JPS63304988A - 哺乳類細胞においてポリペプチドをコードする選択されたｄｎａ断片が発現するためのエピソームベクター、組換えベクター、哺乳類宿主生体およびポリペプチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ポリペプチドをコードする選択されたＤＮＡ
配列が効率よく発現するためのエプスタイン−バーウイ
ルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　。

以下、ＥＢＶという）に基づく染色体外（ｅｘｔｒａｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｉａｌ（ａｐｌｓｏｍａｌ　（エピソー
マル）））復製機能単位（ｒθｐｌｔｃａｔｌｏｎ）お
よびヒトサイトメガロウィルス−エンハンサ−からなる
新規な哺乳類発現ベクターに関する。

本発明はまた、上記ベクターおよび該ベクターの少なぐ
とも１つのクローニング部位に連結される所望のポリペ
プチドをコードする選択されたＤＮＡ断片からなる組換
えベクターに関する。

本発明はさらに、本発明のベクターでトランスフェクシ
ョンされることができ、その中で該ベクターが染色体外
形態で存在する哺乳類宿主生体、および該哺乳類細胞に
おけるポリペプチドの製法に関する。また、本発明は本
発明のベクターと宿主の調製法を開示する。

［従来の技術・発明が解決しようとする課題］選択され
た蛋白質とくに、真核細胞起源の蛋白質をコードするＤ
ＮＡ断片や、単離されたｃＤＮＡの哺乳類細胞での発現
は、それらの原核細胞での発現よりもたいていは有利で
ある。真核細胞で市販用とくに医薬品調製用に製造され
るポリペプチドの品質はすぐれており、該ポリペプチド
には外来起源の望ましくない蛋白質が含まれず、このポ
リペプチドはしばしば原核細胞で製造された対応調製物
よりも活性や特異性が高い。

そのため、トランスフェクションした真核細胞における
外来ＤＮＡの発現が熱心に研究されている。この分野に
おける最先の特許は米国特許第４３９９２１６号および
同第４８３４６６５号で、これらは真核細胞での蛋白質
原料（ｐｒｏｔｅｉｎｅｏｕｓｍａｔｏｒｉａｌ）の製
造を開示している。これらの特許では外来ＤＮＡは真核
細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれなくてはならないこと
をとくに強調している。

しかしながら、のちの研究では、トランスフェクション
されたＤＮＡの宿主細胞染色体への組込みが、外来ＤＮ
Ａの発現にとって効率のよい目標と定められえないこと
が示されている。したがって、安定なトランスフェクシ
ョンした細胞株（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）を選択し、か
つ保持することが困難になった。これらの困難さが、エ
ピソーム発現ベクターの研究を刺激した。これまで、ク
ローン化されたＤＮＡの哺乳類細胞におけるエピソーム
複製（ｅｐｌｓｏｓ＋ａｌ　ｒθｐｉ　１ｃａｔ　１ｏ
ｎ）は、適当な細胞株と組み合わせてパピローマウィル
ス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ配列（米国
特許第４４１９４４６号および欧州特許出願箱１９８３
８８号各明細書参照）およびエプスタイン−バーウイル
スＤＮＡ断片（ヤーテス（Ｙａｔθ８）ら、ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）　３１３．８１３〜８１５頁（１９８
５）、スドゲン（Ｓｕｄｇｅｎ）ら、モレキュラー９ア
ンドウセルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｌｏｌｏｇｙ）　５　（２
）、　４１０〜４１３頁（１９８５）およびシミズ（Ｓ
ｈｉｍｌｚｕ）ら、モレキュラー９アンドウセルラー・
バイオロジーエ（４）、１０７４〜１０８７頁（１９８
６）各参照）をもつベクター、またはシミアンウィルス
（８１ａ１ａｎ　Ｖｌｒｕｓ）、すなわちＳＶ４０　（
米国特許第４６９９８０８号明細書参照）もしくはポリ
オーマウィルス（ミルラー（Ｍｉｌｌθ「）ら、モレキ
ュラーΦアンド・セルラー・バイオロジー４０１）、２
４０６〜２４１２頁（Ｉｎ２）参照）の復製起点をもつ
ベクターを用いてなしとげられてきた。

哺乳類細胞において、クローン化された配列を発現させ
るためには、外米ＤＮＡは、転写開始や新しい転写産物
のプロセッシング （ｐｒｏｃｅｓｓｌｎｇ）に必要な情報を有する発現ベ
クターに接続しなければならない。クローン化されたｃ
ＤＮＡの構成的（ｃｏｎｓｔ　１ｔｕｔ　１ｖｅ）また
は調節された発現（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｘｐｒｅｓ
ｓｌｏｎ）は細胞やウィルス起源のいくつかのエンハン
サ−やプロモーターを用いて達成されてきた。エンハン
サ−の特性は遺伝子の転写活性およびその結果としての
遺伝子産物の量を調節する主要な要因である。

サイトメガロウィルス（以下、ＣＭｖという）エンハン
サ−は欧州特許出願第１７３５２２号明細書に、またパ
ボバウイルスーエンハンサーは欧州特許出願第１５４５
８８号明細書に開示されている。

［課題を解決するための手段］ 本発明は哺乳類細胞にトランスフェクションし、かつ染
色体外形態に複製する能力を有し、以下のＤＮＡ断片、 （ωヒトサイトメガロウィルスの初期遺伝子に隣接した
エンハンサ−配列（ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｒｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ　ｏｆ’　ｔｈｅ　１ａｖｅｄｌａｔｅ　ｅａ
ｒｌｙ　ｇｅｎｅｓ）およびＳＶ４０ウィルスの初期遺
伝子のプロモーターまたはそれらのいかなる機能的部分
からなる転写開始のための調節配列、 （ｂ）ＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のスモールｔ−抗
原イントロンおよびポリアデニル化シグナルまたはそれ
らのいかなる機能的部分からなる合成されたｍＲＮＡの
ためのプロセッシングシグナルからなる配列、 （ｃ）エプスタイン−バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝
子およびｏｒｉ−Ｐ配列またはそれらのいかなる機能的
部分からなるベクターの染色体外複製をになうＤＮＡ配
列および （ｄ）所望のポリペプチドをコードする選択されたＤＮ
Ａ断片が連結されうる少なくとも１つの独特な制限酵素
開裂部位からなる少なくとも１つのクローニング部位 からなる選択された哺乳類細胞においてポリペプチドを
コードする選択されたＤＮＡ断片が高発現するためのエ
ピソームベクターに関する。

