JPS63246659A - 高速液体クロマトグラフによるカルボニル基含有有機成分の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮呈上勿肌■光国 本発明は、アセトイン、アセトアルデヒド、ジアセチル
のようなカルボニル基含有の有機成分を、高速液体クロ
マトグラフ（以下ＨＰＬＣと略記する）を用いて迅速か
つ高感度で定量する方法に関し、特に、発酵食品中のフ
レーバーの定量に有効に利用される。

ｌ米辣歪 発酵バター、発酵マーガリン、ヨーグルト、チーズ及び
ワイン等に特有な香気成分であるアセトイン、アセトア
ルデヒド、ジアセチル等は、これら発酵食品の熟成度の
判定上重要であることから、その正確かつ迅速な測定が
望まれる。

従来、これら香気成分（フレーバー）の定量には、ガス
クロマトグラフ（ＧＬＣ）を用い、アセトアルデヒド及
びジアセチルでは蒸留法により、アセトインでは酸化蒸
留法又は溶剤抽出法による分析が行われていた。

しかし、上記ＧＬＣを用いた分析では、アセトアルデヒ
ドとジアセチルについては満足的すべき回収率（８０〜
９０％）で分析し得るものの、アセトインについては酸
化反応（アセトイン−ジアセチル）もしくは溶剤抽出の
効率が一定せず、かつこれらの処理に時間を要し、加う
るに回収率も５０％程度であるため分析法としては問題
がある。また、この従来法では上記の各フレーバー成分
を同時的に定量することも不可能である。

発１）が”決しようとする課題 本発明は、発酵食品の上記フレーバーの分析法における
叙上の問題点に鑑みなされたものであって、これらのフ
レーバー成分、さらにはカルボニル基を含有する各有機
成分を、ＨＰＬＣによる分析法を利用して比較的簡易な
処理で、しかも高い精度で迅速に定量することができ、
特に、アセトアルデヒド、アセトイン及びジアセチルの
発酵フレーバーについてはこれら３成分を同時的に分析
し得る定量法を提供することを課題とする。因に、従来
、ＨＰＬＣを用いて上記発酵フレーバーを分析すること
について報告はみられない。

以下本発明の詳細な説明する。

光所■盗底 本発明の特徴は、カルボニル基含有の有機成分の試料を
メタノールで抽出処理して得られる供試溶液を２．４−
ジニトロフェニルヒドラジンをアニリンを添加した塩酸
とメタノールの混合液に溶解して成る反応液と混合して
２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃に反応させた後
、得られた反応混合液を高速液体クロマトグラフに付し
て上記有機成分を分析することにある。

課　を　°するための 本発明者は、発酵食品の上記フレーバー成分であるアセ
トイン、アセトアルデヒド及びジアセチルのいずれもカ
ルボニル基を有しており、該カルボニル基を可視ラベル
化することにより高感度で微量定量が可能であるとの想
定のもとに、カルボニル基のラベル化剤として知られて
いる２、４−ジニトロフェニルヒドラジン（以下ＤＮＰ
Ｈと略記する）に着目し、このＤＮＰＨから成る反応液
を用いたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分析を検討した。従来、
ＤＮＰＨによるラベル化反応については、脂肪族アルデ
ヒド含有試料にＤＮＰＨ，メタノール及びｌトＨＣＩを
加えて４０℃で１０分間反応させる方法が報告されてい
ることから、本発明者は、当初ＤＮＰＨ５０ｍｇ、　Ｈ
ＣＩ　２０ｍｊ！をメタノールに溶解して１００ａ＋　
１にした液を反応液として用いてＨＰＬＣによる分析を
試みた。しかし、上述のごとき従来のラベル化反応に用
いられている反応液は、標準液による繰返し精度の試験
では２．４−ジニトロフェニルヒドラジンの析出により
アセトインの場合ではＣＶ値が６．１％、ジアセチルの
場合には５．４％であって、ＣＶ値が５％を越えるため
本発明では使用できないことがわかった。

したがって、この反応液についてさらに検討を進めた結
果、反応液にアニリンの適量を加えることによって２．
４−ジニトロフェニルヒドラジンの析出を防ぎ、標準液
による上記ＣＶ値の低い反応液を調整でき、本発明では
このアニリンを添加した反応液を用いるこ、とにより、
上記発酵フレーバー成分をＨＰＬＣにより効率的に分析
することに成功した。

