JPS63233362A - 分取用電気泳動方法 - Google Patents
分取用電気泳動方法Info
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- JPS63233362A JPS63233362A JP62066922A JP6692287A JPS63233362A JP S63233362 A JPS63233362 A JP S63233362A JP 62066922 A JP62066922 A JP 62066922A JP 6692287 A JP6692287 A JP 6692287A JP S63233362 A JPS63233362 A JP S63233362A
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ＬｌＬ立皿ユ１１
本発明は、核酸、蛋白質等の生体成分を比較的大めに分
離、調製し得る分取用電気泳動方法及びその装置に関す
る。
離、調製し得る分取用電気泳動方法及びその装置に関す
る。
来の技 とその
近年、遺伝子工学の発展によって、微生物や培養細胞系
内で、核酸、蛋白質等の多くの有用物質が生産できるよ
うになった。電気泳動法は、このような微量な有用物質
を同定する上で、欠くことのできない分析法であり、特
に、遺伝子組換え体を開発する時に、重要な役割を演じ
ている。従来の電気泳動法は、ゲル平板の端に井戸を設
け、試料溶液を充填し、該平板面に平行に電流を流し、
成分を平板上に展開することを基本としている。
内で、核酸、蛋白質等の多くの有用物質が生産できるよ
うになった。電気泳動法は、このような微量な有用物質
を同定する上で、欠くことのできない分析法であり、特
に、遺伝子組換え体を開発する時に、重要な役割を演じ
ている。従来の電気泳動法は、ゲル平板の端に井戸を設
け、試料溶液を充填し、該平板面に平行に電流を流し、
成分を平板上に展開することを基本としている。
しかし、この方法では、井戸に充填できる僅かな量の試
料しか分離できず、実際上分析用としてしか使用できな
かった。この場合、分離する試料の量を増加させるには
、１）ゲル平板の厚みを増加させる、２）井戸の深さを
増加させる等の方法が考えられる。しかしながら、１）
の方法では、発熱が著るしくなり、ゲルが溶けたり、対
流が激しくなり、分離能が著るしく低下してしまう。ま
た、２）の方法では、試料の】的拡大に限界がある。
料しか分離できず、実際上分析用としてしか使用できな
かった。この場合、分離する試料の量を増加させるには
、１）ゲル平板の厚みを増加させる、２）井戸の深さを
増加させる等の方法が考えられる。しかしながら、１）
の方法では、発熱が著るしくなり、ゲルが溶けたり、対
流が激しくなり、分離能が著るしく低下してしまう。ま
た、２）の方法では、試料の】的拡大に限界がある。
間 、を解決するための手段
本発明者は、上記従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を
重ねた結果、１）試料を含む薄層ゲルを、電気泳動用平
板ゲルに重層すること、並びに２）通電方向を、該平板
ゲルの面に対して垂直とすることによって、その分離能
を著るしく損なうことなく、従来の電気泳動法に比べ、
比較的犬山の試料を極めて容易に分離できることを見い
出し、ここに本発明を完成した。
重ねた結果、１）試料を含む薄層ゲルを、電気泳動用平
板ゲルに重層すること、並びに２）通電方向を、該平板
ゲルの面に対して垂直とすることによって、その分離能
を著るしく損なうことなく、従来の電気泳動法に比べ、
比較的犬山の試料を極めて容易に分離できることを見い
出し、ここに本発明を完成した。
即ち本発明は、
■電気泳動用平板ゲルに、試料を含む薄層ゲルを重層し
