COsを経時的に添加してpH
を6〜6.5に調整しながら培養した。After cooling, carbon dioxide gas was aseptically introduced into the medium to bring the culture system under anaerobic conditions.
RN P-9390) 20ml was inoculated into (A) medium, and the pH was adjusted by adding Na2COs over time at a temperature of 40°C.
The cells were cultured while adjusting the ratio to 6 to 6.5.
培養は対数増殖期の終期に入ったところで終了させ遠心
分離(lo、000rpm X20m1n )により上
澄液をえた。The culture was terminated at the end of the logarithmic growth phase, and a supernatant was obtained by centrifugation (lo, 000 rpm x 20 m1n).
上澄液を、−昼夜流水中で透析し、つぎに温度5〜10
℃でセファデックスゲル(G−200)カラム(30φ
X 30ha)に流速2 ml−/ winで流し、
酵素を吸着させたのち、0.05Mリン酸緩衝液(pH
5,5)を同流速で流し洗浄を行なった。The supernatant was dialyzed in running water day and night, then at a temperature of 5-10
Sephadex gel (G-200) column (30φ
x 30 ha) at a flow rate of 2 ml/win,
After adsorbing the enzyme, 0.05M phosphate buffer (pH
5, 5) was washed at the same flow rate.
さらにゲルをカラムから0.05Mリン酸緩衝液(pH
5,5)でビーカー内に洗い流し、これを45℃にまで
加温したのち、吸引濾過を行ない、濾紙上のゲルを45
℃同緩衝液で洗浄し、よられた濾液(約50m1)を酵
素液として酵素反応に用いた。Further remove the gel from the column with 0.05M phosphate buffer (pH
After washing the gel into a beaker with 5, 5) and warming it to 45°C, perform suction filtration to remove the gel on the filter paper at 45°C.
The solution was washed with the same buffer solution at °C, and the strained filtrate (approximately 50 ml) was used as an enzyme solution in the enzyme reaction.
なおこのようにしてえられた酵素は電気泳動的に単一の
ものであった。The enzyme thus obtained was electrophoretically single.
この精製酵素を用いて、ロイクロース生産におよぼす温
度、pi、金属塩の影響を調べた。Using this purified enzyme, the effects of temperature, pi, and metal salts on leuclose production were investigated.
酵素反応は、5%スクロース水溶液2.0ml、0.0
5Mリン酸緩衝液(pH5,0〜7.0)2.0ml
、酵素液(100単位) 0.5ml、および蒸留水
0.5mlの組成で24時間行なった。For the enzyme reaction, 2.0 ml of 5% sucrose aqueous solution, 0.0
2.0 ml of 5M phosphate buffer (pH 5.0-7.0)
, 0.5 ml of enzyme solution (100 units), and 0.5 ml of distilled water for 24 hours.
温度の影響を調べるばあいは、pns、sのリン酸緩衝
液を用い、10〜45℃の範囲で酵素反応を行なわせた
。When examining the influence of temperature, the enzymatic reaction was carried out in the range of 10 to 45° C. using a PNS, S phosphate buffer.
pHの影響をみるばあいは、pH5,0〜7.0のリン
酸緩衝液を用い、40℃で反応を進めた。When examining the influence of pH, a phosphate buffer solution with a pH of 5.0 to 7.0 was used and the reaction was carried out at 40°C.
また金属塩の影響をみるばあいは、蒸留水0.5mlの
かわりに0.005Mの各種金属塩の水溶液CCaCl
2 、HgCf12 、HnCI2 、Pe5Oa 、
CoCl2、Cu5O4) 0.5mlを用い、さら
にpH5,5のリン酸緩衝液のもと40℃で反応を行な
わせた。Also, when looking at the influence of metal salts, instead of 0.5 ml of distilled water, use a 0.005 M aqueous solution of various metal salts, CCaCl.
2, HgCf12, HnCI2, Pe5Oa,
Using 0.5 ml of CoCl2, Cu5O4), the reaction was further carried out at 40°C in a phosphate buffer solution of pH 5.5.