本発明のエピソームベクターにおける少なくとも１つの
クローニング部位は、複数のクローニング部位であるこ
とが好ましく、該複数のクローニング部位がプラスミド
ｐＵＣ１３由来で、３種の制限酵素器ｎｄｎ［、Ｓａｔ
　　ＩおよびＸｂａ　Ｉのための制限酵素開裂部位であ
ることがとくに好ましい。

また、本発明のエピソームベクターにおいては、細菌で
の選択のための少なくとも１つの適当なマーカー配列を
ＤＮＡ断片として含むことが好ましく、該細菌での選択
のための適当なマーカー配列としては、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２のアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ　　）およ
びｐＢＩ？３２２のＤＮＡ複製の開始部位がとくに好ま
しい。さらに、本発明のエピソームベクターにおいては
、哺乳類細胞での選択のための少なくとも１つの適当な
マーカー遺伝子をＤＮＡ断片として含むことが好ましく
、該哺乳類細胞の選択のための適当なマーカー遺伝子と
しては、ハイグロマイシンＢ（ＨｙｇＢ　　）に対する
耐性を与える大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）　トランスポゾン
Ｔｎ５由来のｈｐｈ遺伝子がとくに好ましい。

上記のセグメントからなるプラスミドの１例であるプラ
スミドＩ）ＫＴＨ５３９は菌保存機関であるトイチェ・
ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ　Ｓａｉｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＭｌｃｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ）に受託番号ＤＳＭ４０３０として寄託
されている。

本発明はまた、前記エピソームベクターおよび該ベクタ
ーの少なくとも１つのクローニング部位に連結される所
望のポリペプチドをコードする選択されたＤＮＡ断片か
らなる組み換えベクターに関する。

コードされるポリペプチドとしては、細菌クロラムフェ
ニコールアセチル転移酵素（ｃＡＴ）、インフルエンザ
ウィルス赤血球凝集素（ＨＡ）、風疹ウィルスポリペプ
チド、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）　、お
よび第■因子すなわちフオンウィルブランド因子、同様
に旧ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスなどの抗原などがあげ
られる。

なかでも、クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ｃ
ＡＴ）およびインフルエンザウィルス赤血球凝集素（Ｈ
Ａ）が好ましい。

また、本発明は上記の少なくとも１つの組換えベクター
の染色体外形態での複製を許し、該ベクターに含まれる
所望のポリペプチドをコードする選択されたＤＮＡ断片
を発現させることが可能である宿主が、上記の少なくと
も１つの組換えベクターを含んでなる哺乳類宿主生体（
ａ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　、ｈｏｓｔ　ｏｒｇａｎｌｓ
ｍ）に関する。哺乳類宿主としてはヒトヒーラ細胞（Ｈ
ｅＬａ　Ｃｅ１ｌ）、犬（ｃａｎｉｎｓ）ＭＤＣＫ細胞
、サルＣＶ−１細胞、ハムスター　Ｒ１８１０細胞、ヒ
ト２９３細胞、ヒトスルタン細胞（Ｓｕｌｔａｎ　Ｃｅ
１ｌ）が好ましい。

さらに、本発明は上記哺乳類宿主生体を適当な培養条件
で培養する工程およびポリペプチドを回収する工程から
なる哺乳類細胞における所望のポリペプチドの製法に関
する。

［実施例］ 本発明はクローン化されたＤＮＡ配列の効率のよい発現
の可能性をもつエピソーム発現ベクターの提供を目的と
する。

本発明のベクタープラスミドは広範囲に選択された宿主
細胞の中で染色体外の形態で複製できるＤＮＡ断片、ト
ランスフェクションした細胞に選択薬剤耐性を与える断
片および現在知られている最も強い真核生物のエンハン
サ−のうちの１つからなる哺乳類発現カセットを連結し
ている。本発明の発現ベクターはまた適当なプロモータ
ーおよび転写プロセッシングシグナルを有している。こ
の新しい組合せは本ベクターに結合した外来ｃＤＮＡの
高効率での発現と製造に適した細胞株のトランスフェク
ションの使用に最適ならしめるいくつかの特性を本発現
ベクターに提供する。本ベクターに適用されたような染
色体外複製システムの有する高発現能力の組合せは、従
来の方法と比較してつぎのような有利性がある。

（１）組込みベクター（ＩｎｔｅｇｒａｔｌＢ　ｖｅｃ
ｔｏｒｓ）と比較すると、トランスフェクションの効率
が高いため、トランスフェクションされた細胞クローン
の量が非常に多い。

（２）クローン化されたｃＤＮＡの発現を不活性化させ
る可能性のある再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅａ＋ｅｎｔ
ｓ）が少ない。

（３）細胞クローンを長く保持（ａ＋ａｌｎｔｅｎａｎ
ｃｅ）　しても、プラスミドの安定性が高い。

（４）トランスフェクションした細胞において高い割合
で染色体外ベクターからクローンイヒされた配列が効率
よく発現する。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はもとよりこれらに限定されるものではない。

実施例１ クロラムフェニコールアセチル転移酵素（ｃＡＴ）をコ
ードするＤＮＡ断片が発現するためのエピソームベクタ
ーの作製およびその用途 （原料と実験方法） （ωベクターおよび細菌株 ｐｓＶ２ｃＡＴは、ビーｅ　ハワード（Ｂ、Ｈｏｗａｒ
ｄ）　（ゴーマン（Ｇｏｒｉａｎ）ら、モレキユラー・
アンド・セルラｍ−バイオロジー２．１０４４〜１０５
１頁（１９８２））から、９２２０．２はビル・スドゲ
ン（ＢｉｌｌＳｕｄｇｅｎ）　（ユニバーシティーオブ
ｅウィスコンシン（Ｕｎｌｖ、ｏｆ’　Ｗｌｓｃｏｎｓ
ｉｎ）　、７ジソン（Ｍａｄｌｓｏｎ）、アメリカ合衆
国）から、およびｐＭＴＶ　ｄｈｒｒはシー−リンゴー
ルド（Ｇ、Ｒｌｎｇｏｌｄ）　（リ−（Ｌｅｅ）ら、ネ
イチャー２９４．２２８〜２３２頁（１９８１））から
えた。サイトメガロウィルスエンハンサ−は、ＳＶ４０
−ＣＭＶりＯ−：／　Ｃ４（エム”ポジヤード（Ｍ、Ｂ
ｏｓｈａｒｔ）　、セル（ｃｅｌｌ）４１．　５２１〜
５３Ｇ（１９８５））からえた。ｐＨＡ１はエム・ジエ
ーーゲッチング（Ｍ、Ｊ、ＧｅｔｈＩｎｇ）（ゲッチン
グら、ネイチャー２８７．３０１〜３０Ｇ頁（１９８０
））からえた。大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｌ）Ｂ２をｐｕｃｔ
ａおよびＭ１３＊ｐＨ以外のベクターの宿主として用い
、また大腸菌ＪＭ１０３をｐｕｃｔａおよびＭ１３ｓｐ
Ｈのベクターの宿主として用いた。