本発明で用いる反応液は、上述のように、ＤＮＰＨと７
ニリン及び塩酸をメタノールに溶解して成るが、液中ア
ニリンが２０％含有されるものが好ましい。例えば、Ｄ
ＮＰＨ５０ｍｇ、アニリン２０ｍ　ｊ！及びＨＣＩ　１
０ｍｊ！をメタノールに溶解して１００ｍ　ｌにしたも
のが反応液として好適である。因に、上記アニリンの量
が１０％では、反応により生成するＤＮＰＨ誘導体の析
出を十分に防止できない。

次に、上記配合により調整した反応液について標準液に
よる繰返し精度を試験した結果を示す。

標準液の調整： アセトイン、アセトアルデヒド及びジアセチルの各６．
０μｇ　／　ｔａ　１）を８０％メタノール液に溶解し
て得た。

試験方法： 上記標準液１．０＋ｗＮに上記配合の反応液１．０ｍｊ
！を添加、混合し、２５〜３５℃に６０分間反応させた
後ＨＰＬＣへ注入した。

試験結果： 下記表１に示すとおりである。

表１ 表１にみられるとおり、アセトイン、アセトアルデヒド
及びジアセチルのいずれもＣｖ値が１％　　１前後であ
って、満足すべき結果が得られる。　　　　　・本発明
において、上記反応液を用いて、実際に　　１発酵食品
のフレーバーを分析するには、各発酵素　　１品の試料
について次のような前処理を行って試験　　＝溶液を調
整し、得られた試験溶液を等量の反応液と混合し、２５
〜３５℃に反応させた後、ＨＰ　Ｌ　Ｃへ注入して分析
を行う。

試験溶液の調整： ヨーグルト、ワイン等の発酵食品試料の混合は、　　１
その各ｌｏｇを遠沈管に採取し、メタノールで５０ＩＩ
ｌに定容し、振とうした後、遠心分離し、その上清を濾
過して試験溶液とする。

゛また、マーガリン、バター等の油脂系発酵食品試料の
場合は、その各５ｇを遠沈管に採取し、４０℃に溶解し
た後８０％メタノール３５ｍ　ｌｔ及び１５ｍ　ｌｔで
２回抽出して５０＊　ｊ！に定容し、ついで濾過して試
験溶液とする。

試験溶液と反応液との反応は例えば２７〜２８℃で勺６
０分程皮丘うとよい、アニリンを２０％含有させ；反応
液を用いた場合では、アセトアルデヒドで吋時に、アセ
トインで２０分、ジアセチルで６０分でｉ応はそれぞれ
一定となることから反応時間は６０十程度が好ましい。

反応により生成した反応混合液を注入してＨＰしＣによ
る分析を行うのに用いるカラムとしては、一般に汎用さ
れている逆相分配系のＯＤＳ　Ｏ１８がよく、例えばＴ
ＳＫ　ｇｅｌ　００５−８０７Ｍが適しており、そり他
にＮｕｃｌｅ　Ｏ３：１５Ｃ１Ｂ、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　
ＱＤＳ　５、ＴｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ　５．５ｐｈｅｒ
ｉｓｅｒｂ　０ＤＳ−２５も用いられる。なお、これら
のうち、標準液と試料についてクロマトグラムを得たが
ＴＳＫ　ｇｅｌ　００５−８０７Ｍが最も優れていｔ。

移動相としては水−メタノール系、水−アセトニトリル
系が一般的であるが水−メタノール系で：ま圧力が高く
なり、また、ピークにテーリングが１２められることか
ら、水−アセトニトリル系を用いた。これらの比率を変
え、３成分の分離をみたところ、アセトニトリル：水＝
１；１という組成が適当であり、満足的なりロマトグラ
ムが得られる。

以上述べたとおり、本発明は、カルボニル基のラベル化
剤である２、４−ジニトロフェニルヒドラジンを適量の
アニリンとともに塩酸、メタノールに溶解した溶液を反
応液として用いて、発酵フレーバーであるアセトイン、
アセトアルデヒド及びジアセチルのようなカルボニル基
を有する有機成分を高速液体クロマトグラフに付するこ
とにより、高い感度で迅速に定量し得るので、該有機成
分の分析上、特に各種発酵食品のフレーバー分析に有効
であり、発酵食品の熟成管理の面でも有益である。