酵素反応によりえられたオリゴ糖は活性炭カラムを用い
て分離精製され、その加水分解物についてHPLCで分
析した結果グルコースとフルクトースよりなる三糖類で
あることが明らかにさ □れた。またこのオリゴ糖は
、同じくグルコースとフルクトースよりなる三糖類であ
るスクロースやパラチノースともクロマト的に明らかに
異なっており、HPLCにより、ロイクロースと同定さ
れた。The oligosaccharide obtained by the enzymatic reaction was separated and purified using an activated carbon column, and the hydrolyzate was analyzed by HPLC, which revealed that it was a trisaccharide consisting of glucose and fructose. Furthermore, this oligosaccharide was chromatographically clearly different from sucrose and palatinose, which are also trisaccharides composed of glucose and fructose, and was identified as leuucrose by HPLC.
なお、えられた反応液中に残存するスクロースと生成し
たロイクロースをHPLCで、また生成したデキストラ
ンを前記フェノール硫酸法で分析し、その結果を、生成
したロイクロース量のスクロースの消費量および初期添
加量に対する収率(対糖収率)とともに第1表に示す。In addition, the sucrose remaining in the obtained reaction solution and the produced leucrose were analyzed by HPLC, and the produced dextran was analyzed by the above-mentioned phenol-sulfuric acid method, and the results were calculated based on the amount of sucrose consumed and the initial addition amount of the produced leucrose. It is shown in Table 1 along with the yield relative to sugar (yield relative to sugar).
実施例2
実施例1と同様に、精製酵素を用い、ロイクロース生産
における基質(スクロース)濃度と、受容体(フルクト
ース)添加量の影響をみた。Example 2 As in Example 1, using a purified enzyme, the effects of the substrate (sucrose) concentration and the amount of receptor (fructose) added on leucrose production were examined.
酵素反応は、スクロース水溶液またはスクロース・フル
クトース混合水溶液2.0ml、0.125Hリン酸緩
衝液(pH5,5)2.0ml、酵素液(100単位)
0.5ml、および蒸留水0 、5 mlの組成で、4
0℃、24時間行なった。For the enzyme reaction, 2.0 ml of sucrose aqueous solution or sucrose/fructose mixed aqueous solution, 2.0 ml of 0.125H phosphate buffer (pH 5.5), enzyme solution (100 units)
With a composition of 0.5 ml, and 0.5 ml of distilled water, 4
The test was carried out at 0°C for 24 hours.
基質濃度の影響は、1625〜25%のスクロース水溶
液を最終濃度が第2表に示す濃度になるように用いて調
べた。The effect of substrate concentration was investigated using a 1625-25% sucrose aqueous solution at a final concentration shown in Table 2.
また、受容体添加量の影響は、スクロース最終濃度が5
%と10%のばあいめそれぞれについてスクロースに対
してフルクトースがモル濃度比で1 : 0.25〜
1:4の範囲で混合している水溶液を用いて調べた。In addition, the effect of the amount of receptor added is that the final concentration of sucrose is 5
% and 10% respectively, the molar concentration ratio of fructose to sucrose is 1:0.25~
The investigation was conducted using an aqueous solution containing a mixture of 1:4.
いずれの反応系においても、単一のオリゴ糖が生成した
が、受容体添加量に比べ受容体添加量ではオリゴ糖の生
成率が高い結果となった。In both reaction systems, a single oligosaccharide was produced, but the oligosaccharide production rate was higher with the amount of receptor added than with the amount of receptor added.
酵素反応によりえられたオリゴ糖は活性炭カラムを用い
て分離精製され、その加水分解物についてHPLCで分
析した結果グルコースとフルクトースよりなる三糖類で
あることが明らかにされた。またこのオリゴ糖は、同じ
くグルコースとフルクトースよりなる三糖類であるスク
ロースやパラチノースともクロマト的に明らかに異なっ
ており、HPLCにより、ロイクロースと同定された。The oligosaccharide obtained by the enzymatic reaction was separated and purified using an activated carbon column, and the hydrolyzate was analyzed by HPLC and was found to be a trisaccharide consisting of glucose and fructose. Furthermore, this oligosaccharide was chromatographically clearly different from sucrose and palatinose, which are also trisaccharides composed of glucose and fructose, and was identified as leuucrose by HPLC.