山）細胞ゝ培養およびトランスフェクションヒーラ細胞
（ヒト子宮癌、ＡＴＣＣＣＣＬ２）、ＭＤＣＫ細胞（犬
（ｃａｎｌｎｅ）腎臓、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４　）　、
ＣＶ−１細胞（アフリカグリーンモンキー（Ａｒｒｌｃ
ａｎｇｒｅｅｎ　ｍｏｎｋｅｙ）腎臓、ＡＴＣＣＣＣＬ
７０）　、ＲｌＢｌＧ（チャイニーズハムスタ一体細胞
（ＳＯＩａｔｌＣｃｅｌｌｇ）、スイス、ユニバージテ
ィーφオブ・チューリッヒ（Ｕｎｌｖ、　ｏｒ　Ｚｕｒ
ｌｃｈ）　、ディーφピカード（Ｄ、Ｐｌｃａｒｄ）か
ら）および２９３細胞（トランスフオームされた（Ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍｅｄ）原始ヒト胚腎臓、スウェーデン、
ユニバーシティ・オブ・ウプサラ（Ｕｎｉｖ、　ｏ（’
　Ｕｐｐｓａｌａ）、　ユｅベツターソン（Ｕ、Ｐｅｔ
ｔｅｒｓｏｎ）から）は、ペニシリン−ストレプトマイ
シンと１０％牛脂児血清で補足したＨ２Ｎ中で培養した
。トランスフェクションおよび選択したのち、血清の割
合を５％にさげた。

スルタン細胞（ヒト骨髄腫細胞株、フィンランド、ユニ
バーシティ・オブ・ヘルシンキ（Ｕｎｌｖ。

ｏｆ　ｔｌｅｌｓｌｎｋｉ）　、ピー中レイノネン（ｐ
、１ｅｌｎｏｎｅｎ）から）をペニシリン−ストレプト
マイシン、１０％牛脂児血清および１ｈＭへペスで補足
したＭＥＮの懸濁液中、ｐＨ７，２で培養した。

ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら（セル口、７２５〜７３
１頁（１９７ｇ））やウニバー（Ｗｅｂｏｒ）ら（セル
長１９８３〜９９２頁（１９８４））によるリン酸カル
シウム共沈澱技術の変法を用いて、ＤＮＡを細胞単層（
ヒーラ、ＭＤＣＫ、　ＣＭ−１、Ｒ１６１０および２９
３細胞）にトランスフェクションした。トランスフェク
ションの一日前に細胞を１ｏｃ−皿にシード（ｓｅｅｄ
）し、トランスフェクションの４時間前に、培養液を交
換した。エタノール沈澱したＤＮＡ　２０μｇを８２０
２４０１１１に溶解し、４　ＸＣａ　（０，５ＭＣａＣ
ｌ２．０．ＩＭへベス、ｐＨ７，０５）　　２４０ｕ　
ｆｌを加え、５分間室温でインキュベートし、ついで２
Ｘ　ＨＢＳ（０，０５Ｍヘベス、ｐＨ７，０５，０，２
８ＭＮａＣｊ　。

０．７５ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４および０．７５ａ＋Ｍ　Ｎ
ａ２ＰＯ４）４８０ｇｇを加えた。室温で１５分間イン
キュベーションしたのち、リン酸カルシウム−ＤＮＡの
共沈殿を細胞単層に加え、３７℃で１２時間インキュベ
ートした。細胞をＴＢＳ（２５＋＊Ｍ　トリス、ｐＨ７
，４，１３７１Ｍ　　ＮａＣｌ、　　５　　ｉＭ　　Ｋ
Ｃ＃、　　　０．７ｍＭＣａＣ＃２　　、　０．５ｍＭ
Ｍｇｃ＃２．０．８　ｍＭ　Ｎａ２）ＩＰＯ４）で洗い
２５％グリセロールで１分間シジックを与え、再びＴＢ
Ｓで２回洗い、新鮮な培養液を重層した。３７℃で２４
時間インキュベーションしたのち、培養液をハイグロマ
イシンＢを３００ｇｇ／ｍｌ含有する新鮮な培養液と取
りかえた。トランスフエクション後、１０〜１４日で耐
性コロニーが出現し、クローニング環（ｃｌｏｎｉｎｇ
　ｒｉｎｇｓ）によるか、または貯蔵した細胞から単一
の細胞クローンをつくることによってこれらを回収した
。形質転換効率は２．５〜５　Ｘ　１０５細胞のμｇＤ
ＮＡあたり１〜１００コロニーの間で変化した。

スルタン懸濁細胞を二ニーマン（Ｎθｕｍａｎｎ）らの
ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）　　１、８４１〜
８４３頁（１９８２）およびボッター（ＰＯｔｔθ「）
らのブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス（ＰＮＡＳ）８１．７１８１〜７
１６５頁（１９８４）にしたがってエレクトロポレーシ
ョン （ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってトランス
フェクションした。エレクトロポレーションをヘペス緩
衝化塩類液２００μ＃　（１４０ＭＭ　　ＮａＣＮ、２
５ｍＭヘベス、０．７５　ｍＷ　Ｎａ２ＨＰＯ４、ＤＨ
７，１）中で、２Ｘ１０６細胞およびＤＮＡ　１２Ｍｇ
を用いて行なった。細胞−ＤＮＡ懸濁液を７秒間隔で３
パルスに曝らした。

電場は８８ｎＰで５Ｖ／ｃｍであった。エレクトロポレ
ーション後、細胞を２０分間水中でインキュベートし、
培養液の入った細胞培養フラスコに移した。

（ｃ）ＤＮＡの単離と分析 総細胞ＤＮＡを、マニアティス（Ｍａｎｌａｔｌｓ）ら
によって記述された方法（モレキュラー・クローニング
、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ）。

コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）　、ニューヨーク（１９８２））の変法によっ
てトランスフェクションされた細胞から単離した。詳し
くは、５×１０６細胞をＴＥ−バッファー５０μｇに再
度懸濁し、プロテイナーゼＫ　バッファー（０，１ＭＮ
ａ（Ｊ、Ｑ、０５Ｍ　）リス、ｐＨ８，０、０，０２Ｍ
　ＥＤＴＡおよび０．５％５Ｏ８）５００Ｍｇを加え、
プロテイナーゼＫ　１０Ｇμｇ　／　ｍｌとともに３７
℃で２時間インキュベートした。ついで溶解液にフェノ
ール抽出を２回行ない、エタノールで沈澱させた。沈澱
（ペレット）を、ＴＥＸバッファー（５０１Ｍ　）リス
、ｐＨ８、ｌ（ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌｏｍＭ　　Ｎａ
ＣＩ）　）３００μｐに溶かし、アールエヌエース（Ｒ
ＮＡｓｅ）（１００ｔｔ　ｇ　／　１　）とともに、３
７℃で２時間インキュベートし、フェノールで抽出し、
エタノールで沈澱させた。

この結果、総ＤＮＡ　２０ｔ１．かえられ、トリス−酢
酸バッファー中で０．８％アガロースゲル電気泳動に流
した。プロッティングとハイブリダイゼーシジンはマニ
アティスらによって記載された方法（モレキュラー−ク
ローニング、ア拳ラボラトリ−・マニュアル、コールド
争スプリングψバーバー・ラホラトリー、ニューヨーク
、（１９８２））にしたがった。プローブＤＮＡはｐＫ
ＴＨ５４０を比活性１０８ｃｐｓ／μｇでニックトラン
スレーションした。

（ｄ）ＣＡＴアッセイ 安定なトランスフェクションされたプール（ｐｏｏｌｓ
）またはクローンからの細胞を通常シード（ｓｅｅｄ）
後４８時間でハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）　した。

ゴーマンらのアッセイ法（モレキュラーφアンド・セル
ラー・バイオロジー２．１０４４〜１０５１頁（１９８
２））を用いた。ＣＡＴ酵素をｔＯＳ細胞から２５０＠
Ｍ　）リス塩酸（ｐＨ７，８）１００　ｕｆｌ　ｌ：凍
結融解を３回行なうことによって遊離させた。酵素アッ
セイは細胞抽出液１０μｆｌ　ｓ　４ＩＭアセチルコエ
ンザイムＡ（ファルマシア（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉａ）社
製）２０Ｍｇおよび′Ｃクロラムフェニコール（５４ｍ
ＣＩ／ａｍｏｔｅニアマージャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
社製）０．５μＣ１を含有する５００ｍＭ　）リス塩酸
（ｐＨ７，８）の最終容量１５０　　μｇにおいて行な
った。ＣＡＴ活性を定量するため、ＣＡＴ酵素の精製品
（ファルマシア社製）の既知量を用いて、標準曲線を作
成した。酵素アッセイを３７℃で３０分間行なわせ、ク
ロラムフェニコールを酢酸エチル０．８ｍｌで抽出する
ことによって反応を止めた。遠心留去（ｃｅｎｔｒｌｆ
ｕｇａｌ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）後１クロラムフエ
ニコールを酢酸エチル１５μｇに溶解し、シリカゲル薄
層プレート（メルク（Ｍｏｒｃｋ）社製）にスポットし
、クロロホルム−メタノール（９５：５、上方展開）で
展開した。オートラジオグラフィー後、アセチル化クロ
ラムフェニコールを、スポットを切りだし、シンチレー
ションカウンタ−でカウントを測定することによって定
量した。

アセチル化の割合が３０％をこえ、基質を使いはたした
ことを示すばあいは、試料抽出液をＣＡＴ活性測定のた
めに希釈した。直線の範囲のアセチル化１００分率の値
をＣＡＴ活性の単位に換算した。

＜ｅｌサンドイッチ　ハイブリダイゼーシ日ントランス
フエクションされたＤＮＡのコヒー数を正確に決定する
ために英国特許公開箱ＧＢ　２１８７２８３号公報に開
示された方法でサンドイッチハイブリダイゼーションア
ッセイを行なった。

（エピソーム組換えプラスミドの作成）サイトメガロウ
ィルスエンハンサ−と、５Ｖ４Ｇプロモーターは、ＣＭ
ｖエンハンサ−が、広範囲の宿主細胞において最も強力
なエンハンサ−であると知られているため、発現ベクタ
ーの調節配列として選択された。ＣＭＶエンハンサー−
８Ｖ４０プロモ一ター断片　１．１５　ｋｂは、ＳＶ４
０−ＣＭＶクローンＣ４の旧ｎｄｍ消化によってえられ
た（第１図参照）。そのＩ１１ｎｄｍ断片を単離し、ｐ
ＵＣ１３ベクターの旧ｎｄｎＩ部位にサブクローニング
した（第１図参照）。ｐＵＣｌ３のポリリンカークロー
ニング部位から、Ｂａ曽旧部位をＢａ■旧切断後、フレ
ノウで埋め、再連結することによって除いた。このサブ
クローン（ｐＫＴＨ５３３）から、ＣＭＶ−工：／　ハ
”７サーーＳＶ４０プロモーターとｐｕｃｔａポリリン
カーからなるＥｃｏＲｌ−Ｈａｅｎ断片０．９ｋｂを単
離し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にし、ＳＶ４０ポリ
アデニル化部位およびｐＢＲｄ配列からなる平滑末端化
されたｌ）ＭＴＶ−ｄｈｆｒ　（７）ＢｇｆＩＩＩ　−
Ｈ１ｎｄ■断片と連結した（第１図参照）。その結果、
組込みベクターｐＫＴＨ５３５はこの時点で独特なＨｌ
ｎｄｍ、Ｘｂａｌおよび５ａｉｌ部位を有するポリリン
カークローニング部位からなっている。

エピソー　ムＥＢＶベクターｐＫＴＨ５３９（第２図参
照）は、ＣＭＶ　エンハ：／サー、ＳＶ４０プ（ｆｆモ
ーター、ポリリンカークローニング部位（ＭＣ８）　、
スモールｔ−抗原イントロンおよびポリアデニル化シグ
ナルからなるｐＫＴＨ５３５（第２図参照）から作成し
た。エピソーム複製に必要なＥＢＶ断片ＥＢＮＡ−１と
ｏｒｉ−Ｐは、プラスミド９２２０．２　　（第２図参
照）からえた。このプラスミドは、また形質転換体の選
択のためのハイグロマイシンＢ耐性（ｌＩｙｇＢｒ）遺
伝子ｈｐｈモ有シテイル。９２２０．２ヲ、Ｂａ１Ｉ旧
と旧ｎｄｍで消化し、フレノウで埋め（このため、９２
２０．２由来のＸｂａｌ、　５ａｉｌおよびＰｓｔ１部
位は除かれた）、ｐＫＴＨ５３５のフレノウで平滑末端
化されたＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ断片と連結した（第２
図参照）。１）ＫＴ）Ｉ　５３９は独特なりローニング
のための旧ｎｄｍ、Ｘｂａｌおよび５ａｉｌ部位を有し
ている。