て重層ゲルとし、該重層ゲルの面に垂直に通ｆｆｉする
ことを特徴とする分取用電気泳動方法、並びに、 ■電気泳動用平板ゲル゛と試料を含む１１１ｍゲルとか
らなる重層ゲルの面に垂直に通電するように電極を配し
たことを特徴とする分取用電気泳動装置に係る。
て重層ゲルとし、該重層ゲルの面に垂直に通ｆｆｉする
ことを特徴とする分取用電気泳動方法、並びに、 ■電気泳動用平板ゲル゛と試料を含む１１１ｍゲルとか
らなる重層ゲルの面に垂直に通電するように電極を配し
たことを特徴とする分取用電気泳動装置に係る。
本発明では、１）試料を含む薄層ゲルを、電気泳動用平
板ゲルに重層すること、並びに２）通電方向を、該平板
ゲルの面に対して垂直とすることを必須とする。
板ゲルに重層すること、並びに２）通電方向を、該平板
ゲルの面に対して垂直とすることを必須とする。
第１図に、試料を含む薄層ゲルを、電気泳動用平板ゲル
に重層した、所謂、重層ゲルの構造を示す。ＡＦｍは、
電気泳動用ゲルであり、Ｂ層は、試料を含む薄層ゲルで
ある。Ａ層及びＢ層に使用されるゲルとしては、通常電
気泳動に使用されるものが何れも使用でき、例えば、各
種の７ガＯ−スゲル、ポリアクリルアミドゲル等を挙げ
ることができる。重層ゲルは、例えば、以下のようにし
て製造される。即ち、Ａ層のゲルを作って充分固化した
後、試料を含むゲル融液を、熱いうちにＡ層上に薄く展
開してＢｆｆとする。ＡＷｌの厚さは特に制限されない
が、通常１０〜２０ｍ＋程度とすればよい。また、Ａ層
の面積は、分離する試料の量に応じて適宜選択すればよ
いが、例えば、数１００μ９程度のプラスミドを分離す
るには、１００〜Ｘ７程度とすればよい。分Ｉｌｌ能を
更に良くするためには、ＢＦＩＪをできる限り薄くする
ことが重要であるが、例えば、プラスミドを分離する場
合には、Ａ層の１／１０Ｐｉ！度とずればよい。また、
ＢＩＷには、泳動距離をモニターして泳動時間を決定す
るために、色素等を添加してもよい。色素としては、公
知のものが使用でき、例えば、ブロムフェノールブルー
、キシレンシアツール等を挙げることができる。但し、
泳動ＦＲ１！ｌが決定された後は、上記色素は添加しな
（でもよい。
に重層した、所謂、重層ゲルの構造を示す。ＡＦｍは、
電気泳動用ゲルであり、Ｂ層は、試料を含む薄層ゲルで
ある。Ａ層及びＢ層に使用されるゲルとしては、通常電
気泳動に使用されるものが何れも使用でき、例えば、各
種の７ガＯ−スゲル、ポリアクリルアミドゲル等を挙げ
ることができる。重層ゲルは、例えば、以下のようにし
て製造される。即ち、Ａ層のゲルを作って充分固化した
後、試料を含むゲル融液を、熱いうちにＡ層上に薄く展
開してＢｆｆとする。ＡＷｌの厚さは特に制限されない
が、通常１０〜２０ｍ＋程度とすればよい。また、Ａ層
の面積は、分離する試料の量に応じて適宜選択すればよ
いが、例えば、数１００μ９程度のプラスミドを分離す
るには、１００〜Ｘ７程度とすればよい。分Ｉｌｌ能を
更に良くするためには、ＢＦＩＪをできる限り薄くする
ことが重要であるが、例えば、プラスミドを分離する場
合には、Ａ層の１／１０Ｐｉ！度とずればよい。また、
ＢＩＷには、泳動距離をモニターして泳動時間を決定す
るために、色素等を添加してもよい。色素としては、公
知のものが使用でき、例えば、ブロムフェノールブルー
、キシレンシアツール等を挙げることができる。但し、
泳動ＦＲ１！ｌが決定された後は、上記色素は添加しな
（でもよい。
上記のようにして得られる重層ゲルの面に対して垂直に
直流電流を通電することによって、試料が分離される。
直流電流を通電することによって、試料が分離される。
電流の強さは、特に制限されず、試料の種類等に応じて
適宜選択すればよい。また、電気泳動時間は、本操作と
は別に、従来の電気泳動装置を用い、予め、試料の泳動
時間とモニター用色素の泳動時間との比として決めてお
