JPS63291585A - Fused gene expression vector - Google Patents
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- JPS63291585A JPS63291585A JP62125136A JP12513687A JPS63291585A JP S63291585 A JPS63291585 A JP S63291585A JP 62125136 A JP62125136 A JP 62125136A JP 12513687 A JP12513687 A JP 12513687A JP S63291585 A JPS63291585 A JP S63291585A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔概要〕
枯草菌用ベクターとして広く知られている、黄色ブドウ
球菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０を、制限酵素Ａｖａ
ｉｌをもって切断し、その切断末端を７４ＤＮＡポリメ
ラーゼをもって処理して末端を修復し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを使用して長さの異なる３種のＨｌｎｄｌ［ｌリン
カ−（８塩基対、１０塩基対、１２塩基対のＨｉｎｄｍ
リンカ−）を連結し、制限酵素１江ｄｌｌｌと１耗■を
もって切断して、カナマイシン耐性遺伝子のプロモータ
ー及びカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ
のＮ末端部を含み約１７０塩基対よりなるＤＮＡ断片の
人ｖａ１１部位に３種の長さの異なるＨｉｎｄｕｌリン
カ−の一部が残留している３種のＤＮＡ断片を得、次に
、大腸菌−枯草菌のシャトルベクターとして知られてい
る、ストレプトコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡ
Ｍα１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、エシ
ェリシア・コリのベクターＰＡＣＹＣ１７７由来のアン
ピシリン耐性遺伝子領域と、前記プラスミドｐＡＭα１
由来の複製開始領域と、前記ベクターｐＡｃＹｃ１７７
由来の複製開始領域とを有する複合プラスミドｐＨＹ３
００−ＰＬＫを制限酵素且ハｄｌ［ｌと１懸Ｉとをもっ
て切断し、末端の脱リン酸化をなした後、ここに、上記
３種のＤＮＡ断片を連結して得た３種の異なる融合遺伝
子発現ベクターである。Detailed Description of the Invention [Summary] Plasmid pUB110 derived from Staphylococcus aureus, which is widely known as a vector for Bacillus subtilis, was digested with the restriction enzyme Ava.
The cut ends were treated with 74 DNA polymerase to repair the ends, and T4 DNA ligase was used to create Hlndl[l linkers of different lengths (8 base pairs, 10 base pairs, and 12 base pairs). Hindm
linker) and cut it with restriction enzymes 1 dll and 1 dll to create a DNA fragment of approximately 170 base pairs containing the promoter of the kanamycin resistance gene and the N-terminus of kanamycin nucleotidyl transferase at the human va11 site. We obtained three types of DNA fragments with three different lengths in which portions of the Hindul linker remained, and then used the Streptococcus faecalis plasmid pA, which is known as an E. coli-Bacillus subtilis shuttle vector.
A tetracycline resistance gene region derived from Mα1, an ampicillin resistance gene region derived from Escherichia coli vector PACYC177, and the plasmid pAMα1.
and the replication initiation region derived from the vector pAcYc177.
A composite plasmid pHY3 having a replication initiation region derived from
After cutting 00-PLK with restriction enzymes Hadl[l and 1hanging I and dephosphorylating the terminal, three different fusions were obtained by ligating the three above-mentioned DNA fragments. It is a gene expression vector.
〔産業上の利用分野〕
本発明は、融合蛋白質を、大腸菌の中においても、枯草
菌の中においても、また、バチルスステアロサーモフィ
ラス（中等度好熱菌）の中においても発現しうる融合遺
伝子発現ベクターに関する。[Industrial Application Field] The present invention provides a method for expressing a fusion protein in Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Bacillus stearothermophilus (moderate thermophile). Concerning fusion gene expression vectors.
外来遺伝子を宿主細胞中に移入し増殖する運搬媒体たる
ベクターに必須な要件は、外来遺伝子を挿入するための
制限酵素の認識部位の存在と、移入された外来遺伝子が
その中で安定に存在しうる可能性と、外来遺伝子が移入
されたベクター自身が自己複製しうる可能性とである。The essential requirements for vectors, which serve as delivery vehicles for transferring foreign genes into host cells and propagating them, are the presence of a restriction enzyme recognition site for inserting the foreign genes, and the presence of a stable presence of the transferred foreign genes within them. and the possibility that the vector into which the foreign gene has been introduced can self-replicate.