ＣＡＴ−ＥＢＶベクター組換え体ｐＫＴＨ５４０（第３
図参照）は、まずｐｓＶＺｃＡＴの旧ｎｄｍ−Ｂａｇ＋
旧断片をＣＭＶ−ｐＵＣｌ　３サブクローンｐＫＴＨ５
３３のＳｍａ１部位に挿入して作成した。このｐｃＭＶ
ｃＡＴサブクローン（ｐＫＴＩ５３Ｂ）をトランジェン
ト（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）プロモーター活性アッセイに
おいてｐｓＶＺｃＡＴとともに用いた。ＥＢＶ−１１ｙ
ｇＢ’断片を連結するために、ｐＫＴＨ５３ＢをＥｃｏ
ＲＶ−ＥｃｏＲＩ　（ＥｃｏＲＩは部分消化）で切断し
、ＣＭＶエンハンサー−８Ｖ４０プロモーター−ポリリ
ンカー−ＣＡＴ−ポリＡ断片　２．１ｋｂをえた。

この断片を単離し、平滑末端化し、フレノウでうめたｐ
２２０．２　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ−Ｂａｍ旧断片に挿入し
、ｐＫＴＨ５４０をえた（第３図参照）。

（試験） （ωトランスフェクションされた細胞のベクターＤＮＡ
の分析 トランスフェクションされた細胞プール中のベクターｐ
ＫＴＨ５４０ＯＮＡの状態を、総細胞ＤＮＡを単離し、
光自動切断（ｌｉｇｈｔ　ｓｅｃｈａｎｌｃａｌｓｈｅ
ａｒｉｎｇ）後アガロースゲル電気泳動で精製したＤＮ
Ａを分析することによって分析した。ヒーラ、ＣＭ−１
および２９３細胞からえた非消化ＤＮＡのプラスミド特
異的プローブをプローブにしたサザンプロットでは、単
量体ｐＫＴＨ５４０マーカーＤＮＡと同じ位置にくるシ
グナルが表われ、これにより前記細胞では、トランスフ
ェクションされたＤＮＡが、エビソーム形態で残存して
いることがわかる。Ｒ１８１０とＭＤＣＫ細胞では、非
情化―料にハイブリダイズするＤＮＡは、ゲルの上部に
認められ、宿主染色体ＤＮＡと同じ位置にあることを示
した。

ＥＢＶベクターのエピソーム複製を供給する細胞のこの
範囲は、ヤーテス（Ｙａｔｅｓ）ら（ネイチャー川、８
１２〜８１５頁（１９８５））によってつくられた結果
を確認した。本発明者らや、他の人々の実験によると、
ＢＰＶを基本とするベクターは、ある種のげっ歯動物（
ｒｏｄｅｎｔ）細胞（ｃＬ２７およびＮ１１Ｉ３Ｔ３）
ではエピソーム形態で存在するが、いくつかの他の咄乳
類種では細胞内に組み込まれる（ルオーネンーレート（
Ｒｕｏｈｏｎｅｎ−Ｌｅｈｔｏ）らジャーナル・オブ雫
バイオテクノロジーＵ、旧ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　
　６．９１〜１０５頁（１９８７）参照）。このように
、ＥＢＶベクターとＢＰＶベクターはエビソーマリテ４
　（ｏｐｌｓｏａａｌｌｔｙ）の宿主範囲に関して、互
いに相補するように思われる。

山）トランジェント発現アッセイによるＣＭＶと５Ｖ４
Ｇエンハンサ−の活性の比較 ＣＭＶエンハンサ−は、ＳＶ４０ウィルスゲノムに挿入
されたときＳＶ４０初期エンハンサーの数倍活性が高い
ことが発見されている（エム・ポジヤード、セル４１．
　５２１〜５３０頁（１９８５）参照）。本発明者らは
これらのプロモーターが、クローン化された遺伝子の合
成を目的とするとき発現ベクター作成にこの差違があら
れれるかどうかを確かめたかった。この目的のため、Ｃ
ＡＴをコードする配列を、ＣＭＶ−８Ｖ４０エンハンサ
−プロモーターと転写プロセッシング配列をもつベクタ
ー（ｐＫＴＨ５ａ５　、第１図参照）に挿入した。その
結果えられたプラスミドＣＭＶ−ＣＡＴをリン酸カルシ
ウム沈澱法によって種々の培養細胞にトランスフェクシ
ョンし、トランスフェクションして４８時間ののち、Ｃ
ＡＴ活性を決定した。比較として、ＳＶ４０初期エンハ
ンサ−プロモーターがＣＡＴ遺伝子の前に残存している
ｐｓｖ　ＣＡＴプラスミド（ゴーマンら、モレキュラー
中アンドウセルラー中バイオロジー２．１０４４〜１０
５１頁（１９８２）参照）を同じ量の細胞にトランスフ
ェクションし、同様にしてＣＡＴ活性を決定した。トラ
ンジェントのＣＡＴアッセイにおけるＣＭＶ−８Ｖ４０
エンハンサ−プロモーターのＳＶ４０初期エンハンサ−
プロモーターとのプロモーター活性を相対的に比較した
結果を、用いた細胞とともに第１表に示す。

第１表より、げっ歯類、サル細胞ではＣＭＶエンハンサ
−はＳＶ４０エンハンサ−の　Ｌ、Ｓ〜４　、７　倍も
活性が高いことがわかるが、ヒト細胞ではＳＶ４０エン
ハンサ−の方が、わずかにＣＡＴ活性が高いことがわか
る。これらの結果より、ＣＭＶエンハンサ−は、実際に
、種々のタイプの哺乳類細胞の使用に適した強い発現ベ
クターの有望な構成成分であることがわかる。

［以下余白］ 第　　１　　表 ［注］＊ニアセチル化ＣＭ−クロラムフェニコール（ｃ
ｐｓ）の比（ｃＭＶ−ＣＡＴ／５Ｖ−ＣＡＴ）（ｃ）ベ
クターのコピー数 ＣＡＴ遺伝子を有しているｐＫＴＩＩ　５４０ベクター
のコピー数をサンドイッチハイブリダイゼーション法に
よって種々の宿主細胞株から決定した。