く。通電後は、外部よりモニター色素の泳動を観察し、
その時間ｌ：基づいて通電時間を決定する。このように
゛して分離された試料は、超遠心等の処理を施す必要が
なく、公知の方法に従って極めて容易に蹟製できる。
適宜選択すればよい。また、電気泳動時間は、本操作と
は別に、従来の電気泳動装置を用い、予め、試料の泳動
時間とモニター用色素の泳動時間との比として決めてお
く。通電後は、外部よりモニター色素の泳動を観察し、
その時間ｌ：基づいて通電時間を決定する。このように
゛して分離された試料は、超遠心等の処理を施す必要が
なく、公知の方法に従って極めて容易に蹟製できる。
尚本発明では、通常の電気泳動装置に使用される試薬、
電源等を何れも使用できる。
電源等を何れも使用できる。
以下本発明装置の一例を示す第２図及び第３図を参照し
つつ、本発明装置を使用して、例えば、現在遺伝子組換
え実験で需要の多い、クローニングのための大腸菌プラ
スミドと染色体ＤＮＡとを分離する場合について説明す
る。
つつ、本発明装置を使用して、例えば、現在遺伝子組換
え実験で需要の多い、クローニングのための大腸菌プラ
スミドと染色体ＤＮＡとを分離する場合について説明す
る。
第２図は、上記ゲルを使用する本発明装置である電気泳
動槽の斜面図であり、また第３図は、その平面図である
。重層ゲル（１）のＡ層は電気泳動用アガロースゲルで
あり、ＢＪＩは分離したいプラスミド−ＯＮ、１１１合
液を含む薄層アガロースゲルである。（２ンは、透明プ
ラスチック製の液槽、（３）及び（４）は、白金線′ａ
！極であり、その間に試料側が陰極となるように重層ゲ
ル（１）が立てられており、槽内は、電気泳動用緩衝液
で満たされている。（５）は、重層ゲル（１）を保持す
るためのプラスチック製ホルダーで、スポンジ（６）を
介して重層ゲル（１）を挟んでいる。重層ゲル（１）の
両側は、薄板（７）があり、この２枚の薄板（７）は、
重層ゲル（１）を固定した後は、上方へ引出して除去さ
れる。ホルダー（５）の正極側は、その外側に隔膜（８
）が貼り付けられており、重層ゲル（１）と隔膜（８）
とホルダー（５）とで囲まれている隔膜１１（９）は、
分離した試料が溶出して外に漏れることを防止している
。隔膜（８）は透析ＩＩや亀らなり、電気泳動緩衝液イ
オン、低分子イオン等は通過させるが、プラスミド、染
色体ＤＮＡ等は通さない。隔１０１１（９）は、厚さが
１〜２１１１程度であり、ここで溶出したプラスミドが
濃縮される。電流は、直流で２０〜５０Ｖ程度且つ１〜
５Ａ程度、また泳動（通電）時間は前述のようにモニタ
ー色素の泳動時間より求め、１時間程度となる。通常、
電気泳動緩衝液は冷却しなくてもよい。必要に応じて、
プラスミドが溶出し始める直前に、隔薄層！ｊ（９）の
液を、例えば、注射器で排出し、新しい液に入替え、低
分子成分を除去しておいてもよい。通電後、隔膜１１（
９）中で濃縮されたプラスミドを含む液を、例えば、注
射器等で採取する。かくして得られるプラスミド液は、
常法に従って、例えば、以下のようにして極めて容易に
精製される。即ち、エタノール沈澱の後遠心分離機にか
けて上澄液を除去し、精製することによって、充分な高
純度の１ラスミドを多量に得ることができる。従来高純
度のプラスミドを多量に分離したい時は、臭化エチジウ
ムと塩化セシウムを加えて超遠心分離機を１３万Ｇで４
〜８時間かける必要があった。本方法に易に得る事がで
きる。
動槽の斜面図であり、また第３図は、その平面図である
。重層ゲル（１）のＡ層は電気泳動用アガロースゲルで
あり、ＢＪＩは分離したいプラスミド−ＯＮ、１１１合
液を含む薄層アガロースゲルである。（２ンは、透明プ
ラスチック製の液槽、（３）及び（４）は、白金線′ａ
！極であり、その間に試料側が陰極となるように重層ゲ
ル（１）が立てられており、槽内は、電気泳動用緩衝液