以下に実施例を示して本発明とその効果を具体的に説明
する。

実施例１ 試験溶液の調整： ヨーグルトの１０ｇを遠沈管に採取し、これにメタノー
ルを加えて５９ｍ　ｊ！容となして振とうした後、遠心
分離（２００Ｏｒｐｍ、５分）してその上清を濾過して
試験ン容液とした。

反応液の調整： ＤＮＰ８　　５０ｍ＃ ＩＣ１）０ｍ＃ アニリン　　２０ｍｊ！ 上記配合のものにメタノールを加えて１００ｍβ容とし
た。

上記試験溶液１）Ｉｌｌと反応液１ＩＩＩ！！を混合し
、約２７〜２８℃に６０分間反応させた後、得られた混
合反応液をＨＰＬＣへ下記条件で注入した。

なお、ＨＰＬＣのカラムにはＴＳＫ　ｇｅｌ　ＯＤＳ−
８０７Ｍ（２５０Ｘ４．６）を用い、アセトニトリル：
水＝１：１を移動相とした。

ＨＰＬＣ条件： 流ｆｌ　　　　　　　　１．ＯｍＪ／ｌｌ１ｉｎカラム
温度　　　　５０　　℃ 注入管　　　　　　１５　　μｌ 波長　　　　　　　３６５　　ｎｔａ レンジ　　　　　Ｘ　０．１６ チャートスピード　０．５　ｃｍ／ｎ＋ｉｎまた、検出
器には日本分光社製ＵＶＩＤＥＣ１ｏＯｎＷを、ポンプ
には日本分光社製ツインクルをそれぞれ用いた。

なお、標準溶液としてアセトイン、アセトアルデヒド及
びジアセチルの各６．０μｇ／…ｌの割合で８０％メタ
ノールに熔解した溶液を用い、上記同様の手順で反応さ
せたものをＨＰＬＣへ注入して分析した。

上記ＨＰ　Ｌ　Ｃにより得られたクロマトグラムを添付
の第１図及び第２図にそれぞれ示す。

第１図は標準溶液のクロマトグラムを、第２図はヨーグ
ルトのクロマトグラムをそれぞれ示す。

図中のＡＣはアセトイン、ＡＡはアセトアルデヒド及び
ＤＡはジアセチルを表わす。

次に添加回収試験を行った結果を示す。

試料の調整： ヨーグルトにアセトイン、アセトアルデヒド及びジアセ
チルをそれぞれ１（１０ｇｇ／Ｌｏｇ及び３００Ｍｇ／
１０ｇづつ添加したものを試料とした。

試験溶液の調整： 上記により調整した試料１０ｇを遠沈管に採取し、これ
にメタノールを加えて５０ｍ　Ａ容となして振とう後、
遠心分離（２００Ｏｒ、ｐ、ｓ＋、、５分間）し、その
上清を濾過して試験溶液とした。

試験方法： 上記の試験溶液１ｙａｌと、実施例１で用いたと同様の
反応液１ｌ１）とを混合し、３５℃で６０分間反応させ
、得られた混合反応液を実施例１に記載したと同様の手
順でＨＰＬＣへ注入して分析を行った。

上記によりヨーグルトを添加回収試験を行った結果は表
２に示すとおりである。

表２ ＊ベースのフレーバー成分量は上記ヨーグルト中に含ま
れていた値を示す。

実施例２ 市販のマーガリンの５ｇを遠沈管に採取し、これを４０
℃に加温して溶解したものを、８０％メタノール３５ｍ
１及び１５＋ｗ　ｊ！で２回抽出した後、該メタノール
で５０ｍ　ｌ容となし、次いで濾過して試験溶液とした
。

この試験溶液ｌＩｌ＋１と実施例１で用いたと同様の反
応液１ｍｅを混合し、２５〜３５℃に６０分間反応させ
、得られた混合反応液を実施例１に記載したと同様の手
順でＨＰＬＣへ注入して分析した。

次に、添加回収試験を行った結果を示す。

添加回収試験 試料の調整： マーガリンにアセトイン、アセトアルデヒド、ジアセチ
ルを各々１００μｇ１５ｇ添加したものを試料とした。

試験溶液の調整： 上記により調整した試料５ｇを遠沈管に採取し、これを
４０℃に加温して溶解したものを８０％メタノールで３
５ｍ　ｊ！　、　１５ｍ　ｌで２回抽出した後、該メタ
ノールで５抛ｌ容となし、次いで濾過して試験溶液とし
た。