ＥＢＮＡ−１および１０４０　ｂｐのｏｒｉ−Ｐ配列か
らなるｐ２２０．２のＥｃｏＲＩ−ＢｇＮ　ｌ断片３．
５ｋｂを埋め、クレノウ処理したｐＢＲ３２２−Ｅｃｏ
旧消化ＤＮＡを連結してハイブリダイゼーションのため
のＤＮＡ試薬を作成した。前記試薬がプローブ試薬であ
る。サンドイッチハイブリダイゼーションのためのフィ
ルター試薬には、プローブ試薬の下流のｏｒｉ−Ｐ配列
を含むｐ２２０．２のＢｇＮ　Ｉ断片１０９０ｂｐを用
いた。

この断片をＭＬ３ａ＋ｐＨのＳｍａ１部位に挿入した。

フィルター試薬をニトロセルロースフィルターに付着し
、ｐＫＴＨ５４０のコピー数を３　Ｘ　１０６細胞から
決定した。

第２表に示すプラスミドｐＫＴＨ５４０のハイグロフィ
シ２８選択細胞のプールおよび単一細胞クローン（各番
号１〜５）におけるコピー数を第２表に示す。異なる細
胞タイプ（ｔｙｐｅ）によってトランスフェクションさ
れたプラスミドのコピー数は、明らかに異なっている。

たとえば、Ｃｖ−１細胞（６〜１６コピー／細胞）や２
９３細胞（１〜１０コピー／細胞）においては最も高い
コピー数を常に認めた。ヒーラ、ＭＤＣＫおよびＲ１８
１０細胞においては、たいていのクローンは細胞あたり
わずか１コピー存在するだけである。しかし、これらの
細胞においては、コピー数の高い個々のクローンも認め
た（第２表参照）。ヒーラ、ＭＤＣＫおよびＲ１８１０
細胞のいくつかのクローンにおいてはあきらかにコピー
数が細胞あたり１コピーよりも少ない。本発明者らの以
前のデータに基づくと（ルオーネンーレートら、ジャー
ナル・オブψバイオテクノロジー６．９１〜１０５頁、
（１９８７）参照）、前記の結果はプラスミドのプロー
ブおよび（または）フィルター試薬と相同な領域が、け
ずられたことを意味している。

（ｄ）ＣＭＶ−ＥＢＶベクターからのＣＡＴ酵素の発現
ＣＭＶ−ＥＢＶベクター作成物の発現能力をアッセイす
るため、本発明者らは細菌のＣＡＴ遺伝子をベクターに
クローン化しく第３図参照）、第２表に示すトランスフ
ェクションされた細胞プールや細胞クローン（各番号１
〜５）からのＣＡＴ活性をアッセイした。その結果を第
２表に示す。

第２表から、２９３、ヒーラおよびＣＶ−を細胞では細
胞プールや各細胞クローンで、ＣＡＴ活性が高いが、Ｍ
ＤＣＫの５つの細胞クローンのうちでは１個だけが高く
、また、Ｒ１８１０の１つのプールと１つのクローンの
みがかなりのＣＡＴ発現を示すことがわかる。

第２表を調べるとコピー数とＣＡＴ活性には正の相関関
係があることがわかる。２９３およびＣＶ−１細胞では
、たいていの細胞クローンにおいてエピソームベクター
のコピー数が１コピーよりも多く生じていた。ヒーラ細
胞においては、ＣＡＴ活性は、顕著に高いが、コピー数
との相関は、あまり明確ではない。しかし、最も高いＣ
ＡＴ活性をもつクローン番号４　（１９３単位／　１Ｇ
？細胞）はまた細胞あたり２０ベクターコピーを有して
いる。

たいていのＭＤＣＫとＲ１８１０細胞クローンでＣＡＴ
遺伝子の発現が低いのは、ベクターＤＮＡのコピー数が
低いためと考ええた。しかし、細胞あたり１コピーのＭ
ＤＣＫクローン５は、説明しうるように、ＣＡＴ活性が
高いが、細胞あたり約２７コピーノクローン４は、酵素
活性が非常に低い。たいていのＭＤＣＫとＲ１８１０ク
ローンにおいて、コピー数が１コピーよりも明らかに低
い理由はサザンハイプリダイゼーシジンの結果とともに
考えると、前記の細胞においてトランスフェクションさ
れたＤＮＡが、宿主ゲノムに組み込まれていることを示
唆している。この組み込み過程は、ベクターＤＮＡの完
全性（Ｉｎｔｅｇｒｔｔｙ）に強い影響を明らかに与え
、トランスフェクションされた遺伝子の活性を高い頻度
で低下させる。本発明者らの結果はＣＭＶ−ＥＢＶベク
ターにクローン化されたマーカー遺伝子の発現がこれら
の細胞でエビソーム形態で複製するとき、とくに効率が
よいことを示している。たいていのエビソーム細胞クロ
ーンが、ＣＡＴ高発現性を示す事実は、エピソームベク
ターにクローン化された遺伝子は再配列（ｒｅａｒｒａ
ｎｇｅｍｅｎｔｓ）が少なく、組込み部位における隣接
（ｆ　ｌａｎｋｌｎｇ）染色体領域によるシスに働＜　
（ｃｌｓ−ａｃｔｉｎｇ）ダウンレギュレーション　′
（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｌｏｎ）を受けないという
仮定を支持している。前記のように、ＥＢＶベクターは
、染色体遺伝子の単離に効率よく適用でき、外来真核生
物蛋白質を哺乳類細胞において高生産させるために有望
なベクターを供給することができる。

（ｅ）エビソームＣＭＶベクターと組込みＣＭＶベクタ
ーのＣＡＴ遺伝子の発現 ＣＭＶ−ＥＢＶベクターカ組込＊レタＲ１Ｂ１Ｇ　トＭ
ＤｃＫ細胞のＣＡＴ活性の決定により、ベクターが、エ
ピワームに残存しているヒトやサルの細胞よりも平均し
て発現が低いことがすでに示唆されていた（第２表参照
）。この仮定を確認するためヒトとサルの細胞（そして
、犬とげっ菌類細胞にも）にハイグロマイシンＢでの選
択が可能な耐性遺伝子を与えるベクターとともに、組込
み型ノＣＭＶ−ＣＡＴ作成物（第３図（Ｄ　ｐＫＴＨ５
３Ｂ）をトランスフェクションした。本発明者らは、耐
性細胞プールを選択し、各々の細胞タイプから５つの単
一の細胞クローンを無作意に選んだ。これらの細胞から
のＣＡＴ活性の決定により、エピソーム遺伝子は平均し
て、より活性が高いという見方を強く支持した。単一の
細胞クローンのＣＡＴ活性を調べたところ、クローン化
された遺伝子の発現レベルの多様性は、組込みベクター
の方が、エピソームベクターよりもはるかに高いという
見方を支持した。いくつかの理由がおそらくこの観察さ
れた違いの一因となりうる。

確実な１つの要因は細胞核における組込みＤＮＡ配列で
しばしばおこる配列構造変化である。また、組込み部位
の染色体領域によって生じた調節が他の完全な遺伝子の
転写活性を阻害しうる。

［以下余白］ 第　　２　　表 ［注］＊二市販の大腸菌ＣＡＴを対称として用いて標準
曲線を作成した。１単位は、クロラムフェニコールｉ　
ｎ５ｏｌを３７℃で１分間にアセチル化しうる活性とす
る。

（ｆ）ＣＭＶ−ＥＢＶＢクターのトランスフェクション
された細胞クローンにおける安定性 エピソームベクター配列とこれらのベクターにクローン
された遺伝子が、トランスフェクションされた細胞にお
いてどのように安定であるかを知ることは、たいへん興
味深い。細胞を常に選択的条件（ｓｅｌｅｃｔｌｏｎ　
ｐｒｅｓｓｕｒｅ）下に保持するべきかどうかという疑
問はとくに実用上（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ）重要である。従来の結果は、矛盾する情報を
供与している。げっ歯動物細胞におけるＢＰＶベクター
のあるばあいには、エピソーム配列は選択的条件をはず
したのちも長期間はぼ完全な形で残存していることが見
出された。一方、ＥＢｖＢクターにおけるＨＬＡ−２遺
伝子の発現についての一報は、細胞をハイグロマイシン
Ｂ非存右下に増殖させたとき、トランスフェクションさ
れた配列はすみやかに消失したことを見出した。本発明
者らは、本発明のＣＭＶ−ＥＢＶＢクターの安定性を、
培養液に薬剤を含有するときと含有しないときにＣＭＶ
−ＥＢＶ−ＣＡＴ作成物（ハイグロマイシン耐性細胞の
プール）によってトランスフェクションされた異なるタ
イプの細胞を培養することによって試験した。細胞を約
１週間に一度くりかえしてシードすることにより半集合
的（ｓｅｉｉｃｏｎＨｕθｎｃｙ）に保持した。１００
日培養したのち、細胞のＣＡＴ活性およびベクターＤＮ
Ａのコピー数について分析した。その結果を第３表に示
す。なお、第３表においてはベクターＤＮＡとしてｐＫ
ＴＨ５４０配列を用いた。２９３、ｃｖ−ｉおよびＲ１
６１０細胞においては、ハイグロマイシンＢの選択がな
いとき、コピー数の減少で示されるように、ベクター配
列は明らかに消失している。重要なことは、前記の細胞
においてはＣＡＴ活性は明らかに認められるもののＣＡ
Ｔ活性は劇的に低下していることである。

ヒーラまたはＨＤＧＫ細胞においては非選択条件下でも
、ベクターのコピー数は影響をうけず、その結果前記の
細胞においてはＣＡＴ活性も変化がない。

第　　　３　　表 ［注］＊１ｚプラスミドコピー数／細胞（サンドイツチ
ハイブリダイゼーシ目ンにより決定した） ＊２：クロラムフェニコールアセチル転移酵素の活性（
単位／１０７細胞、市販の大腸菌ＣＡＴを対称として用
いて標準曲線を作成し、１単位は、クロラムフェニコー
ル１　ｎ５ｏｌを３７℃で１分間にアセチル化しうる活
性とする） 実施例２ インフルエンザウィルス赤血球凝集素をコードするＤＮ
Ａ断片の発現のためのエピソームベクターの作成および
その用途 インフルエンザウィルス赤血球凝集素（ＨＡ）ＤＮＡは
プラスミドｐＨＡＩから旧ｎｄＩＩ［、Ｂａｍ１ｌｌ消
化により切り出され、フレノウで埋めアガロースゲル電
気泳動後単離して、フレノウで埋めたｐＫＴ１１５３９
の１１１ｎｄＩＩ［部位に挿入した。このＥＢ＾−１１
Ａ作成物は、ＣＭＶエンハンサー−８Ｖ４０プロモータ
ーの制御下に１１＾ｃＤＮ＾を含み、該作成物をｐＫＴ
ｌ＋５４１とした。

（原料および実験方法） 螢光抗体染色法（１ｍ５ｕｎｏｆ　ｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｅｅｓｔａｌｎｌｎｇ） 螢光抗体染色のため、ヒーラ／ｐＫＴｔ１５４１および
２９３／　ｐＫＴＩＩ５４１の安定な細胞プールを３％
パラホルムアルデヒドで固定した。間接螢光抗体法をウ
サギ（抗１１゜Ｎ２、インフルエンザウィルス日本）（
アイ・ジュルクネン（１，Ｊｕｌｋｕｎｅｎ）、フィン
ランド、ユニバーシティ・オブ・ヘルシンキ（Ｏｎｌｙ
、　ｏｆ　Ｈｅ１ｓｉｎｋ１）　、ディパートメントＱ
オブ伊ヴイロロジイ（Ｄｅｐｔ、　Ｖｌｒｏｌｏｇｙ）
とローダミン−コンシュゲイト（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ
）抗ウサギＩｇＧで行なった。

（ＥＢＶベクターからのＨＡ遺伝子の発現）安定にトラ
ンスフェクションされたヒーラ１５４１と２９３／　５
４１細胞プールについて、インフルエンザウィルス抗血
清を用いた間接螢光抗体染色によってＨＡ表面糖蛋白質
の存在を分析した。

両細胞プールとも細胞表面は広範囲にわたってＨＡ染色
され、細胞表面蛋白質を発現する際にもＥＢＶベクター
はまた機能的であることを示した。

［発明の効果］ 本発明のポリペプチド発現ベクターは組込みベクターと
比較すると、トランスフェクションの効率が高いためト
ランスフェクションされた細胞クローンの量が非常に多
く、クローン化されたｃＤＮＡの発現を不活性化させる
可能性のある再配列が少なく、細胞クローンを長く保持
しても、プラスミドの安定性が高く、かつトランスフェ
クションした細胞において高い割合で染色体外ベクター
からクローン化された配列が効率よく発現するものであ
る。