で満たされている。（５）は、重層ゲル（１）を保持す
るためのプラスチック製ホルダーで、スポンジ（６）を
介して重層ゲル（１）を挟んでいる。重層ゲル（１）の
両側は、薄板（７）があり、この２枚の薄板（７）は、
重層ゲル（１）を固定した後は、上方へ引出して除去さ
れる。ホルダー（５）の正極側は、その外側に隔膜（８
）が貼り付けられており、重層ゲル（１）と隔膜（８）
とホルダー（５）とで囲まれている隔膜１１（９）は、
分離した試料が溶出して外に漏れることを防止している
。隔膜（８）は透析ＩＩや亀らなり、電気泳動緩衝液イ
オン、低分子イオン等は通過させるが、プラスミド、染
色体ＤＮＡ等は通さない。隔１０１１（９）は、厚さが
１〜２１１１程度であり、ここで溶出したプラスミドが
濃縮される。電流は、直流で２０〜５０Ｖ程度且つ１〜
５Ａ程度、また泳動（通電）時間は前述のようにモニタ
ー色素の泳動時間より求め、１時間程度となる。通常、
電気泳動緩衝液は冷却しなくてもよい。必要に応じて、
プラスミドが溶出し始める直前に、隔薄層！ｊ（９）の
液を、例えば、注射器で排出し、新しい液に入替え、低
分子成分を除去しておいてもよい。通電後、隔膜１１（
９）中で濃縮されたプラスミドを含む液を、例えば、注
射器等で採取する。かくして得られるプラスミド液は、
常法に従って、例えば、以下のようにして極めて容易に
精製される。即ち、エタノール沈澱の後遠心分離機にか
けて上澄液を除去し、精製することによって、充分な高
純度の１ラスミドを多量に得ることができる。従来高純
度のプラスミドを多量に分離したい時は、臭化エチジウ
ムと塩化セシウムを加えて超遠心分離機を１３万Ｇで４
〜８時間かける必要があった。本方法に易に得る事がで
きる。
本発明方法及び、装置は、上記で説明したプラスミドに
限定されず、蛋白質等のプラスミド以外の他の細胞成分
を分離する何れの場合にも採用でき、特に、分子ｍが充
分離れ、且つ成分数が少ない物質を分離する場合等には
、より優れた結果を得ることができる。
限定されず、蛋白質等のプラスミド以外の他の細胞成分
を分離する何れの場合にも採用でき、特に、分子ｍが充
分離れ、且つ成分数が少ない物質を分離する場合等には
、より優れた結果を得ることができる。
また、本発明方法は、泳動距離が短いので、類似した分
子量を有する物質を分離する場合には、例えば、以下の
ような方法によって分離能を高めてもよい。
子量を有する物質を分離する場合には、例えば、以下の
ような方法によって分離能を高めてもよい。
１）ゲルの種類を選択し、混合成分にｄして親和力の違
いを拡大させる。ゲルとしては、例えば、市販の各種の
アフィニティーアガロースゲル、等を用いることができ
る。
いを拡大させる。ゲルとしては、例えば、市販の各種の
アフィニティーアガロースゲル、等を用いることができ
る。
２）第２図において、隔膜層（９）側の薄板（７）の位
置にメンブレンフィルターを設ける（図示せず）。即ち
、各種メンブレンフィルターを選択することによって、
溶出成分を選択的に捕捉できる。メンブレンフィルター
としては、公知のものが何れも使用できる。
置にメンブレンフィルターを設ける（図示せず）。即ち
、各種メンブレンフィルターを選択することによって、
溶出成分を選択的に捕捉できる。メンブレンフィルター
としては、公知のものが何れも使用できる。
３）操作を多段化することによって、分離能を段層的に
向上させることができる。
向上させることができる。
ｍ江里
本発明方法は、従来高度で精密な超遠心分離機を必要と
していたプラスミド等の大量分離を、簡単な装置で迅速
に行なうことができ、且つゲルフィルター等に工夫を施
すことにより、種々の段階で分離能を調節することがで
き、極めて高い実用性を有している。例えば、本発明方
法では、１時間程度の通電で、通常必要なりローニング
」、即ち数１００μ９程度の高純度プラスミドを得るこ