たり、か−るベクターをもってしては、外来遺伝子を所
望の宿主細胞中に移入し増殖することは可能であるが、
外来遺伝子が移入された宿主細胞において、移入された
外来遺伝子が発現するとは限らない、そこで、上記の意
味のベクターの機能を拡大して、移入された外来遺伝子
を宿主細胞中で発現しうるベクターが開発され−ば、産
業上有用である。However, with such vectors, it is possible to transfer foreign genes into desired host cells and propagate them.
The transferred foreign gene is not necessarily expressed in the host cell into which the foreign gene has been transferred.Therefore, by expanding the function of the vector in the above sense, a vector capable of expressing the transferred foreign gene in the host cell is used. If developed, it would be industrially useful.
また、外来遺伝子が構造蛋白質である場合、組み換えの
結果発現される蛋白質は、当該構造蛋白質の遺伝子以外
の遺伝子の一部または全部をともなっている融合蛋白質
である場合が多いので、融合蛋白質を代表する融合遺伝
子に対して機能しうるベクターの開発は産業上有用であ
る。In addition, when the foreign gene is a structural protein, the protein expressed as a result of recombination is often a fusion protein that includes part or all of a gene other than the gene for the structural protein. The development of vectors that can function for fusion genes that can be used is industrially useful.
ここで、融合遺伝子が融合蛋白質として発現するために
は、ベクター由来のＮ末端ペプチド遺伝子とその下流に
位置する外来の構造遺伝子の読み取り枠が一致しなけれ
ばならない、そこで、ペプチド遺伝子と外来構造遺伝子
の連結に、長さが−塩基対ずつ異なる３種のリンカ−を
用いれば、このうちいずれか一つに読み取り枠の合致し
た融合遺伝子が生じ、融合蛋白質として発現が行われる
。Here, in order for the fusion gene to be expressed as a fusion protein, the reading frames of the vector-derived N-terminal peptide gene and the foreign structural gene located downstream must match. If three types of linkers differing in length by -base pair are used for linking, a fusion gene whose reading frame matches one of the linkers will be generated, and expression will be carried out as a fusion protein.
さらに、遺伝子組み換え技術の宿主としては、特に構造
蛋白質をその中で発現する宿主としては、従来、主とし
て大腸菌が使用されていた。しかし、枯草菌等のバチル
ス属の細菌は、生産した蛋白質の細胞外への分泌能や高
温環境における成育能力等がすぐれているので、枯草菌
等のバチルス属の細菌は融合蛋白質を代表する融合遺伝
子をその中に移入しその中で増殖させる宿主に適する。Furthermore, Escherichia coli has conventionally been mainly used as a host for genetic recombination technology, especially as a host in which structural proteins are expressed. However, since bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis have excellent ability to secrete the proteins they produce to the outside of cells and to grow in high-temperature environments, bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus Suitable for hosts into which genes are transferred and propagated.
そこで、枯草菌等のバチルス属の細菌は、遺伝子組み換
え技術の宿主として、特に構造蛋白質をその中で発現す
る宿主として、近時注目を集めており、か−る枯草菌等
のバチルス属の細菌を宿主として機能する融合遺伝子発
現ベクターの開発は産業上極めて有用である。Therefore, bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis have recently attracted attention as hosts for genetic recombination technology, especially as hosts for expressing structural proteins. The development of fusion gene expression vectors that function as hosts is extremely useful industrially.
ヤクルト本社が開発し市販している複合プラスミドｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫは、大腸菌−枯草菌のシャトルベクター
として機能し、大腸菌の中においても枯草菌の中におい
ても、融合蛋白質を代表する融合遺伝子の運搬媒体とし
て機能しうろことは知られており、組み換えＤＮＡたる
外来の融合蛋白質を代表する融合遺伝子を、大腸菌と枯
草菌に属する任意の細菌内に保持し増殖する機能を有す
ることは知られているが、か−る融合蛋白質を代表する
融合遺伝子を、宿主細閑中で発現する機能は有しない。Complex plasmid pH developed and commercially available by Yakult Honsha
Y300PLK is known to function as a shuttle vector between Escherichia coli and Bacillus subtilis, and to function as a transport vehicle for the fusion gene representing the fusion protein in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. It is known that a fusion gene representing a foreign fusion protein can be retained and propagated in any bacteria belonging to Escherichia coli and Bacillus subtilis. It does not have the functions that occur in quiet environments.