したがって、本発明によれば、所望のポリペプチドを効
率よくつることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は組換えプラスミドｐＫＴＨ５３５作製の模式図
である。第１図においては、組換えプラスミドｐＫＴＨ
５３５は、まずＣＭＶ　Ｃ４Ｈｌｎｄ　ｍ断片のｐＵＣ
１３の旧ｎｄＩＩ［部位へのサブクローニングによって
作製された。ｐＵＣ１３ポリリンカーから、Ｂａｇ旧ク
ローニング部位がＢａｍＨＩ消化後クレノウ（ｋｌｅｎ
ｏｖ）でうめられ（ｆ’１１１１ｎ）再び連結されるこ
とによって除かれた。このサブクローン（ｐＫＴＨ５３
３）から、ＣＭＶ　工：／　ハ：／サー（ｃＭＶＢ）、
ＳＶ４０プロモーター（ＳＶＰ）およびｐＵＣ１３ポリ
リンカーを含むＥｃｏＲＩ−１１ａｅ　ｎ断片が単離さ
れ、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にされて％’　ＳＶ４
０イントロン、ポリアデニル化部位およびｐＢＲｄを含
むｐＭＴＶ−ｄｈｒｒの平滑末端化されたＢｇｌ　ＩＩ
−旧ｎｄ　ｍ断片と連結され、ｐＫＴＨ５３５が作製さ
れた。 第２図は組換えプラスミドｐＫＴＨ５３９作成の模式図
である。第２図においては、ＥＢＶベクターｐＫＴＨ５
３９はｐＫＴ１１５３５と９２２０．２から作成された
。 プラスミドｐ２２０．２がＢａ１１１とＩｌｌｎｄｍで
切断後、フレノウで埋められ、ｐＫＴＨ５３５のフレノ
ウで平滑末端にされたＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ　２．ｌ
ｋｂ断片と連結されて、ｐＫＴＨ５３９が作製された。 第３図は組換えプラスミドｐＫＴＨ５４０すなわちＣＡ
Ｔ発現ベクターの作製の模式図である。第３図において
は、組換えプラスミドｐＫＴＩ＋５４０は、まずｐＳＶ
２ＣＡＴの平滑末端化された１ｌｉｎｄＩＩＩ　−Ｂａ
ａ＋ＨＩ断片のＣＭＶ−ｐＵＣ１３サブクローン（ｐＫ
Ｔ１１５３３）のＳｍａ１部位への挿入によって作製さ
れた。このｐｃＭＶ−ＣＡＴサブクｏ　−ン（ｐＫＴＨ
５３［ｉ）をＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ　　（ＥｃｏＲＩ
は部分消化により）切断してＣＭＶ−３Ｖ４０−ポリリ
ンカー−ＣＡＴ−ポリＡ断片２．１ｋｂをえ、これを平
滑末端にして、９２２０．２のＨｌｎｄ　ｌｌｌ−Ｂａ
■旧断片（フレノウで埋めた）に挿入して、ｐＫＴＨ５
４Ｑが作製された。 特許出願人　　　オリオンーユヒチュメ・オユｔｃＯＩ
ｌｌ ニｈ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　哺乳類細胞にトランスフェクションし、かつ染色体
   外形態に複製する能力を有し、以下のＤＮＡ断片、 （ａ）ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子に隣接し
   たエンハンサー配列およびＳＶ４０ウィルスの初期遺伝
   子のプロモーターまたはそれらのいかなる機能的部分か
   らなる転写開始のための調節配列、 （ｂ）ＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のスモールｔ−抗
   原イントロンおよびポリアデニル化シグナルまたはそれ
   らのいかなる機能的部分からなる合成されたｍＲＮＡの
   ためのプロセッシングシグナルからなる配列、 （ｃ）エプスタイン−バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝
   子およびｏｒｉ−Ｐ配列またはそれらのいかなる機能的
   部分からなるベクターの染色体外複製をになうＤＮＡ配
   列および （ｄ）所望のポリペプチドをコードする選択されたＤＨ
   Ａ断片が連結されうる少なくとも１つの独特な制限酵素
   開裂部位からなる少なくとも１つのクローニング部位 からなる選択された哺乳類細胞においてポリペプチドを
   コードする選択されたＤＮＡ断片が高発現するためのエ
   ピソームベクター。 ２　ＤＮＡ断片として細菌での選択のための適当なマー
   カー配列を含んでなる請求項１記載のベクター。 ３　ＤＮＡ断片として哺乳類細胞での選択のための適当
   なマーカー遺伝子を含んでなる請求項１または２記載の
   ベクター。 ４　少なくとも１つのクローニング部位が、複数のクロ
   ーニング部位である請求項１、２または３記載のベクタ
   ー。 ５　複数のクローニング部位がプラスミド ｐＵＣ１３由来で、３種の制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｓａ
   ｌ I およびＸｂａ I のための制限酵素開裂部位からな
   るものである請求項４記載のベクター。 ６　細菌での選択のための適当なマーカー配列が、プラ
   スミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子およびｐ
   ＢＲ３２２のＤＮＡ複製の開始部位である請求項２、３
   、４または５記載のベクター。 ７　哺乳類細胞での選択のための適当なマーカー遺伝子
   が、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与える大腸菌ト
   ランスポゾンＴｎ５からのｈｐｈ遺伝子である請求項３
   、４、５または６記載のベクター。 ８　ベクターｐｋＴＨ５３９である請求項１記載のベク
   ター。 ９　請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載の
   ベクターおよび該ベクターの少なくとも１つのクローニ
   ング部位に連結される所望のポリペプチドをコードする
   選択された ＤＮＡ断片からなる組換えベクター。 １０　所望のポリペプチドをコードする選択されたＤＮ
   Ａ断片が、細菌クロラムフェニコールアセチル転移酵素
   をコードするものである請求項９記載のベクター。 １１　所望のポリペプチドをコードする選択されたＤＮ
   Ａ断片が、インフルエンザウイルス赤血球凝集素をコー
   ドするものである請求項９記載のベクター。 １２　請求項９、１０または１１記載の少なくとも１つ
   のベクターの染色体外形態での複製を許し、該ベクター
   に含まれる所望のポリペプチドをコードする選択された
   ＤＮＡ断片を発現させることが可能である宿主が、請求
   項９、１０または１１記載の少なくとも１つのベクター
   を含んでなる哺乳類宿主生体。 １３　哺乳類宿主が、ヒトヒーラ細胞、ヒト２９３細胞
   、ヒトスルタン細胞、サルＣＶ−１細胞、犬ＭＤＣＫ細
   胞またはハムスターＲ１６１０細胞である請求項１２記
   載の宿主生体。 １４　請求項１２または１３記載の哺乳類宿主生体を適
   当な培養条件で培養する工程およびポリペプチドを回収
   する工程からなる哺乳類細胞における所望のポリペプチ
   ドの製法。