なお、えられた反応液中に残存するスクロースと生成し
たロイクロースをHPLCで、また生成したデキストラ
ンを前記フェノール硫酸法で分析し、その結果を、生成
したロイクロース量のスクロースの消費量および初期添
加量に対する収率(対糖収率)とともに第2表に示す。In addition, the sucrose remaining in the obtained reaction solution and the produced leucrose were analyzed by HPLC, and the produced dextran was analyzed by the above-mentioned phenol-sulfuric acid method, and the results were calculated based on the amount of sucrose consumed and the initial addition amount of the produced leucrose. It is shown in Table 2 along with the yield relative to sugar (yield relative to sugar).
〔発明の効果〕
本発明の方法は、医薬、食品工業の分野での幅広い用途
が期待されるロイクロースを高収量でしかも迅速に製造
しうるという効果を奏する。[Effects of the Invention] The method of the present invention has the advantage that leuclose, which is expected to have a wide range of applications in the pharmaceutical and food industries, can be rapidly produced in high yield.
また、本発明の方法は、デキストランスクラーゼ産生菌
として、その培養に高価な栄養成分を必要としないスト
レプトコッカス・ボヴィスを使用するので経済的にすぐ
れている。Furthermore, the method of the present invention is economically advantageous because it uses Streptococcus bovis, which does not require expensive nutrients for culturing, as the dextransucrase-producing bacterium.
Claims (1)
ラーゼを誘導する炭素源を含む培地で嫌気的に培養し、
産生されたデキストランスクラーゼをスクロースと、あ
るいは受容体の存在下でスクロースと反応させることを
特徴とするストレプトコッカス・ボヴィスの産生するデ
キストランスクラーゼによるロイクロースの製造法。 2 前記ストレプトコッカス・ボヴィスとしてストレプ
トコッカス・ボヴィスに属する148菌株(FERM
P−9390)を用いる特許請求の範囲第1項記載の製
造法。 3 前記炭素源がグルコースまたはスクロースである特
許請求の範囲第1項または第2項記載の製造法。 4 前記受容体がフルクトースである特許請求の範囲第
1項または第2項記載の製造法。 5 前記スクロースとフルクトースとのモル濃度比が1
:1〜1:4である特許請求の範囲第4項記載の製造法
。[Claims] 1. Cultivating Streptococcus bovis anaerobically in a medium containing a carbon source that induces dextransucrase,
A method for producing leuucrose using dextransucrase produced by Streptococcus bovis, which comprises reacting the produced dextransucrase with sucrose or with sucrose in the presence of a receptor. 2 148 strains belonging to Streptococcus bovis as the Streptococcus bovis (FERM
The manufacturing method according to claim 1 using P-9390). 3. The production method according to claim 1 or 2, wherein the carbon source is glucose or sucrose. 4. The manufacturing method according to claim 1 or 2, wherein the receptor is fructose. 5 The molar concentration ratio of sucrose and fructose is 1
:1 to 1:4.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14191087A JPH0650987B2 (en) | 1987-06-06 | 1987-06-06 | Method for producing leucrose by dextranslase produced by Streptococcus bovis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14191087A JPH0650987B2 (en) | 1987-06-06 | 1987-06-06 | Method for producing leucrose by dextranslase produced by Streptococcus bovis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63304994A true JPS63304994A (en) | 1988-12-13 |
JPH0650987B2 JPH0650987B2 (en) | 1994-07-06 |
Family
ID=15303005
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14191087A Expired - Lifetime JPH0650987B2 (en) | 1987-06-06 | 1987-06-06 | Method for producing leucrose by dextranslase produced by Streptococcus bovis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0650987B2 (en) |
-
1987
- 1987-06-06 JP JP14191087A patent/JPH0650987B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0650987B2 (en) | 1994-07-06 |
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