本発明の目的は、上記の融合蛋白質を代表する融合遺伝
子を大腸菌と枯草菌に属する任意の細菌内に保持し増殖
する機能を有する複合プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫに
形質発現機能を付加し、融合蛋白質を代表する融合遺伝
子を大腸菌と枯草菌に属する任意の細菌内に保持し増殖
する機能を有し、さらに、この融合蛋白質を大腸菌と枯
草菌に属する任意の細菌内で発現する機能を存する融合
遺伝子発現ベクターを提供することにある。The purpose of the present invention is to add a trait expression function to the composite plasmid pHY300PLK, which has the function of retaining and propagating a fusion gene representing the above-mentioned fusion protein in any bacteria belonging to Escherichia coli and Bacillus subtilis. A fusion gene expression vector that has the function of retaining and propagating the fusion gene in any bacteria belonging to E. coli and Bacillus subtilis, and further has the function of expressing this fusion protein in any bacteria belonging to E. coli and Bacillus subtilis. It is about providing.
上記の目的を達成するために本発明が採った手段は、枯
草菌用ベクターとして広く知られている、黄色ブドウ球
菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０を、制限酵素Ａｖａｌ
ｌをもって切断し、その切断末端を７４ＤＮＡポリメラ
ーゼをもって処理して末端を修復し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを使用して長さの異なる３種のＨｉｎｄＩＩＩリンカ
ー（８塩基対、１０塩基対、１２塩基対のＨｉｎｄＩＩ
Ｉリンカー）を連結し、制限酵素Ｈ１ｎｄｎｌとＨａｅ
Ｉ［Ｉをもって切断して、カナマイシン耐性遺伝子のプ
ロモーターを含み１７０塩基対よりなるＤＮＡ断片のＡ
…■部位に３種の長さの異なるＨｉｎｄｌ［１リンカ−
の一部が残留している３種のＤＮＡ断片を得、次に、大
腸菌−枯草菌のシャトルベクターとして知られている、
ストレプトコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα
１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、エシェリ
シア・コリのベクターｐＡｃＹｃ１７７由来のアンピシ
リン耐性遺伝子領域と、前記プラスミドｐＡＭα１由来
の複製開始領域と、前記ベクターｐＡＣＹＣ１７７由来
の複製開始領域とを有する複合プラスミドｐＨＹ３００
ＰＬＫを制限酵素共１ｎｄＩＩＩとＳｍａｌとをもって
切断し、末端の脱リン酸化をなした後、ここに、上記３
種のＤＮＡ断片を連結して、３種の異なる融合遺伝子発
現ベクターを製造したことにある。この融合遺伝子発現
ベクターは、大腸菌の中においても枯草菌の中において
も、また、バチルスステアロサーモフィラス（中等度好
熱菌）の中においても、外来の融合蛋白質を代表する融
合遺伝子を発現しうる。The means taken by the present invention to achieve the above-mentioned object is to transform the Staphylococcus aureus-derived plasmid pUB110, which is widely known as a vector for Bacillus subtilis, into a vector using the restriction enzyme Aval.
The cut ends were treated with 74 DNA polymerase to repair the ends, and T4 DNA ligase was used to create HindIII linkers of three different lengths (8 base pairs, 10 base pairs, and 12 base pairs).
I linker) and restriction enzymes H1ndnl and Hae
A of the DNA fragment containing the promoter of the kanamycin resistance gene and consisting of 170 base pairs is obtained by cutting with I[I.
...■ Three types of Hindl [1 linker] with different lengths are available at the site.
We obtained three types of DNA fragments in which a portion of
Streptococcus faecalis plasmid pAMα
A composite plasmid pHY300 having a tetracycline resistance gene region derived from E. coli vector pAcYc177, a replication initiation region derived from the plasmid pAMα1, and a replication initiation region derived from the vector pACYC177.
After cutting PLK with restriction enzymes 1ndIII and Smal and dephosphorylating the terminal, the above 3
Three different types of fusion gene expression vectors were produced by ligating the DNA fragments of each species. This fusion gene expression vector expresses a fusion gene representing a foreign fusion protein in E. coli, Bacillus subtilis, and Bacillus stearothermophilus (moderate thermophile). I can do it.
上記３種の長さの異なるＨｉｎｄＩ［［リンカ−は、そ
れぞれ、８塩基対、ｌＯ塩基対、１２塩基対であり、上
記のＤＮＡ断片に残留する３種の長さの異なるＨｉｎｄ
Ｉ［ｌリンカ−の一部は４塩基対、５塩基対、または、
６塩基対である。その結果、上記３種の遺伝子発現ベク
ターのいづれか一つを用いることによって任意の遺伝子
が融合蛋白質として読み取られることができる。The above three types of HindI[[linkers are 8 base pairs, 10 base pairs, and 12 base pairs, respectively, and the three different lengths of HindI [[linkers] are 8 base pairs, 10 base pairs, and 12 base pairs, respectively.
I [I part of the linker is 4 base pairs, 5 base pairs, or
It is 6 base pairs. As a result, any gene can be read as a fusion protein by using any one of the above three types of gene expression vectors.
本発明に係る融合遺伝子発現ベクターは、ストレプトコ
ッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由来のテト
ラサイクリン耐性遺伝子領域と、エシェリシア・コリの
ベクターｐＡｃＹｃ１７７由来のアンピシリン耐性遺伝
子領域と、上記プラスミドｐＡＭα１由来の複製開始領
域と、上記ベクターｐＡＣＹＣ１７７由来の複製開始領
域を有するので、大腸菌−枯草菌のシャトルベクターと
しての機能を有し、これに加えて、黄色ブドウ球菌のプ
ラスミドｐＵＢ１１０由来のカナマイシン耐性遺伝子プ
ロモーター及びカナマイシンヌクレオチジルトランスフ
エラーゼのＮ末端部を有するので、外来の融合蛋白質を
代表する融合遺伝子を、大腸菌の中においても枯草菌の
中においてもまたバチルスステアロサーモフィラス（中
等度好熱菌）の中においても発現する機能を有する。し
かも、黄色ブドウ球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由来の
カナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片の末端には、
４塩基対、５塩基対、６塩基対のｎｄＤ１リンカ−の一
部が付されている異なる３種の融合遺伝子発現ベクター
が供給されうるので、これら３種の融合遺伝子発現ベク
ターのいずれかを用いれば、任意の外来融合蛋白質を代
表する融合遺伝子の遺伝子情報を読み取ることが出来、
任意の外来融合蛋白質を代表する融合遺伝子の融合遺伝
子発現ベクターとして機能しうる。任意の遺伝子情報の
読み取り枠がずれることがなく、任意の遺伝子情報を正
確に読み取ることが出来るからである。The fusion gene expression vector according to the present invention comprises a tetracycline resistance gene region derived from the Streptococcus faecalis plasmid pAMα1, an ampicillin resistance gene region derived from the Escherichia coli vector pAcYc177, a replication initiation region derived from the above plasmid pAMα1, and the above vector. Since it has a replication initiation region derived from pACYC177, it functions as an E. coli-Bacillus subtilis shuttle vector.In addition, it has a kanamycin resistance gene promoter derived from the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 and the N of kanamycin nucleotidyl transferase. Because it has a terminal end, it has the ability to express a fusion gene representing a foreign fusion protein in E. coli, Bacillus subtilis, and Bacillus stearothermophilus (moderate thermophile). have Moreover, at the end of the kanamycin resistance gene promoter fragment derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110,
Since three different types of fusion gene expression vectors can be supplied with portions of ndD1 linkers of 4 base pairs, 5 base pairs, and 6 base pairs, any one of these three types of fusion gene expression vectors can be used. For example, it is possible to read the genetic information of a fusion gene representing any foreign fusion protein,
It can function as a fusion gene expression vector for a fusion gene representing any foreign fusion protein. This is because the reading frame of any genetic information does not shift, and any genetic information can be read accurately.
以下、図面を参照しつ−、本発明の実施例に係る融合遺
伝子発現ベクターについて、さらに説明する。Hereinafter, fusion gene expression vectors according to Examples of the present invention will be further explained with reference to the drawings.
人゛ 云 ベクターの１６
第２図、第３図参照
その概略遺伝子地図が第２図に示され、大腸閑−枯草菌
のシャトルベクターとして機能しうる、ストレプトコッ
カス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由来のテトラ
サイクリン耐性遺伝子領域と、エシェリシア・コリのベ
クターｐＡｃＹｃ１７７由来のアンピシリン耐性遺伝子
領域と、前記プラスミドＰＡＭαｌ由来の複製開始領域
と、前記ベクターｐＡｃＹｃ１７７由来の複製開始領域
とを有する複合プラスミドｐＨＹ３００’ＰＬＫを制限
酵素ＨｉｎｄＩ［［と５μｍとをもって切断し、ホスフ
ァターゼを使用して末端の脱リン酸化をなして、概略遺
伝子地図を第３図に示す遺伝子断片を製造する。16 of human vectors See Figures 2 and 3. Its schematic genetic map is shown in Figure 2, and the tetracycline resistance gene derived from Streptococcus faecalis plasmid pAMα1 can function as a shuttle vector for Bacillus subtilis. A composite plasmid pHY300'PLK, which has an ampicillin resistance gene region derived from the Escherichia coli vector pAcYc177, a replication initiation region derived from the plasmid PAMαl, and a replication initiation region derived from the vector pAcYc177, was digested with the restriction enzyme HindI [[ The gene fragment is cut at a length of 5 μm and the terminal is dephosphorylated using phosphatase to produce a gene fragment whose schematic genetic map is shown in FIG. 3.
第４図参照
一方、その概略遺伝子地図が第４図に示される黄色ブド
ウ球菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０を、制限酵素Ａｖ
ａＵをもって切断し、その切断末端を７４ＤＮＡポリメ
ラーゼをもって処理して末端を修復する。See Figure 4. On the other hand, plasmid pUB110 derived from Staphylococcus aureus, the schematic genetic map of which is shown in Figure 4, was injected with the restriction enzyme Av
It is cut with aU and the cut end is treated with 74 DNA polymerase to repair the end.
ここで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、プロモータの
末端に、長さが、それぞれ、８塩基対、１０塩基対、１
２塩基対であり３種の異なる長さの基１ｎｄｌｎリンカ
−を連結して、その概略遺伝子地図が第５図に示される
プラスミドを製造する。Here, using T4 DNA ligase, the lengths of 8 base pairs, 10 base pairs, and 1 base pair, respectively, were added to the end of the promoter.
A plasmid, the schematic genetic map of which is shown in FIG. 5, is produced by ligating two base pair 1ndln linkers of three different lengths.
第６図参照
このプラスミドを、制限酵素且１ｎｄｌと且ａｅｍをも
って切断して、第６図にその概略遺伝子地図が示される
、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターを含み１７０
塩基対よりなるＤＮＡ断片のへ■■部位に３種の長さの
異なるＨｉｎｄＩ［Ｉリンカ−の一部が残留している、
長さの異なる３種のＤＮＡ断片を製造する。See Figure 6. This plasmid was cut with the restriction enzymes 1ndl and aem to contain the promoter of the kanamycin resistance gene, the schematic genetic map of which is shown in Figure 6.
A portion of the HindI linker of three different lengths remains at the site of the DNA fragment consisting of base pairs.
Three types of DNA fragments with different lengths are produced.
このＤＮＡ断片は、カナマイシン耐性遺伝子のプロモー
ター及びカナマイシンヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ遺伝子のＮ末端部を有するので、プロモーターとして
機能することは言うまでもないが、その末端には、長さ
が、４塩基対、５塩基対、６塩基対と長さの異にするＨ
ｉｎｄＩ［Ｉリンカ−の一部が付された３種類が供給さ
れるので、いかなる、塩基対数の末端が連結されてもこ
のうちの一つは遺伝子の読み込み枠が合致する。This DNA fragment has the promoter of the kanamycin resistance gene and the N-terminus of the kanamycin nucleotidyl transferase gene, so it goes without saying that it functions as a promoter. , H with different lengths of 6 base pairs
Three types of indI[I linkers are provided, so no matter how many base pairs of ends are connected, the reading frame of one of the genes will match.