とができる。
していたプラスミド等の大量分離を、簡単な装置で迅速
に行なうことができ、且つゲルフィルター等に工夫を施
すことにより、種々の段階で分離能を調節することがで
き、極めて高い実用性を有している。例えば、本発明方
法では、１時間程度の通電で、通常必要なりローニング
」、即ち数１００μ９程度の高純度プラスミドを得るこ
とができる。
衷−」Ｌ−■
以下に実施例を挙げ、本発明をより一層明瞭なものとす
る。
る。
実施例１
第２図に示す装置を用い、大腸菌Ｈ８１０１を宿主とし
、以下の様にしてプラスミドｐＢＲ３２２を染色体ＤＮ
Ａから分離した。
、以下の様にしてプラスミドｐＢＲ３２２を染色体ＤＮ
Ａから分離した。
まず、常法に従って大腸菌Ｈ８１０１培養液（３００ｍ
）から菌を集めて溶菌し、遠心機（１２０００ｒｐｍ、
ｘ３０ｍｉｎ、）ｔ’細胞壁を分離した後、フェノール
処理を施して高分子蛋白質を除去°し、エタノール沈澱
を行なった。次いでこの試料の電気泳動用緩衝溶液にブ
ロムフェノールブルー０．５重社％及び低融点アガロー
ス（Ｂｌｏ−Ｒａｄ社製、低融点アガロース）０．７％
を添加して試料融液１１１１を調製した。これを、液温
６０℃でゲル平板（ＡＩ）上に展開し、厚さが均一とな
るようにコンラージ棒で延ばし、８層とした。Ａ層のゲ
ルは、電気泳動用緩衝液（４０ｍＭトリス、２０ｍＭ酢
酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１８ｍＭＮａＣＱ ）
に１．３重量％のアガロース（ＬＯ３，宝酒造■）を添
加して製造した（長さ１０．中８．厚さ１ ａｍ ）。
）から菌を集めて溶菌し、遠心機（１２０００ｒｐｍ、
ｘ３０ｍｉｎ、）ｔ’細胞壁を分離した後、フェノール
処理を施して高分子蛋白質を除去°し、エタノール沈澱
を行なった。次いでこの試料の電気泳動用緩衝溶液にブ
ロムフェノールブルー０．５重社％及び低融点アガロー
ス（Ｂｌｏ−Ｒａｄ社製、低融点アガロース）０．７％
を添加して試料融液１１１１を調製した。これを、液温
６０℃でゲル平板（ＡＩ）上に展開し、厚さが均一とな
るようにコンラージ棒で延ばし、８層とした。Ａ層のゲ
ルは、電気泳動用緩衝液（４０ｍＭトリス、２０ｍＭ酢
酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１８ｍＭＮａＣＱ ）
に１．３重量％のアガロース（ＬＯ３，宝酒造■）を添
加して製造した（長さ１０．中８．厚さ１ ａｍ ）。
液槽（２）としては、縦１５．巾３０．高さ２０１の透
明ポリアクリル樹脂製のものを使用した。電極（３）、
（４）は、白金線であり、工種側２本及び負極側２本を
水平に配置した。隔膜（８）は、透析チューブ（ユニオ
ンカーバイド１１１７／８８８）を使用した。染色体Ｄ
ＮＡ、プラスミド及びブロムフェノールブルー（ＢＰＢ
）の泳動速度（Ｖ）は、通常の電気泳動装置（アドバン
ス社製。
明ポリアクリル樹脂製のものを使用した。電極（３）、
（４）は、白金線であり、工種側２本及び負極側２本を
水平に配置した。隔膜（８）は、透析チューブ（ユニオ
ンカーバイド１１１７／８８８）を使用した。染色体Ｄ
ＮＡ、プラスミド及びブロムフェノールブルー（ＢＰＢ
）の泳動速度（Ｖ）は、通常の電気泳動装置（アドバン
ス社製。
Ｍｕｐｉｄ−２）に、夫々同一の試料溶液を展開して求
めた。Ｖ ：Ｖ ：Ｖ ＝ＤＮＡ
ｐｌａｓｍｉｄ ＢＰＢｌ、４：２．４：３．２
であった。これより、ブロムフェノールブルーの移動時
間に対する相対時間を求め、２３Ｖの電圧で通電し、ブ
ロムフェノールブルーが反対側に到達する時間を観測し
、７２分間で通電をストップした。得られたプラスミド
を含む液からエタノール沈澱によって、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２を１５０μり得た。得られたプラスミドを、通