この試験溶液１ｍｊ！を実施例１で用いたと同様の反応
液１−１と混合し、３５℃の温度下に６０分間反応させ
、得られた混合反応液を実施例１に記載したと同様の手
順でＨＰＬＣへ注入して分析した。

上記によりマーガリンの添加回収試験を行った結果を示
すと表３のとおりである。

表３ （単位　μｇ） ＊ベースのフレーバー成分は上記マーガリン中に含まれ
ていた値を示す。

実施例３ 本例は本発明による分析法の繰返し精度をワインとマー
ガリンの各試料について試験した結果を示したものであ
る。

試験方法： 試験溶液の調整： ■ワイン ワインｌＯｇを採取し、メタノールで５０＋＋＋　ｊ！
容に定容し、濾過後試験溶液とする。

■マーガリン マーガリン５ｇを遠沈管に採取し、これを４０℃に加温
して溶解したものを８０％メタノールで３５＋ｓ　１．
１５ｍ　ｌづつで２回抽出した後、該メタノールで５０
ｍ　ｌ容となし、次いで濾過して試験溶液とした。

上記試験溶液１ｍ＃と反応液ｂｗｊｔを混合し３５℃の
温度下に６０分間反応させた後、得られた混合反応液を
実施例１に記載したと同様の手順でＨＰＬＣへ注入して
分析した。

ワイン及びマーガリンの同一試料について各々８回づづ
上記手順で分析し、本試験法の繰返し精度を求めた。

結果は表４に示すとおりである。

表４ 単位（μｇ／ｇ） （注）ＡＣ・・−・−・−・−アセトインＡＡ・−・−
・−・・・−アセトアルデヒドＤＡ−・・−・・−・−
・ジアセチル をそれぞれ示す。

実施例４ 本例は本発明によりＨＰＬＣを用いた分析法と従来のガ
スクロマトグラフ（ＧＬＣ法）を用いた分析法を対比し
た結果を示したものである。

試験方法： 試料としてヨーグルトを用い、ＨＰＬＣ法は実施例１の
手順に従って行い、ガスクロマトグラフ（ＧＬＣ法）は
下記に示す方法により分析した。

ＧＬＣ分析法： ■アセトアルデヒド、ジアセチルの分析ヨーグルト５０
ｇに水２０Ｉ１）１を加え、Ｎｔガスを通しながら、水
蒸気蒸留を行い、留液は予め氷水中で冷却した受器に８
ｍｊｌ補集した。水で１０ｍｊ！にし、ＧＬＣ用試験溶
液とした。

■アセトインの分析（溶剤抽出法） ヨーグルト５ｇを遠沈管に採取し、クロロホルム：メタ
ノール（１：　１）混合溶液５ｍｌ！を加え、遠心分離
（３０００，ｐ、ｍ、　、２０分）して得られた上滑を
ＧＬＣ用試験溶液とした。

結果は表５に示すとおりである。

【図面の簡単な説明】

添付の第１図及び第２図は、実施例１による分析結果を
それぞれ示したものであって、第１図は標準溶液のクロ
マトグラムを、第２図はヨーグルトのクロマトグラムを
示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）カルボニル基を含有する有機成分の試料をメタノ
   ールで抽出処理して得られる供試溶液を、２，４−ジニ
   トロフェニルヒドラジンをアニリンを添加した塩酸とメ
   タノールの混合液に溶解して成る反応液と混合して反応
   させた後、得られた反応混合液を、高速液体クロマトグ
   ラフに付して分析することを特徴とするカルボニル基を
   含有する有機成分の定量法。
2. （２）カルボニル基を含有する有機成分が、アセトイン
   、アセトアルデヒド及びジアセチルから成る発酵食品の
   フレーバー成分である特許請求の範囲第（１）項記載の
   定量法。
3. （３）上記反応を２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５
   ℃で約３０〜９０分間行う特許請求の範囲第（１）項記
   載の定量法。
4. （４）上記反応液はアニリンを１０〜５０％、好ましく
   は１５〜３０％含有するものである特許請求の範囲第（
   １）項記載の定量法。