第１図参照
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、上記の遺伝子断片と上
記の長さの異なる３種のＤＮＡ断片のそれぞれを連結し
て、その概略遺伝子地図を第１図に図示する融合遺伝子
発現ベクターを製造する。Refer to Figure 1.Using T4 DNA ligase, the above gene fragment and each of the above three types of DNA fragments of different lengths are ligated to create a fusion gene expression vector whose schematic genetic map is shown in Figure 1. Manufacture.
以上の工程をもって製造されたプラスミドには、ストレ
プトコッカス・フェカリスのプラスミドｐＡＭα１由来
のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、エシェリシア・
コリのベクターｐＡｃＹｃ１７７由来のアンピシリン耐
性遺伝子領域と、上記プラスミドＰＡＭα１由来の複製
開始領域と、上記ベクターｐＡｃＹｃ１７７由来の複製
開始領域とが含まれているから、大腸菌−枯草菌（バチ
ルスステアロサーモフィラスを含む）のシャトルベクタ
ーとして機能し、しかも、任意の融合蛋白質を、大腸菌
の中においても枯草菌の中においてもまたバチルスステ
アロサーモフィラス（中等度好熱菌）の中においても発
現することができる。The plasmid produced through the above steps contains the tetracycline resistance gene region derived from the Streptococcus faecalis plasmid pAMα1 and the Escherichia faecalis plasmid pAMα1.
The ampicillin resistance gene region derived from the E. coli vector pAcYc177, the replication initiation region derived from the above plasmid PAMα1, and the replication initiation region derived from the above vector pAcYc177 are included. ), and can express any fusion protein in E. coli, Bacillus subtilis, or Bacillus stearothermophilus (moderate thermophile). can.
四乗１旧
第７図参照
上記の工程をもって製造した融合遺伝子発現ベクターを
制限酵素Ｈｉｎｄｎｌをもって切断してＤＮＡ断片を製
造する。The fusion gene expression vector produced by the above steps is cut with the restriction enzyme Hindnl to produce a DNA fragment.
第８図参照
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、上記のＤＮＡ断片に、
大腸菌のＴｎ９由来クロラムフェニコール耐性遺伝子Ｅ
、ｃｏｌｉ ＣＡＴを連結する。Using T4 DNA ligase (see Figure 8), add the above DNA fragment to
E. coli Tn9-derived chloramphenicol resistance gene E
, coli CAT.
これを、大腸菌に導入し、上記のベクターが導入された
大腸菌を増殖させたところ、この大腸菌は、例外なく、
クロラムフェニコールに耐性であった。When this was introduced into E. coli and the E. coli into which the above vector had been introduced was grown, the E. coli, without exception,
It was resistant to chloramphenicol.
一方、上記のベクターを枯草菌に導入したところ、少な
くとも１２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を使用した
ベクターが導入された枯草菌はクロラムフェニコール耐
性を示した。On the other hand, when the above vector was introduced into Bacillus subtilis, the Bacillus subtilis introduced with the vector using a HindIII linker of at least 12 base pairs showed resistance to chloramphenicol.
（発明の効果〕
以上説明せるとおり、本発明に係る融合遺伝子発現ベク
ターは、ストレプトコッカス・フェカリスのプラスミド
ｐＡＭα１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、
エシェリシア・コリのベクターｐＡＣＹＣ１７７由来の
アンピシリン耐性遺伝子領域と、上記プラスミドＰＡＭ
α１由来の複製開始領域と、上記ベクターｐＡｃＹｃ１
？？由来の複製開始領域と、黄色ブドウ球菌のプラスミ
ドρＵＢＩＩＯ由来のカナマイシン耐性遺伝子プロモー
ターとを有するので、任意の外来融合蛋白質を代表する
融合遺伝子を、大腸菌の中にも枯草菌の中にもまたバチ
ルスステアロサーモフィラス（中等度好熱菌）の中にも
導入することができ、この任意の融合蛋白質を、大腸菌
の中においても枯草菌の中においてもまたバチルスステ
アロサーモフィラス（中等度好熱菌）の中においても発
現することができる。(Effects of the Invention) As explained above, the fusion gene expression vector according to the present invention has a tetracycline resistance gene region derived from Streptococcus faecalis plasmid pAMα1,
Ampicillin resistance gene region derived from Escherichia coli vector pACYC177 and the above plasmid PAM
Replication initiation region derived from α1 and the above vector pAcYc1
? ? plasmid ρUBIIO from Staphylococcus aureus, and a kanamycin resistance gene promoter derived from the Staphylococcus aureus plasmid ρUBIIO, it is possible to carry out a fusion gene representing any foreign fusion protein in either E. coli or Bacillus subtilis. This optional fusion protein can be introduced into Bacillus stearothermophilus (moderately thermophilic bacteria), and this optional fusion protein can be introduced into Bacillus stearothermophilus (moderately thermophilic bacteria) as well as in E. coli and Bacillus subtilis. It can also be expressed in F. fever bacteria.
しかも、黄色ブドウ球菌のプラスミドＴＩＵＢＩｌＯ由
来のカナマイシン耐性遺伝子プロモーター断片には、（
３ｎ＋ｌ）塩基対、（３ｎ＋２）塩基対、３ｎ塩基対の
Ｈｉｎｄｌ［［リンカ−の一部が付されているので、こ
れら３種のベクターのいづれかは、いかなる塩基対の外
来遺伝子でも受は入れて、遺伝子情報の読み取り枠のず
れをともなうことなく、正確に遺伝子情報の読み取りを
なすことができる。なお、本発明に係る融合遺伝子発現
ベクターは、バチルスステアロサーモフィラス（中等度
好熱菌）に対しても有効に機能するので、高温環境にお
ける組み換え遺伝子の発現が可能である。Furthermore, the kanamycin resistance gene promoter fragment derived from the Staphylococcus aureus plasmid TIUBIlO contains (
3n+l) base pairs, (3n+2) base pairs, and 3n base pairs of Hindl [[Because a portion of the linker is attached, any of these three vectors cannot accept foreign genes of any base pairs. , it is possible to accurately read genetic information without causing a shift in the reading frame of genetic information. Note that the fusion gene expression vector according to the present invention also functions effectively against Bacillus stearothermophilus (moderate thermophile), so it is possible to express the recombinant gene in a high-temperature environment.
第１図は、本発明の一実施例に係る融合遺伝子発現ベク
ターの概略遺伝子地図である。
第２図は、ｐＨＹ３００ＰＬＫの概略遺伝子地図である
。
Ｆ’１
第３図は、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ツー、！遺伝子断片の
概略遺伝子地図である。
第４図は、ｐＵＢｌｌｏの概略遺伝子地図である。
第５図は、ｐＵＢ１１０由来の遺伝子断片リンカ−を連
結したものの概略遺伝子地図である。
第６図は、プロモーターの概略遺伝子地図である。
第７図は、本発明の一実施例に係る融合遺伝子発現ベク
ターを切断して得たＤＮＡ断片の概略遺伝子地図である
。
第８図は、クロラムフェニコール耐性遺伝子Ｅ。
ｃｏｌｉ ＣＡＴが導入された本発明の一実施例に係
る融合遺伝子発現ベクターの概略遺伝子地図である。
１ｎｄ１
本発尽４
第１図
工程図
第２図
工程図
第３図
工程図
第４図
工程図
第５図
工程図
第６図FIG. 1 is a schematic genetic map of a fusion gene expression vector according to one embodiment of the present invention. FIG. 2 is a schematic genetic map of pHY300PLK. F'1 Figure 3 shows pHY300PLK, two! This is a schematic genetic map of gene fragments. FIG. 4 is a schematic genetic map of pUBllo. FIG. 5 is a schematic genetic map of the pUB110-derived gene fragment linked with linkers. FIG. 6 is a schematic genetic map of the promoter. FIG. 7 is a schematic genetic map of DNA fragments obtained by cutting the fusion gene expression vector according to one example of the present invention. Figure 8 shows chloramphenicol resistance gene E. 1 is a schematic genetic map of a fusion gene expression vector according to an example of the present invention into which E. coli CAT is introduced. 1nd1 Hontsutsu 4 Figure 1 Process diagram Figure 2 Process diagram Figure 3 Process diagram Figure 4 Process diagram Figure 5 Process diagram Figure 6
Claims (1)
ＡＭα１由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、エ
シェリシア・コリのベクターｐＡＣＹＣ１７７由来のア
ンピシリン耐性遺伝子領域と、上記プラスミドｐＡＭα
１由来の複製開始領域と、上記ベクターｐＡＣＹＣ１７
７由来の複製開始領域と、黄色ブドウ球菌のプラスミド
ｐＵＢ１１０由来のカナマイシン耐性遺伝子プロモータ
ーとを有することを特徴とする融合遺伝子発現ベクター
。 ［２］前記黄色ブドウ球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由
来のカナマイシン耐性遺伝子プロモーターには、（３ｎ
＋１）塩基対の￥Ｈｉｎ￥ｄIIIリンカーの一部が付さ
れている特許請求の範囲第１項記載の融合遺伝子発現ベ
クター。 ［３］前記黄色ブドウ球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由
来のカナマイシン耐性遺伝子プロモーターには、（３ｎ
＋２）塩基対の￥Ｈｉｎ￥ｄIIIリンカーの一部が付さ
れている特許請求の範囲第１項記載の融合遺伝子発現ベ
クター。 ［４］前記黄色ブドウ球菌のプラスミドｐＵＢ１１０由
来のカナマイシン耐性遺伝子プロモーターには、３ｎ塩
基対の￥Ｈｉｎ￥ｄIIIリンカーの一部が付されている
特許請求の範囲第１項記載の融合遺伝子発現ベクター。[Claims] [1] Plasmid p of Streptococcus faecalis
Tetracycline resistance gene region derived from AMα1, ampicillin resistance gene region derived from Escherichia coli vector pACYC177, and the above plasmid pAMα
1-derived replication initiation region and the above vector pACYC17
1. A fusion gene expression vector comprising a replication initiation region derived from No. 7 and a kanamycin resistance gene promoter derived from Staphylococcus aureus plasmid pUB110. [2] The kanamycin resistance gene promoter derived from the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 contains (3n
+1) The fusion gene expression vector according to claim 1, wherein a portion of the base pair \Hin\dIII linker is attached. [3] The kanamycin resistance gene promoter derived from the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 contains (3n
+2) The fusion gene expression vector according to claim 1, in which a portion of the base pair \Hin\dIII linker is attached. [4] The fusion gene expression vector according to claim 1, wherein a portion of a 3n base pair \Hin\dIII linker is attached to the kanamycin resistance gene promoter derived from the Staphylococcus aureus plasmid pUB110.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62125136A JPS63291585A (en) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Fused gene expression vector |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62125136A JPS63291585A (en) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Fused gene expression vector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63291585A true JPS63291585A (en) | 1988-11-29 |
Family
ID=14902751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62125136A Pending JPS63291585A (en) | 1987-05-22 | 1987-05-22 | Fused gene expression vector |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63291585A (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55111789A (en) * | 1978-11-13 | 1980-08-28 | Pasteur Institut | Vector suitable for inserting extrinsic dna segment corresponding to any possible translation stage into genom and producing means |
| JPS59135891A (en) * | 1983-01-24 | 1984-08-04 | Yakult Honsha Co Ltd | Complex plasmid |
| JPS60248184A (en) * | 1984-05-24 | 1985-12-07 | Yakult Honsha Co Ltd | Composite plasmid vector |
-
1987
- 1987-05-22 JP JP62125136A patent/JPS63291585A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55111789A (en) * | 1978-11-13 | 1980-08-28 | Pasteur Institut | Vector suitable for inserting extrinsic dna segment corresponding to any possible translation stage into genom and producing means |
| JPS59135891A (en) * | 1983-01-24 | 1984-08-04 | Yakult Honsha Co Ltd | Complex plasmid |
| JPS60248184A (en) * | 1984-05-24 | 1985-12-07 | Yakult Honsha Co Ltd | Composite plasmid vector |
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