常の電気泳動装置で分析したところ、染色体ＤＮＡが完
全に分離されていることが明らかとなった。
めた。Ｖ ：Ｖ ：Ｖ ＝ＤＮＡ
ｐｌａｓｍｉｄ ＢＰＢｌ、４：２．４：３．２
であった。これより、ブロムフェノールブルーの移動時
間に対する相対時間を求め、２３Ｖの電圧で通電し、ブ
ロムフェノールブルーが反対側に到達する時間を観測し
、７２分間で通電をストップした。得られたプラスミド
を含む液からエタノール沈澱によって、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２を１５０μり得た。得られたプラスミドを、通
常の電気泳動装置で分析したところ、染色体ＤＮＡが完
全に分離されていることが明らかとなった。
第１図は、重層ゲルの構造を示し、第２図は、本発明電
気泳動装置の一例の斜面図を示し、第３図は、その平面
図を示す。 （１）・・・ゲル （２）・・・液槽（３）、（４
）・・・電極 （５）・・・ホルダー （６）・・・スポンジ（７）・
・・薄板 （８）・・・隔膜（９）・・・隔膜層 （以 上） 第１図 Ａ 第２図 第３図 Ａ ５
気泳動装置の一例の斜面図を示し、第３図は、その平面
図を示す。 （１）・・・ゲル （２）・・・液槽（３）、（４
）・・・電極 （５）・・・ホルダー （６）・・・スポンジ（７）・
・・薄板 （８）・・・隔膜（９）・・・隔膜層 （以 上） 第１図 Ａ 第２図 第３図 Ａ ５
Claims (2)
- （１）電気泳動用平板ゲルに、試料を含む薄層ゲルを重
層して重層ゲルとし、該重層ゲルの面に垂直に通電する
ことを特徴とする分取用電気泳動方法。 - （２）電気泳動用平板ゲルと試料を含む薄層ゲルとから
なる重層ゲルの面に垂直に通電するように電極を配した
ことを特徴とする分取用電気泳動装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62066922A JPS63233362A (ja) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | 分取用電気泳動方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62066922A JPS63233362A (ja) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | 分取用電気泳動方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63233362A true JPS63233362A (ja) | 1988-09-29 |
| JPH0555817B2 JPH0555817B2 (ja) | 1993-08-18 |
Family
ID=13329955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62066922A Granted JPS63233362A (ja) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | 分取用電気泳動方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63233362A (ja) |
-
1987
- 1987-03-20 JP JP62066922A patent/JPS63233362A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0555817B2 (ja) | 1993-08-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |